CN115887641B - 他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用 - Google Patents
他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，公开了一种他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用，可以诱导产生高效的黏膜免疫应答。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及他米巴汀的新用途，尤其涉及他米巴汀在制备免疫佐剂中的应用。
背景技术
2005年日本新药株式会社研发出他米巴罗汀(Tamibarotene，Tm)，是一种视黄酸受体α/β(RARα/β)激动剂，被FDA批准用于治疗复发或难治性急性前骨髓细胞性白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)。另外，研究表明Tm具有将促肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts，CAF)重编程为抑制性肿瘤相关成纤维细胞，在胰腺癌小鼠模型中，口服Tm可导致α-SMA表达降低，CAF中Meflin表达增加，因此Tm常用于治疗IIIB期非小细胞肺癌伴胸腔积液以及IV期非小细胞肺癌和胰腺癌，其相关治疗目前处于临床前II期试验阶段(Mizutani Y,Iida T,Ohno E,Ishikawa T,Kinoshita F,Kuwatsuka Y,ImaiM,Shimizu S,Tsuruta T,Enomoto A,Kawashima H,Fujishiro M.Safety and efficacyof MIKE-1in patients with advanced pancreatic cancer:a study protocol for anopen-label phase I/II investigator-initiated clinical trial based on a drugrepositioning approach that reprograms the tumour stroma.BMC Cancer.2022,22(1):205)。除此之外，Tm还参与阿尔兹海默症(Alzheimer's disease，AD)病因和病理学等多个靶基因的转录控制，减少不溶性β-淀粉样蛋白的沉积，改善皮质乙酰胆碱的减少，以及减少小鼠行为测试中的焦虑和睡眠不足，还对东莨菪碱诱导的记忆缺陷模型的记忆力有显著改善，因此Tm也可作为治疗阿尔茨海默症的候选药，目前处于临床前II期试验阶段(Fukasawa H,Nakagomi M,Yamagata N,Katsuki H,Kawahara K,Kitaoka K,Miki T,ShudoK.Tamibarotene:a candidate retinoid drug for Alzheimer's disease.Biol PharmBull.2012,35(8):1206-12)。
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种微需氧，寄生于胃黏膜表面的革兰阴性致病菌，Hp感染首先引起慢性胃炎，并导致胃溃疡和胃萎缩严重者则发展为胃癌。目前全球约50％的人感染Hp，目前主要治疗方法为铋剂四联疗法，但是随着抗生素耐药性的增加，临床上幽门螺杆菌的治疗效果以及复发率不容乐观。现有常见的疫苗候选抗原如尿素酶UreA或UreB、空泡毒素VacA等已表现出不同程度的免疫原性，但是如何筛选出能诱导机体产生黏膜免疫应答的佐剂，一直是幽门螺杆菌疫苗开发的重要问题。
尚未有研究报道他米巴罗汀可作为免疫药物，诱导黏膜免疫应答。
发明内容
本发明目的旨在针对上述现有技术中存在的不足，提供一种他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用，可高效诱导黏膜免疫应答。
本发明提供的他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用，以他米巴罗汀和铝佐剂作为复合免疫佐剂。所述他米巴罗汀与铝佐剂的质量比为1：5～100。所述铝佐剂优选为氢氧化铝或磷酸铝。
本发明提供的他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用，对免疫佐剂的剂型和制备方法没有特别限制，可采用本领域常规通用的制备方法制成片剂、胶囊、颗粒剂、缓释剂、注射剂等各种剂型。
本发明进一步提供了包含以他米巴罗汀为免疫佐剂的药物。该药物包含由他米巴罗汀和氢氧化铝构成的复合免疫佐剂，以及幽门螺杆菌重组蛋白。所述幽门螺杆菌重组蛋白与复合免疫佐剂的质量比为1:5～50。
进一步的，所述幽门螺杆菌重组蛋白为幽门螺杆菌重组蛋白HpaA、幽门螺杆菌重组蛋白SecG、幽门螺杆菌重组蛋白TonB、幽门螺杆菌重组蛋白NC-1、幽门螺杆菌重组蛋白UreA或幽门螺杆菌重组蛋白TatB。在优选实现方式中，所述幽门螺杆菌重组蛋白为幽门螺杆菌重组蛋白HpaA。所述幽门螺杆菌重组蛋白HpaA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明经研究发现，他米巴罗汀用DMSO溶解后与氢氧化铝作为复合免疫佐剂，与幽门螺杆菌重组蛋白HpaA共同肌注免疫小鼠，通过Elisa检测免疫小鼠阴道灌洗液中特异性sIgA的抗体水平。结合动物实验发现抗原HpaA仅与氢氧化铝佐剂免疫小鼠，没有检测到特异性sIgA抗体水平，表明没有诱导黏膜免疫应答；而抗原HpaA与他米巴罗汀和氢氧化铝联合肌注免疫小鼠其阴道灌洗液中特异性sIgA抗体最高效价可达1:32，免疫后5天阳转率为90％，表明他米巴罗汀用作免疫佐剂可高效诱导机体产生黏膜免疫应答。此外抗原HpaA与他米巴罗汀和氢氧化铝联合肌注免疫小鼠其血清IgG效价也高于仅与氢氧化铝免疫小鼠，表明他米巴罗汀用作免疫佐剂也可诱导一定程度的体液免疫应答。
与现有技术相比，本发明他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用，具有以下有益效果：
(1)本发明对已知的他米巴罗汀发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域，可以作为诱导黏膜免疫应答的佐剂。
(2)本发明提供的他米巴罗汀与氢氧化铝一起构成复合免疫佐剂，可以诱导产生高效的黏膜免疫应答。
(3)本发明提供的他米巴罗汀与氢氧化铝一起构成复合免疫佐剂，还可进一步提高其特异性血清IgG抗体水平，诱导体液免疫应答，扩展他米巴罗汀的应用领域。
附图说明
图1为重组蛋白HpaA表达鉴定SDS-PAGE图；M：Vazyme 180kDa PrestainedProtein Marker；1：全菌；2：破菌上清；3：破菌沉淀。
图2重组蛋白HpaA纯化鉴定SDS-PAGE图；M：Vazyme 180kDa Prestained ProteinMarker；1：纯化HpaA。
图3阴道灌洗液特异性抗体sIgA Elisa检测情况，(***P<0.001)。
图4血清特异性抗体IgG Elisa检测情况(***P<0.001)。
具体实施方式
以将结合附图对本发明各应用例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述应用例仅仅是本发明的一部分应用例，而不是全部的应用例。基于本发明中的应用例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它应用例，都属于本发明。
应用例
1.幽门螺杆菌重组蛋白HpaA的表达与纯化鉴定
本例中提供的幽门螺杆菌重组抗原蛋白HpaA，通过以下步骤制备获得：
S1、HpaA基因的克隆构建
a、通过NCBI序列比对发现幽门螺杆菌不同菌株间HpaA氨基酸序列高度保守且氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，根据HpaA的氨基酸序列，对其核苷酸序列进行大肠杆菌偏嗜性密码子优化，获得序列如SEQ ID NO:2所示的目的基因片段(下划线示酶切位点碱基序列，双下划线示组氨酸标签序列)。
b、对上述目的基因进行全基因合成，设计通过Nco I和Xho I的酶切位点连接到表达载体pET28a(+)上构建重组表达质粒并转化至重组克隆菌株Escherichia coli Top 10。从重组HpaA-pET28a(+)-E.coli Top 10菌株中提取重组质粒，并对获得的质粒进行测序比对，结果完全一致，经分析确认无氨基酸突变。
c、将重组质粒转化表达菌株E.coli BL21(DE3)，获得可以表达HpaA的重组大肠杆菌HpaA-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)。
SEQ ID NO:1幽门螺杆菌蛋白HpaA氨基酸序列
MDGMPAKQQHNNTGESVELHFHYPIKGKQEPKNSHLVVLIEPKIEINKVIPESYQKEFEKSLFLQLSSFLERKGYSVSQFKDASEIPQDIKEKALLVLRMDGNVAILEDIVEESDALSEEKVIDMSSGYLNLNFVEPKSEDIIHSFGIDVSKIKAVIERVELRRTNSGGFVPKTFVHRIKETDHDQAIRKIMNQAYHKVMVHITKELSKKHMEHYEKVSSEMKKRK
SEQ ID NO:2HpaA基因密码子优化后核苷酸序列
其中，下划线代表酶切位点，双下划线代表组氨酸标签。
S2、HpaA蛋白的诱导表达
a、重组菌株进行平板划线复苏培养过夜，将HpaA-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)平板单菌落接种10mL卡那霉素抗性的LB培养基，220rpm 37℃过夜培养，再将过夜培养的HpaA-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)1mL接种至20mL卡那霉素抗性的TB培养基中，220rpm、37℃培养2h，至OD600为0.6时，加入1M IPTG 3mL，使其IPTG终浓度为0.5mM，恒温摇床中220rpm、37℃诱导表达4h。
b、将诱导表达后的菌液用冷冻落地式离心机4℃8000g离心20min，弃去上清，取0.5g沉淀菌体加入破菌液(50mM PB，0.5M NaCl，pH 8.0)混匀，冰浴超声裂解10min(超声3s停止3s)，4℃、12000g离心3min，分离上清及沉淀。
c、上述破菌沉淀加入4mL破菌液重悬沉淀，分别取裂菌液、上清、重悬沉淀各40μL加入10μL5×蛋白上样缓冲液(生工，货号：C508320-0010，100℃)金属浴加热10min。
d、将处理好的裂菌液、上清和沉淀分别取10μL作为样品上样，进行12％的SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色后，通过凝胶扫描成像系统(BIO-RAD，ChemiDocTM MP ImagingSystem)扫描成像。灰度分析结果表明，HpaA在HpaA-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)菌株中呈可溶性表达，表达量占总蛋白32％(如图1所示)。
S3、HpaA抗原的纯化制备
a、菌株放大培养：取过夜培养的HpaA-pET28a(+)-E.coli BL21(DE3)菌液60mL加入6L卡那霉素抗性的TB培养基中，220rpm、37℃培养2h，培养至OD600为0.6时，加入1MIPTG3mL，使其IPTG终浓度为0.5mM，恒温摇床中220rpm、37℃诱导表达4h。诱导后的菌液，用冷冻落地式离心机4℃8000g离心20min收集菌体，再加入500mL破菌液(50mM PB，0.5M NaCl，pH8.0)重悬菌体后，将菌液进行高压均质仪破菌，冷冻落地式离心机4℃12000g离心30min收集上清。
b、镍柱亲和层析：破菌上清液抽滤瓶过0.45μm滤膜抽滤备用。纯化仪上使用缓冲液1(50mM PB，500mM NaCl，pH 8.0)平衡镍柱，取过滤后上清液上样，使用缓冲液2(50mMPB，150mM NaCl，pH 8.0)平衡层析柱；使用缓冲液3(50mM PB，150mM NaCl，25mM咪唑，pH8.0)洗脱杂质，使用缓冲液4(50mM PB，150mM NaCl，100mM咪唑，pH 8.0)洗脱目的蛋白，收集A280指示的蛋白洗脱峰。
c、阴离子亲和层析：使用缓冲液5(20mM PB，pH 8.0)平衡阳离子柱；将从镍离子亲和柱的洗脱下的洗脱液使用缓冲液5稀释10倍后进行上样；使用缓冲液5复平衡阴离子柱；使用缓冲液6(20mM PB，100mM NaCl，pH8.0)洗脱杂质蛋白；使用缓冲液7(20mM PB，200mMNaCl，pH 8.0)洗脱目的蛋白，收集A280指示的蛋白洗脱峰，得到幽门螺杆菌重组抗原蛋白HpaA，该重组抗原蛋白HpaA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。经12％SDS-page灰度分析检测蛋白纯度，BCA法进行浓度测定后-80℃保存备用。纯化电泳结果如图2所示，泳道1为纯化后蛋白，经12％SDS-PAGE检测，洗脱液呈单一目标蛋白条带，分子质量约为27.2kDa，获得的纯化蛋白纯度为99.2％。
2.动物免疫
本应用例将以应用例1中幽门螺杆菌重组抗原蛋白HpaA作为抗原，以他米巴罗汀和氢氧化铝作为佐剂进行动物免疫实验，具体如下：
实验动物：Balb/c小鼠，雌性，7-8周龄，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，每组10只，共30只小鼠，均分为三组：(1)实验组1，同时注射HpaA、Tm和氢氧化铝；(2)实验组2，同时注射HpaA和氢氧化铝；(3)对照组，同时注射PBS缓冲液、Tm和氢氧化铝。重组蛋白抗原HpaA免疫剂量为50μg/鼠，Tm免疫剂量为20μg/鼠，氢氧化铝免疫剂量为1mg/鼠，分组如表1所示。
表1抗原HpaA和Tm与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠分组
免疫方案：
a、首次免疫，
实验组1：每只鼠按照50μg抗原HpaA与20μg Tm和1mg氢氧化铝佐剂混合后加入PBS缓冲液至体积100μL，于混匀仪中在4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中免疫备用，小鼠双侧大腿肌肉注射(100μL/鼠)；
实验组2：每只鼠按照50μg抗原HpaA与1mg氢氧化铝佐剂混合后加入PBS缓冲液至体积100μL，于混匀仪中在4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中免疫备用，小鼠双侧大腿肌肉注射(100μL/鼠)；
对照组：每只鼠按照20μg Tm和1mg氢氧化铝佐剂混合后加入PBS缓冲液至体积100μL，于混匀仪中在4℃轻柔混匀30min，置于冰盒中免疫备用，小鼠双侧大腿肌肉注射(100μL/鼠)；
b、第二次免疫，第14天进行二次免疫，注射剂量与免疫方式同上；
c、第三次免疫，在第21天进行第三次免疫，注射剂量与免疫方式同上。
阴道灌洗液特异性抗体sIgA与血清IgG检测
(一)抗原HpaA和Tm与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠后阴道灌洗液特异性抗体sIgAElisa检测
第三次免疫后5天，用PBST(含0.05％吐温20的PBS)采集Balb/c小鼠阴道灌洗液，75μL/次，灌洗4次，300μL/鼠。采集后涡旋1min，然后12000g离心3min取上清液用于Elisa检测其中特异性sIgA水平变化。
a、抗原包被：取包被液将重组蛋白HpaA稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；
b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用；
c、标本稀释：将阴道灌洗液用抗体稀释液从1:4开始进行系列倍比稀释至1:64；
d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释样本，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgA(Abcam，货号：Ab97235)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
g、结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，a中包被液为50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)；b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA；d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20。c和e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％ Tween-20+0.5％BSA。f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液﹕3％过氧化氢＝10﹕90﹕1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；柠檬酸底物缓冲液(pH5.0)为0.1M柠檬酸、0.2M Na2HPO4。f中终止液为2M H2SO4溶液。
结果如图3所示：抗原HpaA分别与氢氧化铝、他米巴罗汀和氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠后产生的特异性sIgA抗体最高效价达分别为0和1:32，其中抗原HpaA与他米巴罗汀和氢氧化铝佐剂免疫组的sIgA几何平均滴度为17.27，如表2所示，而且免疫后5天抗体阳性率达到90％，表明仅氢氧化铝佐剂无法诱导产生机体黏膜免疫应答，而他米巴罗汀和氢氧化铝作为复合免疫佐剂可有效诱导小鼠产生黏膜免疫应答。
表2抗原HpaA和氢氧化铝与他米巴罗汀佐剂免疫小鼠其阴道灌洗液sIgA几何平均滴度
(二)抗原HpaA和Tm与氢氧化铝佐剂联合免疫小鼠后血清特异性抗体IgG Elisa检测
第三次免疫后5天，采集Balb/c小鼠尾静脉血，4℃静置3h后3000rpm离心5min分离血清，用Elisa检测HpaA特异性抗体IgG水平变化。
a、抗原包被：取包被液将HpaA纯化蛋白稀释至4μg/mL，100μL/孔包被酶标板，4℃过夜；
b、封闭：封闭液300μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗板后4℃保存备用；
c、标本稀释：将血清用抗体稀释液从1:4000开始进行系列倍比稀释至1:64000；
d、加样：取包被好的酶标板，依次加入稀释血清，100μL/孔，每个样品做双重复，37℃孵育1h，PBST洗涤4次；
e、加二抗：用抗体稀释液1:10000稀释HRP标记羊抗小鼠IgG(生工，货号：D110087-0100)，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤4次；
f、显色：加入底物显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入终止液50μL/孔，酶标仪上以450nm波长测定OD值；
g、结果判断：A样品/A阴性≥2.1为阳性。
其中，a中包被液为50mM碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液pH9.6(15mM Na2CO3，35mMNaHCO3)。b中封闭液为10mM PBS(pH7.4)+1％BSA。d中PBST洗液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％Tween-20。c和e中抗体稀释液为10mM PBS(pH7.4)+0.05％ Tween-20+0.5％BSA。f中显色液为TMB储存液﹕底物缓冲液：3％过氧化氢＝10:90:1；TMB储存液为1mg/mL TMB溶于DMSO；柠檬酸底物缓冲液(pH5.0)为0.1M柠檬酸、0.2M Na2HPO4。f中终止液为2M H2SO4溶液。
结果如图4所示，检测抗原HpaA和氢氧化铝免疫小鼠血清IgG抗体最高效价达到1:32000，而与他米巴罗汀+氢氧化铝免疫最高血清IgG抗体效价达到1：64000；其免疫小鼠对重组蛋白HpaA血清IgG抗体几何平均滴度分别为19755.96与24322.43，免疫5天后抗体阳性率达到100％。这表明他米巴罗汀与氢氧化铝联合免疫小鼠比仅用氢氧化铝佐剂使得机体产生更高水平特异性抗体IgG，诱导体液免疫应答。
表3抗原HpaA和氢氧化铝免疫小鼠其血清IgG几何平均滴度
表4抗原HpaA和氢氧化铝与他米巴罗汀佐剂免疫小鼠其血清IgG几何平均滴度
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的应用例是为了帮助读者理解本发明的原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和应用例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
Claims (8)
1.一种他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用，其特征在于，以他米巴罗汀和铝佐剂作为复合免疫佐剂。
2.根据权利要求1所述的他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用，其特征在于，所述他米巴罗汀与铝佐剂的质量比为1：5~100。
3.根据权利要求1或2所述的他米巴罗汀在制备免疫佐剂中的应用，其特征在于，所述铝佐剂为氢氧化铝或磷酸铝。
4.一种包含以他米巴罗汀为免疫佐剂的药物，其特征在于，该药物包含由他米巴罗汀和氢氧化铝构成的复合免疫佐剂，以及幽门螺杆菌重组蛋白。
5.根据权利要求4所述的包含以他米巴罗汀为免疫佐剂的药物，其特征在于，所述幽门螺杆菌重组蛋白与复合免疫佐剂的质量比为1:5~50。
6.根据权利要求4或5所述的包含以他米巴罗汀为免疫佐剂的药物，其特征在于，所述幽门螺杆菌重组蛋白为幽门螺杆菌重组蛋白HpaA、幽门螺杆菌重组蛋白SecG、幽门螺杆菌重组蛋白TonB、幽门螺杆菌重组蛋白NC-1、幽门螺杆菌重组蛋白UreA或幽门螺杆菌重组蛋白TatB。
7.根据权利要求6所述的包含以他米巴罗汀为免疫佐剂的药物，其特征在于，所述幽门螺杆菌重组蛋白为幽门螺杆菌重组蛋白HpaA。
8.根据权利要求7所述的包含以他米巴罗汀为免疫佐剂的药物，其特征在于，所述幽门螺杆菌重组蛋白HpaA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
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| GR01 | Patent grant | ||
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