WO2011150745A1

WO2011150745A1 - 结核杆菌ag85ab嵌合基因疫苗、其制备方法及应用

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Publication number: WO2011150745A1
Application number: PCT/CN2011/074223
Authority: WO
Inventors: 李忠明; 吴雪琼; 刘庆良; 梁艳; 张平静; 张俊仙; 阳幼荣
Original assignee: 上海海规生物科技有限公司; 中国人民解放军第三0九医院
Priority date: 2010-06-03
Filing date: 2011-05-18
Publication date: 2011-12-08
Also published as: ZA201300060B; CN102268446A; CN102268446B

Description

结核杆菌 Ag85ab嵌合基因疫苗、其制备方法及应用技术领域

本发明涉及生物医药领域的新型疫苗技术，具体涉及采用嵌合基因技术研制的可用于预防或治疗结核病的结核杆菌嵌合基因疫苗，尤其是治疗耐药结核杆菌感染结核病人的嵌合型基因疫苗。技术背景

迄今已知卡介苗虽能预防儿童结核病，包括严重的脑结核和粟粒性结核病，但不能有效地预防成人肺结核病，故美国、加拿大等国一直不常规接种卡介苗。自上世纪 80 年代以来，由于结核杆菌耐药问题越来越严重，以及艾滋病、移民和贫困等社会问题使得结核病发病率在世界范围内重新回升。世界卫生组织 (WHO) 2004年报告全球每年新增结核病人 900多万，每年有 200多万人死于结核病。我国的结核病疫情和耐药情况也相当严重，结核病人数居世界第二，仅次于印度，每年新发活动性肺结核病人 150多万人，现有肺结核病人 450多万，每年约 13万人死于此病，为全国各种传染病之首。耐药结核病人多，结核分枝杆菌总耐药率为 27. 8 %，其中初始耐药率为 18. 6 %，获得性耐药率为 46. 5 % , 耐多药率为 10. 7 %。结核病是一种在感染、免疫、预防和治疗等方面充满矛盾和挑战的慢性传染病，经合理的抗痨药物治疗不耐药结核菌感染一般在 1〜2个月内即可杀死病灶内绝大多数结核菌，但仍有少量菌残留，尤其是寄生于巨噬细胞内的结核菌不易被杀死，需继续治疗至少 6个月，甚至更长时间。由于耐多药结核病的流行、化疗药物长期治疗产生的毒副作用，以及艾滋病毒的感染、免疫抑制剂的使用和老年结核病等原因导致的机体免疫功能低下，使难治性结核病增多，抗结核治疗面临巨大的挑战，尤其是耐多药结核病（MDR-TB)、广泛耐药结核病 (XDR-TB)面临无药可治的困难局面。因此，研制新的抗结核药物面临更大的需求。

但是，研制新的抗结核药物投入大、周期长，而且结核杆菌对新药也可能很快产生耐药性，故新的有效抗结核药物开发进展缓慢，近年来只开发了采用免疫调节剂来辅助治疗结核病的方法。目前用于结核病辅助治疗的已获得批准的细胞免疫调节剂产品主要有二类。一类是细胞因子如 IFN^、 IL-2等，其半衰期短，需反复注射，费用高。另一类是用结核分枝杆菌的同类菌制成的非特异性免疫调节剂，如（1 ) 母牛分枝杆菌菌苗（商品名微卡菌苗），系母牛分枝杆菌经高温灭活纯化后制成的无细胞免疫调节剂，其活性成分主要为细胞壁，还含有蛋白质细胞因子诱导物质，及具有较强免疫活性的 DNA聚合体，能部分增强肺结核患者的细胞免疫功能，与化疗联用能缩短疗程，不良反应少且较轻微，使用安全，复发率低；（2 ) 草分枝杆菌制剂（商品名乌体林斯 utilin's ) , 系灭活的草分枝杆菌制成的免疫调节剂，可部分提高肺结核患者的细胞免疫功能，促进肺结核病灶的吸收好转； ( 3 ) 卡介苗多糖核酸注射液（商品名斯奇康)，系采用热酚法去掉了卡介苗菌体可诱导迟发型超敏反应的菌体蛋白质、再用乙醇沉淀提取的免疫活性较强的菌体脂多糖成分，可部分增强肺结核患者的细胞免疫和体液免疫功能，提高诱生 IL-2、 IL-2受体表达和 IFN-γ的水平，促进细菌阴转和结核病灶的吸收好转而提高联合化疗的疗效。但这三种调节剂都是非特异性细胞免疫增强剂，不能诱导针对结核杆菌的特异性强效细胞毒性 T 淋巴细胞 ( CTL) 应答。

如果能采用疫苗治疗结核病，几个月中只需注射几针，远比每天服药打针方便，且副作用较少费用低，故治疗性疫苗已成为重要的研究与开发方向。

治疗性疫苗的应用对象与预防性疫苗不同，前者用于结核菌感染者或结核病患者，而后者用于正常人群。有效的预防性疫苗不一定能用作治疗性疫苗，如研究证明卡介苗用于治疗结核病不仅无效可能还会加重病情。抗体应答对抗结核无效，而现有的多种蛋白质铝佐剂疫苗主要是诱导体液抗体免疫应答因而效果不佳。要开发的预防和治疗性结核病疫苗必须能诱导细胞介导为主的免疫应答，通过调节或选择性地诱导结核病患者免疫系统蕴藏的细胞免疫力来达到治疗疾病的目的，因此需选择适当类型的疫苗。自上世纪 90 年代以来全世界研发的新型核酸（基因）疫苗的优点就是主要诱导机体产生保护性细胞免疫应答。采用各种结核杆菌保护性抗原的编码核酸 (基因）疫苗预防结核感染的动物实验已有许多成功研究，但采用特异性核酸疫苗联合抗痨药物治疗结核病的研究论文只有几篇，如 (1) Lowrie et al., Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination. Nature 400:269-271 , 1999. (2) S-J Ha et al., Therapeutic effect of DNA vaccines combined with chemotherapy in a Therapy 10: 1592- 1599, 2003. (3) S-J Ha et al., Protective effect of DNA vaccine during chemotherapy on reactivation and reinfection of Mycobacterium tuberculosis. Gene Therapy (2005) 12: 1-5, 2005. (4) D-H YU, X-D and H Cai (北大蔡宏等） , Efficient tuberculosis treatment in mice using chemotherapy and immuno- therapy with combined DNA vaccine encoding Ag85B, MPT-64 and MPT-83. gene Therapy(2008), l-8。这些论文主要涉及小鼠接种标准 (非耐药)结核杆菌 H37Rv株后，肺肝脾均有细菌生长，单独给予利福平等抗痨药物治疗 3个月后，若用地塞米松抑制小鼠的免疫反应，至 6个月时细菌感染复发，但给予利福平同时注射单基因或混合基因核酸疫苗的动物感染不复发，这是由于核酸疫苗诱导了 Thl型免疫应答为主的细胞免疫应答而致。然而，关于耐药结核杆菌感染的治疗却鲜有研究，而结核杆菌易产生耐药性，耐药结核杆菌感染的治疗难度大，正是该技术需要开发的新领域。

目前认为结核病单基因 DNA疫苗在大动物实验中的预防免疫效果不够理想

( Gregorialdis等， "Genetic vaccines: strategies for optimization", Pharmaceutical Research, 15:661-670, 1998)；采用将两个抗原编码基因融合构建的双基因疫苗能够达到用一种载体表达两种不同抗原的目的，但两种表达抗原之间没有协同增效作用，也即融合基因疫苗诱导的免疫应答并不比单基因疫苗效果好 ( Stevenson et al, DNA fusion gene vaccines against cancer: from laboratory to the clinic. Immunology Research, 199: 156- 180, 2004禾口师长宏等， "结核分枝杆菌分泌蛋白 Ag85B-ESAT6的融合表达及纯化"，中华结核和呼吸杂志， 27 (2) : 89-92, 2004)。近年的研究发现将来源于同一病原微生物的两种抗原基因正确嵌合在一起产生的嵌合性基因疫苗有较好效果（Domingo et al, "Immunological properties of a DNA plasmid encod- ing a chimeric protein of herpes simplex virus type 2 glycoprotein B and glycoprotein D", Vaccine, 21(25-26):3565-3574,2003 )₀ 研究发现将一种免疫原性较弱的小抗原基因正确嵌合于另外一种免疫原性较强的大抗原基因中可提高小抗原的免疫原性，此即异源性嵌合基因技术。其成功的例子有在乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)的编码基因中嵌合艾滋病病毒 V3表位的编码基因。艾滋病病毒外壳蛋白抗原的 V3表位含有非常重要的保护性抗原表位，但其分子量很小，单用时难以诱导免疫应答。然而，将编码 HIV V3的基因嵌合在编码乙型肝炎表面抗原（HBsAg)的基因中，使表达的 HBsAg成为 V3表位的载体蛋白，这种嵌合基因即能诱导出特异性抗 HIV V3的体液禾口细胞免疫应答 (Bryder et al; "Improved immunogenicity of HIV- 1 epitopes in HbsAg chimeric DNA vaccine plasmids by structural mutations of HbsAg", DNA and Cell Biology, 18(3):219-225, 1999)。嵌合位点和嵌合方式的正确选择十分重要，应使插入的小基因不破坏作为载体蛋白的大基因构型，从而表达时能保持二者原有的抗原表位和免疫原性。

本发明者在中国发明专利 ZL 2004100843761 (2008年 3月 28日授权）及以其为优先权的国际申请 PCT/CN2005/001914 "结核杆菌嵌合基因疫苗及其制备方法"中，揭示了将编码最小结核杆菌保护性抗原的 ESAT6基因嵌合到编码最具免疫保护效果的结核杆菌较大抗原结构蛋白 Ag85a基因中，得到了结核杆菌嵌合基因 Ag85a-ESAT6。其中，在 Ag85a基因第 245-250 ( GGTACC ) 位的 Kpn I限制性内切酶识别位点或第 430-435

( GTCTAC )位的 Acc l限制性内切酶识别位点的嵌合，分别产生的两种新型结核杆菌嵌合基因（HG856K和 HG856A) 疫苗在动物实验中均显示出优于单基因疫苗的免疫效果，即既保留了 Ag85a的免疫原性又增强了 ESAT6的免疫原性（Li Z , Song D, Zhang H, et al. Improved humoroimmunity against Tuberculosis ESAT-6 antigen by chimeric DNA prime and protein boost strategy. DNA Cell Biol, 2006, 25(l):25-29 ) ₀这是迄今结核杆菌嵌合基因疫苗构建的一个成功例子。

这两种嵌合基因疫苗在预防结核杆菌感染的动物实验中显示了良好效果，但是，后来我们发现当将其用于结核杆菌（尤其是治疗耐药结核杆菌）感染的动物进行实验治疗时，这种嵌合基因疫苗虽能有效减少感染组织中的结核杆菌数，但对减轻结核杆菌导致的病理损伤（如实验动物结核病产生的结核结节等病理损伤）不能尽如人意。

我们在上述发明专利的基础上，不断地进行探索，在研究思路和实验设计上均作了重大改进，构建了结核杆菌最具保护性免疫原性的 Ag85a与 Ag85b两种蛋白（这两种蛋白卡介苗菌均有所表达）编码基因的嵌合基因疫苗 HGAg85ab，本发明的 HGAg85ab嵌合基因疫苗不仅可用于预防，更重要的是可用于治疗结核病，尤其是治疗耐药结核杆菌感染的结核病人。从而完成了本发明。

因此，本发明的第一个目的提供一种嵌合基因 Ag85ab。

本发明的第二个目的在于提供一种包含 Ag85ab嵌合型基因的结核杆菌基因疫苗。本发明的第三个目的在于提供这种嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法。

本发明的第四个目的还在于提供这种嵌合型结核杆菌基因疫苗在制备预防和治疗结核病药物中的应用。发明概述

本发明提供一种嵌合基因，包含序列 1所示编码结核杆菌蛋白 Ag85a的基因和序列 2 所示编码结核杆菌 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列片段的基因，其中编码 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在 Ag85a基因的序列中，嵌合位点为 Ag85a基因的第 245-250位限制性内切酶 Kpn I识别序列或第 430-435位内切酶 Acc I识别序列。

本发明进一步提供一种嵌合型结核杆菌基因疫苗，包含序列 1所示编码结核杆菌蛋白 Ag85a的基因和序列 2所示编码结核杆菌 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列片段的基因，其中编码 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在 Ag85a基因的序列中，嵌合位点为 Ag85a基因的第 245-250位限制性内切酶 Kpn I识别序列或第 430-435位内切酶 Acc I识别序列，编码结核杆菌蛋白 Ag85a基因连接于真核表达载体中。

本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗中，真核表达载体可以是 JW4303 , 或 pcDNA3.1，或 pVAXl系列。优选的是 pVAXl系列。

本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法包括以下步骤：

( 1 ) 选择 Ag85a基因中的第 245-250位 Kpn I酶切位点，或第 430-435位 Acc I酶切位点，分别用内切酶 Kpn I或内切酶 Acc I消化真核表达载体中的 Ag85a基因，使该表达载体线性化，并用碱性磷酸酶去磷酸化；

( 2 ) 分别用带有内切酶 Kpn I识别序列的引物对，或带有内切酶 Acc I识别序列的引物对，通过聚合酶链反应扩增编码 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列的 DNA片段；

( 3 ) 用连接酶分别连接步骤（1 ) 的去磷酸化线性 Ag85a基因载体与步骤（2 ) 的编码 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列的 DNA扩增片段，获得含 Ag85ab嵌合基因的质粒载体疫苗。

本发明方法中，采用的真核表达载体优选 pVAXl。

本发明方法中，采用的引物对优选序列 3所示引物 P1和序列 4所示引物 P2。

本发明方法中，采用的引物对优选序列 6所示引物 P3和序列 7所示引物 P4。

本发明还提供这种嵌合型结核杆菌基因疫苗在制备预防和治疗结核病药物中的应用。用本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗，加或不加左旋咪唑佐剂免疫动物，诱导了比单基因质粒更强的 Thl型免疫应答。与抗痨药联用，本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗与单基因质粒疫苗相比，在耐药结核杆菌感染动物的治疗中诱导了相当或更强的抗结核细胞免疫应答和更佳治疗效果。发明详述

文献检索显示结核杆菌 Ag85a与 Ag85b抗原蛋白的 1-125位氨基酸序列二者彼此差异不大，而 125-282位氨基酸序列之间有较大差异，约有 40个左右氨基酸不相同，此区段二者的编码核酸序列中共有 90多个碱基不同。在此区段中 Ag85b存在有重要的可诱导 Thl 型应答反应细胞因子 IFN-γ和 IL-2的表位（S. D'Souza, V. Rosseels, M. Romano, A et al; Mapping of Murine Thl Helper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85 A, Ag85B, and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity, January 2003, 71(1): 483-493 本发明者通过计算机软件服务公司 Intenet-Based Applied Bioinformatics Company的 Epitope Informatics软件对结核杆菌结构蛋白 Ag85a基因的抗原表位进行搜索，发现其抗原表位主要集中在 Ag85a的氨基端和羧基端（S. D'Souza, V. Rosseels, M. Romano, A et al; Mapping of Murine Thl Helper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85 A, Ag85B, and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity, January 2003, 71(1): 483-493 )。在不含抗原表位的 Ag85a母体基因中间区段第 245-250位含有 Kpn I酶切位点 ( GGTACC ) , 第 430-435位含有 Acc I酶切位点 ( GTCTAC ) , 故设计在此嵌合插入编码 Ag85b的 125-282位氨基酸的核苷酸序列片段。

本发明提供的嵌合基因包含序列 1所示编码结核杆菌蛋白 Ag85a的基因和序列 2所示编码结核杆菌 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列片段的基因，其中编码 Ag85b蛋白 125-282 位氨基酸序列片段的基因嵌合在 Ag85a基因的序列中，嵌合位点为 Ag85a基因的第 245-250 位限制性内切酶 Kpn I识别序列和 /或第 430-435位内切酶 Acc I识别序列。

本发明提供包含编码结核杆菌保护性抗原 Ag85a全部与保护性抗原 Ag85b的 125-282 位氨基酸的嵌合型结核杆菌基因疫苗，包括在以下序列 1所示的结核杆菌保护性结构蛋白 Ag85a基因的第 245-250 ( GGTACC )位 Kpn I酶切位点，或第 430-435 ( GTCTAC )位 Acc I酶切位点嵌合插入以下序列 2所示的编码 Ag85b的 125-282位氨基酸的核苷酸序列片段，这种重组的 Ag85ab 嵌合基因连接于真核表达载体中。真核表达载体可选用 JW4303 , 或 pcDNA3.1，或 p VAX 1系列。优选 p VAX 1系列。

序列 1 : Ag85a基因序列

1 TTTTCCCGGC CGGGCTTGCC GGTGGAGTAC CTGCAGGTGC CGTCGCCGTC GATGGGCCGT

61 GACATCAAGG TCCAATTCCA AAGTGGTGGT GCCAACTCGC CCGCCCTGTA CCTGCTCGAC

121 GGCCTGCGCG CGCAGGACGA CTTCAGCGGC TGGGACATCA ACACCCCGGC GTTCGAGTGG

181 TACGACCAGT ι CGGGCCTGTC ' 3GTGGTCATG ' CCGGTGGGTG ' 3CCAGTCAAG CTTCTACTCC

241 GACTGGTACC AGCCCGCCTG CGGCAAGGCC GGTTGCCAGA CTTACAAGTG GGAGACCTTC

301 CTGACCAGCG AGCTGCCGGG GTGGCTGCAG GCCAACAGGC ACGTCAAGCC CACCGGAAGC

361 GCCGTCGTCG GTCTTTCGAT GGCTGCTTCT TCGGCGCTGA CGCTGGCGAT CTATCACCCC

421 CAGCAGTTCG TCTACGCGGG AGCGATGTCG GGCCTGTTGG ACCCCTCCCA GGCGATGGGT

481 CCCACCCTGA TCGGCCTGGC GATGGGTGAC GCTGGCGGCT ACAAGGCCTC CGACATGTGG

541 GGCCCGAAGG AGGACCCGGC GTGGCAGCGC AACGACCCGC TGTTGAACGT CGGGAAGCTG

601 ATCGCCAACA ACACCCGCGT CTGGGTGTAC TGCGGCAACG GCAAGCCGTC GGATCTGGGT

661 GGCAACAACC TGCCGGCCAA GTTCCTCGAG GGCTTCGTGC GGACCAGCAA CATCAAGTTC

721 CAAGACGCCT ACAACGCCGG TGGCGGCCAC AACGGCGTGT TCGACTTCCC GGACAGCGGT

781 ACGCACAGCT GGGAGTACTG GGGCGCGCAG CTCAACGCTA TGAAGCCCGA CCTGCAACGG

841 GCACTGGGTG CCACGCCCAA CACCGGGCCC GCGCCCCAGG GCGCCTAG 887 序列 2: 编码 Ag86b蛋白 125-282位氨基酸的基因片段序列， GTCTACTCGAT GGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGC CTACCACCCC CAGCAGTTCA TCTACGCCGG CTCGCTGTCG GCCCTGCTGG ACCCCTCTCA GGGGATGGGG CCTAGCCTGA TCGGCCTCGC GATGGGTGAC GCCGGCGGTT ACAAGGCCGC AGACATGTGG GGTCCCTCGA GTGACCCGGC ATGGGAGCGC AACGACCCTA CGCAGCAGAT CCCCAAGCTG GTCGCAAACA ACACCCGGCT ATGGGTTTAT TGCGGGAACG GCACCCCGAA CGAGTTGGGC GGTGCCAACA TACCCGCCGA GTTCTTGGAG AACTTCGTTC GTAGCAGCAA CCTGAAGTTC CAGGATGCGT ACAACGCCGC GGGCGGGCAC AACGCCGTGT TCAACTTCCC GCCCAACGGC ACGCACAGCT GGGAGTACTG GGGCGCTCAG CTCAACGCCA TGAAGGGTGA CCTGCAGAGT TCGTTAG TCTAC 在一个优选实施方案中，本发明的嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法包括以下步骤：

( 1 )选择在 Ag85a基因中可插入外源 DNA片段的第 245-250位 Kpn I酶切位点，或第 430-435位 Acc I酶切位点，分别用内切酶 Kpn I或内切酶 Acc I消化先前构建好的含有 Ag85a基因的真核表达载体 pVAXl , 使之线性化，并用碱性磷酸酶去磷酸化；

( 2 ) 分别用一对带有内切酶 Kpn I识别序列 ^的引物，或一对带有内切酶

Acc I识别序列 GTCTAC的引物，通过聚合酶链反应扩增编码 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列的 DNA片段；

( 3 ) 用连接酶分别连接步骤（1 ) 的去磷酸化线性 Ag85a基因载体与步骤（2 ) 的编码 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列的 DNA扩增片段，选择获得两种连接方向正确的嵌合基因疫苗 HG85abA和 HG85abK载体质粒。

为扩增编码 Ag85b基因 125-282位氨基酸的核苷酸序列，本发明者设计了针对该序列 5 ' 端的上游引物 P1序列和 3 '端的下游引物 P2序列（序列 3和序列 4)，二者均带有 Acc I 酶切位点 ( GTCTAC ) : 或上游引物 P3序列和下游引物 P4序列（序列 5和序列 6)，二者均带有 Kpn I酶切位点 ( GGTACC 合成这两对引物后，用 PCR技术扩增结核杆菌 Ag85b 基因的 PET28A-85B质粒中的该片段（ S. D'Souza, V. Rosseels, M. Romano, A et al; Mapping of Murine Thl Helper T-Cell Epitopes of Mycolyl Transferases Ag85A, Ag85B, and Ag85C from Mycobacterium tuberculosis. Infection and Immunity, January 2003, 71(1): 483-493 ) 并通过凝胶电泳回收。同时用 Acc I酶或 Kpn I酶酶切含结核杆菌 Ag85a基因的 pVAX-Ag85 A质粒载体 (Li Z , Song D, Zhang H, et al. Improved Humoral Immunity of Tuberculosi s ESAT- 6 antigen by Chimeric DNA Prime and Protein Boost Strategy ", DNA Cel l Biol , 2006 , 25 ( 1 )： 25-29 ) 使之线性化，继而用碱性磷酸酶对其作去磷酸化处理并通过凝胶电泳回收。然后将两者用 T4 DNA连接酶连接起来，将所得质粒转化大肠杆菌后在卡那霉素抗性培养基平皿上培养生长出菌落。挑选单个菌落分别小试管培养后，分别抽提质粒作电泳鉴定，再作酶切和电泳鉴定，初步选出正确者经测序确认，重组的 Ag85ab嵌合型基因疫苗构建成功。据专利文献和学术期刊检索，均未发现关于这种 Ag85a与 Ag85b的嵌合基因的报导。

本发明制备的嵌合基因质粒所表达的嵌合蛋白分子量约为 40kD，符合 Ag85a全部与 Ag85b的 125-282位氨基酸相加的分子量，既保留了 Ag85a和 Ag85b的抗原性表位，又提供了 Ag85b的 IFN-γ和 IL-2诱导表位。

本发明的嵌合基因质粒单独使用或与佐剂左旋咪唑联用，免疫小鼠，诱生的血清特异性抗体 IgG亚类分析和活化淋巴细胞表达的细胞因子 (mRNA)类型检测分析表明，其主要诱导了 Thl型免疫应答，水平显著优于 Ag85a和 Ag85b单基因质粒诱导的。采用本发明的嵌合质粒疫苗联用利福平，治疗利福平耐药结核杆菌感染的小鼠，效果相当于或优于单基因质粒疫苗联用利福平。显示了临床上用于治疗结核杆菌感染者，尤其是耐药结核杆菌感染者的应用前景。附图简要说明

图 1A是本发明含有结核杆菌 Ag85abA嵌合型基因的真核表达载体 HG85abA质粒的构建图。

图 1B是用于构建 HG85abA质粒的 pVAX 1载体质粒。

图 2显示初步筛选的含嵌合型 HG85abA基因质粒（C1质粒）的电泳图。泳道 1. C3 质粒；泳道 2. C2 质粒；泳道 3. C1质粒；泳道 4. pVAXl-Ag85a质粒

图 3显示 PCR扩增的 Ag85b基因片段 (0.5kb)与用 Acc I酶酶切 C1质粒产生预期的

0.5kb片段的电泳图。泳道 1. 2000DL标志；泳道 2. PCR扩增的 Ag85b片段 C0.5kb大小与预期相符)；泳道 3. C1质粒经 Accl酶酶切产生的二片段。

图 4显示 C1质粒用 Acc I和 Kpnl双酶切产生了预期的三个片段的电泳图。泳道 1 禾口 7. λ -EcoT14-I digest; 泳道 2-4. CI质粒经 Acc I和 Kpnl 双酶酶切产生了预期大小的三个片段 0.2kb+0.5kb+3.7 kb; 泳道 5. lOObp marker; 泳道 6. 2000DL标志。

图 5A-I显示用利福平抗药性结核杆菌 HB361菌株攻击后，分别采用对照或几种不同质粒和 /或利福平治疗小鼠的肺组织切片病理学检查的代表性显微照片。具体实施方式

以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：卢圣栋主编 "现代分子生物学实验技术"，（第二版，中国协和医科大学出版社， 1999年 12月，北京）；和 J.萨姆布鲁克， D. W. 拉塞尔著,黄培堂等译： "分子克隆实验指南"（第三版， 2002年 8月，科学出版社出版，北京）中的有关章节。本领域普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发明，这些修改和变换均属于本申请书的权利要求范围内。实施例 1: 含 A_g85ab嵌合基因 pVAXl质粒（HG85abA质粒）核酸疫苗的制备

主要实验材料：

pVAX 1载体质粒购自 Invitrogen 公司

源自 pVAX 1质粒载体的含结核杆菌 Ag85a基因的 pVAXl-85a和含结核杆菌 Ag85b基因的 PET28A-85B质粒由上海海规生物科技有限公司制备（Li Z , Song D, Zhang H, et al.， Improved humorol immunity against Tuberculosis ESAT-6 antigen by chimeric DNA prime and protein boost strategy. DNA Cell Biol, 2006, 25(l):25-29) ₀

碱性磷酸酶、 Taq DNA聚合酶为 EB 公司产品。

限制性内切酶 BamH I、 Hind III和 dNTP Mix (混合物）为 Takara公司产品。限制性内切酶 Acc I、 Kpn I和 T4 DNA连接酶为 MBI公司产品。

AXYGEN质粒提取试剂盒、 DNA凝胶回收试剂盒为 Axygen 公司产品。

细菌培养用酵母提取物、蛋白胨为 OXOID公司产品。

NaCl等化学品购自国药集团化学试剂有限公司。硫酸卡那霉素购自上海新先锋药业有限公司。凝胶成象拍摄处理系统为上海天能公司产品。

制备方法：

( 1 ) 引物设计与合成: 利用软件 PerlPrimer设计用 PCR法扩增 Ag85b基因（编码

125-282位氨基酸）片段含有 Acc I酶切位点 |GTCTAC |的上游引物 P1和下游引物 P2寡核苷酸的序列如下：

P1 : 5 ' -CACATCACGATACCGGTCTACTCGATGGCCGGCTCGTC-3， (序列 3 )

P2: 5 ' - CACATGCGAATACCG|GTAGAC|TAACGAACTCTGCAGGTC- 3， (序列 4)

将此二序列送 Invitrogen 公司进行合成。

(2) PCR扩增 Ag85b基因（编码 125-282位氨基酸）片段: 用上述 P1/P2引物（浓度各为 10ριηο1/μ1)、以 PET28a-85b质粒 DNA为模板，采用高保真 pfu DNA聚合酶，按基因工程分子克隆技术的常规方法 (参见 J. 萨姆布鲁克， D. W. 拉塞尔著，黄培堂等译 "分子克隆实验指南"，第三版， 85— 86页， 2002年 8月，科学出版社出版，北京)进行 PCR反应。反应条件为： 94°C变性 4 min; 94 °C 30s 、 60 °C 30s 、 72 °C 40s共 30个循环； 72 °C 延伸 5 min。反应体系（50μ1)为： 10 x buffer 5μ1、 Taq DNA聚合酶 1μ1、 MgCl₂ 5μ1 (Mg²⁺浓度为 1.5mM)、 dNTP mix (四种 dNTP的浓度分别为 20μΜ) 1μ1、 ddH20 35μ1、 PI和 P2 各 1μ1、 PET28a-85b 1μ1。同样的反应体系共 4管，反应后合并 4管内容物用 0.6倍异丙醇沉淀，离心 10 min收集产物用 ddH20重溶解，共得到 ΙΟΟμΙ的 Ag85b基因片段的 PCR扩增产物，凝胶电泳显示目标条带约为 0.5KB, 与 85b基因片段的大小相符。将此 PCR产物取样用 Acc I限制性内切酶进行酶切，酶切反应体系（50μ1) 为: 10 x buffer 5μ1、 Ag85b 产物 30μ1、酶 1μ1、 ddH20 14μ1。 37°C水浴过夜。用 DNA凝胶回收试剂盒按照说明书 (；参见 J. 萨姆布鲁克， D. W. 拉塞尔著，黄培堂等译 "分子克隆实验指南"，第三版，第 404 一 407页， 2002年 8月，科学出版社出版，北京)操作,回收该基因 DNA片段产物。

( 3 )制备去磷酸化线性 pVAXl-Ag85A质粒:用 Acc I限制性内切酶酶切消化含 Ag85a 基因的 pVAXl-Ag85A质粒，酶切反应体系（50μ1) 为： 10 x buffer 5μ1; pVAXl-85A 30μ1 ( 5μ_§)_; 酶液 Ιμΐ; dd¾0 14μ1。 37°C水浴过夜。酶切产物取样作 1%琼脂糖凝胶电泳 (见 J. 萨姆布鲁克， D. W. 拉塞尔著，黄培堂等译 "分子克隆实验指南"，第三版， 387_399 页， 2002年 8月，科学出版社出版，北京)和成像扫描确定酶切完全，用 DNA凝胶回收试剂盒按照试剂盒说明书方法回收此线性质粒，再经凝胶电泳和成像扫描，显示回收的 DNA 条带与预计的 3.9KB大小相符。

用碱性磷酸酶对此 3.9KB的 pVAXl-85A线性化质粒进行去磷酸化处理，反应体系为：碱性磷酸酶 1μ1， pVAXl-85A线性化载体 30μ1、 ddH20 14μΚ 10 x buffer 5μ1。 37°C 水浴 1 小时。反应完毕后用 DNA凝胶回收试剂盒按照说明书操作，回收此去磷酸化粘性末端的线性 PVAX1-85A质粒。

(4)连接 Ag85b基因片段与去磷酸化线性 pVAXl-Ag85A质粒载体并转化大肠杆菌：反应体系（20μ1) 为： 10 X buffer 2μ1、 Τ4 DNA连接酶 2μ1、 Ag85b基因片段 14μ1、去磷酸化 pVAXl-Ag85A线性载体 2μ1， 22°C恒温孵育过夜。将连接产物转化入 JM108感受态大肠杆菌细胞，取 200μ1涂布接种卡那霉素抗性 LB平板，置 37°C培养过夜。 pVA l载体质粒中含有抗卡那霉素基因，被基因重组 HG85abA克隆载体质粒成功转化的大肠杆菌能在卡那霉素抗性培养基平皿上生长成为菌落。次日出现数十个单菌落，挑取 3个单菌落 ( C1、 C2和 C3 ) 分别接种含卡那霉素抗性 LB培养液（约 5ml)的三个试管中， 37°C摇床 200rpm 培养过夜。

( 5 )含 Ag85ab嵌合基因重组 PVAX1质粒（HG85abA质粒）的提取与鉴定: 分别取三个菌落生长产生的的菌液（分别标号为 Cl、 C2、 C3 ) 各 1ml用 AXYGEN质粒提取试剂盒按说明书操作抽提质粒，取样作凝胶电泳，电泳条带显示 C1质粒分子量比 pVAXl-85a 质粒略大，约为 4.4KB, 符合预期的大小。如图 2所示， C1质粒电泳位置比 pVXAl-Ag85a 对照质粒略高，表明 C1质粒分子量比 pVAXl-85a质粒略大，符合预期大小（约 4.4KB ), 因此初步筛选出此质粒作下一步鉴定。

取 C1质粒作 Acc l单酶切鉴定。反应体系（ΙΟμΙ) 为： Acc I Ιμΐ lOxbuffer 1μ1、 CI质粒 8μ1， 37°C孵育 2小时。取样作凝胶电泳成像显示，图 3中泳道 3为 C1质粒经 Accl酶酶切产生的二片段，分子量较小片段的大小 (0.5kb) 与预期的 Ag85b扩增片段分子量相符。表明 C1可能为阳性克隆子，宜进一步鉴定。

再用 Acc l和 Kpn l双酶切 C1质粒，见图 4，泳道 2-4为 C1质粒经 Acc I和 Kpnl 双酶酶切产生了预期大小的三个片段 0.2kb+0.5kb+3.7 kb，进一步确认其为正确的阳性克隆子。

PCR扩增 C1质粒作进一步鉴定：反应体系（50μ1) 为： lO x buffer 5μ1、 Taq DNA聚合酶 1μ1、 MgCl₂ 5μΚ dNTP mix ΙμΚ ddH20 35μ 引物 Ρ1 1μ1、引物 Ρ2 1μ1、 CI质粒 Ιμΐ ( 0.1μ_§)。同样的反应体系共 3管，阳性对照管为模板 Ag85b基因片段，阴性对照无基因片段。反应条件为： 94°C变性 4 min; 94 °C 30s 、 60 °C 30s 、 72 °C 40s, 共 30轮循环； 72°C 延伸 5 min。

分别取 3管 PCR产物各 3μ1进行凝胶电泳，显示均扩增出 0.5ΚΒ的条带，与设计的

Ag85b片段大小吻合，说明其为所要的阳性克隆子，将 C1质粒送 Invitrogen 公司进行基因测序。测序引物为 T7启动子通用引物和 BGH POLY A通用引物，双向测通。

Invitrogen 公司基因测序结果如下（序列 5 ):

ATG (A_g85A蛋白氨基端编码序列）

GTTTCCCGGC CGGGCTTGCC GGTGGAGTAC CTGCAGGTGC CGTCGCCGTC GATGGGCCGT GACATCAAGG

TCCAATTCCA AAGTGGTGGT GCCAACTCGC CCGCCCTGTA CCTGCTCGAC GGCCTGCGCG CGCAGGACGA

CTTCAGCGGC TGGGACATCA ACACCCCGGC GTTCGAGTGG TACGACCAGT CGGGCCTGTC GGTGGTCATG

CCGGTGGGTG GCCAGTCAAG CTTCTACTCC GACTGGTACC AGCCCGCCTG CGGCAAGGCC GGTTGCCAGA

CTTACAAGTG GGAGACCTTC CTGACCAGCG AGCTGCCGGG GTGGCTGCAG GCCAACAGGC ACGTCAAGCC

CACCGGAAGC GCCGTCGTCG GTCTTTCGAT GGCTGCTTCT TCGGCGCTGA CGCTGGCGAT CTATCACCCC

CAGCAGTTCG TCTACTCGAT GGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGC CTACCACCCC CAGCAGTTCA

TCTACGCCGG CTCGCTGTCG GCCCTGCTGG ACCCCTCTCA GGGGATGGGG CCTAGCCTGA TCGGCCTCGC

GATGGGTGAC GCCGGCGGTT ACAAGGCCGC AGACATGTGG GGTCCCTCGA GTGACCCGGC ATGGGAGCGC

AACGACCCTA CGCAGCAGAT CCCCAAGCTG GTCGCAAACA ACACCCGGCT ATGGGTTTAT TGCGGGAACG GCACCCCGAA CGAGTTGGGC GGTGCCAACA TACCCGCCGA GTTCTTGGAG AACTTCGTTC GTAGCAGCAA CCTGAAGTTC CAGGATGCGT ACAACGCCGC GGGCGGGCAC AACGCCGTGT TCAACTTCCC GCCCAACGGC ACGCACAGCT GGGAGTACTG GGGCGCTCAG CTCAACGCCA TGAAGGGTGA CCTGCAGAGT TCGTTAGTCT ACGCGGG AGCGATGTCG GGCCTGTTGG ACCCCTCCCA GGCGATGGGT CCCACCCTGA TCGGCCTGGC GATGGGTGAC GCTGGCGGCT ACAAGGCCTC CGACATGTGG

GGCCCGAAGG AGGACCCGGC GTGGCAGCGC AACGACCCGC TGTTGAACGT CGGGAAGCTG ATCGCCAACA ACACCCGCGT CTGGGTGTAC TGCGGCAACG GCAAGCCGTC GGATCTGGGT GGCAACAACC TGCCGGCCAA

GTTCCTCGAG GGCTTCGTGC GGACCAGCAA CATCAAGTTC CAAGACGCCT ACAACGCCGG TGGCGGCCAC

AACGGCGTGT TCGACTTCCC GGACAGCGGT ACGCACAGCT GGGAGTACTG GGGCGCGCAG CTCAACGCTA TGAAGCCCGA CCTGCAACGG GCACTGGGTG CCACGCCCAA CACCGGGCCC GCGCCCCAGG GCGCCTAG TAA GGATCTCGTC GTTTTGTCGT TTTGTCGTTG GATCCACTAG TCCAGTG GG TGGAATTCTG CAGATATCCA GCACAGTGGC GGCCGCTCGA GTCTAGAGTC CT (Ag85A蛋白羧基端编码序歹 lj)

下划线表示 Accl酶识别位点。

将以上测定的序列与上文设计的序列在 NCBI 网站上进行 BLAST排列对比检索，结果表明 1365个碱基中除结构基因的第一个碱基 G与原基因中的 T不同外，其余都相同。由于 pVAXl载体要求在起始密码子 ATG后的第四个碱基必须是 G (称 Kozak序列），才能获得基因在真核生物体内较高的表达。此第一个碱基 G是先前设计 pVAXl-Ag85A时为增强表达而更改，因此，获得的重组 HG85abA质粒中的 Ag85abA嵌合基因序列正确。

( 6) 核酸疫苗（HG85abA质粒）的配制与贮存: 将用 AXYGEN质粒抽提试剂盒纯化的重组 HG85abA质粒溶解于磷酸生理盐水 (PBS)中，浓度为 lmg/ml; 或制备为冻干制剂贮存，用前溶解于 PBS中。实施例 2: 含 A_g85ab嵌合基因 PVAX1质粒（HG85abK质粒）核酸疫苗的制备

主要实验材料：与实施例 1相同

制备方法

(1) 引物设计与合成: 设计用于 PCR扩增 Ag85b基因（编码 125-282位氨基酸）片段含有 Kpn I酶切位点 GGTACC的以下上游引物 Ρ3和下游引物 Ρ4寡核苷酸序列：

Ρ3: 5 ' -CACATCACGATACCGGGTACCTCGATGGCCGGCTCGTC- 3 ' (序列 6 )

Ρ4: 5 ' -CACATGCGAATACCGGGTACCTAACGAACTCTGCAGGTC-3， (序列 7 )

将此二序列送 Invitrogen 公司进行合成。

( 2 ) PCR扩增 Ag85b基因（编码 125-282位氨基酸）片段: 方法与实施例 1相同，但采用上述 P3/P4引物。

( 3 )制备去磷酸化线性 pVAXl-Ag85A质粒: 方法与实施例 1相同，但采用 Kpn I酶。

( 4) 连接 Ag85b基因片段与去磷酸化线性 _PVAXl-Ag85A载体并转化大肠杆菌: 方法与实施例 1相同。

( 5 ) 含 Ag85ab嵌合基因重组 pVAXl质粒（HG85abK质粒）的提取与鉴定: 方法与实施例 1相同，但所得的 K1质粒单酶切鉴定采用 Kpn I酶，双酶切鉴定采用 Nhe I和 BamH I酶，单酶切得到一条 0.5kb大小的条带，与预期的 Ag85b基因片段相符；双酶切产生了 3kb的载体 pVAXl和 1.4kb的 HG 85ab嵌合基因两个预期条带，进一步确认 K1为正确阳性克隆子。 K1质粒的 PCR扩增作进一步鉴定采用 P3和 P4引物，其方法与实施例 1相同。 K1质粒送 Ivitrogen公司测序方法也与实施例 1相同。测序结果表明获得的重组 HG85abK 质粒中的 Ag85abK嵌合基因序列正确。

Invitrogen 公司基因测序结果如下（序列 8 ) :

ATG (A_g85A蛋白氨基端编码序列）

GTTTCCCGGC CGGGCTTGCC GGTGGAGTAC CTGCAGGTGC CGTCGCCGTC GATGGGCCGT GACATCAAGG

TCCAATTCCA AAGTGGTGGT GCCAACTCGC CCGCCCTGTA CCTGCTCGAC GGCCTGCGCG CGCAGGACGA

CTTCAGCGGC TGGGACATCA ACACCCCGGC GTTCGAGTGG TACGACCAGT CGGGCCTGTC GGTGGTCATG

CCGGTGGGTG GCCAGTCAAG CTTCTACTCC GACTGGTACC TCGAT GGCCGGCTCG TCGGCAATGA TCTTGGCCGC

CTACCACCCC CAGCAGTTCA TCTACGCCGG CTCGCTGTCG GCCCTGCTGG ACCCCTCTCA GGGGATGGGG

CCTAGCCTGA TCGGCCTCGC GATGGGTGAC GCCGGCGGTT ACAAGGCCGC AGACATGTGG GGTCCCTCGA

GTGACCCGGC ATGGGAGCGC AACGACCCTA CGCAGCAGAT CCCCAAGCTG GTCGCAAACA ACACCCGGCT

ATGGGTTTAT TGCGGGAACG GCACCCCGAA CGAGTTGGGC GGTGCCAACA TACCCGCCGA GTTCTTGGAG

AACTTCGTTC GTAGCAGCAA CCTGAAGTTC CAGGATGCGT ACAACGCCGC GGGCGGGCAC AACGCCGTGT

TCAACTTCCC GCCCAACGGC ACGCACAGCT GGGAGTACTG GGGCGCTCAG CTCAACGCCA TGAAGGGTGA

CCTGCAGAGT TCGTTAGGTA CC AGCCCGCCTG CGGCAAGGCC GGTTGCCAGA CTTACAAGTG

GGAGACCTTC CTGACCAGCG AGCTGCCGGG GTGGCTGCAG GCCAACAGGC ACGTCAAGCC CACCGGAAGC

GCCGTCGTCG GTCTTTCGAT GGCTGCTTCT TCGGCGCTGA CGCTGGCGAT CTATCACCCC CAGCAGTTCG

TCTACGCGGG AGCGATGTCG GGCCTGTTGG ACCCCTCCCA GGCGATGGGT CCCACCCTGA TCGGCCTGGC

GATGGGTGAC GCTGGCGGCT ACAAGGCCTC CGACATGTGG GGCCCGAAGG AGGACCCGGC GTGGCAGCGC

AACGACCCGC TGTTGAACGT CGGGAAGCTG ATCGCCAACA ACACCCGCGT CTGGGTGTAC TGCGGCAACG

GCAAGCCGTC GGATCTGGGT GGCAACAACC TGCCGGCCAA GTTCCTCGAG GGCTTCGTGC GGACCAGCAA

CATCAAGTTC CAAGACGCCT ACAACGCCGG TGGCGGCCAC AACGGCGTGT TCGACTTCCC GGACAGCGGT

ACGCACAGCT GGGAGTACTG GGGCGCGCAG CTCAACGCTA TGAAGCCCGA CCTGCAACGG GCACTGGGTG

CCACGCCCAA CACCGGGCCC GCGCCCCAGG GCGCCTAG TAA ■ GGATCTCGTC GTTTTGTCGT TTTGTCGTTG

GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGGAATTCTG CAGATATCCA GCACAGTGGC GGCCGCTCGA GTCTAGAGTC

CT (Ag85A蛋白羧基端编码序列)

( 6) 核酸疫苗（HG85abK质粒）的配制与贮存: 方法与实施例 1相同。

实施例 3: 嵌合型结核杆菌核酸疫苗 HG85abA质粒或 HG85abK质粒的体外基因表达

采用 T_NT体外转录和翻译系统（Promega, Madison, WI, USA) 按照美国 Promega公司说明书的实验步骤，将每份 12.5 微升反应系统中含有 0.25 g HG85ab质粒 DNA和 9μ1 T_NT T7 快速反应母液， 30°C与每毫升含 400uCi [ S³⁵]标记的甲硫氨酸液孵育 90 分钟。将该嵌合基因表达的蛋白质（带有 [ S³⁵]放射性）作常规 10% SDS-PAGE电泳，用放射自显影法观察蛋白质泳动位置，显示所表达的嵌合蛋白分子量约为 40kDa，符合 Ag85a蛋白分子量（约 32kDa) 与 Ag85b片段（125-282氨基酸）分子量（约 18kDa) 之和。实施例 4: 结核杆菌嵌合基因 HG85abA或 HG85abK质粒接种小鼠诱导血清特异性抗体应答水平的测定（ELISA法）和 Th细胞相关细胞因子 mR A水平的检测（逆转录 RT-PCR法）

( 1 ) 材料和免疫方法

取 8周龄雌性 BALB/C小鼠随机分组，每组 6只，饲养在上海公共卫生中心的 SPF

( Specific Pathogen Free) 级动物房中。第 1 组（pVAXl-Ag85a单基因质粒），第二组 (pVAXl-Ag85b单基因质粒，上海海规生物科技有限公司制），第三组（HG85abA嵌合基因质粒）和第四组（HG85abK嵌合基因质粒）小鼠每次分别于胫前肌注射 10μ_§各质粒液，或各质粒与 0.25mg左旋咪唑的混合液，注射后立即用带电极的夹子夹住注射部位，用 WJ-2002活体基因导入仪（宁波新芝生物科技股份有限公司 )进行体内电转染（电压： 100 V；脉冲次数：正反各 6次；波宽： 60毫秒；间隔： 10毫秒）。每隔两周质粒免疫一次，共 3次。三次质粒免疫后第 10天经小鼠心脏穿剌采血分离血清 -20°C保存。

( 2 ) 常规 ELISA间接法检测各小鼠血清抗 Ag85a的 IgG亚类抗体的效价

以纯化的重组 Ag85a蛋白（1.25 g/mL) 4 °C包被 96孔酶标板（50μ1/孔）过夜，用 0.15M PBS-吐温 20洗涤 3次后每孔用 ΙΟΟμΙ 0.5%牛血清白蛋白封闭 1小时。洗涤 3次后各孔中分别加入 1 : 100小鼠血清的 2倍倍比（1 :200-1 : 102400)稀释液（50μ1/孔） 37°C 孵育 2小时。洗涤后分别加入 1 : 10,000稀释的碱性磷酸标记羊抗小鼠 IgGl或羊抗小鼠 IgG2a抗体（Sigma, Cat#A3688 ) 37°C孵育 1.5小时。再经洗涤后加入底物液显色， 30分钟后加入 3M NaOH终止反应用酶标仪作 OD_4Q5nm检测。结果见表 1。

( 3 ) RT-PCR检测相关 Th细胞因子 mRNA的表达

小鼠心脏穿剌采血后无菌取各小鼠双腹股沟淋巴结同组合并，分离淋巴细胞。各组取等量淋巴细胞以 TRIzoL试剂提取总 RNA，各取 4μ1 RNA在同样条件下进行逆转录，然后取获得的各 cDNA 5^用以下三对特异性引物作 PCR扩增，反应条件为： 94 °C变性 5 min; 94 V 45s 、 55 °C退火 1 min， 72 V 延伸 1 min，共 35轮循环。各取 12μ1 ΡΟ 扩增产物作琼脂糖凝胶电泳，用天能公司成象系统拍摄和作相对定量处理。所述引物序列为：扩增管家基因（GAPDH) 的上下游引物：

5' -CTGCACCACCAATGCTTAG-3' (序列 9) 禾口

5' -GTCTGGGATGGAAATTGTGA-3' (序列 10)

扩增 IL-4基因的上下游引物：

5， — TCCACGGTAGCGACAAAAAT-3' (序列 11) 禾口

5' -TGAAATCCAGGCATCGAAAAG-3 ' (序列 12)

扩增 IFN- Y基因的上下游引物：

5， -TCTGAGACAATGAACGATAC-3 ' (序列 13) 禾口

5' -GGACCTGTGGGTTGTTGA- 3' (序列 14)

将得到的 IL-4基因与 IFN- Y 基因 mRNA表达量与 GAPDH基因表达量作比较，并求得二者比值，结果见表 2。

表 1: 不同结核杆菌基因质粒疫苗接种及相应蛋白质疫苗加强后小鼠血清结核杆菌

表 2：各组免疫小鼠淋巴细胞 Th分型细胞因子 mRNA的表达水平与比值细胞因子左旋咪唑免疫用的核酸疫苗质粒

Ag85a Ag85b HG85abA HG85abK

IFN-y/GAPDH 不用 0.25 0.24 0.30 0.29

用 0.30 0.29 0.36 0.34

IL-4/ GAPDH 不用 0.18 0.18 0.19 0.19 用 0.13 0.13 0.12 0.13

IFN-y/IL-4 不用 1.38 1.33 1.57 1.52

比值用 2.31 2.23 3.00 2.61 小鼠的 Thl细胞免疫应答主要产生 IFN-γ和 IgG2a抗体， Th2体液免疫应答主要产生 IL-4和 IgGl抗体，因此疫苗免疫产生的特异性 IgG2a/IgGl抗体水平及 IFN-_Y/IL-4细胞因子二者的比例可反映其主要诱导那种免疫应答。从表 1可见，单单三次质粒疫苗接种各诱导产生了 IgG2a抗体 / IFN-Y细胞因子，其效价比产生的 IgGl抗体 /IL-4细胞因子高约 1.3-1.5 倍，这正是核酸疫苗主要诱导 Thl细胞免疫应答的特征。加 Thl型佐剂左旋咪唑后，诱导产生 Thl免疫应答（抗体 IgG2a)更高，这二种比值提高到约 2.2-3.0倍，与左旋咪唑佐剂主要增强细胞免疫相符。这 4种质粒中，二种 HG85ab嵌合基因质粒诱导细胞免疫应答的能力差不多，都比另二种单基因质粒高。分析认为这可能是 HG85ab嵌合基因表达的嵌合蛋白中含有诱导 IFN-γ和 IL-2的表位从而增强了诱导 Thl细胞免疫应答的能力所致，这正是治疗结核病所需要的。实施例 5: 用 HG85ab质粒核酸疫苗治疗耐药结核杆菌感染的小鼠

( 1 ) 感染菌株的选择与小鼠攻击用菌量: 按《结核病诊断细菌学检验规程》进行分枝杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验，选择表 3所示高耐利福平、低耐异烟肼的临床分离结核分枝杆菌 HB361菌株。表 3.药物敏感试验

药物名称和药物终浓度

菌株

利福平 RFP ( μ_δ/πι1 ) 异菸肼 ΙΝΗ ( μ_δ/πι1 )

名称无药对照

50 250 1 10

HB361 生长生长生长生长不生长将用改良罗氏鸡卵培养基培养生长良好的结核分枝杆菌 HB361 菌株用玻璃研磨器研磨成细菌悬液，用生理盐水配制 3 mg/ml悬浮液后，作 10倍系列稀释，将 10 10_²、 10_³、 10— ⁴菌液各取 0.1ml接种于 2支改良罗氏鸡卵平皿培养基 37°C培养 4周作菌落计数。动物为从军事医学科学院购进有合格证的体重 17-19g、 6-8周龄雌性 Balb/c小鼠。经动物实验室喂养 1天后进行攻击，所用的 HB361细菌悬液每毫升含有 5.5xl0⁵CFU，每只小鼠尾静脉注射 0.4ml，即每只小鼠攻击菌量为 2.2xl0⁵CFU (见表 4)。表 4.结核分枝杆菌 HB361菌株悬液菌落计数结果

( 2) 动物实验分组: 小鼠称重后，随机分为以下 7组，每组 10只。细菌感染后第 3 天开始治疗，每只小鼠双侧胫前肌各注射：（A)生理盐水组：注射生理盐水 100μ_β/100μ1。 (B) pVAXl空载体组：注射 pVAXl空载体质粒 100μ /100μ1。（C) 利福平（RFP) 治疗组：沈阳红旗制药有限公司 RFP胶囊 1粒药粉加水 187. 5 ml溶解，利福平浓度为 0. 8mg/ml, 每天每公斤体重 20mg (0. 02mg/g) 给药，小鼠按 20克计算，每只小鼠每天喂利福平 0. 4 mg/0. 5ml一次。（D)单纯 Ag85a核酸疫苗治疗组：注射 Ag85a质粒 100μ /100μ1。（Ε) 单纯 HG85abA核酸疫苗组：注射 HG85abA嵌合基因质粒 100μ /100μ1 (F) RFP+Ag85a核酸疫苗治疗组：注射核酸疫苗 Ag85a质粒 100μ /100μ1，同时给予上述剂量利福平。

(G) RFP+HG85abA质粒治疗组：注射 HG85abA质粒 100μ /100μ1，同时给予上述剂量利福平。 (H) RFP+HG85abK质粒治疗组：注射 HG85abK质粒 100μ /100μ1，同时给予上述剂量利福平。各质粒每隔 12天注射一次，肌肉注射的深度为 2mm，共 5次。利福平治疗共 50天。

(3) 治疗效果观察指标: 观察小鼠体重变化；记录实验期间小鼠死亡数、死亡率；实验结束时处死小鼠，取肺、肝、脾测重量指数，观察记录大体病理变化；解剖肉眼观察各组小鼠肺和脾有无水肿、萎缩、病变，病变的严重程度及范围，并取小鼠肺右叶固定于 10% 中性福尔马林，石蜡包埋切片，苏木精 /伊红（HE) 染色后，镜下观察肺组织病理改变。

将左肺和脾各以 3ml和 2ml生理盐水研磨成组织悬液，如下作残留活菌培养计数 (CFU)：取肺组织悬液加等体积 6% NaOH消化 30分钟，脾悬液不用消化。然后各用生理盐水制成 10— ²、 10—³、 10— ⁴系列稀释液，各取 0. 1ml接种含两性霉素 B的改良罗氏鸡卵培养基平皿，每个稀释度接种 2个平皿， 37°C培养 4周后计数菌落平均数。将得到的肺左叶菌落数根据肺左叶和全肺的重量，脾的上半部分的菌落数根据其重量和全脾的重量换算为全肺或全脾菌落数。

应用 SAS 6.12软件处理数据，定量资料用单因素方差分析，两两比较用 ^检验，进行统计学分析。

(4) 结果:

各组小鼠体重增长缓慢，组间无显著差异，各组小鼠无死亡。停止治疗后 3周处死小鼠，各组肺、脾重量及重量指数（脏器重量除以小鼠体重）之间无显著差别（Ρ>0.05 )。病理学检查，小鼠单用结核杆菌 HB361菌株攻击后 8周，肺组织充血、肺实变严重而广泛，正常肺泡结构破坏消失，有结核肉芽肿和大片干酪样坏死，肺泡腔内有大量浆液纤维素渗出，少量淋巴细胞浸润，全肺平均荷菌量为 2.0 X 10⁶CFU; 全脾平均荷菌量为 6.8 X 10⁵ CFU, 表明成功建立了小鼠结核病模型。

各组小鼠肺组织病理变化如下：对照的 A、 B和 C三组小鼠肺组织病理学变化基本如单用结核杆菌 HB361菌株攻击的小鼠，都有肺组织充血、正常肺泡结构破坏消失，肺实质病变严重而广泛，有结核肉芽肿和干酪样坏死； B组肺病变比 A组轻，尚存有部分正常肺泡结构； C组肺充血渗出肺实质病损比 A组还重。

用构建的含结核杆菌基因的质粒和 /或药物治疗的 D、 E、 F、 G和 H组小鼠大部分区域肺泡结构正常，肺泡轮廓清晰，肺组织病变局限，可见数量不同的由类上皮细胞、多核巨细胞、泡沫细胞和淋巴细胞组成的结核肉芽肿，无干酪样坏死灶或少，呈点状分布范围局限。表明均有不同程度的治疗效果（代表性肺组织切片病理检查见图 5的 A-H，图 5的最后一幅图是小鼠的正常肺组织，可见清晰的肺泡结构）。

各组小鼠肺组织结核病变和肺脾结核杆菌培养计数见表 5。

表 5.各组小鼠的肺部结核样病变，肺脾组织细菌培养计数

从以上结果可见，单用利福平治疗对耐药菌感染无效，肺脾结核杆菌最多。单用 Ag85a 质粒或 Ag85ab质粒治疗鼠的肺脾结核杆菌数均减少约一半，基本无干酪样坏死灶、病灶范围最小。利福平加 Ag85a质粒或加 HG85abA质粒联合治疗效果最好，肺脾结核杆菌数比单用利福平减少了 80%左右，但二者无统计学差异。表明核酸疫苗对治疗耐药结核杆菌感染有效，联合抗痨药效果更好。

现已通过具体实施方式描述了本发明，显然本领域其他技术人员知道可在不背离本发明的思路和范围条件下设计出其它实施方式和作出各种变化，但所有这些实施方式和相等的变化均包括在本发明附件权利要求书所述的范围内。

Claims

权利要求书

1.一种嵌合基因，包含序列 1所示编码结核杆菌蛋白 Ag85a的基因和序列 2所示编码结核杆菌 Ag85b 蛋白 125-282位氨基酸序列片段的基因，其中所述编码 Ag85b 蛋白 125-282位氨基酸序列片段的基因嵌合在 Ag85a基因的序列中，嵌合位点为 Ag85a基因的第 245-250位限制性内切酶 Kpn I识别序列和 /或第 430-435位内切酶 Acc I识别序列。

2. 一种嵌合型结核杆菌基因疫苗，其特征在于：包含权利要求 1所述的嵌合基因，所述嵌合基因连接于真核表达载体中。

3. 如权利要求 2所述的嵌合型结核杆菌基因疫苗，其中所述真核表达载体为 JW4303 , 或 pcDNA3.1，或 pVAXl系列。

4. 如权利要求 2所述的嵌合型结核杆菌基因疫苗，其中所述真核表达载体为 pVAXl 系列。

5. 权利要求 2所述嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(2) 分别用带有内切酶 Kpn I识别序列的引物对，或带有内切酶 Acc I识别序列的引物对，通过聚合酶链反应扩增编码 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列的 DNA片段；

(3 ) 用连接酶分别连接步骤（1 ) 的去磷酸化线性 Ag85a基因载体与步骤（2) 的编码 Ag85b蛋白 125-282位氨基酸序列的 DNA扩增片段，获得含 Ag85ab嵌合基因的质粒载体疫苗。

6. 权利要求 5所述嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法，其中所述的引物对为序列 3所示的引物 P1和序列 4所示的引物 P2。

7. 权利要求 5所述嵌合型结核杆菌基因疫苗的制备方法，其中所述的引物对为序列 6所示的引物 P3和序列 7所示的引物 P4。

8. 权利要求 2所述嵌合型结核杆菌基因疫苗在制备预防和治疗结核病药物中的应用。

9. 如权利要求 8所述的应用，其中所述结核病是耐药结核杆菌感染的结核病。

10. 如权利要求 8所述的应用，其中所述嵌合型结核杆菌基因疫苗是单独使用或与抗结核药物联用。

11. 如权利要求 8所述的应用，其中所述嵌合型结核杆菌基因疫苗在应用中加佐剂。

12. 如权利要求 11所述的的应用，其中所述佐剂是左旋咪唑。