CN1745848A

CN1745848A - 壳聚糖－海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球及制备方法

Info

Publication number: CN1745848A
Application number: CN 200510057193
Authority: CN
Inventors: 邹全明; 王毅超; 毛旭虎; 郭刚; 任建敏; 朱永红; 童文德
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2005-07-29
Publication date: 2006-03-15
Anticipated expiration: 2025-07-29
Also published as: CN100368019C

Abstract

本发明属于生物制药领域，特别涉及一种壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球及制备方法。该微球包括幽门螺杆菌全菌蛋白与可生物降解天然高分子物质壳聚糖、海藻酸钠，经过乳化、固化、重悬等微球制备工艺制成壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球。本发明以Hp全菌蛋白为包裹物，制备出适合于肠道靶向给药的微球制剂，为研制高效、缓释、靶向的Hp疫苗提供了依据。

Description

壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球及制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，特别涉及一种以壳聚糖、海藻酸钠为主要材料包裹幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)全菌蛋白抗原，制备Hp疫苗的方法。

背景技术

幽门螺杆菌Hp是导致人类胃溃疡、胃炎乃至胃癌等消化道疾病的最主要致病菌。自1983年Warren教授发现Hp以来，人们围绕其疫苗制剂学开展了大量研究并取得了一定的进展。

随着蛋白组学研究的逐步深入，越来越多的蛋白药物在诊断、治疗或作为疫苗预防各种疾病方面发挥着重要作用。与小分子药物相比，此类药物稳定性差、易被酶降解、生物半衰期短，而扩散差、分配系数小的蛋白药物，难以通过生物屏障及脂质膜。所以，如何将这类生物物质有效的投递到人体相应部位，一直是制剂研究的热点问题。

目前，蛋白药物尤其是疫苗类药物多以注射用溶液或冻干粉针剂应用于临床，但常需频繁给药且操作不便，病人不易接受，有一定的微创性，治疗费用高。而口服途径以服用方便、病人依从性好且有效等特点成为研究的热点。Johansson等通过系统比较几种Hp疫苗给药途径所引起的免疫效果发现，直接口服优于注射、直肠免疫、鼻腔免疫等其它途径。

口服给药途径也有明显不足，主要表现在胃肠道环境异常复杂，尤其胃部强酸性环境对抗原物质有较大破坏，要达到相同的免疫效果必须增大免疫剂量且增加免疫次数，这对于蛋白及多肽类药物的制备、开发及应用具有较大困难。

研究表明以可降解高分子材料为载体的缓释微球(MS)制剂在蛋白类药物的给药途径，尤其是在口服给药途径中其具有明显优势：(1)保护抗原：在口服给药时，MS可以有效防止胃酸以及消化道酶类物质对抗原的分解及破坏作用，保持抗原物质的整体稳定性及抗原活性；(2)靶向性：MS粒径大小决定了其在体内各器官的分布。人为把握MS制作工艺，将其粒径控制在一定范围之内并定向诱导其被靶器官俘获，从而最大限度的发挥其免疫效力。(3)长效缓释作用：包裹抗原时，人们可以通过改变载体材料与抗原的配成比例、调节载体材料的生物降解作用，从而改变MS的制作孔径以及抗原物质和MS的粘附作用，达到长期缓释抗原的功效。Kidane通过口服MS后发现其主要分布在肝、脾和肠系膜淋巴结等部位，在唾液、胃肠道、阴道和鼻内均可检测到分泌型IgA和IgG抗体，且可显著提高肺中IgG水平。可见MS在口服制剂中具有明显的优点。

在以往的微球制备中，其主要材料多沿用半合成或合成的高分子材料，以人工合成的高分子物质为原料制备MS具有以下特点：(1)材料本身制备比较繁琐，即来源缺乏。(2)MS制备过程中常常需要加入大量的有机试剂。(3)常需高温等比较复杂的制备环境。(4)疏水性强，与亲水性抗原亲和性差。(5)降解过程中MS内部呈现局部酸性环境。因此，人工合成高分子材料一般应用于包裹化学药物而不适用于蛋白或多肽类药物的体内投递。

发明内容

本发明的目的，是提供一种用壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球(HpWCP-CAMS)及制备方法。它采用Hp全菌蛋白为包裹物，制备出适合于肠道靶向给药的微球制剂，为研制Hp疫苗提供了依据，微球工艺的改善对于药物尤其是蛋白质药物的投递提供了新的方法。

幽门螺杆菌全菌蛋白与药物上可接受的可降解天然高分子物质的载体组成微球。可降解天然高分子物质的材料有壳聚糖、海藻酸钠、淀粉、明胶、白蛋白、透明质酸纳等，其中优选壳聚糖和海藻酸钠。

壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球的制备方法，包括以下步骤：

(1).抗原制备

取幽门螺杆菌菌株，微需氧条件下培养后收集细菌，加入甲醛溶液灭活，超声碎菌，离心收集，测定蛋白抗原浓度；

(2).壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球的制备

取步骤1中所得蛋白与2％海藻酸钠溶液混匀，加入植物油，植物油与海藻酸钠乳液的比例为2∶8。乳化后，反向滴定方法滴入到CaCl₂溶液中，速度为500～1000r/min搅拌，形成海藻酸钠包裹蛋白微球剂，将得微球固化后洗涤，离心取沉淀物后重悬；再将其加入到壳聚糖溶液中，形成再包裹得到壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球。

所得壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球的制备方法平均粒径为0～10μm。

本发明选取的海藻酸钠、壳聚糖都是天然高分子物质，易得、无毒且生物相容性强，降解产物可被机体充分吸收。其中：

海藻酸钠是从海带或海藻中提取的一种天然高分子钠盐，相对分子质量7-15万，不仅具有可调节性、生物相容性、缓释性、安全性等诸多特点，并且将其作为主要材料制备口服蛋白疫苗缓释MS具有以下优点：在口服药物中加入可增大粘度，延长药物的释放时间，减少不良反应；有生物粘附性、无毒、有良好的生物相容性，易粘附在湿润组织上；能明显促进粘膜下巨噬细胞的吞噬功能，增强体液免疫，促进淋巴细胞转化；利用MS的溶胀对pH值的依赖性，使得该制剂在胃中不溶胀，不崩解，而在肠道的中性或稍碱性环境中崩解，适用于肠道粘膜给药系统；我国海洋资源丰富，AGS的产量居世界前列，将其开发为缓释材料有丰富的物质基础和广阔的前景。

壳聚糖CTS是甲壳素脱乙酰产物，是自然环境中存在的唯一碱性多糖，由于其有粘膜粘附性和对上皮细胞的紧密连接通道的调节作用，因此有口服粘膜给药的特点：可延长药物在消化道内的滞留时间，延缓药物的释放，提高消化道粘膜通透性；携带大量的氨基，具有一定的抗酸性，可抑制质子向粘膜的扩散，起到保护胃肠粘膜的作用；能有效地抑制人工胃液和人工肠液中的酶的活性，使蛋白类物质在胃肠道免于被降解；在体外对Hp有抑菌作用，在酸性条件下其抑菌作用明显加强；具有抗菌作用、中和胃酸、调节免疫功能和增强抗菌药作用；促进药物吸收的作用。

本发明用壳聚糖、海藻酸钠为主要材料制备微球，海藻酸钠荷负电，壳聚糖荷正电，两者可通过静电相互作用形成MS，对包载物的性质没有影响，可以有效避免原有微球制备工艺中所用的有机溶剂以及高温制备环境，减少了蛋白药物的损失率。

在微球的制备中，所得的微球粒径大小决定了其在体内各器官的分布。当微球粒径≤10μm时，微球易定向于派伊尔结(Peyer’s Patches，PP结)；粒径≤5μm的微球弥散性分布于肠系膜淋巴结、血液循环系统和脾的巨噬细胞内产生LgG；而＞5μm的微球滞留在富含B细胞的PP结内，受抗原物质致敏的B细胞迁居于各种粘膜组织，从而诱导机体产生全身或局部的粘膜sIgA抗体产生。因此，将其粒径控制在一定范围之内有助于最大限度的发挥其免疫效力。本发明的诱发肠道粘膜免疫为主要目的的Hp疫苗平均粒径为3.33μm，适合于肠道靶向给药，是效果良好的疫苗微球制剂。

本发明以海藻酸钠与壳聚糖为MS制备时的水相，对蛋白无任何破坏的植物油为油相包裹的幽门螺杆菌全菌蛋白(HpWCP)。选用2％作为AGS浓度，其具有良好的流动性、溶解性，粘稠度也比较低，其作为内水相所制备的MS具有较好的稳定性，粒径符合要求。用天然植物油作为的油相，使其制备工艺简单、易得、在体内可降解而被机体直接吸收，有不会对蛋白物质造成任何破坏的优点。MS制备中油相的加入会更进一步加大液体的粘稠度，其比例越高，所制备MS的粒径越大。

本发明所包裹的抗原为蛋白物质，具有明显的亲水性。选用2∶8的油水相比例，油相体积分数利于MS的多孔性，使一些在自身分子间存在的交联及吸引作用减弱，液体流动性好、粘稠度相对较低。采用反向滴定，当乳滴迅速进入到CaCl₂溶液时，由于剪切力及搅拌作用，其可被溶液中存在的大量水分子迅速隔离并充分扩散开，使MS相互之间不能形成粘连，从而形不成沉淀物。

本发明的实验结果表明，制备MS粒径影响的因素是：搅拌速率、药物浓度、制备温度以及搅拌时间。由于随着搅拌速率的增加，液体分子间的剪切力增大，打断分子间的某些交联，另外外界对溶液做的功也随之增加，其中一部分会转化为MS的表面能，由于乳滴越小其表面能越大，乳滴越趋于稳定，所以MS粒径随着搅拌速率的增加而减小。随着蛋白浓度的增大，分子间的粘连也会随之增强，MS的包封率也会升高。因此本发明制备MS的最佳的工艺参数是：搅拌速率800rpm、药物浓度为2mg/mL、制备温度25℃、搅拌时间30min。

采用本发明方法制备的MS，释药时间可达到20d左右，具有很好的缓释功能。

本发明微球释药所应用的人工胃液及人工肠液的配制参见卫生部《生物制品检定规程》，采集时间参照人体生理参数。微球工艺的改善对于药物尤其是蛋白质药物的投递提供了新的方法。

附图说明

图1为微球冻干前形态；

图2为冻干后微球形态；

图3为微球冻干品复溶后形态；

图4为微球电镜扫描照片；

图5为微球粒径分布图；

图6为Western Blotting检测加速稳定性试验前后蛋白抗原性结果。

具体实施方式

材料的准备：

1.菌株

M13菌株[M13为临床分离并保存的Hp菌株，毒素相关抗原A(cytotoxin-associated antigen A，cagA)阳性和空泡毒素A(vacuolating cytotoxinA，vacA)阳性，经蒙古沙鼠反复感染驯化后传代保种，为动物高感染适应株。

2.实验动物

BALB/c小鼠：6-8周龄，体重18-22g，由四川大学实验动物中心提供，动物质量合格证号：医动字第24101110号。

3.主要试剂

(1)脑心浸液(参照胡伏莲主编《幽门螺杆菌感染的基础与临床》p240-241

(2)Hp培养基

Hp固体培养基：脑心浸液45％，琼脂粉1.5％，5％葡萄糖，0.5％抗生素混合液和5％绵羊全血。

实施例1制备壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球

1.取Hp菌株M13，脑心浸液培养基微需氧环境(温度：37℃；湿度＞95％)培养24h，0.05M磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)洗涤6次，5000r/min 4℃离心10min收集细菌，加入5％甲醛溶液灭活24h。200W×30s×10次超声碎菌，15000g4℃离心20min收集上清，Lowry法测定抗原浓度。

2.HpWCP-CAMS的制备

在室温下，将实施例1中制备的Hp全菌蛋白与2％的海藻酸钠溶液混匀，加入植物油，植物油包括大豆油、菜子油、花生油、芝麻油等。植物油与海藻酸钠乳液的比例为2∶8，8000r/min乳化10min后逐滴滴入到CaCl₂溶液中，800r/min搅拌30min后，形成O/W乳液，离心取沉淀物洗涤后重悬。将悬液加入到1％浓度的壳聚糖溶液中，800rpm×30min搅拌完成再包裹制备出壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球HpWCP-CAMS。

实施例2壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球的检测

将上述制备微球蒸馏水离心洗涤3次后收集，真空冷冻干燥后备检。

1.HpWCP-CAMS形态的检测

1)MS的冷冻干燥

将得到的微球混悬液缓慢倒入玻璃平皿中，液面高度低于1cm。-40℃冰箱预冻12h后直接置于已预冷的真空干燥机内干燥，并缓慢提升温度使水分迅速升华，待气体压力指示计显示无气体生成时取出冻干品待检。

2)MS干燥前后的形态观察

分别取洗涤离心后MS、冻干粉以及冻干粉复溶物微量涂于载玻片上，光镜下观察其冻干前后微球形态变化，参见图1，图2，图3，离心洗涤后的微球大小形态规则；冻干后则呈不规则分布，形态呈现出杆状、梭状以及扁圆状等诸多不规则形状；而用等量蒸馏水复溶后镜下可见微球数量以及形态基本恢复冻干前原有特征。

3)MS的扫描电镜(SEM)观察

取微量洗涤后的MS涂于盖玻片上，室温下自然干燥，按常规的方法对标本进行处理，扫描电镜观察MS形态。

4)MS的粒径分布

应用粒径分布仪进行检测，参见图4和图5。所制备MS表面饱满、大小均一，平均粒径为3.33μm。

结论：采用冻干技术所得的产品具有很好的稳定性，MS在冻干前后的蛋白含量、包裹效率、释药时间、表面特征等指标均未见明显变化。

2.蛋白包封率

取20mg冻干后微球称重，溶解于PBS(pH＝7.2，浓度0.5M)中，振荡器上破碎过夜，低温高速离心去除壳聚糖、海藻酸钠残渣，取上清，采用BCA法测定Hp全菌蛋白含量，计算微球的蛋白包裹率及蛋白包裹效率。

蛋白包裹率＝M_测/MS总质量×100％；

蛋白包裹效率＝M_测/M_总×100％

(上述公式中M_侧为微球中检测所得的理论蛋白含量；M_总为制备前加入的总蛋白量)

3.HpWCP-CAMS毒性试验

(1)体外毒性试验

采用MTT比色法测定HpWCP-CAMS对Hela细胞的毒性。结果表明，所制备的HpWCP-CAMS在浓度为5mg/mL，加入量为125μL、作用时间72h条件下对Hela细胞仍无毒性。

(2)体内毒性试验参照《中国生物制品规程》相关规定进行^[53]

1)急性毒性试验：将小鼠经口灌喂壳聚糖-海藻酸钠包裹的幽门螺杆菌全菌蛋白微球，灌喂体积为0.5mL/20g鼠重，观察1周内动物均无中毒症状及死亡情况发生。

2)异常毒性试验：将小鼠腹腔注射0.5mLMS(含MS量为480μg)，7天后观察小鼠生存状况良好，并无异常反应产生，体重较实验前有所增加，结果见表1。

表1 HpWCP-CAMS异常毒性试验结果表

Tab1 The results for Abnormal Toxicity of HpWCP-CAMS

	小鼠一般状况
	小鼠一般状况			健存情况	异常反应	体重(g)
实验前	实验后					体重(g)
实验前	实验后	I	健存			无	18.2	18.9

IIIIIIVV

健存健存健存健存

无无无无

18.919.218.519.3

19.320.219.419.9

(3)HpWCP-CAMS稳定性实验结果

1).加速稳定性试验：壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球冻干制剂在考察期间各项指标均符合检验要求。受试MS冻干制剂在不同的检验时间内表面特征均为疏松白色粉末状物质，溶解性良好，溶解后无沉淀出现，水份含量符合冻干制剂要求(＜3％)，蛋白含量与试验前没有明显差异(p＞0.05)。参见图6，保存6个月后MS内所包裹HpWCP仍能与兔抗Hp血清发生免疫反应，条带清晰，显示其仍具有良好的免疫反应性。

2).壳聚糖—海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球稳定性试验

SDS-PAGE电泳及Western blotting测定HpWCP-CAMS中蛋白成份降解程度及抗原反应性，实验方法按《精编分子生物学实验指南》进行。受试MS冻干制剂在不同的检验时间内表面特征均为疏松白色粉末状物质，溶解性良好，溶解后无沉淀出现，水份含量符合冻干制剂要求(＜3％)，蛋白含量与实验前没有明显差异(p＞0.05)。保存12个月后HpWCPHpWCP-CAMS仍能与兔抗Hp血清发生免疫反应，其仍具有良好的免疫反应性。

结论：

以HpWCP为抗原成分制备出平均粒径为3.33μm、包裹率30.7％、包封率63.5％的HpWCP-CAMS，体外释药时间显示其具有长达20d的缓释周期，靶向实验表明其主要被肠道粘膜组织摄取并诱发免疫反应，实验显示其具有很好的抗酸性，并且对被包裹蛋白有良好的保护作用，毒性试验符合相关规定，致敏淋巴细胞增殖实验结果表明其能有效诱导小鼠体内的淋巴细胞致敏并且能维持较长时间。

本发明通过实验测定了MS的无毒性及稳定性。测定结果表明冻干品在冻干前后对其所包裹的HpWCP的稳定性及抗原活性均没有明显影响，因此MS具有很好的稳定性。毒性试验中，无论是体外试验还是体内试验，受试细胞或动物均未出现明显的中毒症状，其各项检测指标均符合相关法规要求，因此MS产品符合药物制剂的基本要求。

在致敏淋巴细胞增实验中，小鼠口服壳聚糖-海藻酸钠包裹的幽门螺杆菌全菌蛋白微球后2w，外周血淋巴细胞就已经对抗原物质致敏并具备了很好的增殖活性，说明此时MS已在PP结、脾脏等相关淋巴组织释放抗原物质并激发免疫细胞产生相应的应答。

Claims

1.一种壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球，其特征在于：包括幽门螺杆菌全菌蛋白与药物上可接受的载体组成微球。

2.根据权利要求1所述的壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球，其特征在于：载体的制备材料为可生物降解天然高分子物质。

3.根据权利要求1所述的壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球，其特征在于：本微球适宜口服给药途径。

4.一种制备壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球的方法，包括以下步骤：

(1).抗原制备

(2).壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球的制备

取步骤1中所得蛋白与2％海藻酸钠乳液混匀，加入植物油，其植物油与海藻酸钠乳液的比例为2∶8；乳化后，反向滴定方法滴入到CaCl2溶液中，速度为500～1000r/min搅拌，形成海藻酸钠包裹蛋白微球剂，将得微球固化后洗涤，离心取沉淀物后重悬；再将其加入到壳聚糖溶液中，形成再包裹得到壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球。

5.根据权利要求4所述的壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球的制备方法，其特征在于：所得壳聚糖-海藻酸钠包裹幽门螺杆菌全菌蛋白微球的平均粒径为0～10μm。