CN1919181A

CN1919181A - 两亲性荧光靶向纳米胶束及其制备方法

Info

Publication number: CN1919181A
Application number: CN 200610116045
Authority: CN
Inventors: 任杰; 李航; 袁华
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2006-09-14
Filing date: 2006-09-14
Publication date: 2007-02-28
Anticipated expiration: 2026-09-14
Also published as: CN100434120C

Abstract

本发明属于化学药物技术领域，具体公开了一种两亲性荧光靶向纳米胶束及其制备方法。本发明的两亲性荧光靶向纳米胶束，是以一种生物可降解聚酯和多氨基聚合物共聚，合成两亲性药物载体；采用溶剂挥发法制备纳米尺度的载药胶束，所包裹的药物为疏水性或者略水溶性抗肿瘤药物；温和条件下，将靶向分子叶酸接枝到表面含有氨基的胶束上；用表面剩余氨基接枝异硫氰酸荧光素。本发明通过两亲性载体制备荧光靶向纳米胶束，稳定性能好，并且以叶酸受体介导、荧光素示踪实现并证实靶向给药，既可提高药效和特异性，又可降低药物的毒副作用。

Description

两亲性荧光靶向纳米胶束及其制备方法

技术领域

本发明属于化学药物技术领域，具体涉及一种两亲性荧光靶向纳米胶束及其制备方法。

技术背景

近几年，研究表明聚合胶束可用作难以溶于水的药物的潜在载体，M.Jones等已进行了聚合胶束的制备、表征鉴定和药物应用的尝试。聚合胶束在两个主要方面提供了吸引特性：(1)可以在疏水内核中溶解疏水性药物或者水略溶性药物；(2)可以避免药物在体外被RES(网状内皮系统)或MPS(吞噬细胞系统)吸收。

尽管胶束体系似乎是最有利的运送难溶于水的药物的载体的一种，但是他们在灌输液或体液中的稳定性使得问题依然存在。X.Zhang等报道了聚丙交酯和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的二嵌段共聚物具有紫杉醇载体的用途。由于在该制剂中使用的物质是无毒的，并且它们的水解产物很容易地从身体排除。

EP03970307A2公开了一种AB型两亲二嵌段共聚物的聚合物胶束，该共聚物包含作为亲水性组分的聚氧乙烯和作为疏水性组分的聚(氨基酸)，其中治疗活性药物化学性地连接在该聚合物的疏水性组分上。然而，虽然该聚合物胶束可作为给药疏水性药物的一种手段，但其也有不利之处：即需要在嵌段共聚物中引入官能团。EP0583955A2公开了一种在EP03970307A2中描述的二嵌段共聚物胶束中包覆疏水性药物的方法。这种方法解决了上述需引入官能团的不利之处。EP0520888A1公开了一种由聚乳酸和聚(烯化氧)嵌段共聚物制成的纳米级颗粒，该纳米级颗粒显示出降低被网状内皮系统的吸收。

传统的制备胶束的两亲性载体，除疏水组分为可降解的高聚物外，亲水性组分多为聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯(PEO)等，但是合成载体的过程较复杂，并且无法有效引入较多活性端基以方便进一步功能化。

近年来，靶向药物投递系统作为治疗肿瘤和癌症的重要手段之一成为了学者们研究的重点，它既可以解决现有药物选择性不强致使药物分布在全身各个器官问题，又可以提高药物活性，降低药物毒副作用。要提高肿瘤的治疗效果，需要提高药物的肿瘤选择性，减少其在非靶部位的聚集。理想状态下药物的靶向性不受给药方法和部位的影响，可避免一些病人顺从性差、操作不方便的给药方式，还可以减少药物剂量和降低了治疗成本，此外药物靶向性使在靶部位局部的药物浓度增大。

随着肿瘤分子水平研究的不断进展，主动靶向药物投递系统成为近年来的一大热点。在肿瘤细胞表面或肿瘤相关的血管表面发现了一系列受体，它们与肿瘤生长增殖密切相关并在肿瘤组织过度表达，这些肿瘤特异性的受体为肿瘤治疗提供了靶点，比如：叶酸受体在某些肿瘤组织处就会过度表达，而在正常组织处则呈低水平表达或不表达。

叶酸(folic acid，FA)又名维生素B₁₁，结构式见上图，是一种分子结构中含有喋呤环的小分子维生素，为真核细胞单碳代谢核苷合成所必需，其结构一端含有两个羧基，它在生理温度和pH条件下被动扩散到细胞膜的可能性较少。基体主动摄取叶酸的途径有两种：第一种机制是通过低亲和力的叶酸结合蛋白，直接将叶酸导入胞浆；第二种机制是通过高亲和力的特异性叶酸结合蛋白，即叶酸受体(Folate Receptor，FR)介导细胞内化，将叶酸摄入胞浆。制备以叶酸为“靶弹头”的药物，具有转移效率高和靶向性投递的特点。

异硫氰酸荧光素Fluorescein isothiocyanate(FITC)，是荧光素衍生物的一种，5-FITC较6-FITC更经常使用。FITC的异硫氰酸基能与氨基反应，可用于标记氨基修饰DNA，一旦形成，产物极为稳定。适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em＝492/519nm(pH＝9.0)。FITC可用作示踪分子，在细胞实验或动物实验中，借助荧光显微镜，直观显示标记物的位置，成为表征靶向的最直接手段。

发明内容

本发明的目的在于提出一种具有生物相容性和降解性的可以长期安全释药的两亲性荧光靶向纳米胶束及其制备方法。

本发明提出的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，以疏水性组分生物可降解聚合物和亲水性组分聚乙烯亚胺(PEI)共聚物为胶束载体，采用溶剂挥发法将疏水性或略水溶性抗肿瘤药物包裹在胶束内，借助胶束表面氨基，将靶向分子叶酸和示踪荧光物质接枝到胶束表面，得到两亲性荧光靶向纳米胶束，具体步骤如下：

(1)制备两亲性聚合物载体

活化的疏水性生物可降解聚合物(如聚乳酸(PLA))和聚乙烯亚胺(PEI)溶于有机溶剂中，胺解1～12hr，得到两亲性聚合物生物可降解聚合物-聚乙烯亚胺。当聚合物为PLA时，反应方程式如下：

这里n为[ ]中聚合物的聚合度，n为50-10000。

(2)制备两亲性纳米载药胶束

将步骤(1)所得的两亲性聚合物溶于有机溶剂中，聚合物在有机溶剂中的重量浓度为1％～10％，将疏水性或略水溶性药物溶解于或者悬浮于上述有机溶剂中形成油相，药物在有机溶剂中的重量浓度为0.01％～1％；将上述油相滴加到在搅拌或者超声的某种含水介质中，乳化6～48hr，得到纳米载药胶束。

(3)制备两亲性靶向纳米胶束

取步骤(2)所得的纳米载药胶束，悬浮于pH值为4.0-4.5的PBS中形成体系A。取叶酸(folate)，1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺(EDAC)溶于二甲亚砜(DMSO)中形成体系B。将体系A滴加到体系B中去，搅拌下保持1～10hr，用pH值为4.0-4.5的PBS溶液调节，始终保持体系的pH值小于5.0，制备得两亲性靶向纳米胶束。

(4)制备两亲性荧光靶向纳米胶束

取步骤(3)制备的两亲性靶向纳米胶束，用pH值为9.5的碳酸盐缓冲溶液(PBS)配置成1％～10％g/ml的胶束溶液，采用搅拌法接荧光素：用pH值为9.5的碳酸盐缓冲溶液溶解荧光物质，滴加到胶束溶液中，搅拌1～10hr，透析法除去游离的荧光物质。透析袋内的悬浮液经过离心，三蒸水润洗三次，离心、冷干，得到粉末状胶束。

本发明中所述的两亲性聚合物载体的疏水组分选自下述的可生物降解聚合物之一种：聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、丙交酯和乙交酯共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)、聚原酯酸、丙交酯和1，4-二噁烷-2-酮的共聚物、己内酯和1，4-二噁烷-2-酮的共聚物。

本发明中所述的两亲性聚合物载体，其疏水性组分和亲水性组分的分子量分别为5000～50000g/mol和423～25000g/mol，两者的物质量之比为1∶0.1～1∶5.0。

本发明中所述有机溶剂可以是二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯或丙酮等。

本发明中所述的两亲性纳米载药胶束的疏水性或水略溶性药物选自紫杉烷类似物、长春花碱类、蒽环类、表鬼臼素类、喜树碱、阿霉素、顺铂或5-氟尿嘧啶等。

本发明中所述的两亲性纳米载药胶束制备中，其含水介质可采用0.9％的氯化钠水溶液(标准盐水)，5％葡萄糖水溶液，含5％葡萄糖和0.9％氯化钠的注射用水，含5％葡萄糖的林格氏注射液，或者含有Tween-80(吐温-80)或聚乙烯醇(PVA)等表面活性剂的水溶液。

本发明中所述的两亲性纳米载药胶束，药物被以物理手段捕获从而包覆在胶束内，而非共价结合于疏水核；该疏水核由两亲性聚合物的疏水PLA组分形成。

本发明中所述的两亲性靶向纳米胶束的制备方法，利用胶束表面的的活性氨基与靶向分子耦联。

本发明中所述的两亲性靶向纳米胶束的制备方法，靶向分子为可循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质，该靶向分子可以为叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、四氢喋呤、喋酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸和8-去氮叶酸。

本发明中所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，采用的荧光物质可为异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗丹明(RB200)或四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)或二氯三嗪基氨基荧光素等。

本发明中所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，所述的叶酸与表面氨基、荧光物质与表面氨基的投料比为0.1/1～1/1。

本发明先合成两亲性聚合物PLA-PEI，通过不同投料比得到不同亲疏水性、不同分子量的聚合物；然后制备纳米级的载药胶束，将抗肿瘤药物物理包覆在胶束内部；再借助两亲性载体暴露在胶束表面的活性氨基，接枝靶向分子叶酸和示踪分子荧光物质，从而得到功能性载药系统。本发明得到的两亲性荧光靶向纳米胶束，粒径较小，分布均匀，具有良好的生物相容性和降解性，可以有效到达病变部位集中药效，实现长期安全释药；同时，可以通过荧光物质的示踪作用，在实验和检测过程中，直观方便地考察靶向作用及药物作用情况。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同比例PLA∶PEI合成产物的凝胶渗透色谱。

图2为本发明实施例2中不同配比PLA/PEI制备的两亲性聚合物制备的载药胶束的粒径及粒径分布。

图3为本发明实施例2载药胶束的透射电镜照片。

图4为本发明实施例1(2)在细胞试验中的靶向显色图片。

具体实施方式

以下通过实施例进一步描述本发明，但不限于这些实施例。

实施例1：制备PLA-PEI两亲性载体

(1)PLA∶PEI＝1∶0.4

取PLA，N，N-二环己基碳酰亚胺(DCC)，N-羟基丁二酰亚胺(NHS)溶于二氯甲烷(DCM)中，室温搅拌24hr，制备活化PLA；取活化的PLA1g，溶于10mlDCM(A)，0.0121g PEI溶于5ml的丙酮中(B)；各自混和均匀后，将B体系缓慢加入高速搅拌的A体系中，胺解6hr；将得到的溶液加入高速搅拌的冰冷的乙醚中沉淀；布氏漏斗过滤，真空干燥，得到白色PLA-PEI粉末。

所得到的PLA-PEI，Mn＝6447g/mol，Mw＝16076g/mol。(见附图1)

(2)PLA∶PEI＝1∶0.8

取PLA，DCC，NHS溶于DCM中，室温搅拌24hr，制备活化PLA；取活化的PLA1g，溶于10mlDCM中(A)，0.0242g PEI溶于5ml的丙酮中(B)；各自混和均匀后，将B体系缓慢加入高速搅拌的A体系中，胺解6hr；将得到的溶液加入高速搅拌的冰冷的乙醚中沉淀；布氏漏斗过滤，真空干燥，得到白色PLA-PEI粉末。

所得到的PLA-PEI，Mn＝6259g/mol，Mw＝15648g/mol。(见附图1)

(3)PLA∶PEI＝1∶1.2

取PLA，DCC，NHS溶于DCM中，室温搅拌24hr，制备活化PLA；取活化的PLA1g，溶于10mlDCM中(A)，0.0363g PEI溶于5ml的丙酮中(B)；各自混和均匀后，将B体系缓慢加入高速搅拌的A体系中，胺解6hr；将得到的溶液加入高速搅拌的冰冷的乙醚中沉淀；布氏漏斗过滤，真空干燥，得到白色PLA-PEI粉末。

所得到的PLA-PEI，Mn＝6047g/mol，Mw＝14959g/mol。(见附图1)

实施例2：制备PLA-PEI为载体的载药胶束

0.5gPLA-PEI溶于20mlDCM中，溶解均匀后成为油相，并将5-Fu粉末超声悬浮于油相中；1g Tweeen-80溶于100ml水中成为水相；在高速搅拌的条件下将油相滴加到水相中，继续搅拌48hr直至有机溶剂挥发，放到冰箱冷冻24hr，使胶束进一步固化；离心，三蒸水润洗三次，冷冻干燥，得到纳米载药胶束粉末。

所得纳米载药胶束，粒径均为100nm左右(见附图2)，成圆整球形，大小均匀。(见附图3)

5-Fu在0.1M稀盐酸中265nm处的标准曲线方程为：

A＝0.0567563C+0.000651(r＝0.9999)C为5-Fu浓度(μg/ml)，A为吸光度。

取适量的载药胶束用DCM溶解，然后用稀盐酸萃取三次，收集上层稀盐酸的5-Fu溶液然后定容至50ml，用U-1800型紫外分光光度计测定265nm处的吸光度A，带入5-Fu在0.1M稀盐酸中的标准曲线方程，计算得到包封率为和载药量见下表：

PLA∶PEI	1∶0.4	1∶0.8	1∶1.2
PLA∶PEI	1∶0.4	1∶0.8	1∶1.2	包封率/％	76.5	57.3	42.1
载药量/％	24.2	20.5	13.8	包封率/％	76.5	57.3	42.1

实施例3制备两亲性靶向纳米胶束

取PLA-PEI为载体的载药胶束，悬浮于一定量的pH值为4.0的磷酸盐的缓冲溶液(PBS)中(C)；取0.026g folate，0.0226g EDAC溶于5ml DMSO中(D)，在磁力搅拌下3hr；将C体系缓慢滴加到D体系中，磁力搅拌下保持10hr，用pH值为4.0的PBS溶液调节，始终保持体系的pH值5.0；离心胶束悬浮液，三蒸水润洗三次，冷冻干燥24hr，得到粉末状靶向纳米胶束。

称取一定量靶向纳米胶束，将其溶解在DMSO中，测定362nm处的吸光度，并代入标准曲线方程：

C(μg/ml)＝0.83037+65.63382*A，C为叶酸的浓度，A为吸光度，r＝0.99953，计算得到接枝量见下表：

PLA∶PEI	1∶0.4	1∶0.8	1∶1.2
PLA∶PEI	1∶0.4	1∶0.8	1∶1.2	接枝量/mol/mg	17.5	25.8	27.4

实施例4制备两亲性荧光靶向纳米胶束

称取1.5417g NaHCO₃和0.25g Na₂CO₃用250ml蒸馏水溶解，配置成0.05M的pH值为9.5的碳酸盐缓冲溶液，取上述制备的纳米靶向载药胶束，采用搅拌法接荧光素：取一定量的载药胶束悬浮于pH值为9.5的碳酸盐缓冲溶液；用80mlpH值为9.5的碳酸盐缓冲溶液溶解FITC，滴加到磁力搅拌的胶束溶液中，滴加时控制体系的pH值≥9.0；滴加完毕后，室温下，磁力搅拌10hr；透析法除去游离的荧光素：将上述体系注入透析袋内，外侧为0.9％的生理盐水，不断更换外侧生理盐水，直至外水相中荧光素浓度为零；透析袋内的悬浮液经过离心，三蒸水润洗三次，离心、冷干，得到粉末状荧光靶向纳米胶束。

Claims

1、一种两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于：以疏水性组分生物可降解聚合物和亲水性组分聚乙烯亚胺共聚物为胶束载体，采用溶剂挥发法将疏水性或略水溶性抗肿瘤药物包裹在胶束内，借助胶束表面氨基，将靶向分子叶酸和示踪荧光分子接枝到胶束表面，得到两亲性荧光靶向纳米胶束，具体步骤如下：

(1)合成两亲性聚合物载体

疏水性生物可降解聚合物和聚乙烯亚胺溶于有机溶剂中，胺解1～12hr，得到两亲性聚合物疏水性聚合物-聚乙烯亚胺；

(2)制备两亲性纳米载药胶束

将步骤(1)所得的两亲性聚合物溶于有机溶剂中，聚合物在有机溶剂中的质量浓度为1％～10％，将疏水性或水略溶性药物溶解于或者悬浮于上述有机溶剂中形成油相，药物在有机溶剂中的重量浓度为0.01％～1％；将上述油相滴加到搅拌或者超声的某种含水介质中，乳化6～48hr，得到纳米载药胶束；

(3)制备两亲性靶向纳米胶束

取步骤(2)所得的纳米载药胶束，悬浮于pH值为4-4.5的碳酸盐缓冲液中形成体系A，取叶酸、1-乙基-1-3-(3-二甲基氨基-丙基)-碳化二亚胺溶于二甲亚砜中，形成体系B，将体系A滴加到体系B中去，搅拌下保持1～10hr，用pH值为4-4.5的碳酸盐缓冲液调节，始终保持体系的pH值小于5.0，制备得两亲性靶向纳米胶束；

(4)制备两亲性荧光靶向纳米胶束

取步骤(3)制备的两亲性靶向纳米胶束，用pH值为9.5的碳酸盐缓冲溶液配置成1％～10％g/ml的胶束溶液，采用搅拌法接荧光物质：用pH值为9.5的碳酸盐缓冲溶液溶解荧光物质，滴加到上述胶束溶液中，搅拌1～10hr，透析法除去游离的荧光物质，透析袋内的悬浮液经过离心，三蒸水润洗三次，离心、冷干，得到粉末状胶束。

2、根据权利要求1所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于所述疏水组分选自下述可生物降解聚合物之一种：聚丙交酯、聚乙交酯、丙交酯和乙交酯共聚物、聚己内酯、聚原酯酸、丙交酯和1，4-二噁烷-2-酮的共聚物、己内酯和1，4-二噁烷-2-酮的共聚物。

3、根据权利要求1或2所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于所述疏水性组分和亲水性组分的分子量分别为5000～50000g/mol和423～25000g/mol，两者的物质量之比为1∶0.1～1∶5.0。

4、根据权利要求1或2所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于所述疏水性或略水溶性药物选自紫杉烷类似物、长春花碱类、蒽环类、表鬼臼素类、喜树碱、阿霉素、顺铂或5-氟尿嘧啶之一种。

5、根据权利要求1或2所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于所述的含水介质选择0.9％的氯化钠水溶液，5％葡萄糖水溶液，含5％葡萄糖和0.9％氯化钠的注射用水，含5％葡萄糖的林格氏注射液，或者含有吐温-80或聚乙烯醇表面活性剂的水溶液。

6、根据权利要求1或2所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于所述药物被以物理手段捕获从而包覆在胶束内，而非共价结合于疏水核；该疏水核由两亲性聚合物的疏水性组分形成。

7、根据权利要求1或2所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于靶向分子为循细胞膜上叶酸受体途径进入细胞的物质，该靶向分子为叶酸、亚叶酸、二氢叶酸、四氢叶酸、四氢喋呤、喋酰多谷氨酸、2-去氨基-羟基叶酸、1-去氮叶酸、3-去氮叶酸或8-去氮叶酸。

8、根据权利要求1或2所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于所述的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或二氯三嗪基氨基荧光素。

9、根据权利要求1或2所述的两亲性荧光靶向纳米胶束的制备方法，其特征在于所述的叶酸与表面氨基、荧光物质与表面氨基的物质量比分别为0.1/1～1/1。

10、如权利要求1-9之一所述方法制备的两亲性荧光靶向纳米胶束。