KR20230104264A - 유전자 발현 또는 활성을 조절하는 시스템 및 방법 - Google Patents

유전자 발현 또는 활성을 조절하는 시스템 및 방법 Download PDF

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KR20230104264A
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지펜 양
로나 하라리-스테인펠드
매기 엘 보빈
비탈리 발란
프란세스코 엠 마린콜라
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레퓨즈 바이오테크놀로지스, 인크.
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Abstract

본 개시내용의 특정 측면은 세포의 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절하는 시스템, 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 경우, 본 개시내용은 내생성 사이토카인을 코딩하는 표적 유전자와 복합체를 형성하여 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 작동자 모이어티(actuator moiety)를 포함하는 시스템을 제공한다. 이 작동자 모이어티는 세포에 대해 이종성일 수 있다. 작동자 모이어티는 세포를 외부 자극에 노출시켰을 때 활성화될 수 있다. 세포를 외부 자극에 노출시켰을 때, 작동자 모이어티는 활성화되어 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다.

Description

유전자 발현 또는 활성을 조절하는 시스템 및 방법
상호참조
본원은 전체적으로 본원에 각각 참고로 포함되는, 2020년 11월 8일에 출원된 미국 가출원 제63/111,053호 및 2021년 6월 30일에 출원된 미국 가출원 제63/216,659호의 이익을 주장한다.
암(예를 들어, 신생물, 종양)은 다수의 신체 조직에서 비정상적인 세포 생장을 수반하는 큰 계열의 질환이다. 암은 신체의 다른 부분을 침범할 수 있거나 이러한 다른 부분으로 퍼질 수 있다. 암은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로서 매년 약 1,000만 명의 사망의 원인이 된다. 암에 의해 침범되는 신체 조직의 비제한적 예는 폐, 전립선, 대장, 위, 간, 유방, 결장, 직장, 자궁경부 및 갑상선을 포함한다. 암을 치료하거나 조절하는 것을 목표로 다양한 요법들, 예를 들어, 소분자, 항체 및 입양 세포 요법(예를 들어, 세포 면역요법)이 개발되었다.
본 개시내용은 암과 같은 병태를 갖거나 가진 것으로 의심되는 대상체를 치료하는 입양 세포 요법을 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본 개시내용의 방법 및 시스템은 예를 들어, 세포 면역요법(예를 들어, 자가 또는 동종 면역 세포를 사용하는 암 요법)의 활성(예를 들어, 항종양 활성)을 향상시키는 데 이용될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 내생성(endogenous) 사이토카인을 코딩하는 표적 유전자와 복합체를 형성하여 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 작동자 모이어티(actuator moiety)를 포함하는, 세포의 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절하는 시스템으로서, 상기 작동자 모이어티가 세포에 대해 이종성이고 세포를 외부 자극에 노출시켰을 때 활성화될 수 있고, 세포를 외부 자극에 노출시켰을 때, 상기 작동자 모이어티가 활성화되어 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절함으로써, 세포로 하여금 (i) 대조군에 비해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화; (ii) 대조군에 비해 세포의 상이한 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화; (iii) 대조군에 비해 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20% 감소에 의해 확인되는, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성; (iv) 대조군에 비해 세포를 포함하는 세포 집단의 크기의 적어도 20% 증가에 의해 확인되는 향상된 증식; 및 (v) 대조군에 비해 종양 크기의 감소로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 미치는 것인 시스템을 제공한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 외부 자극은 리간드이고, 시스템은 리간드에 결합하였을 때 변형되는 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)를 포함하고, 이때 작동자 모이어티는 수용체 변형 시 활성화될 수 있다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티의 활성화는 (1) 기질로부터의 작동자 모이어티의 방출 또는 (2) 작동자 모이어티의 변형을 포함한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 (i) 내지 (v) 중 2개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받는다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 (i) 내지 (v) 중 3개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받는다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 (i) 내지 (v) 중 4개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받는다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 (i) 내지 (v) 모두를 나타내도록 영향을 받는다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 대조군 세포에 비해 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 증가를 나타내도록 영향을 받는다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 내생성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 및 IL-36으로 구성된 군으로부터 선택된 인터류킨(IL)을 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 내생성 사이토카인은 IL-12를 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 IL-12A(p35)를 코딩하는 제1 유전자 및 IL-12B(p40)를 코딩하는 제2 유전자를 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 내생성 사이토카인은 IL-21을 포함한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 복합체를 형성할 수 있고, 이때 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 (i) 표적 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 적어도 일부를 포함하거나, (ii) 표적 유전자의 TSS로부터 약 1,000개 염기 내지 약 900개 염기, 약 900개 염기 내지 약 800개 염기, 약 800개 염기 내지 약 700개 염기, 약 700개 염기 내지 약 600개 염기, 약 600개 염기 내지 약 500개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기만큼 떨어져 있다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, (1) 작동자 모이어티의 제1 작동자 모이어티는 표적 유전자의 제1 유전자와 복합체를 형성할 수 있고 (2) 작동자 모이어티의 제2 작동자 모이어티는 표적 유전자의 제2 유전자와 복합체를 형성할 수 있음으로써, 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절할 수 있고, 이때 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성은 상이한 제1 유전자 및 제2 유전자의 조절 하에 있다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 핵산 가이드된(guided) 작동자 모이어티를 포함하고, 이때 시스템은 작동자 모이어티와 복합체를 형성하는 가이드 핵산을 추가로 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 시스템은 표적 유전자의 상이한 부분에 대해 상보성을 가진 2개 이상의 가이드 핵산을 추가로 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 가이드 리보핵산(RNA)을 포함한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 대조군 세포에 비해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화를 나타내도록 영향을 받는다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 상이한 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 증가를 나타내도록 영향을 받는다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IFN-α(알파), IFN-β(베타), IFN-κ(카파), IFN-δ(델타), IFN-ε(엡실론), IFN-τ(타우), IFN-ω(오메가), IFN-ζ(제타), IFN-γ(감마) 및 IFN-λ(람다)로 구성된 군으로부터 선택된 인터페론(IFN)을 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IFN-γ(감마)를 포함한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 TNFβ, TNFα, TNFγ, CD252(OX40 리간드), CD154(CD40 리간드), CD178(Fas 리간드), CD70(CD27 리간드), CD153(CD30 리간드), 4-1BBL(CD137 리간드), CD253(TRAIL), CD254(RANKL), APO-3L(TWEAK), CD256(APRIL), CD257(BAFF), CD258(LIGHT), TL1(VEGI), GITRL(TNFSF18) 및 엑토디스플라신(Ectodysplasin) A로 구성된 군으로부터 선택된 종양 괴사 인자(TNF) 단백질을 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 TNFα를 포함한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 상이한 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 감소를 나타내도록 영향을 받는다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IL-12가 아니다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IL-21이 아니다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IL-2를 포함한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성은 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60% 감소에 의해 확인된다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 표적 세포 집단은 이환된 세포를 포함하고, 리간드는 이환된 세포의 항원이다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 이환된 세포는 암 세포 또는 종양 세포를 포함한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 향상된 증식은 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80% 또는 적어도 100% 증가에 의해 확인된다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 종양 크기는 대조군에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60% 감소된다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 표적 유전자의 발현을 조절하도록 구성된 이펙터 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자(repressor) 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 전사 활성화 도메인이다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 전사 억제인자 도메인이다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 이종 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체를 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 변형은 입체구조적 변화 또는 화학적 변형이다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템을 포함하는 조작된 세포 집단을 제공한다. 본원에 개시된 조작된 세포 집단들 중 어느 한 조작된 세포 집단의 일부 실시양태에서, 집단은 조작된 면역 세포를 포함한다. 본원에 개시된 조작된 면역 세포 집단들 중 어느 한 조작된 면역 세포 집단의 일부 실시양태에서, 집단은 조작된 T 세포를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 조작된 세포 집단들 중 어느 한 조작된 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 조성물들 중 어느 한 조성물의 일부 실시양태에서, 조성물은 보조치료제를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 세포의 인터류킨(IL) 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 설계된 가이드 핵산 분자를 포함하는 시스템을 제공하는 것으로, 이때 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 (i) IL 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 적어도 일부를 포함하거나 (ii) IL 유전자의 TSS로부터 약 1,000개 염기 내지 약 900개 염기, 약 900개 염기 내지 약 800개 염기, 약 800개 염기 내지 약 700개 염기, 약 700개 염기 내지 약 600개 염기, 약 600개 염기 내지 약 500개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기만큼 떨어져 있고, 이때 가이드 핵산 분자는 세포에 대해 이종성이다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 가이드 핵산 분자는 작동자 모이어티를 IL 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로 동원하여, IL의 발현 또는 활성을 조절할 수 있고, 상기 시스템은 작동자 모이어티를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 세포의 인터류킨(IL) 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있는 작동자 모이어티를 포함하는 시스템을 제공하는 것으로, 이때 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 (i) IL 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 적어도 일부를 포함하거나 (ii) IL 유전자의 TSS로부터 약 1,000개 염기 내지 약 900개 염기, 약 900개 염기 내지 약 800개 염기, 약 800개 염기 내지 약 700개 염기, 약 700개 염기 내지 약 600개 염기, 약 600개 염기 내지 약 500개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기만큼 떨어져 있고, 작동자 모이어티는 세포에 대해 이종성이다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 이종 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체를 포함한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, IL 유전자는 세포에 대해 내생성이다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, TSS는 세포에 대해 내생성이다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, IL은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 및 IL-36으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, IL은 IL-12이다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, IL은 IL-12A 및/또는 IL-12B이다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, IL은 IL-21이다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 시스템은 (i) TSS의 제1 부분에 결합하도록 설계된 제1 가이드 핵산 분자 및 (ii) TSS의 제2 부분에 결합하도록 설계된 제2 가이드 핵산 분자를 추가로 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 시스템은 (i) IL 유전자(예를 들어, IL-12A 유전자)의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 제1 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 설계된 제1 가이드 핵산 분자 및 (ii) IL 유전자(예를 들어, IL-12B 유전자)의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 설계된 제2 가이드 핵산 분자를 포함한다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 가이드 핵산 분자는 가이드 리보핵산(RNA)을 포함한다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, TSS는 서열번호 1에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, TSS는 서열번호 2에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진다.
본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템의 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템을 포함하는 조작된 세포 집단을 제공한다. 본원에 개시된 조작된 세포 집단들 중 어느 한 조작된 세포 집단의 일부 실시양태에서, 집단은 조작된 면역 세포를 포함한다. 본원에 개시된 조작된 면역 세포 집단들 중 어느 한 조작된 면역 세포 집단의 일부 실시양태에서, 집단은 조작된 T 세포를 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 조작된 세포 집단들 중 어느 한 조작된 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원에 개시된 조성물들 중 어느 한 조성물의 일부 실시양태에서, 조성물은 보조치료제를 추가로 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 세포의 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절하는 방법으로서, (a) 세포를 외부 자극에 노출시키는 단계; 및 (b) 외부 자극에의 노출에 반응하여, 작동자 모이어티와 내생성 사이토카인을 코딩하는 표적 유전자 사이에 복합체를 형성하여 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절함으로써, 세포가 (i) 대조군에 비해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화; (ii) 대조군에 비해 세포의 상이한 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화; (iii) 대조군에 비해 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20% 감소에 의해 확인되는, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성; (iv) 세포를 포함하는 세포 집단의 크기의 적어도 20% 증가에 의해 확인되는 향상된 증식; 및 (v) 대조군에 비해 종양 크기의 감소로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 미치는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 외부 자극은 리간드이고, (a)는 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)를 리간드에 노출시켜 수용체의 변형을 달성하는 단계를 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, (b)는 (1) 기질로부터의 작동자 모이어티의 방출 또는 (2) 작동자 모이어티의 변형을 통해 작동자 모이어티를 활성화시키는 것을 포함한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 (i) 내지 (v) 중 2개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받는다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 (i) 내지 (v) 중 3개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받는다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 (i) 내지 (v) 중 4개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받는다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 (i) 내지 (v) 모두를 나타내도록 영향을 받는다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 대조군 세포에 비해 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 증가를 나타내도록 영향을 받는다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 내생성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 및 IL-36으로 구성된 군으로부터 선택된 인터류킨(IL)을 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 내생성 사이토카인은 IL-12를 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 표적 유전자는 IL-12A(p35)를 코딩하는 제1 유전자 및 IL-12B(p40)를 코딩하는 제2 유전자를 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 내생성 사이토카인은 IL-21을 포함한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 (i) 표적 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 적어도 일부를 포함하거나 (ii) 표적 유전자의 TSS로부터 약 1,000개 염기 내지 약 900개 염기, 약 900개 염기 내지 약 800개 염기, 약 800개 염기 내지 약 700개 염기, 약 700개 염기 내지 약 600개 염기, 약 600개 염기 내지 약 500개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기만큼 떨어져 있다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, (b)는 (1) 작동자 모이어티의 제1 작동자 모이어티와 표적 유전자의 제1 유전자 사이에 복합체를 형성하고 (2) 작동자 모이어티의 제2 작동자 모이어티와 표적 유전자의 제2 유전자 사이에 복합체를 형성함으로써, 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절하는 단계를 추가로 포함하고, 이때 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성은 상이한 제1 유전자와 제2 유전자의 조절 하에 있다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 핵산 가이드된 작동자 모이어티를 포함하고, 이때 시스템은 작동자 모이어티와 복합체를 형성하는 가이드 핵산을 추가로 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 시스템은 표적 유전자의 상이한 부분에 대해 상보성을 가진 2개 이상의 가이드 핵산을 추가로 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 가이드 핵산은 가이드 리보핵산(RNA)을 포함한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 대조군 세포에 비해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화를 나타내도록 영향을 받는다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 상이한 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 증가를 나타내도록 영향을 받는다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IFN-α(알파), IFN-β(베타), IFN-κ(카파), IFN-δ(델타), IFN-ε(엡실론), IFN-τ(타우), IFN-ω(오메가), IFN-ζ(제타), IFN-γ(감마) 및 IFN-λ(람다)로 구성된 군으로부터 선택된 인터페론(IFN)을 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IFN-γ(감마)를 포함한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 TNFβ, TNFα, TNFγ, CD252(OX40 리간드), CD154(CD40 리간드), CD178(Fas 리간드), CD70(CD27 리간드), CD153(CD30 리간드), 4-1BBL(CD137 리간드), CD253(TRAIL), CD254(RANKL), APO-3L(TWEAK), CD256(APRIL), CD257(BAFF), CD258(LIGHT), TL1(VEGI), GITRL(TNFSF18) 및 엑토디스플라신 A로 구성된 군으로부터 선택된 종양 괴사 인자(TNF) 단백질을 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 TNFα를 포함한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 상이한 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 감소를 나타내도록 영향을 받는다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IL-12가 아니다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IL-21이 아니다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 상이한 내생성 사이토카인은 IL-2를 포함한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성은 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60% 감소에 의해 확인된다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 표적 세포 집단은 이환된 세포를 포함하고, 리간드는 이환된 세포의 항원이다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 이환된 세포는 암 세포 또는 종양 세포를 포함한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 향상된 증식은 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80% 또는 적어도 100% 증가에 의해 확인된다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 종양 크기는 대조군에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60% 감소된다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 표적 유전자의 발현을 조절하도록 구성된 이펙터 도메인을 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 전사 활성화 도메인이다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 전사 억제인자 도메인이다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 이종 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체를 포함한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 변형은 입체구조적 변화 또는 화학적 변형이다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 세포를, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 세포는 대상체에 대해 자가 또는 동종이다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 방법은 보조치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 본원에 개시된 방법들 중 어느 한 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 개시내용의 추가 측면 및 이점은 본 개시내용의 예시적인 실시양태만이 제시되고 설명되어 있는 하기 상세한 설명으로부터 당분야의 숙련된 자에게 쉽게 명백해질 것이다. 이해될 바와 같이, 본 개시내용은 다른 실시양태 및 상이한 실시양태가 가능하며, 이의 몇몇 세부사항은 모두 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 다양한 자명한 관점에서 변형될 수 있다. 따라서, 도면 및 설명은 본질적으로 예시적인 것으로서 간주되어야 하며 제한적인 것으로서 간주되어서는 안 된다.
참고에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 표시되는 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함되는 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 개시내용과 모순되는 범위 내에서, 본 명세서는 임의의 이러한 모순되는 자료를 대신하고/하거나 이러한 자료보다 우선한다.
본 발명의 신규 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 기재되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면(또한 본원에서 "도면" 및 "도")을 참고함으로써 더 잘 이해될 것이다.
도 1의 A 내지 D는 인산화되는 수용체를 포함하는 시스템에서 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 개략적으로 예시하고; 도 1의 E 내지 H는 입체구조적으로 변화되는 수용체를 포함하는 시스템에서 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 개략적으로 예시한다.
도 2의 A 내지 D는 리간드 결합 시 인산화되는 수용체를 포함하는 상이한 시스템에서 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 개략적으로 예시하고; 도 2의 E 내지 H는 입체구조적으로 변화되는 수용체를 포함하는 시스템에서 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 개략적으로 예시한다.
도 3의 A 내지 D는 적어도 2개의 어댑터 폴리펩티드 및 인산화되는 수용체를 포함하는 시스템에서 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 개략적으로 예시하고; 도 3의 E 내지 H는 적어도 2개의 어댑터 폴리펩티드 및 입체구조적으로 변화되는 수용체를 포함하는 시스템에서 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 개략적으로 예시한다.
도 4는 키메라 수용체 신호전달을 통한 작동자 모이어티의 조건부 유도 가능한 발현을 개략적으로 예시한다.
도 5는 면역 세포에서 키메라 항원 수용체(CAR) 신호전달에 의한 인터류킨(IL)-12의 상황별 분비를 개략적으로 예시한다.
도 6은 적어도 CAR, 작동자 모이어티, 및/또는 IL-12 유전자(들)에 결합할 수 있는 하나 이상의 가이드 핵산 분자를 코딩하는 발현 카세트를 개략적으로 예시한다.
도 7a 내지 7d는 항원 제시 비드에 의한 CAR T 세포의 활성화 시 2개의 상이한 인간 CAR T 세포에서 내생성 IL-12 분비의 향상(도 7a 및 7b) 및 내생성 IFNγ의 향상(도 7d 및 7d)을 보여준다.
도 8은 내생성 IL-2의 조건부 발현에 대한 가이드 핵산 분자의 상이한 조합의 효과를 보여준다.
도 9a는 내생성 IL-12 및 내생성 IFNγ의 발현을 향상시키기 위한 CAR T 세포의 암 세포 매개 활성화를 보여주고; 도 9b는 IL-12를 항시적으로 발현하도록 조작된 암 세포를 사용함으로써 설정된 대조군을 보여준다.
도 10a는 CAR T 세포에 의한 내생성 IL-12의 조건부 발현 시 종양 세포 세포독성 및 CAR T 세포의 증식을 보여주고; 도 10b는 IL-12를 항시적으로 발현하도록 조작된 암 세포를 사용함으로써 설정된 대조군을 보여준다.
도 11a 내지 11d는 CAR이 특이적 리간드와 결합하여 내생성 IL-12의 발현을 조건부로 유도하였을 때 CAR T 세포에 의한 상이한 사이토카인의 발현 프로파일을 보여준다.
도 12a 내지 12d는 CAR이 특이적 리간드와 결합하여 내생성 IL-12의 발현을 조건부로 유도하였을 때 CAR T 세포의 향상된 종양 세포독성 및 CAR T 세포의 증식을 보여준다.
도 13a 및 13b는 IL-12의 발현 수준을 조절하기 위해 IL-12에 대한 가이드 핵산 분자를 확인하는 상이한 스크리닝 방법을 예시한다.
도 14a는 가이드 핵산 분자(하단)에 의해 표적화되는 IL-12B(P40) 유전자의 영역(녹색 화살표), 및 가이드 핵산 분자에 의한 IL-12B의 상대적 발현 수준을 보여준다.
도 14b는 가이드 핵산 분자(하단)에 의해 표적화되는 IL-12A(P35) 유전자의 영역(녹색 화살표), 및 가이드 핵산 분자에 의한 IL-12 이종이량체(P70)의 상대적 발현 수준을 보여준다.
도 15 및 16은 IL-12A 유전자 및/또는 IL-12B 유전자에 대한 작동자 모이어티 및 하나 이상의 가이드 핵산 분자에 의한 IL-12 이종이량체의 상대적 발현 수준을 보여준다.
도 17은 IL-21 유전자에 대한 가이드 핵산 분자의 예, 및 가이드 핵산 분자에 의한 활성화 시 IL-21의 상대적 발현 수준을 보여준다.
본 발명의 다양한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태가 예시로서만 제공된다는 것은 당분야의 숙련된 자에게 자명할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않으면서 수많은 변경, 변화 및 치환이 당분야의 숙련된 자에게 인식될 수 있다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태의 다양한 대안이 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 단수 형태는 복수 지시대상도 포함한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 일반적으로 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계에 의해 좌우될 수 있는, 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미한다. 예를 들어, "약"은 당분야의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 소정의 값의 최대 20%, 최대 10%, 최대 5% 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 상기 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 본원 및 특허청구범위에 기재되어 있는 경우, 달리 명시되지 않는 한, 특정 값에 대해 허용되는 오차 범위 이내를 의미하는 용어 "약"이 가정되어야 한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 어느 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "및/또는"은 대안 중 어느 하나 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "세포"는 일반적으로 생물학적 세포를 지칭한다. 세포는 살아있는 유기체의 기본 구조적, 기능적 및/또는 생물학적 유닛일 수 있다. 세포는 하나 이상의 세포를 가진 임의의 유기체로부터 유래할 수 있다. 일부 비제한적 예는 원핵세포, 진핵세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단세포 진핵생물 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물의 세포(예를 들어, 식물 작물, 과일, 채소, 곡물, 대두, 옥수수, 수수, 밀, 종자, 토마토, 쌀, 카사바, 사탕수수, 호박, 건초, 감자, 목화, 대마초, 담배, 개화 식물, 침엽수, 겉씨식물, 양치류, 석송, 뿔풀, 간풀, 이끼의 세포), 조류 세포(예를 들어, 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 클라미도모나스 레인하르티(Chlamydomonas reinhardtii), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 사르가섬 파텐스 씨. 아가드(Sargassum patens C. Agardh) 등), 해조류(예를 들어, 다시마), 진균 세포(예를 들어, 효모 세포, 버섯의 세포), 동물 세포, 무척추 동물(예를 들어, 초파리, 자포동물, 극피동물, 선충 등)의 세포, 척추 동물(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유동물)의 세포, 포유동물(예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류, 래트, 마우스, 비인간 영장류, 인간 등)의 세포 등을 포함한다. 종종 세포는 천연 유기체로부터 유래하지 않는다(예를 들어, 세포는 합성에 의해 만들어질 수 있고 종종 인공 세포로서 지칭된다).
본원에서 상호교환 가능하게 사용된 바와 같이, 용어 "조혈 줄기 세포", "조혈 원시 세포" 또는 "조혈 전구체 세포"는 일반적으로 조혈 계통에 속하지만 추가 조혈 분화(예를 들어, T 세포로 분화)될 수 있는 세포를 지칭하고, 다분화능 조혈 줄기 세포(혈모세포), 골수 원시 세포, 거핵구 원시 세포, 적혈구 원시 세포 및 림프 원시 세포를 포함한다. 조혈 줄기 세포(HSC)는 골수 계통(단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포) 및 림프 계통(T 세포, B 세포, NK 세포)를 포함하는 모든 혈액 세포 유형을 생성하는 다분화능 줄기 세포이다.
용어 "면역 세포" 또는 "림프구"는 일반적으로 분화된 조혈 세포를 지칭한다. 면역 세포의 비제한적 예는 T 세포, NK 세포, 단핵구, 선천성 림프구, 종양 침윤 림프구, 대식세포, 과립구 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드"는 일반적으로 염기-당-포스페이트 조합을 의미한다. 뉴클레오타이드는 합성 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 합성 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 핵산 서열(예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA))의 단량체 유닛일 수 있다. 용어 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 아데노신 트리포스페이트(ATP), 우리딘 트리포스페이트(UTP), 사이토신 트리포스페이트(CTP), 구아노신 트리포스페이트(GTP) 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, 예컨대, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 유도체는 예를 들어, [αS]dATP, 7-데아자-dGTP 및 7-데아자-dATP, 및 이들을 함유하는 핵산 분자에 뉴클레아제 내성을 부여하는 뉴클레오타이드 유도체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 뉴클레오타이드는 디데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(ddNTP) 및 이의 유도체를 지칭할 수 있다. 디데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 예시적인 예는 ddATP, ddCTP, ddGTP, ddITP 및 ddTTP를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 뉴클레오타이드는 표지부착되지 않을 수 있거나, 잘 알려진 기법에 의해 검출 가능하게 표지부착될 수 있다. 표지부착은 양자 점을 사용함으로써 수행될 수도 있다. 검출 가능한 표지는 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 표지, 화학발광 표지, 생체발광 표지 및 효소 표지를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 형광 표지는 플루오레세인, 5-카르복시플루오레세인(FAM), 2'7'-디메톡시-4'5-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE), 로다민, 6-카르복시로다민(R6G), N,N,N',N'-테트라메틸-6-카르복시로다민(TAMRA), 6-카르복시-X-로다민(ROX), 4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산(DABCYL), 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 오레곤 그린(Oregon Green), 텍사스 레드(Texas Red), 시아닌(Cyanine) 및 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-설폰산(EDANS)을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 형광 표지부착된 뉴클레오타이드의 구체적인 예는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)(캘리포니아주 포스터 시티)로부터 입수될 수 있는 [R6G]dUTP, [TAMRA]dUTP, [R110]dCTP, [R6G]dCTP, [TAMRA]dCTP, [JOE]ddATP, [R6G]ddATP, [FAM]ddCTP, [R110]ddCTP, [TAMRA]ddGTP, [ROX]ddTTP, [dR6G]ddATP, [dR110]ddCTP, [dTAMRA]ddGTP 및 [dROX]ddTTP; 아머샴(Amersham)(일리노이주 알링턴 하이츠)으로부터 입수될 수 있는 플루오로링크(FluoroLink) 데옥시뉴클레오타이드인 플루오로링크 Cy3-dCTP, 플루오로링크 Cy5-dCTP, 플루오로링크 플루오르 X-dCTP, 플루오로링크 Cy3-dUTP 및 플루오로링크 Cy5-dUTP; 뵈링거 만하임(Boehringer Mannheim)(인디애나주 인디애나폴리스)으로부터 입수될 수 있는 플루오레세인-15-dATP, 플루오레세인-12-dUTP, 테트라메틸-로다민-6-dUTP, IR770-9-dATP, 플루오레세인-12-ddUTP, 플루오레세인-12-UTP 및 플루오레세인-15-2'-dATP; 및 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)(오레곤주 유진)로부터 입수될 수 있는 염색체 표지부착된 뉴클레오타이드인 BODIPY-FL-14-UTP, BODIPY-FL-4-UTP, BODIPY-TMR-14-UTP, BODIPY-TMR-14-dUTP, BODIPY-TR-14-UTP, BODIPY-TR-14-dUTP, 캐스케이드 블루-7-UTP, 캐스케이드 블루-7-dUTP, 플루오레세인-12-UTP, 플루레세인-12-dUTP, 오레곤 그린 488-5-dUTP, 로다민 그린-5-UTP, 로다민 그린-5-dUTP, 테트라메틸로다민-6-UTP, 테트라메틸로다민-6-dUTP, 텍사스 레드-5-UTP, 텍사스 레드-5-dUTP 및 텍사스 레드-12-dUTP를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드는 화학적 변형에 의해 표지부착될 수 있거나 표시될 수도 있다. 화학적으로 변형된 단일 뉴클레오타이드는 바이오틴-dNTP일 수 있다. 바이오티닐화된 dNTP의 일부 비제한적 예는 바이오틴-dATP(예를 들어, 바이오-N6-ddATP, 바이오틴-14-dATP), 바이오틴-dCTP(예를 들어, 바이오틴-11-dCTP, 바이오틴-14-dCTP), 및 바이오틴-dUTP(예를 들어, 바이오틴-11-dUTP, 바이오틴-16-dUTP, 바이오틴-20-dUTP)를 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 일반적으로 단일, 이중 또는 다중 가닥 형태로 존재하는, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드인 임의의 길이의 뉴클레오타이드 또는 이의 유사체의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 세포에 대한 외생성 또는 내생성 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 무세포 환경에 존재할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 이의 단편일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 알려져 있거나 알려져 있지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 유사체(예를 들어, 변경된 골격, 당 또는 핵염기)를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전 또는 후에 부여될 수 있다. 유사체의 일부 비제한적 예는 5-브로모우라실, 펩티드 핵산, 제노(xeno) 핵산, 모르폴리노, 잠긴 핵산, 글리콜 핵산, 트레오스 핵산, 디데옥시뉴클레오타이드, 코르디셉핀(cordycepin), 7-데아자-GTP, 형광단(예를 들어, 당에 연결된 로다민 또는 플루오레세인), 티올 함유 뉴클레오타이드, 바이오틴 연결된 뉴클레오타이드, 형광 염기 유사체, CpG 아일랜드, 메틸-7-구아노신, 메틸화된 뉴클레오타이드, 이노신, 티오우리딘, 슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 퀴오신 및 와이오신을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적 예는 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 리보좀 RNA(rRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 무세포 DNA(cfDNA) 및 무세포 RNA(cfRNA)를 포함하는 무세포 폴리뉴클레오타이드, 핵산 프로브, 및 프라이머를 포함한다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 구성요소에 의해 불연속될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 핵산(예를 들어, 게놈 DNA 및 cDNA와 같은 DNA), 및 RNA 전사체를 코딩하는 데 관여하는 이의 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 게놈 DNA와 관련하여 본원에서 사용된 이 용어는 개재 비-코딩 영역뿐만 아니라 조절 영역도 포함하고 5' 말단 및 3' 말단을 포함할 수 있다. 일부 용도에서, 상기 용어는 5' 비번역 영역 및 3' 비번역 영역(5'-UTR 및 3'-UTR), 엑손 및 인트론을 포함하는 전사된 서열을 포괄한다. 일부 유전자에서, 전사된 영역은 폴리펩티드를 코딩하는 "개방 판독 프레임"을 함유할 것이다. 상기 용어의 일부 사용에서, "유전자"는 폴리펩티드를 코딩하는 데 필요한 코딩 서열(예를 들어, "개방 판독 프레임" 또는 "코딩 영역")만을 포함한다. 일부 경우, 유전자, 예를 들어, 리보좀 RNA 유전자(rRNA) 및 전달 RNA(tRNA) 유전자는 폴리펩티드를 코딩하지 않는다. 일부 경우, 용어 "유전자"는 전사된 서열뿐만 아니라, 업스트림 및 다운스트림 조절 영역, 인핸서 및 프로모터를 포함하는 전사되지 않는 영역도 포함한다. 유전자는 유기체의 게놈에서 그의 천연 위치에 있는 "내생성 유전자" 또는 천연 유전자를 지칭할 수 있다. 유전자는 "외생성 유전자" 또는 비천연 유전자를 지칭할 수 있다. 비천연 유전자는 일반적으로 숙주 유기체에서 발견되지 않으나 유전자 전달에 의해 숙주 유기체에 도입되는 유전자를 지칭할 수 있다. 비천연 유전자는 유기체의 게놈에서 그의 천연 위치에 있지 않는 유전자를 지칭할 수도 있다. 비천연 유전자는 돌연변이, 삽입 및/또는 결실(예를 들어, 비천연 서열)을 포함하는 천연 생성 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수도 있다.
용어 "형질감염" 또는 "형질감염된"은 핵산이 비-바이러스 또는 바이러스 기반 방법에 의해 세포에 도입되는 것을 의미한다. 핵산 분자는 완전한 단백질 또는 이의 기능성 부분을 코딩하는 유전자 서열일 수 있다.
용어 "발현"은 폴리뉴클레오타이드가 DNA 주형으로부터 (예를 들어, mRNA 또는 다른 RNA 전사체로) 전사되는 하나 이상의 과정, 및/또는 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 후속 번역되는 과정을 의미한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 "유전자 생성물"로서 통칭될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드가 게놈 DNA로부터 유래한 경우, 발현은 진핵 세포에서의 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 발현과 관련하여 "상향조절된"은 일반적으로 야생형 상태에서의 발현 수준에 비해 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA와 같은 RNA) 및/또는 폴리펩티드 서열의 증가된 발현 수준을 의미하는 반면, "하향조절된"은 일반적으로 야생형 상태에서의 발현에 비해 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, mRNA와 같은 RNA) 및/또는 폴리펩티드 서열의 감소된 발현 수준을 의미한다. 형질감염된 유전자의 발현은 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 일어날 수 있다. "일시적 발현" 동안 형질감염된 유전자는 세포 분열 동안 딸 세포에게 전달되지 않는다. 이의 발현은 형질감염된 세포로 제한되기 때문에, 유전자의 발현은 시간 경과에 따라 상실된다. 대조적으로, 형질감염된 유전자의 안정한 발현은 유전자가 선택 이점을 형질감염된 세포에 부여하는 또 다른 유전자와 함께 공형질감염될 때 일어날 수 있다. 이러한 선택 이점은 세포에 제시된 특정 독소에 대한 내성일 수 있다.
용어 "발현 카세트", "발현 구축물" 또는 "발현 벡터"는 코딩 서열 및 주형 서열과 같은 뉴클레오타이드 서열, 및 코딩 서열의 발현에 필요한 서열을 포함하는 핵산을 지칭한다. 발현 카세트는 바이러스 또는 비-바이러스 발현 카세트일 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 숙주 세포에 도입될 때 각각 RNA 또는 폴리펩티드의 전사 및/또는 번역을 야기하는 핵산 구축물을 포함한다. 번역되지 않거나 번역될 수 없는 안티센스 구축물 또는 센스 구축물은 이 정의에 의해 명시적으로 포함된다. 숙련된 자는 삽입된 폴리뉴클레오타이드 서열이 동일할 필요는 없지만 이 서열이 유래된 유전자의 서열과 단지 실질적으로 유사할 수 있음을 인식할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "플라스미드"는 일반적으로 비-바이러스 발현 벡터, 예를 들어, 유전자, 및/또는 유전자의 발현에 필요한 조절 요소를 코딩하는 핵산 분자를 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "바이러스 벡터"는 일반적으로 또 다른 핵산을 세포 내로 수송할 수 있는 바이러스 유래 핵산을 의미한다. 바이러스 벡터는 적절한 환경에 존재할 때 벡터에 의해 운반되는 하나 이상의 유전자에 의해 코딩된 단백질 또는 단백질들의 발현을 유도할 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 세포에서 코딩 서열의 전사를 유도할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 따라서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드 구축물에 사용된 프로모터는 유전자의 전사 시간 및/또는 속도를 조절하거나 조정하는 데 관여하는 시스 작용 전사 조절 요소 및 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 프로모터는 전사 조절에 관여하는 인핸서, 프로모터, 전사 터미네이터, 복제 기점, 염색체 통합 서열, 5' 및 3' 비번역 영역, 또는 인트론 서열을 비롯한 시스 작용 전사 조절 요소일 수 있다. 이 시스 작용 서열은 전형적으로 단백질 또는 다른 생체분자와 상호작용하여 유전자 전사를 수행한다(켜기/끄기, 조절, 조정 등). "항시성 프로모터"는 거의 모든 조직 유형에서 전사를 시작할 수 있는 프로모터인 반면, "조직 특이적 프로모터"는 하나 또는 소수의 특정 조직 유형에서만 전사를 시작한다. "유도 가능한 프로모터"는 특정 환경 조건, 발생 조건, 또는 약물 또는 화학적 조건 하에서만 전사를 시작하는 프로모터이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상보체", "상보체들", "상보적" 및 "상보성"은 일반적으로 소정의 서열에 완전히 상보적이고 하이브리드화될 수 있는 서열을 지칭한다. 일부 경우, 소정의 핵산과 하이브리드화된 서열은 예를 들어, A-T, A-U, G-C 및 G-U 염기쌍이 형성되도록 소정의 영역에 걸쳐 그의 염기 서열이 그의 결합 파트너의 염기 서열에 상보적으로 결합할 수 있는 경우 소정의 분자의 "상보체" 또는 "역상보체"로서 지칭된다. 일반적으로, 제2 서열에 하이브리드화될 수 있는 제1 서열은 제2 서열에 특이적 또는 선택적으로 하이브리드화될 수 있으므로, 하이브리드화 반응 동안 제2 서열 또는 제2 서열 세트에의 하이브리드화는 비-표적 서열에의 하이브리드화보다 더 선호된다(예를 들어, 소정의 조건 세트, 예컨대, 당분야에서 통상적으로 사용되는 엄격한 조건 하에 열역학적으로 더 안정하다). 전형적으로, 하이브리드화될 수 있는 서열들은 이들 각각의 길이의 전체 또는 일부에 걸쳐 어느 정도의 서열 상보성, 예컨대, 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100% 서열 상보성을 포함하는 25% 내지 100% 상보성을 공유한다. 예컨대, 퍼센트 상보성을 평가하기 위한 서열 동일성은 니들만-분슈(Needleman-Wunsch) 알고리즘(예를 들어, 임의로 디폴트 설정을 가진, 웹사이트(www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)에서 이용될 수 있는 EMBOSS Needle 정렬기 참조), BLAST 알고리즘(예를 들어, 임의로 디폴트 설정을 가진, 웹사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)에서 이용될 수 있는 BLAST 정렬 수단 참조), 또는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘(예를 들어, 임의로 디폴트 설정을 가진, 웹사이트( www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html)에서 이용될 수 있는 EMBOSS Water 정렬기 참조)을 포함하나 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 정렬 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 포함하는, 선택된 알고리즘의 임의의 적합한 파라미터를 사용함으로써 평가될 수 있다.
상보성은 완벽할 수 있거나 상당할/충분할 수 있다. 두 핵산들 사이의 완벽한 상보성은 두 핵산들이 이중체의 모든 염기가 왓슨-크릭(Watson-Crick) 페어링에 의해 상보적 염기에 결합되어 있는 이중체를 형성할 수 있음을 의미할 수 있다. 상당한 또는 충분한 상보성은 한 가닥의 서열이 반대 가닥의 서열에 완전히 및/또는 완벽하게 상보적이지 않으나, 하이브리드화 조건 세트(예를 들어, 염 농도 및 온도)에서 두 가닥의 염기 사이에 충분한 결합이 일어나 안정한 하이브리드 복합체를 형성함을 의미할 수 있다. 이러한 조건은 서열과 표준 수학적 계산을 이용하여 하이브리드화된 가닥의 Tm을 예측함으로써 예측될 수 있거나, 관용적인 방법을 이용하여 Tm을 실험적으로 측정함으로써 예측될 수 있다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 일반적으로 펩티드 결합(들)에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 잔기로 이루어진 중합체를 지칭한다. 이 용어는 특정 길이의 중합체를 의미하지 않으며, 펩티드가 재조합 기법, 화학적 또는 효소적 합성을 이용함으로써 생성되는지 아니면 천연적으로 생성되는지를 내포하거나 구분하기 위한 것도 아니다. 상기 용어는 천연 생성 아미노산 중합체뿐만 아니라, 적어도 하나의 변형된 아미노산을 포함하는 아미노산 중합체에도 적용된다. 일부 경우, 중합체는 비-아미노산에 의해 불연속될 수 있다. 상기 용어는 전체 길이 단백질, 및 2차 및/또는 3차 구조(예를 들어, 도메인)을 갖거나 갖지 않은 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산 쇄를 포함한다. 상기 용어는 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 산화 및 임의의 다른 조작, 예컨대, 표지부착 구성요소와의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체도 포괄한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산" 및 "아미노산들"은 일반적으로 변형된 아미노산 및 아미노산 유사체를 포함하나 이들로 제한되지 않는 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 지칭한다. 변형된 아미노산은 천연 아미노산, 및 아미노산에 천연적으로 존재하지 않는 기 또는 화학적 모이어티를 포함하도록 화학적으로 변형된 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산 유사체는 아미노산 유도체를 지칭할 수 있다. 용어 "아미노산"은 D-아미노산 및 L-아미노산 둘 다를 포함한다.
폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유도체", "변이체" 또는 "단편"은 일반적으로 예를 들어, 아미노산 서열, 구조(예를 들어, 2차 및/또는 3차), 활성(예를 들어, 효소 활성) 및/또는 기능에 의해 야생형 폴리펩티드와 관련된 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리펩티드의 유도체, 변이체 및 단편은 야생형 폴리펩티드에 비해 하나 이상의 아미노산 변이(예를 들어, 돌연변이, 삽입 및 결실), 절두, 변형 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 조절 폴리펩티드" 또는 "GMP"는 유전자의 발현 또는 활성을 조절할 수 있고/있거나 핵산 서열을 편집할 수 있는 적어도 하나의 작동자 모이어티를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. GMP는 유전자 발현 조절에 관여하지 않는 추가 펩티드 서열, 예를 들어, 절단 인식 부위, 링커 서열, 표적화 서열 등을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동자 모이어티", "작동자 도메인" 및 "유전자 조절 도메인"은 외생성이든 아니면 내생성이든 관계없이 유전자의 발현 또는 활성을 조절할 수 있고/있거나 핵산 서열을 편집할 수 있는 모이어티를 의미한다. 작동자 모이어티는 전사 수준 및/또는 번역 수준에서 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 작동자 모이어티는 예를 들어, 염색체 DNA 또는 cDNA와 같은 DNA로부터의 mRNA의 생성을 조절함으로써 전사 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 특정 DNA 서열에 결합하는 적어도 하나의 전사 인자를 동원함으로써, DNA로부터 mRNA로의 유전 정보의 전사 속도를 조절한다. 작동자 모이어티는 그 자체로 DNA에 결합할 수 있으며, 예를 들어, RNA 중합효소 및 다른 관련 단백질과 같은 단백질이 DNA 주형에서 어셈블링되는 것을 방지하는 물리적 방해로 전사를 조절할 수 있다. 작동자 모이어티는 예를 들어, mRNA 주형으로부터의 단백질의 생성을 조절함으로써 번역 수준에서 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 mRNA 전사체의 안정성에 영향을 미침으로써 유전자 발현을 조절한다. 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 핵산 서열(예를 들어, 게놈의 영역)을 편집함으로써 유전자의 발현을 조절한다. 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 mRNA 주형을 편집함으로써 유전자의 발현을 조절한다. 일부 경우, 핵산 서열의 편집은 유전자 발현을 위한 기저 주형을 변경시킬 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적화 서열"은 단백질이 세포하(sub-cellular) 위치, 예를 들어, 소정의 소기관, 핵, 세포질, 미토콘드리아, 소포체(ER), 골지, 엽록체, 아포플라스트, 퍼록시좀 또는 다른 소기관의 원형질막 또는 막에 국소화(또는 체류)되는 것을 매개하는 표적화 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 표적화 서열은 핵 국소화 신호(NLS)를 이용하여 단백질(예를 들어, 수용체 폴리펩티드 또는 어댑터 폴리펩티드)을 핵으로 향하게 할 수 있거나; 핵 이출 신호(NES)를 이용하여 이러한 단백질을 세포의 핵 외부, 예를 들어, 세포질로 향하게 할 수 있거나; 미토콘드리아 표적화 신호를 이용하여 이러한 단백질을 미토콘드리아로 향하게 할 수 있거나; 소포체(ER) 체류 신호를 이용하여 이러한 단백질을 ER로 향하게 할 수 있거나; 퍼록시좀 표적화 신호를 이용하여 이러한 단백질을 퍼록시좀으로 향하게 할 수 있거나; 막 국소화 신호를 이용하여 이러한 단백질을 원형질막으로 향하게 할 수 있거나; 이들의 조합을 야기할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "융합체"는 하나 이상의 비천연 서열(예를 들어, 모이어티)을 포함하는 단백질 및/또는 핵산을 지칭할 수 있다. 융합체는 하나 이상의 동일한 비천연 서열을 포함할 수 있다. 융합체는 하나 이상의 상이한 비천연 서열을 포함할 수 있다. 융합체는 키메라일 수 있다. 융합체는 핵산 친화성 태그를 포함할 수 있다. 융합체는 바코드를 포함할 수 있다. 융합체는 펩티드 친화성 태그를 포함할 수 있다. 융합체는 부위 지정 폴리펩티드의 세포하 국소화(예를 들어, 핵으로 표적화하기 위한 핵 국소화 신호(NLS), 미토콘드리아로 표적화하기 위한 미토콘드리아 국소화 신호, 엽록체로 표적화하기 위한 엽록체 국소화 신호, 소포체(ER) 체류 신호 등)를 제공할 수 있다. 융합체는 추적 또는 정제에 사용될 수 있는 비천연 서열(예를 들어, 친화성 태그)을 제공할 수 있다. 융합체는 소분자, 예컨대, 바이오틴 또는 염료, 예컨대, 알렉사 플루오르(alexa fluor) 염료, 시아닌(Cyanine)3 염료, 시아닌5 염료일 수 있다.
융합체는 기능적 효과를 가진 임의의 단백질을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질은 메틸트랜스퍼라제(methyltransferase) 활성, 데메틸라제(demethylase) 활성, 디스뮤타제(dismutase) 활성, 알킬화 활성, 탈푸린화(depurination) 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제(integrase) 활성, 전위효소 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제(ligase) 활성, 헬리카제(helicase) 활성, 포토리아제(photolyase) 활성 또는 글리코실라제(glycosylase) 활성, 아세틸트랜스퍼라제(acetyltransferase) 활성, 데아세틸라제(deacetylase) 활성, 키나제(kinase) 활성, 포스파타제(phosphatase) 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 탈유비퀴틴화(deubiquitinating) 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화(deadenylation) 활성, SUMO일화(SUMOylation) 활성, 탈SUMO일화(deSUMOylation) 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화(deribosylation) 활성, 미리스토일화 활성, 리모델링 활성, 프로테아제(protease) 활성, 산화환원효소 활성, 트랜스퍼라제 활성, 하이드롤라제(hydrolase) 활성, 리아제(lyase) 활성, 이소머라제(isomerase) 활성, 신타제(synthase) 활성, 신테타제(synthetase) 활성 또는 탈미리스토일화(demyristoylation) 활성을 포함할 수 있다. 이펙터 단백질은 게놈 유전자좌를 변형시킬 수 있다. 융합 단백질은 Cas 단백질에서 융합체일 수 있다. 융합 단백질은 Cas 단백질에서 비천연 서열일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비천연"은 천연 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 비천연은 친화성 태그를 지칭할 수 있다. 비천연은 융합을 지칭할 수 있다. 비천연은 돌연변이, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 천연 생성 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 지칭할 수 있다. 비천연 서열은 비천연 서열에 융합되어 있는 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열에 의해서도 나타날 수 있는 활성(예를 들어, 효소 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 키나제 활성, 유비퀴틴화 활성 등)을 나타낼 수 있고/있거나 코딩할 수 있다. 비천연 핵산 또는 폴리펩티드 서열은 키메라 핵산 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 키메라 핵산 및/또는 폴리펩티드 서열을 생성하기 위해 유전적 조작에 의해 천연 생성 핵산 또는 폴리펩티드 서열(또는 이의 변이체)에 연결될 수 있다.
용어 "항체"는 일반적으로 면역글로불린 유사 기능을 가진 단백질성 결합 분자를 지칭한다. 용어 항체는 항체(예를 들어, 단일클론 및 다중클론 항체)뿐만 아니라, 이의 유도체, 변이체 및 단편도 포함한다. 항체는 다양한 클래스(즉, IgA, IgG, IgM, IgD 및 IgE) 및 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2 등)의 면역글로불린(Ig)을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 이의 유도체, 변이체 또는 단편은 상응하는 항체의 (예를 들어, 완전한 및/또는 부분적) 결합 특이성을 보유하는 기능성 유도체 또는 단편을 지칭할 수 있다. 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 가변 단편(Fv), 단일 쇄 가변 단편(scFv), 미니바디, 디아바디 및 단일 도메인 항체("sdAb" 또는 "나노바디" 또는 "낙타")를 포함한다. 용어 항체는 최적화되었거나, 조작되었거나 화학적으로 접합된 항체 및 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 최적화된 항체의 예는 친화성 성숙 항체를 포함한다. 조작된 항체의 예는 Fc 최적화된 항체(예를 들어, 단편 결정화 가능한 영역에서 최적화된 항체) 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)를 포함한다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용된 바와 같이, 용어 "항원 결합 모이어티" 또는 "항원 결합 도메인"은 일반적으로 특정 표적 항원과의 우선적인 결합을 나타내는 구축물을 지칭한다. 항원 결합 도메인은 폴리펩티드 구축물, 예컨대, 항체, 이의 변형체, 이의 단편 또는 이의 조합일 수 있다. 항원 결합 도메인은 본원에 개시된 임의의 항체 또는 이의 기능성 변이체일 수 있다. 항원 결합 도메인의 비제한적 예는 뮤린 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 낙타 Ig, 상어 중쇄 단독 항체(VNAR), Ig NAR, 키메라 항체, 재조합 항체, 또는 이의 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편의 비제한적 예는 Fab, Fab', F(ab)'2, F(ab)'3, Fv, 단일 쇄 항원 결합 단편(scFv), (scFv)2, 이황화 안정화된 Fv(dsFv), 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 단일 도메인 항원 결합 단편(sdAb, 나노바디), 재조합 중쇄 단독 항체(VHH), 및 전체 항체의 결합 특이성을 유지하는 다른 항체 단편을 포함한다.
용어 "향상된 활성", "증가된 활성" 또는 "상향조절된 활성"은 일반적으로 숙주 균주(예를 들어, 숙주 세포)에서 관심 있는 모이어티의 정상 활성 수준보다 더 높은 수준으로 변화된, 관심 있는 모이어티(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드)의 활성을 의미한다. 정상 활성 수준은 실질적으로 0(또는 무의미함)일 수 있거나 0보다 더 높을 수 있다. 관심 있는 모이어티는 숙주 균주의 폴리펩티드 구축물을 포함할 수 있다. 관심 있는 모이어티는 숙주 균주에 또는 숙주 균주 내로 도입되는 이종 폴리펩티드 구축물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 관심 있는 폴리펩티드를 코딩하는 이종 유전자는 숙주 균주에서 관심 있는 폴리펩티드의 향상된 활성을 위해 숙주 균주의 게놈에 넉-인(knock-in)(KI)될 수 있다.
용어 "감소된 활성", "줄어든 활성" 또는 "하향조절된 활성"은 일반적으로 숙주 균주(예를 들어, 숙주 세포)에서 관심 있는 모이어티의 정상 활성 수준보다 더 낮은 수준으로 변화된, 관심 있는 모이어티(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드)의 활성을 지칭한다. 정상 활성 수준은 0보다 더 높다. 관심 있는 모이어티는 숙주 균주의 내생성 유전자 또는 폴리펩티드 구축물을 포함할 수 있다. 일부 경우, 관심 있는 모이어티는 숙주 균주에서 넉-아웃(knock-out)되거나 넉-다운(knock-down)될 수 있다. 일부 예에서, 관심 있는 모이어티의 감소된 활성은 숙주 균주에서 이러한 활성의 완전한 억제를 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환 가능하게 사용된 바와 같이, 용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 일반적으로 척추동물, 바람직하게는 인간과 같은 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 뮤린, 유인원, 인간, 농장 동물, 스포츠 동물 및 반려동물을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 생체내에서 수득되거나 시험관내에서 배양된 생물학적 물질의 조직, 세포 및 이들의 자손도 포함된다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 일반적으로 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 포함하나 이들로 제한되지 않는 유익한 또는 원하는 결과를 수득하기 위한 접근법을 의미한다. 예를 들어, 치료는 본원에 개시된 시스템 또는 세포 집단을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 치료적 이점은 치료 중인 하나 이상의 질환, 병태 또는 증상의 임의의 치료적으로 적절한 개선, 또는 이러한 질환, 병태 또는 증상에 대한 임의의 치료적으로 적절한 효과를 의미한다. 예방적 이점을 위해, 조성물은 특정 질환, 병태 또는 증상을 발생시킬 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있거나, 질환, 병태 또는 증상이 아직 발현되지 않았을 수 있지만 질환의 생리학적 증상들 중 하나 이상의 증상을 보고하는 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "투여한다", "투여하는", "투여" 및 이들의 파생어는 작용제 또는 조성물을 원하는 생물학적 작용 부위로 전달하는 데 이용될 수 있는 방법을 의미한다. 이 방법은 비경구 투여(예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 혈관내, 척수강내, 비강내, 유리체내, 주입 및 국소 주사), 경점막 주사, 경구 투여, 좌약으로서의 투여 및 국소 투여를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 투여는 비경구를 포함하는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 비경구 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 세동맥내, 진피내, 피하, 복강내, 심실내 및 두개내 투여를 포함한다. 다른 전달 방식은 리포좀 제제의 사용, 정맥내 주입, 이식 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 일반적으로 조성물, 예를 들어, 본원에 개시된 조성물(예를 들어, 하나 이상의 유닛 용량)이 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되었을 때 원하는 활성을 발생시키기에 충분한 이 조성물의 양을 의미한다. 본 개시내용의 맥락 내에서, 용어 "치료 유효"는 일반적으로 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 장애의 적어도 하나의 증상의 발현을 지연시키거나, 이러한 증상의 진행을 저지하거나, 이러한 증상을 경감시키거나 완화하기에 충분한 조성물의 양을 의미한다.
I. 도입
면역 세포(예를 들어, T 세포, NK 세포)는 암(예를 들어, 고형 종양, 림프종 등)의 치료를 위한 입양 면역요법을 위해 하나 이상의 특정 항원(예를 들어, 암 또는 종양 항원)에 대한 특정 친화성을 나타내도록 조작될 수 있다. 일부 경우, 면역 세포는 하나 이상의 특정 항원에 결합할 수 있는 이종 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체 또는 "CAR")를 발현함으로써, 대상체에서 암 세포를 표적화하도록 조작될 수 있다. 그러나, 조작된 면역 세포의 치료 효능은 예를 들어, 좋지 않은 수송, 대상체의 혈청에서의 제한된 지속성, 또는 조작된 면역 세포에 대한 대상체의 암 세포 또는 면역 세포의 억제 활성에 의해 제한될 수 있다.
일부 경우, 다수의 재조합 사이토카인(예를 들어, 인터류킨 또는 "IL")을 조작된 면역 세포와 함께 대상체에게 투여하여 그의 효능(예를 들어, 세포독성 활성, 지속성, 증식)을 개선할 수 있다. 그러나, 이러한 재조합 사이토카인의 공투여는 원치 않는 부작용, 예를 들어, 핍지혈증, 구역, 간 기능장애, 전신 독성 및 심지어 사망을 나타낼 수도 있다.
따라서, 부작용을 억제하거나 부작용의 정도를 감소시키면서 암을 치료하기 위해 사이토카인(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조절하여 입양 면역요법의 효능을 향상시킬 필요성이 상당히 충족되지 않은 상태로 남아 있다.
II. 유전자 조절을 위한 시스템
한 측면에서, 본 개시내용은 세포의 내생성 단백질의 발현 또는 활성을 조건부로 조절하는 시스템을 제공한다. 이 시스템은 본원에 개시된 내생성 단백질을 코딩하는 표적 유전자와 복합체를 형성하여 내생성 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 작동자 모이어티를 포함할 수 있다. 작동자 모이어티는 외부 자극(예를 들어, 세포와 특정 리간드의 결합) 시 활성화될 수 있다. 일부 경우, 내생성 단백질은 내생성 사이토카인일 수 있다. 일부 경우, 내생성 단백질은 면역 세포 조절(예를 들어, T 세포 또는 NK 세포 조절)에 관여하는 단백질일 수 있다. 일부 경우, 내생성 사이토카인은 면역 세포 조절에 관여하는 단백질의 일례일 수 있다.
일부 경우, 작동자 모이어티의 활성화는 작동자 모이어티의 변형(예를 들어, 입체구조적 변화, 화학적 변형)을 포함할 수 있다. 일부 경우, 작동자 모이어티의 활성화는 기질(예를 들어, 폴리펩티드 기질)로부터의 작동자 모이어티의 방출을 포함할 수 있다. 이러한 경우, 작동자 모이어티는 기질에 결합될 때 활성화되지 않을 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 세포의 내생성 단백질의 발현 또는 활성을 조건부로 조절하는 시스템을 제공한다. 이 시스템은 리간드에 결합하였을 때 변형되는 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)를 포함할 수 있다. 이 시스템은 본원에 개시된 내생성 단백질을 코딩하는 표적 유전자와 복합체를 형성하여 내생성 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 작동자 모이어티를 포함할 수 있다. 작동자 모이어티는 수용체 변형 시 활성화될 수 있다. 일부 경우, 내생성 단백질은 내생성 사이토카인일 수 있다.
일부 경우, 수용체는 적어도 하나의 리간드(예를 들어, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 이상의 리간드)에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 모이어티를 포함할 수 있다. 항원 결합 모이어티는 (A) 1가 또는 다가일 수 있고 (B) 단일특이적 또는 다중특이적일 수 있다.
일부 경우, 수용체 변형 시, 작동자 모이어티는 활성화되어 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조절함으로써, 세포가 (i) 대조군에 비해 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화; (ii) 대조군에 비해 세포의 상이한 내생성 단백질(예를 들어, 상이한 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화; (iii) 대조군에 비해 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20% 감소에 의해 확인되는, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성; (iv) 대조군에 비해 세포를 포함하는 세포 집단의 크기의 적어도 20% 증가에 의해 확인되는 향상된 증식; 또는 (v) 대조군에 비해 종양 크기의 감소를 포함하는 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 미칠 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (i) 내지 (v) 중 2개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (i) 내지 (v) 중 3개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (i) 내지 (v) 중 4개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 경우, 세포는 (i) 내지 (v) 모두를 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (i), 및 (ii), (iii), (iv) 및/또는 (v) 중 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (i), 및 (ii), (iii), (iv) 및/또는 (v) 중 2개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (i), 및 (ii), (iii), (iv) 및/또는 (v) 중 3개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (ii), 및 (i), (iii), (iv) 및/또는 (v) 중 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (ii), 및 (i), (iii), (iv) 및/또는 (v) 중 2개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (ii), 및 (i), (iii), (iv) 및/또는 (v) 중 3개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (iii), 및 (ii), (i), (iv) 및/또는 (v) 중 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (iii), 및 (ii), (i), (iv) 및/또는 (v) 중 2개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (iii), 및 (ii), (i), (iv) 및/또는 (v) 중 3개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (iv), 및 (ii), (iii), (i) 및/또는 (v) 중 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (iv), 및 (ii), (iii), (i) 및/또는 (v) 중 2개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (iv), 및 (ii), (iii), (i) 및/또는 (v) 중 3개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (v), 및 (ii), (iii), (iv) 및/또는 (i) 중 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (v), 및 (ii), (iii), (iv) 및/또는 (i) 중 2개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (v), 및 (ii), (iii), (iv) 및/또는 (i) 중 3개 이상의 특성을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (i)를 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (ii)를 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (iii)을 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (iv)를 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (v)를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, 작동자 모이어티는 하나 이상의 전사 인자(예를 들어, 내생성 전사 인자(들))를 이용하는 신호전달 경로의 부재 하에 활성화될 수 있다. 대안적으로, 작동자 모이어티는 하나 이상의 전사 인자(예를 들어, 내생성 전사 인자(들))를 이용하는 신호전달 경로를 통해 활성화될 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 표적 유전자는 내생성 유전자일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 표적 유전자는 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)을 코딩하는 이종 유전자일 수 있다. 예를 들어, 이종 유전자는 내생성 단백질의 천연 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 작동자 모이어티(예를 들어, 유전자 조절 폴리펩티드 또는 GMP의 일부인 작동자 모이어티)는 세포에 대한 작동자 모이어티일 수 있다. GMP는 기질일 수 있고, 작동자 모이어티의 활성화는 본원에 개시된 바와 같이 수용체 변형 시 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 포함할 수 있다. GMP는 더 큰 단백질(예를 들어, 본원에 개시된 수용체 폴리펩티드 또는 어댑터 폴리펩티드)의 일부일 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 작동자 모이어티는 표적 유전자의 내생성 프로모터와 복합체를 형성할 수 있다. 일부 경우, 본원에 개시된 작동자 모이어티는 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 복합체를 형성할 수 있다. 일부 경우, 본원에 개시된 작동자 모이어티는 표적 유전자의 인트론과 복합체를 형성할 수 있다. 일부 경우, 본원에 개시된 작동자 모이어티는 표적 유전자의 엑손과 복합체를 형성할 수 있다.
본원에 개시된 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 TSS의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 약 100%를 포함할 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 TSS의 최대 약 100%, 최대 약 99%, 최대 약 98%, 최대 약 87%, 최대 약 96%, 최대 약 95%, 최대 약 90%, 최대 약 85%, 최대 약 80%, 최대 약 75%, 최대 약 70%, 최대 약 65%, 최대 약 60%, 최대 약 55%, 최대 약 50%, 최대 약 40%, 최대 약 30%, 최대 약 20%, 최대 약 15%, 최대 약 10%, 최대 약 5% 또는 더 낮은 퍼센트를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 유전자의 TSS로부터 최대 약 20,000개 염기, 최대 약 10,000개 염기, 최대 약 9,000개 염기, 최대 약 8,000개 염기, 최대 약 7,000개 염기, 최대 약 6,000개 염기, 최대 약 5,000개 염기, 최대 약 4,000개 염기, 최대 약 3,000개 염기, 최대 약 2,500개 염기, 최대 약 2,000개 염기, 최대 약 1,900개 염기, 최대 약 1,800개 염기, 최대 약 1,700개 염기, 최대 약 1,600개 염기, 최대 약 1,500개 염기, 최대 약 1,400개 염기, 최대 약 1,300개 염기, 최대 약 1,200개 염기, 최대 약 1,100개 염기, 최대 약 1,000개 염기, 최대 약 900개 염기, 최대 약 800개 염기, 최대 약 700개 염기, 최대 약 600개 염기, 최대 약 500개 염기, 최대 약 450개 염기, 최대 약 400개 염기, 최대 약 350개 염기, 최대 약 300개 염기, 최대 약 250개 염기, 최대 약 200개 염기, 최대 약 150개 염기, 최대 약 100개 염기 또는 더 적은 염기(예를 들어, 기껏해야 표적 유전자의 TSS의 중심 핵염기의 업스트림 또는 다운스트림에 있는 개시된 대략적인 염기 수)만큼 떨어져 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부는 표적 유전자의 TSS의 다운스트림일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부는 표적 유전자의 TSS의 업스트림일 수 있다. 일부 예에서, 표적 유전자의 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 본원에 개시된 시스템 및 방법에 의해 이용될 수 있고(예를 들어, 본원에 개시된 작동자 모이어티와 복합체를 형성함), 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 (1) 표적 유전자의 TSS의 적어도 부분적으로 다운스트림에 있는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열, (2) 표적 유전자의 TSS의 적어도 부분적으로 업스트림에 있는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 (3) 표적 유전자의 TSS로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성원(예를 들어, 1개의 구성원, 2개의 구성원 또는 3개의 구성원 모두)을 포함할 수 있다.
일부 경우, 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 중심 핵염기)과 표적 유전자의 TSS(예를 들어, TSS의 중심 핵염기) 사이의 거리는 약 1개 염기 내지 약 10,000개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 적어도 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 최대 약 10,000개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 10,000개 염기 내지 약 9,000개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 8,000개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 7,000개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 6,000개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 5,000개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 4,000개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 10,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 8,000개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 7,000개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 6,000개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 5,000개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 4,000개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 9,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 8,000개 염기 내지 약 7,000개 염기, 약 8,000개 염기 내지 약 6,000개 염기, 약 8,000개 염기 내지 약 5,000개 염기, 약 8,000개 염기 내지 약 4,000개 염기, 약 8,000개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 8,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 8,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 8,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 8,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 7,000개 염기 내지 약 6,000개 염기, 약 7,000개 염기 내지 약 5,000개 염기, 약 7,000개 염기 내지 약 4,000개 염기, 약 7,000개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 7,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 7,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 7,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 7,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 6,000개 염기 내지 약 5,000개 염기, 약 6,000개 염기 내지 약 4,000개 염기, 약 6,000개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 6,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 6,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 6,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 6,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 4,000개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 1개 염기, 또는 약 500개 염기 내지 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 10,000개 염기, 약 9,000개 염기, 약 8,000개 염기, 약 7,000개 염기, 약 6,000개 염기, 약 5,000개 염기, 약 4,000개 염기, 약 3,000개 염기, 약 2,000개 염기, 약 1,000개 염기, 약 500개 염기 또는 약 1개 염기일 수 있다.
일부 경우, 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 중심 핵염기)과 표적 유전자의 TSS(예를 들어, TSS의 중심 핵염기) 사이의 거리는 약 1개 염기 내지 약 5,000개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 적어도 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 최대 약 5,000개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 5,000개 염기 내지 약 4,500개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 4,000개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 3,500개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 2,500개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 1,500개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 100개 염기, 약 5,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 4,000개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 3,500개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 2,500개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 1,500개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 500개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 100개 염기, 약 4,500개 염기 내지 약 1개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 3,500개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 2,500개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 1,500개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 100개 염기, 약 4,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 3,500개 염기 내지 약 3,000개 염기, 약 3,500개 염기 내지 약 2,500개 염기, 약 3,500개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 3,500개 염기 내지 약 1,500개 염기, 약 3,500개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 3,500개 염기 내지 약 500개 염기, 약 3,500개 염기 내지 약 100개 염기, 약 3,500개 염기 내지 약 1개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 2,500개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 1,500개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 100개 염기, 약 3,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 2,500개 염기 내지 약 2,000개 염기, 약 2,500개 염기 내지 약 1,500개 염기, 약 2,500개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 2,500개 염기 내지 약 500개 염기, 약 2,500개 염기 내지 약 100개 염기, 약 2,500개 염기 내지 약 1개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1,500개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 100개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 1,500개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 1,500개 염기 내지 약 500개 염기, 약 1,500개 염기 내지 약 100개 염기, 약 1,500개 염기 내지 약 1개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 100개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 500개 염기 내지 약 100개 염기, 약 500개 염기 내지 약 1개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 5,000개 염기, 약 4,500개 염기, 약 4,000개 염기, 약 3,500개 염기, 약 3,000개 염기, 약 2,500개 염기, 약 2,000개 염기, 약 1,500개 염기, 약 1,000개 염기, 약 500개 염기, 약 100개 염기 또는 약 1개 염기일 수 있다.
일부 경우, 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 중심 핵염기)과 표적 유전자의 TSS(예를 들어, TSS의 중심 핵염기) 사이의 거리는 약 1개 염기 내지 약 2,000개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 적어도 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 최대 약 2,000개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 2,000개 염기 내지 약 1,800개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1,600개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1,400개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1,200개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 800개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 600개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 400개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 200개 염기, 약 2,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 1,800개 염기 내지 약 1,600개 염기, 약 1,800개 염기 내지 약 1,400개 염기, 약 1,800개 염기 내지 약 1,200개 염기, 약 1,800개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 1,800개 염기 내지 약 800개 염기, 약 1,800개 염기 내지 약 600개 염기, 약 1,800개 염기 내지 약 400개 염기, 약 1,800개 염기 내지 약 200개 염기, 약 1,800개 염기 내지 약 1개 염기, 약 1,600개 염기 내지 약 1,400개 염기, 약 1,600개 염기 내지 약 1,200개 염기, 약 1,600개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 1,600개 염기 내지 약 800개 염기, 약 1,600개 염기 내지 약 600개 염기, 약 1,600개 염기 내지 약 400개 염기, 약 1,600개 염기 내지 약 200개 염기, 약 1,600개 염기 내지 약 1개 염기, 약 1,400개 염기 내지 약 1,200개 염기, 약 1,400개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 1,400개 염기 내지 약 800개 염기, 약 1,400개 염기 내지 약 600개 염기, 약 1,400개 염기 내지 약 400개 염기, 약 1,400개 염기 내지 약 200개 염기, 약 1,400개 염기 내지 약 1개 염기, 약 1,200개 염기 내지 약 1,000개 염기, 약 1,200개 염기 내지 약 800개 염기, 약 1,200개 염기 내지 약 600개 염기, 약 1,200개 염기 내지 약 400개 염기, 약 1,200개 염기 내지 약 200개 염기, 약 1,200개 염기 내지 약 1개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 800개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 600개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 400개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 200개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 800개 염기 내지 약 600개 염기, 약 800개 염기 내지 약 400개 염기, 약 800개 염기 내지 약 200개 염기, 약 800개 염기 내지 약 1개 염기, 약 600개 염기 내지 약 400개 염기, 약 600개 염기 내지 약 200개 염기, 약 600개 염기 내지 약 1개 염기, 약 400개 염기 내지 약 200개 염기, 약 400개 염기 내지 약 1개 염기, 또는 약 200개 염기 내지 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 2,000개 염기, 약 1,800개 염기, 약 1,600개 염기, 약 1,400개 염기, 약 1,200개 염기, 약 1,000개 염기, 약 800개 염기, 약 600개 염기, 약 400개 염기, 약 200개 염기 또는 약 1개 염기일 수 있다.
일부 경우, 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 중심 핵염기)과 표적 유전자의 TSS(예를 들어, TSS의 중심 핵염기) 사이의 거리는 약 1개 염기 내지 약 1,000개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 적어도 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 최대 약 1,000개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 1,000개 염기 내지 약 900개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 800개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 700개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 600개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 500개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 400개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 300개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 200개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 100개 염기, 약 1,000개 염기 내지 약 1개 염기, 약 900개 염기 내지 약 800개 염기, 약 900개 염기 내지 약 700개 염기, 약 900개 염기 내지 약 600개 염기, 약 900개 염기 내지 약 500개 염기, 약 900개 염기 내지 약 400개 염기, 약 900개 염기 내지 약 300개 염기, 약 900개 염기 내지 약 200개 염기, 약 900개 염기 내지 약 100개 염기, 약 900개 염기 내지 약 1개 염기, 약 800개 염기 내지 약 700개 염기, 약 800개 염기 내지 약 600개 염기, 약 800개 염기 내지 약 500개 염기, 약 800개 염기 내지 약 400개 염기, 약 800개 염기 내지 약 300개 염기, 약 800개 염기 내지 약 200개 염기, 약 800개 염기 내지 약 100개 염기, 약 800개 염기 내지 약 1개 염기, 약 700개 염기 내지 약 600개 염기, 약 700개 염기 내지 약 500개 염기, 약 700개 염기 내지 약 400개 염기, 약 700개 염기 내지 약 300개 염기, 약 700개 염기 내지 약 200개 염기, 약 700개 염기 내지 약 100개 염기, 약 700개 염기 내지 약 1개 염기, 약 600개 염기 내지 약 500개 염기, 약 600개 염기 내지 약 400개 염기, 약 600개 염기 내지 약 300개 염기, 약 600개 염기 내지 약 200개 염기, 약 600개 염기 내지 약 100개 염기, 약 600개 염기 내지 약 1개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 500개 염기 내지 약 300개 염기, 약 500개 염기 내지 약 200개 염기, 약 500개 염기 내지 약 100개 염기, 약 500개 염기 내지 약 1개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 400개 염기 내지 약 200개 염기, 약 400개 염기 내지 약 100개 염기, 약 400개 염기 내지 약 1개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 300개 염기 내지 약 100개 염기, 약 300개 염기 내지 약 1개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 약 200개 염기 내지 약 1개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 1,000개 염기, 약 900개 염기, 약 800개 염기, 약 700개 염기, 약 600개 염기, 약 500개 염기, 약 400개 염기, 약 300개 염기, 약 200개 염기, 약 100개 염기 또는 약 1개 염기일 수 있다.
일부 경우, 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 중심 핵염기)과 표적 유전자의 TSS(예를 들어, TSS의 중심 핵염기) 사이의 거리는 약 1개 염기 내지 약 500개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 적어도 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 최대 약 500개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 500개 염기 내지 약 450개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 500개 염기 내지 약 350개 염기, 약 500개 염기 내지 약 300개 염기, 약 500개 염기 내지 약 250개 염기, 약 500개 염기 내지 약 200개 염기, 약 500개 염기 내지 약 150개 염기, 약 500개 염기 내지 약 100개 염기, 약 500개 염기 내지 약 50개 염기, 약 500개 염기 내지 약 1개 염기, 약 450개 염기 내지 약 400개 염기, 약 450개 염기 내지 약 350개 염기, 약 450개 염기 내지 약 300개 염기, 약 450개 염기 내지 약 250개 염기, 약 450개 염기 내지 약 200개 염기, 약 450개 염기 내지 약 150개 염기, 약 450개 염기 내지 약 100개 염기, 약 450개 염기 내지 약 50개 염기, 약 450개 염기 내지 약 1개 염기, 약 400개 염기 내지 약 350개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 400개 염기 내지 약 250개 염기, 약 400개 염기 내지 약 200개 염기, 약 400개 염기 내지 약 150개 염기, 약 400개 염기 내지 약 100개 염기, 약 400개 염기 내지 약 50개 염기, 약 400개 염기 내지 약 1개 염기, 약 350개 염기 내지 약 300개 염기, 약 350개 염기 내지 약 250개 염기, 약 350개 염기 내지 약 200개 염기, 약 350개 염기 내지 약 150개 염기, 약 350개 염기 내지 약 100개 염기, 약 350개 염기 내지 약 50개 염기, 약 350개 염기 내지 약 1개 염기, 약 300개 염기 내지 약 250개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 300개 염기 내지 약 150개 염기, 약 300개 염기 내지 약 100개 염기, 약 300개 염기 내지 약 50개 염기, 약 300개 염기 내지 약 1개 염기, 약 250개 염기 내지 약 200개 염기, 약 250개 염기 내지 약 150개 염기, 약 250개 염기 내지 약 100개 염기, 약 250개 염기 내지 약 50개 염기, 약 250개 염기 내지 약 1개 염기, 약 200개 염기 내지 약 150개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 약 200개 염기 내지 약 50개 염기, 약 200개 염기 내지 약 1개 염기, 약 150개 염기 내지 약 100개 염기, 약 150개 염기 내지 약 50개 염기, 약 150개 염기 내지 약 1개 염기, 약 100개 염기 내지 약 50개 염기, 약 100개 염기 내지 약 1개 염기, 또는 약 50개 염기 내지 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 500개 염기, 약 450개 염기, 약 400개 염기, 약 350개 염기, 약 300개 염기, 약 250개 염기, 약 200개 염기, 약 150개 염기, 약 100개 염기, 약 50개 염기 또는 약 1개 염기일 수 있다.
일부 경우, 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 중심 핵염기)과 표적 유전자의 TSS(예를 들어, TSS의 중심 핵염기) 사이의 거리는 약 1개 염기 내지 약 250개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 적어도 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 최대 약 250개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 250개 염기 내지 약 225개 염기, 약 250개 염기 내지 약 200개 염기, 약 250개 염기 내지 약 175개 염기, 약 250개 염기 내지 약 150개 염기, 약 250개 염기 내지 약 125개 염기, 약 250개 염기 내지 약 100개 염기, 약 250개 염기 내지 약 75개 염기, 약 250개 염기 내지 약 50개 염기, 약 250개 염기 내지 약 25개 염기, 약 250개 염기 내지 약 1개 염기, 약 225개 염기 내지 약 200개 염기, 약 225개 염기 내지 약 175개 염기, 약 225개 염기 내지 약 150개 염기, 약 225개 염기 내지 약 125개 염기, 약 225개 염기 내지 약 100개 염기, 약 225개 염기 내지 약 75개 염기, 약 225개 염기 내지 약 50개 염기, 약 225개 염기 내지 약 25개 염기, 약 225개 염기 내지 약 1개 염기, 약 200개 염기 내지 약 175개 염기, 약 200개 염기 내지 약 150개 염기, 약 200개 염기 내지 약 125개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 약 200개 염기 내지 약 75개 염기, 약 200개 염기 내지 약 50개 염기, 약 200개 염기 내지 약 25개 염기, 약 200개 염기 내지 약 1개 염기, 약 175개 염기 내지 약 150개 염기, 약 175개 염기 내지 약 125개 염기, 약 175개 염기 내지 약 100개 염기, 약 175개 염기 내지 약 75개 염기, 약 175개 염기 내지 약 50개 염기, 약 175개 염기 내지 약 25개 염기, 약 175개 염기 내지 약 1개 염기, 약 150개 염기 내지 약 125개 염기, 약 150개 염기 내지 약 100개 염기, 약 150개 염기 내지 약 75개 염기, 약 150개 염기 내지 약 50개 염기, 약 150개 염기 내지 약 25개 염기, 약 150개 염기 내지 약 1개 염기, 약 125개 염기 내지 약 100개 염기, 약 125개 염기 내지 약 75개 염기, 약 125개 염기 내지 약 50개 염기, 약 125개 염기 내지 약 25개 염기, 약 125개 염기 내지 약 1개 염기, 약 100개 염기 내지 약 75개 염기, 약 100개 염기 내지 약 50개 염기, 약 100개 염기 내지 약 25개 염기, 약 100개 염기 내지 약 1개 염기, 약 75개 염기 내지 약 50개 염기, 약 75개 염기 내지 약 25개 염기, 약 75개 염기 내지 약 1개 염기, 약 50개 염기 내지 약 25개 염기, 약 50개 염기 내지 약 1개 염기, 또는 약 25개 염기 대 약 1개 염기일 수 있다. 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 표적 유전자의 TSS 사이의 거리는 약 250개 염기, 약 225개 염기, 약 200개 염기, 약 175개 염기, 약 150개 염기, 약 125개 염기, 약 100개 염기, 약 75개 염기, 약 50개 염기, 약 25개 염기 또는 약 1개 염기일 수 있다.
일부 경우, 세포는 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)을 코딩하는 이종 유전자를 포함하지 않을 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 세포는 내생성 단백질의 수용체를 코딩하는 이종 유전자를 포함하지 않을 수 있다.
일부 경우, 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)은 분비 단백질일 수 있다.
일부 경우, 세포는 대조군 세포에 비해 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 100%, 적어도 또는 최대 약 200%, 적어도 또는 최대 약 300%, 적어도 또는 최대 약 400%, 적어도 또는 최대 약 500%, 적어도 또는 최대 약 600%, 적어도 또는 최대 약 700%, 적어도 또는 최대 약 800%, 적어도 또는 최대 약 900%, 적어도 또는 최대 약 1,000%, 적어도 또는 최대 약 2,000%, 적어도 또는 최대 약 3,000%, 적어도 또는 최대 약 4,000%, 또는 적어도 또는 최대 약 5,000% 변화를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, 세포는 대조군 세포에 비해 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 100%, 적어도 또는 최대 약 200%, 적어도 또는 최대 약 300%, 적어도 또는 최대 약 400%, 적어도 또는 최대 약 500%, 적어도 또는 최대 약 600%, 적어도 또는 최대 약 700%, 적어도 또는 최대 약 800%, 적어도 또는 최대 약 900%, 적어도 또는 최대 약 1,000%, 적어도 또는 최대 약 2,000%, 적어도 또는 최대 약 3,000%, 적어도 또는 최대 약 4,000%, 또는 적어도 또는 최대 약 5,000% 증가를 나타내도록 영향을 받을 수 있다
일부 경우, 세포는 대조군 세포에 비해 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 100%, 적어도 또는 최대 약 200%, 적어도 또는 최대 약 300%, 적어도 또는 최대 약 400%, 적어도 또는 최대 약 500%, 적어도 또는 최대 약 600%, 적어도 또는 최대 약 700%, 적어도 또는 최대 약 800%, 적어도 또는 최대 약 900%, 적어도 또는 최대 약 1,000%, 적어도 또는 최대 약 2,000%, 적어도 또는 최대 약 3,000%, 적어도 또는 최대 약 4,000%, 또는 적어도 또는 최대 약 5,000% 감소를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, 대조군 세포에 비해 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 변화(예를 들어, 증가, 감소)는 본원에 개시된 바와 같이 적어도 또는 최대 약 6시간, 적어도 또는 최대 약 12시간, 적어도 또는 최대 약 18시간, 적어도 또는 최대 약 24시간, 적어도 또는 최대 약 2일, 적어도 또는 최대 약 3일, 적어도 또는 최대 약 4일, 적어도 또는 최대 약 5일, 적어도 또는 최대 약 6일, 적어도 또는 최대 약 7일, 적어도 또는 최대 약 2주, 적어도 또는 최대 약 3주, 또는 적어도 또는 최대 약 4주의 수용체 변형 시 관찰될 수 있다.
일부 경우, 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 변화(예를 들어, 증가, 감소)는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 일어날 수 있다(또는 관찰될 수 있다).
일부 경우, 본원에 개시된 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)은 인터류킨(IL)을 포함할 수 있다. 일부 경우, 내생성 사이토카인은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 및 IL-36으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성원을 포함할 수 있다. 일부 경우, 내생성 사이토카인은 IL-12의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 경우, 표적 유전자는 IL-12A(p35)를 코딩하는 제1 유전자 또는 IL-12B(p40)를 코딩하는 제2 유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 표적 유전자는 IL-12A(p35)를 코딩하는 제1 유전자 및 IL-12B(p40)를 코딩하는 제2 유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 내생성 사이토카인은 IL-21의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 경우, 내생성 사이토카인은 IL-2, IL-6 및/또는 IL-8이 아닐 수 있고 이들일 필요도 없다.
일부 경우, 세포는 대조군에 비해 IL-12(예를 들어, IL-12A 및/또는 IL-12B) 및/또는 IL-21의 발현 또는 활성의 적어도 20% 증가를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, (1) 작동자 모이어티의 제1 작동자 모이어티는 표적 유전자의 제1 유전자와 복합체를 형성할 수 있고 (2) 작동자 모이어티의 제2 작동자 모이어티는 표적 유전자의 제2 유전자와 복합체를 형성할 수 있음으로써, 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절할 수 있고, 이때 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성은 상이한 제1 유전자와 제2 유전자의 조절 하에 있을 수 있다.
일부 경우, (i) 제1 유전자는 내생성 사이토카인의 제1 폴리펩티드를 코딩할 수 있고 (ii) 제2 유전자는 내생성 사이토카인의 제2 부분을 코딩할 수 있다. 일부 경우, 제1 부분 및 제2 부분은 서로 복합체를 형성하여 내생성 사이토카인의 적어도 일부를 형성할 수 있다. 대안적으로, 제1 유전자 및 제2 유전자는 표적 유전자의 프로모터의 상이한 부분일 수 있거나, 표적 유전자의 상이한 프로모터일 수 있다.
일부 예에서, 제1 유전자는 내생성 사이토카인의 제1 부분(예를 들어, IL-12A)을 코딩할 수 있고, 제2 유전자는 내생성 사이토카인의 제2 부분(예를 들어, IL-12B)을 코딩할 수 있다.
일부 경우, 작동자 모이어티는 핵산 가이드된 작동자 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 경우, 시스템은 작동자 모이어티와 복합체를 형성하는 가이드 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우, 시스템은 표적 유전자의 상이한 부분에 대해 상보성을 가진 2개 이상의 가이드 핵산(예를 들어, 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이상의 가이드 핵산)을 추가로 포함한다. 일부 경우, 본원에 개시된 가이드 핵산은 가이드 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 세포는 (1) 내생성 사이토카인의 제1 부분(예를 들어, IL-12A)을 코딩하는 제1 유전자에 결합할 수 있는 제1 가이드 핵산(예를 들어, 제1 가이드 RNA) 및 (2) 내생성 사이토카인의 제2 부분(예를 들어, IL-12B)을 코딩하는 제2 유전자에 결합할 수 있는 제2 가이드 핵산(예를 들어, 제2 가이드 RNA)을 포함할 수 있다.
일부 경우, 세포는 대조군 세포에 비해 상이한 내생성 단백질(예를 들어, 상이한 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 100%, 적어도 또는 최대 약 200%, 적어도 또는 최대 약 300%, 적어도 또는 최대 약 400%, 적어도 또는 최대 약 500%, 적어도 또는 최대 약 600%, 적어도 또는 최대 약 700%, 적어도 또는 최대 약 800%, 적어도 또는 최대 약 900%, 적어도 또는 최대 약 1,000%, 적어도 또는 최대 약 2,000%, 적어도 또는 최대 약 3,000%, 적어도 또는 최대 약 4,000%, 또는 적어도 또는 최대 약 5,000% 변화를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, 세포는 대조군 세포에 비해 상이한 내생성 단백질(예를 들어, 상이한 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 100%, 적어도 또는 최대 약 200%, 적어도 또는 최대 약 300%, 적어도 또는 최대 약 400%, 적어도 또는 최대 약 500%, 적어도 또는 최대 약 600%, 적어도 또는 최대 약 700%, 적어도 또는 최대 약 800%, 적어도 또는 최대 약 900%, 적어도 또는 최대 약 1,000%, 적어도 또는 최대 약 2,000%, 적어도 또는 최대 약 3,000%, 적어도 또는 최대 약 4,000%, 또는 적어도 또는 최대 약 5,000% 증가를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, 세포는 대조군 세포에 비해 상이한 내생성 단백질(예를 들어, 상이한 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 100%, 적어도 또는 최대 약 200%, 적어도 또는 최대 약 300%, 적어도 또는 최대 약 400%, 적어도 또는 최대 약 500%, 적어도 또는 최대 약 600%, 적어도 또는 최대 약 700%, 적어도 또는 최대 약 800%, 적어도 또는 최대 약 900%, 적어도 또는 최대 약 1,000%, 적어도 또는 최대 약 2,000%, 적어도 또는 최대 약 3,000%, 적어도 또는 최대 약 4,000%, 또는 적어도 또는 최대 약 5,000% 감소를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, 대조군 세포에 비해 상이한 내생성 단백질(예를 들어, 상이한 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 변화(예를 들어, 증가, 감소)는 본원에 개시된 바와 같이 적어도 또는 최대 약 6시간, 적어도 또는 최대 약 12시간, 적어도 또는 최대 약 18시간, 적어도 또는 최대 약 24시간, 적어도 또는 최대 약 2일, 적어도 또는 최대 약 3일, 적어도 또는 최대 약 4일, 적어도 또는 최대 약 5일, 적어도 또는 최대 약 6일, 적어도 또는 최대 약 7일, 적어도 또는 최대 약 2주, 적어도 또는 최대 약 3주, 또는 적어도 또는 최대 약 4주의 수용체 변형 시 관찰될 수 있다.
일부 경우, 상이한 내생성 단백질(예를 들어, 상이한 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성 수준의 변화(예를 들어, 증가, 감소)는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 일어날 수 있다(또는 관찰될 수 있다).
일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 IFN을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 IFN-α(알파), IFN-β(베타), IFN-κ(카파), IFN-δ(델타), IFN-ε(엡실론), IFN-τ(타우), IFN-ω(오메가), IFN-ζ(제타), IFN-γ(감마) 및 IFN-λ(람다)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 IFN-γ(감마)를 포함할 수 있다. 일부 경우, 세포는 IFN(예를 들어, IFN-γ)의 발현 또는 활성 수준의 증가를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 TNF 단백질을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 TNFβ, TNFα, TNFγ, CD252(OX40 리간드), CD154(CD40 리간드), CD178(Fas 리간드), CD70(CD27 리간드), CD153(CD30 리간드), 4-1 BBL(CD137 리간드), CD253(TRAIL), CD254(RANKL), APO-3L(TWEAK), CD256(APRIL), CD257(BAFF), CD258(LIGHT), TL1(VEGI), GITRL(TNFSF18) 및 엑토디스플라신 A로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 TNFα를 포함할 수 있다. 일부 경우, 세포는 TNF(예를 들어, TNFα)의 발현 또는 활성 수준의 증가를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 IL(예를 들어, 상이한 IL)을 포함할 수 있다. 일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 IL-2일 수 있다. 일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 IL-12가 아닐 수 있고 IL-12일 필요도 없다. 일부 경우, 상이한 내생성 사이토카인은 IL-21이 아닐 수 있고 IL-21일 필요도 없다. 일부 경우, 세포는 상이한 IL(예를 들어, IL-2)의 발현 또는 활성 수준의 감소를 나타내도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서, 세포는 (1) 내생성 IL(예를 들어, IL-12 또는 IL-21)의 발현 또는 활성 수준의 증가 및 (2) 상이한 내생성 IL(예를 들어, IL-2)의 발현 또는 활성 수준의 감소를 나타내도록 영향을 받을 수 있다.
일부 경우, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성은 표적 세포 집단의 크기의 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 25%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 35%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 45%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 55%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 65%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 75%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 85%, 적어도 또는 최대 약 90%, 또는 적어도 또는 최대 약 95% 감소에 의해 확인될 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성은 본원에 개시된 바와 같이 적어도 또는 최대 약 6시간, 적어도 또는 최대 약 12시간, 적어도 또는 최대 약 18시간. 적어도 또는 최대 약 24시간, 적어도 또는 최대 약 2일, 적어도 또는 최대 약 3일, 적어도 또는 최대 약 4일, 적어도 또는 최대 약 5일, 적어도 또는 최대 약 6일, 적어도 또는 최대 약 7일, 적어도 또는 최대 약 2주, 적어도 또는 최대 약 3주, 적어도 또는 최대 약 4주, 적어도 또는 최대 약 1개월, 적어도 또는 최대 약 2개월, 적어도 또는 최대 약 3개월, 적어도 또는 최대 약 4개월, 적어도 또는 최대 약 5개월, 또는 적어도 또는 최대 약 6개월의 수용체 변형 시 관찰될 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 발생할 수 있다(또는 관찰될 수 있다).
일부 경우, 본원에 개시된 리간드는 이환된 세포의 항원일 수 있다. 일부 경우, 본원에 개시된 표적 세포 집단은 이환된 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 본원에 개시된 이환된 세포는 암 세포 또는 종양 세포를 포함할 수 있다.
일부 경우, 세포의 향상된 증식은 세포를 포함하는 세포 집단의 크기의 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 90%, 적어도 또는 최대 약 100%, 적어도 또는 최대 약 200%, 적어도 또는 최대 약 300%, 적어도 또는 최대 약 400%, 적어도 또는 최대 약 500%, 적어도 또는 최대 약 600%, 적어도 또는 최대 약 700%, 적어도 또는 최대 약 800%, 적어도 또는 최대 약 900%, 적어도 또는 최대 약 1,000%, 적어도 또는 최대 약 2,000%, 적어도 또는 최대 약 3,000%, 적어도 또는 최대 약 4,000%, 또는 적어도 또는 최대 약 5,000% 증가에 의해 확인된다.
일부 경우, 본원에 개시된 세포 또는 세포를 포함하는 세포 집단의 향상된 증식은 본원에 개시된 바와 같이 적어도 또는 최대 약 6시간, 적어도 또는 최대 약 12시간, 적어도 또는 최대 약 18시간, 적어도 또는 최대 약 24시간, 적어도 또는 최대 약 2일, 적어도 또는 최대 약 3일, 적어도 또는 최대 약 4일, 적어도 또는 최대 약 5일, 적어도 또는 최대 약 6일, 적어도 또는 최대 약 7일, 적어도 또는 최대 약 2주, 적어도 또는 최대 약 3주, 적어도 또는 최대 약 4주, 또는 적어도 또는 최대 약 1개월의 수용체 변형 시 관찰될 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 세포 또는 세포를 포함하는 세포 집단의 향상된 증식은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 일어날 수 있다(또는 관찰될 수 있다).
일부 경우, 대상체의 종양(예를 들어, 고형 종양)의 크기는 적어도 또는 최대 약 5%, 적어도 또는 최대 약 10%, 적어도 또는 최대 약 15%, 적어도 또는 최대 약 20%, 적어도 또는 최대 약 25%, 적어도 또는 최대 약 30%, 적어도 또는 최대 약 35%, 적어도 또는 최대 약 40%, 적어도 또는 최대 약 45%, 적어도 또는 최대 약 50%, 적어도 또는 최대 약 55%, 적어도 또는 최대 약 60%, 적어도 또는 최대 약 65%, 적어도 또는 최대 약 70%, 적어도 또는 최대 약 75%, 적어도 또는 최대 약 80%, 적어도 또는 최대 약 85%, 적어도 또는 최대 약 90%, 또는 적어도 또는 최대 약 95% 감소될 수 있다.
일부 경우, 종양 크기의 감소는 본원에 개시된 바와 같이 적어도 또는 최대 약 24시간, 적어도 또는 최대 약 2일, 적어도 또는 최대 약 3일, 적어도 또는 최대 약 4일, 적어도 또는 최대 약 5일, 적어도 또는 최대 약 6일, 적어도 또는 최대 약 7일, 적어도 또는 최대 약 2주, 적어도 또는 최대 약 3주, 적어도 또는 최대 약 4주, 적어도 또는 최대 약 1개월, 적어도 또는 최대 약 2개월, 적어도 또는 최대 약 3개월, 적어도 또는 최대 약 4개월, 적어도 또는 최대 약 5개월, 또는 적어도 또는 최대 약 6개월의 수용체 변형 시 일어날 수 있다(또는 관찰될 수 있다)
일부 경우, 세포는 조혈 줄기 세포(HSC)일 수 있다. 일부 경우, 세포는 면역 세포(림프구)일 수 있다. 일부 경우, 면역 세포는 T 세포, NK 세포, 단핵구, 선천성 림프구, 종양 침윤 림프구, 대식세포 및 과립구로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 대조군은 (i) 기능성 키메라 수용체 폴리펩티드, (ii) 기능성 작동자 모이어티, (iii) 표적 유전자를 표적화하도록 설계된 기능성 가이드 핵산 서열(예를 들어, 기능성 가이드 RNA), (iv) 키메라 수용체 폴리펩티드에 작동 가능하게 커플링된 키메라 어댑터 폴리펩티드(이후 논의됨)를 포함하는 하나 이상의 구성원을 갖지 않는 대조군 세포일 수 있다. 일부 경우, 세포는 가이드 핵산 서열을 이용할 수 있고, 대조군 세포는 표적 유전자와 복합체를 형성하도록 설계되지 않은 대조군 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우, 세포는 2개의 상이한 가이드 핵산 서열(예를 들어, IL-12A에 대한 하나의 가이드 핵산 서열 및 IL-12B에 대한 다른 하나의 가이드 핵산 서열, IL-21에 대한 2개의 가이드 핵산 서열 등)을 이용할 수 있고, 대조군 세포는 2개의 상이한 가이드 핵산 서열들 중 어느 것도 포함하지 않을 수 있거나 이러한 서열들 중 하나만을 포함할 수 있다.
일부 경우, 본 개시내용의 시스템은 대상체에서 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 면역 반응의 비제한적 향상은 증가된 CD4 + 헬퍼 T 세포 활성 및 세포용해성 T 세포의 생성을 포함할 수 있다. 면역 반응의 향상은 세포독성 T 림프구 어세이, 사이토카인의 방출(예를 들어, IL-12, IL-2 또는 IFN-γ 생성), 종양의 퇴행, 종양 보유 동물의 생존, 항체 생성, 면역 세포 증식, 세포 표면 마커의 발현 및 세포독성을 포함하나 이들로 제한되지 않는, 당분야의 숙련된 자에게 알려져 있는 다수의 시험관내 또는 생체내 측정을 이용함으로써 평가될 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 조절된 발현 및/또는 활성은 (i) 다운스트림 신호전달 단백질(예를 들어, (a) IL-12 신호전달을 위한 TYK2, JAK2 또는 STAT4; (b) IL-21 신호전달을 위한 JAK1, JAK2, STAT1, STAT2 또는 STAT3; (c) IFN-γ 신호전달을 위한 JAK1, JAK2 또는 STAT3; (d) TNFα 신호전달을 위한 PI3K, Akt, IκB 키나제, STAT5 등)의 인산화, 또는 (ii) 웨스턴 블롯팅 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법을 통한 다운스트림 유전자(예를 들어, IFN-γ 또는 TNFα)의 발현을 포함하나 이들로 제한되지 않는 다수의 방법에 의해 확인될 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 시스템들 중 어느 한 시스템을 포함하는 세포 집단을 제공한다. 일부 경우, 세포 집단은 조작된 면역 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우, 조작된 면역 세포는 조작된 T 세포를 포함한다. 일부 경우, 조작된 면역 세포는 조작된 NK 세포를 포함한다.
III. 키메라 수용체 폴리펩티드
일부 경우, 본원에 개시된 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)는 키메라 어댑터 폴리펩티드(어댑터)에 작동 가능하게 커플링될 수 있다. 일부 경우, 수용체 및 어댑터는 리간드와 수용체의 결합 시(예를 들어, 수용체를 포함하는 세포와 리간드의 접촉 시) 및/또는 수용체 변형 시 복합체(예를 들어, 신호전달 복합체)를 형성하도록 구성될 수 있다. 어댑터는 막횡단 단백질일 수 있다. 대안적으로, 어댑터는 세포내 단백질일 수 있다. 일부 경우, 어댑터는 수용체 변형 시 수용체 쪽으로 동원되는, 수용체 신호전달 경로의 신호전달 단백질일 수 있다.
일부 경우, 수용체와 어댑터의 복합체 형성은 직접적인 복합체 형성 및/또는 간접적인 복합체 형성일 수 있다. 직접적인 복합체 형성에서, 수용체 및 어댑터 중 하나는 (예를 들어, 공유 및/또는 비공유 상호작용을 통해) 수용체 및 어댑터 중 다른 하나에 직접 결합하도록 구성될 수 있다. 일부 예에서, 수용체 및 어댑터 중 하나는 수용체 및 어댑터 중 다른 하나의 적어도 일부(예를 들어, 세포내 부분)에 결합하도록 구성된 결합 도메인(예를 들어, 폴리펩티드 서열)을 포함할 수 있다. 간접적인 복합체 형성에서, 수용체와 어댑터는 수용체 변형이 없는 경우에 비해 수용체 변형 시 임의의 직접적인 결합 없이 서로에 더 가까워지도록(예를 들어, 하나가 다른 하나 쪽으로 동원되도록) 구성될 수 있다. 일부 예에서, 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 변형된 면역 세포 수용체(예를 들어, 변형된 T 세포 수용체 또는 "TCR")를 포함할 수 있고, 어댑터는 수용체 변형 시 수용체의 신호전달 캐스케이드의 일부로서 동원되는, T 세포 활성화를 위한 링커(LAT)의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
일부 경우, 수용체 및 어댑터 중 하나는 절단 인식 부위에 연결된 작동자 모이어티를 포함하는 유전자 조절 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 수용체 및 어댑터 중 다른 하나는 절단 인식 부위를 절단하여 GMP로부터 작동자 모이어티를 방출하도록 구성된 절단 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 절단 모이어티에 의한 절단 인식 부위의 절단은 수용체와 어댑터 사이의 직접적인 복합체 형성 시 발생할 수 있다. 일부 예에서, 절단 모이어티에 의한 절단 인식 부위의 절단은 수용체와 어댑터 사이의 간접적인 복합체 형성 시 발생할 수 있다. 수용체 변형 시, 본원에 개시된 바와 같이 절단 모이어티가 GMP로부터 작동자 모이어티를 절단함으로써, 작동자 모이어티를 활성화시켜 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조절할 수 있도록, 수용체와 어댑터는 서로를 향해 동원될 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)는 제1 키메라 어댑터 폴리펩티드(제1 어댑터) 및 제2 키메라 어댑터 폴리펩티드(제2 어댑터)에 작동 가능하게 커플링될 수 있다. 일부 경우, 제1 어댑터 및 제2 어댑터는 수용체 변형 시 수용체 신호전달 경로의 수용체 쪽으로 또는 또 다른 신호전달 단백질 쪽으로 동원되는, 수용체 신호전달 경로의 신호전달 단백질일 수 있다. 일부 예에서, 제1 어댑터와 제2 어댑터는 수용체 변형 시 서로를 향해 동원될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 제1 어댑터와 제2 어댑터는 직접적인 결합을 통해 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 제1 어댑터와 제2 어댑터는 (예를 들어, 서로의 근처에서) 간접적인 결합을 통해 복합체를 형성할 수 있다. 일부 경우, 제1 어댑터는 본원에 개시된 바와 같이 (절단 인식 부위에 연결된 작동자 모이어티를 포함하는) GMP를 포함할 수 있고 제2 어댑터는 절단 모이어티를 포함할 수 있다. 수용체 변형 시, 절단 모이어티가 GMP로부터 작동자 모이어티를 절단함으로써, 작동자 모이어티를 활성화시켜 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조절하도록, 제1 어댑터와 제2 어댑터는 서로를 향해 동원될 수 있다.
일부 경우, 제1 어댑터 및 제2 어댑터 중 하나는 절단 인식 부위에 연결된 작동자 모이어티를 포함하는 유전자 조절 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 제1 어댑터 및 제2 어댑터 중 다른 하나는 절단 인식 부위를 절단하여 GMP로부터 작동자 모이어티를 방출하도록 구성된 절단 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 절단 모이어티에 의한 절단 인식 부위의 절단은 제1 어댑터와 제2 어댑터 사이의 직접적인 복합체 형성 시 일어날 수 있다. 일부 예에서, 절단 모이어티에 의한 절단 인식 부위의 절단은 제1 어댑터와 제2 어댑터 사이의 간접적인 복합체 형성 시 일어날 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 수용체는 리간드에 결합할 때 입체구조적 변화 또는 화학적 변형(예를 들어, 인산화 또는 탈인산화)을 포함하는 수용체 변형을 겪을 수 있다.
도 1의 A 내지 D는 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 개략적으로 예시한다. 도 1의 A는 항원과 막횡단 키메라 수용체 폴리펩티드의 결합을 보여준다. 막횡단 키메라 수용체 폴리펩티드는 항원 상호작용 도메인(101)을 가진 세포외 영역 및 GMP를 포함하는 세포내 영역을 포함한다. GMP는 절단 인식 부위(102b)에 연결된 작동자 모이어티(102a)를 포함한다. 항원 결합에 반응하여, 수용체는 수용체의 세포내 영역에서 인산화(103)에 의해 변형된다(도 1의 B). 수용체 변형(예를 들어, 인산화) 후, 수용체 결합 모이어티를 포함하는 어댑터 단백질은 도 1의 C에 나타낸 바와 같이 수용체로 동원된다. 수용체는 절단 모이어티(104)를 포함하고; 절단 모이어티는 어댑터와 복합체를 형성할 수 있거나, 예를 들어, 펩티드 결합 및/또는 펩티드 링커에 의해 수용체 결합 모이어티에 연결될 수 있다. 절단 인식 부위에 근접할 때, 절단 모이어티는 도 1의 D에 나타낸 바와 같이 인식 부위를 절단하여 GMP로부터 작동자 모이어티를 방출할 수 있다. 방출 시, 작동자 모이어티는 핵으로 들어가 표적 유전자의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있거나 핵산 서열을 편집할 수 있다. 도 1의 E 내지 H는 수용체 변형이 입체구조적 변화를 포함하는 유사한 시스템을 보여준다. 일부 실시양태에서, 어댑터 단백질은 (예를 들어, 막 결합 단백질로서) 막에 부착된다.
도 2의 A 내지 D는 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 개략적으로 예시한다. 도 2의 A는 항원과 막횡단 키메라 수용체 폴리펩티드의 결합을 보여준다. 막횡단 키메라 수용체 폴리펩티드는 항원 상호작용 도메인(205)을 가진 세포외 영역 및 절단 모이어티(206)를 포함하는 세포내 영역을 포함한다. 절단 모이어티는 수용체와 복합체를 형성할 수 있거나, 예를 들어, 펩티드 결합 및/또는 펩티드 링커에 의해 수용체에 연결될 수 있다. GMP는 키메라 어댑터 폴리펩티드의 일부를 형성한다. 수용체 결합 모이어티(201)에 연결된 GMP는 절단 인식 부위(202b)에 연결된 작동자 모이어티(202a)를 포함한다. 항원 결합에 반응하여, 수용체는 수용체의 세포내 영역에서 인산화(203)에 의해 변형된다(도 2의 B). 수용체 변형(예를 들어, 인산화) 후, 키메라 어댑터 폴리펩티드는 도 3의 C에 나타낸 바와 같이 수용체로 동원된다. 수용체는 절단 모이어티(206)를 포함한다. 절단 인식 부위에 근접할 때, 절단 모이어티는 도 2의 D에 나타낸 바와 같이 인식 부위를 절단하여 GMP로부터 작동자 모이어티를 방출할 수 있다. 방출 시, 작동자 모이어티는 핵으로 들어가 표적 유전자의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있거나 핵산 서열을 편집할 수 있다. 도 2의 E 내지 H는 수용체 변형이 입체구조적 변화를 포함하는 유사한 시스템을 보여준다. 일부 실시양태에서, 키메라 어댑터 단백질은 (예를 들어, 막 결합 단백질로서) 막에 부착된다.
도 3의 A 내지 D는 GMP로부터의 작동자 모이어티의 방출을 개략적으로 예시한다. 도 3의 A는 항원과 막횡단 키메라 수용체 폴리펩티드의 결합을 보여준다. 막횡단 키메라 수용체 폴리펩티드는 항원 상호작용 도메인(305)을 가진 세포외 영역 및 세포내 영역을 포함한다. 절단 인식 부위에 연결된 작동자 모이어티를 포함하는 GMP는 키메라 어댑터 폴리펩티드의 일부를 형성한다. 절단 인식 부위(302b)는 수용체 결합 모이어티(301) 및 작동자 모이어티(302a)로 플랭킹된다. 항원 결합에 반응하여, 수용체는 세포내 영역에서 인산화(303)에 의해 변형된다(도 3의 B). 수용체 변형(예를 들어, 인산화) 후, 키메라 어댑터 폴리펩티드는 도 3의 B에 나타낸 바와 같이 수용체로 동원된다. 절단 모이어티(306)를 포함하는 제2 어댑터 폴리펩티드(307)도 변형된 수용체로 동원된다(도 3의 C). 절단 모이어티는 제2 어댑터 폴리펩티드와 복합체를 형성할 수 있거나, 예를 들어, 펩티드 결합 및/또는 펩티드 링커에 의해 어댑터에 연결될 수 있다. 절단 인식 부위에 근접할 때, 절단 모이어티는 도 3의 D에 나타낸 바와 같이 인식 부위를 절단하여 GMP로부터 작동자 모이어티를 방출할 수 있다. 방출 시, 작동자 모이어티는 핵으로 들어가 표적 유전자의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있거나 핵산 서열을 편집할 수 있다. 도 3의 E 내지 H는 수용체 변형이 입체구조적 변화를 포함하는 유사한 시스템을 보여준다. 일부 실시양태에서, 키메라 어댑터 폴리펩티드는 (예를 들어, 막 결합 단백질로서) 막에 부착된다. 일부 실시양태에서, 제2 어댑터 폴리펩티드는 (예를 들어, 막 결합 단백질로서) 막에 부착된다.
일부 경우, 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)는 리간드 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 신호전달 도메인은 리간드와 리간드 결합 도메인의 결합 시 세포의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있다. 세포는 프로모터의 조절 하에 놓인 본원에 개시된 작동자 모이어티(예를 들어, 작동자 모이어티를 포함하는 GMP)를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다. 작동자 모이어티는 이종 엔도뉴클레아제를 포함할 수 있다. 프로모터는 리간드와 리간드 결합 도메인의 결합 시 작동자 모이어티의 발현을 유도하도록 활성화될 수 있다. 발현된 작동자 모이어티는 본원에 개시된 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)을 코딩하는 표적 유전자와 복합체를 형성하여, 상기 내생성 단백질의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다. 프로모터는 세포의 내생성 프로모터를 포함할 수 있다. 내생성 프로모터는 리간드와, 수용체의 리간드 결합 도메인의 결합 시 활성화될 수 있다.
도 4는 적어도 하나의 표적 유전자의 발현을 조절하는 데 유용한 막횡단 수용체를 포함하는 예시적인 시스템을 예시한다. 리간드와 키메라 수용체 폴리펩티드(예를 들어, scFv-CAR)의 결합 시, 고유 신호 전달도입 경로가 활성화되어, 적어도 하나의 세포 전사 인자(예를 들어, 내생성 전사 인자)가 천연 유전자좌에 있는 내생성 유전자(시그니처 유전자)의 프로모터 영역으로 동원된다. 작동자 모이어티 코딩 서열(예를 들어, 작동자 모이어티 코딩 서열을 포함하는 GMP 코딩 서열)은 게놈에 통합되고 시그니처 유전자의 프로모터의 조절 하에 배치된다. 프로모터의 전사 활성화는 작동자 모이어티(예를 들어, 전사 활성화제(예를 들어, VPR) 또는 전사 억제인자(예를 들어, KRAB)에 연결된 dCas를 포함함)의 발현을 야기한다. 발현된 작동자 모이어티는 가이드 RNA(예를 들어, sgRNAa, sgRNAb)(예를 들어, 항시적으로 또는 조건부로 발현됨)와 복합체를 형성할 때 본원에 개시된 내생성 단백질(예를 들어, IL-12A와 같은 유전자 A, IL-12B와 같은 유전자 B)의 발현을 조절(활성화 또는 억제)할 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)는 키메라 항원 수용체(CAR) 및/또는 변형된 T 세포 수용체(TCR)일 수 있다.
일부 경우, 본원에 개시된 CAR은 제1세대, 제2세대, 제3세대 또는 제4세대 CAR 시스템, 이의 기능성 변이체, 또는 이의 임의의 조합일 수 있다. 제1세대 CAR(예를 들어, CD19R 또는 CD19CAR)은 특정 항원에 대한 특이성을 가진 항원 결합 도메인(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대, scFv, Fab 단편, VHH 도메인, 또는 중쇄 단독 항체의 VH 도메인), 적응 면역 수용체로부터 유래한 막횡단 도메인(예를 들어, CD28 수용체로부터 유래한 막횡단 도메인), 및 적응 면역 수용체로부터 유래한 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ 수용체 또는 FcεRIγ의 세포내 영역으로부터 유래한 하나 이상(예를 들어, 3개)의 ITAM 도메인)을 포함한다. 제2세대 CAR은 보조자극 도메인을 CAR의 세포내 신호전달 도메인 부분(예를 들어, T 세포 수용체와 함께 작용하는 보조자극 수용체, 예컨대, CD28, CD137/4-1BB 및 CD134/OX40으로부터 유래함)에 추가하여 제1세대 CAR을 변형시킴으로써, 제1세대 CAR과 함께 보조인자(예를 들어, IL-2)를 투여할 필요성을 없앤다. 제3세대 CAR은 다수의 보조자극 도메인을 CAR의 세포내 신호전달 도메인 부분(예를 들어, CD3ζ-CD28-OX40 또는 CD3ζ-CD28-41BB)에 추가한다. 제4세대 CAR은 활성화 사이토카인(예를 들어, IL-23 또는 IL-27)을 CAR의 세포내 신호전달 부분(예를 들어, 하나 이상의 보조자극 도메인과 CD3ζ ITAM 도메인 사이)에 추가하거나 CAR 유도 프로모터(예를 들어, NFAT/IL-2 최소 프로모터)의 조절 하에 배치함으로써 제2세대 또는 제3세대 CAR을 변형시킨다.
IV. 작동자 모이어티
본원에 개시된 작동자 모이어티(예를 들어, GMP의 일부인 작동자 모이어티)는 (예를 들어, 삽입 및/또는 결실(indel), 상동성 유도 복구(HDR), 비-상동성 말단 연결(NHEJ)을 통해) 표적 유전자를 편집하여, 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인, 예컨대, IL-12 또는 IL-21)의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다. 대안적으로, 작동자 모이어티는 표적 유전자를 편집할 수 없지만, 여전히 표적 유전자와 복합체를 형성하는 능력을 나타낼 수 있다(예를 들어, 본원에서 제공된 바와 같이, 불활성화되었거나 사멸된 CRISPR/Cas 단백질).
본원에 개시된 작동자 모이어티(예를 들어, GMP의 일부인 작동자 모이어티)는 적어도 하나의 이펙터 도메인에 작동 가능하게 커플링될 수 있다. 적어도 하나의 이펙터 도메인은 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조절하도록 구성될 수 있다. 일부 경우, 작동자 모이어티는 적어도 하나의 이펙터 도메인에 융합되어 융합 모이어티를 형성할 수 있다. 일부 경우, 작동자 모이어티는 제1 커플링 모이어티(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드)를 포함할 수 있고, 적어도 하나의 이펙터 도메인은 제2 커플링 모이어티(예를 들어, 제1 폴리뉴클레오타이드에 대해 상보성을 가진 제2 폴리뉴클레오타이드)를 포함할 수 있으므로, 작동자 모이어티와 적어도 하나의 이펙터 도메인은 서로 커플링될 수 있다. 일부 예에서, 적어도 하나의 이펙터 도메인은 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조절하기 위한 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인일 수 있다.
본원에 개시된 적어도 하나의 이펙터 도메인의 기능의 비제한적 예는 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 디스뮤타제 활성, 알킬화 활성, 탈푸린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 전위효소 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 포토리아제 활성 또는 글리코실라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, SUMO일화 활성, 탈SUMO일화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성, 리모델링 활성, 프로테아제 활성, 산화환원효소 활성, 트랜스퍼라제 활성, 하이드롤라제 활성, 리아제 활성, 이소머라제 활성, 신타제 활성, 신테타제 활성 및 탈미리스토일화 활성을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 적어도 하나의 이펙터 도메인의 비제한적 예는 메틸트랜스퍼라제, 데메틸라제, 디스뮤타제, 알킬화 효소, 탈푸린화 효소, 산화 효소, 피리미딘 이량체 형성 효소, 인테그라제, 전위효소, 재조합효소, 중합효소, 리가제, 헬리카제, 포토리아제 또는 글리코실라제, 아세틸트랜스퍼라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 유비퀴틴 리가제, 탈유비퀴틴화 효소, 아데닐화 효소, 탈아데닐화 효소, SUMO일화 효소, 탈SUMO일화 효소, 리보실화 효소, 탈리보실화 효소, 미리스토일화 효소, 리모델링 효소, 프로테아제, 산화환원효소, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 리아제, 이소머라제, 신타제, 신테타제 및 탈미리스토일화 효소를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 작동자 모이어티는 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas)와 같은 뉴클레아제를 포함할 수 있다. 엔도뉴클레아제는 본원에 개시된 임의의 세포에 대해 이종성일 수 있다.
본원에 개시된 작동자 모이어티는 Cas 엔도뉴클레아제, 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), 징크 핑거 관련 유전자 조절 폴리펩티드, 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 전사 활성화제 유사 이펙터 관련 유전자 조절 폴리펩티드, 메가뉴클레아제, 천연 마스터 전사 인자, 후성적 변형 효소, 재조합효소, 플립파제(flippase), 전위효소, RNA 결합 단백질(RBP), 아그로나우트(Argonaute) 단백질, 이들의 임의의 유도체, 이들의 임의의 변이체 또는 이들의 임의의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 Cas 단백질을 포함하고, 시스템은 Cas 단백질과 복합체를 형성하는 가이드 RNA(gRNA)를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 작동자 모이어티는 Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있는 gRNA와 복합체를 형성한 RBP를 포함한다. 일부 실시양태에서, gRNA는 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 80% 서열 동일성을 나타내는 표적화 분절을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 단백질은 DNA 절단 활성을 실질적으로 결여한다(즉, 사멸된 Cas, 불활성화된 Cas 또는 dCas). 예를 들어, Cas 단백질은 돌연변이되고/되거나 변형되어, 뉴클레아제 결핍 단백질, 또는 야생형 Cas 단백질에 비해 감소된 뉴클레아제 활성을 가진 단백질을 생성한다. 뉴클레아제 결핍 단백질은 DNA에 결합하는 능력을 보유할 수 있지만, 핵산 절단 활성을 결여할 수 있거나 감소된 핵산 절단 활성을 가질 수 있다.
일부 경우, 적합한 작동자 모이어티는 제I형 CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드, 제II형 CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드, 제III형 CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드, 제IV형 CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드, 제V형 CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드 및 제VI형 CRISPR 관련(Cas) 폴리펩티드를 포함하는 CRISPR 관련(Cas) 단백질 또는 Cas 뉴클레아제; 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN); 전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN); 메가뉴클레아제; RNA 결합 단백질(RBP); CRISPR 관련 RNA 결합 단백질; 재조합효소; 플립파제; 전위효소; 아그로나우트(Ago) 단백질(예를 들어, 원핵생물 아그로나우트(pAgo), 고세균 아그로나우트(aAgo) 및 진핵생물 아그로나우트(eAgo)); 이들의 임의의 유도체; 이들의 임의의 변이체; 및 이들의 임의의 단편을 포함한다.
본원에서 언급된 Cas 단백질은 일종의 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. Cas 단백질은 뉴클레아제를 지칭할 수 있다. Cas 단백질은 엔도리보뉴클레아제를 지칭할 수 있다. Cas 단백질은 Cas 단백질의 임의의 변형된(예를 들어, 단축된, 돌연변이된, 연장된) 폴리펩티드 서열 또는 상동체를 지칭할 수 있다. Cas 단백질은 코돈 최적화될 수 있다. Cas 단백질은 Cas 단백질의 코돈 최적화된 상동체일 수 있다. Cas 단백질은 효소 불활성, 부분적 활성, 항시적 활성, 완전한 활성, 유도 가능한 활성 및/또는 더 높은(예를 들어, 단백질 또는 폴리펩티드의 야생형 상동체보다 더 높은) 활성을 나타낼 수 있다. Cas 단백질은 Cas9일 수 있다. Cas 단백질은 Cpf1일 수 있다. Cas 단백질은 C2c2일 수 있다. Cas 단백질(예를 들어, 변이체, 돌연변이된, 효소 불활성 및/또는 조건부 효소 불활성 부위 지정 폴리펩티드)은 표적 핵산에 결합할 수 있다. Cas 단백질(예를 들어, 변이체, 돌연변이된, 효소 불활성 및/또는 조건부 효소 불활성 엔도리보뉴클레아제)은 표적 RNA 또는 DNA에 결합할 수 있다.
Cas 단백질의 비제한적 예는 c2c1, C2c2, c2c3, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e(CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12), Cas10, Cas10d, Cas1O, Cas1Od, CasF, CasG, CasH, Cpf1, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1(CasA), Cse2(CasB), Cse3(CasE), Cse4(CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx1O, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4 및 Cul966, 및 이들의 상동체 또는 변형된 버전을 포함한다.
일부 경우, 본원에 개시된 뉴클레아제(예를 들어, Cas)는 핵산 가이드된 뉴클레아제(예를 들어, RNA 가이드된 엔도뉴클레아제)일 수 있다. 용어 "가이드 핵산"은 일반적으로 또 다른 핵산에 하이브리드화할 수 있는 핵산을 지칭한다. 가이드 핵산은 RNA일 수 있다. 가이드 핵산은 DNA일 수 있다. 가이드 핵산은 핵산 서열에 부위 특이적으로 결합하도록 프로그래밍될 수 있다. 표적화될 핵산 또는 표적 핵산은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 가이드 핵산은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 핵산의 일부는 가이드 핵산의 일부에 상보적일 수 있다. 가이드 핵산에 상보적이고 하이브리드화하는 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드의 가닥은 상보적 가닥으로서 지칭될 수 있다. 상보적 가닥에 상보적이어서 가이드 핵산에 상보적이지 않을 수 있는 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드의 가닥은 비상보적 가닥으로서 지칭될 수 있다. 가이드 핵산은 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함할 수 있으며 "단일 가이드 핵산"으로서 지칭될 수 있다. 가이드 핵산은 2개의 폴리뉴클레오타이드 쇄를 포함할 수 있고 "이중 가이드 핵산"으로서 지칭될 수 있다. 달리 특정되지 않는 한, 용어 "가이드 핵산"은 단일 가이드 핵산 및 이중 가이드 핵산 둘 다를 지칭하는 포괄적 용어일 수 있다.
가이드 핵산은 "핵산 표적화 분절" 또는 "핵산 표적화 서열"로서 지칭될 수 있는 분절을 포함할 수 있다. 핵산 표적화 분절은 "단백질 결합 분절" 또는 "단백질 결합 서열" 또는 "Cas 단백질 결합 분절"로서 지칭될 수 있는 하위분절을 포함할 수 있다.
가이드 핵산은 이중 가이드 핵산으로서 지칭될 수 있는 2개의 별개의 핵산 분자를 포함할 수 있다. 가이드 핵산은 단일 가이드 핵산(예를 들어, sgRNA)으로서 지칭될 수 있는 단일 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 가이드 핵산은 융합된 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함하는 단일 가이드 핵산이다. 일부 경우, 가이드 핵산은 crRNA를 포함하는 단일 가이드 핵산이다. 일부 경우, 가이드 핵산은 crRNA를 포함하지만 tracrRNA를 결여하는 단일 가이드 핵산이다. 일부 경우, 가이드 핵산은 융합되지 않은 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 가이드 핵산이다. 예시적인 이중 가이드 핵산은 crRNA 유사 분자 및 tracrRNA 유사 분자를 포함할 수 있다. 예시적인 단일 가이드 핵산은 crRNA 유사 분자를 포함할 수 있다. 예시적인 단일 가이드 핵산은 융합된 crRNA 유사 분자 및 tracrRNA 유사 분자를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "crRNA"는 일반적으로 야생형 예시적인 crRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 crRNA)에 대해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 약 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 가진 핵산을 지칭한다. crRNA는 일반적으로 야생형 예시적인 crRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 crRNA)에 대해 최대 약 5%, 최대 약 10%, 최대 약 20%, 최대 약 30%, 최대 약 40%, 최대 약 50%, 최대 약 60%, 최대 약 70%, 최대 약 80%, 최대 약 90% 또는 약 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 가진 핵산을 지칭할 수 있다. crRNA는 결실, 삽입 또는 치환, 변이체, 돌연변이 또는 키메라와 같은 뉴클레오타이드 변화를 포함할 수 있는 변형된 형태의 crRNA를 지칭할 수 있다. crRNA는 적어도 6개의 연속 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 야생형 예시적인 crRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 crRNA) 서열에 대해 적어도 약 60% 서열 동일성을 가진 핵산일 수 있다. 예를 들어, crRNA 서열은 적어도 6개의 연속 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 야생형 예시적인 crRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 crRNA) 서열과 적어도 약 60% 동일할 수 있거나, 적어도 약 65% 동일할 수 있거나, 적어도 약 70% 동일할 수 있거나, 적어도 약 75% 동일할 수 있거나, 적어도 약 80% 동일할 수 있거나, 적어도 약 85% 동일할 수 있거나, 적어도 약 90% 동일할 수 있거나, 적어도 약 95% 동일할 수 있거나, 적어도 약 98% 동일할 수 있거나, 적어도 약 99% 동일할 수 있거나 100% 동일할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "tracrRNA"는 일반적으로 야생형 예시적인 tracrRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 tracrRNA) 서열에 대해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 가진 핵산을 지칭한다. tracrRNA는 야생형 예시적인 tracrRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 tracrRNA) 서열에 대해 최대 약 5%, 최대 약 10%, 최대 약 20%, 최대 약 30%, 최대 약 40%, 최대 약 50%, 최대 약 60%, 최대 약 70%, 최대 약 80%, 최대 약 90% 또는 약 100% 서열 동일성 및/또는 서열 유사성을 가진 핵산을 지칭할 수 있다. tracrRNA는 결실, 삽입 또는 치환, 변이체, 돌연변이 또는 키메라와 같은 뉴클레오타이드 변화를 포함할 수 있는 변형된 형태의 tracrRNA를 지칭할 수 있다. tracrRNA는 적어도 6개의 연속 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 야생형 예시적인 tracrRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 tracrRNA) 서열과 적어도 약 60% 동일할 수 있는 핵산을 지칭할 수 있다. 예를 들어, tracrRNA 서열은 적어도 6개의 연속 뉴클레오타이드의 스트레치에 걸쳐 야생형 예시적인 tracrRNA(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 tracrRNA) 서열과 적어도 약 60% 동일할 수 있거나, 적어도 약 65% 동일할 수 있거나, 적어도 약 70% 동일할 수 있거나, 적어도 약 75% 동일할 수 있거나, 적어도 약 80% 동일할 수 있거나, 적어도 약 85% 동일할 수 있거나, 적어도 약 90% 동일할 수 있거나, 적어도 약 95% 동일할 수 있거나, 적어도 약 98% 동일할 수 있거나, 적어도 약 99% 동일할 수 있거나 100% 동일할 수 있다.
crRNA는 가이드 핵산의 핵산 표적화 분절(예를 들어, 스페이서 영역), 및 가이드 핵산의 Cas 단백질 결합 분절의 이중 가닥 이중체의 절반을 형성할 수 있는 뉴클레오타이드 스트레치를 포함할 수 있다.
tracrRNA는 gRNA의 Cas 단백질 결합 분절의 이중 가닥 이중체의 나머지 절반을 형성하는 뉴클레오타이드 스트레치를 포함할 수 있다. crRNA의 뉴클레오타이드 스트레치는 tracrRNA의 뉴클레오타이드 스트레치에 상보적일 수 있고 이와 하이브리드화하여 가이드 핵산의 Cas 단백질 결합 도메인의 이중 가닥 이중체를 형성할 수 있다.
crRNA와 tracrRNA는 하이브리드화하여 가이드 핵산을 형성할 수 있다. crRNA는 또한 표적 핵산 인식 서열(예를 들어, 프로토스페이서)에 하이브리드화하는 단일 가닥 핵산 표적화 분절(예를 들어, 스페이서 영역)을 제공할 수 있다. 스페이서 영역을 포함하는 crRNA의 서열 또는 tracrRNA 분자는 가이드 핵산이 사용될 종에 특이적이도록 설계될 수 있다.
일부 경우, 이펙터 도메인은 GAL4, VP16, VP64, p65, Rta, VPR 및 이들의 변이체(예를 들어, 미니-VPR)로 구성된 군으로부터 선택된 전사 활성화 도메인일 수 있다. 일부 예에서, 작동자 모이어티는 본원에 개시된 바와 같이 전사 활성화 도메인에 융합된 Cas 단백질(예를 들어, dCas9와 같은 dCas)일 수 있다.
일부 경우, 이펙터 도메인은 KRAB, SID, ERD 및 이들의 변이체로 구성된 군으로부터 선택된 전사 억제인자 도메인일 수 있다. 일부 예에서, 작동자 모이어티는 본원에 개시된 바와 같이 전사 억제인자 도메인에 융합된 Cas 단백질(예를 들어, dCas9와 같은 dCas)일 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같이 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하여 세포에서 내생성 사이토카인(예를 들어, 인터류킨(IL))의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는, 본원에 개시된 바와 같은 작동자 모이어티를 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 경우, 작동자 모이어티는 세포에 대해 이종성이다. 예를 들어, IL은 IL-12(예를 들어, IL-12A 및/또는 IL-12B) 또는 IL-21일 수 있다.
V. 가이드 핵산
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 바와 같이 세포에서 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하여 세포에서 내생성 사이토카인(예를 들어, 인터류킨(IL))의 발현 또는 활성을 조절하도록 설계된 가이드 핵산 분자를 포함하는 시스템을 제공한다. 일부 경우, 가이드 핵산 분자는 세포에서 작동자 모이어티를 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로 동원하여, IL의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다. 일부 경우, 상기 시스템은 작동자 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, IL은 IL-12(예를 들어, IL-12A 및/또는 IL-12B) 또는 IL-21일 수 있다.
일부 경우, IL 유전자는 세포에 대해 내생성일 수 있다. 일부 경우, TSS는 세포에 대해 내생성일 수 있다.
일부 경우, 시스템은 상이한 핵산 서열을 가진 적어도 또는 최대 2개, 적어도 또는 최대 3개, 적어도 또는 최대 4개, 적어도 또는 최대 5개, 적어도 또는 최대 6개, 적어도 또는 최대 7개, 적어도 또는 최대 8개, 적어도 또는 최대 9개, 또는 적어도 또는 최대 10개의 상이한 가이드 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 경우, 가이드 핵산 분자는 가이드 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 시스템은 다중체 가이드 핵산(예를 들어, 다중체 가이드 RNA)을 포함할 수 있다.
일부 경우, 시스템은 (i) 본원에 개시된 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 제1 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 설계된 제1 가이드 핵산 분자 및 (ii) 본원에 개시된 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 설계된 제2 가이드 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 시스템은 (i) TSS의 제1 부분에 결합하도록 설계된 제1 가이드 핵산 분자 및 (ii) TSS의 제2 부분에 결합하도록 설계된 제2 가이드 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 제1 표적 폴리뉴클레오타이드 서열 및 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 적어도 또는 최대 약 1개의 염기, 적어도 또는 최대 약 2개의 염기, 적어도 또는 최대 약 3개의 염기, 적어도 또는 최대 약 4개의 염기, 적어도 또는 최대 약 5개의 염기, 적어도 또는 최대 약 6개의 염기, 적어도 또는 최대 약 7개의 염기, 적어도 또는 최대 약 8개의 염기, 적어도 또는 최대 약 9개의 염기, 적어도 또는 최대 약 10개의 염기, 적어도 또는 최대 약 15개의 염기, 적어도 또는 최대 약 20개의 염기, 적어도 또는 최대 약 30개의 염기, 적어도 또는 최대 약 40개의 염기, 적어도 또는 최대 약 50개의 염기, 적어도 또는 최대 약 60개의 염기, 적어도 또는 최대 약 70개의 염기, 적어도 또는 최대 약 80개의 염기, 적어도 또는 최대 약 90개의 염기, 적어도 또는 최대 약 100개의 염기, 적어도 또는 최대 약 200개의 염기, 적어도 또는 최대 약 300개의 염기, 적어도 또는 최대 약 400개의 염기, 적어도 또는 최대 약 500개의 염기, 적어도 또는 최대 약 600개의 염기, 적어도 또는 최대 약 700 개의 염기, 적어도 또는 최대 약 800개의 염기, 적어도 또는 최대 약 900개의 염기, 적어도 또는 최대 약 1,000개의 염기, 적어도 또는 최대 약 2,000개의 염기, 적어도 또는 최대 약 3,000개의 염기, 적어도 또는 최대 약 4,000개의 염기, 또는 적어도 또는 최대 약 5,000개의 염기에 의해 분리될 수 있다. 제1 표적 폴리뉴클레오타이드 서열 및 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 핵산 분자(예를 들어, 세포의 표적 게놈)의 동일한 가닥 상에 있을 수 있다. 대안적으로, 제1 표적 폴리뉴클레오타이드 서열 및 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 핵산 분자의 상이한 가닥 상에 있을 수 있다.
일부 경우, IL 유전자는 제1 TSS 및 제2 TSS를 포함하는 복수의 TSS를 포함할 수 있다. 제1 TSS 및 제2 TSS 각각은 IL 유전자의 상이한 부분을 코딩할 수 있다. 예를 들어, IL은 IL-12일 수 있고, 제1 TSS는 IL-12A 유전자의 일부일 수 있고, 제2 TSS는 IL-12B 유전자의 일부일 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 제1 가이드 핵산 분자는 (1a) 제1 TSS의 적어도 일부를 포함할 수 있거나 (1b) 본원에서 제공된 바와 같이 제1 TSS로부터 특정 거리에 떨어져 있을 수 있고, 제2 가이드 핵산은 (2a) 제2 TSS의 적어도 일부를 포함할 수 있거나 (2b) 본원에서 제공된 바와 같이 제2 TSS로부터 특정 거리에 떨어져 있을 수 있다.
일부 경우, TSS(예를 들어, 제1 TSS)는 서열번호 1에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 경우, TSS(예를 들어, 제2 TSS)는 서열번호 2에 대해 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 100% 서열 동일성을 가질 수 있다.
VI. 세포로의 시스템 발현의 전달
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 본 시스템 중 임의의 시스템을 포함하는(또는 발현하는) 세포(예를 들어, 면역 세포)를 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 본 시스템 중 임의의 시스템을 포함하는(또는 발현하는) 세포 집단(예를 들어, 면역 세포 집단)을 제공한다.
RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템은 본원에 개시된 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 키메라 수용체, 키메라 어댑터, 이펙터 도메인을 갖거나 갖지 않는 작동자 모이어티, 또는 이를 코딩하는 유전자)를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 본 개시내용의 세포에게 전달하는 데 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 시험관내에서 세포를 처리하는 데 사용될 수 있으며, 변형된 세포는 임의로 투여될 수 있다(생체외). 대안적으로, 바이러스 벡터는 대상체에게 직접(생체내) 투여될 수 있다. 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 삽입된 형질전이유전자의 장기간 발현을 야기할 수 있는, 숙주 게놈 내로의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스 유전자 전달 방법에 의해 일어날 수 있다.
일부 경우, 비-바이러스 전달 방법은 본원에 개시된 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 중 임의의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 키메라 수용체, 키메라 어댑터, 이펙터 도메인을 갖거나 갖지 않는 작동자 모이어티, 또는 이를 코딩하는 유전자)를 본 개시내용의 세포에게 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 카고(cargo)의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 마이크로주사, 바이오리스틱스(biolistics), 비로좀(virosome), 리포좀, 면역리포좀, 엑소좀, 폴리양이온 또는 지질:카고 접합체(또는 응집체), 네이키드(naked) 폴리펩티드(예를 들어, 재조합 폴리펩티드), 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 폴리펩티드 또는 DNA의 작용제 증강 흡수를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드의 효율적인 수용체 인식 지질(lipo)-전달에 적합한 양이온성 지질 및 중성 지질이 사용될 수 있다.
VII. 방법 및 조성물
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 본 시스템 중 임의의 시스템을 도입(또는 발현)함으로써 세포의 내생성 단백질(예를 들어, IL-12 또는 IL-21과 같은 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조건부로 조절하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 세포의 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조건부로 조절하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)를 리간드에 노출시키는 단계를 포함할 수 있으며, 이때 수용체는 리간드에 결합되었을 때 변형된다. 이 방법은 (b) 수용체 변형에 반응하여, 작동자 모이어티와 내생성 단백질을 코딩하는 표적 유전자 사이에 복합체를 형성하여 내생성 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 경우, 수용체 변형 시, 작동자 모이어티는 활성화되어, 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조절함으로써, 세포가 본원에 개시된 하나 이상의 특성, 예를 들어, (i) 대조군에 비해 내생성 단백질(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화; (ii) 대조군에 비해 세포의 상이한 내생성 단백질(예를 들어, 상이한 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화; (iii) 대조군에 비해 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20% 감소에 의해 확인되는, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성; (iv) 대조군에 비해 세포를 포함하는 세포 집단의 크기의 적어도 20% 증가에 의해 확인되는 향상된 증식; 또는 (v) 대조군에 비해 종양 크기의 감소를 포함하는 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 미칠 수 있다.
일부 경우, 상기 방법은 보조치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 경우, 대상체에게 투여되는 세포는 대상체에 대해 자가 또는 동종일 수 있다. 예를 들어, 대상체에게 투여되는 세포는 자가 면역 세포 또는 동종 면역 세포일 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 본 시스템 중 임의의 시스템을 포함(또는 발현)하는 세포 또는 세포 집단(예를 들어, 조작된 면역 세포 집단)을 포함하는 조성물을 제공한다. 이 조성물은 대상체의 병태(예를 들어, 암, 종양)를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 이 조성물은 적어도 또는 최대 약 1회 용량, 적어도 또는 최대 약 2회 용량, 적어도 또는 최대 약 3회 용량, 적어도 또는 최대 약 4회 용량, 적어도 또는 최대 약 5회 용량, 적어도 또는 최대 약 6회 용량, 적어도 또는 최대 약 7회 용량, 적어도 또는 최대 약 8회 용량, 적어도 또는 최대 약 9회 용량, 또는 적어도 또는 최대 약 10회 용량을 포함할 수 있다.
일부 경우, 조성물은 보조치료제를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 약학 조성물은 (원하는 투여 방법에 따라) 임의의 적합한 형태로 존재할 수 있다. 약학 조성물은 유닛 제형으로 제공될 수 있고/있거나, 밀봉된 용기에 제공될 수 있고/있거나, 키트의 일부로서 제공될 수 있다. 이러한 키트는 사용 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 복수의 상기 유닛 제형을 포함할 수 있다.
보조치료제의 비제한적 예는 세포독성제, 화학요법제, 성장 억제제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항혈관신생제, 아폽토시스제, 항튜불린제, 및 암을 치료하기 위한 다른 작용제, 예를 들어, 항-CD20 항체, 항-PD1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙(Pembrolizumab)), 혈소판 유래 성장 인자 억제제(예를 들어, GLEEVEC™(이마티닙 메실레이트(imatinib mesylate))), COX-2 억제제(예를 들어, 셀레콕십(celecoxib)), 인터페론, 사이토카인, 표적 PDGFR-β, BlyS, APRIL, BCMA 수용체(들), TRAIL/Apo2 중 하나 이상에 결합하는 길항제(예를 들어, 중화 항체), 다른 생물활성 및 유기 화학 작용제 등을 포함할 수 있다.
용어 "세포독성제"는 일반적으로 세포의 기능을 억제하거나 방해하고/하거나 세포 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성제의 비제한적 예는 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 인터칼레이팅제, 효소 및 이의 단편, 예컨대, 핵산분해 효소, 항생제 및 독소, 예컨대, 소분자 독소, 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소를 포함할 수 있다.
화학요법제의 비제한적 예는 알킬화제, 예컨대, 티오테파 및 CYTOXAN® 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예컨대, 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대, 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토제닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신(합성 유사체 토포테칸(HYCAMTIN®), CPT-11(이리노테칸, CAMPTOSAR®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신을 포함함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체를 포함함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포사이드; 크립토파이신(특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신(합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1을 포함함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰기스타틴; 질소 머스타드, 예컨대, 클로람부실, 클로마파진, 콜로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대, 에네디인(enediyne) 항생제; 다이네미신(dynemicin) A를 포함하는 다이네미신; 에스페라미신; 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN® 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 C와 같은 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예컨대, 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예컨대, 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 푸린 유사체, 예컨대, 플루다라빈, 6-머캡토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신제, 예컨대, 아미노글루테티마이드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대, 프롤린산; 아세글라톤; 아이도포스파마이드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 디포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄신 및 안사미토신과 같은 메이탄시노이드; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸하이드라자이드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신(ELDISINE®, FILDESIN®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL® 파클리탁셀(Bristol-Myers Squibb Oncology, 뉴저지주 프린스톤), ABRAXANE™ 크레모포르 무함유, 파클리탁셀의 알부민 조작된 나노입자 제제(American Pharmaceutical Partners, 일리노이주 숌버그), 및 TAXOTERE® 도세탁셀(Rhone-Poulenc Rorer, 프랑스 안토니)을 비롯한 탁산; 클로란부실; 젬시타빈(GEMZAR®); 6-티오구아닌; 머캡토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대, 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴(VELBAN®); 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 미톡산트론; 빈크리스틴(ONCOVIN®); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈(NAVELBINE®); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대, 레티노산; 카페시타빈(XELODA®); 이러한 화학요법제들 중 임의의 화학요법제의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 이 화학요법제들 중 둘 이상의 화학요법제들의 조합, 예컨대, 사이클로포스파마이드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴(ELOXATIN™)을 사용한 치료 요법에 대한 약어인 FOLFOX를 포함할 수 있다. 추가 화학요법제는 예를 들어, 항체 약물 접합체로서 유용한 세포독성제, 예컨대, 메이탄시노이드(예를 들어, DM1) 및 아우리스타틴 MMAE 및 MMAF를 포함한다.
화학요법제의 예는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절하거나, 감소시키거나, 차단하거나 억제하는 작용을 하고 종종 전체 또는 전신 치료의 형태로 존재하는 "항호르몬제" 또는 "내분비 치료제"도 포함할 수 있다. 이들은 호르몬 그 자체일 수 있다. 예는 예를 들어, 타목시펜(NOLVADEX® 타목시펜을 포함함), EVISTA® 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 FARESTON® 토레미펜을 포함하는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM); 항프로게스테론; 에스트로겐 수용체 하향조절제(ERD); 난소를 억제하거나 차단하는 기능을 하는 작용제, 예를 들어, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH) 아고니스트, 예컨대, LUPRON® 및 ELIGARD) 류프롤라이드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트립테렐린; 다른 항안드로겐, 예컨대, 플루타마이드, 닐루타마이드 및 비칼루타마이드; 및 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티마이드, MEGASE® 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN® 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, RIVISOR® 보로졸, FEMARA® 레트로졸 및 ARIMIDEX® 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의는 비스포스포네이트, 예컨대, 클로드로네이트(예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), DIDROCAL® 에티드로네이트, NE-58095, ZOMETA® 졸레드론산/졸레드로네이트, FOSAMAX® 알렌드로네이트, AREDIA® 파미드로네이트, SKELID® 틸루드로네이트, 또는 ACTONEL® 리세드로네이트; 트록사시타빈(1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상적인 세포 증식과 관련된 신호전달 경로의 유전자, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 백신, 예컨대, THERATOPE® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN® 백신, LEUVECTIN® 백신 및 VAXID® 백신; LURTOTECAN® 토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX® rmRH; 라파티닙 디토실레이트(GW572016으로서도 알려져 있는 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 억제제); 및 이들 중 임의의 작용제의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
화학요법제의 예는 항체, 예컨대, 알렘투주맙(alemtuzumab)(Campath), 베바시주맙(bevacizumab)(AVASTIN®, Genentech); 세툭시맙(cetuximab)(ERBITUX®, Imclone); 파니투무맙(panitumumab)(VECTIBIX®, Amgen), 리툭시맙(rituximab)(RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), 퍼투주맙(pertuzumab)(OMNITARG®, 2C4, Genentech), 트라스투주맙(trastuzumab)(HERCEPTIN®, Genentech), 토시투모맙(tositumomab)(Bexxar, Corixia), 및 항체 약물 접합체인 젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin)(MYLOTARG®, Wyeth)도 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물과 조합되는 작용제로서 치료 잠재력을 가진 추가 인간화된 단일클론 항체는 아폴리주맙(apolizumab), 아셀리주맙(aselizumab), 아틀리주맙(atlizumab), 바피네우주맙(bapineuzumab), 비바투주맙 메르탄신(bivatuzumab mertansine), 칸투주맙 메르탄신(cantuzumab mertansine), 세델리주맙(cedelizumab), 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 시드푸시투주맙(cidfusituzumab), 시드투주맙(cidtuzumab), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 에프라투주맙(epratuzumab), 에를리주맙(erlizumab), 펨주맙(feMzumab), 폰톨리주맙(fontolizumab), 젬투주맙 오조가미신, 이노투주맙(inotuzumab) 오조가미신, 이필리무맙(ipilimumab), 라베투주맙(labetuzumab), 린투주맙(lintuzumab), 마투주맙(matuzumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 모타비주맙(motavizumab), 모토비주맙(motovizumab), 나탈리주맙(natalizumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 놀로비주맙(nolovizumab), 누마비주맙(numavizumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 파스콜리주맙(pascolizumab), 펙푸시투주맙(pecfusituzumab), 펙투주맙(pectuzumab), 펙셀리주맙(pexelizumab), 랄리비주맙(ralivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 레슬리비주맙(reslivizumab), 레슬리주맙(reslizumab), 레시비주맙(resyvizumab), 로벨리주맙(rovelizumab), 루플리주맙(ruplizumab), 시브로투주맙(sibrotuzumab), 시플리주맙(siplizumab), 손투주맙(sontuzumab), 타카투주맙 테트라섹탄(tacatuzumab tetraxetan), 타도시주맙(tadocizumab), 탈리주맙(talizumab), 테피바주맙(tefibazumab), 토실리주맙(tocilizumab), 토랄리주맙(toralizumab), 투코투주맙 셀몰류킨(tucotuzumab celmoleukin), 투쿠시투주맙(tucusituzumab), 우마비주맙(umavizumab), 우르톡사주맙(urtoxazumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 비실리주맙(visilizumab), 및 인터류킨-12 p40 단백질을 인식하도록 유전적으로 변형된 재조합 배타적 인간 서열 전체 길이 IgG1λ 항체인 항인터류킨-12(ABT-874/J695, Wyeth Research and Abbott Laboratories)를 포함한다.
화학요법제의 예는 "티로신 키나제 억제제", 예컨대, EGFR 표적화 작용제(예를 들어, 소분자, 항체 등); 소분자 HER2 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 타케다(Takeda)로부터 입수 가능한 TAK165; ErbB2 수용체 티로신 키나제의 경구 선택적 억제제인 CP-724,714(Pfizer 및 OSI); EGFR에 우선적으로 결합하지만 HER2 및 EGFR 과발현 세포 둘 다를 억제하는 EKB-569(와이어쓰(Wyeth)로부터 입수 가능함)와 같은 이중-HER 억제제; 경구 HER2 및 EGFR 티로신 키나제 억제제인 라파티닙(GSK572016; 글락소-스미스클라인(Glaxo-SmithKline)으로부터 입수 가능함); PKI-166(노바티스(Novartis)로부터 입수 가능함); 범-HER 억제제, 예컨대, 카네르티닙(CI-1033; Pharmacia); Raf-1 억제제, 예컨대, Raf-1 신호전달을 억제하는, ISIS 파마슈티칼스(Pharmaceuticals)로부터 입수 가능한 안티센스 작용제 ISIS-5132; 비-HER 표적화 TK 억제제, 예컨대, 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC®, 글락소-스미스클라인으로부터 입수 가능함); 다중 표적화 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 수니티닙(SUTENT®, 화이자(Pfizer)로부터 입수 가능함); VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 바탈라닙(PTK787/ZK222584, 노바티스/쉐링 아게(Schering AG)로부터 입수 가능함); MAPK 세포외 조절 키나제 I 억제제 CI-1040(파마샤(Pharmacia)로부터 입수 가능함); 퀴나졸린, 예컨대, PD 153035,4-(3-클로로아닐리노)퀴나졸린; 피리도피리미딘; 피리미도피리미딘; 피롤로피리미딘, 예컨대, CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘; 커큐민(디페룰로일 메탄, 4,5-비스(4-플루오로아닐리노)프탈이미드); 니트로티오펜 모이어티를 함유하는 티르포스틴; PD-0183805(워너-람버(Warner-Lamber)); 안티센스 분자(예를 들어, HER 코딩 핵산에 결합하는 안티센스 분자); 퀴녹살린(미국 특허 제5,804,396호); 트리포스틴(미국 특허 제5,804,396호); ZD6474(아스트라제네카(AstraZeneca)); PTK-787(노바티스/쉐링 아게); 범-HER 억제제, 예컨대, CI-1033(화이자); 아피니택(Affinitac)(ISIS 3521; 아이시스/릴라이(Isis/Lilly)); 이마티닙 메실레이트(GLEEVEC®); PKI 166(노바티스); GW2016(글락소 스미스클라인); CI-1033(화이자); EKB-569(와이어쓰); 세막시닙(화이자); ZD6474(아스트라제네카); PTK-787(노바티스/쉐링 아게); INC-1C11(임클론(Imclone)); 및 라파마이신(시롤리무스, RAPAMUNE®)도 포함할 수 있다.
화학요법제의 예는 덱사메타손, 인터페론, 콜히친, 메토프린, 사이클로스포린, 암포테리신, 메트로니다졸, 알렘투주맙, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 아미포스틴, 삼산화비소, 아스파라기나제, BCG 라이브, 베바쿠지맙, 벡사로텐, 클라드리빈, 클로파라빈, 다르베포에틴 알파, 데닐류킨, 덱스라족산, 에포에틴 알파, 엘로티닙, 필그라스팀, 히스트렐린 아세테이트, 이브리투모맙, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 레날리도마이드, 레바미솔, 메스나, 메톡살렌, 난드롤론, 넬라라빈, 노페투모맙, 오프렐베킨, 팔리페르민, 파미드로네이트, 페가데마제, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, 페메트렉세드 이나트륨, 플리카마이신, 포르피머 나트륨, 퀴나크린, 라스부리카제, 사르그라모스팀, 테모졸로마이드, VM-26, 6-TG, 토레미펜, 트레티노인, ATRA, 발루비신, 졸레드로네이트 및 졸레드론산, 및 이들의 약학적으로 허용되는 염도 포함할 수 있다.
화학요법제의 예는 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 아세테이트, 코르티손 아세테이트, 틱소코르톨 피발레이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 알코올, 모메타손, 암시노나이드, 부데소나이드, 데소나이드, 플루오시노나이드, 플루오시놀론 아세토나이드, 베타메타손, 베타메타손 인산나트륨, 덱사메타손, 덱사메타손 인산나트륨, 플루오코르톨론, 히드로코르티손-17-부티레이트, 히드로코르티손-17-발레레이트, 아클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 프레드니카르베이트, 클로베타손-17-부티레이트, 클로베타솔-17-프로피오네이트, 플루오코르톨론 카프로에이트, 플루오코르톨론 피발레이트 및 플루프레드니덴 아세테이트: 면역 선택적 소염성 펩티드(ImSAID), 예컨대, 페닐알라닌-글루타민-글리신(FEG) 및 이의 D-이성질체 형태(feG)(IMULAN BioTherapeutics, LLC); 항류마티스 약물, 예컨대, 아자티오프린, 시클로스포린(사이클로스포린 A), D-페니실라민, 금염, 하이드록시클로로퀸, 레플루노마이드미노사이클린, 설파살라진, 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 차단제, 예컨대, 에타너셉트(ENBREL®), 인플릭시맙(REMICADE®), 아달리무맙(HUMIRA®), 세르톨리주맙 페골(CIMZIA®), 골리무맙(SIMPONI®), 인터류킨 1(IL-1) 차단제, 예컨대, 아나킨라(anakinra)(KINERET®), T 세포 보조자극 차단제, 예컨대, 아바타셉트(ORENCIA®), 인터류킨 6(IL-6) 차단제, 예컨대, 토실리주맙(ACTEMERA®); 인터류킨 13(IL-13) 차단제, 예컨대, 레브리키주맙; 인터페론 알파(IFN) 차단제, 예컨대, 론탈리주맙; 베타 7 인테그린 차단제, 예컨대, rhuMAb 베타7; IgE 경로 차단제, 예컨대, 항-M1 프라임; 분비된 동종삼량체 LTa3 및 막 결합 이종삼량체 LTa/β2 차단제, 예컨대, 항-림프톡신 알파(LTa); 기타 연구용 작용제, 예컨대, 티오플라틴, PS-341, 페닐부티레이트, ET-18-OCH3 또는 파메실 트랜스퍼라제 억제제(L-739749, L-744832); 폴리페놀, 예컨대, 케르세틴, 레스베라트롤, 피세아탄올, 에피갈로카테킨 갈레이트, 테아플라빈, 플라바놀, 프로시아니딘, 베툴린산 및 이들의 유도체; 자가포식 억제제, 예컨대, 클로로퀸; 델타-9-테트라하이드로칸나비놀(드로나비놀, MARINOL®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴, 및 9-아미노캄프토테신); 포도필로톡신; 테가푸르(UFTORAL®); 벡사로텐(TARGRETIN®); 비스포스포네이트, 예컨대, 클로드로네이트(예를 들어, BONEFOS® 또는 OSTAC®), 에티드로네이트(DIDROCAL®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트(ZOMETA®), 알렌드로네이트(FOSAMAX®), 파미드로네이트(AREDIA®), 틸루드로네이트(SKELID®) 또는 리세드로네이트(ACTONEL®); 및 표피 성장 인자 수용체(EGF-R); 백신, 예컨대, THERATOPE® 백신; 페리포신, COX-2 억제제(예를 들어, 셀레콕십 또는 에토리콕십), 프로테오좀 억제제(예를 들어, PS341); CCI-779; 티피파밉(R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대, 오블리메르센 나트륨(GENASENSE®); 픽산트론; 파메실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대, 로나파밉(SCH 6636, SARASAR™); 및 이들 중 임의의 작용제의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 이들 중 둘 이상의 조합도 포함할 수 있다.
용어 "생장 억제제"는 일반적으로 시험관내 또는 생체내에서 세포(예를 들어, 그의 생장이 PD-L1 발현에 의존하는 세포)의 생장 및/또는 증식을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 생장 억제제는 S 기에 있는 세포의 퍼센트를 상당히 감소시키는 억제제일 수 있다. 생장 억제제의 비제한적 예는 (S 기 이외의 주기에서) 세포 주기 진행을 차단하는 작용제, 예컨대, G1 정지 및 M 기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 고전적인 M 기 차단제는 빈카(빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대, 안트라사이클린 항생제 독소루비신((8S-시스)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥사피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라하이드로-6,8,11-트리하이드록시-8-(하이드록시아세틸)-1-메톡시-5,12-나프타센디온), 에피루비신, 다우노루비신, 에토포사이드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어, DNA 알킬화제, 예컨대, 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S 기 정지에도 영향을 미친다. 탁산(파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘 다 주목 나무로부터 유래한 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래한 도세탁셀(TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer)은 파클리탁셀(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb)의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 마이크로튜불의 어셈블리를 촉진하고 탈중합을 방지하여 마이크로튜불을 안정화시켜 세포의 유사분열을 억제한다.
VIII. 치료 응용
본 시스템은 면역 반응에 관여하는 임의의 세포를 포함하는 다양한 면역 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 과립구, 예컨대, 호염기구, 호산구 및 호중구; 비만 세포; 대식세포로 발달할 수 있는 단핵구; 항원 제시 세포, 예컨대, 수지상 세포; 및 림프구, 예컨대, 천연 킬러 세포(NK 세포), B 세포 및 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 면역 이펙터 세포이다. 면역 이펙터 세포는 자극에 반응하여 특정 기능을 수행할 수 있는 면역 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 세포 사멸을 유도할 수 있는 면역 이펙터 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 림프구이다. 일부 실시양태에서, 림프구는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 림프구는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 활성화된 T 세포이다. T 세포는 미감작 세포 및 기억 세포 둘 다(예를 들어, 중추 기억 또는 TCM, 이펙터 기억 또는 TEM 및 이펙터 기억 RA 또는 TEMRA), 이펙터 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포 또는 CTL 또는 Tc 세포), 헬퍼 세포(예를 들어, Th1, Th2, Th3, Th9, Th7, TFH), 조절 세포(예를 들어, Treg 및 Trl 세포), 천연 킬러 T 세포(NKT 세포), 종양 침윤 림프구(TIL), 림프구 활성화된 킬러 세포(LAK), αβ T 세포, γδ T 세포, 및 T 세포 계통의 유사한 독특한 클래스를 포함한다. T 세포는 세포 표면에 존재하는 단백질을 기준으로 두 넓은 범주, 즉 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포로 나눌 수 있다. 본 시스템을 발현하는 T 세포는 감염된 세포의 사멸 및 다른 면역 세포의 활성화 또는 동원을 비롯한 여러 기능을 수행할 수 있다. CD8+ T 세포는 세포독성 T 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL)로서 지칭된다. 본 시스템을 발현하는 CTL은 바이러스에 감염된 세포 및 암 세포를 인식하고 제거하는 데 관여할 수 있다. CTL은 아폽토시스, 예를 들어, 프로그래밍된 세포 사멸을 야기하는 세포독소를 함유하는 전문화된 구획 또는 과립을 가진다. 추가 서브세트가 존재할 수 있지만, CD4+ T 세포는 4개의 서브세트, 즉 Th1, Th2, Th17 및 Treg로 세분될 수 있으며, 이때 "Th"는 "T 헬퍼 세포"를 지칭한다. Th1 세포는 세포내 미생물, 특히 박테리아에 대한 면역 반응을 조정할 수 있다. 이 세포는 박테리아를 섭취하는 대식세포와 같은 다른 면역 세포에게 알리고 이러한 면역 세포를 활성화시키는 분자를 생성하고 분비할 수 있다. Th2 세포는 B 세포, 과립구 및 비만 세포에게 알림으로써 연충(기생충)과 같은 세포외 병원체에 대한 면역 반응을 조정하는 데 관여한다. Th17 세포는 면역 및 비면역 세포를 활성화시키는 신호전달 분자인 인터류킨 17(IL-17)을 생성할 수 있다. Th17 세포는 호중구 동원에 중요하다.
본원에 개시된 항원 결합 모이어티의 리간드 또는 항원(즉, 표적 항원)은 세포 표면 마커, 분비 마커 또는 세포내 마커일 수 있다.
본원에 개시된 항원 결합 모이어티의 항원(즉, 표적 항원)의 비제한적 예는 ADGRE2, 탄산 탈수효소 IX(CA1X), CCRI, CCR4, 암배아 항원(CEA), CD3ζ, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD44V6, CD49f, CD56, CD70, CD74, CD99, CD123, CD133, CD138, CD269(BCMA), CD S, CLEC12A, 사이토메갈로바이러스(CMV) 감염 세포의 항원(예를 들어, 세포 표면 항원), 상피 당단백질 2(EGP 2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), EGFRvIII, 수용체 티로신-단백질 키나제 erb-B2,3,4, EGFIR, EGFR-VIII, ERBB 엽산염 결합 단백질(FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(AChR), 엽산염 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), gp100, 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER-2), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), ICAM-1, 인테그린 B7, 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Rα2), κ-경쇄, 키나제 삽입체 도메인 수용체(KDR), 카파, 루이스(Lewis) A(CA19.9), 루이스 Y(LeY), L1 세포 부착 분자(L1-CAM), LILRB2, MART-1, 흑색종 항원 계열 A1(MAGE-A1), MICA/B, 뮤신 1(Muc-1), 뮤신 16(Muc-16), 메소텔린(MSLN), NKCSI, NKG2D 리간드, c-Met, 암-고환 항원 NY-ESO-1, NY-ESO-2, 암태아 항원(h5T4), PRAIVIE, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), PRAME 전립선 특이적 막 항원(PSMA), ROR1, 종양 관련 당단백질 72(TAG-72), TIM-3, TRBCI, TRBC2, 혈관 내피 성장 인자 R2(VEGF-R2), 윌름스 종양 단백질(WT-1) 및 다양한 병원체 항원(예를 들어, 질환을 야기할 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 및 원생동물로부터 유래한 병원체 항원)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 병원체 항원은 HIV, HBV, EBV, HPV, 라세(Lasse) 바이러스, 인플루엔자 바이러스 또는 코로나바이러스로부터 유래한다.
본원에 개시된 항원 결합 모이어티의 항원의 추가 예는 1-40-β-아밀로이드, 4-1BB, 5AC, 5T4, 액티빈 수용체 유사 키나제 1, ACVR2B, 선암종 항원, AGS-22M6, 알파-태아단백질, 안지오포이에틴 2, 안지오포이에틴 3, 탄저병 독소, AOC3(VAP-1), B7-H3, 바실러스 탄저균 탄저병, BAFF, 베타-아밀로이드, B-림프종 세포, C242 항원, C5, CA-125, 캐니스 루푸스 패밀리아리스(Canis lupus familiaris) IL31, 탄산 탈수효소 9(CA-IX), 심장 미오신, CCL11(에오탁신(eotaxin)-1), CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147(바시긴(basigin)), CD15, CD152, CD154(CD40L), CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23(IgE 수용체), CD25(IL-2 수용체의 α 쇄), CD27, CD274, CD28, CD3, CD3 엡실론, CD30, CD33, CD37, CD38, CD4, CD40, CD40 리간드, CD41, CD44 v6, CD5, CD51, CD52, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, CEA 관련 항원, CFD, ch4D5, CLDN18.2, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 응집 인자 A, CSF1R, CSF2, CTLA-4, C-X-C 케모카인 수용체 제4형, 사이토메갈로바이러스, 사이토메갈로바이러스 당단백질 B, 다비가트란(dabigatran), DLL4, DPP4, DR5, 대장균 시가(shiga) 독소 제1형, 대장균 시가 독소 제2형, EGFL7, EGFR, 내독소, EpCAM, 에피시알린(episialin), ERBB3, 대장균, 호흡기 세포융합 바이러스의 F 단백질, FAP, 피브린 II 베타 쇄, 피브로넥틴 엑스트라 도메인-B, 엽산염 하이드롤라제, 엽산염 수용체 1, 엽산염 수용체 알파, 프리즐드(Frizzled) 수용체, 강글리오사이드 GD2, GD2, GD3 강글리오사이드, 글리피칸 3, GMCSF 수용체 α-쇄, GPNMB, 성장 분화 인자 8, GUCY2C, 헤마글루티닌, B형 간염 표면 항원, B형 간염 바이러스, HER1, HER2/neu, HER3, HGF, HHGFR, 히스톤 복합체, HIV-1, HLA-DR, HNGF, Hsp90, 인간 분산 인자 수용체 키나제, 인간 TNF, 인간 베타-아밀로이드, ICAM-1(CD54), IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc 영역, IGF-1 수용체, IGF-1, IGHE, IL17A, IL17F, IL20, IL-12, IL-13, IL-17, IL-1β, IL-22, IL-23, IL-31RA, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6 수용체, IL-9, ILGF2, 인플루엔자 A 헤마글루티닌, 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌, 인슐린 유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 α4β7, 인테그린 α4, 인테그린 α5β1, 인테그린 α7β7, 인테그린 αIIbβ3, 인테그린 αvβ3, 인터페론 α/β 수용체, 인터페론 감마 유도 단백질, ITGA2, ITGB2(CD18), KIR2D, 루이스-Y 항원, LFA-1(CD11a), LINGO-1, 리포테이코산, LOXL2, L-셀렉틴(CD62L), LTA, MCP-1, 메소텔린, MIF, MS4A1, MSLN, MUC1, 뮤신 CanAg, 미엘린 관련 당단백질, 미오스타틴, NCA-90(과립구 항원), 신경 아폽토시스 조절 프로테이나제 1, NGF, N-글리콜릴뉴라민산, NOGO-A, Notch 수용체, NRP1, 오릭톨라구스 쿠니쿨러스(Oryctolagus cuniculus), OX-40, oxLDL, PCSK9, PD-1, PDCD1, PDGF-Rα, 인산나트륨 보조수송체, 포스파티딜세린, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 베타, 전립선 암종 세포, 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 광견병 바이러스 당단백질, RANKL, 호흡기 세포융합 바이러스, RHD, 레서스(Rhesus) 인자, RON, RTN4, 스클레로스틴(sclerostin), SDC1, 셀렉틴 P, SLAMF7, SOST, 스핑고신-1-포스페이트, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), STEAP1, TAG-72, T 세포 수용체, TEM1, 테나신 C, TFPI, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16.88, MUC1의 종양 특이적 글리코실화, 종양 관련 칼슘 신호 전달도입제 2, TWEAK 수용체, TYRP1(당단백질 75), VEGFA, VEGFR1, VEGFR2, 비멘틴(vimentin) 및 VWF를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항원 결합 모이어티의 항원의 추가 예는 707-AP, 바이오티닐화된 분자, a-악티닌(Actinin)-4, abl-bcr alb-b3(b2a2), abl-bcr alb-b4(b3a2), 아디포필린(adipophilin), AFP, AIM-2, 아넥신(Annexin) II, ART-4, BAGE, b-카테닌, bcr-abl, bcr-abl p190(e1a2), bcr-abl p210(b2a2), bcr-abl p210(b3a2), BING-4, CAG-3, CAIX, CAMEL, 카스파제(Caspase)-8, CD171, CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v7/8, CDC27, CDK-4, CEA, CLCA2, Cyp-B, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EGFRvIII, EGP-2, EGP-40, ELF2, Ep-CAM, EphA2, EphA3, erb-B2, erb-B3, erb-B4, ES-ESO-1a, ETV6/AML, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, FGF-5, FN, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GD2, GD3, GnT-V, Gp100, gp75, Her-2, HLA-A*0201-R170I, HMW-MAA, HSP70-2 M, HST-2(FGF6), HST-2/neu, hTERT, iCE, IL-11Rα, IL-13Rα2, KDR, KIAA0205, K-RAS, L1-세포 부착 분자, LAGE-1, LDLR/FUT, 루이스 Y, MAGE-1, MAGE-10, MAGE-12, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-B1, MAGE-B2, 말산 효소, 맘마글로빈(Mammaglobin)-A, MART-1/멜란(Melan)-A, MART-2, MC1R, M-CSF, 메소텔린(mesothelin), MUC1, MUC16, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, 미오신, NA88-A, Neo-PAP, NKG2D, NPM/ALK, N-RAS, NY-ESO-1, OA1, OGT, 종양태아 항원(h5T4), OS-9, P 폴리펩티드, P15, P53, PRAME, PSA, PSCA, PSMA, PTPRK, RAGE, ROR1, RU1, RU2, SART-1, SART-2, SART-3, SOX10, SSX-2, 서바이빈(Survivin), 서바이빈-2B, SYT/SSX, TAG-72, TEL/AML1, TGFaRII, TGFbRII, TP1, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TRP-2-6b, 티로시나제(Tyrosinase), VEGF-R2, WT1, α-엽산염 수용체 및 κ-경쇄를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 항원 결합 모이어티의 항원의 추가 예는 항체, 이의 단편 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 천연 항체(예를 들어, 대상체의 면역 세포, 예컨대 B 세포에 의해 천연적으로 분비됨), 합성 항체 또는 변형된 항체일 수 있다. 일부 경우, 본원에 개시된 항원 결합 모이어티의 항원은 20-(74)-(74)(밀라투주맙; 벨투주맙), 20-2b-2b, 3F8, 74-(20)-(20)(밀라투주맙; 벨투주맙), 8H9, A33, AB-16B5, 아바고보맙, 아브식시맙, 아비투주맙, 즐린투주맙), 악톡수맙, 아달리무맙, ADC-1013, ADCT-301, ADCT-402, 아데카투무맙, 아두카누맙, 아펠리모맙, AFM13, 아푸투주맙, AGEN1884, AGS15E, AGS-16C3F, AGS67E, 알라시주맙 페골, ALD518, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, AMG 228, AMG 820, 아나투모맙 마페나톡스, 아네투맙 라브탄신, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, APN301, APN311, 아폴리주맙, APX003/SIM-BD0801(세바시주맙), APX005M, 아르시투모맙, ARX788, 아스크린바쿠맙, 아셀리주맙, ASG-15ME, 아테졸리주맙, 아티누맙, ATL101, 아틀리주맙(토실리주맙으로서도 지칭됨), 아토롤리무맙, 아벨루맙, B-701, 바피뉴주맙, 바실릭시맙, 바비툭시맙, BAY1129980, BAY1187982, 벡투모맙, 베겔로맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베타루틴(177Lu-테트라세탄-테툴로맙), 베바시주맙, BEVZ92(베바시주맙 바이오시밀러), 베즐로톡수맙, BGB -A317, BHQ880, BI 836880, BI-505, 비시로맙, 비마그루맙, 비메키주맙, 비바투주맙 메르탄신, BIW-8962, 블리나투모맙, 블로소주맙, BMS-936559, BMS-986012, BMS-986016, BMS-986148, BMS-986178, BNC101, 보코시주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브레바렉스(BrevaRex), 브리아키누맙, 브로달루맙, 브롤루시주맙, 브론틱투주맙, C2-2b-2b, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데타이드, 칼루맙, 카투막소맙, CBR96-독소루비신 면역접합체, CBT124(베바시주맙), CC-90002, CDX-014, CDX-1401, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, CGEN-15001T, CGEN-15022, CGEN-15029, CGEN-15049, CGEN-15052, CGEN-15092, Ch.14.18, 시타투주맙 보가톡스, 식수투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트라세탄, CM-24, 코드리투주맙, 콜툭시맙, 라브탄신, 코나투무맙, 콘시주맙, 코타라(Cotara)(요오드 I-131 데를로툭시맙 바이오틴), cR6261, 크레네주맙, DA-3111(트라스투주맙 바이오시밀러), 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다피롤리주맙 페골, 다라투무맙, 다라투무맙 엔한즈(Daratumumab Enhanze)(다라투무맙), 다를류킨, 덱트레쿠맙, 뎀시주맙, 데닌투주맙 마포도틴, 데노수맙, 데파툭시주맙, 데파툭시주맙 마포도틴, 데를로툭시맙 바이오틴, 데투모맙, DI-B4, 디누툭시맙, 디리다부맙, DKN-01, DMOT4039A, 도를리모맙 아리톡스, 드로지투맙, DS-1123, DS-8895, 둘리고투맙, 두필루맙, 두르발루맙, 두시기투맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에펑구맙, 엘델루맙, 엘젬투맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에막투주맙, 에미베투주맙, 에나바투주맙, 엔포르투맙 베도틴, 엔리모맙 페골, 에노블리투주맙, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에트롤리주맙, 에비나쿠맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파를레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, FF-21101, FGFR2 항체-약물 접합체, 피브로문(Fibromun), 피클라투주맙, 피기투무맙, 피리부맙, 플란보투맙, 플레티쿠맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, FPA144, 프레솔리무맙, FS102, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 젬투주맙 오조가미신, 게릴림주맙, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙 베도틴, GNR-006, GNR-011, 골리무맙, 고밀릭시맙, GSK2849330, GSK2857916, GSK3174998, GSK3359609, 구셀쿠맙, Hu14.18K322A MAb, hu3S193, Hu8F4, HuL2G7, HuMab-5B1, 이발리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이크루쿠맙, 이다루시주맙, IGN002, IGN523, 이고보맙, IMAB362, IMAB362(클라우딕시맙), 이말루맙, IMC-CS4, IMC-D11, 임시로맙, 임가투주맙, IMGN529, IMMU-102(이트륨 Y-90 에프라투주맙 테트라세탄), IMMU-114, 이뮤툰(ImmuTune) IMP701 길항제 항체, INCAGN1876, 인클라쿠맙, INCSHR1210, 인다툭시맙 라브탄신, 인두사투맙 베도틴, 인플릭시맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가미신, 인테투무맙, 이파프리셉트, IPH4102, 이필리무맙, 이라투무맙, 이사툭시맙, 이스티라투맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, JNJ-56022473, JNJ-61610588, 켈릭시맙, KTN3379, L19IL2/L19TNF, 라베투주맙, 라베투주맙 고비테칸, LAG525, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, L-DOS47, 레브리키주맙, 레말레소맙, 렌질루맙, 레르델리무맙, 류코툭시맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리파스투주맙 베도틴, 리겔리주맙, 릴로토맙 사테트라세탄, 린투주맙, 리릴루맙, LKZ145, 로델시주맙, 로키베트맙, 로르보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 룰리주맙 페골, 루밀릭시맙, 룸레투주맙, LY3164530, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마슬리모맙, 마투주맙, 마브릴리무맙, MB311, MCS-110, MEDI0562, MEDI-0639, MEDI0680, MEDI-3617, MEDI-551(이네빌리주맙), MEDI-565, MEDI6469, 메폴리주맙, 메텔리무맙, MGB453, MGD006/S80880, MGD007, MGD009, MGD011, 밀라투주맙, 밀라투주맙-SN-38, 민레투모맙, 미르베툭시맙 소라브탄신, 미투모맙, MK-4166, MM-111, MM-151, MM-302, 모가물리주맙, MOR202, MOR208, MORAb-066, 모롤리무맙, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 나프투모맙 에스타페나톡스, 나르나투맙, 나탈리주맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네몰리주맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메르펜탄, NOV-10, 오빌톡삭시맙, 오비누투주맙, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오말리주맙, OMP-131R10, OMP-305B83, 오나르투주맙, 온툭시주맙, 오피시누맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틀러투주맙, OX002/MEN1309, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 판코맙, 판코맙-GEX, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파소툭시주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, PAT-SC1, PAT-SM6, 펨브롤리주맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, PF-05082566(우토밀루맙), PF-06647263, PF-06671008, PF-06801591, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리톡사시맙, 프리투무맙, PRO 140, 프록시늄(Proxinium), PSMA ADC, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 랄판시주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레파네주맙, 레가비루맙, REGN1400, REGN2810/SAR439684, 레슬리주맙, RFM-203, RG7356, RG7386, RG7802, RG7813, RG7841, RG7876, RG7888, RG7986, 릴로투무맙, 리누쿠맙, 리툭시맙, RM-1929, RO7009789, 로바투무맙, 롤레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사시투주맙 고비테칸, 사말리주맙, SAR408701, SAR566658, 사릴루맙, SAT 012, 사투모맙 펜데타이드, SCT200, SCT400, SEA-CD40, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세톡사시맙, 세비루맙, SGN-CD19A, SGN-CD19B, SGN-CD33A, SGN-CD70A, SGN-LIV1A, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 소피투주맙 베도틴, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수비주맙, SYD985, SYM004(푸툭시맙 및 모도툭시맙), Sym015, TAB08, 타발루맙, 타카투주맙 테트라세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타니비루맙, 타플리투모맙 팝톡스, 타렉스투맙, TB-403, 테피바주맙, 텔류킨, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 테프로투무맙, 테시돌루맙, 테툴로맙, TG-1303, TGN1412, 토륨-227-에프라투주맙 접합체, 티실리무맙, 티가투주맙, 틸드라키주맙, 티소투맙 베도틴, TNX-650, 토실리주맙, 토랄리주맙, 토사톡수맙, 토시투모맙, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, TRBS07, TRC105, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 트레보그루맙, TRPH 011, TRX518, TSR-042, TTI-200.7, 투코투주맙 셀몰류킨, 투비루맙, U3-1565, U3-1784, 우블리툭시맙, 울로쿠플루맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 바다스툭시맙 탈리린, 반도르투주맙 베도틴, 반틱투맙, 바누시주맙, 바팔릭시맙, 바릴루맙, 바텔리주맙, VB6-845, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 볼로식시맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, YYB-101, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙 및 졸리모맙 아리톡스를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 시스템들 중 임의의 시스템은 세포의 내생성 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 내생성 단백질을 코딩하는 예시적인 유전자는 표 1, 2 및 3에서 제공되어 있다. 특정 질환 및 장애와 관련된 예시적인 유전자는 표 1 및 2에서 제공되어 있다. 신호전달 생화학적 경로 관련 유전자 및 폴리뉴클레오타이드의 예는 표 3에 나열되어 있다.
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본원에 개시된 시스템들 및 방법들 중 어느 한 시스템 및 방법은 대상체의 표적 세포, 표적 조직, 표적 병태 또는 표적 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다.
표적 질환은 바이러스, 박테리아 및/또는 기생충 감염; 염증 및/또는 자가면역 질환; 또는 암 및/또는 종양과 같은 신생물일 수 있다.
표적 세포는 이환된 세포일 수 있다. 이환된 세포는 변경된 대사, 유전자 발현 및/또는 형태학적 특징을 가질 수 있다. 이환된 세포는 암 세포, 당뇨병 세포 및 아폽토시스 세포일 수 있다. 이환된 세포는 이환된 대상체의 세포일 수 있다. 예시적인 질환은 혈액 장애, 암, 대사 장애, 눈 장애, 장기 장애, 근골격 장애, 심장 질환 등을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 방법들 또는 조성물들 중 어느 한 방법 또는 조성물을 사용하여 다양한 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. 표적 세포는 매우 다양한 세포 유형을 포함할 수 있다. 표적 세포는 시험관내 세포일 수 있다. 표적 세포는 생체내 세포일 수 있다. 표적 세포는 생체외 세포일 수 있다. 표적 세포는 단리된 세포일 수 있다. 표적 세포는 유기체 내부의 세포일 수 있다. 표적 세포는 유기체일 수 있다. 표적 세포는 세포 배양물의 세포일 수 있다. 표적 세포는 세포 집합체의 하나일 수 있다. 표적 세포는 포유동물 세포일 수 있거나 포유동물 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 설치류 세포일 수 있거나 설치류 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 인간 세포일 수 있거나 인간 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 원핵 세포일 수 있거나 원핵 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 박테리아 세포일 수 있거나 박테리아 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 고세균 세포일 수 있거나 고세균 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 진핵 세포일 수 있거나 진핵 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 다분화능 줄기 세포일 수 있다. 표적 세포는 식물 세포일 수 있거나 식물 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 동물 세포일 수 있거나 동물 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 무척추동물 세포일 수 있거나 무척추동물 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 척추동물 세포일 수 있거나 척추동물 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 미생물 세포일 수 있거나 미생물 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 진균 세포일 수 있거나 진균 세포로부터 유래할 수 있다. 표적 세포는 특정 장기 또는 조직으로부터 유래할 수 있다.
표적 세포는 줄기 세포 또는 원시 세포일 수 있다. 표적 세포는 줄기 세포(예를 들어, 성체 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 유도된 다분화능 줄기(iPS) 세포) 및 원시 세포(예를 들어, 심장 원시 세포, 신경 원시 세포 등)를 포함할 수 있다. 표적 세포는 설치류 줄기 세포, 설치류 원시 세포, 인간 줄기 세포, 인간 원시 세포 등을 포함하는 포유동물 줄기 세포 및 원시 세포를 포함할 수 있다. 클론 세포는 세포의 자손을 포함할 수 있다. 표적 세포는 표적 핵산을 포함할 수 있다. 표적 세포는 살아있는 유기체에 있을 수 있다. 표적 세포는 유전적으로 변형된 세포일 수 있다. 표적 세포는 숙주 세포일 수 있다.
표적 세포는 분화전능(totipotent) 줄기 세포일 수 있으나, 본 개시내용의 일부 실시양태에서 용어 "세포"가 사용될 수 있지만 분화전능 줄기 세포를 지칭하지 않을 수 있다. 표적 세포는 식물 세포일 수 있으나, 본 개시내용의 일부 실시양태에서 용어 "세포"는 사용될 수 있지만 식물 세포를 지칭하지 않을 수 있다. 표적 세포는 다분화능 세포일 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 조혈 세포 계통의 다른 세포로 분화할 수 있지만 임의의 다른 비-조혈 세포로 분화할 수 없는 다분화능 조혈 세포일 수 있다. 표적 세포는 전체 유기체로 발달할 수 있다. 표적 세포는 전체 유기체로 발달할 수 있거나 발달하지 않을 수 있다. 표적 세포는 전체 유기체일 수 있다.
표적 세포는 1차 세포일 수 있다. 예를 들어, 1차 세포의 배양물은 0회, 1회, 2회, 4회, 5회, 10회, 15회 이상 계대배양될 수 있다. 세포는 단세포 유기체일 수 있다. 세포는 배양물에서 생장될 수 있다.
표적 세포는 이환된 세포일 수 있다. 이환된 세포는 변경된 대사, 유전자 발현 및/또는 형태학적 특징을 가질 수 있다. 이환된 세포는 암 세포, 당뇨병 세포 및 아폽토시스 세포일 수 있다. 이환된 세포는 이환된 대상체의 세포일 수 있다. 예시적인 질환은 혈액 장애, 암, 대사 장애, 눈 장애, 장기 장애, 근골격 장애, 심장 질환 등을 포함할 수 있다.
표적 세포가 1차 세포인 경우, 표적 세포는 임의의 방법에 의해 개체로부터 채취될 수 있다. 예를 들어, 백혈구는 성분채집술, 백혈구성분채집술, 밀도 구배 분리 등에 의해 채취될 수 있다. 피부, 근육, 골수, 비장, 간, 췌장, 폐, 장, 위 등과 같은 조직의 세포는 생검에 의해 채취될 수 있다. 채취된 세포의 분산 또는 현탁을 위해 적절한 용액을 사용할 수 있다. 이러한 용액은 일반적으로 저농도에서 허용되는 완충제와 함께 태아 송아지 혈청 또는 다른 천연 생성 인자로 편리하게 보충된 균형 잡힌 염 용액(예를 들어, 생리 식염수, 인산염 완충 식염수(PBS), 행크의 균형 잡힌 염 용액 등)일 수 있다. 완충제는 HEPES, 인산염 완충제, 젖산염 완충제 등을 포함할 수 있다. 세포는 즉시 사용될 수 있거나 (예를 들어, 동결에 의해) 보관될 수 있다. 동결된 세포는 해동되어 재사용될 수 있다. 세포는 DMSO, 혈청, 배지 완충제(예를 들어, 10% DMSO, 50% 혈청, 40% 완충 배지), 및/또는 동결 온도에서 세포를 보존하는 데 사용되는 일부 다른 이러한 일반 용액에서 동결될 수 있다.
표적 세포일 수 있는 세포의 비제한적 예는 림프 세포, 예컨대, B 세포, T 세포(세포독성 T 세포, 천연 킬러 T 세포, 조절 T 세포, T 헬퍼 세포), 천연 킬러 세포, 사이토카인 유도 킬러(CIK) 세포(예를 들어, US20080241194 참조); 골수 세포, 예컨대, 과립구(호염기구 과립구, 호산구 과립구, 호중구 과립구/과분절된 호중구), 단핵구/대식세포, 적혈구(망상적혈구), 비만 세포, 혈소판/거핵구, 수지상 세포; 갑상선 세포(갑상선 상피 세포, 부여포(Parafollicular) 세포), 부갑상선 세포(부갑상선 주 세포, 옥시필 세포), 부신 세포(크로마핀(Chromaffin) 세포), 송과체 세포(솔방울샘세포(Pinealocyte))를 포함하는 내분비계 세포; 아교세포(성상세포, 미세아교세포), 대세포성 신경분비 세포, 성상(Stellate) 세포, 보에트처(Boettcher) 세포 및 뇌하수체(고나도트로프(Gonadotrope), 코르티코트로프(Corticotrope), 티로트로프(Thyrotrope), 소마토트로프(Somatotrope), 락토트로프(Lactotroph))를 포함하는 신경계 세포; 폐세포(제I형 폐세포, 제II형 폐세포), 클라라(Clara) 세포, 고블릿(Goblet) 세포, 더스트(Dust) 세포를 포함하는 호흡계 세포; 심근세포, 페리세포를 포함하는 순환계 세포; 위 세포(위 주 세포, 벽세포), 고블릿 세포, 파네스(Paneth) 세포, G 세포, D 세포, ECL 세포, I 세포, K 세포, S 세포를 포함하는 소화계 세포; 장크롬친화 세포, APUD 세포, 간(간세포, 쿠퍼 세포), 연골/뼈/근육을 포함하는 장내분비 세포; 골모세포, 골세포, 파골세포, 치아(백아질모세포(Cementoblast), 범랑모세포(Ameloblast))를 포함하는 골 세포; 연골모세포, 연골세포를 포함하는 연골 세포; 트리코세포, 각질세포, 멜라닌세포(모반 세포)를 포함하는 피부 세포; 근세포를 포함하는 근육 세포; 족소세포(Podocyte), 사구체옆 세포, 사구체내경계 세포/사구체외경계 세포, 신장 근위 세뇨관 브러시 경계 세포, 황반 치밀 세포를 포함하는 비뇨계 세포; 정자, 세르톨리(Sertoli) 세포, 레이디그(Leydig) 세포, 난자를 포함하는 생식계 세포; 및 지방세포, 섬유모세포, 힘줄 세포, 표피 각질세포(분화 표피 세포), 표피 기저 세포(줄기 세포), 손톱 및 발톱의 각질세포, 손발톱 기저 세포(줄기 세포), 수질 모간 세포, 피질 모간 세포, 표피 모간 세포, 표피 모근 피복 세포, 헉슬리 층의 모근 피복 세포, 헨레 층의 모근 피복 세포, 외부 모근 피복 세포, 모발 매트릭스 세포(줄기 세포), 습식 층화 장벽(Wet stratified barrier) 상피 세포, 각막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 원위 요도 및 질의 층화 편평 상피의 표면 상피 세포, 각막, 혀, 구강, 식도, 항문관, 원위 요도 및 질의 상피의 기저 세포(줄기 세포), 비뇨기 상피 세포(방광 및 요관 내벽), 외분비 상피 세포, 침샘 점액 세포(다당류 풍부 분비), 침샘 장액 세포(당단백질 효소 풍부 분비), 혀의 폰 에브너(Von Ebner) 샘 세포(미뢰 세척), 유선 세포(유즙 분비), 눈물샘 세포(눈물 분비), 귀의 귀지샘 세포(왁스 분비), 에크린 땀샘 어두운 세포(당단백질 분비), 에크린 땀샘 투명 세포(소분자 분비), 아포크린 땀샘 세포(냄새 분비, 성호르몬 민감), 눈꺼풀의 몰(Moll) 세포 샘(전문화된 땀샘), 피지샘 세포(지질 풍부 피지 분비), 코의 보우만샘 세포(후각 상피 세척), 십이지장의 브루너샘 세포(효소 및 알칼리성 점액), 정낭 세포(정자의 유영을 위한 프럭토스를 포함하는 정액 성분 분비), 전립선샘 세포(정액 성분 분비), 구순샘 세포(점액 분비), 바르톨린샘 세포(질 윤활제 분비), 리트르(Littre) 샘 세포(점액 분비), 자궁 내막 세포(탄수화물 분비), 호흡기 및 소화관의 단리된 고블릿 세포(점액 분비), 위 내벽 점액 세포(점액 분비), 위샘 효소원 세포(펩시노겐 분비), 위샘 산분비 세포(염산 분비), 췌장 선세포(중탄산염 및 소화 효소 분비), 소장의 파네스 세포(라이소자임 분비), 폐의 제2형 폐세포(계면활성제 분비), 폐의 클라라 세포, 호르몬 분비 세포, 뇌하수체 전엽 세포, 소마토트로프, 락토트로프, 티로트로프, 고나도트로프, 코르티코트로프, 중간 뇌하수체 세포, 대세포성 신경분비 세포, 장 및 호흡기 세포, 갑상선 세포, 갑상선 상피 세포, 부여포 세포, 부갑상선 세포, 부갑상선 주 세포, 옥시필 세포, 부신 세포, 크로마핀 세포, 고환의 레이디그 세포, 난소 여포의 테카 내부(Theca interna) 세포, 파열된 난소 여포의 황체 세포, 과립구 루테인 세포, 테카 루테인 세포, 사구체옆 세포(레닌 분비), 신장의 황반 치밀 세포, 대사 및 저장 세포, 장벽 기능 세포(폐, 장, 외분비선 및 비뇨생식기), 신장, 제1형 폐세포(폐의 내벽 공기 공간), 췌관 세포(샘꽈리중심 세포), (땀샘, 침샘, 유선 등의) 민무늬 관 세포, (정낭, 전립선 등의) 관 세포, 닫힌 내부 체강 내벽을 형성하는 상피 세포, 추진 기능을 가진 섬모 세포, 세포외 매트릭스 분비 세포, 수축 세포; 골격근 세포, 줄기 세포, 심장근 세포, 혈액 및 면역계 세포, 적혈구(적혈 세포), 거핵구(혈소판 전구체), 단핵구, 결합 조직 대식세포(다양한 유형), 표피 랑게르한스 세포, 파골세포(뼈), 수지상 세포(림프 조직), 미세아교세포(중추신경계), 호중구 과립구, 호산구 과립구, 호염기구 과립구, 비만 세포, 헬퍼 T 세포, 억제 T 세포, 세포독성 T 세포, 천연 킬러 T 세포, B 세포, 천연 킬러 세포, 망상적혈구, 줄기 세포 및 혈액과 면역계의 수임 원시 세포(다양한 유형), 다분화능 줄기 세포, 분화전능 줄기 세포, 유도 다분화능 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 감각 전달도입제 세포, 자율 신경 세포, 감각 기관 및 말초 신경 지지 세포, 중추신경계 신경 및 아교세포, 수정체 세포, 색소 세포, 멜라닌세포, 망막 색소 상피 세포, 생식 세포, 난자/난모세포, 정세포, 정모세포, 정원세포(정모세포를 위한 줄기 세포), 정자, 간호 세포, 난소 여포 세포, 세르톨리 세포(고환), 흉선 상피 세포, 간질 세포 및 간질 신장 세포를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
특히 흥미로운 것은 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 표적 세포는 암 세포이다. 암 세포의 비제한적 예는 가시세포종, 선상 세포 암종, 청각 신경종, 말단 흑색성 흑색종, 아크로스피로마, 급성 호산구성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병, 급성 거핵모세포성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 성숙을 동반한 급성 골수모세포성 백혈병, 급성 골수성 수지상 세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 법랑질종, 선암종, 선양 낭성 암종, 선종, 선종양 치원성 종양, 부신피질 암종, 성인 T 세포 백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, AIDS 관련 암, AIDS 관련 림프종, 폐포 연부 육종, 법랑모세포 섬유종, 항문암, 역형성 대세포 림프종, 역형성 갑상선암, 혈관면역모세포성 T 세포 림프종, 혈관근육지방종, 혈관육종, 맹장암, 성상세포종, 비정형 기형 횡문근 종양, 기저 세포 암종, 기저 유사 암종, B 세포 백혈병, B 세포 림프종, 벨리니관 암종, 담도암, 방광암, 모세포종, 골암, 골종양, 뇌간 신경교종, 뇌종양, 유방암, 브레너 종양, 기관지 종양, 세기관지폐포 암종, 갈색 종양, 버킷 림프종, 원발 부위를 알 수 없는 암, 카르시노이드 종양, 암종, 상피내 암종, 음경 암종, 원발 부위를 알 수 없는 암종, 암육종, 캐슬만병, 중추신경계 배아 종양, 소뇌 성상세포종, 대뇌 성상세포종, 자궁경부암, 담관암종, 연골종, 연골육종, 척색종, 융모막암종, 맥락막유두종, 만성 림프구성 백혈병, 만성 단핵구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환, 만성 호중구성 백혈병, 투명 세포 종양, 결장암, 대장암, 두개인두종, 피부 T 세포 림프종, 데고스병(Degos disease), 돌기피부섬유육종, 유피낭종, 결합조직형성 작은 원형 세포 종양, 미만성 거대 B 세포 림프종, 이배형성 신경상피 종양, 배아 암종, 내배엽동 종양, 자궁내막암, 자궁내막 자궁암, 자궁내막양 종양, 장병증 관련 T 세포 림프종, 뇌실막모세포종, 뇌실막종, 상피양 육종, 적백혈병, 식도암, 감각신경모세포종, 유잉 계열 종양, 유잉 계열 육종, 유잉 육종, 두개외 생식 세포 종양, 생식선외 생식 세포 종양, 간외담관암, 유방외 파제트병, 나팔관암, 태아내태아, 섬유종, 섬유육종, 여포성 림프종, 여포성 갑상선암, 담낭암, 신경절신경교종, 신경절신경종, 위암, 위 림프종, 위장암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양, 생식 세포 종양, 생식세포종, 임신성 융모막암종, 임신성 영양막 종양, 골의 거대 세포 종양, 다형 교모세포종, 신경교종, 뇌신경교종증, 사구 종양, 글루카곤종, 생식모세포종, 과립막 세포 종양, 털세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 혈관모세포종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 혈액 악성종양, 간세포 암종, 간비장 T 세포 림프종, 유전성 유방-난소암 증후군, 호지킨 림프종, 호지킨의 림프종, 하인두암, 시상하부 신경교종, 염증성 유방암, 안구 흑색종, 섬세포 암종, 섬세포 종양, 소아 골수단핵구성 백혈병, 카포시 육종, 카포시의 육종, 신장암, 클라츠킨(Klatskin) 종양, 크루켄버그(Krukenberg) 종양, 후두암, 흑색점 악성 흑색종, 백혈병, 입술 및 구강암, 지방육종, 폐암, 황체종, 림프관종, 림프관육종, 림프상피종, 림프성 백혈병, 림프종, 마크로글로불린혈증, 악성 섬유성 조직구종, 골의 악성 섬유성 조직구종, 악성 신경교종, 악성 중피종, 악성 말초 신경초 종양, 악성 횡문근 종양, 악성 트리톤 종양, MALT 림프종, 맨틀 세포 림프종, 비만 세포 백혈병, 종격동 생식 세포 종양, 종격동 종양, 수질 갑상선암, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 수막종, 메르켈 세포 암종, 중피종, 잠복 원발성 전이성 편평 경부암, 전이성 요로상피 암종, 혼합 뮬러 종양, 단핵구성 백혈병, 구강암, 점액성 종양, 다발성 내분비 신생물 증후군, 다발성 골수종, 균상식육종, 골수이형성 질환, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병, 골수성 육종, 골수증식성 질환, 점액종, 비강암, 비인두암, 비인두 암종, 신생물, 신경종, 신경모세포종, 신경섬유종, 신경종, 결절성 흑색종, 비호지킨 림프종, 비흑색종 피부암, 비소세포 폐암, 안 종양, 희소성상세포종, 핍지교종, 종양세포종, 시신경초 수막종, 구강암, 구강인두암, 골육종, 난소암, 난소상피암, 난소 생식 세포 종양, 난소 저악성 잠재성 종양, 유방 파제트병, 파노코스트(Panocoast) 종양, 췌장암, 유두형 갑상선암, 유두종증, 부신경절종, 부비동암, 부갑상선암, 음경암, 혈관주위 상피 세포 종양, 인두암, 크롬친화세포종, 중간 분화의 송과체 실질 종양, 송과체모세포종, 뇌하수체종, 뇌하수체 선종, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물, 흉막폐 모세포종, 다배아종, 전구체 T 림프모세포성 림프종, 원발성 중추신경계 림프종, 원발성 삼출액 림프종, 원발성 간세포암, 원발성 간암, 원발성 복막암, 원시 신경외배엽 종양, 전립선암, 복막 가성점액종, 직장암, 신장 세포 암종, 15번 염색체의 NUT 유전자를 수반하는 호흡기 암종, 망막모세포종, 횡문근종, 횡문근육종, 리히터(Richter) 형질전환, 천골미골기형종, 타액선암, 육종, 신경초종증, 피지샘 암종, 속발성 신생물, 정상피종, 장액성 종양, 세르톨리-레이디그 세포 종양, 성삭-기질 종양, 세자리 증후군, 인장 고리 세포 암종, 피부암, 작은 청색 원형 세포 종양, 소세포 암종, 소세포 폐암, 소세포 림프종, 소장암, 연조직 육종, 소마토스타틴종, 그을음 사마귀(Soot wart), 척수 종양, 척추 종양, 비장 변연부 림프종, 편평 세포 암종, 위암, 표재성 전이 흑색종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 표면 상피-기질 종양, 윤활막 육종, T 세포 급성 림프모세포성 백혈병, T 세포 대과립 림프구 백혈병, T 세포 백혈병, T 세포 림프종, T 세포 전림프구성 백혈병, 기형종, 말기 림프암, 고환암, 난포막종(Thecoma), 인후암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 이행 세포 암종, 요막암, 요도암, 비뇨생식기 신생물, 자궁 육종, 포도막 흑색종, 질암, 버너 모리슨(Verner Morrison) 증후군, 사마귀 암종, 시각 경로 신경교종, 외음부암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 와틴(Warthin) 종양, 윌름스 종양 및 이들의 조합을 포함하는 암의 세포를 포함한다. 일부 경우, 표적화 암 세포는 암 세포 집단 내의 하위집단, 예컨대, 암 줄기 세포를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 암은 조혈 계통의 암, 예컨대, 림프종이다. 항원은 종양 관련 항원일 수 있다.
일부 경우, 대상체는 자가면역 질환을 가질 수 있거나 가진 것으로 의심될 수 있다. 자가면역 질환의 비제한적 예는 급성 파종성 뇌척수염(ADEM), 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염, 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 알레르기성 천식, 알레르기성 비염, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항체 매개 이식 거부, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질 증후군(APS), 자가면역 혈관부종, 자가면역 역형성 빈혈, 자가면역 자율신경실조증, 자가면역 간염, 자가면역 고지혈증, 자가면역 면역결핍, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 췌장염, 자가면역 망막병증, 자가면역 혈소판감소성 자반병(ATP), 자가면역 갑상선 질환, 자가면역 두드러기, 축삭 및 신경 신경병증, 발로병(Balo disease), 베체트병(Behcet's disease), 수포성 유천포창, 심근병증, 캐슬만병(Castleman disease), 셀리악병(Celiac disease), 샤가스병(Chagas disease), 만성 피로 증후군, 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP), 만성 재발성 다초점 골수염(CRMO), 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 증후군, 반흔성 유천포창/양성 점막 유천포창, 크론병, 코간스(Cogans) 증후군, 한랭 응집소 질환, 선천성 심장 차단, 콕사키 심근염, CREST 질환, 필수 혼합 한랭글로불린혈증, 탈수초 신경병증, 포진성 피부염, 피부근염, 데빅병(Devic's disease)(시신경척수염), 원판형 루푸스, 드레슬러(Dressler) 증후군, 자궁내막증, 호산구성 근막염, 결절 홍반, 실험적 알레르기성 뇌척수염, 에반스(Evans) 증후군, 섬유근육통, 섬유화 폐포염, 거대 세포 동맥염(측두 동맥염), 사구체신염, 굿파스처 증후군, 다발혈관염을 동반한 육아종증(GPA), 그레이브스병, 길랭-바레(Guillain-Barre) 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쉰라인(Henoch-Schonlein) 자반병, 임신성 헤르페스, 저감마글로불린혈증, 과감마글로불린혈증, 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP), IgA 신병증, IgG4 관련 경화 질환, 면역조절 지단백질, 봉입체 근염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 당뇨병(제1형), 간질성 방광염, 소아 관절염, 소아 당뇨병, 가와사키(Kawasaki) 증후군, 램버트-이튼(Lambert-Eaton) 증후군, 백혈구파괴성 혈관염, 편평 태선, 경화성 태선, 목질 결막염, 선형 IgA 질환(LAD), 루푸스(SLE), 라임병, 메니에르병, 현미경적 다발혈관염, 혼합 결합 조직 질환(MCTD), 불명확한 의미의 단일클론 감마글로불린병증(MGUS), 무렌 궤양, 무차-하버만병(Mucha-Habermann disease), 다발성 경화증, 중증 근무력증, 근염, 기면증, 시신경척수염(데빅병), 호중구감소증, 안구 반흔성 유천포창, 시신경염, 회귀성 류마티즘, PANDAS(스트렙토코커스와 관련된 소아과 자가면역 신경정신과 장애), 부신생물성 소뇌 변성, 발작성 야간 헤모글로빈뇨증(PNH), 패리 롬버그(Parry Romberg) 증후군, 파르소니지-터너(Parsonnage-Turner) 증후군, 평면부염(말초 포도막염), 천포창, 말초 신경병증, 정맥주위 뇌척수염, 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 제I형, 제II형 및 제III형 자가면역 다선 증후군, 류마티스성 다발근육통, 다발근염, 심근경색후 증후군, 심막절개술후 증후군, 프로게스테론 피부염, 원발성 담즙성 간경변증, 원발성 경화성 담관염, 건선, 건선성 관절염, 특발성 폐 섬유증, 괴저성 농피증, 진성 적혈구 무형성증, 레이노 현상, 반사 교감신경 위축증, 라이터(Reiter) 증후군, 재발성 다발연골염, 하지불안 증후군, 후복막 섬유증, 류마티스열, 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 슈미트(Schmidt) 증후군, 공막염, 경피증, 쇼그렌 증후군, 정자 및 고환 자가면역, 강직 인간 증후군, 아급성 박테리아 심내막염(SBE), 수삭(Susac) 증후군, 교감성 안염, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판감소성 자반병(TTP), 톨로사-헌트(Tolosa-Hunt) 증후군, 횡단성 척수염, 궤양성 결장염, 미분화 결합 조직 질환(UCTD), 포도막염, 혈관염, 수포성 피부병, 백반증, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM) 및 베게너 육아종증(다발혈관염을 동반한 육아종증(GPA))을 포함할 수 있다.
일부 경우, 자가면역 질환은 류마티스성 관절염, 제1형 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스(루푸스 또는 SLE), 중증 근무력증, 다발성 경화증, 경피증, 애디슨병, 수포성 유천포창, 심상성 천포창, 길랭-바레 증후군, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 혈전성 혈소판감소성 자반병, 고감마글로불린혈증, 불명확한 의미의 단일클론 감마글로불린병증(MGUS), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(WM), 만성 염증성 탈수초 다발신경병증(CIDP), 하시모토 뇌병증(HE), 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 베게너 육아종증 및 항체 매개 이식 거부(예를 들어, 신장 이식과 같은 조직 이식)을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 구성원을 포함한다. 예를 들어, 자가면역 질환은 제1형 당뇨병, 루푸스 또는 류마티스성 관절염일 수 있다.
일부 경우, 표적 세포는 종양(즉, 고형 종양)을 형성한다. 본원의 방법으로 치료된 종양은 종양 성장을 안정화할 수 있다(예를 들어, 하나 이상의 종양은 크기가 1%, 5%, 10%, 15% 또는 20% 이상 증가하지 않고/않거나 전이하지 않음). 일부 경우, 종양은 적어도 약 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 이상 동안 안정화된다. 일부 경우, 종양은 적어도 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 이상 동안 안정화된다. 일부 경우, 종양은 적어도 약 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년 또는 10년 이상 동안 안정화된다. 일부 경우, 종양의 크기 또는 종양 세포의 수는 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 감소된다. 일부 경우, 종양은 완전히 제거되거나 검출 수준 이하로 감소된다. 일부 경우, 대상체는 치료 후 적어도 약 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주 또는 12주 이상 동안 종양 부재 상태(예를 들어, 관해)를 유지한다. 일부 경우, 대상체는 치료 후 적어도 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 또는 12개월 이상 동안 종양 부재 상태를 유지한다. 일부 경우, 대상체는 치료 후 적어도 약 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년 또는 10년 이상 동안 종양 부재 상태를 유지한다.
실시예
실시예 1: 암 또는 종양 치료를 위한 CAR T 세포에 의한 내생성 IL-12의 조건부 분비
인터류킨(IL)-12는 만성 염증을 급성 염증으로 바꾸는 스위치를 작동시키는 T 세포 및 대식세포를 활성화시켜 암 거부를 유발할 수 있다. 그러나, 임상 전 모델에서의 강력한 항종양 효과에도 불구하고, IL-12(예를 들어, 재조합 IL-12)의 임상 활용은 다수의 부작용, 예를 들어, 심각한 전신 독성에 의해 제한될 수 있다. 따라서, 조작된 면역 세포(예를 들어, CAR T 세포)의 내생성 IL-12의 발현을 활성화시킬 수 있거나 상향조절할 수 있는 조건부 항원 의존성 비-유전자 편집 CRISPR 활성화(CRISPRa) 회로를 이용하여 조작된 면역 세포의 자가분비 활성화를 촉진할 수 있다.
A. CAR T 세포 설계
T 세포는 도 5에 나타낸 바와 같이 CAR(즉, CAR T 세포)을 발현하도록 조작될 수 있다. CAR T 세포는 종양 세포의 특정 항원, 예컨대, HER2에 결합하도록 설계된 CAR을 발현할 수 있다. HER2와 CAR의 결합 시, CAR의 후속 수용체 변형은 CAR T 세포의 세포내 활성을 유발하여 CAR T 세포의 내생성 IL-12의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다(도 5, 왼쪽). CAR T 세포는 서로 작동 가능하게 커플링되어 있는 CAR(예를 들어, 항원 결합 scFv, 막횡단 도메인, 및 CD28, CD3ζ 및 TEV 프로테아제를 포함하는 세포내 도메인을 포함함)과 키메라 어댑터(예를 들어, TEV 절단 가능한 부위를 통해 dCas9-VPR 작동자 모이어티와 융합된 LAT를 포함함)를 발현하도록 조작될 수 있다. CAR의 항원의 부재 하에("항원 없음"), 키메라 어댑터는 CAR로 동원될 수 없으므로, 작동자 모이어티는 키메라 어댑터에 커플링된 상태를 유지할 수 있고 불활성화된 상태를 유지할 수 있다(도 5, 중간). 대조적으로, CAR의 항원의 존재 하에("+ 항원"), (sgRNA와 함께) 작동자 모이어티의 활성화를 달성하여, IL-12를 코딩하는 내생성 유전자와 복합체를 형성함으로써 내생성 IL-12의 발현을 활성화시키거나 향상시키기 위해, 키메라 어댑터는 CAR로 동원됨으로써, CAR의 TEV 프로테아제가 키메라 어댑터로부터 작동자 모이어티를 절단할 수 있게 한다(도 5, 오른쪽).
조작되지 않은 세포는 대조군으로서 사용될 수 있다. sgRNA를 결여하는 CAR T 세포는 상이한 대조군으로서 사용될 수 있다.
B. 가이드 RNA 서열
적어도 부분적으로 인간 IL-12A의 TSS 뉴클레오타이드 서열(서열번호 1): GCTTTCATTTTGGGCCGAGCTGGA를 기반으로 하나 이상의 가이드 RNA를 설계하였다.
적어도 부분적으로 인간 IL-12B의 TSS 뉴클레오타이드 서열(서열번호 2): AGAAGAAACAACATCTGTTTCAGG를 기반으로 하나 이상의 가이드 RNA를 설계하였다.
C. CAR T 세포 제조
2개의 내생성 서브유닛 p35 및 p40의 조건부 전사를 통해 IL-12 이종이량체를 조건부로 발현하도록 CAR T 세포를 조작하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 제1 발현 카세트는 담배 에치(etch) 바이러스(TEV) 프로테아제에 연결된 CD28 및 CD3ζ 보조자극 도메인, 및 IL-12A 또는 IL-12B(즉, IL12Asg, IL12Bsg)에 대한 프로모터 영역을 표적화하는 2개의 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 가진, 항-HER2(4D5) 단일 쇄 가변 단편을 코딩하는 렌티바이러스 구축물을 코딩하였다(즉, LV #1). 도 6에 나타낸 바와 같이, 제2 발현 카세트는 TEV 절단 가능한 링커(LdCV)를 통해 뉴클레아제 불활성화/사멸 Cas9(dCas9)-VP64-p65-Rta(dCas9-VPR) 전사 활성화제(VPR)와 복합체를 형성한, T 세포의 활성화를 위한 링커를 코딩하였다(즉, LV #2). CAR과 HER2의 결합 시 CAR의 활성화 및 후속 수용체 변형은 CAR의 TEV를 LdCV에 근접하게 함으로써, 핵 국소화를 위한 dCas9-VPR을 조절 영역으로 방출할 수 있고 p70 이종이량체(즉, IL-12)의 나노규모 발현을 조건부 및 가역적으로 유도할 수 있다.
D. 내생성 사이토카인의 조절된 발현
인간 공여자로부터 단리된 T 세포를 도 6에 나타낸 구축물로 조작하여 본원에 개시된 CAR T 세포(즉, RG1874, RG1654)를 생성하였다. CAR T 세포를 (예를 들어, 높은 표면 밀도에서) HER2 엑토도메인으로 코팅된 비드(예를 들어, 중합체 비드, 자기 비드 등)와 함께 인큐베이션하여 CAR T 세포를 활성화시켰다. 비드 대 CAR T 세포의 비(예를 들어, 다수의 비드 대 다수의 CAR T 세포)는 약 1:1("HER2 1:1") 또는 2:1("HER2 2:1")이었다. 그 후(예를 들어, 3일 후), (예를 들어, 효소 연결 면역흡착 어세이 또는 "ELISA"를 통해) 세포로부터 내생성 IL-12 및 내생성 IFNγ의 발현(또는 분비)을 측정하였다. dCas9-VPR 작동자 모이어티를 포함하는 2종의 조작된 인간 CAR T 세포(RG1874, RG1654)에서, 내생성 IL-12의 분비는 가이드 RNA의 부재("NOsg")에 비해 IL-12A 및 IL-12B에 대한 가이드 RNA의 존재("IL12sg") 하에 향상되었다. RG1874 CAR T 세포에서, 내생성 IL-12의 분비는 1:1 비드 대 세포 비 및 2:1 비드 대 세포 비에서 HER2-비드에 의해 활성화되었을 때 향상되었다(도 7a). RG1874 CAR T 세포에서, 내생성 IFNγ의 분비는 1:1 비드 대 세포 비 및 2:1 비드 대 세포 비에서 HER2-비드에 의해 활성화되었을 때 향상되었다(도 7c). RG1654 CAR T 세포에서, 내생성 IL-12의 분비는 1:1 비드 대 세포 비 및 2:1 비드 대 세포 비에서 HER2-비드에 의해 활성화되었을 때 향상되었다(도 7b). RG1654 CAR T 세포에서, 내생성 IFNγ의 분비는 1:1 비드 대 세포 비 및 2:1 비드 대 세포 비에서 HER2-비드에 의해 활성화되었을 때 향상되었다(도 7d).
E. 표적 서열 의존성
IL-12A 유전자 TSS(서열번호 1)를 표적화하도록 제1 가이드 RNA("#38")를 설계하였다. IL-12B 유전자 TSS(서열번호 2)의 상이한 영역을 표적화하도록 제2 가이드 RNA("#49") 및 제3 가이드 RNA("#55")를 설계하였다. 앞에서 논의된 바와 같이, (i) 가이드 RNA 없음("NOsg"), (ii) #48 및 #49 gRNA를 가진 다중체 IL-12 gRNA, 및 (iii) #48 및 #55 gRNA를 가진 다중체 IL-12 gRNA를 이용하여 CAR-T 세포를 제조하였다. HER2 제시 비드에 의한 활성화 시, #38 + #49 다중체 gRNA 시스템은 #38 + #55 다중체 gRNA 시스템보다 더 높은 수준의 내생성 IL-12 분비를 유도하였는데, 이는 각각의 유전자의 TSS의 어느 영역을 표적화하는 것이 중요한지를 암시하였다.
F. 종양 세포에 의한 CAR T 세포 활성화
앞에서 논의된 바와 같이 (i) 가이드 RNA 없음("NOsg") 또는 (ii) IL-12A TSS 및 IL-12B TSS에 대한 다중체 gRNA("IL12sg")를 이용하여 CAR-T 세포를 생성하였다. 조작되지 않은 인간 공여자 T 세포도 대조군("NT")으로서 사용하였다. CAR T 세포를 HER2+ FaDu 세포(하인두 암종 세포주)와 함께 배양하여 CAR T 세포를 활성화시켰다. FaDu 세포 활성화 시, 다중체 gRNA를 포함하는 CAR-T 세포는 내생성 IL-12 및 IFNγ의 가장 높은 발현도를 나타내었다(도 9a).
분비된 IL-12의 효과를 확인하기 위해, 작동자 모이어티 및 IL-12 유전자(들)에 대한 가이드 RNA(들) 없이 대조군 항-HER2 CAR T 세포를 생성하였고("HER2.CAR-T"), CAR T 세포를 (i) IL-12(p70, p35와 p40의 이종이량체)를 항시적으로 발현하도록 조작된 HER2+ FaDu 세포("FaDuIL12") 또는 (ii) IL-12의 임의의 변형된 발현이 없는 HER2+ FaDu 세포("FaDu")(약 1:1 비의 CAR T 세포 대 FaDu 세포)와 함께 인큐베이션하였다. 예상된 바와 같이, FaDuIL12 세포는 3일째 날 대조군 FaDu 세포보다 더 많은 IL-12를 분비하였다(도 9b, 왼쪽). 또한, FaDuIL12 세포로부터 분비된 IL-12에 의한 CAR T 세포의 활성화로 인해, 3일째 날 CAR T 세포를 FaDuIL12 세포와 함께 인큐베이션하였을 때 더 높은 수준의 분비된 IFNγ가 관찰되었다(도 9b, 오른쪽).
G. FaDu 종양 세포의 표적화
앞에서 논의된 바와 같이 (i) 가이드 RNA 없음("NOsg") 또는 (ii) IL-12A TSS 및 IL-12B TSS에 대한 다중체 gRNA("IL12sg")를 이용하여 CAR-T 세포를 제조하였다. 조작되지 않은 인간 공여자 T 세포도 대조군("NT")으로서 사용하였다. 상기 세포를, IL-12를 항시적으로 발현하지 않는 HER2+ FaDu 세포와 함께 배양하였다(약 1:1 비의 CAR T 세포 대 FaDu 세포). HER2에 결합하였을 때 내생성 IL-12의 발현을 조건부로 향상시킬 수 있는 CAR T 세포(IL12sg 세포)는 약 3일 이내에 FaDu 종양 세포 수의 가장 큰 정도의 감소를 나타내었다(도 10a, 왼쪽). 또한, IL12sg CAR T 세포는 약 3일 이내에 가장 큰 정도의 세포 증식을 나타내었다(도 10a, 오른쪽).
CAR T 세포의 내생성 IL-12 발현에 의존하는 것의 중요성을 평가하기 위해, 작동자 모이어티 및 sgRNA 분자를 갖지 않는 대조군 항-HER2 CAR T 세포("HER2.CAR-T")를 앞에서 논의된 바와 같이 FaDu 세포 또는 FaDuIL12 세포와 함께 배양하였다. CAR T 세포가 내생성 IL-12의 발현을 조건부로 조절할 수 없었을 때, FaDuIL12 세포 단독에 의해 분비된 IL-12의 존재는 약 3일 이내에 CAR T 세포의 종양 세포 세포독성을 향상시키기에 충분하지 않았다(도 10b, 왼쪽). FaDuIL12 세포는 FaDu 세포에 비해 CAR T 세포의 향상된 증식을 촉진하였다.
H. MDAMB231 종양 세포의 표적화
유사하게, 대조군 인간 공여자 T 세포("NT"), IL-12 다중체 gRNA를 갖지 않는 CAR T 세포("NOsg"), 및 IL-12 다중체 gRNA를 가진 CAR T 세포("IL12sg")를 약 3일 동안 HER2+ MDAMB231 종양 세포와 함께 배양하였다(약 1:1 비 또는 1:3 비의 CAR T 세포 대 MDAMB231 세포). HER2에 결합하였을 때 내생성 IL-12의 발현을 조건부로 향상시킬 수 있는 CAR T 세포(IL12sg 세포)는 가장 높은 내생성 IL-12 발현 수준을 나타내었다(도 11a). IL12sg 세포는 가장 높은 내생성 IFNγ 발현 수준을 나타내었다(도 11b). IL12sg 세포는 가장 높은 내생성 TNFα 발현 수준을 나타내었다(도 11c). IL12sg 세포는 NOsg 대조군 세포에 비해 IL-2 발현(또는 분비)의 감소를 나타내었다.
나아가, CAR T 세포를 MDAMB231 종양 세포와 함께 배양한 후, 남아있는 MDAMB231 종양 세포의 수(CAR T 세포의 종양 세포 세포독성의 지표) 및 CAR T 세포의 수(CAR T 세포 증식의 지표)를 3일째 날과 6일째 날에 측정하였다. HER2에 결합하였을 때 내생성 IL-12의 발현을 조건부로 향상시킬 수 있는 CAR T 세포(IL12sg 세포)와 약 3일 또는 6일 동안 배양하였을 때 가장 낮은 수의 종양 세포가 관찰되었다(도 12a 및 12c). IL12sg 세포는 또한 대조군 NOsg CAR T 세포보다 더 큰 정도의 세포 증식을 나타내었다(도 12b 및 12d).
I. 생체내 종양 감소
HER2에 결합하였을 때 내생성 IL-12의 발현을 조건부로 향상시킬 수 있는 CAR T 세포(IL12sg 세포)를, FaDu 세포로부터 유래한 확립된 종양(FaDu 이종이식편)을 가진 마우스에서 시험한다. FaDu 세포(약 5x106개의 FaDu 세포)를 CB17 SCID 마우스에 피하 접종한다. 유사한 크기의 종양을 가진 동물을 다음과 같은 치료 코호트(n=9/군)로 무작위 배정한다: 비히클(예를 들어, 완충제), IL12sg 세포(예를 들어, 약 1x105개 내지 약 1x106개 세포/kg) 및 대조군 NOsg 세포(예를 들어, 약 1x105개 내지 약 1x106개 세포/kg). 치료를 무작위 배정 당일에 (예를 들어, 정맥내로) 투여하고 총 4회 치료를 위해 주마다 계속 투여한다. 연구 기간 동안 주당 2회 캘리퍼로 종양을 측정한다. 혈액에서의 CAR T 세포의 지속성을 상이한 시점에서 측정한다. CAR T 세포의 내생성 IL-12의 조건부 발현(종양 이종이식편에서 HER2의 결합 시)은 혈액에서의 향상된 지속성 및 생체내에서의 향상된 종양 사멸을 촉진할 수 있다.
이론에 의해 구속받고자 하지는 않지만, 내생성 IL-12와 같은 Th1 분극화 성분의 조건부 유도 발현 및 이의 후속 CAR-T 세포 활성화(즉, 조건부 유도 자가분비 IL-12 신호전달)는 이펙터 기능의 향상을 세포 적합성과 조합함으로써 재프로그램밍된 CAR-T 세포의 효능을 증가시킬 수 있다. 동시에, 나노규모 IL-12 생성의 자가분비 효과는 종양 외부 누출 및 전신 독성의 위험을 제한할 수 있다.
실시예 2: 내생성 IL-12를 조절하기 위한 가이드 RNA(들)의 스크리닝
A. Jurkat 세포의 형질감염
IL-2는 Th1 세포 발생의 필수 유도제일 수 있다. IL-12는 2개의 별개의 유전자에 의해 코딩된 2개의 서브유닛, 즉 IL-12 베타(P40) 및 IL-12 알파(P35)로 구성된 이종이량체이다. 일부 경우, 성공적인 IL-12 분비를 위해 이들 두 유전자를 함께 전사하고 두 단백질을 함께 생성하여 전체(즉, 기능성) P70 단백질을 형성할 필요가 있을 수 있다.
IL-12를 코딩하는 유전자의 상이한 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 설계된 복수의 gRNA와 함께 dCAS9-VPR을 코딩하는 벡터로 Jurkat 세포(인간 T 림프구 세포의 불멸화된 세포주)를 형질감염시켰다(예를 들어, 약 500 나노그램 (ng) 내지 약 1 마이크로그램(㎍)의 각각의 벡터를 형질감염에 사용하였다). (예를 들어, 전압 1325, 폭 30 및 1 펄스에서 인비트로겐 네온(Invitrogen Neon) 전기천공을 이용하여) 상기 벡터(들)를 형질감염시켰다. 세포를 배지(예를 들어, RPMI1640 + 10% FCS)에 플레이팅하고(예를 들어, 96웰 플레이트) 사이토카인 분비 측정 전에 (예를 들어, 37℃에서 48시간 내지 72시간 동안) 인큐베이션하여, 복수의 항-IL-12 gRNA들 중 하나 이상의 gRNA의 유효성 및 효과를 평가하였다.
B. 사이토카인 분비 측정
형질감염된 Jurkat 세포로부터 분비된 사이토카인을 측정하기 위해, Jurkat 세포 배양물로부터 상청액을 수거하고, (예를 들어, 인비트로겐 ELISA 키트를 사용하여) 효소 연결 면역흡착 어세이(ELISA)를 수행하였다. P40 키트를 사용하여 P40(IL-12 베타) 분비를 측정하였고, P70 키트(IL-12 알파+베타)를 사용하여 전체 사이토카인 분비를 측정하였다.
C. gRNA 스크리닝
일부 예에서, (예를 들어, IL-12B(p40)에 대해 설계된 gRNA를 시험하기 전에) IL-12A(p35)에 대해 설계된 gRNA를 시험할 수 있다.
일부 예에서, (예를 들어, IL-12A(p35)에 대해 설계된 gRNA를 시험하기 전에) IL-12B(p40)에 대해 설계된 gRNA를 시험할 수 있다.
일부 예에서, IL-12A(p35)에 대해 설계된 하나 이상의 gRNA 및 IL-12B(p40)에 대해 설계된 하나 이상의 gRNA를 함께 시험할 수 있다.
일부 예에서(도 13a에 예시된 바와 같음), IL-12A(p35)에 대해 설계된 gRNA를 시험할 수 있고, 항-IL-12A gRNA(들)(예를 들어, 상위 선도물질 gRNA(들))의 선택을 IL-12B(p40)에 대한 복수의 gRNA와 함께 시험하여, 항-IL-12B gRNA(들)(예를 들어, 상위 선도물질(들))의 선택을 확인할 수 있다. 따라서, 항-IL-12A gRNA(들)의 선택과 항-IL-12B gRNA(들)의 선택을 함께 이용하여 표적 세포(들)에서 IL-12의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다.
일부 예에서(도 13b에 예시된 바와 같음), IL-12B(p40)에 대해 설계된 gRNA를 시험할 수 있고, 항-IL-12B gRNA(들)(예를 들어, 상위 선도물질 gRNA(들))의 선택을 IL-12A(p35)에 대한 복수의 gRNA와 함께 시험하여, 항-IL-12A gRNA(들)(예를 들어, 상위 선도물질(들))의 선택을 확인할 수 있다. 따라서, 항-IL-12B gRNA(들)의 선택과 항-IL-12A gRNA(들)의 선택을 함께 이용하여 표적 세포(들)에서 IL-12의 발현 또는 활성을 조절할 수 있다.
D. 스크리닝 결과
항-IL-12 gRNA 스크리닝을 2 단계로 수행하였다. 먼저, Jurkat 세포를 IL-12B gRNA 스크리닝에 사용하였는데, 이는 이 서브유닛이 단량체로서 분비되고 (예를 들어, ELISA에 의해) 검출될 수 있기 때문이다. dCAS9-VPR과 함께 추정 gRNA를 형질감염시킴으로써 스크리닝을 수행하였다. IL-12B에 대해 설계된 약 100개의 gRNA를 분석하였다. 본원에서 제공된 바와 같이 ELISA를 이용하여 사이토카인 분비를 측정하였다. 스크리닝 실험(예를 들어, 3회 스크리닝 실험)을 수행하였고, IL-12B의 전사를 활성화시킬 수 있는 여러 gRNA를 확인하였다. IL-12B에 대한 상위 선도물질 gRNA는 도 14a에서 화살표로 표시된 바와 같이 IL-12B 유전자의 전사 시작 부위(TSS)에 가깝게 업스트림에 있는(예를 들어, TSS의 300개 염기 업스트림 내에 있는) 영역에 대해 상보성을 나타내었다.
다음으로, IL-12A 유전자에 대한 gRNA를 스크리닝하기 위해, Jurkat 세포를 추정 IL-12A gRNA와 함께 dCAS9-VPR, 선도물질 IL-12B gRNA로 형질감염시켰다. 이어서, 전체 IL-12(P70) 사이토카인 분비를 ELISA로 측정하였다. 몇 개의 효율적인 항-IL-12A gRNA를 확인하였다. 몇 가지 예외/이상치가 있지만, IL-12A에 대한 상위 선도물질 gRNA는 도 14b에서 화살표로 표시된 바와 같이 IL-12A 유전자의 전사 시작 부위(TSS)에 가깝게 업스트림에 있는(예를 들어, TSS의 250개 염기 업스트림 내에 있는) 영역에 대해 상보성을 나타내었다.
각각의 유전자에 대한 gRNA(예를 들어, 2개 또는 3개의 gRNA)를 선택하고 Jurket 세포에서 다양한 조합으로 시험하여 이들의 활성을 검증하였다(도 15 참조). 항-IL-12A gRNA와 항-IL-12B gRNA의 조합의 사용(도 15에서 38+55 참조)은 IL-12A 또는 IL-12B에 대한 단일 gRNA만을 사용한 경우(도 15에서 55, 50 및 38 참조)의 IL-12(P70) 발현 수준보다 약 10배 내지 약 15배(예를 들어, 약 10배, 11배, 12배, 13배, 14배 또는 15배) 더 높은 IL-12(P70) 발현 수준을 나타내었다. 항-IL-12A gRNA와 항-IL-12B gRNA의 조합의 사용(도 15에서 38+55 참조)은 항-IL-12A gRNA와 항-IL-12B gRNA의 상이한 조합을 사용한 경우(도 15에서 50+55, 50+49 또는 38+49 참조)의 IL-12(P70) 발현 수준보다 약 2배 내지 약 10배(예를 들어, 약 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배) 더 높은 IL-12(P70) 발현 수준을 나타내었다. IL-12A(p35)를 표적화하도록 가이드 38 및 50을 설계하였다. IL-12B(P40)를 표적화하도록 가이드 49 및 55를 설계하였다.
각각의 유전자에 대한 gRNA(예를 들어, 2개 또는 3개의 gRNA)를 선택하고 1차 T 세포에서 다양한 조합으로 시험하여 이들의 활성을 검증하였다(도 16 참조). 항-IL-12A gRNA와 항-IL-12B gRNA의 조합의 사용(도 16에서 38+49 참조)은 gRNA의 조합을 사용하지 않은 대조군 1차 T 세포에 비해 IL-12(P70) 발현 수준의 향상을 촉진하였다.
실시예 3: 내생성 IL-21의 조절
ef1a-dCas9-VPR-Q8(이하, "Q8")을 함유하는 렌티바이러스를 Jurkat 세포에 형질도입한 후, Q8 양성 세포를 (예를 들어, 약 1주 후) 분류하였다. 그 다음, 분류된 Q8 양성 세포를 (예를 들어, 약 2주 후) 다시 분류하여 dCas9-VPR 발현 세포주를 확립하였다. 그 다음, 형질감염제를 사용하여 이 세포(예를 들어, 반응당 약 200,000개의 세포)를 sgRNA(예를 들어, 약 250 내지 500 ng의 sgRNA)로 형질감염시켰다. 세포를 배지(예를 들어, RPMI1640 + 10% FCS)에 플레이팅하고(예를 들어, 96웰 플레이트) 일정 시간(예를 들어, 48시간 내지 72시간) 동안 37℃에서 인큐베이션한 후 유전자 발현을 분석하였다. IL-21을 코딩하는 유전자에 대한 복수의 가이드 RNA의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 위치는 도 17(상단)에 표시되어 있고, IL-21에 대한 복수의 가이드 RNA의 서열은 도 17(하단, 왼쪽)에 제공되어 있다.
델타 델타 Ct 방법을 이용하여 SYBR 그린 qPCR로 유전자 발현(들)을 측정하였다. IL-21을 코딩하는 유전자에 대한 프라이머(정방향 프라이머: TAGAGACAAACTGTGAGTGGTCA; 역방향 프라이머: GGGCATGTTAGTCTGTGTTTCTG)를 설계하였고, GAPDH를 기준 유전자로서 사용하였다.
Q8, 및 IL-21에 대한 복수의 가이드 RNA 중 하나를 포함하는 시스템에 의한 활성화 시, Jurkat 세포에서 내생성 IL-21의 향상된 발현이 도 17(하단, 오른쪽)에 표시되어 있다. 일부 경우, 이러한 시스템의 사용은 IL-21 유전자의 상이한 위치에 결합하거나 IL-21 유전자에 대해 특이적 결합 친화성을 나타내지 않는 대조군 gRNA(예를 들어, IL21_UP_gR92f)를 가진 대조군 Jurket 세포에 비해 내생성 IL-21 발현 수준의 약 10배(예를 들어, IL-21_UP_gR8r), 약 100배(예를 들어, IL-21_UP_gR16r) 또는 약 1,000배(예를 들어, IL-21_UP_gR42f) 향상을 촉진하였다.
본 발명의 상이한 측면은 개별적으로, 집합적으로 또는 서로 조합되어 인식될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 설명된 본 발명의 다양한 측면은 본원에 개시된 임의의 특정 응용에 적용될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이 세포의 사이토카인(예를 들어, 내생성 사이토카인)의 발현 또는 활성을 조절하는 시스템은 본원에 개시된 사용 및 제조 방법을 포함하는 방법 단락에서 이용될 수 있고, 그 반대도 가능하다. 이러한 시스템은 본원에 개시된 바와 같이 이 시스템을 포함하는 임의의 세포를 포함하는 물질 조성물에서 이용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 실시양태가 단지 예로서 제공된다는 것은 당분야의 숙련된 자에게 자명할 것이다. 본 발명은 본 명세서 내에 제공된 특정 예에 의해 제한되지 않는다. 본 발명이 상기 언급된 본 명세서를 참조함으로써 설명되었지만, 본원에서 실시양태의 설명 및 예시는 제한적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 비로소 본 발명을 벗어나지 않으면서 수많은 변경, 변화 및 치환이 당분야의 숙련된 자에게 인식될 것이다. 또한, 본 발명의 모든 측면은 다양한 조건 및 변수에 의해 좌우되는, 본원에 제시된 특정 묘사, 구성 또는 상대적 비율로 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본원에 설명된 본 발명의 실시양태의 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 임의의 이러한 대안, 변형, 변경 또는 등가물도 커버할 것으로 생각된다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고 이 청구범위 내의 방법과 구조 및 이들의 등가물은 이에 의해 커버된다.

Claims (108)

  1. 세포의 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절하는 시스템으로서, 시스템은
    내생성(endogenous) 사이토카인을 코딩하는 표적 유전자와 복합체를 형성하여 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 작동자 모이어티(actuator moiety)를 포함하고, 상기 작동자 모이어티는 세포에 대해 이종성이고 세포를 외부 자극에 노출시켰을 때 활성화될 수 있고,
    세포를 외부 자극에 노출시켰을 때, 상기 작동자 모이어티가 활성화되어 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절함으로써, 세포로 하여금
    (i) 대조군에 비해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화;
    (ii) 대조군에 비해 세포의 상이한 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화;
    (iii) 대조군에 비해 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20% 감소에 의해 확인되는, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성;
    (iv) 대조군에 비해 세포를 포함하는 세포 집단의 크기의 적어도 20% 증가에 의해 확인되는 향상된 증식; 및
    (v) 대조군에 비해 종양 크기의 감소
    로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 미치는 것인 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 외부 자극이 리간드이고, 시스템이 리간드에 결합하였을 때 변형이 되는 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)를 포함하고, 여기서 작동자 모이어티가 수용체 변형 시 활성화될 수 있는 것인 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 작동자 모이어티의 활성화가 (1) 기질로부터의 작동자 모이어티의 방출 또는 (2) 작동자 모이어티의 변형을 포함하는 것인 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 (i) 내지 (v) 중 2개 이상을 나타내도록 영향을 받는 것인 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 (i) 내지 (v) 중 3개 이상을 나타내도록 영향을 받는 것인 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대조군 세포에 비해 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 증가를 나타내도록 영향을 받는 것인 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 내생성 사이토카인이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 및 IL-36으로 구성된 군으로부터 선택된 인터류킨(IL)을 포함하는 것인 시스템.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 내생성 사이토카인이 IL-12를 포함하는 것인 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자가 IL-12A(p35)를 코딩하는 제1 유전자 및 IL-12B(p40)를 코딩하는 제2 유전자를 포함하는 것인 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 내생성 사이토카인이 IL-21을 포함하는 것인 시스템.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 작동자 모이어티가 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 복합체를 형성할 수 있고, 여기서 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 (i) 표적 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 적어도 일부를 포함하거나, (ii) 표적 유전자의 TSS로부터 약 1,000개 염기 내지 약 900개 염기, 약 900개 염기 내지 약 800개 염기, 약 800개 염기 내지 약 700개 염기, 약 700개 염기 내지 약 600개 염기, 약 600개 염기 내지 약 500개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기만큼 떨어져 있는 것인 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, (1) 작동자 모이어티의 제1 작동자 모이어티가 표적 유전자의 제1 유전자와 복합체를 형성할 수 있고 (2) 작동자 모이어티의 제2 작동자 모이어티가 표적 유전자의 제2 유전자와 복합체를 형성할 수 있고, 이에 의해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절할 수 있고, 여기서 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성이 상이한 제1 유전자와 제2 유전자의 조절 하에 있는 것인 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 작동자 모이어티가 핵산 가이드된(guided) 작동자 모이어티를 포함하고, 시스템이 작동자 모이어티와 복합체를 형성하는 가이드 핵산을 추가로 포함하는 것인 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자의 상이한 부분에 대해 상보성을 가진 2개 이상의 가이드 핵산을 추가로 포함하는 시스템.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 핵산이 가이드 리보핵산(RNA)을 포함하는 것인 시스템.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대조군 세포에 비해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화를 나타내도록 영향을 받는 것인 시스템.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 상이한 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 증가를 나타내도록 영향을 받는 것인 시스템.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 IFN-α(알파), IFN-β(베타), IFN-κ(카파), IFN-δ(델타), IFN-ε(엡실론), IFN-τ(타우), IFN-ω(오메가), IFN-ζ(제타), IFN-γ(감마) 및 IFN-λ(람다)로 구성된 군으로부터 선택된 인터페론(IFN)을 포함하는 것인 시스템.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 IFN-γ(감마)를 포함하는 것인 시스템.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 TNFβ, TNFα, TNFγ, CD252(OX40 리간드), CD154(CD40 리간드), CD178(Fas 리간드), CD70(CD27 리간드), CD153(CD30 리간드), 4-1BBL(CD137 리간드), CD253(TRAIL), CD254(RANKL), APO-3L(TWEAK), CD256(APRIL), CD257(BAFF), CD258(LIGHT), TL1(VEGI), GITRL(TNFSF18) 및 엑토디스플라신(Ectodysplasin) A로 구성된 군으로부터 선택된 종양 괴사 인자(TNF) 단백질을 포함하는 것인 시스템.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 TNFα를 포함하는 것인 시스템.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 상이한 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 감소를 나타내도록 영향을 받는 것인 시스템.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 IL-12가 아닌 것인 시스템.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 IL-2를 포함하는 것인 시스템.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성이 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60% 감소에 의해 확인되는 것인 시스템.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포 집단이 이환된 세포를 포함하고, 리간드가 이환된 세포의 항원인 시스템.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 이환된 세포가 암 세포 또는 종양 세포를 포함하는 것인 시스템.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 향상된 증식이 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80% 또는 적어도 100% 증가에 의해 확인되는 것인 시스템.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 크기가 대조군에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60% 감소되는 것인 시스템.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 작동자 모이어티가 표적 유전자의 발현을 조절하도록 구성된 이펙터 도메인을 포함하는 것인 시스템.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 도메인은 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자(repressor) 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 시스템.
  32. 제30항에 있어서, 이펙터 도메인은 전사 활성화 도메인인 시스템.
  33. 제30항에 있어서, 이펙터 도메인은 전사 억제인자 도메인인 시스템.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 작동자 모이어티가 이종 엔도뉴클레아제(endonuclease) 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 입체구조적 변화 또는 화학적 변형인 시스템.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 면역 세포인 시스템.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포 또는 NK 세포인 시스템.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항의 시스템을 포함하는 조작된 세포 집단.
  39. 제37항에 있어서, 조작된 면역 세포를 포함하는 조작된 세포 집단.
  40. 제38항에 있어서, 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 세포 집단.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 조작된 세포 집단을 포함하는 조성물.
  42. 제40항에 있어서, 보조치료제를 추가로 포함하는 조성물.
  43. 세포의 인터류킨(IL) 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 설계된 가이드 핵산 분자를 포함하는 시스템으로서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 (i) IL 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 적어도 일부를 포함하거나 (ii) IL 유전자의 TSS로부터 약 1,000개 염기 내지 약 900개 염기, 약 900개 염기 내지 약 800개 염기, 약 800개 염기 내지 약 700개 염기, 약 700개 염기 내지 약 600개 염기, 약 600개 염기 내지 약 500개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기만큼 떨어져 있고, 가이드 핵산 분자가 세포에 대해 이종성인 시스템.
  44. 제42항에 있어서, 가이드 핵산 분자가 작동자 모이어티를 IL 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열로 동원하여, IL의 발현 또는 활성을 조절할 수 있고, 시스템이 작동자 모이어티를 추가로 포함하는 것인 시스템.
  45. 세포의 인터류킨(IL) 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있는 작동자 모이어티를 포함하는 시스템으로서, 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 (i) IL 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 적어도 일부를 포함하거나 (ii) IL 유전자의 TSS로부터 약 1,000개 염기 내지 약 900개 염기, 약 900개 염기 내지 약 800개 염기, 약 800개 염기 내지 약 700개 염기, 약 700개 염기 내지 약 600개 염기, 약 600개 염기 내지 약 500개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기만큼 떨어져 있고, 작동자 모이어티가 세포에 대해 이종성인 시스템.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 작동자 모이어티가 이종 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, IL 유전자가 세포에 대해 내생성인 시스템.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, TSS가 세포에 대해 내생성인 시스템.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, IL이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 및 IL-36으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 시스템.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, IL이 IL-12인 시스템.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, IL이 IL-12A 및/또는 IL-12B인 시스템.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, IL이 IL-21인 시스템.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, (i) TSS의 제1 부분에 결합하도록 설계된 제1 가이드 핵산 분자 및 (ii) TSS의 제2 부분에 결합하도록 설계된 제2 가이드 핵산 분자를 포함하는 시스템.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, (i) IL 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 제1 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 설계된 제1 가이드 핵산 분자 및 (ii) IL 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 제2 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 설계된 제2 가이드 핵산 분자를 포함하는 시스템.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 핵산 분자가 가이드 리보핵산(RNA)을 포함하는 것인 시스템.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, TSS가 서열번호 1에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 것인 시스템.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, TSS가 서열번호 2에 대해 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가진 것인 시스템.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 면역 세포인 시스템.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포 또는 NK 세포인 시스템.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 한 항의 시스템을 포함하는 조작된 세포 집단.
  61. 제58항에 있어서, 조작된 면역 세포를 포함하는 조작된 세포 집단.
  62. 제59항에 있어서, 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 세포 집단.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항의 조작된 세포 집단을 포함하는 조성물.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 시스템을 포함하는 조성물.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 보조치료제를 추가로 포함하는 조성물.
  66. 세포의 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절하는 방법으로서,
    (a) 세포를 외부 자극에 노출시키는 단계; 및
    (b) 외부 자극에의 노출에 반응하여, 작동자 모이어티와 내생성 사이토카인을 코딩하는 표적 유전자 사이에 복합체를 형성하여 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절하고, 이에 의해 세포로 하여금
    (i) 대조군에 비해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화;
    (ii) 대조군에 비해 세포의 상이한 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화;
    (iii) 대조군에 비해 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20% 감소에 의해 확인되는, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성;
    (iv) 세포를 포함하는 세포 집단의 크기의 적어도 20% 증가에 의해 확인되는 향상된 증식; 및
    (v) 대조군에 비해 종양 크기의 감소
    로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 특성을 나타내도록 영향을 미치는 단계
    를 포함하는 방법.
  67. 제64항에 있어서, 외부 자극이 리간드이고, (a)가 키메라 수용체 폴리펩티드(수용체)를 리간드에 노출시켜 수용체의 변형을 달성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 (1) 기질로부터의 작동자 모이어티의 방출 또는 (2) 작동자 모이어티의 변형을 통해 작동자 모이어티를 활성화시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 (i) 내지 (v) 중 2개 이상을 나타내도록 영향을 받는 것인 방법.
  70. 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 (i) 내지 (v) 중 3개 이상을 나타내도록 영향을 받는 것인 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대조군 세포에 비해 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 증가를 나타내도록 영향을 받는 것인 방법.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 내생성 사이토카인이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35 및 IL-36으로 구성된 군으로부터 선택된 인터류킨(IL)을 포함하는 것인 방법.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 내생성 사이토카인이 IL-12를 포함하는 것인 방법.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자가 IL-12A(p35)를 코딩하는 제1 유전자 및 IL-12B(p40)를 코딩하는 제2 유전자를 포함하는 것인 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 내생성 사이토카인이 IL-21을 포함하는 것인 방법.
  76. 제1항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 작동자 모이어티가 표적 유전자의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열과 복합체를 형성할 수 있고, 여기서 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 (i) 표적 유전자의 전사 시작 부위(TSS)의 적어도 일부를 포함하거나 (ii) 표적 유전자의 TSS로부터 약 1,000개 염기 내지 약 900개 염기, 약 900개 염기 내지 약 800개 염기, 약 800개 염기 내지 약 700개 염기, 약 700개 염기 내지 약 600개 염기, 약 600개 염기 내지 약 500개 염기, 약 500개 염기 내지 약 400개 염기, 약 400개 염기 내지 약 300개 염기, 약 300개 염기 내지 약 200개 염기, 약 200개 염기 내지 약 100개 염기, 또는 약 100개 염기 내지 약 1개 염기만큼 떨어져 있는 것인 방법.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 (1) 작동자 모이어티의 제1 작동자 모이어티와 표적 유전자의 제1 유전자 사이에 복합체를 형성하고 (2) 작동자 모이어티의 제2 작동자 모이어티와 표적 유전자의 제2 유전자 사이에 복합체를 형성하고, 이에 의해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성을 조절하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성이 상이한 제1 유전자와 제2 유전자의 조절 하에 있는 것인 방법.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 작동자 모이어티가 핵산 가이드된 작동자 모이어티를 포함하고, 시스템이 작동자 모이어티와 복합체를 형성하는 가이드 핵산을 추가로 포함하는 것인 방법.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 시스템이 표적 유전자의 상이한 부분에 대해 상보성을 가진 2개 이상의 가이드 핵산을 추가로 포함하는 것인 방법.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 가이드 핵산이 가이드 리보핵산(RNA)을 포함하는 것인 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대조군 세포에 비해 내생성 사이토카인의 발현 또는 활성의 적어도 20% 변화를 나타내도록 영향을 받는 것인 방법.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 상이한 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 300%, 적어도 400% 또는 적어도 500% 증가를 나타내도록 영향을 받는 것인 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 IFN-α(알파), IFN-β(베타), IFN-κ(카파), IFN-δ(델타), IFN-ε(엡실론), IFN-τ(타우), IFN-ω(오메가), IFN-ζ(제타), IFN-γ(감마) 및 IFN-λ(람다)로 구성된 군으로부터 선택된 인터페론(IFN)을 포함하는 것인 방법.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 IFN-γ(감마)를 포함하는 것인 방법.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 TNFβ, TNFα, TNFγ, CD252(OX40 리간드), CD154(CD40 리간드), CD178(Fas 리간드), CD70(CD27 리간드), CD153(CD30 리간드), 4-1BBL(CD137 리간드), CD253(TRAIL), CD254(RANKL), APO-3L(TWEAK), CD256(APRIL), CD257(BAFF), CD258(LIGHT), TL1(VEGI), GITRL(TNFSF18) 및 엑토디스플라신 A로 구성된 군으로부터 선택된 종양 괴사 인자(TNF) 단백질을 포함하는 것인 방법.
  86. 제1항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 TNFα를 포함하는 것인 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 상이한 내생성 사이토카인의 발현 수준의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90% 감소를 나타내도록 영향을 받는 것인 방법.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 IL-12가 아닌 것인 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 IL-21이 아닌 것인 방법.
  90. 제1항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상이한 내생성 사이토카인이 IL-2를 포함하는 것인 방법.
  91. 제1항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포 집단에 대한 향상된 세포독성이 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60% 감소에 의해 확인되는 것인 방법.
  92. 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 세포 집단이 이환된 세포를 포함하고, 리간드가 이환된 세포의 항원인 방법.
  93. 제1항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 이환된 세포가 암 세포 또는 종양 세포를 포함하는 것인 방법.
  94. 제1항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 향상된 증식이 표적 세포 집단의 크기의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 60%, 적어도 80% 또는 적어도 100% 증가에 의해 확인되는 것인 방법.
  95. 제1항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 크기가 대조군에 비해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50% 또는 적어도 60% 감소되는 것인 방법.
  96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 작동자 모이어티가 표적 유전자의 발현을 조절하도록 구성된 이펙터 도메인을 포함하는 것인 방법.
  97. 제1항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 이펙터 도메인은 절단 도메인, 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제인자 도메인으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 방법.
  98. 제93항에 있어서, 이펙터 도메인은 전사 활성화 도메인인 방법.
  99. 제93항에 있어서, 이펙터 도메인은 전사 억제인자 도메인인 방법.
  100. 제1항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 작동자 모이어티가 이종 엔도뉴클레아제 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 방법.
  101. 제1항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 입체구조적 변화 또는 화학적 변형인 방법.
  102. 제1항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 면역 세포인 방법.
  103. 제1항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포 또는 NK 세포인 방법.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 대상체에 대해 자가 또는 동종인 방법.
  106. 제1항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 보조치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  107. 제1항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 포유동물인 방법.
  108. 제1항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
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