CN111172088A - 表达her2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法 - Google Patents

表达her2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法。该技术方案首先将HER2单链抗体的编码基因通过酶切酶连的方法与Igκ载体连接，再利用所得的重组质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，从而得到能够表达HER2单链抗体的重组菌株。本发明中采用对HER2阳性细胞的定点靶向特性和减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的胞内侵袭、聚集的特性，位点特异性地实现HER2抗体蛋白的表达，从而更准确地杀伤HER2阳性肿瘤细胞，降低对机体正常细胞的损伤。在此基础上，本发明提供了考察该重组菌抗肿瘤功效的一种实验方法，将活化后的菌株采用灌胃的方式处理乳腺癌动物模型，再考察其肿瘤体积的变化。

Description

表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，进一步涉及生物制药及肿瘤医学技术，具体涉及一种表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法。
背景技术
目前针对肿瘤的治疗有化学、物理和生物方法等，但上述疗法始终未能达到治疗肿瘤的理想效果，因此探索更安全、更有效地新型肿瘤治疗方法迫在眉睫。自WilliamColey首次利用细菌治疗肿瘤以来，细菌靶向治疗肿瘤己成为近年国际研究的热点，多种细菌被发现可特异性的侵入机体肿瘤组织并大量繁殖，利用活菌治疗肿瘤的设想就随之产生。
靶向治疗是指抗肿瘤药物能针对性地与肿瘤的特异性位点结合，从而对肿瘤细胞起到杀伤效果，而对健康组织基本无影响，是目前较为理想的治疗模式，也代表着肿瘤治疗的未来趋势。其主要分为单克隆抗体药和抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADC)。ADC药物是一类新颖的治疗药物，正日益受到全球制药公司的关注。ADC药物由单克隆抗体和强效毒性药物(toxic drug)通过生物活性连接器(linker)偶联而成，是一种定点靶向癌细胞的强效抗癌药物。由于其对靶点的准确识别性及非癌细胞不受影响性，极大地提高了药效并减少了毒副作用。
在乳腺癌患者中约25％～30％呈现出人表皮生长因子受体-2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2)的过表达，这种类型的乳腺癌通常具有较高的临床及病理分期和较差的预后。HER2也称为受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)erbB-2，为HER家族成员之一，主要由胞外域配体结合区、单链跨膜区及胞内域蛋白酪氨酸激酶区这3部分组成。因为无相应配体，通常与HER家族其他成员如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR/HER1)和HER3等形成二聚体，引起胞内域酪氨酸激酶区的自身磷酸化，启动细胞内信号级联反应，维持细胞的生存与发育，促进细胞增殖和迁移等。HER2的过表达通过启动多种转移相关机制而增加转移能力，HER2过表达的乳腺癌恶性程度相对较高，容易出现淋巴结、骨、肺等处转移，HER2过表达也影响某些黏附分子如上皮细胞钙黏蛋白(E-cadher-in)等合成，从而促进肿瘤细胞的转移。HER2单链抗体能与乳腺癌细胞过表达的HER2进行强有力的结合，从而抑制HER2过表达引起的一系列癌细胞增殖和转移的过程。
尽管对乳腺癌具有确切的治疗作用，但常规给药方式下HER2单链抗体在患者体内均匀分布，无法在肿瘤内特异性聚集，使其靶向性有待提升。在这种情况下，如果能对HER2单链抗体进行结构改进，以实现其对实体肿瘤或肿瘤细胞的专一性，那么则有望进一步提升HER2单链抗体的抗肿瘤效果。然而，要实现这一目的，采用化学偶联方法还是微生物重组方法、选择怎样的载体、二者如何实现分子水平的连接，诸多问题尚有待解决。
研究发现，鼠伤寒沙门氏菌相较于其他细菌更易于在肿瘤部位定殖。然而其天然菌株毒性强，易造成患者的严重感染。为克服这一安全性差问题，研究人员改造了一系列减毒突变株用于肿瘤靶向治疗，VNP20009就是其中一种研究最广泛的减毒突变株。VNP20009是一种基因修饰的鼠伤寒沙门氏菌菌株，具有极好的安全性，这种安全性特征包括遗传毒性减弱(puri基因缺失)、败血症性休克电位的降低(msbb基因缺失)和抗生素敏感性。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法，以解决现有技术中常规HER2单链抗体无法在肿瘤内特异性聚集的技术问题。
本发明要解决的另一技术问题是，对实体肿瘤具有偏好性的鼠伤寒沙门氏菌，无法在肿瘤中表达HER2单链抗体，以实现抗肿瘤作用。
本发明要解决的再一技术问题是，对于携带有基因药物的重组微生物，如何验证其抗肿瘤功效。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，该重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是由以下方法构建的：
1)将HER2抗体的编码基因片段通过酶切酶连的方法连接到Igκ质粒中，得到Igκ-HER2重组质粒；
2)将所述Igκ-HER2重组质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。
作为优选，在于步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA片段。
作为优选，步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是由人工合成获得的。
作为优选，步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是以核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA片段为引物，由PCR扩增获得的。
作为优选，步骤2)中所使用的Igκ-HER2重组质粒，是先将步骤1)所得的Igκ-HER2重组质粒转入E.coli Top10中，而后培养扩增获得的。
作为优选，步骤1)所述的酶切酶连，是以Age I和Hind III双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Igκ质粒中。
作为优选，步骤2)包括：采用0.1cm电转杯，以1.8kV，200Ω，25μF，电转4.7ms的条件，将所述Igκ-HER2重组质粒电转至感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中；而后通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，即得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。
作为优选，所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，是通过以下方法制备的：将减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mL LB培养基中，37℃振荡培养12h；按1:100的比例接种于100mL LB培养基中，振荡培养至细菌OD值为0.4；冰浴20min，而后以4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃、3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，即得到所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。
作为优选，所述Igκ质粒是核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子。
在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的抗肿瘤功能验证方法，该方法是将活化后的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，对利用SK-BR-3乳腺癌细胞造模成功的乳腺癌小鼠进行灌胃处理，而后记录肿瘤体积。
在以上技术方案的基础上，本发明进一步提供了上述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的抗肿瘤功能验证方法，该方法包括以下步骤：
1)将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2用LB培养基活化；
2)将HER2阳性的乳腺癌细胞SK-BR-3以2×106的数量在雌性裸鼠右侧肋部进行皮下注射；
3)将步骤1)活化后的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2对步骤2)造模成功的乳腺癌小鼠进行灌胃处理，而后记录肿瘤体积。
本发明提供了一种表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法。该技术方案首先将HER2单链抗体的编码基因通过酶切酶连的方法与Igκ载体连接，再利用所得的重组质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，从而得到能够表达HER2单链抗体的重组菌株。本发明中采用对HER2阳性细胞的定点靶向特性和减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的胞内侵袭、聚集的特性，位点特异性地实现HER2抗体蛋白的表达，从而更准确地杀伤HER2阳性肿瘤细胞，降低对机体正常细胞的损伤。在此基础上，本发明提供了考察该重组菌抗肿瘤功效的一种实验方法，将活化后的菌株采用灌胃的方式处理乳腺癌动物模型，再考察其肿瘤体积的变化。
该技术方案构建出Igκ-HER2重组质粒，利用Igκ真核载体携带HER2单链抗体，并以减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009作为治疗载体，综合应用了减毒鼠伤寒沙门氏菌胞内侵袭的特性和特异性聚集在实体瘤中的性质，进一步扩大了本发明中肿瘤杀伤的特异性。本发明结合前期实验基础，为ADC药物治疗肿瘤的发展提供了一定的理论基础和数据支撑。
本发明通过实验室前期发现的特异性识别HER2蛋白的单链抗体，结合减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009的肿瘤内特异性聚集及胞内侵袭的特性，携带HER2抗体达到特异性杀伤肿瘤的效果。其技术优势集中体现在以下方面：本发明利用HER2单链抗体对HER2阳性细胞的靶向特性和减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009在实体瘤中侵袭、聚集特性，属于抗体偶联药物这种新型治疗药物，能更好地实现特异性杀伤肿瘤细胞效果并可降低对机体正常细胞的损伤；本发明采用减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009为药物表达载体，介导真核质粒转染细胞并实现其真核表达，大幅降低了药物成本。
附图说明
图1是本发明实施例1中，不同实验组肿瘤体积随时间的变化曲线图。图中：M组为空白组；M+VNP20009为采用常规减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009进行灌胃的实验组；M+VNP20009-Igκ-HER2为采用本发明重组减毒鼠伤寒沙门氏菌进行灌胃的实验组。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实验中所采用的原始质粒Igκ、E.coli Top10、减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009、限制性内切酶、T4DNA连接酶、LB固体培养基及液体培养基，均为常规生化实验材料，均自市面购得。
实施例1
1、以HER2抗体片段为模板，以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3序列为引物，PCR扩增获得SEQ ID No.1所示的HER2抗体片段。
2、已获得的HER2抗体片段和质粒Igκ，经Age I和Hind III双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Igκ(SEQ ID No.4)质粒中，重组质粒命名为Igκ-HER2。
3、将-80℃保存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mL LB中，37℃振荡培养12h；按1:100比例接种于100mL LB中振荡培养至细菌OD＝0.4左右；冰浴20min后，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，制成VNP20009感受态分装后-80℃留存备用。
4、将已获得的重组质粒Igκ-HER2电转进入减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，采用0.1cm电转杯，条件设置为：1.8kV，200Ω，25μF，电转4.7ms；通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，获得重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，命名为VNP20009-Igκ-HER2。
5、将活化好的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2对利用SK-BR-3乳腺癌细胞造模成功的乳腺癌小鼠进行灌胃处理，记录小鼠肿瘤大小。实验结果如图1所示，与空白组及减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009组相比，采用本发明重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2灌胃处理后，实体肿瘤体积增速显著降低，表现出了确切的肿瘤抑制效果。
实施例2
表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，该重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是由以下方法构建的：
1)将HER2抗体的编码基因片段通过酶切酶连的方法连接到Igκ质粒中，得到Igκ-HER2重组质粒；
2)将所述Igκ-HER2重组质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。
其中步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA片段。步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是以核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA片段为引物，由PCR扩增获得的。
步骤2)中所使用的Igκ-HER2重组质粒，是先将步骤1)所得的Igκ-HER2重组质粒转入E.coli Top10中，而后培养扩增获得的。
步骤1)所述的酶切酶连，是以Age I和Hind III双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Igκ质粒中。
步骤2)包括：采用0.1cm电转杯，以1.8kV，200Ω，25μF，电转4.7ms的条件，将所述Igκ-HER2重组质粒电转至感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中；而后通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，即得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。
所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，是通过以下方法制备的：将减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mLLB培养基中，37℃振荡培养12h；按1:100的比例接种于100mL LB培养基中，振荡培养至细菌OD值为0.4；冰浴20min，而后以4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃、3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，即得到所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。
所述Igκ质粒是核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子。
接下来，可采用以下方法A或B对重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的抗肿瘤功能进行验证：
方法A：将活化后的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，对利用SK-BR-3乳腺癌细胞造模成功的乳腺癌小鼠进行灌胃处理，而后记录肿瘤体积。
方法B：
1)将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2用LB培养基活化；
2)将HER2阳性的乳腺癌细胞SK-BR-3以2×106的数量在雌性裸鼠右侧肋部进行皮下注射；
3)将步骤1)活化后的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2对步骤2)造模成功的乳腺癌小鼠进行灌胃处理，而后记录肿瘤体积。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南昌大学
<120> 表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其功能验证方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1536
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tctagaatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tggccttgct gctccacgcc 60
gccaggccgg gatcccaggt gcagctgttg cagtctgggg cagagttgaa aaaacccggg 120
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cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 960
agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1020
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1080
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1140
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1200
agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500
caggccctgc cccctcgcca tcatcaccat caccat 1536
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cttcaccggt tctagaatgg ccttacc 27
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
tattaagctt ttaatggtga tggtgatgat ggcgaggggg cagggcctgc at 52
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<211> 4756
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
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ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 120
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 180
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 240
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tatagaataa catccacttt gcctttctct ccacaggtgt ccactcccag gtccaactgc 900
acctcggttc tatcgattga attccaccat gggatggtca tgtatcatcc tttttctagt 960
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ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 1080
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 1140
tctggatcga tcgggaatta attcggcgca gcaccatggc ctgaaataac ctctgaaaga 1200
ggaacttggt taggtacctt ctgaggcgga aagaaccagc tgtggaatgt gtgtcagtta 1260
gggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 1320
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ggcctaggct tttgcaaaaa gctgttaaca gcttggcact ggccgtcgtt ttacaacgtc 1620
gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccccttcg 1680
ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgtagcc 1740
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accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 1860
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 1920
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 1980
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 2040
tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 2100
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 2160
tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 2220
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat 2280
tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta 2340
tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 2400
tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 2460
tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagta ttcttgaaga 2520
cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct 2580
tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc 2640
taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa 2700
tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt 2760
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gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc 2880
cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta 2940
tgtggcgcgg tattatcccg tgatgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac 3000
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ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg 3180
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gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc 3480
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atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca 3600
tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 3660
ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca 3720
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ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt 3900
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gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg 4020
ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg 4080
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attcattaat ccagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac 4620
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gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac 4740
catgattacg aattaa 4756

Claims (10)

1.表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于该重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是由以下方法构建的：
1)将HER2抗体的编码基因片段通过酶切酶连的方法连接到Igκ质粒中，得到Igκ-HER2重组质粒；
2)将所述Igκ-HER2重组质粒转化至减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。
2.根据权利要求1所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的DNA片段。
3.根据权利要求2所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤1)中HER2抗体的编码基因片段是以核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的DNA片段为引物，由PCR扩增获得的。
4.根据权利要求1所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤2)中所使用的Igκ-HER2重组质粒，是先将步骤1)所得的Igκ-HER2重组质粒转入E.coliTop10中，而后培养扩增获得的。
5.根据权利要求1所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤1)所述的酶切酶连，是以Age I和Hind III双酶切，酶切产物纯化后，采用T4连接酶连接到Igκ质粒中。
6.根据权利要求1所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于步骤2)包括：采用0.1cm电转杯，以1.8kV，200Ω，25μF，电转4.7ms的条件，将所述Igκ-HER2重组质粒电转至感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中；而后通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，即得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2，即为所述表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。
7.根据权利要求6所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，是通过以下方法制备的：将减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009划线接种于无抗性的LB平板，37℃培养过夜；挑取单个菌落于5mL LB培养基中，37℃振荡培养12h；按1:100的比例接种于100mL LB培养基中，振荡培养至细菌OD值为0.4；冰浴20min，而后以4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀用1/10体积预冷的无菌去离子水洗涤两次，4℃、3000rpm离心10min；菌体沉淀再次用1/100体积预冷的10％甘油洗涤菌体，4℃、3000rpm离心10min；将菌体沉淀重悬于1/100体积预冷的10％甘油中，即得到所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009。
8.根据权利要求1所述的表达HER2单链抗体的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，其特征在于所述Igκ质粒是核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子。
9.权利要求1～8任一项所述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的抗肿瘤功能验证方法，其特征在于该方法是将活化后的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-H ER2，对利用SK-BR-3乳腺癌细胞造模成功的乳腺癌小鼠进行灌胃处理，而后记录肿瘤体积。
10.权利要求1～8任一项所述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的抗肿瘤功能验证方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)将重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2用LB培养基活化；
2)将HER2阳性的乳腺癌细胞SK-BR-3以2×106的数量在雌性裸鼠右侧肋部进行皮下注射；
3)将步骤1)活化后的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009-Igκ-HER2对步骤2)造模成功的乳腺癌小鼠进行灌胃处理，而后记录肿瘤体积。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106591365A (zh) * 2016-12-07 2017-04-26 南昌大学 一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的真核细胞质粒转染方法
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