KR102610715B1 - 입양 t 세포 요법을 위한 중앙 기억 ｔ 세포 - Google Patents

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Abstract

인터루킨-13Rα2 (IL13Rα2)에 결합하는 IL-13 또는 그의 변이체를 포함하는 세포외 도메인, 막횡단 영역, 공자극 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 막횡단 면역수용체 (CAR)를 기술한다.

Description

입양 T 세포 요법을 위한 중앙 기억 Ｔ 세포 {CENTRAL MEMORY T CELLS FOR ADOPTIVE T CELL THERAPY}
항종양 치료를 위해, 조작된 T 세포를 사용하는 요법을 비롯한, 종양 특이 T 세포 기반 면역요법이 연구되어 왔다. 일부 경우에서, 상기 요법에서 사용되는 T 세포는 생체내에서 충분히 장기간 동안 활성 상태 그대로 유지되지 못한다. 일부 경우에서, T 세포의 종양 특이성은 비교적 낮다. 그러므로, 관련 기술분야에서는 항종양 기능이 더욱 장기간 동안 지속되는 종양 특이적 암 요법이 요구되고 있다.
키메라 항원 수용체 (CAR) 조작된 T 세포를 사용하는 입양 T 세포 요법 (ACT)이 MG의 재발률을 감소시킬 수 있는 안전하고, 효과적인 방법을 제공할 수 있는데, 그 이유는 CAR T 세포가 항원과 관련하여 독특한 종양 집단을 특이적으로 인식하도록 조작될 수 있고 (Cartellieri et al. 2010 J Biomed Biotechnol 2010:956304; Ahmed et al. 2010 Clin Cancer Res 16:474; Sampson et al. 2014 Clin Cancer Res 20:972; Brown et al. 2013 Clin Cancer Res 2012 18:2199; Chow et al. 2013 Mol Ther 21:629), T 세포는 뇌 실질을 통과하여 이동함으로써 침윤성 악성 세포를 표적화하고, 그를 사멸시킬 수 있다 (Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Brown et al. 2007 J Immunol 179:3332; Hong et al. 2010 Clin Cancer Res 16:4892; Yaghoubi 2009 Nat Clin PRact Oncol 6:53). 전임상 연구 결과, IL13Rα2-표적화 CAR+ T 세포가 줄기 유사 및 분화된 신경교종 세포, 둘 모두에 대하여 강력한 주조직적합성 복합체 (MHC)-비의존성, IL13Rα2-특이적 세포용해 활성을 보이고, 생체내에서 확립된 신경교종 이종이식편의 퇴행을 유도한다는 것이 입증되었다 (Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64:9160; Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199).
본원에서는 중앙 기억 T 세포 (Tcm)를 포함하는 세포 집단을 기술한다. 세포 집단은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포, 둘 모두를 포함한다. 세포 집단 중의 세포는 세포외 도메인 (예컨대, 선택된 표적에 결합하는 scFv), 막횡단 영역 및 세포내 신호전달 도메인, 예컨대, 인간 CD3 복합체의 제타 쇄 (CD3ζ)로부터의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인, 및 하나 이상의 공자극 도메인, 예컨대, 4-1BB 공자극 도메인을 포함하는 키메라 막횡단 면역수용체 (키메라 항원 수용체 또는 "CAR")를 발현하는 데 유용하다. 세포외 도메인은 T 세포의 표면 상에 발현되었을 때, CAR가, 세포외 도메인에 의해 인식된 표적을 발현하는 세포로 T 세포 활성을 지시하게 할 수 있다. 세포내 영역 내에 CD3ζ와 연속하여 공자극 도메인, 예컨대, 4-1BB (CD137) 공자극 도메인을 포함함에 따라, T 세포는 공자극 신호를 받을 수 있게 된다.
본원에 기술된 Tcm 세포, 예를 들어, 환자 특이적, 자가 또는 동종이계 Tcm 세포는 원하는 CAR을 발현하도록 조작될 수 있고, 조작된 세포는 확장될 수 있고, ACT에서 사용될 수 있다. TCM 세포 집단은 CD45RO+CD62L이고, CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 인간 T 세포 집단은 키메라 항원 수용체를 발현하는 벡터를 포함하고; 인간 중앙 기억 T 세포 (Tcm 세포) 집단은 적어도 10%의 CD4+ 세포 및 적어도 10%의 CD8+ 세포 (예컨대, 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%의 세포는 Tcm 세포이고; 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%의 Tcm 세포는 CD4+이고, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%의 Tcm 세포는 CD8+ 세포이다).
본원에서는 또한 키메라 항원 수용체를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 벡터에 의해 형질도입된 자가 또는 동종이계 인간 T 세포 집단 (예컨대, Tcm 세포를 포함하는 자가 또는 동종이계 T 세포, 예컨대, 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 60%, 70%, 80%의 세포는 Tcm 세포이고; 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%의 Tcm 세포는 CD4+이고, 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%의 Tcm 세포는 CD8+ 세포이다)을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암을 치료하는 방법도 기술한다.
본원에서는 형질도입된 인간 T 세포 중 적어도 50%가 중앙 기억 T 세포인 것인, 키메라 항원 수용체를 발현하는 벡터로 형질도입된 인간 T 세포 집단을 기술한다. 다양한 실시양태에서, 형질도입된 세포 중앙 기억 T 세포 중 적어도 10%는 CD4+이고; 형질도입된 중앙 기억 T 세포 중 적어도 10%는 CD8+이고; 중앙 기억 T 세포 중 적어도 15%는 CD4+이고, 적어도 15%는 CD8+이고; 형질도입된 인간 T 세포 중 적어도 50%는 CD4+/CD8+/CD62L+이다.
본원에서는 또한 형질도입된 인간 T 세포 중 적어도 50%가 CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-이고, 적어도 10%의 세포는 CD4+이고, 적어도 10%의 세포는 CD4+인 것인, 키메라 항원 수용체를 발현하는 벡터로 형질도입된 인간 T 세포 집단도 기술한다. 다양한 실시양태에서: CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-인 세포 중 적어도 10%는 또한 CD4+이고, CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-인 세포 중 적어도 10%는 또한 CD8+이고; CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-인 세포 중 적어도 15%는 또한 CD4+이고, CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-인 세포 중 적어도 15%는 또한 CD4+이다.
또한, 암 치료를 필요로 하는 환자에게 본원에 기술된 중앙 기억 T 세포를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법도 기술한다. T 세포는 환자 자가 유래의 것일 수 있거나, 또는 환자에 대해 동종이계인 것이다.
또한, 인간 대상체로부터 T 세포 집단을 수득하는 단계; CD25를 발현하는 세포, CD14를 발현하는 세포, 및 CD45+를 발현하는 세포에 대해 T 세포 집단을 고갈시켜 고갈된 T 세포 집단을 제조하는 단계; 고갈된 T 세포 집단을 CD62L을 발현하는 세포에 대하여 강화시켜 중앙 기억 T 세포 집단을 제조하는 단계를 포함하는, 중앙 기억 T 세포 집단을 제조하는 방법으로서, 여기서, 상기 방법은 CD4를 발현하는 세포에 대하여 세포 집단을 고갈시키는 단계를 포함하지 않고, CD8+을 발현하는 세포에 대하여 세포 집단을 고갈시키는 단계를 포함하지 않는 것인, 중앙 기억 T 세포 집단을 제조하는 방법도 기술한다. 다양한 실시양태에서: 중앙 기억 T 세포 집단 중 적어도 50% (예컨대, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)의 세포는 CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-이고, 적어도 10%의 세포는 CD4+이고 적어도 10%의 세포는 CD4+이고; 중앙 기억 T 세포 집단 중 적어도 50% (예컨대, 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%)의 세포는 CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-이고, 적어도 15%의 세포는 CD4+이고, 적어도 15%의 세포는 CD4+이고; 중앙 기억 T 세포 집단 중 적어도 50%의 세포는 CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-이고, 적어도 20% (예컨대, 적어도 30%, 40% 또는 50%)의 세포는 CD4+이고, 적어도 20% (예컨대, 적어도 30%, 40% 또는 50%)의 세포는 CD4+이다. 본 방법은 (예컨대, 중앙 기억 T 세포 집단을 CD3 및/또는 CD28과 접촉시킴으로써) 중앙 기억 T 세포 집단을 자극시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고; 재조합 단백질을 발현하는 벡터를 세포에 형질도입시켜 유전적으로 변형된 중앙 기억 T 세포 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있고; 유전적으로 변형된 중앙 기억 T 세포 집단을 확장시키는 단계 (예컨대, 세포를 IL-2 및 IL-15 중 하나, 또는 그 둘 모두에 노출시킴으로써 유전적으로 변형된 중앙 기억 T 세포 집단을 확장시키는 단계)를 포함할 수 있다.
도 1은 명시된 바와 같이 IL13Rα2-특이적 인간 IL-13 변이체 (huIL-13(E13Y)), 인간 IgG4 Fc 스페이서 (huγ4Fc), 인간 CD4 막횡단 (huCD4 tm), 및 인간 CD3ζ 쇄 세포질 (huCD3ζ cyt) 부위로 구성된 IL13(E13Y)-제타카인 CAR (좌측)을 개략적으로 도시한 것이다. IL13(E13Y)-제타카인과 동일하되, 단, IgG4 스페이서의 CH2 도메인에 위치하는 2개의 점 돌연변이, L235E 및 N297Q (적색 표시), 및 공자극 4-1BB 세포질 도메인 (4-1BB cyt) 부가를 예외로 하는 IL13(EQ)BBζ CAR 또한 도시되어 있다.
도 2A-C는 특정 벡터 오픈 리딩 프레임이 도시되어 있다. A는 2,670개의 뉴클레오티드 IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t 구축물의 cDNA 오픈 리딩 프레임의 다이어그램으로서, 여기서, IL13(EQ)BBZ CAR의 IL13Rα2-특이적 리간드 IL13(E13Y), IgG4(EQ) Fc 힌지, CD4 막횡단, 4-1BB 세포질 신호전달, 3-글리신 링커, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인 뿐만 아니라, T2A 리보솜 스킵 및 말단절단된 CD19 서열이 제시되어 있다. IL13(EQ)BBζ CAR 및 CD19t의 표면 발현을 구동시키는 인간 GM-CSF 수용체 알파 및 CD19 신호 서열 또한 제시되어 있다. B는 숙주 게놈 내로 통합되는 긴 말단 반복부 ('R'로 표시) 측면에 위치하는 서열에 관한 다이어그램이다. C는 IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 플라스미드 지도이다.
도 3은 pHIV7의 구축을 도시한 것이다.
도 4는 pHIV7의 요소를 도시한 것이다.
도 5는 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM에 대한 제조 방식 계획안을 도시한 것이다.
도 6A-C는 표면 트랜스진 및 T 세포 마커 발현의 유세포 분석법 분석 결과를 도시한 것이다. IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1을 CD8+ CAR+ 및 CD4+ (즉, CD8 음성) CAR+ 세포를 검출하기 위해 항-IL13-PE 및 항-CD8-FITC로 (A), 또는 CD4+ CD19t+ 및 CD8+ (즉, CD4 음성) CAR+ 세포를 검출하기 위해 항-CD19-PE 및 항-CD4-FITC로 (B) 공동 염색시켰다. IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1은 플루오로크롬접합된 항-CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L 및 CD28 (회색 히스토그램) 또는 이소타입 대조군 (검은색 히스토그램)으로 염색하였다 (C). 모든 경우에서, 비율(%)은 생존가능한 림프구 (DAPI 음성) 염색된 상기 이소타입에 기초한 것이다.
도 7A-B는 IL13(EQ)BBZ+ TCM의 IL13Rα2-특이적 이펙터 기능의 시험관내 기능성 특징 규명을 도시한 것이다. IL13(EQ)BBZ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1을 CD19t 발현에 기초한 10:1 E:T 비를 사용하는 6시간 동안 51Cr 방출 검정법에서 이펙터로서 사용하였다. IL13Rα2-양성 종양 표적을 IL13Rα2를 발현하도록 K562 조작하였고 (K562-IL13Rα2), 원발성 신경교종 세포주 PBT030-2, 및 IL13Rα2-음성 종양 표적 대조군은 K562 모체 세포주였다 (A). IL13(EQ)BBZ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1을, IL13Rα2-양성 및 음성 표적과 함께 10:1 E:T 비로 밤새도록 공동 배양한 후, 항원-의존성 시토카인 생산에 대하여 평가하였다. 바이오-플렉스 프로 휴먼 시토카인 TH1/TH2 어세이(Bio-Plex Pro Human Cytokine TH1/TH2 Assay) 키트를 사용하여 시토카인 수준을 측정하였고, INF-γ가 기록됨 (B).
도 8A-C는 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM의 입양 전달 후, 확립된 신경교종 종양 이종이식편의 퇴행을 입증하는 연구 결과를 도시한 것이다. EGFP-ffLuc+ PBT030-2 종양 세포 (1x105)를 NSG 마우스의 우측 전뇌에 정위 방식으로 이식하였다. 5일째, 마우스는 2x106개의 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM (1.1x106개의 CAR+; n=6), 2x106개의 모의 TCM (CAR 없음; n=6) 또는 PBS (n=6)를 받았다. 제노젠 리빙 이미지(Xenogen Living Image)를 사용하여 상대적인 종양 부하량을 보여주는, 각 군으로부터의 대표 마우스 (A). ffLuc 플럭스 (광자/sec)의 정량화는 모의-형질도입된 TCM 및 PBS와 비교하여 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM이 종양 퇴행을 유도한다는 것 (#p<0.02, *p<0.001, 반복 측정 ANOVA)을 보여준다 (B). IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM으로 처리된 마우스에 경우, 생존율이 유의적으로 향상되었음을 입증하는 카플란 마이어(Kaplan Meier) 생존 곡선 (n=6/군) (p=0.0008; log-순위 검정) (C).
도 9A-C는 IL13(EQ)BBZ TCM 및 IL13-제타카인 CTL 클론의 항종양 효능을 비교한 연구 결과를 도시한 것이다. EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TS (1x105)를 NSG 마우스의 우측 전뇌에 정위 방식으로 이식하였다. 8일째, 마우스는 1.6x106개의 모의 TCM (CAR 없음), 1.0x106개의 CAR+ IL13(EQ)BBζ TCM (1.6x106개의 전체 T 세포; 63% CAR), 1.0x106개의 IL13-제타카인 CD8+ CTL cl. 2D7 (클로날 CAR+), 또는 비처리 중 하나를 받았다 (n=6/군). 제노젠 리빙 이미지를 사용하여 상대적인 종양 부하량을 보여주는, 각 군으로부터의 대표 마우스 (A). 시간 경과에 따른 ffLuc 플럭스 (광자/sec)의 자연 log의 선형 회귀선, p 값은 군 대 시간 상호작용 비교에 대한 것이다 (B). 카플란 마이어 생존 분석 (n=6/군)은 IL13-제타카인 CD8+ CTL cl. 2D7과 비교하였을 때, IL13(EQ)BBζ TCM으로 처리된 마우스의 경우, 생존율이 유의적으로 향상되었다는 것을 입증한다 (p=0.02; log-순위 검정) (C).
도 10A-C는 IL13(EQ)BBζ TCM 및 IL13-제타카인 CTL 클론의 항종양 효능을 비교한 연구 결과를 도시한 것이다. EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TS (1x105)를 NSG 마우스의 우측 전뇌에 정위 방식으로 이식하였다. 8일째, 마우스는 1.3x106개의 모의 TCM (CAR 없음; n=6), 1.0, 0.3 또는 0.1x106개의 CAR+ IL13(EQ)BBζ TCM (78% CAR+; n=6-7), 1.0, 0.3 또는 0.1x106개의 IL13-제타카인 CD8+ CTL cl. 2D7 (클로날 CAR+; n=6-7), 또는 비처리 (n=5)를 받았다. 상대적인 종양 부하량을 보여주는, 각 군으로부터의 대표 마우스의 제노젠 영상화 (A). ffLuc 플럭스 (광자/sec)의 자연 log의 선형 회귀선은 제1 세대 IL13-제타카인 CTL cl. 2D7, 모의 TCM 및 종양 단독인 것과 비교하였을 때, IL13(EQ)BBζ TCM이 우수한 종양 퇴행을 달성한다는 것을 보여준다 (B). 0.1x106개의 IL13(EQ)BBζ TCM 용량이 1.0x106개 용량의 IL13-제타카인 CD8+ CTL cl. 2D7보다 10배 더 높은 정도로 능가한다는 것 (p = 0.043; 웰치(Welch) 두 샘플 t 검정)을 입증하는 종양 주사 후 27일째 각 군당 평균 플럭스 (C).
도 11은 IL13-제타카인 CTL 클론과 비교하였을 때, IL13(EQ)BBζ Tcm이 개선된 지속 효과를 보인다는 것을 입증하는 연구의 결과를 도시한 것이다. T 세포 주입 후 7일째 종양 부위에서 T 세포 지속을 평가하는 CD3 면역조직화학법. IL13(EQ)BBζ Tcm에 대하여 상당수의 T 세포가 검출된다 (상단 패널). 그에 반해, 생존가능한 CD3+ IL13-제타카인 T 세포는 거의 검출되지 않는다 (하단 패널).
도 12A-D는 확립된 큰 종양에 대한 CAR+ T 세포 전달 경로 (i.c. 대 i.v.)를 비교하는 실험의 결과를 도시한 것이다. EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TS (1x105)를 NSG 마우스의 우측 전뇌에 이식하였다. 19 및 26일째, 마우스는 5x106 CAR+ IL13(EQ)BBζ+ Tcm (11.8x106개의 전체 세포; n=4), 또는 모의 Tcm (11.8x106개의 세포; n=4) 중 하나를 꼬리 정맥을 통해 i.v. 주사를 맞았다. 대안적으로, 19, 22, 26 및 29일째, 마우스는 1x106개의 CAR+ IL13(EQ)BBζ+ Tcm (2.4x106개의 전체 세포; n=4), 또는 모의 Tcm (2.4x106개의 세포; n=5) 중 하나를 i.c. 주사를 맞았다. 시간 경과에 따른 평균 ffLuc 플럭스 (광자/sec)는 i.c. 전달된 IL13(EQ)BBζ Tcm이 19일된 종양의 종양 퇴행을 매개한다는 것을 보여준다. 그에 반해, i.v. 전달된 T 세포에서는 비처리 대조군 또는 모의 Tcm 대조군과 비교하였을 때, 종양 부하량 감소가 나타나지 않았다 (A). 카플란 마이어 생존 곡선은, i.v. 투여된 CAR+ Tcm으로 처리된 마우스와 비교하였을 때, i.c. IL13(EQ)BBZ Tcm으로 처리된 마우스의 경우, 생존율이 향상되었음을 입증한다 (p = 0.0003 log 순위 검정) (B). IL13(EQ)BBZ+ Tcm으로 i.v. (C) 대 i.c. (D)로 처리된 마우스의 대표적인 H&E 및 CD3 IHC. CD3+ T 세포는 오직 i.c. 처리군에서만 검출되었고, i.v. 처리된 마우스의 경우, 종양에서, 또는 주변 뇌 실질에서는 어떤 CD3+ 세포도 검출되지 않았다.
도 13A-B는 종양내 (i.c.t.) 또는 뇌실내 (i.c.v.) 중 하나로 두개내로 주사된 CAR+ T 세포가 반대쪽 반구 상의 종양으로 이동할 수 있다는 것을 보여주는 연구의 결과를 도시한 것이다. EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TS (1x105)를 NSG 마우스의 우측 및 좌측 전뇌에 정위 방식으로 이식하였다. 6일째, 마우스는 1.0x106개의 IL13(EQ)BBζ+ Tcm (1.6x106개의 전체 세포; 63% CAR; n=4)을 우측 종양 부위에 i.c.로 주사를 맞았다. 다초점 신경교종 실험 모델의 개략도 (A). T 세포가 우측 및 좌측 종양 부위, 둘 모두의 부위로 침윤된다는 것을 보여주는 CD3 IHC (B).
도 14는 IL13(EQ)BBζ/CD19t+의 아미노산 서열 (서열식별번호: 10)을 도시한 것이다.
도 15는 IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (서열식별번호: 12) 및 CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (서열식별번호: 13)의 서열 비교를 도시한 것이다.
CD4+ 세포 및 CD8+ 세포를 포함하는 TCM 세포 집단 ("TCM CD4+/CD8+" 세포 집단)은 하기 기술한다. TCM CD4+/CD8+ 세포 집단의 세포는 항-CD3/CD28로 활성화될 수 있고, 예를 들어, CAR의 발현을 지시하는 SIN 렌티바이러스 벡터로 형질도입되어 유전적으로 변형된 세포를 생성할 수 있다. 활성화된/유전적으로 변형된 세포는 시험관내에서 IL-2/IL-15와 함께 확장될 수 있고, 이어서, 사용되거나, 또는 동결보존되고, 추후 사용될 수 있다. IL13Rα2로 표적화되는 CAR를 발현하는 TCM CD4+/CD8+ 세포 집단의 용도에 관한 예를 기술한다.
하기 실시예에서 사용되는 CAR은 IL13(EQ)BBζ로 지칭된다. 상기 CAR은 IL13α2에 결합하는 특이성을 개선시키는 아미노산 변이를 가지는 IL13α2 리간드; 유익한 공자극을 제공하는, CD3ζ과 연속하여 존재하는 CD137 (4-1BB)의 도메인; 및 Fc 수용체 (FcR)에 의한 결합을 감소시키는 방식으로 CH2 영역 내의 2개 부위에서 돌연변이화된 (L235E; N297Q) IgG4 Fc 영역을 비롯한, 다양한 중요한 특징을 포함한다. 상기 CAR 및 다른 것은 CAR 오픈 리딩 프레임 다음으로 T2A 리보솜 스킵 서열 및 (아미노산 323에서 말단절단된) 세포질 신호전달 테일이 없는 것인 말단절단된 CD19 (CD19t)가 이어지는 벡터를 사용하여 제조될 수 있다. 상기 배열로 CD19t의 공동 발현은, 유전자 변형된 세포를 정확하게 측정할 수 있게 하고, 유전자 변형된 세포의 양성 선별 뿐만 아니라, 입양 전달 후 생체내에서 치료학적 T 세포의 효율적인 세포 추적 및/또는 영상화를 가능하게 하는, 불활성, 비-면역원성 표면 마커를 제공한다. CD19t의 공동 발현은, 임상적으로 이용가능한 항체 및/또는 면역독소 시약을 사용하여 치료학적 세포를 선택적으로 제거하고, 이로써, 자살 스위치로서 작용하면서, 생체내에서 형질도입된 세포의 면역학적 표적화를 위한 마커를 제공한다.
신경교종은 IL13 수용체, 및 특히, 고친화성 IL13 수용체를 발현한다. 그러나, IL13 수용체와 달리, 신경교종 세포는 IL4Rβ 또는 γc44를 필요로 하는 요건과 관계없이, IL13에 결합할 수 있는 독특한 IL13Rα2 쇄를 과다발현한다. 그의 호몰로그인 IL4와 같이, IL13은 CNS 밖에서 다면발현성 면역조절성 활성을 가진다. IL13 및 IL4, 둘 모두 B 림프구에 의한 IgE 생산을 자극하고, 대식세포에 의한 염증유발성 시토카인 생산을 억제시킨다.
방사성 표지된 IL13을 이용하는 자가방사선술을 사용하여 수행된 상세한 연구를 통해 연구된 거의 모든 악성 신경교종 조직 상에 IL13이 풍부하게 결합하는 것이 입증되었다. 이러한 결합은 종양 절편 내에서 및 단일 세포 분석에서 고도한 균질성을 띤다. 그러나, IL13Rα2 mRNA에 특이적인 분자 프로브 분석에서는 정상적인 뇌 요소에 의한 신경교종-특이적 수용체 발현을 검출하지 못했고, 방사성 표지된 IL13을 이용하는 자가방사선술에서도 또한 정상 CNS에서 특이적 IL13 결합을 검출할 수 없었다. 이러한 연구는 공유 IL13Rα1/IL4β/γc 수용체는 정상 CNS에서는 검출가능하게 발현되지 않는다는 것을 제안한다. 그러므로, IL13Rα2는 신경교종에 대해 매우 특이적인 세포-표면 표적이며, 신경교종 치료를 위해 디자인된 CAR에 대하여 적합한 표적이 된다.
그러나, IL13-기반 치료학적 분자의 광범위하게 발현되는 IL13Rα1/IL4β/γc 수용체 복합체에의 결합은 CNS 밖의 정상 조직에 원치않는 독성을 매개할 수 있는 잠재성을 가지며, 따라서, 상기 작용제의 전신 투여를 제한한다. IL13 알파 나선 A 중의 천연 글루탐산에 대한 아미노산 13의 티로신의 아미노산 치환은 IL13의 IL13Rα1/IL4β/γc 수용체에의 친화도를 선택적으로 감소시킨다. 그러나, (IL13(E13Y)로 명명되는) 상기 돌연변이체의 IL13Rα2에의 결합은 야생형 IL13과 비교하였을 때, 증가되었다. 따라서, 이러한 최소로 변경된 IL13 유사체는 신경교종 세포에 대한 IL13의 특이성 및 친화성을 동시에 증가시킨다. 그러므로, 본원에 기술된 CAR은 (문헌 [Debinski et al. 1999 Clin Cancer Res 5:3143s]의 넘버링에 따라) 아미노산 13에 돌연변이 (E → Y, 또는 E → 일부 다른 아미노산, 예컨대, K 또는 R 또는 L 또는 V)를 함유하는 IL13을 포함한다. 그러나, 천연 서열을 가지는 IL13 또한 사용될 수 있고, 변형된 T 세포를 예컨대, 종양괴 내로 직접 주사하여 국소적으로 투여하고자 하는 상황에서는 특히 유용할 수 있다.
본원에 기술된 CAR은, 비록 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조하는 것이 바람직하기는 하지만, 관련 기술분야에 공지된 임의 수단에 의해 제조될 수 있다. 키메라 수용체의 여러 영역을 코딩하는 핵산은 편리한 바, 관련 기술분야에 공지된 표준 분자 클로닝 기술 (게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머 지원 라이게이션, 부위 지정 돌연변이유발법 등)에 의해 제조하고, 완전한 코딩 서열로 어셈블리될 수 있다. 바람직하게는 생성된 코딩 영역을 발현 벡터 내로 삽입하고, 이를 사용하여 적합한 발현 숙주 세포주, 바람직하게, T 림프구 세포주, 및 가장 바람직하게, 자가 T 림프구 세포주를 형질전환시킨다.
실시예 1: IL13Rα2 -특이적 CAR의 구축 및 구조
유용한 IL13Rα2-특이적 CAR의 구조는 하기에서 기술한다. 코돈 최적화된 CAR 서열은 IL13Rα1에의 잠재적인 결합을 감소시키기 위해 단일 부위에서 돌연변이화된 (E13Y) 막-테더링된 IL-13 리간드, Fc 수용체-매개 인식 모델을 크게 감소시키는 2개의 돌연변이 (L235E; N297Q)를 함유하는 IgG4 Fc 스페이서, CD4 막횡단 도메인, 공자극 4-1BB 세포질 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 함유한다. T2A 리보솜 스킵 서열은 상기 IL13(EQ)BBζ CAR 서열을, 불활성, 비-면역원성 세포 표면 검출/선별 마커인 CD19t로부터 분리시킨다. 이러한 T2A 연결을 통해 단일 전사체로부터 IL13(EQ)BBζ 및 CD19t, 둘 모두의 동조 발현이 이루어진다. 도 1A는 IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t 구축물을 코딩하는 2,670개의 뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임의 개략적 도면이다. 본 도면에는 IL13(EQ)BBZ CAR의 IL13Rα2-특이적 리간드 IL13(E13Y), IgG4(EQ) Fc, CD4 막횡단, 4-1BB 세포질 신호전달, 3-글리신 링커, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인 뿐만 아니라, T2A 리보솜 스킵 및 말단절단된 CD19 서열 모두 제시되어 있다. IL13(EQ)BBZ CAR 및 CD19t의 표면 발현을 구동시키는 인간 GM-CSF 수용체 알파 및 CD19 신호 서열 또한 제시되어 있다. 따라서, IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t 구축물은 IL13Rα2-특이적, 힌지-최적화된, 공자극 키메라 면역수용체 서열 (IL13(EQ)BBZ로 명명), 리보솜-스킵 T2A 서열, 및 CD19t 서열을 포함한다.
인간 GM-CSF 수용체 알파 리더 펩티드를 IL13(E13Y) 리간드 5 L235E/N297Q-변형된 IgG4 Fc 힌지 (여기서, 이중 돌연변이가 FcR 인식을 간섭한다), CD4 막횡단, 4-1BB 세포질 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인 서열과 융합함으로써 IL13(EQ)BBZ 서열을 생성하였다. 코돈 최적화 후에 서열을 새로 합성하였다. T2A 함유 플라스미드를 분해하여 T2A 서열을 수득하였다. CD19t 서열은 CD19 함유 플라스미드의 리더 펩티드 서열에서부터 막횡단 성분 (즉, 염기쌍 1-972)까지에 이르는 것으로부터 수득하였다. 3개의 단편, 1) IL13(EQ)BBZ, 2) T2A, 및 3) CD19t를 모두 epHIV7 렌티바이러스 벡터의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝하였다. 적절한 세포 형질감염되었을 때, 벡터는 도 1B에 개략적으로 도시된 서열을 숙주 세포 게놈 내로 통합한다. 도 1C는 9,515 염기쌍의 IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 플라스미드 그 자체의 개략적 도면을 제공한다.
도 2에 개략적으로 제시된 바와 같이, IL13(EQ)BBZ CAR은 여러 중요한 측면에서 IL13(E13Y)-제타카인으로 지칭되는 앞서 기술된 IL13Rα2-특이적 CAR과 차이가 난다 (Brown et al. 2012 Clinical Cancer Research 18:2199). IL13(E13Y)-제타카인은 명시된 바와 같이, IL13Rα2-특이적 인간 IL-13 뮤테인 (huIL-13(E13Y)), 인간 IgG4 Fc 스페이서 (huγ4Fc), 인간 CD4 막횡단 (huCD4 tm), 및 인간 CD3ζ 쇄 세포질 (huCD3ζ cyt) 부위로 구성된다. 그에 반해, IL13(EQ)BBζ)는 IgG4 스페이서의 CH2 도메인, 및 공자극 4-1BB 세포질 도메인 (4-1BB cyt)에 위치하는 2개의 점 돌연변이, L235E 및 N297Q를 가진다.
실시예 2: IL13Rα2 -특이적 CAR의 발현에 사용되는 epHIV7의 구축 및 구조
pHIV7 플라스미드는 시티 오브 호프(City of Hope: COH)의 T 셀 쎄라퓨틱스 리서치 라보라토리(T cell Therapeutics Research Laboratory: TCTRL)에서의 임상 벡터 IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7의 유래 기점이 된 모체 플라스미드이다. CAR의 발현을 위해 사용된 epHIV7 벡터는 pHIV7 벡터로부터 제조되었다. 중요하게는, 상기 벡터는 CAR의 발현을 구동시키기 위해 인간 EF1 프로모터를 사용한다. 상기 벡터의 5' 및 3' 서열, 둘 모두 앞서 HXBc2 프로바이러스로부터 유래된 pv653RSN으로부터 유래되었다. 폴리퓨린 트랙 DNA 플랩 서열 (cPPT)은 NIH AIDS 검체 보관소(NIH AIDS Reagent Repository)로부터의 HIV-1 균주 pNL4-3로부터 유래되었다. 우드 전사 후 조절 요소 (WPRE) 서열는 앞서 기술되었다.
pHIV7의 구축은 도 3에 개략적으로 도시되어 있다. 간략하면, 개재 SL3-네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자 (Neo)와 함께 gag-pol + 5' 및 3' 긴 말단 반복부 (LTR)로부터 653 bp를 함유하는 pv653RSN을 하기와 같이 p블루스크립트(pBluescript)로 서브클로닝하였다: 1 단계에서, 5' LTR부터 rev-반응성 요소 (RRE)까지의 서열이 p5'HIV-1 51을 제조하였고, 이어서, TATA 박스의 상류쪽 서열을 제거함으로써 5' LTR을 변형시키고, 먼저 CMV 인핸서에, 및 이어서, SV40 복제 기점에 라이게이션시켰다 (p5'HIV-2). 2 단계에서, 3' LTR을 p블루스크립트로 서브클로닝하여 p3'HIV-1을 제조한 후, 3' LTR 인핸서/프로모터에 400-bp를 결실시켜 HIV U3에서 시스-조절 요소를 제거하고, p3'HIV-2를 형성하였다. 3 단계에서, p5'HIV-3 및 p3'HIV-2로부터 단리된 단편을 라이게이션시켜 pHIV-3을 제조하였다. 4 단계에서, 추가의 상류 HIV 서열을 제거하여 p3'HIV-2를 추가로 변형시킴으로써 p3'HIV-3을 생성하고, WPRE를 함유하는 600-bp BamHI-SalI 단편을 p3'HIV-3에 부가하여 p3'HIV-4를 제조하였다. 5 단계에서, PCR에 의해 pHIV-3 RRE 크기를 축소시키고, pHIV-3으로부터의 5' 단편에 (제시되지 않음) 및 p3'HIV-4에 라이게이션시켜 pHIV-6을 제조하였다. 6 단계에서, HIV-1 pNL4-3 (55)으로부터의 cPPT DNA 플랩 서열을 함유하는 190-bp BglII-BamHI 단편을 pNL4-3으로부터 증폭시키고, pHIV6 중의 RRE와 WPRE 서열 사이에 배치하여 pHIV-7을 제조하였다. 상기 모체 플라스미드 pHIV7-GFP (GFP, 녹색 형광 단백질)를 사용함으로써 4-플라스미드 시스템을 이용하여 모체 벡터를 패키징하였다.
패키징 신호인 psi ψ는 바이러스 게놈을 벡터 내로 효율적으로 패키징하는 데 요구된다. RRE 및 WPRE는 RNA 전사체 수송 및 트랜스진 발현을 증진시킨다. WPRE와 조합하여 플랩 서열은 포유동물 세포에서 렌티바이러스 벡터의 형질도입률을 증진시키는 것으로 입증되었다.
바이러스 벡터 제조에 필요한 헬퍼 기능은 재조합을 통해 복제 가능 렌티바이러스의 생성 가능성을 감소시키기 위해 별개의 3가지 플라스미드로 나뉜다: 1) pCgp는 바이러스 벡터 어셈블리에 필요한 gag/pol 단백질을 코딩하고; 2) pCMV-Rev2는 효율적인 패키징 목적으로 바이러스 게놈의 수송을 지원하기 위하여 RRE 서열에 작용하는 것인 Rev 단백질을 코딩하고; 3) pCMV-G는 바이러스 벡터의 감염력에 필요한 것인 베시쿨로 구내염 바이러스 (VSV)의 당단백질을 코딩한다.
pHIV7 코딩된 벡터 게놈과 헬퍼 플라스미드 사이에는 최소의 DNA 서열 상동성이 존재한다. 상동성인 영역으로는 pCgp 헬퍼 플라스미드의 gag/pol 서열에 위치하는, 대략 600개 정도의 뉴클레오티드로 이루어진 패키징 신호 영역; 3가지 헬퍼 플라스미드 모두에 있는 CMV 프로모터 서열; 및 헬퍼 플라스미드 pCgp 중의 RRE 서열을 포함한다. 상기 영역에서의 상동성에 기인하여 복제 가능 재조합 바이러스가 생성될 수 있는 개연성은 매우 낮은데, 그 이유는 이는 다중 재조합 이벤트를 필요로 하기 때문이다. 추가로, 임의의 재조합 재조합체는 렌티바이러스 복제에 필요한 tat 서열 및 기능성 LTR 누락 상태일 것이다.
CMV 프로모터는 EF1α-HTLV 프로모터 (EF1p)로 대체하였고, 신규 플라스미드를 epHIV7로 명명하였다 (도 4). EF1p는 563 bp를 가지고, CMV 프로모터를 자른 후, NruI 및 NheI를 사용하여 epHIV7 내로 도입하였다.
야생형 바이러스의 병원성에 필요하고, 표적 세포의 증식성 감염에 요구되는 gag/pol 및 rev를 제외한, 렌티바이러스 게놈을 본 시스템으로부터 제거하였다. 추가로, IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7 벡터 구축물은 무손상 3'LTR 프로모터를 함유하지 않고, 이에, 표적화된 세포에서 생성된 발현된 및 역전사된 DNA 프로바이러스 게놈은 불활성 LTR을 가지게 될 것이다. 상기 디자인 결과로서, HIV-I 유래 서열 중 어느 것도 프로바이러스로부터 전사되지 않을 것이며, 오직 치료학적 서열만이 그의 각 프로모터로부터 발현될 것이다. SIN 벡터에서의 LTR 프로모터 활성 제거가 숙주 유전자의 비의도성 활성화 가능성을 유의적으로 감소시킬 것으로 예상된다 (56). 하기 표 4에는 IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7에 존재하는 각종 조절인자 요소가 요약되어 있다.
<표 4>
실시예 3: 환자 T 세포의 형질도입을 위한 벡터 제조
각 플라스미드 (IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7; pCgp; pCMV-G; 및 pCMV-Rev2)를 위해, 충분한 양의 플라스미드 DNA를 제조하기 위해 발효조에 접종하는 데 사용되는 시드 뱅크를 생성한다. 플라스미드 DNA를, 렌티바이러스 벡터를 제조하는 데 그를 사용하기 이전에 아이덴티티, 멸균성 및 내독소에 대하여 시험한다.
간략하면, 시험을 통해 멸균성 및 바이러스 오염 부재에 대하여 확인이 된 293T 작업용 세포 (WCB)로부터 세포를 확장시켰다. 293T WCB로부터의 293T 세포의 바이알을 해동시켰다. 충분한 개수의 세포가 존재할 때까지 세포를 성장시키고, 확장시켜 벡터 제조 및 세포 훈련 유지를 위해 적절한 개수의 10층 세포 공장 (CF)을 플레이팅하였다. 제조에는 세포의 단일 훈련이 사용될 수 있다.
렌티바이러스 벡터를 최대 10 CF의 서브배치에서 제조하였다. 2개의 서브배치를 같은 주에 제조하여 대략 20 L의 렌티바이러스 상청액/주로 제조할 수 있다. 한 로트의 생성물을 제조하기 위해 하류 프로세싱 기간 동안 모든 서브배치로부터 제조된 물질을 풀링하였다. 293T 세포를 293T 배지 (10% FBS를 포함하는 DMEM) 중 CF에서 플레이팅하였다. 공장을 37℃ 인큐베이터에 배치하고, CF의 모든 층 상에 있는 세포가 고르게 분포될 수 있도록 하기 위해 수평으로 평평하게 만들었다. 2일 경과 후, 트리스(Tris):EDTA, 2 M CaCl2, 2X HBS, 및 4개의 DNA 플라스미드의 혼합물을 포함하는 CaPO4 방법을 사용하여 상기 기술된 4개의 렌티바이러스 플라스미드로 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 3일째, 분비된 렌티바이러스 벡터를 함유하는 상청액을 수집하고, 정제시키고, 농축시켰다. CF로부터 상청액을 제거한 후, 각 CF로부터 생산 종료 세포를 수집하였다. 세포를 각 공장으로부터 트립신 처리하고, 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 냉동 배지 중에 재현탁시키고, 동결보존하였다. 상기 세포를 추후에 복제 가능 렌티바이러스 (RCL) 검사에 사용하였다.
벡터를 정제하고, 제제화하기 위해, 막 여과에 의해 조 상청액을 정화시켜 세포 파편을 제거하였다. 숙주 세포 DNA 및 잔류 플라스미드 DNA를 엔도뉴클레아제 분해 (벤조나제(Benzonase)®)에 의해 분해하였다. 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 세포 파편으로부터 바이러스 상청액을 정화시켰다. 안에 벤조나제®가 첨가되어 있는 (최종 농도 50 U/mL) 미리 측량되어 있는 용기 내로 정화된 상청액을 수집하였다. 잔류 플라스미드 DNA 및 숙주 게놈 DNA에 대한 엔도뉴클레아제 분해를 37℃에서 6 h 동안 수행하였다. 엔도뉴클레아제로 처리된 상청액의 초기 접선 유동 한외여과 (TFF) 농축을 사용하여 조 상청액으로부터 잔류 저분자량 성분을 제거하면서, 동시에 바이러스를 ~20배로 농축시켰다. 정화된 엔도뉴클레아제로 처리된 바이러스 상청액을, 동시에 플럭스 속도를 최대화시키면서, ~4,000 sec-1 이하의 전단 속도를 유지시키도록 디자인된 유량으로 500 kD NMWCO와 함께 중공사 카트리지를 통해 순환시켰다. 카트리지 성능을 유지시키기 위해 농축시키는 동안 뉴클레아제로 처리된 상청액의 투석 여과를 개시하였다. 투석 여과 완충제로서 PBS 중 4% 락토스를 사용하여 80%의 투과물 교체율을 확립하였다. 바이러스 상청액을, 조 상청액의 20배 농도를 나타내는 표적 부피로 만들었고, 4회 추가의 교환 부피를 위해 투석 여과를 계속 수행하였고, 여기서, 투과물 교체율은 100%가 되었다.
고속 원심분리 기술을 사용하여 바이러스 생성물을 추가로 농축시켰다. 6℃에서 16-20 h 동안 6,000 RPM (6,088 RCF)으로 소르발(Sorvall) RC-26 + 원심분리기를 사용하여 렌티바이러스의 각 서브배치를 펠릿화하였다. 이어서, 각 서브배치로부터의 바이러스 펠릿을 PBS 중 4% 락토스와 함께 50 mL 부피로 재구성하였다. 상기 완충제 중 재구성된 펠릿은 바이러스 제조를 위한 최종 제제를 나타낸다. 전체 벡터 농축 프로세스를 통해 부피가 대략 200배 감소되었다. 모든 서브배치의 완료 후, 이어서, 물질을 -80℃에 놓고, 동시에 각 서브배치로부터의 샘플을 멸균성에 대하여 시험하였다. 샘플 멸균성을 확인한 후, 빈번하게 교반시키면서, 서브배치를 37℃에서 신속하게 해동시켰다. 이어서, 물질을 풀링하고, 바이러스 벡터 스위트 중의 클래스 II 타입(Class II Type) A/B3 생물안전 작업대에서 수동으로 분취하였다. O-링 냉동바이알이 외부 장착된, 멸균 USP 부류 6 중 1 mL의 농축된 렌티바이러스의 필 컨피규레이션이 사용되었다. COH의 응용 기술 개발 센터(Center for Applied Technology Development: CATD)의 품질 관리 시스템(Quality Systems: QS)은 CBG를 위한 정책 및 표준 운영 절차(Policies and Standard Operating Procedures for the CBG)에 따라, 및 현행 우수 제조 관리 기준(current Good Manufacturing Practices: cGMPs)을 준수하여 모든 물질을 출시하였다.
렌티바이러스 벡터 제제의 순도를 확인하기 위해, 잔류 숙주 DNA 오염물질, 및 잔류 숙주 및 플라스미드 DNA의 전달에 대해 시험하였다. 다른 시험들 중에서도, RT-PCR에 의해 벡터 아이덴티티를 평가하여 올바른 벡터가 존재하는지 확인하였다. 본 연구에서 사용하기 위한 것으로 의도된 벡터는 모든 출시 기준을 충족시켰다.
실시예 4: ACT에서 사용하는 데 적합한 T CM CD4+/CD8+ 세포 집단 제조
TCM CD4+/CD8+ 세포 집단을 제조하는 전략법에 관한 개요는 도 8 (IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM 제조에 관한 개요)에 도시되어 있다. 구체적으로, 동의한 연구 참가자로부터 수득된 성분채집 생성물을 피콜링하고, 세척하고, 밤새도록 인큐베이션시킨다. 이어서, GMP 등급 항-CD14, 항-CD25 및 항-CD45RA 시약 (밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotec)) 및 클리니MACS™ 분리 장치를 사용하여 세포에서 단핵구, 조절성 T 세포 및 나이브 T 세포 집단을 고갈시킨다. 고갈시킨 후, 클리니MACS™ 분리 장치 상에서 DREG56-비오틴 (COH 임상 등급) 및 항-비오틴 마이크로비드 (밀테니 바이오테크)를 사용하여 CD62L+ TCM 세포에 대해 음성 분획 세포를 강화시킨다. 상기 세포를 CD4+ 세포에 대해서 또는 CD8+ 세포에 대해서는 고갈시키지 않는다.
강화시킨 후, TCM CD4+/CD8+ 세포를 완전 X-비보15(X-Vivo15) + 50 IU/mL IL-2 및 0.5 ng/mL IL-15 중에서 제제화하고, 테플론(Teflon) 세포 배양 백으로 옮겨 놓고, 여기서, 세포는 다이날 클린EX™ 비보(Dynal ClinEx™ Vivo) CD3/CD28 비드로 자극을 받게 된다. 자극 후 최대 5일 경과 후, CAR을 발현하는 원하는 벡터 (예컨대, IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7 렌티바이러스 벡터)를 사용하여, 예를 들어, 1.0 내지 0.3의 다중 감염도 (MOI)로 세포에 형질도입시킨다. 세포 확장을 위해 필요에 따라 완전 X-비보15 및 IL-2 및 IL-15 시토카인을 첨가하면서, 최대 42일 동안 배양을 유지시킨다 (세포 밀도를 3x105 내지 2x106개의 생존가능한 세포/mL로 유지, 및 배양하는 동안 매주 월요일, 수요일, 및 금요일마다 시토카인 보충). 세포는 전형적으로 21일 이내에 상기 조건하에서 대략 109개의 세포로 확장된다. 배양기 종료 시점에 세포를 수거하고, 2회에 걸쳐 세척하고, 임상 등급의 동결보존 배지 (크라이오스토어(Cryostore) CS5, 바이오라이프 솔루션즈(BioLife Solutions)) 중에서 제제화한다.
T 세포 주입 당일(들), 동결보존되고, 출시된 생성물을 재주입을 위해 해동시키고, 세척하고, 제제화한다. 출시된 세포 생성물을 함유하는 동결보존된 바이알을 액체 질소 보관으로부터 제거하고, 해동시키고, 냉동시키고, PBS/2% 인간 혈청 알부민 (HSA) 세척 완충제로 세척한다. 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 세포를 냉동제 무함유 생리 식염수 (PFNS)/2% HSA 주입 희석제 중에 재현탁시킨다. 샘플을 품질 관리 검사를 위해 제거한다.
상기 기술된 제조 플랫폼을 사용하여 건강한 기증자로부터 입수된 세포에 대한 2회에 걸쳐 품질 적격성 작업을 수행하였다. 각 전임상 품질 적격성 실행 생성물에 인간 기증자 (HD) 번호 - HD006.5 및 HD187.1을 부여하였다. 중요하게는, 하기 표 5에 제시된 바와 같이, 상기 품질 적격성 작업을 통해 28일 이내에 >80배로 확장되었고, 확장된 세포는 IL13(EQ)BBγ/CD19t 트랜스진을 발현하였다.
<표 5>
전임상 품질 적격성 작업 생성물로부터 얻은 발현 데이터에 관한 요약
Figure 112017036486829-pct00002
실시예 5: IL13(EQ)BBγ/CD19t+T CM 에서의 표면 트랜스진 및 T 세포 마커 발현에 관한 유세포 분석법 분석
실시예 4에 기술된 2개의 전임상 품질 적격성 작업 생성물을 하기 기술하는 바와 같이 전임상 연구에서 사용하였다. 도 6A-C는 표면 트랜스진 및 T 세포 마커 발현의 유세포 분석법 분석의 결과를 도시하는 것이다. IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1을 CD8+ CAR+ 및 CD4+ (즉, CD8 음성) CAR+ 세포를 검출하기 위해 항-IL13-PE 및 항-CD8-FITC로 (도 6A), 또는 CD4+ CD19t+ 및 CD8+ (즉, CD4 음성) CAR+ 세포를 검출하기 위해 항-CD19-PE 및 항-CD4-FITC로 (도 6B) 공동 염색시켰다. IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1은 플루오로크롬-접합된 항-CD3, TCR, CD4, CD8, CD62L 및 CD28 (회색 히스토그램) 또는 이소타입 대조군 (검은색 히스토그램)으로 염색하였다 (도 6C). 도 6A-C 각각에서, 명시된 비율(%)은 생존가능한 림프구 (DAPI 음성) 염색된 상기 이소타입에 기초한 것이다.
실시예 6: IL13(EQ)BBγ / CD19t + T CM 의 이펙터 활성
IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM의 이펙터 활성을 사정하였고, 본 분석 결과는 도 7A-B에 도시되어 있다. 간략하면, IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5 및 HD187.1을 CD19t 발현에 기초한 10E:1T 비를 사용하는 6시간 동안 51Cr-방출 검정법에서 이펙터로서 사용하였다. IL13Rα2-양성 종양 표적을 IL13Rα2를 발현하도록 K562 조작하였고 (K562-IL13Rα2), 원발성 신경교종 세포주 PBT030-2, 및 IL13Rα2-음성 종양 표적 대조군은 K562 모체 세포주였다 (도 7A). IL13(EQ)BBγ/CD19t+ HD006.5 및 HD187.1을, 상기 기술된 바와 같이, 동일한 IL13Rα2-양성 및 음성 표적과 함께 10E:1T 비로 밤새도록 공동 배양한 후, 항원-의존성 시토카인 생산에 대하여 평가하였다. 바이오-플렉스 프로 휴먼 시토카인 TH1/TH2 어세이 키트를 사용하여 시토카인 수준을 측정하였고, INF-γ 수준이 도시되어 있다 (도 7B).
실시예 7: IL13(EQ)BBγ / CD19t + T CM 의 생체내 항종양 활성
하기 기술하는 연구는 IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM이 생체내 마우스 모델에서 항종양 효능을 보인다는 것을 입증한다. 구체적으로, 본 발명자들은, EGFP 및 반딧불이 루시페라제 (ffLuc) 리포터 유전자, 둘 모두를 발현하도록 조작된 것 (PBT030-2 EGFP:ffLuc)인, IL13Rα2+ 원발성 저-계대수의 교모세포종 종양 구체 세포주 PBT030-2에 대한 IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM의 항종양 효능을 평가하였다 ( 6 ). 교모세포종 환자 표본으로부터의 1차 세포주 패널 (PBT)은 무혈청 배지 중에서 종양 구체 (TS)로서 성장하였다. 상기 확장된 TS 세포주는, 줄기 세포 마커 발현, 다계대 분화 및 면역손상된 마우스 (NSG)에서 낮은 세포 개수로 동소 종양을 개시할 수 있는 능력을 비롯한, 줄기 세포 유사 특징을 보인다. PBT030-2 EGFP:ffLuc TS-개시된 이종이식편 모델 (0.1x106개의 세포; 5일 생착)은 앞서 NSG 마우스에서 T 세포를 발현하는 IL13Rα2-특이적 CAR의 생체내 항종양 활성을 평가하는 데 사용되어 왔으며, 이로써, 2주 동안에 걸친 2x106개의 세포용해성 T 림프구 (CTL)의 3회 주사가 종양 성장을 감소시킨 것으로 나타났다. 그러나, 본 실험에서, 대다수의 PBT030-2 종양은 결국 재발하였다. 그에 비해, IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM (1.1x106개의 CAR+ TCM; 2x106개의 총 TCM)의 1회 주사는 도 8A-C에 제시된 바와 같이, PBT030-2 EGFP:ffLuc TS-개시된 종양 (0.1x106개의 세포; 5일 생착)에 대하여 강건한 항종양 활성을 보였다. PBS 또는 모의 형질도입된 TCM (CAR 없음)으로 처리된 NSG 마우스와 비교하였을 때, IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM은 ffLuc 플럭스를 유의적으로 감소시켰고 (>18일째 p < 0.001), 생존율을 유의적으로 향상시켰다 (p = 0.0008).
간략하면, EGFP-ffLuc+ PBT030-2 종양 세포 (1x105)를 NSG 마우스의 우측 전뇌에 정위 방식으로 이식하였다. 5일째, 마우스는 2x106개의 IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM (1.1x106개의 CAR+; n=6), 2x106개의 모의 TCM (CAR 없음; n=6) 또는 PBS (n=6)를 받았다. 도 8A는 제노젠 리빙 이미지를 사용하여 상대적인 종양 부하량을 보여주는, 각 군으로부터의 대표 마우스를 도시한 것이다. ffLuc 플럭스 (광자/sec)의 정량화는 모의-형질도입된 TCM 및 PBS와 비교하여 IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM이 종양 퇴행을 유도한다는 것 (#p<0.02, *p<0.001, 반복 측정 ANOVA)을 보여준다 (도 8B). 도 8C에 제시된 바와 같이, 카플란 마이어 생존 곡선 (n=6/군)은 IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM으로 처리된 마우스에 경우, 생존율이 유의적으로 향상되었음을 입증한다 (p=0.0008; log-순위 검정).
실시예 8: 항종양 효능 및 T 세포 지속에서의 IL13(EQ)BBζ + Tcm 및 비- Tcm IL13-제타카인 CD8+ CTL 클론 비교
하기 기술하는 연구는 IL13(EQ)BBζ+ Tcm 및 앞서 생성된 IL13Rα2-특이적 인간 CD8+ CTL (문헌 [Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199] 및 [Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64:9160]에 기술된) IL13-제타카인 CD8+ CTL)을 비교한다. IL13-제타카인은 CD3ζ 자극 도메인을 사용하고, 공자극 도메인은 없으며, IL13(EQ)BBζ+와 동일한 IL13 변이체를 사용한다.
무혈청 배지 중에서 종양 구체 (TS)로서 성장시킨, 교모세포종 환자 표본으로부터의 1차 세포주 패널 (PBT)을 생성하였다 (Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199; Brown et al. 2009 Cancer Res 69:8886). 상기 확장된 TS 세포주는, 줄기 세포 마커 발현, 다계대 분화 및 면역손상된 마우스 (NSG)에서 낮은 세포 개수로 동소 종양을 개시할 수 있는 능력을 비롯한, 줄기 세포 유사 특징을 보인다. EGFP 및 반딧불이 루시페라제 (ffLuc) 리포터 유전자, 둘 모두를 발현하도록 조작된 것 (PBT030-2 EGFP:ffLuc)인 (Brown et al. 2012 Clin Cancer Res 18:2199), IL13Rα2+ 원발성 저-계대수의 교모세포종 TS 세포주 PBT030-2를 하기 개략적으로 설명된 실험에 사용하였다.
먼저, 단일 용량의 (1x106개의 CAR T 세포) IL13(EQ)BBζ+ Tcm 생성물을, 8일째 PBT030-2 EGFP:ffuc TS-개시된 이종이식편 (0.1x106개의 세포)에 대하여 평가된 IL13-제타카인 CD8+ CTL 클론과 비교하였다. 비처리 대조군 및 모의 Tcm (CAR-음성) 대조군과 비교하였을 때, 두 IL13Rα2-특이적 CAR T 세포 (IL13-제타카인 CTL 및 IL13(EQ)BBζ Tcm) 모두 확립된 PBT030-2 종양에 대하여 항종양 활성을 입증한 반면 (도 9A 및 9B), 본 발명자들의 제1 세대 IL13-제타카인 CD8+ CTL 클론과 비교하였을 때, IL13(EQ)BBZ+ Tcm은 유의적으로 향상된 생존 및 오래 지속된 종양 관해를 매개하였으며, 여기서, 마우스는 >150일 생존하였다 (도 9C).
상기 두 IL13Rα2-CAR T 세포 생성물의 치료학적 효과를 추가로 비교하기 위해, 8일째 PBT030-2 EGFP:ffuc TS-개시된 종양에 대한 1.0, 0.3 및 0.1x106개의 CAR T 세포의 용량 역가 측정을 수행하였다 (도 10A- C). 6마리의 동물 중 3마리에서 제노젠 플럭스에 의해 측정된 바, 최고 용량 (1x106)의 IL13-제타카인 CD8+ CTL cl. 2D7은 항종양 반응을 매개하였지만 (도 10C), 그보다 더 낮은 CAR T 세포 용량에서는 어떤 유의적인 항종양 반응도 관찰되지 않았다. 그에 반해, IL13(EQ)BBζ+ Tcm 생성물 주사는 0.1x106개의 CAR T 세포 만큼 소량으로 치료한 것을 비롯하여, 모든 용량 수준에서 대다수의 마우스에서 완전한 종양 관해를 매개하였다. 상기 데이터는 IL13(EQ)BBζ+ Tcm이 항종양 효능에 있어서 IL13-제타카인 CD8+ CTL 클론보다 적어도 10배 더 큰 강력한 효능을 가지고 있음을 입증한다. 항종양 효능이 개선된 것은 종양 미세환경에서의 T 세포 지속이 개선된 것에 기인한다. i.c. 주사 후 7일째 CD3+ T 세포 평가 결과, 종양 미세환경에서 상당수의 IL13(EQ)BBζ+ Tcm이 나타난 반면, 제1 세대 IL13-제타 CTL은 거의 존재하지 않았다 (도 11).
실시예 9: 큰 TS-개시된 PBT 종양 치료를 위한 CAR T 세포 전달 경로 비교
하기에는 침습성 원발성 PBT 세포주에 대한 항종양 활성에 대하여 전달 경로, 정맥내 (i.v.) 또는 두개내 (i.c.) 경로를 비교하는 연구를 기술한다. 파일럿 연구에서는 (나타내지 않음), 예상밖으로, 작은 (5일째) PBT030-2 EGFP:ffLuc 종양 치료를 위해 i.v. 투여된 IL13(EQ)BBζ+ Tcm은 PBS와 비교하였을 때, 어떤 치료학적 이익도 제공하지 않았다는 것이 관찰되었다. 이는 i.c. 투여된 CAR+ T 세포 경우에 관찰된 강력한 치료학적 효능과는 상반되는 것이다. 주변부로부터 치료학적 T 세포를 동원하기에는 5일째 PBT030-2 종양이 너무 작을 수 있다고 추론하면서, 더욱 큰 19일째 PBT030-2 EGFP:ffLuc 종양에 대한 i.v. 대 i.c. 전달을 비교하였다. 본 연구를 위해, PBT030-2 생착된 마우스에 IL13(EQ)BBZ+ Tcm, 또는 모의 Tcm (CAR 없음)을 2회 i.v. 주입 (5 x 106개의 CAR+ Tcm; 19 및 26일째) 또는 4회 i.c. 주입 (1 x 106개의 CAR+ Tcm; 19, 22, 26 및 29일째)하여 처리하였다. 여기서, i.v. 투여된 CAR+ T 세포에 대한 카플란 마이어 생존 분석 또는 제노젠 영상화에 의해 모니터링된 바, 어떤 큰 치료학적 이익은 없었다 (도 12A 및 12B). 그에 반해, i.c. 투여된 IL13(EQ)BBζ+ Tcm의 경우, 강령한 항종양 활성이 관찰되었다 (도 12A-B). 이어서, T 세포 주사 후 7일째 마우스 코호트로부터 뇌를 수거하고, IHC에 의해 CD3+ 인간 T 세포에 대하여 평가하였다. 놀랍게도, 모의 Tcm 또는 IL13(EQ)BBζ Tcm을 사용하여 i.v.로 처리된 마우스의 경우, 종양에서는, 또는 전형적으로 인간 T 세포가 존재하는 다른 마우스 뇌 영역 (즉, 연질뇌척수막)에서는 어떤 검출가능한 CD3+ 인간 T 세포도 존재하지 않았고 (도 12C), 이는 종양 유주활성 기능(tropism)이 부족하다는 것을 제안하는 것이다. 이는 i.c. 처리된 마우스에서 상당수의 T 세포가 검출되는 것과는 상반되는 것이다 (도 12D).
종양 유래 시토카인, 특히, MCP-1/CCL2는 T 세포를 종양으로 동원하는 데 중요하다. 따라서, PBT030-2 종양 세포를 평가하였고, 상기 세포주가, i.v. 투여된 이펙터 CD8+ T 세포를 i.c. 생착된 종양으로 유도하는 것으로 앞서 밝혀져 있는 신경교종 세포주인 U251T 세포 (데이터는 나타내지 않음)와 유사하게 고수준의 MCP-1/CCL2를 생산하는 것으로 밝혀졌다. 악성 신경교종은 고도로 침습성인 종양이고, 이는 대개 다초점 형태로 나타난다. IL13BBZ TCM은 침윤된 종양, 예컨대, PBT030-2를 제거할 수 있고, 장기간 지속되는 항종양 활성을 매개할 수 있다는 것이 상기 기술된 연구를 통해 확립된다. 두개내로 전달된 CAR T 세포가 다초점 질환으로 이동할 수 있는 능력 또한 조사하였다. 본 연구를 위해, PBT030-2 EGFP:ffLuc TS를 좌측 및 우측 반구, 둘 모두에 이식하고 (도 13A), CAR+ T 세포를 오직 우측 종양 부위에만 주사하였다. 고무적으로, 평가된 모든 마우스에 대하여 (n=3), 본 발명자들은 T 세포 주입 후 7일이 경과하였을 때, 주사 부위 (즉, 우측 종양)에서 뿐만 아니라, 좌측 반구 상의 종양 내에서도, 둘 모두에서 CD3 IHC에 의해 T 세포를 검출하였다 (도 13B). 이러한 관찰 결과는 CAR+ T 세포가 원거리에 있는 종양 초점으로 이동할 수 있고, 침윤될 수 있다는 것을 입증한다. U251T 신경교종 세포주를 사용한 제2 종양 모델에서도 유사한 관찰 결과가 또한 관찰되었다 (데이터 나타내지 않음).
실시예 10: IL13(EQ)BBζ / CD19t 서열
IL13(EQ)BBζ/CD19t의 완전한 아미노산 서열은 도 17에 도시되어 있다. 전체 서열 (서열식별번호: 1)은 22개의 아미노산 GMCSF 신호 펩티드 (서열식별번호: 2), 112개의 아미노산 IL-13 서열 (서열식별번호: 3; 아미노산 치환 E13Y (굵은체로 표시)); 229개의 아미노산 IgG4 서열 (서열식별번호: 4; 아미노산 치환 L235E 및 N297Q (굵은체로 표시) 포함); 22개의 아미노산 CD4 막횡단 서열 (서열식별번호: 5); 42개의 아미노산 4-1BB 서열 (서열식별번호: 6); 3개의 아미노산 Gly 링커; 112(굵은체로 표시) 아미노산 CD3ζ 서열 (서열식별번호: 7); 24개의 아미노산 T2A 서열 (서열식별번호: 8); 및 323개의 아미노산 CD19t 서열 (서열식별번호: 9)을 포함한다.
성숙한 키메라 항원 수용체 서열 (서열식별번호: 10)은 112개의 아미노산 IL-13 서열 (서열식별번호: 3; 아미노산 치환 E13Y (굵은체로 표시)); 229개의 아미노산 IgG4 서열 (서열식별번호: 4; 아미노산 치환 L235E 및 N297Q (굵은체로 표시) 포함); 22개의 아미노산 CD4 서열 (서열식별번호: 5); 42개의 아미노산 4-1BB 서열 (서열식별번호: 6); 3개의 아미노산 Gly 링커; 및 112개의 아미노산 CD3ζ 서열 (서열식별번호: 7)을 포함한다. 상기 CAR 서열 (서열식별번호: 10) 내에, 112개의 아미노산 IL-13 서열 (서열식별번호: 3; 아미노산 치환 E13Y (굵은체로 표시)); 229개의 아미노산 IgG4 서열 (서열식별번호: 4; 아미노산 치환 L235E 및 N297Q (굵은체로 표시) 포함); 22개의 아미노산 CD4 서열 (서열식별번호: 5); 및 42개의 아미노산 4-1BB 서열 (서열식별번호: 6)을 포함하는 IL-13/IgG4/CD4t/41-BB 서열 (서열식별번호: 11)이 존재한다. IL13/IgG4/CD4t/4-1BB 서열 (서열식별번호: 11)은 링커 예컨대, Gly Gly Gly 링커에 의해 112개의 아미노산 CD3ζ 서열 (서열식별번호: 7)에 연결될 수 있다. 22개의 아미노산 GMCSF 신호 펩티드 (서열식별번호: 2)가 CAR 서열 (서열식별번호: 10) 앞에 위치할 수 있다. 도 18은 IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζ T2A-CD19t_epHIV7; pF02630] (서열식별번호: 12) 및 CD19Rop_epHIV7 (pJ01683) (서열식별번호: 13)의 서열 비교를 도시한 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> CITY OF HOPE <120> CENTRAL MEMORY T CELLS FOR ADOPTIVE T CELL THERAPY <130> 40056-0002WO2 <140> PCT/US2015/051280 <141> 2015-09-21 <150> 62/053,068 <151> 2014-09-19 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 889 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg 20 25 30 Tyr Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro 35 40 45 Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met 50 55 60 Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala 65 70 75 80 Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val 85 90 95 Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu 100 105 110 Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe 115 120 125 Arg Glu Gly Arg Phe Asn Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 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ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta 2040 cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacggc tagcgccgcc accatgctgc tgctggtgac 2100 cagcctgctg ctgtgcgagc tgccccaccc cgcctttctg ctgatccccg acatccagat 2160 gacccagacc acctccagcc tgagcgccag cctgggcgac cgggtgacca tcagctgccg 2220 ggccagccag gacatcagca agtacctgaa ctggtatcag cagaagcccg acggcaccgt 2280 caagctgctg atctaccaca ccagccggct gcacagcggc gtgcccagcc ggtttagcgg 2340 cagcggctcc ggcaccgact acagcctgac catctccaac ctggaacagg aagatatcgc 2400 cacctacttt tgccagcagg gcaacacact gccctacacc tttggcggcg gaacaaagct 2460 ggaaatcacc ggcagcacct ccggcagcgg caagcctggc agcggcgagg gcagcaccaa 2520 gggcgaggtg aagctgcagg aaagcggccc tggcctggtg gcccccagcc agagcctgag 2580 cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gcccgactac ggcgtgagct ggatccggca 2640 gccccccagg aagggcctgg aatggctggg cgtgatctgg ggcagcgaga ccacctacta 2700 caacagcgcc ctgaagagcc ggctgaccat catcaaggac aacagcaaga gccaggtgtt 2760 cctgaagatg aacagcctgc agaccgacga caccgccatc tactactgcg ccaagcacta 2820 ctactacggc ggcagctacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag 2880 cagcgagagc aagtacggcc ctccctgccc cccttgccct gcccccgagt tcctgggcgg 2940 acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc 3000 cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg 3060 gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag cccagggaag agcagttcaa 3120 cagcacctac cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa 3180 agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc agcatcgaga aaaccatcag 3240 caaggccaag ggccagcctc gggagcccca ggtgtacacc ctgccccctt cccaggaaga 3300 gatgaccaag aatcaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat 3360 cgccgtggag tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt 3420 gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagcaggctg accgtggaca agagccggtg 3480 gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac 3540 ccagaagagc ctgtccctga gcctgggcaa gatggccctg atcgtgctgg gcggcgtggc 3600 cgggctgctg ctgttcatcg gcctgggcat ctttttccgg gtgaagttca gccggtccgc 3660 cgacgcccct gcctaccagc agggccagaa ccagctgtac aacgagctga acctgggcag 3720 gcgggaggaa tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg gaccctgaga tgggcggcaa 3780 gcccaggcgg aagaaccctc aggaaggcct gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc 3840 cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggcgg aggggcaagg gccacgacgg 3900 cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggatacctac gacgccctgc acatgcaggc 3960 cctgcccccc aggtgacccg ggctgcagga attcgatatc aagcttatcg ataatcaacc 4020 tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 4080 gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 4140 cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 4200 tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 4260 cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 4320 ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 4380 tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 4440 tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 4500 ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg 4560 ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg catcgatacc gtcgactagc 4620 cgtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact ttttaaaaga 4680 aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaaagaaga caagatctgc tttttgcctg 4740 tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa 4800 cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct 4860 gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc 4920 tagcagaatt cgatatcaag cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc 4980 aattcgccct atagtgagtc gtattacaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac 5040 tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc 5100 tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat 5160 ggcgaatgga aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 5220 tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 5280 agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 5340 tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 5400 catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 5460 aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 5520 ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 5580 taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc 5640 ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 5700 cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga 5760 gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt 5820 ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag 5880 tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag 5940 aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta 6000 ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg 6060 agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca 6120 gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag 6180 gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc 6240 gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg 6300 tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc 6360 ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg 6420 cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg 6480 gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga 6540 cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac 6600 tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa 6660 aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca 6720 aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 6780 gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 6840 cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 6900 ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct agtgtagccg tagttaggcc 6960 accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag 7020 tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 7080 cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 7140 gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 7200 ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 7260 cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 7320 tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 7380 ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 7440 ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 7500 ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 7560 gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 7620 acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 7680 ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 7740 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc aagctcgaaa 7800 ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg agctccaccg cggtggcggc ctcgaggtcg 7860 agatccggtc gaccagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact 7920 ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag 7980 gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc 8040 ctaggctttt gcaaaaagct tcgacggtat cgattggctc atgtccaaca ttaccgccat 8100 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 8160 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 8220 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 8280 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 8340 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 8400 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 8460 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 8520 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 8580 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 8640 aaatgggcgg taggcgtgta cggaattcgg agtggcgagc cctcagatcc tgcatataag 8700 cagctgcttt ttgcctgtac tgggtctctc tg 8732

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  5. 인간 대상체로부터 수득된 T 세포 집단을 사용하여 중앙 기억 T 세포 집단을 제조하는 방법이며, 상기 방법은
    CD25를 발현하는 세포, CD14를 발현하는 세포, 및 CD45Ra를 발현하는 세포에 대해 T 세포 집단을 고갈시켜 고갈된 T 세포 집단을 제조하는 단계;
    고갈된 T 세포 집단을 CD62L을 발현하는 세포에 대하여 강화시켜 중앙 기억 T 세포 집단을 제조하는 단계, 중앙 기억 T 세포 집단을 자극시키는 단계, 및 키메라 항원 수용체를 발현하는 핵산 분자를 세포에 형질도입시켜 유전적으로 변형된 중앙 기억 T 세포 집단을 생성하는 단계
    를 포함하며,
    CD4+를 발현하는 세포에 대하여 세포 집단을 고갈시키는 단계를 포함하지 않고, CD8+을 발현하는 세포에 대하여 세포 집단을 고갈시키는 단계를 포함하지 않는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    중앙 기억 T 세포 집단 중 적어도 50%의 세포가 CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-이고,
    적어도 10%의 세포가 CD4+이고,
    적어도 10%의 세포가 CD8+인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 중앙 기억 T 세포 집단 중 적어도 50%의 세포가 CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-이고, 적어도 15%의 세포가 CD4+이고, 적어도 15%의 세포가 CD8+인, 방법.
  8. 제5항에 있어서, 중앙 기억 T 세포 집단 중 적어도 50%의 세포가 CD45R0+, CD62L+ 및 CD45Ra-이고, 적어도 20%의 세포가 CD4+이고, 적어도 20%의 세포가 CD8+인, 방법.
  9. 삭제
  10. 제5항에 있어서, 중앙 기억 T 세포 집단을 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  11. 삭제
  12. 제5항에 있어서, 유전적으로 변형된 중앙 기억 T 세포 집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 유전적으로 변형된 중앙 기억 T 세포 집단을 확장시키는 단계가 세포를 IL-2 및 IL-15 모두에 노출시키는 것을 포함하는 것인, 방법.
  14. 삭제
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