CN116963759A - 包含靶向癌症的car-t细胞的组合疗法及使用其治疗癌症的方法 - Google Patents

Abstract

描述了利用CAR‑T免疫疗法和病毒溶瘤疗法的双重方法治疗实体瘤(例如恶性神经胶质瘤)的改进方法。

Description

包含靶向癌症的CAR-T细胞的组合疗法及使用其治疗癌症的 方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年9月10日提交的美国临时申请63/076,805号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及肿瘤免疫治疗领域，特别是恶性神经胶质瘤CAR-T疗法。

关于序列表的声明

与本申请相关联的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在本文中通过引用并入说明书中。包含序列表的文本文件名为118180-0600_ST25.txt.，文本文件约28kb，创建于2020年9月8日，通过EFS-Web以电子方式提交。

背景技术

使用工程化以表达免疫受体的T细胞的新疗法已经为包括癌症和自身免疫性疾病在内的一系列顽固性疾病带来了有前途的免疫疗法。

癌症是对人类健康的显著威胁，导致了生活质量下降，并经常导致死亡。就所需的资源和人力而言，对于国家、地区和地方卫生保健组织来治疗和预防各种形式的癌症的负担是巨大的。人类对抗疾病的主要武器之一是功能正常的免疫系统。抗原(包括突变抗原)是破坏肿瘤的强有力的靶点，例如在小鼠中，靶向这些抗原的肿瘤浸润淋巴细胞可以导致患者的持久肿瘤消退。

高亲和力白细胞介素-13受体α2(IL13Rα2)在多形性胶质母细胞瘤(GBM)和其他肿瘤类型中选择性地高频率表达。靶向这种肿瘤特异性受体的一种途径利用与细胞毒性分子结合的同源配体IL-13。然而，这种途径缺乏特异性，因为IL-13的低亲和力受体IL-13Rα1在非癌组织中广泛表达。人表皮生长因子受体2(HER2)是几种类型癌症中有效的癌症靶点，最显著的是乳腺癌，但最近确定了HER也在高达80％的GBM中表达，但不在正常出生后的神经元或神经胶质中表达。

许多人类癌症缺乏可预测地存在于癌组织上或癌组织中并且能够作为免疫细胞(例如T细胞)的有效缓解靶点的特异性抗原。每种癌细胞类型都含有一组导致不同的肿瘤特异性抗原的独特的突变。尽管技术水平有所进步，但鉴定有效的独特抗原和分离合适的T细胞受体以转导自体T细胞以用于过继免疫疗法仍然是困难的。然而，利用具有嵌合抗原受体(CAR)和双特异性T细胞接合蛋白(BiTE)的过继T细胞免疫疗法的成功主要受限于肿瘤性血液病。许多因素使得过继免疫疗法难以治疗实体瘤，主要归因于对T细胞不利的肿瘤微环境。

因此，需要确定用于治疗实体瘤(特别是GBM)的过继免疫疗法。本公开解决了这种需要。

发明内容

在一些方面，本公开大体涉及一种治疗对象的多形性胶质母细胞瘤(GBM)的方法，包括向患有GBM的对象施用(i)表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群，和(ii)溶瘤病毒。在一些方面，表达CAR的细胞群和溶瘤病毒是同时施用的。在一些方面，表达CAR的细胞群和溶瘤病毒是按顺序施用的。在一些方面，首先施用表达CAR的细胞群，然后施用溶瘤病毒。在一些方面，首先施用溶瘤病毒，然后施用表达CAR的细胞群。在一些方面，对象先前经历了移除原发性GBM肿瘤和/或转移性肿瘤的手术。

在一些方面，表达CAR的细胞群包含T细胞。在一些方面，T细胞是中枢记忆T细胞。在一些方面，表达CAR的细胞群包含NK细胞。

在一些方面，CAR包含结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些方面，CAR选择性地结合IL-13Rα2。在一些方面，结合结构域包含SEQ ID NO：1。在一些方面，间隔结构域包含IgG4 Fc结构域。在一些方面，IgG4Fc结构域包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5。

在一些方面，跨膜结构域包含CD4跨膜结构域。在一些方面，CD4跨膜结构域包含MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF(SEQ ID NO：6)。在一些方面，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些方面，或CD8跨膜结构域包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO：11)、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY(SEQ ID NO：12)或IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：13)。在一些方面，共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域。在一些方面，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO：7。在一些方面，CAR包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14。

在一些方面，表达CAR的细胞群还表达选择标签。在一些方面，选择标签是截短的CD19序列(CD19t)或截短的表皮生长因子受体序列(EGFRt)。在一些方面，CD19t或EGFRt序列通过T2a间隔序列与CAR分离。

在一些方面，溶瘤病毒是基因工程的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。在一些方面，溶瘤病毒具有复制能力。在一些方面，从溶瘤病毒的基因组中删除ICP34.5基因，并且将编码人巨细胞病毒(HCMV)IRS1基因的基因引入溶瘤病毒的基因组中。在一些方面，溶瘤病毒是C134。

在一些方面，表达CAR的细胞群是中枢记忆T细胞，并且CAR包含SEQ ID NO：8或SEQID NO：14，并且其中溶瘤病毒是C134。在一些方面，表达CAR的细胞群和溶瘤病毒通过相同的施用途径施用。在一些方面，表达CAR的细胞群和溶瘤病毒通过不同的施用途径施用。

在一些方面，施用的途径选自脑室内、肿瘤内、鞘内和进入切除的肿瘤腔。在一些方面，表达CAR的细胞群和溶瘤病毒被直接施用到对象的中枢神经系统(CNS)中。

本文描述和要求保护的发明具有许多属性和实施方案，包括但不限于在发明简述和以下附图说明和详细说明中阐述或描述或引用的属性和实施方案。其并不旨在包括所有，并且本文所描述和要求保护的发明并不局限于或受该发明简述中确定的特征或实施方案的限制，该发明简述仅出于说明而非限制的目的而被包括。其他的实施方案可以在下面的详细说明中公开。

附图说明

图1描绘了实施例4中进行的施用和检测的示例性方案的图形表示。

详细说明

本公开涉及通过施用(1)表达与IL-13Rα2或HER2特异性相互作用(例如结合)的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞和(2)溶瘤病毒的组合来治疗以表达或呈递IL-13Rα2或HER2的细胞为特征的多种癌症的方法。

I.定义

尽管本领域的普通技术人员可以很好地理解以下术语，但阐述以下定义是为了便于解释当前公开的主题。

术语“一”或“一个/项/种”可以指代该实体的一个或多个，即可以指代多个指代对象。因此，术语“一”或“一个/项/种”、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换地使用。此外，用“一”或“一个/项/种”提及“一个元素”时并不排除存在一个以上元素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且只有一个元素。

在整个说明书中，对“一个实施方案”、“实施例”、“一个方面”或“方面”的引用意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”在本说明书的各个地方的出现不一定都指同一个实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合在一个或多个实施方案中。

如本文所使用的，当在数值之前时，术语“大约”或“约”表示该值加上或减去该值的10％的范围。例如，“大约10”应该理解为“10”和“9-11”。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地被确认为充分描述并使得相同的范围能够被分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性的例子，这里讨论的每个范围可以容易地分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还可以理解，所有语言，例如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等，都包括所列举的数字，并且指的是可以随后分解成如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组指具有1、2、3、4或5个单元等的组。

本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应该理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，范围的描述应该被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。举例而言，对例如从1到6的范围的描述应该被认为具有特别公开的子范围，例如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围有多广，这都适用。

通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语是众所周知的且在本领域中常用的。除非另有指示，否则本文提供的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法来执行，并且如在本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的。如本领域通常完成的或如本文所述的，酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行。本文描述的与分析化学、合成有机化学以及药物和药物化学相关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配方和递送以及患者的治疗。

如本文所用，“对照”是在实验中用于比较目的的替代样品。对照可以是“阳性”或“阴性”的。本文中使用的“对照样品”或“参考样品”是指作为对照与实验样品进行比较的样品或参考。例如，实验样品包含小瓶中的化合物A、B和C，并且对照可以是与实验样品相同处理的相同类型的样品，但是缺少化合物A、B或C中的一种或多种。

如本文所用，术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸的一般知识，多核苷酸可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方法获得的所有核酸序列，包括但不限于重组方法，即使用普通克隆技术和聚合酶链式反应等从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列，以及通过合成方法。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对能够包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语既指短链，其在本领域中通常也例如称为肽、寡肽和寡聚体，也指长链，其在本领域中通常称为蛋白质，其中有许多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文所用，术语“组合物”旨在涵盖含有任选地特定量的特定成分(例如，本文所提供的溶瘤病毒)的产品，以及由任选地特定量的特定成分的组合直接或间接产生的任何产品。

如本文所用，术语“载体”是指包含分离的核酸并可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质的组合物。本领域已知许多载体，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相连的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的示例包括但不限于仙台病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、HSV载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。

如本文所用，术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，例如粘粒、质粒(例如裸的或包含在脂质体中的)和并入重组多核苷酸的病毒(例如仙台病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所用，术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

如本文所用，术语“表位”定义为抗原上的小化学分子，其可引发免疫应答，诱导B和/或T细胞应答。抗原可以有一个或多个表位。大多数抗原有许多表位；即，它们是多价的。一般来说，一个表位的尺寸大约为10个氨基酸和/或糖。优选地，表位是约4-18个氨基酸，更优选约5-16个氨基酸，甚至更优选6-14个氨基酸，更优选约7-12个氨基酸，最优选约8-10个氨基酸。本领域技术人员理解，通常整体三维结构，而不是分子的特异性线性序列，是抗原特异性的主要标准，因此将一个表位与另一个表位区分开来。基于本公开，本发明的肽可以是表位。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有彼此简并版本且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。短语“编码蛋白质或RNA的核苷酸序列”也可以包括内含子，因为编码蛋白质的核苷酸序列可能在某些版本中包含内含子。

如本文所用，术语“自体”意指来源于同一个体的任何物质，其随后将被重新引入该个体。

如本文所用，“同种异体”是指来自同一物种的不同动物的任何材料。“异种”是指来自不同物种的动物的任何材料。

如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指被工程化以在免疫细胞上表达并特异性结合靶蛋白或抗原的人工受体。CAR可以用作过继细胞转移疗法，其中T细胞从患者体内取出并修饰，使其表达CAR，然后重新引入患者体内。在一些实施方案中，CAR对选定的靶(例如表达前列腺特异性膜抗原的细胞)具有特异性。CAR还可以包含细胞内激活结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。

如本文所用，短语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如人工APC(aAPC)、树突状细胞、B细胞等)上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供信号，该信号除了由例如TCR/CD3复合物与装载有肽的MHC分子的结合提供的初级信号之外，还介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX 40L、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及特异性结合B7-H3的配体。除其他外，共刺激配体还涵盖与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，这些分子例如但不限于CD27、CD28、4-1BB、0X40、CD30、CD40、PD-l、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-l(LFA-l)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，以及与CD83特异性结合的配体。

如本文所用，“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合伙伴，其与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激反应，例如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。

如本文所用，“共刺激信号”是指与初级信号(例如TCR/CD3连接)结合导致T细胞增殖和/或关键分子上调或下调的信号。

如本文所用，短语“有效量”和“治疗有效量”可互换使用，并且指有效实现特定生物学结果或提供治疗或预防益处的如本文所述的化合物、配方、材料或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于当向哺乳动物(例如，人类患者)施用时引起肿瘤尺寸、数量或体积减小的量；癌症/肿瘤细胞死亡的量；和/或肿瘤消退的量。本领域技术人员应该理解，本文施用的组合物的量是变化的，并且可以基于许多因素(例如正在治疗的癌症、正在治疗的哺乳动物的年龄和健康以及身体状况、癌症的阶段/疾病的严重程度、正在施用的特定化合物等)容易地确定。

如本文所用，关于CAR或其抗原结合结构域的短语“特异性结合”意味着CAR识别特定抗原，但基本上不识别或结合样品中的其他分子。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的CAR也可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身不会改变抗体的特异性分类。在另一个示例中，特异性结合抗原的CAR也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应本身并不改变特异性分类。

II.嵌合抗原受体

在一些方面，本公开提供了用于修饰的免疫细胞或其前体的组合物和方法，所述免疫细胞例如T细胞或自然杀伤细胞(NK细胞)，包含嵌合抗原受体(CAR)。因此，在一些方面，免疫细胞已被基因修饰以表达CAR。在一些方面，本公开的CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、铰链结构域和细胞内信号传导结构域。在一些方面，CAR包含抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域。

在一些方面，抗原结合结构域可以可操作地连接到CAR的另一个结构域，例如跨膜结构域和/或胞内结构域，两者都在本文别处描述，用于在细胞中表达。在一些方面，编码抗原结合结构域的第一核酸序列可操作地连接到编码跨膜结构域的第二核酸，并且进一步可操作地连接到编码细胞内结构域的第三核酸序列。

在一些方面，本文所述的抗原结合结构域可以与本文所述的任何跨膜结构域、本文所述的任何胞内结构域或胞质结构域或本文所述的任何其他结构域结合，这些结构域可以被包括在本发明的CAR中。在一些方面，CAR还可以包括如本文所述的间隔结构域。在一些方面，抗原结合结构域、跨膜结构域和胞内结构域中的每一个都由接头分离。

抗原结合结构域

CAR的抗原结合结构域是CAR的细胞外区域，用于结合特定的靶抗原，所述靶抗原包括蛋白质、碳水化合物和糖脂。在一些方面，CAR包含与靶细胞上的靶抗原的亲和力。靶抗原可以包括与靶细胞相关的任何类型的蛋白质或其表位。例如，CAR可以包含与靶细胞上的靶抗原的亲和力，其指示靶细胞的特定疾病状态。

在示例性方面，靶细胞抗原是在细胞表面上表达的IL-13Rα2。在一些方面，CAR对IL-13Rα2、IL-13Rα2表位、IL-13Rα2突变体和/或IL-13Rα2片段具有亲和力或特异性。

在另一示例性方面，靶细胞抗原是在细胞表面上表达的HER2。在一些方面，CAR对HER2、HER2表位、HER2突变体和/或HER2片段具有亲和力或特异性。

如本文所述，对靶细胞上的特异性靶抗原具有亲和力的本公开的CAR可以包含靶特异性结合结构域。在一些实施方案中，靶特异性结合结构域是小鼠靶特异性结合结构域，例如，靶特异性结合结构域是小鼠来源的。在一些实施方案中，靶特异性结合结构域是人类靶特异性结合结构域，例如，靶特异性结合结构域是人类来源的。在示例性的实施方案中，对靶细胞上的IL-13Rα2或HER2具有亲和力的本公开的CAR可以包含IL-13Rα2-或HER2-结合结构域。在一些实施方案中，结合结构域是小鼠结合结构域，例如，结合结构域是小鼠来源的。在一些实施方案中，结合结构域是人类结合结构域，例如，IL-结合结构域是人类来源的。

在一些方面，本公开的CAR可以对一个或多个靶细胞上的一个或多个靶抗原具有亲和力。在一些方面，CAR可以对靶细胞上的一种或多种靶抗原具有亲和力。在这些方面，CAR是双特异性CAR或多特异性CAR。在一些方面，CAR包含一个或多个赋予一种或多种靶抗原亲和力的靶特异性结合结构域。在一些方面，CAR包含一个或多个赋予相同靶抗原亲和力的靶特异性结合结构域。例如，包含对相同靶抗原具有亲和力的一个或多个靶特异性结合结构域的CAR可以结合靶抗原的不同表位。当CAR中存在多个靶特异性结合结构域时，结合结构域可以串联地排列并且可以通过接头肽分离。例如，在包含两个靶特异性结合结构域的CAR中，结合结构域通过寡肽或多肽接头、Fc铰链区或膜铰链区在单个多肽链上彼此共价连接。

在一些方面，抗原结合结构域选自抗体、抗原结合片段(Fab)和单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，本发明的IL-13Rα2或HER2结合结构域选自IL-13Rα2-或HER2-特异性抗体、IL-13Rα2-或HER2-特异性Fab和IL-13Rα2-或HER2-特异性scFv。在一个实施方案中，IL-13Rα2或HER2-结合结构域是IL-13Rα2或HER2-特异性抗体。在一个实施方案中，IL-13Rα2-或Her2-结合结构域是IL-13Rα2-或HER2-特异性Fab。在一个实施方案中，IL-13Rα2-或HER2-结合结构域是IL-13Rα2-或HER2-特异性scFv。在一些方面，抗原结合结构域是IL-13细胞因子或其突变体、变体或片段(即，“zetakine”)。例如，在一些实施方案中，抗原结合结构域可以包含IL13 E13Y突变蛋白。

抗原结合结构域可以包括与抗原结合的任何结构域，并且可以包括但不限于能够与IL-13Rα2结合的IL-13蛋白、多肽、变体、突变体或其片段，或者能够与HER2结合的蛋白或多肽；单克隆抗体；多克隆抗体；合成抗体；人抗体；人源化抗体；非人抗体；及其任何片段或scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域部分包含哺乳动物抗体或其片段。抗原结合结构域的选择可能取决于靶细胞表面上存在的抗原的类型和数量。如本文所用，术语“单链可变片段”或“scFv”是共价连接以形成VH::VL异二聚体的免疫球蛋白(例如，小鼠或人)的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或者通过肽编码接头连接，该接头将VH的N-端与VL的C-端连接，或者将VH的C-端与VL的N-端连接。在一些实施方案中，抗原结合结构域(例如，IL-13Rα2结合结构域)包含具有从N-端到C-端的构型(VH-接头-VL)的scFv。在一些实施方案中，抗原结合结构域(例如，IL-13Rα2结合结构域)包含具有从N-端到C-端的构型(VL-接头-VH)的scFv。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适当构型。scFv的接头通常富含甘氨酸以获得灵活性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解度。该接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。接头的非限制性示例在WO2014/087010中公开。

在一些方面，抗原结合结构域包含GPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKT QRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN(SEQ ID NO：1)。

在一些方面，抗原结合结构域包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。

在一些方面，结合结构域中可容忍的变化对于本领域的技术人员是已知的，同时保持与IL-13Rα2的结合。在一些方面，IL-13Rα2结合结构域包含与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：9具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。

间隔结构域

在一些方面，CAR包含间隔结构域。在一些方面，间隔结构域是寡肽或多肽，其功能是将抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域中的一个或多个连接到抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和信号传导结构域中的一个或多个。在一些方面，间隔结构域可以是长度为包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的短氨基酸接头。例如甘氨酸-丝氨酸双链体。在一些方面，间隔结构域出现在CAR的胞内结构域和跨膜结构域之间。在一些方面，间隔结构域出现在胞外结构域和跨膜结构域之间。在一些方面，间隔结构域可以包含多达300个氨基酸，例如10至100个氨基酸或25至50个氨基酸。

接头的非限制性示例在WO 2015/105522中公开。

在一些方面，间隔结构域包含免疫球蛋白Fc结构域。在一些方面，间隔结构域包括IgG Fc结构域。在一些方面，间隔结构域包含IgG4 Fc结构域。在一些方面，IgG4 Fc结构域包含下列中的一种：

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD

GVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK

GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:10)ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK(SEQ ID NO:2)；

ESKYGPPCPSCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVD

GVEVHQAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK

GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:3)；PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHQAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:4)；或

GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:5)。

在一些方面，IgG4 Fc结构域中可容忍的变化对于本领域的技术人员是已知的。在一些方面，IgG4 Fc结构域包含与SEQ ID NO：2-5或10中任一个序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。

铰链结构域

在一些方面，CAR包含铰链结构域。CAR的铰链结构域是亲水性区域，可以位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间。在一些方面，除其他功能外，该结构域可以促进CAR的适当蛋白质折叠。铰链结构域是CAR的任选的元件。在一些方面，跨膜结构域进一步包含铰链结构域。铰链结构域可以包括选自抗体的Fc片段、抗体的铰链区、抗体的CH2区、抗体的CH3区、人工铰链序列或其组合的结构域。铰链结构域的例子包括但不限于CD8a铰链、由小至三个甘氨酸(Gly)的多肽制成的人工铰链以及IgG(例如人IgG4)的CH1和CH3结构域。

在一些方面，CAR包括铰链结构域，其将抗原结合结构域和跨膜结构域连接，而跨膜结构域又连接到细胞内结构域。铰链结构域优选能够支持抗原结合结构域以识别和结合靶细胞上的靶抗原。在一些方面，铰链结构域是柔性结构域，因此允许抗原结合结构域具有最佳地识别细胞(例如肿瘤细胞)上靶抗原的特异性结构和密度的结构。铰链结构域的灵活性允许铰链结构域采用许多不同的构象。

在一些实施方案中，铰链结构域是免疫球蛋白重链铰链区。在一些实施方案中，铰链结构域是源自受体的多肽(例如，源自CD8的铰链区)。

在一些方面，铰链结构域可以具有约4个氨基酸至约50个氨基酸的长度，例如，约4aa至约10aa、约10aa至约15aa、约15aa至约20aa、约20aa至约25aa、约25aa至约30aa、约30aa至约40aa、或约40aa至约50aa的长度。

在一些方面，铰链结构域可以容易地选择，并且可以是许多合适长度中的任何一种，例如1个氨基酸(例如Gly)到20个氨基酸、2个氨基酸到15个氨基酸、3个氨基酸到12个氨基酸，包括4个氨基酸到10个氨基酸、5个氨基酸到9个氨基酸、6个氨基酸到8个氨基酸、或者7个氨基酸到8个氨基酸，并且可以是1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。

跨膜结构域

在一些方面，本公开的CAR可以包含连接CAR的抗原结合结构域和CAR的胞内结构域的跨膜结构域。本发明的CAR的跨膜结构域是能够跨越细胞(例如免疫细胞或其前体)的质膜的区域。跨膜结构域用于插入细胞膜，例如真核细胞膜。在一些方面，跨膜结构域介于CAR的抗原结合结构域和胞内结构域之间。

在一些方面，跨膜结构域天然地与CAR中的一个或多个结构域相关联。在一些方面，跨膜结构域可以通过一个或多个氨基酸取代来选择或修饰，以避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。跨膜结构域可以来源于天然或合成来源。如果来源是天然的，则该结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白，例如I型跨膜蛋白。在来源是合成的情况下，跨膜结构域可以是任何有助于将CAR插入细胞膜的人工序列，例如人工疏水序列。在一些方面，跨膜结构域是源自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9的跨膜结构域(即至少包括其跨膜区)。在一些方面，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，它将主要包含疏水残基(例如亮氨酸和缬氨酸)。优选在合成跨膜结构域的每一端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。

在一些方面，跨膜结构域包含CD4跨膜结构域。在一些方面，CD4跨膜结构域包含MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF(SEQ ID NO：6)。在一些方面，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域。在一些方面，CD8跨膜结构域包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO：11)、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY(SEQ ID NO：12)或IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：13)。

在一些方面，跨膜结构域中可容忍的变化对于本领域的技术人员是已知的。在一些方面，所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：13具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。

共刺激结构域

在一些方面，共刺激信号对于实现强大的CAR-T细胞扩增、功能、持久性和抗肿瘤活性是必要的。这些可以通过整合来自一个或多个T细胞共刺激分子的一个或多个共刺激结构域来提供。在一些方面，共刺激结构域选自CD3、CD4、CD8、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、0X40、CD30、CD40、PD-l、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-l(LFA-l)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体或其任何片段的共刺激分子。

在一些方面，共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域。在一些方面，4-1BB共刺激结构域包含KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：7)。

在一些方面，共刺激结构域中可容忍的变化对于本领域的技术人员是已知的。在一些方面，共刺激结构域包含与SEQ ID NO：7具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。

细胞内信号传导结构域

在一些方面，CAR还包括细胞内信号传导结构域。术语“细胞内信号传导结构域”和“细胞内结构域”在本文中可互换使用。CAR的细胞内信号传导结构域负责激活表达CAR的细胞(例如免疫细胞)的至少一种效应子功能。细胞内信号传导结构域转导效应子功能信号并指导细胞(例如免疫细胞)执行其特化功能，例如伤害和/或破坏靶细胞。

在一些方面，细胞内信号传导结构域是表面受体、共刺激分子或任何协同作用以启动T细胞中信号转导的分子的细胞质部分，以及这些元素的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何合成序列。

在一些方面，细胞内信号传导结构域是T细胞受体复合物的z链或其任何同源物，例如h链、FcsRfy和b链、MB 1(IgA)链、B29(Ig)链等、人CD3ζ链、CD3多肽(A、d和e)、syk家族酪氨酸激酶(syk、ZAP 70等)、src家族酪氨酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)，以及参与T细胞转导的其他分子，例如CD2、CD5和CD28。在一些方面，细胞内信号传导结构域可以是人CD3ζ链、FcyRIII、FcsRI、Fc受体的细胞质尾、携带细胞质受体的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(IT AM)及其组合。

在一些方面，细胞内信号传导结构域包括来自一种或多种分子或受体的片段或结构域，包括但不限于TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、常见的FcRγ、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRlla、DAP 10、DAP 12、T细胞受体(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、0X40、CD30、CD40、PD-l、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-l)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-l、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1Id、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11 a、LFA-l、ITGAM、CD lib、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD 96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD 162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9，本文所述的其他共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段、具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，以及其任何组合。

在一些方面，细胞内信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域，例如RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO：15)。

在一些方面，本公开的CAR包含以下或由以下组成：GPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:8)。

在一些方面，本公开的CAR包含下或由以下组成：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:14)。

在一些方面，CAR中可容忍的变化对于本领域的技术人员是已知的。在一些方面，CAR包含与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面，通过本领域技术人员已知的任何方法将表达CAR的细胞引入宿主细胞。如果需要，表达载体可以包括用于转染的病毒序列。或者，表达载体可以通过融合、电穿孔、生物学、转染、脂转染等引入。在引入表达载体之前，宿主细胞可以在培养物中生长和扩增，随后进行适当的处理以引入和整合载体。然后扩增宿主细胞，并可借助载体中存在的标志物进行筛选。可以使用的各种标志物是本领域已知的，并且可以包括hprt、新霉素抗性、胸苷激酶、潮霉素抗性等。如本文所用，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。在一些实施方案中，宿主细胞是免疫细胞或其前体，例如T细胞、NK细胞或NK T细胞。

当CAR在体内表达时，它可以暂时包含前导序列或GMCSFRa信号肽，例如MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO：16)，其最终从成熟的CAR上切割下来。

本公开还提供了基因工程细胞，其包括并稳定表达本公开的CAR。在一些方面，工程化细胞表达本公开的显性阴性受体和/或开关受体和/或双特异性抗体和/或其组合。在一些方面，基因工程细胞是基因工程T淋巴细胞(T细胞)、初始T细胞(TN)、记忆T细胞(例如，中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆细胞(TEM))、自然杀伤细胞(NK细胞)和能够产生治疗相关后代的巨噬细胞。在一些方面，基因工程细胞是自体细胞。修饰的细胞(例如，包含本发明的CAR、显性阴性受体和/或开关受体和/或表达和分泌双特异性抗体和/或其组合)可以通过用包括本公开的核酸的表达载体的稳定地转染宿主细胞来产生。产生本公开的修饰细胞的其他方法包括但不限于化学转化方法(例如，使用磷酸钙、树状大分子、脂质体和/或阳离子聚合物)、非化学转化方法(例如，电穿孔、光学转化、基因电转移和/或流体动力递送)和/或基于颗粒的方法(例如，使用基因枪和/或磁感染的刺穿法)。表达本公开的本发明的CAR、显性阴性受体和/或开关受体和/或双特异性抗体和/或其组合的转染细胞可以体外扩增。

在一些方面，本公开涉及表达CAR的修饰免疫细胞群。在一些方面，细胞群包含T细胞、NK细胞和/或巨噬细胞的一个或多个亚群。

在一些方面，表达CAR的细胞群进一步表达选择标签。在一些方面中，选择标签是截短的CD19序列(CD19t)(例如，CGDVEENPGPRMPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCVPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKR；SEQ ID NO:17)。在一些方面，选择标签是截短的表皮生长因子受体序列(EGFRt)。在一些方面，表达CAR的细胞群包含允许分离和纯化表达CAR的细胞的标签。例如CD19t和EGFRt的标签可以通过T2A跳过序列(例如，LEGGGEGRGSLLT；SEQ ID NO：18)与成熟CAR序列分离。

III.溶瘤病毒

溶瘤病毒是一种利用病毒特异性感染和破坏癌细胞的免疫疗法。这些病毒，有些是自然产生的，有些是合成的或修饰的，代表了治疗癌症的一种有前途的方法，原因有几个。癌细胞通常具有受损的抗病毒防御能力，这使它们容易受到感染。天然存在的溶瘤病毒可以被修饰以赋予它们有利的特性，例如降低它们感染健康细胞的能力。感染后，这些病毒可以导致癌细胞溶解、杀死癌细胞并释放癌细胞抗原。这些抗原可以刺激免疫反应，增强免疫系统的抗癌活性。

在一些方面，溶瘤病毒选自呼肠孤病毒(reovirus)、新城疫病毒(NDV)、水泡性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒、流感病毒、辛比斯(Sinbis)病毒、腺病毒、痘病毒和疱疹病毒(HSV)。在一些方面，溶瘤病毒选自腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、小核糖核酸病毒、脊髓灰质炎病毒、副粘病毒、呼肠孤病毒、细小病毒和弹状病毒。在一些方面，溶瘤病毒是痘苗病毒(vaccinia virus)。

在全球范围内，两种病毒T-VEC和H101已经获得监管机构的批准。H101是一种基因修饰的溶瘤腺病毒，其在中国被批准用于组合全身性化疗治疗鼻咽癌。T-Vec是一种含有重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的人单纯疱疹I型病毒(HSV-1)，用于无法手术的局部晚期或转移性恶性黑色素瘤。

为了本公开的目的，溶瘤性单纯疱疹病毒优选与公开的抗IL-13Rα2CAR结合。溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)I型构建体是多种恶性肿瘤(包括恶性神经胶质瘤)的抗肿瘤药剂。迄今为止的临床试验支持都这些药物的安全性，即使直接在中枢神经系统中施用。传统的美国食品和药物管理局(FDA)对这些药剂的临床前毒性研究包括使用两个物种，一般包括小鼠和灵长类研究。特别地，C134(一种嵌合的oHSV构建体)已经在许多模型系统中被证明是安全且有效的。C134是一种神经毒性、溶瘤的第二代、具有复制能力的重组和基因工程的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)，其中ICP34.5的基因已被删除，并且编码人巨细胞病毒(HCMV)蛋白激酶R(PKR)逃避蛋白IRS1的基因具有潜在的溶瘤和免疫刺激活性。在肿瘤内施用时，溶瘤HSV-1C134特异性地感染并在快速分裂的神经胶质瘤细胞内复制，从而直接溶解肿瘤细胞。释放的病毒颗粒反过来感染邻近的肿瘤细胞并在其中复制，从而进一步杀死肿瘤细胞。从裂解的肿瘤细胞释放的肿瘤抗原也激活免疫系统以诱导肿瘤特异性的全身性免疫和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，从而杀死附近未感染的肿瘤细胞。编码ICP34.5的基因缺失通过阻止健康细胞中的复制赋予肿瘤选择性。IRS1的表达允许病毒在肿瘤内复制，但限制了病毒的传播。

在一些方面，溶瘤病毒是被基因修饰的。在一些方面，病毒中的一个或多个基因被破坏。在一些方面，病毒中的一个或多个基因被删除。在一些方面，将一个或多个与病毒异源的基因引入病毒。在一些方面，基因修饰的病毒是HSV-1。在一些方面，HSV-1被修饰为使得ICP 34.5基因被破坏或缺失。在一些方面，HSV-1被修饰为使得人巨细胞病毒(HCMV)IRS1基因被引入病毒基因组。在一些方面，HSV-1病毒是C134。在一些方面，溶瘤病毒具有复制能力。

IV.药物组合物

本发明的药物组合物可以包含本文所述的基因修饰的免疫细胞，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或赋形剂组合。这种组合物可以包含缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸、抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。在一些方面，本发明的组合物优选地配制用于静脉内施用。在一些方面，本发明的药物组合物优选地配制成用于施用到中枢神经系统中。在一些方面，包含逆转录病毒(例如慢病毒)载体的药物组合物适用于施用至哺乳动物，优选地施用至人。

V.治疗方法在一些方面，给有需要的患者施用(1)表达CAR的细胞群，和(2)溶瘤病毒。在一些方面，有需要的患者是癌症患者。在一些方面，癌症包含表达IL-13Rα2和/或HER2的细胞。在一些实施方案中，癌症是多形性胶质母细胞瘤(GBM)。

在一些方面，有需要的患者是女性。在一些方面，有需要的患者是男性。在一些方面，患者是成年人(18岁以上)。在一些方面，患者是儿童。在一些方面，儿童的年龄大于2岁、大于3岁、大于4岁、大于5岁、大于6岁、大于7岁、大于8岁、大于9岁、大于10岁、大于11岁、大于12岁、大于13岁、大于14岁、大于15岁或大于16岁。在一些方面，患者是大于50岁、大于55岁、大于60岁、大于65岁、大于70岁、大于75岁、大于80岁、大于85岁、大于90岁、大于95岁、大于100岁或大于105岁的成年人。

在一些方面，患者在经过至少6个月、至少9个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月、至少36个月、至少48个月、至少5年、至少6年、至少7年、至少8年、至少9年或至少10年的缓解期之后，癌症复发或复现。

在一些方面，患者已经经历了移除实体瘤的手术。在一些方面，实体瘤是本文描述的任何一种癌症。在一些方面，实体瘤是转移性肿瘤。在一些方面，手术是切除原发性胶质母细胞瘤。在一些方面，胶质母细胞瘤是多形性胶质母细胞瘤。在一些方面，患者的癌症对单独的溶瘤治疗没有反应。在一些方面，患者的癌症对单独的CAR-T治疗没有反应。

在一些方面，同时给患者施用包含CAR的细胞群和溶瘤病毒。在一些方面，分别给患者施用包含CAR的细胞群和溶瘤病毒。在一些方面，首先给患者施用包含CAR的细胞群，然后给患者施用溶瘤病毒。在一些方面，首先给患者施用溶瘤病毒，然后给患者施用包含包含CAR的细胞群的细胞群。

在一些方面，给患者施用至少一个剂量的每种溶瘤病毒和包含CAR的细胞群。在一些方面，给患者施用至少两个剂量的每种溶瘤病毒和包含CAR的细胞群。在一些方面，给患者施用至少三个剂量的每种溶瘤病毒和包含CAR的细胞群。在一些方面，给患者施用至少一个剂量的溶瘤病毒和至少两个剂量的包含CAR的细胞群。在一些方面，给患者施用至少一个剂量的包含CAR的细胞群和至少两个剂量的溶瘤病毒。

在一些方面，首先施用包含CAR的细胞群，并且在施用溶瘤病毒之前经过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天的时间。在一些方面，首先施用溶瘤病毒，并且在施用包含CAR的细胞群之前经过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天的时间。

在一些方面，首先施用包含CAR的细胞群，并且在施用溶瘤病毒之前经过至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17天、至少18、至少19、至少20、至少21天、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30天的时间。在一些方面，首先施用溶瘤病毒，并且在施用包含CAR的细胞群之前经过至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29或至少30天的时间。

在一些方面，溶瘤病毒和包含CAR的细胞群通过脑室内途径、通过肿瘤内途径、通过鞘内途径、进入切除的肿瘤腔、通过颅内途径或通过直接进入中枢神经系统来施用。

VI.癌症

在一些方面，对本文描述的治疗敏感的癌症包括其中IL-13Rα2表达的癌症。在一些方面，这种癌症包括实体瘤，例如癌和肉瘤。癌包括来源于浸润周围组织导致转移的上皮细胞的恶性肿瘤。腺癌是来源于腺组织或形成可识别腺结构的组织的癌。在一些方面，癌症包括肉瘤和纤维肉瘤，它们是其细胞包埋在纤维状或均质物质(例如胚胎结缔组织)中的肿瘤。在一些方面，癌症包括髓样或淋巴样癌症，例如白血病、淋巴瘤和通常不表现为肿瘤块但通常分布在血管或淋巴网状系统中的其他癌症。在一些方面，癌症包括成人、儿童、男性和/或女性特有或通常特有的癌症。在一些方面，癌症包括原发性癌症、继发性癌症、转移前癌症、转移后癌症、急性癌症、慢性癌症、良性癌症、恶性癌症、通常定位于解剖位置的癌症。

在一些方面，可以治疗的癌包括肾上腺皮质、腺泡、腺泡细胞、腺泡状、腺囊性、腺样囊性、腺样鳞状细胞、腺瘤癌、腺鳞状、附件(adnexel)、肾上腺皮质癌、肾上腺皮质、产生醛固酮的、分泌醛固酮的、肺泡、肺泡细胞、成釉细胞、壶腹状(ampullary)、甲状腺的退行性癌、顶泌、基底细胞、基底细胞、肺泡的、粉刺基底细胞、囊性基底细胞、硬斑病样基底细胞、多中心基底细胞、结节溃疡性基底细胞、色素性基底细胞、硬化性基底细胞、浅表基底细胞、基底样细胞、基底鳞状细胞、胆管、肝外胆管、肝内胆管、支气管肺泡(bronchioalveolar)、小支气管、细支气管肺泡(bronchioloalveolar)、支气管肺泡、支气管肺泡细胞、支气管原、脑状、胆管细胞、绒毛膜、脉络丛、透明细胞、泄殖腔肛门、胶状、粉刺、原体(corpus)、子宫体癌、产生皮质醇的、筛状、圆柱状、圆柱状细胞、管、导管、前列腺导管癌、导管原位癌(DCIS)、外分泌腺、胚胎性、铠甲状癌、子宫内膜、子宫内膜癌、子宫内膜样、表皮样、混合肿瘤的癌、多形性腺瘤癌、外生性、纤维层状、纤维癌、甲状腺滤泡癌、胃、胶状(gelatinform)、凝胶状(gelatinous)、巨细胞、甲状腺巨细胞癌、巨细胞癌(cancer gigantocellulare)、腺的、颗粒细胞、肝细胞、嗜酸性细胞(Hurthle cell)、肾上腺样、幼稚型胚胎性、胰岛细胞癌、乳腺炎性癌、原位癌、导管内、表皮内、上皮内、少年胚胎性、库尔奇茨基细胞(Kulchitsky-cell)、大细胞、软脑膜、小叶、浸润小叶、侵袭性小叶、小叶原位癌(LCIS)、淋巴上皮、髓质癌、髓质、甲状腺髓质癌、甲状腺髓质、黑色素性、脑膜、默克尔细胞(Merkel cell)、非典型细胞、微乳头状、软癌(cancer molle)、粘液的、粘液癌、黏液细胞癌、黏液表皮样、黏液癌、黏液、鼻咽、皮肤神经内分泌癌、非浸润性、非小细胞、非小细胞肺癌(NSCLC)、燕麦状细胞癌、骨化性癌、骨样癌、骨或乳腺的佩吉特氏病(Paget's disease)、乳头状、甲状腺乳头状癌、壶腹周围的、侵袭前的、棘细胞、原发性骨内、肾细胞、瘢痕、血吸虫性膀胱、施耐德氏(Schneiderian)、硬癌(scirrhous)、皮脂性、印戒细胞、单纯癌、小细胞、小细胞肺癌(SCLC)、梭形细胞、海绵状癌(cancer spongiosum)、鳞状、鳞状细胞、终末导管、间变性甲状腺(anaplastic thyroid)、滤泡状甲状腺、甲状腺癌髓样、乳头状甲状腺、皮肤小梁癌(trabecular cancer)、移行细胞、管状、未分化甲状腺癌、子宫体、疣状、绒毛、绒毛癌、卵黄囊(yolk sac)、特别是头颈部的鳞状细胞、食道鳞状细胞以及口腔癌和癌(carcinoma)。

在一些方面，可以治疗的肉瘤包括脂肪性、肺泡柔软部位、成釉细胞、禽、葡萄状(botryoid)、葡萄状肉瘤、鸡、绿瘤(chloromatous)、软骨母细胞、肾透明细胞肉瘤、胚胎、子宫内膜基质、上皮样、尤文氏(Ewing's)、筋膜、成纤维细胞、家禽、巨细胞、颗粒细胞、血管内皮、霍奇金氏(Hodgkin's)、特发性多发性色素出血、B细胞免疫母细胞肉瘤、T细胞免疫母细胞肉瘤、詹森氏(Jensen's)、卡波西氏(Kaposi's)、库普弗细胞(Kupffer cell)、白细胞、淋巴、黑色素、混合细胞、多发性、淋巴管、特发性出血性、多潜能原发性骨肉瘤、成骨细胞、骨源性(osteogenic)、骨旁、多形性、假性卡波西(pseudo-Kaposi)、网状细胞、脑网状细胞肉瘤、横纹肌肉瘤、劳斯(Rous)、软组织、梭形细胞、滑膜、毛细血管扩张性、骨的肉瘤(骨肉瘤)/恶性纤维组织细胞瘤和软组织肉瘤。

在一些方面，可以治疗的淋巴瘤包括艾滋病相关的、非霍奇金氏(non-Hodgkin's)、霍奇金氏、T细胞、T细胞白血病/淋巴瘤、非洲(African)、B细胞、B细胞单核细胞样、牛恶性、伯基特氏(Burkitt's)、中心细胞、皮肤淋巴瘤、弥漫性、弥漫性、大细胞、弥漫性、混合的小细胞和大细胞、弥漫性、小分裂细胞、滤泡性、滤泡性中心细胞、滤泡性、混合的小分裂细胞和大细胞、滤泡性、主要的大细胞、滤泡性、主要的小分裂细胞、巨滤泡性、巨滤泡性的、肉芽肿性、组织细胞性、大细胞、免疫母细胞性、大分裂细胞的、大非分裂细胞、伦纳特式(Lennert's)、淋巴母细胞、淋巴细胞、中间；淋巴细胞、中间分化、浆细胞样；低分化淋巴细胞、小淋巴细胞、高分化淋巴细胞、牛淋巴瘤；MALT、套细胞、套区、边缘区、地中海淋巴瘤混合淋巴细胞-组织细胞、结节性、浆细胞样、多形性、原发性中枢神经系统、原发性渗出、小b细胞、小分裂细胞、小非分裂细胞、T细胞淋巴瘤；卷曲T细胞、皮肤t细胞、小淋巴细胞T细胞、未定义淋巴瘤、u细胞、未分化、与艾滋病(aids)相关的、中枢神经系统、皮肤T细胞、渗出(基于体腔)、胸腺淋巴瘤和皮肤T细胞淋巴瘤。

在一些方面，可以治疗的白血病和其他血细胞恶性肿瘤包括急性淋巴母细胞性、急性髓样、淋巴细胞性、慢性髓性、毛细胞性、淋巴母细胞性、髓样、淋巴细胞性、髓性、白血病、毛细胞、T细胞、单核细胞性、髓细胞性、粒细胞性、gross、手镜细胞、嗜碱性、血液母细胞性、组织细胞性、白细胞减少性、淋巴性、席林氏(Schilling's)、干细胞、髓单核细胞性、前淋巴细胞性、微髓母细胞性、巨核母细胞性、巨核细胞性、里德细胞(Rieder cell)、牛、白细胞缺乏(aleukemic)、肥大细胞、髓细胞性、浆细胞、亚白血病、多发性骨髓瘤、非淋巴细胞性和慢性粒细胞性白血病。

在一些方面，可以治疗的脑和中枢神经系统(CNS)癌症和肿瘤包括星形细胞瘤(包括小脑和脑)、胶质瘤(包括恶性胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑干胶质瘤、视觉通路和下丘脑胶质瘤)、脑肿瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorialprimitive neuroectodermal tumors)、原发性中枢神经系统淋巴瘤、颅外生殖细胞瘤、骨髓增生异常综合征、少突胶质细胞瘤、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、髓性白血病、髓样白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生性疾病、神经母细胞瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、中枢神经系统淋巴瘤、内源性脑肿瘤、星形细胞性脑肿瘤和在中枢神经系统中的转移性肿瘤细胞侵袭。

在一些方面，可以治疗的胃肠癌包括肝外胆管癌、结肠癌、结肠和直肠癌、结肠直肠癌、胆囊癌、胃(胃部的)癌、胃肠类肿瘤、胃肠类肿瘤、胃肠间质瘤、膀胱癌、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、前列腺癌直肠癌、唾液腺癌、小肠癌、结肠癌和与结肠直肠肿瘤相关的息肉。

在一些方面，可以治疗的骨癌包括骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、骨髓癌、骨转移、骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤以及骨瘤和骨肉瘤。

在一些方面，可以治疗的乳腺癌包括小细胞癌和导管癌。

在一些方面，可以治疗的肺癌和呼吸系统癌包括支气管腺瘤/类癌、食道癌、食道癌、下咽癌、喉癌、下咽癌、肺类癌肿瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺的小细胞癌、间皮瘤、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、鼻咽癌、口腔癌、口腔癌和唇癌、口咽癌；副鼻窦和鼻腔癌以及胸膜肺母细胞瘤。

在一些方面，可以治疗的泌尿和生殖道癌症包括宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢上皮癌、性腺外生殖细胞肿瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、妊娠滋养母细胞肿瘤、脾脏、肾癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、阴茎癌、肾细胞癌(包括恶性肿瘤)、肾细胞癌、肾盂和输尿管(移行细胞癌)、肾盂和输尿管的移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、睾丸癌、输尿管和肾盂、移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、卵巢癌、原发性腹膜上皮肿瘤、宫颈癌、子宫癌和卵巢滤泡中的实体肿瘤)、浅表性膀胱肿瘤、膀胱浸润性移行细胞癌和肌肉浸润性膀胱癌。

在一些方面，可以治疗的皮肤癌和黑色素瘤包括皮肤t细胞淋巴瘤、眼内黑色素瘤、人皮肤角质形成细胞的肿瘤进展、基底细胞癌和鳞状细胞癌。可以靶向的肝癌包括肝外胆管癌和肝细胞癌。可以靶向的眼癌包括眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤和眼内黑色素瘤。可以靶向的激素癌包括：甲状旁腺癌、松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体瘤、胸腺瘤和胸腺癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、肾上腺皮质癌和产生ACTH的肿瘤。

在一些方面，可以治疗的其他癌症包括晚期癌症、与AIDS有关的、肛门癌、肾上腺、皮质的、再生障碍性贫血、苯胺、槟榔状或槟榔脸颊、脑状、煤烟癌(chimney-sweeps)、烟管(clay pipe)、胶质、接触性、囊性、树突状、配偶癌、管道、染工癌(dye workers)、脑样、铠甲状癌、子宫内膜、内皮、上皮、腺的、原位癌、炕癌(kang)、热炕癌(kangri)、潜伏性、髓样、黑色素性、纺棉工癌(mule-spinners')、非小细胞肺、隐匿性癌、石蜡、沥青工人癌(pitchworkers')、瘢痕、血吸虫性膀胱、硬癌(scirrhous)、淋巴结、小细胞肺、软、烟灰、梭形细胞、沼泽、焦油、管状癌、类癌(胃肠道和支气管)卡斯尔曼(Castleman's)病慢性骨髓增生性疾病、腱鞘透明细胞肉瘤、尤文氏(Ewing's)肿瘤家族、头颈部癌、唇癌和口腔癌、沃尔登斯特伦(Waldenstrom)巨球蛋白血症、具有隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、蕈样肉芽肿、嗜铬细胞瘤、sezary综合征、幕上原始神经外胚层肿瘤、原发部位未知、腹膜积液、恶性胸腔积液、滋养细胞肿瘤和血管外皮细胞瘤。

在一些方面，可以治疗的癌症是其中表达IL-13Rα2的任何一种先前的癌症。在一些方面，IL-13Rα2在癌细胞的细胞外表面上表达。在一些方面，癌症是多形性胶质母细胞瘤。

在一些方面，可以治疗的癌症是其中表达HER2的任何一种先前的癌症。在一些方面，HER2在癌细胞的细胞外表面上表达。在一些方面，癌症是多形性胶质母细胞瘤。

除了癌症之外，目前公开的组合物、用途和方法可以治疗软脑膜疾病。软脑膜疾病(LMD；也称为软脑膜转移瘤或癌性脑膜炎)是实体瘤晚期癌症的一种罕见但通常常具有破坏性的并发症，最常见的是肺癌、乳腺癌和黑色素瘤(以及其他疾病，例如脑癌)。由于颅脊髓轴的多个区域同时受累，患者可表现出广泛的体征和症状。诊断通常需要高度怀疑并通过神经影像学和脑脊液(CSF)分析得到证实。LMD患者有复杂的需求并有迅速恶化的风险。患者通常需要多学科护理以实现最佳的症状控制和生活质量。除了多灶性神经系统体征和症状外，患者还可能出现脑积水、癫痫发作和下丘脑-垂体轴功能障碍。

因此，在另一方面，本公开提供了LMD的治疗，包括给患有GBM的对象施用(i)表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群，和(ii)溶瘤病毒。在一些实施方案中，同时施用表达CAR的细胞群和溶瘤病毒。在一些实施方案中，按顺序施用表达CAR的细胞群和溶瘤病毒。在一些实施方案中，首先施用表达CAR的细胞群，然后施用溶瘤病毒。在一些实施方案中，首先施用溶瘤病毒，然后施用表达CAR的细胞群。在一些实施方案中，对象先前已经经历了移除原发性GBM肿瘤和/或转移性肿瘤的手术。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群包含T细胞，例如中枢记忆T细胞。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群包含NK细胞。在一些实施方案中，CAR包含结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR可以选择性地结合IL-13Rα2，例如，结合结构域可以包含SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，间隔区结构域包含IgG4 Fc结构域(例如，包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的IgG4Fc结构域)。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD4跨膜结构域(例如，包含MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF(SEQ ID NO：6)的TM结构域)。在一些实施方案中，跨膜结构域包含CD8跨膜结构域(例如，包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO：11)、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY(SEQ ID NO：12)或IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ IDNO：13)的TM结构域)。在一些实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域(例如，包含SEQ ID NO：7的共刺激结构域)。在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14。在一些实施方案中，溶瘤病毒是基因工程的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。在一些实施方案中，溶瘤病毒具有复制能力。在一些实施方案中，从溶瘤病毒的基因组中删除ICP34.5基因，并将编码人巨细胞病毒(HCMV)IRS1基因的基因引入溶瘤病毒的基因组。在一些实施方案中，溶瘤病毒是C134。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群是中枢记忆T细胞，并且CAR包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14，并且溶瘤病毒是C134。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群和溶瘤病毒通过相同的施用途径施用。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群和溶瘤病毒通过不同的施用途径施用。在一些实施方案中，施用途径选自脑室内、肿瘤内、鞘内和进入切除的肿瘤腔。在一些实施方案中，表达CAR的细胞群和溶瘤病毒被直接施用到对象的中枢神经系统(CNS)中。

本技术不限于本申请中描述的特定方面，其旨在作为本技术的各个方面的单独说明。在不脱离其精神和范围的情况下对本技术进行许多修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外，本技术范围内的功能等效的方法和装置对于本领域技术人员来说从前面的描述中将是显而易见的。这种修改和变化旨在落入本技术的范围内。应当理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不旨在限制。

实施例

实施例1-U87无胸腺小鼠模型中的CAR-T处理

在一些方面，使用了利用无胸腺裸鼠的异种移植模型。无胸腺裸鼠表现出胸腺发育异常，导致严重的T细胞功能障碍；然而，小鼠仍然具有先天免疫系统成分(中性粒细胞和树突状细胞(DC)、NK细胞)和B细胞。参见Goldman et al.1998.Br J Haematol,103(2):335-342。用于制造人类异种移植物的最古老和最广泛的动物之一是移植人类肿瘤细胞的无胸腺裸鼠。该模型准确地反映了肿瘤自然发展所介导的复杂性，包括基因组异质性、肿瘤结构和微环境因素，尤其是在肿瘤原位移植的情况下。参见Wang et al.2017.Int JCancer,140(3):662-673和Hoffman 2015.Nat Rev Cancer,15(8):451-452。造血和淋巴组织肿瘤的异种移植小鼠模型被积极用于评估和开发针对各种肿瘤的新CAR T细胞疗法。参见Teng et al.2019.J Immunother,42(2):33-42和Zah et al.2017.Cancer ImmunolRes,4(6):498-508。

U87是一种常用于脑癌研究的人原发胶质母细胞瘤细胞系。此外，U87细胞系对溶瘤性HSV感染具有很高的耐受性。参见Ghonime et al.2018.Transl Oncol,11(1):86-93和Shah etal.2007.Gene Ther,14(13):1045-1054。

使用了利用无胸腺裸鼠的异种移植小鼠模型，其中将包含U87人原代胶质母细胞瘤细胞系的肿瘤原位移植到小鼠中。移植后大约20天后，CAR-T细胞被施用于小鼠。

本公开的CAR-T包括那些选择性结合IL-13Rα2或HER2的CAR-T，其被颅内注射到U87无胸腺小鼠中，每次实验的剂量包含0.5×10⁶至1.0×10⁶个CAR-T细胞。

每个实验包含用于每个取样时间点的三只雌性和三只雄性小鼠。时间点为CAR-T施用后第0天(D0)、第1天(D1)、第4天(D4)、第8天(D8)和第14天(D14)。每次取样收集小鼠大脑和血液。将大脑切片，并利用了抗体(例如抗CD8、抗IL-13Rα2或抗HER2、抗PD1)以及与各种荧光分子偶联的相应二抗对切片进行免疫组织化学和免疫荧光分析。

在每个时间点肿瘤内和外周评估CAR-T的持久性。此外，相对于植入时的肿瘤大小来评估肿瘤的大小。

实施例2-U87无胸腺小鼠模型中的溶瘤病毒

将本公开的溶瘤病毒脑内施用到包含含有U87人原代胶质母细胞瘤细胞的移植肿瘤的U87无胸腺小鼠中。移植后大约20天后，CAR-T细胞被施用于小鼠。

每个实验包含用于每个取样时间点的三只雌性和三只雄性小鼠。时间点为肿瘤植入后第0天(D0)、第1天(D1)、第4天(D4)、第8天(D8)和第14天(D14)。每次取样收集小鼠大脑和血液。评估每个时间点的小鼠从肿瘤中恢复的溶瘤病毒和相对于植入时肿瘤大小的肿瘤大小。

通过有限稀释试验和TAQMAN定量PCR以测量体内病毒恢复。对于肿瘤恢复研究，在SCID小鼠中诱导U87-MG肿瘤，并用C134重组病毒处理。在接种后的第1、2、4和8天，处死来自每个治疗组的三只动物，回收它们的大脑，称重，冷冻解冻，通过匀浆机械破坏，并对样品进行超声处理，然后在使用Qiagen biorobot和Qiagen EZ1组织试剂盒提取DNA后，通过限制性稀释斑块试验或TAQMAN定量PCR对回收的病毒进行定量。

计算每个病毒和测试时间点的平均回收病毒和标准偏差。类似的方法用于非恶性CNS的体内恢复研究。给5周龄CBA/J小鼠群注射相等剂量(5×10⁵PFU)的C130或C101。第2、4、6和8天，处死动物，回收大脑，并使用有限稀释斑块试验测量传染性病毒。

实施例3-U87无胸腺小鼠模型中的溶瘤病毒-CAR-T联合治疗在这项研究中，有四组小鼠：(1)仅肿瘤标记，(2)仅CAR-T(CAR-T的最佳剂量)，(3)仅C134溶瘤病毒(1×10⁶pfu)，和(4)溶瘤病毒C134，随后是CAR-T。

将包含U87人原代胶质母细胞瘤细胞的肿瘤移植到无胸腺小鼠中。在稍后的时间点，给小鼠注射(1)仅CAR-T，(2)仅溶瘤病毒，或(3)溶瘤病毒，随后注射CAR-T。

每个实验包含每组和每个取样时间点的三只雌性和三只雄性小鼠。时间点为C134溶瘤病毒和/或CAR-T施用后的第0天(D0)、第3天(D3)、第5天(D5)和第7天(D7)。对于组合C134溶瘤病毒和CAR-T样品，在施用溶瘤病毒和CAR-T之间使用不同的时间点。每次取样包含与未施用溶瘤病毒和/或CAR-T的阴性对照相比的通过活体成像对肿瘤的评估。

实施例4-U87无胸腺小鼠模型中溶瘤病毒和CAR-T组合治疗3个月在这项研究中，有四组小鼠：(1)仅肿瘤标记，(2)仅CAR-T，(3)仅C134溶瘤病毒(1×10⁶pfu)，和(4)溶瘤病毒C134，随后是CAR-T。

将包含U87人原代胶质母细胞瘤细胞的肿瘤移植到无胸腺小鼠中。在稍后的时间点，给小鼠注射(1)仅CAR-T，(2)仅溶瘤病毒，或(3)溶瘤病毒，然后注射CAR-T。

每个实验包括每组和每个取样时间点的五只雌性和五只雄性小鼠。时间点为C134溶瘤病毒和/或CAR-T施用后的第0天(D0)、第3天(D3)、第5天(D5)和第7天(D7)。对于组合C134溶瘤病毒和CAR-T样品，在施用溶瘤病毒和CAR-T之间使用不同的时间点。

每次取样都包含对(1)CAR-T持久性、(2)C134持久性、(3)存在的促炎细胞因子、(4)通过活体成像的肿瘤、(5)存活率和(6)发病率的评估。此外，将进行日常临床观察，包括体重测量。对于每次取样，在处死后采集以下中每一种：全血/血清、脑、脑脊液、肝和脾。图1中描绘了施用和检测的图形表示。应当注意，在一些实施方案中，可以切换CAR T细胞和OV注射的施用顺序(即，在D4的CAR T注射和在D7的OV注射)。

*****

本文说明性地描述的方法可以在没有任何未在本文中具体公开的元素、限制或制约的情况下适当地实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被扩大而不受限制地解读。此外，本文采用的术语和表达方式已经被用作描述术语而不是限制术语，并且在使用这些术语和表达方式时无意排除所示和描述的特征的任何等效物或其部分。应当认识到，在所要求保护的公开的范围内，可以具有各种修改。因此，应当理解，尽管本公开已经通过优选方面和任选的特征具体公开，但是本领域技术人员可以求助于在此公开的其中体现的公开的修改和变化，并且这种修改和变化被视为在本公开的范围内。

本公开在本文中已经被广泛地和一般地描述。落入属公开中的每个较窄的种和亚属群也构成方法的一部分。这包括具有从该属中移除任何主题的但书或否定限制的方法的一般性描述，而不管本文是否具体叙述了移除的材料。本技术不限于本申请中描述的特定方面，其旨在作为本技术的各个方面的单独说明。在不脱离其精神和范围的情况下对本技术进行许多修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。除了本文列举的那些之外，本技术范围内的功能等效的方法和装置对于本领域技术人员来说从前面的描述中将是显而易见的。这种修改和变化旨在落入本技术的范围内。应当理解，本技术不限于特定的方法、试剂、化合物组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应理解，这里使用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不旨在限制。

本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利出版物和专利申请都通过引用的方式整体并入，用于所有目的。

序列表

<110> 野马生物股份有限公司（Mustang Bio, Inc.）

<120> 包含靶向癌症的CAR-T细胞的组合疗法及使用其治疗癌症的方法

<130> 118180-0600

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CAR结合结构域

<400> 1

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

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85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

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<210> 2

<211> 129

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4 Fc间隔结构域

<400> 2

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1 5 10 15

Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

20 25 30

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35 40 45

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100 105 110

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

115 120 125

Lys

<210> 3

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4 Fc间隔结构域

<400> 3

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Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

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Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

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225

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4 Fc间隔结构域

<400> 4

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1 5 10 15

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

20 25 30

Val Asp Gly Val Glu Val His Gln Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

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Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

50 55 60

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

65 70 75 80

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

85 90 95

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

100 105 110

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

115 120 125

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

130 135 140

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

145 150 155 160

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

165 170 175

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

180 185 190

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

195 200

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG4 Fc间隔结构域

<400> 5

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

100 105

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD4跨膜结构域

<400> 6

Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ile Phe Phe

20

<210> 7

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 4-1BB共刺激结构域

<400> 7

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 8

<211> 520

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 嵌合抗原受体（CAR）

<400> 8

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Tyr Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

115 120 125

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

130 135 140

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

145 150 155 160

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

165 170 175

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

180 185 190

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

195 200 205

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

210 215 220

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

225 230 235 240

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

245 250 255

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

260 265 270

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

275 280 285

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

290 295 300

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

305 310 315 320

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

325 330 335

Leu Ser Leu Gly Lys Met Ala Leu Ile Val Leu Gly Gly Val Ala Gly

340 345 350

Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile Phe Phe Lys Arg Gly Arg Lys

355 360 365

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

370 375 380

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

385 390 395 400

Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

405 410 415

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

420 425 430

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

435 440 445

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

450 455 460

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

465 470 475 480

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

485 490 495

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

500 505 510

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

515 520

<210> 9

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER2 CAR结合结构域

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 10

<211> 229

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 10

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 11

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 12

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 12

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

20

<210> 13

<211> 24

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 14

<211> 652

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HER2-特异性嵌合抗原受体

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile

165 170 175

Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

180 185 190

Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met

195 200 205

Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp

210 215 220

Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

245 250 255

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

260 265 270

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

275 280 285

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

290 295 300

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

305 310 315 320

Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

325 330 335

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

340 345 350

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

355 360 365

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

370 375 380

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

385 390 395 400

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

405 410 415

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

420 425 430

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

435 440 445

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

450 455 460

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

465 470 475 480

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys

485 490 495

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

500 505 510

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

515 520 525

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly Arg Val Lys Phe

530 535 540

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

545 550 555 560

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

565 570 575

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

580 585 590

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

595 600 605

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

610 615 620

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

625 630 635 640

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

645 650

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GMCSFRa 信号肽序列

<400> 16

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 17

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 经修饰的CD19序列

<400> 17

Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Pro Pro Pro Arg

1 5 10 15

Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu

20 25 30

Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln

35 40 45

Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln Gln Leu Thr Trp Ser

50 55 60

Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro

65 70 75 80

Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe

85 90 95

Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro

100 105 110

Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly

115 120 125

Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly

130 135 140

Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly

145 150 155 160

Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu

165 170 175

Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn

180 185 190

Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp

195 200 205

Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser

210 215 220

Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu

225 230 235 240

Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp Val Met Glu Thr Gly

245 250 255

Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys

260 265 270

His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg

275 280 285

Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser

290 295 300

Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu Cys Ser Leu Val Gly

305 310 315 320

Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg Arg Lys Arg

325 330

<210> 18

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A跳跃序列

<400> 18

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr

1 5 10

Claims (30)

1.一种治疗对象的多形性胶质母细胞瘤(GBM)的方法，其包含向患有GBM的对象施用(i)表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞群，和(ii)溶瘤病毒。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达CAR的细胞群和所述溶瘤病毒是同时施用的。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达CAR的细胞群和所述溶瘤病毒是按顺序施用的。

4.根据权利要求3所述的方法，其中首先施用表达CAR的细胞群，然后施用溶瘤病毒。

5.根据权利要求3所述的方法，其中首先施用溶瘤病毒，然后施用表达CAR的细胞群。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述对象先前经历了移除原发性GBM肿瘤和/或转移性肿瘤的手术。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中表达CAR的细胞群包含T细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述T细胞是中枢记忆T细胞。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中表达CAR的细胞群包含NK细胞。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述CAR包含结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ信号传导结构域。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述CAR选择性地结合IL-13Rα2或HER2。

12.根据权利要求10或11中任一项所述的方法，其中所述结合结构域包含GPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKT QRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFN(SEQ ID NO:1)或

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述间隔结构域包含IgG4 Fc结构域。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述IgG4 Fc结构域包含

(i)

ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:10)；

(ii)

ESKYGPPCPPCPGGGSSGGGSGGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSLGK(SEQ ID NO:2)；

(iii)

ESKYGPPCPSCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHQAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:3)；(iv)

PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHQAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:4)；或

(v)

GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:5)。

15.根据权利要求10-14中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域包含CD4跨膜结构域或CD8跨膜结构域。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述CD4跨膜结构域包含MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF(SEQ ID NO：6)或其中所述CD8跨膜结构域包含IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO：11)、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY(SEQ ID NO：12)或IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO：13)。

17.根据权利要求10-16中任一项所述的方法，其中所述共刺激结构域包含4-1BB共刺激结构域。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述4-1BB共刺激结构域包含KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO：7)。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述CAR包含GPVPPSTALRYLIEELVNITQNQKAPLCNGSMVWSINLTAGMYCAALESLINVSGCSAIEKTQRMLSGFCPHKVSAGQFSSLHVRDTKIEVAQFVKDLLLHLKKLFREGRFNESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKMALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:8)；或

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFQSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELGGGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:14)。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中表达CAR的细胞群还表达选择标签。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述选择标签是截短的CD 19序列(CD19t)或截短的表皮生长因子受体序列(EGFRt)，并且任选地，其中所述CD19t或EGFRt通过T2A间隔序列与所述CAR分离。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒是基因工程的1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒具有复制能力。

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中从所述溶瘤病毒的基因组中删除ICP34.5基因，并且将编码人巨细胞病毒(HCMV)IRS1基因的基因引入所述溶瘤病毒的基因组中。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒是C134。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述表达CAR的细胞群是中枢记忆T细胞，并且所述CAR包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14，并且其中所述溶瘤病毒是C134。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中表达CAR的细胞群和溶瘤病毒通过相同的施用途径施用。

28.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中表达CAR的细胞群和溶瘤病毒通过不同的施用途径施用。

29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述施用途径选自脑室内、肿瘤内、鞘内和进入切除的肿瘤腔。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中将表达CAR的细胞群和溶瘤病毒直接施用到对象的中枢神经系统(CNS)中。