KR102568745B1 - 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법 - Google Patents

세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포, 특히 세포외소포체 분비능이 증진된 CAR 발현 세포는 안정성 및/또는 유효성이 개선된 면역항암요법에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법 {Immune cells with enhanced extracellular vesicle secretion and immunotherapy using the same}
본 발명은 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이를 활용한 면역 항암요법에 관한 것이다.
지난 수십년 동안 항암 요법은 꾸준히 변화하고 발전해왔다. 최근들어, 기존 항암 요법의 한계를 뛰어넘기 위해 면역항암요법 (immunotherapy)에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 면역항암요법은 체내 면역세포들의 특성을 이용하여 부작용을 최대한 줄이고 환자의 신체가 암세포와 맞서 싸우도록 면역 반응을 강화하는 치료방법으로, 면역관문억제제 (immune checkpoint inhibitor), 항암 백신 (anticancer vaccine), 항체 치료제 (therapeutic antibodies) 및 면역세포요법 (immune cell therapy) 등으로 구분될 수 있다. 이중, 유전공학 기술의 발전에 따라 면역세포요법에 대한 관심이 급증하고 있다.
면역세포요법은 체내의 면역세포를 추출하여 이를 강화하거나 유전공학적으로 변형시켜 다시 인체에 투입하는 세포치료 방식으로, 입양세포치료제 (adoptive cell transfer; ACT)라 불리기도 한다. 대표적으로 암세포에 대한 세포성 면역을 강화시키는 방법으로 종양 침윤 림프구 (tumor infiltrating lymphocyte; TIL), 키메라 항원 수용체 (chimeric antigen receptor; CAR), T 세포 수용체 (T-cell receptor; TCR) 기술 등이 있다. 특히, CAR를 발현하는 유전자 변형된 T 세포는 혈액 종양 또는 비혈액 종양의 치료를 위한 혁신적인 치료제로 급부상하고 있다.
CAR 발현 유전자 변형 면역세포요법은 신속하고 지속가능한 임상적 반응을 유도할 수 있으나, 다른 한편으로는 특유의 급성 독성(acute toxicities) 문제를 야기할 수 있고, 면역억제 기전(immunosuppressive mechanism)에 취약하다는 점 등이 해결해야 할 과제로 남아 있다.
한편, 세포외소포체는 이중지질막으로 이루어진 수십 nm에서 수백nm 크기를 가진 나노 소포체로 단백질, 지질, 및 유전자 등 생물학적 활성을 가진 물질들로 구성되어 있다. 종래에는 이러한 세포외소포체가 세포에서 분비되는 찌꺼기로 여겨졌으나, 최근에는 세포외소포체들의 임상학적 의미가 대두되면서 다양한 연구가 진행되고 있다. 최근 연구에 따르면, CAR 발현 면역세포에서 분비되는 세포외소포체 (이른바, CAR 엑소좀)는 표면에 CAR를 함유하고 있고, 고농도의 세포독성 물질을 발현하며, 종양 성장을 효과적으로 억제하는 등 종래의 CAR-T 세포가 갖는 장점을 가지고 있으면서도, CAR-T 치료에 비해 상대적으로 안전하고 면역저해에 영향을 받지 않아 CAR-T 세포의 대안적 치료 요법으로 각광받고 있다 (문헌[Fu, Wenyan, et al. "CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity."　Nature communications　10.1 (2019): 1-12.]).
이러한 배경 하에 본 발명자들은 면역세포에서 세포외소포체 분비능을 증대시킬 수 있는 기술을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 강화시킴으로써 면역세포의 세포외소포체 분비능을 현저히 증대시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
국제특허공개 WO 2016/056228
Fu, Wenyan, et al. "CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity."　Nature communications　10.1 (2019): 1-12.
본 발명의 하나의 목적은 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 세포외소포체 분비능이 증진된 CAR 발현 면역세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 발현 유도제를 포함하는, 세포외소포체 분비 증진용 조성물을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명자들은 MAL, CD9 또는 이들의 조합을 면역세포에서 과발현시킬 경우, 면역세포의 세포외소포체 분비능이 현저히 증가한다는 점을 최초로 발견하고, 이를 CAR 발현 세포에 활용함으로써 종래의 면역항암제의 유효성 및 안정성을 개선할 수 있음에 주목하였다. 이에, 본 발명은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 발굴, 이를 이용한 세포외소포체 분비능이 증진된 세포 및 세포외소포체 분비 자극 단백질을 활용한 CAR 발현 세포 등을 제공한다.
1. 세포외소포체 분비 자극 단백질의 발굴 및 이를 이용한 세포외소포체 분비능이 증진된 세포
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화되어 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포이다.
본 발명에서 용어, "세포외소포체 (Extracellular vesicle)"는 세포에 의해 세포 외부 공간으로 배출되는 지질로 구성된 운반체를 의미하며 미세운반체 (microvesicle), 엑소좀 등을 포함하는 넓은 개념이다. 본 발명에서 세포외소포체 분비 자극 단백질은 본래 세포와 비교하여 그 세포에서 활성이 강화될 경우 세포외소포체 분비능을 증진시킬 수 있는 단백질을 의미한다. 본 발명에 있어서, 특히 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질은 MAL (myelin and lymphocyte protein) 및/또는 CD9을 말한다.
본 발명에서, MAL은 막 관통 형태가 4 번 반복되는 (tetraspanning) 막 단백질로서, 신경계에서 세포의 미엘린에 위치하고 미엘린 생합성 및 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다. MAL은 면역세포 (T 세포, NK 세포 등)와 신경세포 (올리고덴드로사이트 및 슈완 세포 등)에서 세포 의존적으로 발현양상이 상이한 것으로 알려져있다.
본 발명에서, CD9은 테트라스파닌 (tetraspanin) 패밀리에 속하는 막 단백질로서, 접착 (adhesion), 세포 이동성 (motility), 막 융합 (membrane fusion), 신호전달, 단백질 이동 (trafficking)과 같은 다양한 생물학적 과정에 관여하는 것으로 알려져있다.
본 발명에서는 놀랍게도, MAL과 CD9의 동시 발현으로 시너지한 효과를 확인하였다. 기능적으로, CD9이 세포외소포체를 생성하는 테트라스파닌이 다수 함유된 마이크로도메인을 형성하는데 특화된 단백질이라면, MAL은 테트라스파닌 마이크로 도메인이 세포밖 소포의 형태로 세포 밖으로 배출되도록 돕는 막 변형 단백질의 기능이 강하다. 따라서 기능적으로 일부 상이한 CD9과 MAL 단백질을 함께 발현시켰을 때 시너지를 내면서 세포외소포체의 분비를 촉진한 것으로 생각된다.
MAL 및 CD9의 아미노산 서열 정보는 공지된 문헌이나 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/) 등의 데이터베이스를 검색하여 적절히 입수할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 MAL은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성될 수 있고, CD9은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 MAL 단백질을 코딩하는 핵산 및/또는 CD9 단백질을 코딩하는 핵산을 과발현하는 렌티바이러스 벡터를 제작하였으며 이를 일차 T 세포에 형질 도입하여 MAL 및/또는 CD9의 활성이 강화된 면역세포주를 수득하였다 (실시예 1 및 실시예 2). 그 다음 상기 면역세포의 배양액에 생성된 세포외소포체의 개수를 확인한 결과, MAL 또는 CD9의 활성이 강화된 세포에서는 대조군 대비 세포외소포체 개수가 최소 2 배 이상 상승하였고, MAL과 CD9를 동시에 과발현한 면역세포에서는 대조군 대비 약 6 배 이상의 세포외소포체 분비능 증진 효과를 확인하였다 (실시예 3; 도 6 내지 8). 위 결과로부터, 면역세포에서 MAL 및/또는 CD9의 활성을 강화할 경우 세포외소포체 분비능이 증가한다는 것을 알 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, 단백질 활성의 "강화"는 세포가 보유하고 있는 단백질의 활성 상태를 향상시키는 것을 의미한다. 본 발명의 핵심은 면역세포에서 MAL 및/또는 CD9의 활성을 강화시킴으로써 세포외소포체 분비능을 증가시킬 수 있다는 점에 있으므로, 본 발명에서 단백질의 활성 강화는 목적 단백질의 활성을 비변이 세포 보다 강화시킬 수 있는 한, 그 방법에 있어서 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 활성의 강화는 i) 각 단백질을 코딩하는 핵산의 카피수 증가, ii) 상기 핵산의 발현이 증가하도록 발현 조절 서열의 변형, iii) 각 단백질의 활성이 강화되도록 염색체 상의 상기 핵산 서열의 변형 및 iv) 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는 각 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 핵산을 염색체에 삽입/통합시키는 방법, 상기 핵산을 벡터 시스템에 도입하여 세포에 도입하는 방법, 각 단백질을 코딩하는 염기서열의 상류에 개량된 활성을 나타내는 프로모터를 도입하거나 프로모터에 변이를 준 각 단백질을 도입하는 방법, 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법 및 각 단백질을 코딩하는 염기서열의 변이체를 도입하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의하여 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
구체적인 일례로, 상기 활성의 강화는 재조합 발현 벡터에 상대적으로 강한 발현을 유도하는 프로모터와 작동가능하게 연결된 형태로 표적 단백질을 코딩하는 서열을 배치함으로써 수행될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 외래 핵산을 숙주 세포로 도입하고, 상기 숙주 세포를 형질전환하며, 도입된 핵산의 발현을 촉진할 수 있는 비히클로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 용어와 동일한 의미로 사용된다. 구체적으로 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에 형질전환되어 MAL 및 CD9을 공동 발현하는 발현 벡터일 수 있고, 또는 MAL과 CD9을 각각 발현하는 별도의 발현 벡터일 수 있다. 예컨대, 상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 벡터, 또는 인공 염색체 벡터일 수 있다.
본 발명에서, 플라스미드 벡터는 외래 DNA를 용이하게 수용할 수 있고, 숙주 세포에 용이하게 도입될 수 있는 DNA 분자로서 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 의미로 사용된다. 전형적인 플라스미드 벡터는 숙주세포 당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, 플라스미드 벡터로 형질전환 된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 선별 표지 및 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 포함한다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다.
본 발명에서, 바이러스 벡터는 DNA 바이러스 벡터 또는 RNA 바이러스 벡터일 수 있고, 박테리오파지, 동물 바이러스 또는 식물 바이러스일 수 있다. 예컨대, 상기 바이러스 벡터는 백시니아바이러스 (vacciniavirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 아데노 관련 바이러스 (adeno-associated virus; AAV), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스 (restovirus), 헤르페스 바이러스 (herpesvirus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 재조합 벡터는 세포외소포체 분비 자극 단백질을 코딩하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 특정 핵산이 그 기능을 발휘할 수 있도록 다른 핵산에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 상기 프로모터에 의해 해당 유전자가 mRNA로 전사되어 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 있음을 의미한다.
상기 재조합 벡터 내 유전자 서열은 코돈의 축퇴성 (degeneracy)을 고려하여, 코딩 영역으로부터 발현되는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩 영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 재조합 벡터 내에 포함되는 핵산은 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 이상 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 MAL 및/또는 CD9을 코딩하는 핵산을 발현할 수 있는 이상, 임의의 핵산을 더 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터가 MAL 및 CD9을 코딩하는 핵산을 모두 포함할 경우, MAL을 코딩하는 핵산과 CD9을 코딩하는 핵산 사이에 자기 절단형 펩티드 (예컨대, 2A 펩티드), 또는 IRES (internal　ribozyme　entry　site)를 코딩하는 서열을 더 포함하여 하나의 벡터에서 2 개의 단백질을 모두 발현하도록 할 수 있다. 또는 하나의 벡터에서 각기 다른, 또는 동일하지만 별개의 프로모터 하에서 2 개의 단백질이 작동가능하게 연결되거나, 2 개의 각기 다른 벡터에 의해 각 단백질이 발현되는 형태일 수 있다. 본 발명의 목적에 따라 면역세포에서 MAL 및/또는 CD9 단백질의 활성을 비변이 세포에 비해 강화시킬 수 있는 한 구체적인 적용 형태는 특별히 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 상기 재조합 벡터는, MAL을 코딩하는 핵산과 CD9을 코딩하는 핵산을 서로 연결하는 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 서열을 더 포함할 수 있으며, 상기 자기 절단형 펩티드는 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대 2A 펩티드일 수 있다. 2A 펩티드 (또는 2A 자기 절단형 펩티드)는 세포 내에서 단백질의 번역 동안 리보좀 스킵 (ribosomal skipping)을 유도할 수 있는 18 내지 22 아미노산 길이의 펩티드로 당업계에 공지되어 있으며, 대표적으로 T2A, P2A, E2A, F2A 등을 들 수 있다. 2A 펩티드를 통해 그 전후에 삽입된 핵산은 세포 내에서 서로 독립적으로 발현될 수 있다. 구체적인 일례로, 상기 재조합 벡터는 5'에서 3' 방향으로 CD9-자기 절단형 펩티드-MAL의 순서로 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서, 자기 절단형 펩티드의 일례로 P2A 펩티드 (서열번호 3)를 사용한 재조합 벡터를 제작하였으며 (실시예 1), 통상의 기술자는 본 명세서를 참조할 경우 당업계에 속하는 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 핵산이 MAL9 및 CD9을 코딩하는 핵산을 서로 연결하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터는 MAL, CD9 및 자기절단형 펩티드를 코딩하는 핵산들 외에도 당업계에 공지된 임의의 링커 펩티드 (예컨대, 서열번호 4의 아미노산 서열)를 추가로 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포는 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 매크로파지, 수지상 세포, NK 세포, B 세포 및 T 세포로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포는 T 세포이며, 인간 유래 또는 비인간 포유동물 유래의 T 세포일 수 있다. 상기 T 세포는 혈액, 골수액 등의 체액이나, 비장, 흉선, 림프절 등의 조직, 혹은 원발 종양, 전이성 종양, 암성 복수 등의 암 조직에 침윤하는 면역 세포로부터 단리, 정제하여 얻을 수 있다. 이러한 T 세포로서는, αβT 세포, γδT 세포, CD8＋T 세포, CD4＋T 세포, 종양 침윤 T 세포, 메모리 T 세포, 나이브 T 세포, NKT 세포 등을 들 수 있으며, 해당 기술분야에서 통상적으로 T 세포의 범주에 들어가는 한 특별히 그 종류가 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에서, 면역세포의 일례로 인간 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell;　PBMC)에 포함된 T 세포를 사용하였으며 (실시예 2), 통상의 기술자는 본 명세서를 참조할 경우 T 세포 외에도 다른 적합한 면역세포 내에 MAL 및/또는 CD9을 발현시킴으로써 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포를 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, MAL 및 CD9의 공동 발현 유도제를 포함하는 세포외소포체 분비 증진용 조성물이다.
상기 MAL 및 CD9의 공동 발현 유도제는 처리되는 숙주세포 내에서 MAL 및 CD9을 공동으로 과발현시킬 수 있는 당업계에 알려진 적합한 물리적, 화학적 및/또는 생물학적 수단을 의미한다. 구체적으로, 상기 공동 발현 유도제는 MAL 및 CD9 단백질을 세포 내에서 공동으로 과발현시킬 수 있는 단백질 발현용 재조합 벡터, siRNA, miRNA, mRNA, 세포투과성 펩티드 융합 단백질, 리포좀 등을 들 수 있으며, MAL 및 CD9의 공동 과발현을 유도할 수 있는 상류 유전자에 대한 발현 조절 수단을 포함한다.
일례로, 상기 MAL 및 CD9의 공동 발현 유도제는 (i) MAL을 코딩하는 핵산 및 CD9을 코딩하는 핵산을 포함하는 하나의 재조합 벡터일 수 있고, 또는 (ii) MAL을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 CD9을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 각기 다른 벡터에 포함된 형태로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
통상의 기술자는 본 명세서를 통해 본 발명이 속한 기술 분야에 알려진 적절한 방법을 참조하여 MAL 및 CD9 공동 발현 유도제를 사용하여 면역세포의 세포외소포체 분비 증진 효과를 달성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, (i) 시험관 내 (in vitro 또는 ex vivo)에서 면역세포에 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 비변이 세포에 비해 강화시키는 단계; 및 (ii) 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 강화된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포의 제조방법이다. 세포외소포체 분비 자극 단백질, 활성 강화, 면역세포 등은 앞서 설명한 바와 같다.
2. 세포외소포체 분비 자극 단백질을 활용한 키메라 항원 수용체 (CAR) 발현 세포의 제조 및 이의 용도
본 발명자들은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 이용한 항암 면역 요법에서, 보다 뛰어난 면역 유도 효과나 항종양 활성을 달성하는 것을 목적으로 하여 개량을 시도했다. 그 과정에서, 상술한 세포외소포체 분비 자극 인자인 MAL 및 CD9의 기능에 주목하여, CAR와 함께 상기 세포외소포체 분비 자극 인자를 발현하는 CAR 발현 세포를 착안하게 되었다. 구체적으로, CAR와 함께 상기 세포외소포체 분비 자극 인자를 발현하는 벡터를 T 세포에 도입하여, 종래의 CAR 발현 세포보다 뛰어난 면역 유도 효과나 항종양 활성을 갖는 세포를 제작할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 상술한 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화된 면역세포에 추가로 키메라 항원 수용체 (CAR)의 활성이 도입된, 면역세포이다. 본 발명에서 용어 "도입"은 세포에 활성이 존재하지 않던 것을 외부 조작에 의해 활성을 나타내도록 하는 모든 형태의 행위를 의미한다.
본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 세포외소포체 분비능이 증가된 면역세포에 추가로 CAR의 활성을 도입하기 위해 당업계에 공지된 어떠한 방법도 사용될 수 있으며, 그 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다. 일례로, 면역세포에 CAR 활성을 도입할 수 있는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터를 사용할 수 있으며, CAR는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성 강화 수단과는 별도의 단계로 면역세포에 도입될 수 있고, 혹은 (i) 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor; CAR)를 코딩하는 핵산; 및 (ii) 세포외소포체 분비 자극 단백질을 코딩하는 핵산을 모두 포함하는 CAR 발현 벡터의 형태로 도입될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 CAR 발현 벡터는 상술한 재조합 벡터 형태일 수 있다. 예컨대, 상기 CAR 발현 벡터는 프로모터 서열의 하류에 작동 가능하게 CAR를 코딩하는 핵산 및 세포외소포체 분비 자극 단백질을 코딩하는 핵산을 배치함으로써 각각의 핵산을 효율적으로 전사 및 발현시킬 수 있다. 추가적으로, GFP 등 마커 유전자를 더 포함시켜 CAR를 코딩하는 핵산의 발현을 용이하게 확인할 수 있다.
상기 CAR를 코딩하는 핵산은 CAR를 구성하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이면 특별히 제한되지 않고, 암세포의 세포 표면 항원을 인식하는 타겟 결합 도메인, 세포막 관통 도메인, 및 면역세포(예컨대, T 세포)의 활성화를 유도하는 신호전달 도메인의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 상기 CAR는 (i-1) 타겟 결합 도메인, (i-2) 세포막 관통 도메인, 및 (i-3) 신호전달 도메인을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (i-1) 타겟 결합 도메인은 예컨대 단일사슬 항체이며, 구체적으로 단일 클론 항체의 항원 결합 부위에 유래하는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역 (scFv)으로 이루어지고, 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 사이에 링커 펩티드가 위치하는 올리고 또는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 타겟 결합 도메인이 인식하는 암세포의 세포 표면 항원은 암세포 및 그 전구 세포에 특이적으로 발현하는 생체 분자, 세포의 암화에 의해 새롭게 발현이 확인되게 된 생체 분자, 혹은 암세포에서 정상세포에 비해 발현 레벨이 증가하고 있는 생체 분자일 수도 있으며, 예컨대 AFP, PSMA, PD-L1, CD20, EGFR, FITC, CD19, CD22, CD33, PSMA, GD2, EGFR 변이체, ROR1, ROR2, c-Met, HER2, CEA, 메소텔린 (mesothelin), GM2, CD7, CD10, CD30, CD34, CD38, CD41, CD44, CD70, CD74, CD80/86,Ny-ESO-1, MUC16, MUC1, cMet, DR5, MUC1, MMP, MG7, DLL-3, EGFRvIII, EPCAM, EpHA2, ErbB ligands, FAP, FR-alpha, Melan A, MAGE-A1/A3/A4, FAP, FR-alpha, LMP1, GD2, IL-12Ra2, HER2, GPC3, gp100, CD117, CD171, CD123,　CD133, CD171, MUC16, MUC1, CS1(CD319), IL-13 Ra2, BCMA, LewisY, IgG kappa　chain, 폴산 수용체-알파, PSCA, EpCAM, NKG2A, NKG2B, NKG2D, VEGFR2, AXL 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 당업자는 표적으로 하는 암종에 따라서 적절한 타겟 결합 도메인을 선정하고 이를 본 발명에 적용할 수 있다.
(i-2) 세포막 관통 도메인은 CAR 발현 세포에서 CAR가 세포막에 고정되도록 하는 세포막 관통 폴리펩티드로서, CD8, T 세포 수용체의 α, β 사슬 CD28, CD3ε CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, GITR 유래의 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 들 수 있고, 인간 CD8 세포막 관통 영역의 폴리펩티드를 바람직하게 들 수 있다. 이러한 세포막 관통 영역에 의해, CAR이 T 세포의 세포막에 고정된다. 상기 세포막 관통 영역에는, 임의의 올리고 펩티드 또는 폴리펩티드로 이루어지고, 길이가 1~100 아미노산, 바람직하게는 10~70 아미노산의 힌지 영역을 포함할 수도 있다. 힌지 영역으로서는, 인간 CD8의 힌지 영역을 들 수 있다.
상기 (i-3) 신호전달 도메인은 CAR 발현 세포가 (i-1) 타겟 결합 도메인이 외부 타겟을 인식하였을 때에 세포 내로 신호 전달 기능을 담당하는 도메인이다. 예컨대, 상기 신호전달 도메인은 타겟 결합 도메인이 암세포의 세포 표면 항원을 인식했을 때에, 세포 내에 신호전달 기능을 수행하며, CD28, 4-1BB(CD137), GITR, CD27, OX40, HVEM, CD3ζ, Fc　Receptor-associated　γ chain의 세포 내 영역의 폴리펩티드에서 선택되는 적어도 1종 또는 2종 이상을 포함할 수 있고, 보다 구체적으로 CD28, 4-1BB, 및 CD3ζ의 3종의 세포 내 영역의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
상기 신호전달 도메인 내 각각의 세부 영역은 2~10 아미노산으로 이루어지는 올리고 펩티드 링커 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결되어 있을 수도 있고, 이러한 링커 서열로서 글리신-세린 연속 서열을 들 수 있다.
또한, 상술한 (i-1) 타겟 결합 도메인 (i-2) 세포막 관통 도메인을 코딩하는 핵산, 및 (i-3) 신호전달 도메인 사이에는, 임의의 올리고 펩티드 또는 폴리펩티드로 이루어지는 스페이서 영역을 설치할 수도 있다. 스페이서 영역의 길이는 1~100 아미노산, 예컨대 10~50 아미노산일 수 있고 예컨대 글리신-세린 연속 서열일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (i) 시험관 내 (in vitro 또는 ex vivo)에서 면역세포에 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 비변이 세포에 비해 강화시키고 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산을 도입하는 단계; 및 (ii) 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 강화된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 세포외소포체 분비능이 증진된 면역 세포의 제조방법이다. 면역세포에 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 강화시키는 것과 CAR 활성을 도입하는 것은 상술한 바와 같다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화되고, (b) 키메라 항원 수용체 (CAR)의 활성이 도입된 면역세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 세포외소포체 분비 자극 단백질, CAR 등에 대해서는 상술한 바와 같다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 CAR 발현 세포를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 암은 악성 종양 또는 신생물로도 불리는 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 세포 사멸 균형이 무너져 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 상태 또는 질병을 지칭한다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 된다.
상기 암은 혈액암, 예컨대 급성골수성백혈병 (AML), 급성림프구성백혈병 (ALL), 만성골수성백혈병 (CML), 만성림프구성백혈병 (CLL), 골수증식성종양 (MPN), 골수이형성증후군 (MPN), 림프종 (Lymphoma), 다발골수종 (Multiple myeloma) 또는 이들의 조합일 수 있다.
또는, 상기 암은 고형암, 예컨대 선암, 편평상피암, 선편평상피암, 미분화암, 대세포암, 소세포암, 피부암, 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 경부암, 자궁암, 간암, 신장암, 췌장암, 비장암, 폐암, 기관암, 기관지암, 결장암, 소장암, 위암, 식도암, 담낭암, 정소암, 난소암 등의 암이나, 골조직, 연골 조직, 지방조직, 근조직, 혈관 조직 및 조혈조직의 암 외에, 연골육종, 유잉육종, 악성 혈관내피종, 악성 슈반종, 골육종, 연부 조직 육종 등의 육종이나, 간아종, 수아종, 신아종, 신경아종, 췌아종 (췌장 모세포종), 흉막폐아종, 망막아종 등의 아종, 배세포 종양, 악성중피종, 담관암, 대장암, 흉선암 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "암의 예방 또는 치료용"은 암과 관련된 증상을 직접적으로 예방, 호전, 해소, 완화, 경감, 개선, 치료하기 위한 용도를 의미한다.
본 발명의 CAR 발현 세포 (예컨대, CAR-T 세포)는 입양 면역요법에 사용될 수 있다. 구체적으로, CAR를 발현하는 면역세포 (예컨대, T 세포)를 입양 전달하여, 종양 세포 상에 제시되는 특이적 항원을 인식하고 면역세포(예컨대, T 세포)를 활성화시켜 이들 종양 세포를 특이적으로 용해시킴으로써 종양 세포를 사멸하기에 유용한 항종양 치료 요법으로서, 본 발명의 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 강화시킴으로써 항암 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 CAR 발현 세포 및 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함하는 항암제를 제공한다. 상기 첨가제는 본 발명의 CAR 발현 세포와 함께 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 첨가제라면 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 생리 식염수, 완충 생리 식염수, 세포 배양 배지, 덱스트로오스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 조합, 안정제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 방부제, 등장화제, 충진제, 윤활제 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 항암제는 본 발명에 속하는 기술분야의 종래 방법을 이용하여, 암 치료를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있고, 투여 방법으로서는, 정맥내, 종양내, 피내, 피하, 근육내, 복강내, 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내, 활액낭내, 두엽내, 수강내, 및 지주막하 (골수액)에 대한 주사를 들 수 있다.
투여하는 항암제에 포함되는 본 발명의 CAR 발현 세포의 양은, 암의 종류, 위치, 중증도, 치료를 받는 피험체의 연령, 체중 및 상태 등에 따라 적절히 조정할 수 있고, 예컨대 1 회의 투여에서 1Х104 ~ 1Х1010 개, 예컨대 1Х105 ~ 1Х10 9개, 보다 구체적으로 5Х106 ~ 5Х108 개일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
투여되는 항암제는, 1 일 4 회, 3 회, 2 회 또는 1 회, 1 일 간격, 2 일 간격, 3 일 간격, 4 일 간격, 5 일 간격, 주 1 회, 7 일 간격, 8 일 간격, 9 일 간격, 주 2 회, 월 1 회 또는 월 2 회 독립적으로 투여할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항암제는, CAR 발현 세포의 면역항암요법을 강화할 수 있는 공지된 1종 이상의 항암제와 병용하여 이용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 CAR 발현 세포에 존재하는 소포체를 유효성분으로 포함하는, 즉 상기 면역세포의 파쇄물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 상술한 CAR 발현 세포에서 분비된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는, 즉 상기 면역세포의 배양물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
CAR 발현 세포에서 생산, 분비되는 세포외소포체는 대부분 엑소좀의 형태를 띄고 있으며 표면에 CAR를 함유하고 있다. CAR 함유 세포외소포체는 고농도의 세포독성 분자를 발현하고, 종양 성장을 억제하는 것으로 알려져 있으며, CAR 발현 세포와 비교하여 PD-1을 발현하지 않아 재조합 PD-L1 치료와 같은 면역관문억제제 치료에 의해 면역항암 효과가 약화되지 않은 이점이 있다. 또한, CAR 발현 세포 대비 안정성을 확보하고 있어, 항암요법에 유용하게 활용될 수 있다(문헌[Fu, Wenyan, et al. "CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity."　Nature communications　10.1 (2019): 1-12.] 등 참조).
본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 "포함"한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 세포외소포체 분비능이 증진된 면역세포, 특히 세포외소포체 분비능이 증진된 CAR 발현 세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물은 안정성 및/또는 유효성이 개선된 면역항암요법에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 및 이를 포함하는 재조합 벡터의 도식이다.
도 2는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포 내 유전체 통합 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포 내 mRNA 발현량을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포 내 T 세포 함유율 (CD3) 단백질 생성 비율 (GFP)을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포에서 생성된 세포외소포체 크기를 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포에서 생성된 세포외소포체의 상대적 개수를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포에서 생성된 세포외소포체를 촬영한 이미지를 나타낸다.
도 8은 세포외소포체 분비 자극 단백질의 유전자 도입 후 T 세포에서 지속적인 세포외소포체의 배출을 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 세포외소포체 분비 자극 유전자와 CAR 유전자의 조합 및 이를 포함하는 재조합 벡터의 도식이다.
도 10은 세포외소포체 분비 자극 유전자와 CAR 유전자 조합을 포함하는 재조합 벡터의 사용 시, T 세포에서 세포외소포체 분비 자극mRNA 발현과 CAR mRNA 발현을 나타낸다.
도 11은 세포외소포체 분비 자극 DNA와 CAR DNA 조합을 포함하는 재조합 벡터의 사용시, T 세포에서 CAR-T-EVs (MSLN에 결합하는 CAR를 발현하는 T 세포 EV) 생성이 증가되는 것을 나타낸다. 각각 세포외소포체의 개수와 세포외소포체에 CAR의 함유율을 보여준다.
도 12는 MSLN (Mesothelin)이 발현하는 암세포를 확인한 결과이다.
도 13은 CAR-T-EVs 가 암세포를 사멸시키는 효능을 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 세포외소포체 분비 자극 단백질을 발현하는 재조합 벡터의 제작
본 발명의 세포외소포체 분비 자극 단백질 발현용 재조합 벡터의 일례로 pCDH-MSCV-MCS-EF1-GFP (SYSTEM BIOSCIENCE) 플라스미드를 사용하였다. 본 실시예에서, Mock 플라스미드는 상기 플라스미드를 활용한 것이고, 유전자 전달 플라스미드(transfer plasmid)는 상기 Mock 플라스미드의 MCS 부위에 GOI (gene of interest)를 삽입한 플라스미드이다.
구체적으로, 유전자 전달 플라스미드는 Mock 플라스미드의 MCS 부위에 알라닌 (GCC)과 발린 (ACC)을 삽입 후 하류 방면에 하기 표에 기재된 CD9 및/또는 MAL 유전자를 도입한 것으로 각각 CD9 플라스미드 (CD9), MAL 플라스미드 (MAL), CD9-MAL 플라스미드 (CD9-2A-MAL) 및 MAL-CD9 플라스미드 (MAL-2A-CD9)로 명명하였다.
벡터명 도입 유전자
CD9 플라스미드 5'-CD9-3' (서열번호 5)
MAL 플라스미드 5'-MAL-3' (서열번호 6)
CD9-MAL 플라스미드 5'-CD9-Linker-P2A-MAL-3' (서열번호 7)
MAL-CD9 플라스미드 5'-MAL-Linker-P2A-CD9-3' (서열번호 8)
CD9-MAL 플라스미드와 MAL-CD9 플라스미드는 CD9 및 MAL 유전자 사이에 링커 (서열번호 10) 및 P2A (서열번호 9)가 연결된 것으로, 여기서 P2A는 도입 유전자 서열이 단백질로 번역된 이후 CD9과 MAL 단백질이 서로 분리될 수 있도록 하는 기능을 담당한다.
상기 CD9 및/또는 MAL 발현용 플라스미드를 클로닝 이후 One ShotTM Stbl3 균주 (Invitrogen)에서 증폭하여 실험에 사용하였다. 각 플라스미드 5 μl (DNA 400 ng)를 One ShotTM Stbl3 균주 50 μl에 섞어 얼음에서 30 분간 반응시킨 후, 42 ℃에서 45 초간 열처리하고 얼음에 2 분간 인큐베이션하였다. S.O.C 배양액 250 μl에 넣은 후 쉐이킹 인큐베이터에서 225 rpm, 37 ℃로 1 시간 배양하였다. LB 배양액 1 ml을 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 배양하였다. 배양 후 앰피실린 (100 μg/ml)이 포함된 아가 플레이트에 도말하여 37 ℃에서 12 ~ 16시간 배양하였다. 원하는 DNA 절편을 지닌 벡터를 가진 형질전환 대장균을 선별하기 위하여, 성장한 각 콜로니들을 취하여 4 ml의 앰피실린 (100 μg/ml)이 포함된 LB 배양액에 접종한 후 쉐이킹 인큐베이터에서 180 rpm, 37 ℃로 6 시간 배양하고, 배양액의 2 ml을 200 ml의 LB 배양액에 넣어 쉐이킹 인큐베이터에서 180 rpm, 37 ℃로 밤새 배양해주었다. 배양액에서 플라스미드 정제 키트 (QIAGEN)를 이용해 플라스미드를 추출하였다.
상기 추출된 유전자 전달 플라스미드를 HEK293TN 세포에 도입하여 바이러스 벡터를 생성하였다. 상세하게는, HEK293TN 세포를 1 % 페니실린/스트렙토마이신 (WELGENE), 10 % FBS (Capricorn)를 포함하는 10 ml의 DMEM (WELGENE) 배지 내에 10 cm2 플레이트 당 8 Х 106 세포의 밀도로 도말하였다. 세포를 도말하고 24 시간 후에, 배지를 제거하고 1.5 ml의 OptiMem I (GIBCO) 배지에 패키징 플라스미드인 psPAX2, 엔벨롭 플라스미드 pMD2G, 및 상술한 유전자 전달 플라스미드를 1 : 1 : 3으로 배합하고 1.5 ml의 OptiMem I 배지에 Lipofectamine3000 시약, P3000 시약을 배합한 혼합물을 각각 제작 후 이를 혼합하여 RT에서 20 분 동안 인큐베이션한 다음 세포에 가하여 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션이 시작된 지 6 시간 후에 항생제가 없는 10 % FBS를 포함하는 DMEM 배지로 교체하였다. 혼합액을 세포에 트랜스펙션한 시간을 기준으로 24시간 후에 배지를 플레이트에서 제거하고 4 ℃에서 보관한 후, 항생제가 없는 10 % FBS을 포함하는 DMEM 배지로 한번 더 교체하였다. 트랜스펙션이 시작된 지 52 시간 후에, 배지를 플레이트에서 제거하고 처음 수득한 배지와 합하였다. 2000 rpm에서 10 분 동안 4 ℃에서 원심분리하여 배지로부터 세포와 잔해물을 펠렛화하였다. 상등액을 세공 크기 40 μM의 멸균된 필터를 통해 여과하여 남아 있는 HEK293TN 세포를 모두 제거하였다. 바이러스를 다양한 크기의 단일 사용량으로 나누고, 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다. p24 캡시드 ELISA를 사용하여 바이러스 농도를 측정하였다. 다른 외피를 포함하는 바이러스의 감염성은 세포에 따라 크게 다를 수 있으므로, 알려진 양의 바이러스 입자가 형질도입될 수 있도록 p24 ELISA (ORIGENE)를 수행하여 배양된 세포에 대한 감염역가 대신 입자 수를 측정하였다.
<실시예 2> 세포외소포체 분비 자극 단백질을 과발현하는 면역세포의 제작
실시예 1에서 제작한 렌티바이러스 (lentivirus)를 인간 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)에 형질 도입하였다. 상세하게는, 인간 PBMC를 해동하여 펠렛화한 후 T 세포 수 대비 T 세포 활성 비드인 CD3/CD28 비드 (GIBCO)의 비율을 1 : 1로 하여 37 ℃에서 24 시간 배양하였다. 배양 배지로는 5 % CTSTM Immune Cell SR (GIBCO), 1 % P/S, 1 X MEM 비필수 아미노산 용액 (WELGENE), 2 mM L-글루타민 (WELGENE), 20 ng/ml IL-2 (PEPROTECH)을 함유하는 CTSTM OpTmizerTM T Cell Expansion SFM (GIBCO)을 이용하였다. 24 시간 활성화시킨 T 세포를 헤모사이토미터에서 센 다음, 24-웰 플레이트에 5 x 105의 세포를 깔아주었다. 형질도입을 위해 MOCK, CD9, MAL, CD9-MAL 또는 MAL-CD9 유전자를 함유한 바이러스 상층액을 10 MOI로 가하였다. 이 때, 바이러스와 T세포의 결합력을 증가시키기 위해 폴리브렌 (Merck)을 8 μg/ml의 농도로 넣어주고, Spinoculation (800 g, 32 ℃, 1 hr)해준 후 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO2)에서 24 시간 동안 실행하였다.
렌티바이러스에 포함된 코딩 서열 부분의 유전자가 일차 T 세포 (primary T cell)의 게놈 DNA에 통합된 정도를 실시간 중합효소연쇄반응 (Real Time Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 확인하였으며 방법은 하기와 같다.
상세하게는, 배양시점으로부터 5 일째에 형질도입된 일차 T 세포의 DNA 추출을 위하여 실리카 기반의 DNA 결합 컬럼을 이용한 키트 (Accuprep Genomic DNA extraction kit, bioneer, Korea)를 사용하였다. 간단히 살펴보면, 일차 T 세포의 단백질과 RNA를 proteinase K와 RNAse A로 제거하고, DNA가 컬럼의 실리카 막에 붙도록 bright를 형성하는 역할인 구아니딘 클로라이드가 함유된 결합 완충액을 넣고 볼텍싱하였다. 60 ℃에서 10 분간 반응 후 에탄올을 넣고 결합 컬럼에 로딩하여 막에 DNA를 부착시켰다. 세척 용액으로 막을 세척한 후 낮은 염도의 용출 용액을 넣어 5 분간 반응하여 실리카 막과 DNA를 분리한 다음 원심분리를 이용하여 DNA를 얻었다. 이어서 분리한 DNA를 중합효소연쇄반응 (PCR)으로 Mock, CD9, MAL의 코딩 서열을 증폭하는 프라이머로 각각 증폭해주었다. PCR은 LightCycler® 480 SYBR Green I Master (ROCHE)를 이용하여 각 프라이머와 DNA 주형으로 전체 부피 20 μl로 하여 증폭하였다. 증폭된 DNA 값은 Mock군 대비 상대적으로 분석하여 표현하였다. 그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 과발현을 한 군에서 해당 유전자의 게놈 DNA 통합을 확인하였다. CD9을 과발현한 군의 경우 대조군 대비 약 41만배의 CD9 DNA가 증가하였고, MAL을 과발현한 경우 대조군 대비 약 10만배의 MAL DNA의 증가를 관찰하였다. CD9과 MAL을 동시 과발현 (CD9-MAL)한 경우, CD9, MAL 각각의 DNA가 약 13만배, 2만 7천배 증가함을 확인하여, 렌티바이러스를 통해 코딩 서열인 CD9, MAL, CD9-MAL 유전자가 일차 T 세포의 염색체에 통합이 잘 이루어졌음을 확인하였다.
다음으로, 일차 T 세포의 게놈 DNA에 통합된 코딩 서열이 mRNA로 전사가 되는지를 확인하였다. 상세하게는, 배양시점으로부터 5 일째에 일차 T 세포의 RNA를 RNAiso Plus (TAKARA)로 얻었으며, cDNA는 PrimeScriptTM RT Master Mix (TAKARA)를 이용하여 합성하였다. PCR은 LightCycler® 480 SYBR Green I Master (ROCHE)를 이용하여 각 프라이머와 DNA 주형으로 전체 부피 20 μl로 하여 증폭하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, CD9, MAL, CD9-MAL 바이러스로 유전자를 일차 T 세포에 통합하여 T 세포 내의 CD9과 MAL의 mRNA 발현이 80 ~ 250 배 사이로 증대됨을 확인하였고, CD9-MAL 조합에 의해서도 80 ~ 250 배 사이로 CD9과 MAL 각각의 mRNA 발현이 증대됨을 확인할 수 있었다.
말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 T 세포 외에도 B 세포, NK 세포와 단핵구 등으로 다양한 세포로 구성되어있다. 이 중 T 세포에서 공통적으로 발현하는 수용체로 CD3가 존재한다. 본 연구에서는 말초 혈액 단핵세포들을 CD3/CD28 비드에서 배양하여, 다양한 세포 중에서 일차 T 세포의 활성화 및 증식을 유도하였다. 상기와 같은 배경으로 T 세포의 함유율을 CD3로 확인하고 확인된 T 세포 내에 도입된 CD9, MAL, CD9-MAL 코딩 서열 mRNA가 단백질로 번역되는지를 각 단백질들과 함께 생성되는 GFP로 확인하였다. 앞서 언급된 과정으로 6 일 동안 배양된 말초 혈액 단핵세포에 FACS 완충액 (PBS + 1% BSA) 2 ml을 넣고 1500 rpm에서 5 분 동안 2 회 세척하였고, CD3-PE (Biolegend) 항체 4 μl를 넣고 얼음 위에서 반응시켰다. 30 분 후에 FACS 완충액 2 ml을 넣고 1500 rpm에서 5 분 동안 3 회 세척하였다. 상층액을 제거한 후, 500 μl의 FACS 완충액을 다시 넣고 유세포분석기 (Novocyte, Agilemt, CA, United States)를 이용하여 세포 표면에 발현한 형광 (CD3-PE 와 GFP)들을 측정하였다.
타겟 유전자가 도입된 말초 혈액 단핵세포에서 T 세포의 함유율을 분석한 결과 CD9, MAL 또는 CD9-MAL이 도입된 세포에서 모두 80 % 이상의 T 세포가 함유됨을 확인하였고 T 세포 외의 말초 혈액 단핵세포의 비율은 15 % 이하임을 확인하였다 (도 4). 또한, CD3+ T 세포 중에서도 25 % 이상의 세포에서 GFP 유전자가 강하게 발현되는 현상을 확인하였다. 이를 통해 발명자들이 제작한 유전자 전달 플라스미드의 코딩 유전자들이 일차 T 세포로 도입되었고, 도입된 유전자가 일차 T 세포에서 단백질로 번역되었음을 최종 확인하였다.
<실시예 3> 세포외소포체 분비 자극 단백질을 과발현하는 면역세포의 세포외소포체 분비 증진 효과
면역세포 배양액 내 세포외소포체의 크기 및 개수 측정
실시예 1에서 제작한 렌티바이러스를 실시예 2에 기재된 방법에 따라 T 세포에 형질전환하였으며, 배양 시점으로부터 14 일째에 일차 T 세포의 배양액을 수득하였다.
상세하게는, 배양 총 기간 11 일째에 자극 단백질이 과발현된 일차 T 세포가 생성한 세포외소포체의 개수를 나노입자추적분석기 (Nanoparticle tracking analysis, NTA, Nanosight NS300, Malvern, UK)로 측정하기 위하여 일차 T 세포 각 군을 2 번씩 세척한 후 파티클 제거 배지 (particle-depleted media)에서 배양하였다. 배양 3 일 후, 배양액 내 CD3/CD28 활성 비드를 제거한 후 세포를 가라앉혀 상등액만 획득하였다. 각 군의 세포 수는 헤모사이토미터를 이용하여 측정하였다. 그 후, 일차 T 세포가 생성한 배양액 내의 세포외소포체를 분리하기 위하여 필트레이션 스핀 컬럼 (Filtration spin column)(Vivaspin, Satorius, New Zealand)을 사용하였다. 먼저, 배양액 내 세포사멸소포 (Apoptotic vesicle)를 제거하기 위하여 3000 g에서 20 분 동안 원심분리 후의 상등액으로 세포외소포체를 분리하였다. 필트레이션 스핀 컬럼으로 배양액의 엑소좀과 연관되지 않은 작은 단백질들은 제거하고 세포외소포체를 획득하였다.
위와 같이 분리한 세포외소포체의 크기와 개수를 나노입자추적분석기로 측정하여 크기의 그래프는 도 5에, 개수는 세포 수 대비하여 도 6에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 세포외소포체의 크기는 과발현하는 자극 단백질에 따라 차이가 없음을 보여주었다. 도 6에서 나타난 바와 같이, 세포외소포체의 개수를 세포 수 대비하여 비교한 결과 CD9과 MAL을 과발현한 군의 경우 대조군에 비해 각각 약 2.5 배, 2.2 배의 더 많은 세포외소포체를 생성하였음을 확인하였다. 또한, MAL과 CD9을 동시 과발현한 일차 T 세포는 놀랍게도 대조군 대비 약 6 배 많은 세포외소포체를 생성함을 확인하여 각각의 자극 단백질을 과발현하는 T 세포 보다 최소 2 배 이상으로 세포외소포체의 생성량이 현저히 증가함을 증명하였다. 세포에서 분비되는 세포외소포체의 수는 한계가 있기 때문에 대조군 대비 6 배 수준으로 분비량이 증가된 것은 그 자체로도 예측할 수 없었던 현저한 효과이다. 또한, CD9 또는 MAL을 과발현시켰을 때 세포외소포체 분비 증가가 확인된 것으로부터 CD9과 MAL을 동시에 과발현시켰을 때 단독 발현 대비 세포외소포체 분비의 일부 상승은 기대할 수 있을지라도, 세포외소포체 분비량의 한계치를 가질 수밖에 없는 세포의 특성을 고려할 때 단순히 이들 각각의 효과를 합친 수준으로까지 증가될 것을 예상하기는 어려우나, 본 발명에서는 CD9-MAL 과발현시 각 유전자를 단독 발현시킨 경우의 효과를 단순 합한 경우 보다도 더욱 높은 분비 수준을 보임을 확인하여, CD9 및 MAL 조합의 시너지 효과를 직접적으로 증명하였다.
다음으로, 대조군과 CD9, MAL을 동시 과발현하는 T 세포에서 생성된 세포외소포체의 사진을 나노입자추적분석기로 촬영하여 도 7에 나타내었다. 카메라를 통해 관찰 결과 비교군과 대비하여 CD9과 MAL을 동시 과발현하는 세포에서 현저히 많은 수의 세포외소포체 (흰 점)를 관찰할 수 있었다.
세포외소포체 분비능의 지속적 증진 효과 확인
본 발명의 세포외소포체 분비 자극 단백질이 일차 T 세포에 과발현되었을 때 지속적으로 세포외소포체 생성을 유지하는지 확인하기 위하여 세포외소포체의 개수 변화를 5 일까지 측정 후 누적 그래프로 표현하였다. 실시예 3과 같은 방법으로 얻은 배양액 내 세포외소포체를 각 연속적으로 수득하여 도입된 MAL 유전자에 의해 일차 T 세포 내에서 세포외소포체의 생성이 지속적으로 증가함을 증명하였다. 상세하게는 배양시점 8 일 이후 총 5 일 동안 파티클 제거 배지 (particle-depleted media)에서 배양하였고 두 번 (2 일과 5 일) 일차 T 세포의 배양액을 수득하였다. 배양액을 필트레이션 스핀 컬럼으로 분리하고 나노입자추적분석기를 사용하여 누적된 세포외소포체의 개수를 도 9에 그래프로 표현하였다.
도 8에 나타난 바와 같이, 자극 단백질인 MAL을 과발현하는 세포의 경우 2 일차에 대조군에 비해 2.5 배의 세포외소포체가 더 생성되었고, 이는 점점 더 축적되어 5 일차에는 대조군 대비 약 3.5 배의 세포외소포체가 축적되어 시간이 지날수록 축적된 세포외소포체의 차이가 증가함을 확인하였다. MAL 유전자의 경우, 일차 T 세포에 특이적으로 세포외소포체의 생성을 지속적으로 증대시키는 특성을 확인하였다.
<실시예 4> 세포외소포체 분비 자극 단백질과 CAR (Chimeric Antigen Receptor) 단백질을 동시 발현하는 재조합 벡터의 제작 및 세포외소포체 생성 및 특성 분석
본 발명의 세포외소포체 분비 자극 단백질 발현용 재조합 벡터의 일례로 pCDH-MSCV-MCS1-EF1-MCS2를 자체 제작하였다. 본 실시예에서, Mock 플라스미드는 상기 플라스미드 자체를 활용한 것이고, 유전자 전달 플라스미드 (transfer plasmid)는 상기 Mock 플라스미드의 MCS 부위에 GOI (gene of interest)를 삽입한 플라스미드이다.
구체적으로, 유전자 전달 플라스미드는 Mock 플라스미드의 MCS1과 MCS2 부위에 알라닌 (GCC)과 발린 (ACC)을 삽입한 후 하류 방면에 하기 표에 기재된 유전자를 도입한 것으로, CAR 유전자를 도입한 플라스미드 벡터를 CAR 플라스미드 (CAR), CAR와 CD9 및 MAL을 구분하여 MCS1과 MCS2에 각각 나누어 도입한 플라스미드 벡터를 CAR-CD9-MAL 플라스미드 (CAR-CD9-MAL)로 명명하였다 (도 9 및 표 2).
벡터명 도입 유전자
CAR 플라스미드 5'-CAR-3' (서열번호 11)
CAR-CD9-MAL 플라스미드 5'-CAR-CD9-P2A-MAL-3'
MSCV와 EF1 프로모터들은 CAR와 세포외소포체의 발현율을 전체적으로 높이기 위한 방법으로 제안되었고, CAR-CD9-MAL 플라스미드에서 CD9-MAL 부분은 CAR와 CD9 및 MAL 유전자 사이에 P2A (서열번호 9)가 연결된 것으로, 여기서 P2A는 플라스미드 서열이 단백질로 번역된 이후 CD9과 MAL 단백질이 서로 분리될 수 있도록 하는 기능을 담당한다. CAR 유전자의 핵산 및 아미노산 서열은 서열번호 11, 12에 각각 표기하였다.
일차 T 세포의 게놈 DNA에 통합된 코딩 서열이 mRNA로 전사되는지를 확인하였다. 상세하게는, 배양시점으로부터 5 일째에 일차 T 세포의 RNA를 RNAiso Plus (TAKARA)로 얻었으며, cDNA는 PrimeScriptTM RT Master Mix (TAKARA)를 이용하여 합성하였다. PCR은 LightCycler® 480 SYBR Green I Master (ROCHE)를 이용하여 각 프라이머와 DNA 주형으로 전체 부피 20 μl로 하여 증폭하였다. 그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, CAR-CD9-MAL 바이러스로 유전자를 일차 T 세포에 통합하여 T 세포 내의 CD9과 MAL의 mRNA 발현이 40-250 배 사이로 증대됨을 확인하였고, CAR는 약 300000 배 증대됨을 확인할 수 있었다. CAR 바이러스로 도입한 경우는 CD9과 MAL이 mock에 비해 증대되지 않음을 확인하였다.
배양 시점으로부터 14 일째에, 일차 T 세포의 배양액을 수득한 후 실시예 3과 마찬가지로 세포외소포체를 수득하였다. 세포외소포체의 개수를 나노입자추적분석기로 측정한 결과, CAR만 발현시킨 경우에는 세포외소포체 수의 변화가 거의 없었으나, CAR-CD9-MAL 바이러스를 도입한 T 세포는 세포외소포체가 mock 대조군 및 CAR 단독 발현군 대비 2배 이상 증가함을 확인하였다 (도 11 왼쪽). 다음으로, 증가된 EV의 각각에 CAR의 함유 비율을 비교하였다. 세포외소포체를 CAR를 염색하는 형광물질로 염색한 결과, 도11 오른쪽 그림 (CAR on indicidual EV)에서 확인할 수 있듯이, CAR의 단독 발현군이 도입된 혹은 CAR-CD9-MAL이 도입된 면역세포 유래 세포외소포체는 CAR를 함유하고 있음을 확인하였다. 결론적으로, 상기 CAR-CD9-MAL 바이러스를 도입한 T 세포는 CAR-T-EVs (CAR를 함유한 EVs)의 분비량 역시 증가되었음을 알 수 있다.
<실시예 5> CAR 단백질을 함유하는 세포외소포체의 암세포 사멸능 분석
본 발명의 세포외소포체의 항암 활성을 확인하기 위한 하나의 예시로서, 상기 실시예에서 사용한 CAR가 표적으로 하는 MSLN (mesothelin)을 과발현하는 암세포주 (OVCAR3)와 약한 발현을 보이는 암세포주 (PANC-1)에서 암세포 사멸능을 평가하였다.
먼저, OVCAR3 및 PANC-1 세포주를 각각 항-MSLN-PE 항체로 염색한 후 유세포분석기 (Novocyte, Agilemt, CA, United States)로 분석하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, PANC-1은 2 % 정도로 MSLN의 발현이 낮고, OVCAR3는 50 % 근방의 높은 발현을 보임을 확인하였다.
다음으로, CAR-T-EVs (CAR를 함유한 T 세포의 세포외소포체)의 지속적인 암세포 사멸 능력을 보여주기 위해, CAR-CD9-MAL 플라스미드를 도입한 T 세포로부터 수득한 CAR-T-EVs, 또는 Mock플라스미드를 도입한 T 세포로부터 수득한 T-EVs (CAR를 함유하지 않는 T 세포의 세포외소포체)를 1 ㎛의 공극을 가진 트랜스웰의 상단 배양접시에 배양하였다. 트랜스웰의 1 ㎛ 공극은 CAR-T 혹은 T 세포가 통과되지 않고 세포외소포체만이 통과 가능한 크기이다. 트랜스웰의 하단 배양접시에는 암세포를 배양하여, 세포외소포체에 의해 암세포 사멸이 일어나는지 여부를 평가하였다.
구체적으로, 배양 1 일째와 배양 5 일째에 암세포의 생존률을 WST-1으로 측정, 확인하였다. 도 13에서 나타낸 바와 같이, MSLN을 거의 발현하지 않는 PANC-1에서 5 일 동안 처리해본 결과, T-EVs와 CAR-T-EVs의 세포 사멸 능력에서 큰 차이를 보이지 않았다 (CAR-T-Evs의 경우 5 일 동안 처리한 경우에만 약 10 % 수준의 생존율 차이를 보임). 반면에, MSLN을 과발현하는 OVCAR3에서는 배양 1 일째부터 T-EVs와 CAR-T-EVS의 세포 사멸에 큰 차이를 보였다. 특히, CAR-T-EVs를 5 일 동안 OVCAR-3에 처리한 그룹에서는 암세포가 60 % 이상 사멸되어 40 % 이하로 생존하였고, 이와 달리 T-EVs를 OVCAR3에 5 일 동안 처리한 결과에서는 90 %의 생존을 보였다 (50 %의 생존율 차이). 또한, CAR-CD9-MAL 플라스미드를 도입한 T 세포는 CAR만 발현시킨 T 세포에 비하여 CAR-T-EVs에 따른 항암 효과가 현저히 우수한 것으로 확인되었다.
본 결과는 CAR-T-EVs 가 암 항원을 인지하여 선별적으로 표적 항원을 발현하는 암세포의 사멸을 유도한다는 것을 보여주며, CD9 및 MAL을 통해 세포외소포체 분비량을 증가시킴으로써 표적 특이적 항암 효과가 현저히 증가함을 증명한 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명의 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Biosolution Co.,Ltd <120> Immune cells with enhanced extracellular vesicle secretion and immunotherapy using the same <130> P21017-BSL-PA <150> KR 10-2021-0064428 <151> 2021-05-18 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 153 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human MAL <400> 1 Met Ala Pro Ala Ala Ala Thr Gly Gly Ser Thr Leu Pro Ser Gly Phe 1 5 10 15 Ser Val Phe Thr Thr Leu Pro Asp Leu Leu Phe Ile Phe Glu Phe Ile 20 25 30 Phe Gly Gly Leu Val Trp Ile Leu Val Ala Ser Ser Leu Val Pro Trp 35 40 45 Pro Leu Val Gln Gly Trp Val Met Phe Val Ser Val Phe Cys Phe Val 50 55 60 Ala Thr Thr Thr Leu Ile Ile Leu Tyr Ile Ile Gly Ala His Gly Gly 65 70 75 80 Glu Thr Ser Trp Val Thr Leu Asp Ala Ala Tyr His Cys Thr Ala Ala 85 90 95 Leu Phe Tyr Leu Ser Ala Ser Val Leu Glu Ala Leu Ala Thr Ile Thr 100 105 110 Met Gln Asp Gly Phe Thr Tyr Arg His Tyr His Glu Asn Ile Ala Ala 115 120 125 Val Val Phe Ser Tyr Ile Ala Thr Leu Leu Tyr Val Val His Ala Val 130 135 140 Phe Ser Leu Ile Arg Trp Lys 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190 Phe His Ile Ile Gly Ala Val Gly Ile Gly Ile Ala Val Val Met Ile 195 200 205 Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Ile Leu Cys Cys Ala Ile Arg Arg Asn 210 215 220 Arg Glu Met Val 225 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 3 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 4 Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 <210> 5 <211> 687 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD9 <400> 5 atgccggtca aaggaggcac caagtgcatc aaatacctgc tgttcggatt taacttcatc 60 ttctggcttg ccgggattgc tgtccttgcc attggactat ggctccgatt cgactctcag 120 accaagagca tcttcgagca agaaactaat aataataatt ccagcttcta cacaggagtc 180 tatattctga tcggagccgg cgccctcatg atgctggtgg gcttcctggg ctgctgcggg 240 gctgtgcagg agtcccagtg catgctggga ctgttcttcg gcttcctctt ggtgatattc 300 gccattgaaa tagctgcggc catctgggga tattcccaca aggatgaggt gattaaggaa 360 gtccaggagt tttacaagga cacctacaac aagctgaaaa ccaaggatga gccccagcgg 420 gaaacgctga aagccatcca ctatgcgttg aactgctgtg gtttggctgg gggcgtggaa 480 cagtttatct cagacatctg ccccaagaag gacgtactcg aaaccttcac cgtgaagtcc 540 tgtcctgatg ccatcaaaga ggtcttcgac aataaattcc acatcatcgg cgcagtgggc 600 atcggcattg ccgtggtcat gatatttggc atgatcttca gtatgatctt gtgctgtgct 660 atccgcagga accgcgagat ggtctag 687 <210> 6 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human MAL <400> 6 atggcccccg cagcggcgac ggggggcagc accctgccca gtggcttctc ggtcttcacc 60 accttgcccg acttgctctt catctttgag tttatcttcg ggggcctggt gtggatcctg 120 gtggcctcct ccctggtgcc ctggcccctg gtccagggct gggtgatgtt cgtgtctgtg 180 ttctgcttcg tggccaccac caccttgatc atcctgtaca taattggagc ccacggtgga 240 gagacttcct gggtcacctt ggacgcagcc taccactgca ccgctgccct cttttacctc 300 agcgcctcag tcctggaggc cctggccacc atcacgatgc aagacggctt cacctacagg 360 cactaccatg aaaacattgc tgccgtggtg ttctcctaca tagccactct gctctacgtg 420 gtccatgcgg tgttctcttt aatcagatgg aagtcttcat aa 462 <210> 7 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD9-linker-P2A-MAL <400> 7 atgccggtca aaggaggcac caagtgcatc aaatacctgc tgttcggatt taacttcatc 60 ttctggcttg ccgggattgc tgtccttgcc attggactat ggctccgatt cgactctcag 120 accaagagca tcttcgagca agaaactaat aataataatt ccagcttcta cacaggagtc 180 tatattctga tcggagccgg cgccctcatg atgctggtgg gcttcctggg ctgctgcggg 240 gctgtgcagg agtcccagtg catgctggga ctgttcttcg gcttcctctt ggtgatattc 300 gccattgaaa tagctgcggc catctgggga tattcccaca aggatgaggt gattaaggaa 360 gtccaggagt tttacaagga cacctacaac aagctgaaaa ccaaggatga gccccagcgg 420 gaaacgctga aagccatcca ctatgcgttg aactgctgtg gtttggctgg gggcgtggaa 480 cagtttatct cagacatctg ccccaagaag gacgtactcg aaaccttcac cgtgaagtcc 540 tgtcctgatg ccatcaaaga ggtcttcgac aataaattcc acatcatcgg cgcagtgggc 600 atcggcattg ccgtggtcat gatatttggc atgatcttca gtatgatctt gtgctgtgct 660 atccgcagga accgcgagat ggtcaggtct ggtggcggag gcagcggcgc cacaaacttc 720 tctctgctaa agcaagcagg tgatgttgaa gaaaaccccg ggcctgccac catggccccc 780 gcagcggcga cggggggcag caccctgccc agtggcttct cggtcttcac caccttgccc 840 gacttgctct tcatctttga gtttatcttc gggggcctgg tgtggatcct ggtggcctcc 900 tccctggtgc cctggcccct ggtccagggc tgggtgatgt tcgtgtctgt gttctgcttc 960 gtggccacca ccaccttgat catcctgtac ataattggag cccacggtgg agagacttcc 1020 tgggtcacct tggacgcagc ctaccactgc accgctgccc tcttttacct cagcgcctca 1080 gtcctggagg ccctggccac catcacgatg caagacggct tcacctacag gcactaccat 1140 gaaaacattg ctgccgtggt gttctcctac atagccactc tgctctacgt ggtccatgcg 1200 gtgttctctt taatcagatg gaagtcttca taa 1233 <210> 8 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human MAL-linker-P2A-CD9 <400> 8 atggcccccg cagcggcgac ggggggcagc accctgccca gtggcttctc ggtcttcacc 60 accttgcccg acttgctctt catctttgag tttatcttcg ggggcctggt gtggatcctg 120 gtggcctcct ccctggtgcc ctggcccctg gtccagggct gggtgatgtt cgtgtctgtg 180 ttctgcttcg tggccaccac caccttgatc atcctgtaca taattggagc ccacggtgga 240 gagacttcct gggtcacctt ggacgcagcc taccactgca ccgctgccct cttttacctc 300 agcgcctcag tcctggaggc cctggccacc atcacgatgc aagacggctt cacctacagg 360 cactaccatg aaaacattgc tgccgtggtg ttctcctaca tagccactct gctctacgtg 420 gtccatgcgg tgttctcttt aatcagatgg aagtcttcaa ggtctggtgg cggaggcagc 480 ggcgccacaa acttctctct gctaaagcaa gcaggtgatg ttgaagaaaa ccccgggcct 540 gccaccatgc cggtcaaagg aggcaccaag tgcatcaaat acctgctgtt cggatttaac 600 ttcatcttct ggcttgccgg gattgctgtc cttgccattg gactatggct ccgattcgac 660 tctcagacca agagcatctt cgagcaagaa actaataata ataattccag cttctacaca 720 ggagtctata ttctgatcgg agccggcgcc ctcatgatgc tggtgggctt cctgggctgc 780 tgcggggctg tgcaggagtc ccagtgcatg ctgggactgt tcttcggctt cctcttggtg 840 atattcgcca ttgaaatagc tgcggccatc tggggatatt cccacaagga tgaggtgatt 900 aaggaagtcc aggagtttta caaggacacc tacaacaagc tgaaaaccaa ggatgagccc 960 cagcgggaaa cgctgaaagc catccactat gcgttgaact gctgtggttt ggctgggggc 1020 gtggaacagt ttatctcaga catctgcccc aagaaggacg tactcgaaac cttcaccgtg 1080 aagtcctgtc ctgatgccat caaagaggtc ttcgacaata aattccacat catcggcgca 1140 gtgggcatcg gcattgccgt ggtcatgata tttggcatga tcttcagtat gatcttgtgc 1200 tgtgctatcc gcaggaaccg cgagatggtc tag 1233 <210> 9 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 9 gccacaaact tctctctgct aaagcaagca ggtgatgttg aagaaaaccc cgggcct 57 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 10 aggtctggtg gcggaggcag cggc 24 <210> 11 <211> 1455 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR (SS1-CD8hinge-CD8TM-h41BB-hCD3z) <400> 11 atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60 ccgcaggtgc agctgcagca gtccggccct gagctggaga agcccggcgc ttccgtgaag 120 atctcctgta aggccagcgg ctacagcttc acaggctaca caatgaactg ggtgaagcag 180 tcccacggca agtccctgga gtggatcggc ctgatcaccc cctacaatgg cgccagcagc 240 tacaatcaga agtttagagg caaggccaca ctgacagtgg acaagagcag cagcaccgcc 300 tacatggacc tgctgagcct gaccagcgag gacagcgccg tgtacttctg tgccaggggc 360 ggctacgacg gcaggggatt cgactactgg ggccagggca ccacagtgac cgtgagctcc 420 ggcggcggcg gatctggagg aggaggatcc ggcggcggag gctctgatat cgagctgaca 480 cagagccccg ccatcatgtc cgcctcccct ggcgagaagg tgaccatgac ctgcagcgcc 540 agcagctccg tgtcctacat gcactggtac cagcagaaga gcggcacctc ccccaagagg 600 tggatctacg acaccagcaa gctggcctcc ggcgtgcctg gcagattctc cggctccggc 660 agcggcaact cctacagcct gacaatctcc tccgtggagg ccgaggacga cgccacctac 720 tactgtcagc agtggtccgg ctaccccctg acattcggcg ccggcacaaa gctggagatc 780 aagaccacta ccccagcacc gaggccaccc accccggctc ctaccatcgc ctcccagcct 840 ctgtccctgc gtccggaggc atgtagaccc gcagctggtg gggccgtgca tacccggggt 900 cttgacttcg cctgcgatat ctacatttgg gcccctctgg ctggtacttg cggggtcctg 960 ctgctttcac tcgtgatcac tctttactgt aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc 1020 tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc 1080 cggttcccag aggaggagga aggcggctgc gaactgcgcg tgaaattcag ccgcagcgca 1140 gatgctccag cctacaagca ggggcagaac cagctctaca acgaactcaa tcttggtcgg 1200 agagaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggacggg acccagaaat gggcgggaag 1260 ccgcgcagaa agaatcccca agagggcctg tacaacgagc tccaaaagga taagatggca 1320 gaagcctata gcgagattgg tatgaaaggg gaacgcagaa gaggcaaagg ccacgacgga 1380 ctgtaccagg gactcagcac cgccaccaag gacacctatg acgctcttca catgcaggcc 1440 ctgccgcctc ggtaa 1455 <210> 12 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR (SS1-CD8hinge-CD8TM-h41BB-hCD3z) <400> 12 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu 20 25 30 Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr 35 40 45 Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys 50 55 60 Ser Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr 145 150 155 160 Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met 165 170 175 Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln 180 185 190 Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu 195 200 205 Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser 210 215 220 Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr 245 250 255 Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 260 265 270 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 275 280 285 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 290 295 300 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 305 310 315 320 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys 325 330 335 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 340 345 350 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 355 360 365 Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 370 375 380 Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 385 390 395 400 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 405 410 415 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 420 425 430 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 435 440 445 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 450 455 460 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 465 470 475 480 Leu Pro Pro Arg

Claims (10)

  1. 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화된 면역세포로서, 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질은 MAL (myelin and lymphocyte protein) 및 CD9의 조합인, 면역세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 면역세포는 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 매크로파지, 수지상 세포, NK 세포, B 세포 및 T 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인, 면역세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산이 도입된, 면역세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체 (CAR)는
    (i-1) 타겟 결합 도메인;
    (i-2) 세포막 관통 도메인; 및
    (i-3) 신호전달 도메인을 포함하는, 면역세포.
  5. (a) 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 비변이 세포에 비해 강화되고,
    (b) 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산이 도입된 면역세포로서,
    상기 세포외소포체 분비 자극 단백질은 MAL (myelin and lymphocyte protein) 및 CD9의 조합인,
    면역세포, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 면역세포의 배양물은 세포외소포체 (Extracellular vesicles)를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포외소포체는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. MAL (myelin and lymphocyte protein) 및 CD9의 공동 발현 유도제를 포함하는, 세포외소포체 분비 증진용 조성물로서, 상기 MAL 및 CD9의 공동 발현 유도제는
    (i) MAL을 코딩하는 핵산 및 CD9을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터, 또는
    (ii) MAL을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터 및 CD9을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터인 조성물.
  9. (i) 시험관 내 (in vitro 또는 ex vivo)에서 면역세포에 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성을 비변이 세포에 비해 강화시키는 단계; 및
    (ii) 상기 세포외소포체 분비 자극 단백질의 활성이 강화된 면역 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 세포외소포체 분비능이 증진된 면역 세포의 제조방법으로서,
    상기 자극 단백질은 MAL 및 CD9의 조합인, 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 세포외소포체 분비능이 증진된 면역 세포의 제조방법.
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