JP2023501506A - Ｔ細胞機能を改善するｔｍｅｍ５９タンパク質二量体またはキメラ発現受容体 - Google Patents
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Abstract
TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片、キメラ抗原受容体CARおよび/またはそのコード要素を含む免疫細胞、および腫瘍を治療するための医薬品の調製における上記の免疫細胞の使用に関する。さらに、免疫細胞の増殖を促進する方法、およびメモリー細胞の産生を促進する方法を提供した。
Description
本発明は、生物医学の分野に関し、具体的に、腫瘍を治療するための組成物の調製におけるキメラ抗原受容体Tリンパ球の使用および方法に関する。
悪性腫瘍は、人間の生命を深刻に脅かす主要な疾患である。現在、悪性腫瘍は、有効な治療法が欠けて、疾患の再発性や、死亡率も高いことがほとんどであり、患者の健康を著しく脅かし、生活の質を著しく低下させている。
キメラ抗原受容体Tリンパ球療法は、近年登場した養子免疫療法である。腫瘍特異的抗原を標的とするモノクローナル抗体由来一本鎖抗体可変領域は、共刺激分子（4-1BB、CD28タンパク質など）およびTリンパ球シグナル伝達領域の細胞内セグメントのCD3zetaとともに、1つのキメラ抗原受容体タンパク質を構成し、細胞膜を貫通してTリンパ球の表面で発現する。一本鎖抗体の可変領域は、腫瘍細胞の表面上の特異的抗原を認識した場合に、共刺激分子とCD3zetaを活性化し、Tリンパ球活性化シグナルを伝達し、Tリンパ球活性化が依存する第1と第2のシグナルを直接活性化し、Tリンパ球の活性化やTリンパ球の増殖を促進し、免疫殺傷機能を強化し、腫瘍細胞に対する免疫調節および殺傷を達成すると共に、腫瘍クリアランスの目的を実現する。
患者におけるエフェクターTリンパ球の生存期間の延長は、キメラ抗原受容体T療法の治療効果を最適化し、有効期間を延長するための重要な手段である。臨床試験の結果、キメラ抗原受容体Tリンパ球療法による長期間の疾患寛解は、患者におけるキメラ抗原受容体Tリンパ球の長期生存や持続性に強い相関があることが示された。エフェクターTリンパ球は、腫瘍を溶解する強い能力を持っているが、患者における生存期間は短い。また、エフェクターメモリーTリンパ球やセントラルメモリーTリンパ球を含むメモリーTリンパ球は、生体内で長時間にわたって増幅することができ、強力な増殖能を持ち、同時にエフェクターTリンパ球に分化する潜在力もあり、エフェクターTリンパ球を継続的に供給することが可能である。
したがって、その有効性を維持するために、生存期間が延長されたキメラ抗原受容体Tリンパ球が緊急に必要とされる。
本発明は、TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片、キメラ抗原受容体CARおよび/またはそのコード要素を含む免疫細胞、ならびに腫瘍を治療するための医薬品の調製における上記の免疫細胞の使用を提供した。本発明は、さらに、免疫細胞の増殖を促進する方法、および、メモリー細胞の産生を促進する方法を提供した。本発明に記載の免疫細胞は、次の有益な効果の1つを含む：（1）メモリーリンパ球の数を、例えば、TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含まないCAR T細胞と比較して、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%または200%以上増加することができ、（2）リンパ球の増殖能を、例えば、TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含まないCAR T細胞と比較して、少なくとも10%、20%、30%40%または50%以上増強することができ、（3）標的細胞に対するリンパ球による殺傷率を、例えば、TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含まないCAR T細胞と比較して、少なくとも10%、20%、30%またはそれ以上増強することができ、および、（4）腫瘍細胞の成長を抑制し、および/または腫瘍にかかっている被験者の生存率を高める。
一方、本発明は、細胞膜にあるTMEM59タンパク質、および/または、少なくとも上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片を含む免疫細胞を提供した。
いくつかの実施形態において、上記の免疫細胞は、改変されることによって細胞膜に上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態において、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、ヒトTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片である。
いくつかの実施形態において、上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域は、SEQ ID NO. 1で表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記のTMEM59タンパク質のヒンジ領域は、SEQ ID NO. 2で表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO. 3で表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記の免疫細胞は、キメラ抗原受容体CARおよび/またはそのコード要素を含む。
いくつかの実施形態において、上記のCARは、膜貫通領域を含む。
いくつかの実施形態において、上記のCARの膜貫通領域は、TMEM59タンパク質の膜貫通領域およびCD8の膜貫通領域から選ばれる。
いくつかの実施形態において、上記のCARの膜貫通領域は、SEQ ID NO.1および37のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記のCARは、ヒンジ領域を含む。
いくつかの実施形態において、上記のCARのヒンジ領域は、TMEM59タンパク質のヒンジ領域およびCD8のヒンジ領域から選ばれる。
いくつかの実施形態において、上記のCARのヒンジ領域は、SEQ ID NO. 2および38のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記のCARは、シグナル伝達ドメインおよび/または共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記のシグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記の共刺激ドメインは、4-1BBの共刺激ドメインを含む。
いくつかの実施形態において、上記のCARは、ターゲティング部分を含む。
いくつかの実施形態において、上記のターゲティング部分は、ScFvを含む。
いくつかの実施形態において、上記のターゲティング部分は、腫瘍抗原に特異的に結合および/または認識する。
いくつかの実施形態において、上記のターゲティング部分は、CD19、CD22およびGPC3からなる群から選ばれる標的に特異的に結合および/または認識する。
いくつかの実施形態において、上記の免疫細胞は、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含まない上記のCARならびに上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態において、上記のCARは、上記のターゲティング部分、CD8のヒンジ領域、CD8の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み、ここで、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含む。
いくつかの実施形態において、上記のCARは、SEQ ID NO. 49、51、55および56のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記の免疫細胞は、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含む上記のCAR、および、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含む。
いくつかの実施形態において、上記のCARは、上記のターゲティング部分、TMEM59タンパク質のヒンジ領域、TMEM59タンパク質の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み、ここで、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含む。
いくつかの実施形態において、上記のCAR は、SEQ ID NO. 43、57および44のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、上記の免疫細胞は、Tリンパ球を含む。
他方、本発明は、上記の免疫細胞および任意に薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供した。
他方、本発明は、腫瘍を治療するための医薬品の調製における上記の免疫細胞または上記の医薬組成物の使用を提供した。
いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は、固形腫瘍および/または非固形腫瘍を含む。
いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は、Bリンパ性白血病および/または肝癌からなる。
他方、本発明は、免疫細胞に、TMEM59タンパク質および/または少なくとも上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片をその細胞膜上に発現させることを含む免疫細胞の増殖を促進する方法を提供した。
他方、本発明は、免疫細胞に、TMEM59タンパク質および/または少なくとも上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片をその細胞膜上に発現させることを含むメモリー免疫細胞の産生を促進する方法を提供した。
他方、本発明は、上記の免疫細胞に、TMEM59タンパク質および/または少なくとも上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片をその細胞膜上に発現させることを含む腫瘍に対する免疫細胞の殺傷能を増強する方法を提供した。
いくつかの実施形態において、上記の発現は、上記の免疫細胞に上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片をコードする核酸を含ませることを含む。
いくつかの実施形態において、上記の発現は、上記の免疫細胞を上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片をコードする核酸を含むプラスミドでトランスフェクションすることを含む。
いくつかの実施形態において、上記の免疫細胞は、Tリンパ球を含む。
いくつかの実施形態において、上記の免疫細胞は、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片をコードする核酸を含む。
いくつかの実施形態において、上記の核酸は、ウイルスベクターにある。
他方、本発明は、上記の免疫細胞を腫瘍細胞に接触させることを含む、腫瘍細胞の増殖抑制および/または殺傷の方法を提供した。
いくつかの実施形態において、上記の方法は、インビトロ法またはエクスビボ法を含む。
いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は、固形腫瘍および/または非固形腫瘍を含む。
いくつかの実施形態において、上記の腫瘍は、Bリンパ性白血病および/または肝癌からなる。
当該技術分野における当業者は、以降の詳細な記載からの本開示のその他の側面や利点の把握が容易であろう。以下の詳細な記載では、本開示の例としての実施形態しか表現して記載していない。当該技術分野における当業者にとって、本開示の詳細によって、本発明に係る趣旨や範囲を逸脱しない限り、開示されている具体的な実施形態を変更しても良い。それに応じて、本発明において、図面や明細書の記載があくまでも例であり、本発明を限定するするものではない。
本発明に係る具体的な特徴は、添付の請求項のように示されたものである。本発明に係る特徴やメリットは、以下詳しく記載されている例示的実施形態や図面を参照することによって、より確実的に把握されるだろう。図面に関しては、以下のように概略的に説明する。
以下、本願発明の実施形態を、所定の具体的な実施例によって説明するが、当業者が、本明細書に開示された内容により、本願発明のその他のメリットや効果を容易に把握することができる。
本発明において、「キメラ抗原受容体（CAR）」という用語は、例えば人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体、またはキメラ免疫受容体のことを言い、特定の免疫エフェクター細胞の上に人工特異性を移植する遺伝子操作された受容体を包含する。CARを用いて、モノクローナル抗体の特異性をT細胞に与えることで、多数の特異的T細胞を、例えば、養子細胞療法で用いるために生成することができる。いくつかの場合に、CARは、細胞の特異性を腫瘍関連抗原に誘導することができる。CARは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、および腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。例えば、CARは、CD3ζ膜貫通領域および細胞内ドメインに融合したモノクローナル抗体由来の単鎖可変断片（scFv）を組み込んだ融合体を含む。他の場合には、CARは、CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAPlOおよび/または0X40などの追加の共刺激シグナル伝達のためのドメインを含むこともできる。いくつかの場合に、分子は、CARと共発現させることができ、かつ、共刺激分子、イメージング（例えば、陽電子放射断層撮影法）用のレポーター遺伝子、プロドラッグの追加時にＴ細胞を条件付きでアブレーションする遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体を含むことがある。
本発明において、「抗体」という用語は通常、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル、多重鎖または一本鎖、または完全免疫グロブリンであり、天然由来のものでも組換え由来のものでもあり得る。抗体は免疫グロブリン分子の4量体であり得る。「抗体断片」という用語は通常、完全抗体の少なくとも一部またはその組換え変異体を指し、例えば、標的（例えば抗原）に対する抗体断片の認識および特異的結合を付与するのに十分な抗原性決定可変領域などの完全抗体の抗原結合ドメインを指す場合がある。抗体断片の例として、抗原結合断片（Fab、Fab’、F(ab)2、Fv断片、F(ab’)2、scFv、di-scFvおよび/またはdAb）、イムノコンジュゲート、多重特異的抗体（例えば二重特異的抗体）、抗体断片、抗体誘導体、抗体アナログまたは融合タンパク質、VHHドメイン、および抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれるが、これらに限定されない。「scFv」という用語は通常、少なくとも1つの軽鎖可変領域含有抗体断片と少なくとも1つの重鎖可変領域含有抗体断片を含む融合タンパク質を指し、ここで、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は短い柔軟なペプチドリンカーによって連続的に連結され、一本鎖ポリペプチドとして発現可能で、また、scFvはそれが由来する完全抗体の特異性を保持している。特に断らない限り、本発明において、scFvはVLおよびVH可変領域を任意の順序で含んでよく、例えばポリペプチドのN末端およびC末端に対して、VL-リンカー-VHまたはVH-リンカー-VLを含んでよい。本発明のCARのうち、抗体またはその抗体断片を含む部分は、例えば、単一ドメイン抗体断片（sdAb)、一本鎖抗体（scFv）、ヒト化抗体（Harlowら、1999, In:Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY ；Harlowら、1989, In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York ； Houstonら、1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 ;Birdら、1988,Science 242:423-426)などの様々な形態で存在しうり、ここで、抗原結合ドメインが連続したポリペプチド鎖の一部として発現される。いくつかの場合に、本発明に記載のCARの抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。他の場合には、CARはscFvを含む抗体断片を含んでいてもよい。
本発明において、「scFv」という用語は通常、少なくとも1つの軽鎖含有可変領域抗体断片と少なくとも1つの重鎖含有可変領域の抗体断片を含む融合タンパク質を指し、ここで、上記の軽鎖可変領域および重鎖可変領域は隣接したもの（例えば、短い柔軟なポリペプチドリンカーのような合成リンカーを介する）であり、一本鎖ポリペプチドとして発現することができ、かつ、上記のscFvは、それが由来する完全抗体の特異性を保持している。本発明において、scFvは、（例えば、ポリペプチドのN-末端およびC末端に対する）上記のVLおよびVH可変領域を任意の順序で含んでよい。上記のscFv分子は、一般的な構造：NH2-VL-リンカー-VH-COOHまたはNH2-VH-リンカー-VL-COOHを有する。
本発明において、「TMEM59」という用語は通常、膜貫通タンパク質59、その機能的変異体および/またはその機能的断片を指す。TMEM59配列は当該技術分野で知られている。例えば、本発明のヒトTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO.4のようなヌクレオチド配列からなるものであってもよい。本発明のヒトTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.3のようなアミノ酸配列からなるものであってもよい。
本発明において、「共刺激分子」という用語は通常、共刺激リガンドに特異的に結合することで、例えば、増殖であるがこれに限定されないT細胞の共刺激反応を媒介するT細胞上の関連結合性リガンドを指す。共刺激分子は、有効な免疫反応に必要な非抗原受容体の細胞表面分子またはそのリガンドである。共刺激分子は、MHCクラスI分子、BTLAやTollリガンド受容体、およびOX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-I （CD18）ならびに4-1BB（CD137）が含まれるが、これらに限定されない。
本発明において、「共刺激ドメイン」という用語は通常、例えば4-1BBの刺激シグナル伝達ドメインを含む4-1BB（CD137）の任意の配列を指す。それは4-1BBの相同体、変異体、異性体または機能的断片を含み得る。
本発明において、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、タンパク質の機能的部分を指す。シグナル伝達ドメインは、例えばT細胞またはNK細胞のようなCAR発現細胞などのCAR含有細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを産生することができる。例えば、CAR発現細胞において、免疫エフェクター機能の例として、細胞溶解性活性およびサイトカインの分泌を含み得るヘルパー活性が挙げられる。いくつかの場合に、シグナルドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞が特殊な機能を実行するように指示する。細胞内シグナル伝達ドメイン全体を使用することは可能であるが、多くの場合、ドメイン全体の完全鎖を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が使用される限り、エフェクター機能シグナルを伝達するのであれば、このような短縮部分を完全鎖の代わりに使用することができる。したがって、「シグナル伝達ドメイン」という用語は、所望の機能シグナルを伝達するのに十分なシグナル伝達ドメインの任意の短縮部分を含み得る。
本発明において、「膜貫通領域」という用語は通常、細胞質膜にまたがることができるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のドメインを指す。これらのドメインは、抗体またはその断片を細胞膜にアンカーさせるために使用することができる。
本発明において、「コードする」という用語は通常、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型としての、遺伝子、cDNA、またはmRNAなどのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの所定の配列の固有の特性を指し、該ポリマーおよび高分子はヌクレオチド(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)の特定された配列またはアミノ酸の特定されたいずれかの配列およびそれらから生じる生物学的特性を有する。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞あるいは他の生物学的系でタンパク質を産生する場合に、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がmRNA配列に同一でありかつ通常配列表に提供されるコーディング鎖、および遺伝子もしくはcDNAの転写のための鋳型として使用される非コーディング鎖の双方を、該遺伝子あるいはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると称し得る。本発明において、「コード要素」という用語は通常、タンパク質（キメラ抗原受容体CARなど）をコードするヌクレオチド配列を有する核酸（RNAまたはDNA分子）を指す。
本発明において、「腫瘍抗原」という用語は通常、腫瘍細胞の腫瘍形成特性に寄与することが知られている、または考えられている腫瘍細胞に発現する（または腫瘍細胞の発達と関連する）任意の分子を指す。これらの抗原は通常、細胞表面に提示可能な細胞外部分だけではなく、細胞外部分に連結された膜貫通部分および細胞質部分を有している。これらの抗原は、腫瘍細胞の表面にのみ提示され正常細胞の表面には提示されない場合がある。腫瘍抗原は、腫瘍細胞に特異的に発現していたり、正常細胞に比べて腫瘍に特異的な変異を有していたりすることがある。このような場合、それらは腫瘍特異的抗原（TSA）と呼ばれる。TSAは腫瘍細胞に特有のものであり、体内の他の細胞では発生しない。腫瘍抗原は、腫瘍細胞だけでなく、抗原に対する免疫の寛容状態を誘発できない症状下で、正常細胞にも発現することがあり、腫瘍関連抗原（TAA）と呼ばれる。TAAは、正常細胞と比較して、腫瘍細胞で過剰に発現するか、または正常組織に比べて腫瘍組織の構造がコンパクトでないため、腫瘍細胞で容易に抗体に結合することができる。
本発明において、「特異的結合」という用語は通常、サンプル中に存在する相同結合リガンドタンパク質を認識して結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識または結合しない抗体またはリガンドを指す。
本発明において、「CD19」という用語は通常、白血病前駆体細胞で検出可能な抗原決定基である分化抗原群19タンパク質を指す。ヒトおよびマウスCD19のアミノ酸および核酸配列は、GenBank、UniProtおよびSwiss-Protなどの公開データベースで確認することができる。例えば、ヒトCD19のアミノ酸配列は、UniProt/Swiss-Protアクセッション番号P15391で確認することができ、ヒトCD19をコードするヌクレオチド配列は、NCBIアクセッション番号NM_001178098で確認することができる。CD19はほとんどのB系列がんで発現しており、また、B細胞前駆細胞の初期マーカーでもある。本発明において、「CD19」は、全長野生型CD19の点突然変異、断片、挿入、欠失、スプライス変異体などの変異を含むタンパク質を含み得る。
本発明において、「含まない」という用語は通常、ある行為、構造または構造の可能性を排除することを意味する。例えば、AはBを含まないというのは通常、Aの中にBが出現する可能性を排除するという意味である。
本発明において、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、通常、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質またはペプチド配列を含むアミノ酸の最大数に制限がない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに連結された2つまたはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含むことができる。本発明において、該用語は、当該技術分野でも一般的にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーと呼ばれる2つの短鎖と、例えば当該技術分野で一般的にタンパク質と呼ばれる長鎖を指し、多くの種類が存在する。「ポリペプチド」は、例えば、生物学的活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質などを含む。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチドまたはそれらの組み合わせが含まれる。
本発明は、本明細書に記載の特定のタンパク質およびヌクレオチドに加えて、その機能的変異体、誘導体、アナログ、ホモログおよびその断片を含み得る。
「機能的変異体」という用語は、天然に存在する配列に対して実質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または、実質的に同一のヌクレオチド配列によってコードされ、天然に存在する配列の1種類または複数種類の活性を有することができるポリペプチドを指す。本発明の文脈において、任意の所与の配列の変異体は、そのうちの残基の特定の配列（アミノ酸またはヌクレオチド残基のいずれか）が上記のポリペプチドまたはポリヌクレオチドが実質的に少なくとも1種類の内因性機能の配列を保持するように改変されていることを意味する。変異体配列は、元の機能的活性が維持される限り、天然に存在するタンパク質および/またはポリヌクレオチドに存在する少なくとも1つのアミノ酸残基および/またはヌクレオチド残基の付加、欠失、置換、改変、置換および/または変異によって得ることができる。本発明において、「誘導体」という用語は通常、得られるポリペプチドまたはポリヌクレオチドが少なくとも1種類の内因性機能を実質的に保持する限り、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連して、配列の1つ（または複数）のアミノ酸残基から/対しての任意の置換、変異、改変、置換、欠失および/または付加を含むことを意味する。
本発明において、「アナログ」という用語は通常、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの任意の模倣体、すなわち、該模倣体により模倣されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの少なくとも1種類の内因性機能を有する化学化合物を含む。一般的に、改変された配列が実質的に必要な活性または能力を保持する限り、アミノ酸置換、例えば、少なくとも1つ（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または20つ以上）のアミノ酸置換を行うことができる。アミノ酸置換には、非天然に存在するアナログを使用することが含まれる場合がある。本発明で使用されるタンパク質またはポリペプチドはまた、サイレント変化を生じ、機能的に同等のタンパク質をもたらすアミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有し得る。内因性機能を保持する限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および/または両性特性の類似性に基づいて、意図的にアミノ酸置換を行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸やグルタミン酸が、正に帯電したアミノ酸にはリジンとアルギニンが、極性頭部基のない同様の親水性の値を持つアミノ酸にはアスパラギン、グルタミン、セリンや、スレオニン、チロシンが含まれている。
本発明において、「ホモログ」という用語は通常、野生型アミノ酸配列や野生型ヌクレオチド配列に対して特定の相同性を持つアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を指す。「相同性」という用語は、配列の「同一性」に相当する。相同配列は、サブジェクト配列に対して少なくとも80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%または99.9%同一のアミノ酸配列を含み得る。一般的に、ホモログは、サブジェクトアミノ酸配列と同一の活性部位などを含むことになる。相同性は、類似性（すなわち、化学的性質/機能が類似したアミノ酸残基）を基準に考えることもできるし、配列の同一性を基準に表現することも可能である。本発明に記載のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列のSEQ ID NOのいずれか１つがパーセント同一性を有する配列は、言及されたSEQ ID NOの全長にわたって上記のパーセント同一性を有するものを指す。配列同一性を特定するために、配列比較を行うことができ、これは当該技術分野における当業者に周知の種々の手段、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLEまたはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアなどを用いて行うことができる。当該技術分野における当業者であれば、比較される全長配列において最適な比較を実現するために必要な任意のアルゴリズムを含め、比較に使用する適切なパラメータを決定することが可能である。
本発明において、「ベクター」という用語は通常、発現させたいヌクレオチド配列に効率よく連結された発現制御配列を有する組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。上記のベクターは、発現に十分なシスエレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞またはインビトロ発現系で提供されてもよい。上記のベクターは、コスミド、プラスミド（例えば、裸またはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む上記の組換えポリヌクレオチドに組み込むことができる当該技術分野で既知の全ての発現ベクターを含んでいてもよい。「レンチウイルス」という用語は、レンチウイルス科レンチウイルス属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも非分裂性の細胞に感染するユニークなウイルスであり、大量の遺伝情報を宿主細胞のDNAに伝達することができるため、遺伝子伝達ベクターとして最も効果的な方法の一つになる。HIV、SIV、FIVはすべてレンチウイルスの例である。「レンチウイルスベクター」という用語は通常、特に、Milone et al.、Mol.Ther.l7(8):1453 - 1464(2009)に提供された自己不活性化レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指す。臨床的に使用できるレンチウイルスベクターの他の例として、例えばOxford BioMedicaによるLENTIVECTOR（商標）遺伝子導入技術、LentigenによるLENTIMAX（商標）ベクターシステムなどが含まれるが、これらに限定されない。非臨床的なレンチウイルスベクターも利用可能であり、当業者には既知である。
本発明において、「被験者」という用語は通常、免疫応答を引き起こすことができる生体（例えば哺乳類、ヒト）を指す。
本発明において、「治療」という用語は通常、1種類または複数種類の治療法（例えば、本発明のCARなどの1種類または複数種類の治療薬）の投与による増殖性疾患の進行、重症度および/または持続期間を遅延または改善するか、または増殖性疾患の1種類または複数種類の症状（例えば、1種類または複数種類の識別可能な症状）を改善することを意味する。本発明において、「治療」という用語は、腫瘍成長などの増殖性疾患の少なくとも1種類の測定可能な物理的パラメータを改善し、必ずしも患者によって識別可能ではないことも意味する。本発明における「治療」という用語は、例えば、識別可能な症状を安定化させる物理的方法、物理的パラメータを安定化させる生理学的方法、またはその両方によって増殖性疾患の進行を抑制することを指す場合もある。いくつかの場合に、「治療」という用語は、腫瘍のサイズまたは癌細胞数の減少または安定化を意味する場合がある。
本発明において、「包含」という用語は、通常、明確に特定された特徴を含むことを意味するが、他の要素を除外するものではない。
本発明において、「約」という用語は、通常、指定された値の上下0.5%～10%の範囲、例えば指定された値の上下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、または10%の範囲に変動するものを指す。
一方、本発明は、キメラ抗原受容体CARおよび/またはそのコード要素を含み得る免疫細胞を提供する。
ターゲティング部分
本発明に記載の免疫細胞のCARは、ターゲティング部分を含んでよい。上記のターゲティング部分は、抗原結合ドメインであってよく、その選択は標的細胞の表面を規定するリガンドの種類および数によるものである。1つの側面では、CAR媒介T細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインをCARに遺伝子操作することによって、標的抗原に誘導することができる。いくつかの場合に、上記のターゲティング部分は、腫瘍抗原に特異的に結合および/または認識することができる。上記の腫瘍抗原は腫瘍特異的抗原（TSA）または腫瘍関連抗原（TAA）であってよい。本発明のCARは、標的とする所望の腫瘍抗原に基づいて、所望の抗原に特異的な適切な抗原結合部分を含むように生物工学によって作られ得る。上記のターゲティング部分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびその機能的断片が含まれるがこれらに限定されないもの、重鎖可変ドメイン（VH）、軽鎖可変ドメイン（VL）およびラクダ科由来のナノボディの可変ドメイン（VHH）などの単一ドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されないものであってよい。いくつかの場合に、本発明に記載のターゲティング部分は、抗体単鎖可変領域scFvであってよい。CARのターゲティング部分は、一般的に、実用化を促進するために、抗体または抗体断片のためのヒトまたはヒト化の抗原結合ドメインの残基を含んでよい。
本発明に記載の免疫細胞のCARは、ターゲティング部分を含んでよい。上記のターゲティング部分は、抗原結合ドメインであってよく、その選択は標的細胞の表面を規定するリガンドの種類および数によるものである。1つの側面では、CAR媒介T細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合する抗原結合ドメインをCARに遺伝子操作することによって、標的抗原に誘導することができる。いくつかの場合に、上記のターゲティング部分は、腫瘍抗原に特異的に結合および/または認識することができる。上記の腫瘍抗原は腫瘍特異的抗原（TSA）または腫瘍関連抗原（TAA）であってよい。本発明のCARは、標的とする所望の腫瘍抗原に基づいて、所望の抗原に特異的な適切な抗原結合部分を含むように生物工学によって作られ得る。上記のターゲティング部分は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびその機能的断片が含まれるがこれらに限定されないもの、重鎖可変ドメイン（VH）、軽鎖可変ドメイン（VL）およびラクダ科由来のナノボディの可変ドメイン（VHH）などの単一ドメイン抗体が含まれるが、これらに限定されないものであってよい。いくつかの場合に、本発明に記載のターゲティング部分は、抗体単鎖可変領域scFvであってよい。CARのターゲティング部分は、一般的に、実用化を促進するために、抗体または抗体断片のためのヒトまたはヒト化の抗原結合ドメインの残基を含んでよい。
いくつかの場合に、本発明に記載のCARのターゲティング部分は、CD19標的を標的化することができる。例えば、本発明に記載のCARのターゲティング部分は、ヒト化CD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域であってよく、例えば、上記のヒト化CD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域は、SEQ ID NO.41で表されるアミノ酸配列を有し、また、例えば、上記のヒト化CD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域は、SEQ ID NO.11で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。または、ターゲティング部分は、完全ヒトCD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域であってもよい。例えば、上記の完全ヒトCD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域は、SEQ ID NO.42で表されるアミノ酸配列を有し、また、例えば、完全ヒトCD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域は、SEQ ID NO.12で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
他の場合には、本発明に記載のCARのターゲティング部分は、CD22標的を標的化することができる。例えば、上記のターゲティングCD22のターゲティング部分は、SEQ ID NO.48で表されるアミノ酸配列によってコードされることができる。例えば、上記のターゲティングCD22のターゲティング部分は、SEQ ID NO.35で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
他の場合には、本発明に記載のCARのターゲティング部分は、GPC3標的を標的化することができる。例えば、上記のターゲティングGPC3のターゲティング部分は、SEQ ID NO.54で表されるヌクレオチド配列を有し得る。例えば、上記のターゲティングGPC3のターゲティング部分は、SEQ ID NO.36で表されるヌクレオチド配列を有し得る。
本発明において、上記のCARのターゲティング部分は、CD19、CD22およびGPC3からなる群から選ばれる標的に特異的に結合および/または認識することができる。
本発明に記載のCARのターゲティング部分は、1種類または1種類以上（例えば、2種類または2種類以上）の標的のターゲティング部分に特異的に結合および/または認識することができる。いくつかの場合に、本発明に記載のCARは、CD19、CD22およびGPC3からなる群から選ばれる標的に対する結合および/または認識の特異性を有するターゲティング部分を含み得る。他の場合には、本発明に記載のCARのターゲティング部分は、CD19およびCD22からなる群から選ばれる第1の標的に対する結合および/または認識の特異性を有する第1のターゲティング部分と、CD19およびGPC3ならびにCD22およびGPC3からなる群から選ばれる第2の標的に対する結合および/または認識の特異性を有する第2のターゲティング部分を含み得る。
膜貫通領域
本発明に記載の免疫細胞のCARは、膜貫通領域を含み得る。いくつかの場合に、上記のヒンジ領域は、CARにおける1つのドメインに自然に関連する膜貫通領域であり得る。他の場合に、膜貫通領域は、そのようなドメインが同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを避けるように、アミノ酸によって改変されることにより、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小にすることができる。膜貫通ドメインは、天然由来または合成由来のものであってよい。天然由来の場合、該ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に誘導することが可能である。本発明における特定の用途のための膜貫通ドメインは、当該技術分野における利用可能なものであるか、またはそれらに誘導されたものであってもよい。膜貫通ドメインは、合成されるものであってよく、その場合、主に疎水性のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの場合に、上記の膜貫通領域は、例えば、SEQ ID NO. 1で表されるアミノ酸配列を有し得るTMEM59タンパク質の膜貫通領域であり得る。また、例えば、上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域は、SEQ ID NO. 5で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。他の場合には、上記の膜貫通領域は、例えば、SEQ ID NO. 37で表されるアミノ酸配列を有し得るCD8の膜貫通領域であり得、また、例えば、上記のCD8の膜貫通領域は、SEQ ID NO. 34で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
本発明に記載の免疫細胞のCARは、膜貫通領域を含み得る。いくつかの場合に、上記のヒンジ領域は、CARにおける1つのドメインに自然に関連する膜貫通領域であり得る。他の場合に、膜貫通領域は、そのようなドメインが同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを避けるように、アミノ酸によって改変されることにより、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小にすることができる。膜貫通ドメインは、天然由来または合成由来のものであってよい。天然由来の場合、該ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に誘導することが可能である。本発明における特定の用途のための膜貫通ドメインは、当該技術分野における利用可能なものであるか、またはそれらに誘導されたものであってもよい。膜貫通ドメインは、合成されるものであってよく、その場合、主に疎水性のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの場合に、上記の膜貫通領域は、例えば、SEQ ID NO. 1で表されるアミノ酸配列を有し得るTMEM59タンパク質の膜貫通領域であり得る。また、例えば、上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域は、SEQ ID NO. 5で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。他の場合には、上記の膜貫通領域は、例えば、SEQ ID NO. 37で表されるアミノ酸配列を有し得るCD8の膜貫通領域であり得、また、例えば、上記のCD8の膜貫通領域は、SEQ ID NO. 34で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
ヒンジ領域
ある場合には、膜貫通領域は、ヒンジを介してCARのターゲティング部分などの細胞外領域に連結することができる。本発明に記載の免疫細胞のCARは、ヒンジ領域を含み得る。いくつかの場合に、上記のヒンジ領域は、例えば、SEQ ID NO.2で表されるアミノ酸配列を有するTMEM59タンパク質のヒンジ領域であり得、また、例えば、上記のTMEM59タンパク質は、SEQ ID NO. 6で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。他の場合には、上記のヒンジ領域は、CD8のヒンジ領域であり得る。例えば、上記のCD8のヒンジ領域は、SEQ ID NO.38で表されるアミノ酸配列を有し、また、例えば、上記のCD8のヒンジ領域は、SEQ ID NO. 8で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
ある場合には、膜貫通領域は、ヒンジを介してCARのターゲティング部分などの細胞外領域に連結することができる。本発明に記載の免疫細胞のCARは、ヒンジ領域を含み得る。いくつかの場合に、上記のヒンジ領域は、例えば、SEQ ID NO.2で表されるアミノ酸配列を有するTMEM59タンパク質のヒンジ領域であり得、また、例えば、上記のTMEM59タンパク質は、SEQ ID NO. 6で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。他の場合には、上記のヒンジ領域は、CD8のヒンジ領域であり得る。例えば、上記のCD8のヒンジ領域は、SEQ ID NO.38で表されるアミノ酸配列を有し、また、例えば、上記のCD8のヒンジ領域は、SEQ ID NO. 8で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
細胞内ドメイン
本発明において、上記の免疫細胞のCARは細胞内ドメインをさらに含み得る。細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み得る。本発明に用いられるためのCARにおける細胞内シグナル伝達ドメインの例として、一般的に、抗原受容体に接着後にシグナル伝達を引き起こすために共同作用するT細胞受容体（TCR）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体および同じ機能的能力を持つ任意の組換え配列が含まれ得る。
本発明において、上記の免疫細胞のCARは細胞内ドメインをさらに含み得る。細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメインを含み得る。本発明に用いられるためのCARにおける細胞内シグナル伝達ドメインの例として、一般的に、抗原受容体に接着後にシグナル伝達を引き起こすために共同作用するT細胞受容体（TCR）および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体および同じ機能的能力を持つ任意の組換え配列が含まれ得る。
TCRだけで産生されたシグナルは、T細胞を完全に活性化するのに十分ではなく、二次的シグナルまたは共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、T細胞活性化は、2つの異なる種類の細胞質シグナル伝達配列、すなわちTCRを介して抗原依存的一次活性化を開始させるシグナル伝達配列（一次細胞質シグナル伝達配列）および抗原非依存的に作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するシグナル伝達配列（二次細胞質シグナル伝達配列、例えば共刺激ドメイン）によって媒介されると考えられる。
一次細胞質シグナル伝達配列は、TCR複合体の一次活性化を刺激的方法又は阻害的方法で調節する。刺激的方法で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、例えば免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ITAM）などのシグナル伝達モチーフを含むことがある。本発明において一次細胞質シグナル伝達配列として使用可能なITAMは、当該技術分野における任意の実行可能なシグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの場合に、本発明に記載のシグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO.9で表されるヌクレオチド配列を有するCD3ζのシグナル伝達ドメインであり得る。
いくつかの場合に、本発明に記載のCARの細胞内ドメインは、CD3ζシグナル伝達ドメインを含み得る。または、上記のシグナル伝達ドメインは、本発明に記載のCARの機能の遂行に有用であれば、任意の他の実現可能な1つまたは複数の細胞内ドメインと会合することもできる。例えば、CARの細胞内ドメインは、CD3ζ鎖部分と共刺激ドメインを含み得る。共刺激ドメインは通常、CARに含まれている共刺激分子の細胞内ドメインの一部を指す。共刺激分子は通常、抗原に対するリンパ球の効果的な応答に必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子を指す。本発明に適用される共刺激分子の例として、当該技術分野で利用可能なものが含まれ得る。いくつかの場合に、本発明に記載の共刺激ドメインは4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記の4-1BB共刺激ドメインは、SEQ ID NO. 10で表されるヌクレオチド配列を有し得る。
TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片
本発明に記載の免疫細胞は、細胞膜にあるTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含み得る。
本発明に記載の免疫細胞は、細胞膜にあるTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含み得る。
いくつかの場合に、本発明に記載の免疫細胞は、TMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含み得る。いくつかの場合に、上記のTMEM59タンパク質はヒトTMEM59タンパク質であり得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域は、SEQ ID NO. 1で表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質のヒンジ領域は、SEQ ID NO. 2で表されるアミノ酸配列を有し得る。
いくつかの場合に、上記の免疫細胞は、TMEM59タンパク質および/または少なくとも上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片を含み得る。いくつかの場合に、上記の機能的断片は、ヒトTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片であり得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域は、SEQ ID NO. 1で表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質のヒンジ領域は、SEQ ID NO. 2で表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO. 3で表されるアミノ酸配列を有し得る。
いくつかの場合に、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、上記の免疫細胞の細胞膜に位置してもよい。他の場合には、上記の免疫細胞は、改変されることによって細胞膜に上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含むことができる。
本発明に記載のCARは、シグナルペプチドをさらに含むことがある。いくつかの場合に、上記のシグナルペプチドは、CD8シグナルペプチドを含み得る。例えば、上記のCD8シグナルペプチドは、SEQ ID NO.46で表されるアミノ酸配列を有し得、例えば、上記のCD8シグナルペプチドは、SEQ ID NO.16で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
本発明に記載の免疫細胞は、上記のCARおよび上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含み得る。いくつかの場合に、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、上記の免疫細胞の細胞膜に位置してもよい。
TMEM59のキメラ抗原受容体共発現
いくつかの場合に、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含まなくてもよい。いくつかの具体的な場合に、上記のCARは、上記のターゲティング部分、上記のヒンジ領域、上記の膜貫通領域、上記のシグナル伝達ドメイン、および上記の共刺激ドメインを含み得る。上記のCARは、上記のターゲティング部分、CD8のヒンジ領域、CD8の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。いくつかの場合に、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を共発現することができる。いくつかの場合に、上記のCARの細胞内ドメインは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片に直接または間接的に連結されていてもよい。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 49、51、55および56のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 19、21、25および28のいずれか1つで表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.1-3のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.4-6のいずれか1つで表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
いくつかの場合に、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含まなくてもよい。いくつかの具体的な場合に、上記のCARは、上記のターゲティング部分、上記のヒンジ領域、上記の膜貫通領域、上記のシグナル伝達ドメイン、および上記の共刺激ドメインを含み得る。上記のCARは、上記のターゲティング部分、CD8のヒンジ領域、CD8の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。いくつかの場合に、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を共発現することができる。いくつかの場合に、上記のCARの細胞内ドメインは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片に直接または間接的に連結されていてもよい。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 49、51、55および56のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 19、21、25および28のいずれか1つで表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.1-3のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.4-6のいずれか1つで表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
例えば、上記のCARは、ヒト化CD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域のターゲティング部分、CD8のヒンジ領域、CD8の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 49で表されるアミノ酸配列を有し得る。また、例えば、上記のCARは、SEQ ID NO.19で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。いくつかの場合に、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を共発現することができる。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO. 3中で表されるアミノ酸配列を有し得る。また、例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO. 4中で表されるアミノ酸配列によってコードされることができる。本発明に記載のCARにおける上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を共発現するタンパク質は、SEQ ID NO. 50または52で表されるアミノ酸配列を有し得、また、例えば、本発明に記載のCARにおける上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を共発現するタンパク質は、SEQ ID NO. 20、32、36および29のいずれか1つで表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
例えば、上記のCARは、完全ヒトCD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域のターゲティング部分、CD8のヒンジ領域、CD8の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO.51で表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO.21で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。いくつかの場合に、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を共発現することができる。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.3中で表されるヌクレオチド配列を有し得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.4中で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
例えば、上記のCARは、GPC3ターゲティング部分、CD8のヒンジ領域、CD8の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO.55で表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO.25で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。いくつかの場合に、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を共発現することができる。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.3中で表されるヌクレオチド配列を有し得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.4中で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。例えば、上記のCARは、CD19およびCD22ターゲティング部分、CD8のヒンジ領域、CD8の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO.28で表されるヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの場合に、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を共発現することができる。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.3中で表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO.4中で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
本発明において、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片と共に、切断ペプチドによって共発現可能である。例えば、上記の切断ペプチドは、2A配列であり得る。また、例えば、上記の2A配列は、SEQ ID NO.47で表されるアミノ酸配列を有し得、また、例えば、上記の2A配列は、SEQ ID NO.17で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。本発明において、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片と共に、IRES配列によって共発現可能である。また、例えば、上記のIIRES配列は、SEQ ID NO.18で表されるヌクレオチド配列を有し得る。
TMEM59改変のキメラ抗原受容体
他の場合には、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含み得る。いくつかの具体的な場合に、上記のCARは、上記のターゲティング部分、上記のヒンジ領域、上記の膜貫通領域、上記のシグナル伝達ドメイン、および上記の共刺激ドメインを含み得る。いくつかの場合に、上記のCARは、上記のターゲティング部分、TMEM59タンパク質のヒンジ領域、TMEM59タンパク質の膜貫通領域、上記のシグナル伝達ドメイン、および上記の共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記のCARは、上記のターゲティング部分、TMEM59タンパク質のヒンジ領域、TMEM59タンパク質の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。
他の場合には、上記のCARは、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含み得る。いくつかの具体的な場合に、上記のCARは、上記のターゲティング部分、上記のヒンジ領域、上記の膜貫通領域、上記のシグナル伝達ドメイン、および上記の共刺激ドメインを含み得る。いくつかの場合に、上記のCARは、上記のターゲティング部分、TMEM59タンパク質のヒンジ領域、TMEM59タンパク質の膜貫通領域、上記のシグナル伝達ドメイン、および上記の共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記のCARは、上記のターゲティング部分、TMEM59タンパク質のヒンジ領域、TMEM59タンパク質の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。
例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 43、57および44のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 13、14、31、32および33のいずれか1つで表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
例えば、上記のCARは、完全ヒトCD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域のターゲティング部分、TMEM59タンパク質のヒンジ領域、TMEM59タンパク質の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 44で表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 7または33で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
例えば、上記のCARは、CD19およびCD22のターゲティング部分、TMEM59タンパク質のヒンジ領域、TMEM59タンパク質の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO.57で表されるアミノ酸配列を有し得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 31または32で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
例えば、上記のCARは、GPC3ターゲティング部分、TMEM59タンパク質のヒンジ領域、TMEM59タンパク質の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO.43で表されるヌクレオチド配列を有し得る。例えば、上記のCARは、SEQ ID NO. 13または14で表されるヌクレオチド配列によってコードされることができる。
ベクター、細胞および調製方法
一方、本発明は、上記のCARポリペプチドまたはその一部をコードすることができる1種類または複数種類の単離された核酸を提供した。一般的に、CARをコードする天然または合成の核酸の発現は、CARポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。該ベクターは真核細胞への複製や組み込みに適したものとすることができる。典型的なクローニングベクターには、所望の核酸配列の発現を調節するために使用することができる転写および翻訳のターミネーター、初期配列、プロモーターが含まれている。
一方、本発明は、上記のCARポリペプチドまたはその一部をコードすることができる1種類または複数種類の単離された核酸を提供した。一般的に、CARをコードする天然または合成の核酸の発現は、CARポリペプチドまたはその一部をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことにより達成される。該ベクターは真核細胞への複製や組み込みに適したものとすることができる。典型的なクローニングベクターには、所望の核酸配列の発現を調節するために使用することができる転写および翻訳のターミネーター、初期配列、プロモーターが含まれている。
所望の分子をコードする核酸配列は、例えば標準的な技術を用いて、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングすることにより、または遺伝子を含むことが知られているベクターから該遺伝子を得ることにより、または遺伝子を含む細胞および組織から直接単離することによりなど、当技術分野において既知の組換え方法を用いて得ることができる。核酸は、例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドが含まれるがこれらに限定されないベクターにクローニングすることができる。特に、デスティネーションベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シークエンスベクターを含み得る。
他方、本発明は、本発明に記載の核酸またはベクターを含む細胞を提供した。いくつかの場合に、上記の細胞は、本発明に記載のCARをコードする核酸を含むインビトロ細胞であり得る。他の場合、インビトロ細胞などの本発明に記載の細胞は、本発明に記載のCARによってコードされるポリペプチドを含み得る。
本発明に記載の核酸、ベクターまたはポリペプチドについては、任意の細胞を宿主細胞として使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞などの高等真核細胞であり得る。適切な原核細胞は、グラム陰性菌またはグラム陽性菌などの真正細菌が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合に、細胞は、ヒト細胞であり得る。他の場合には、細胞は、免疫細胞であり得る。本発明に記載の免疫細胞は、Tリンパ球、Bリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、TCR発現細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ球細胞、巨核球、単球、マクロファージ、血小板、胸腺細胞および骨髄性細胞からなる群から選択され得る。いくつかの場合に、上記の免疫細胞は、Tリンパ球を含み得る。他の場合には、Tリンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、自己Tリンパ球、操作された自己Tリンパ球（eACTTM）、同種T細胞、異種T細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合に、Tリンパ球はドナー被験者から得ることができる。本発明に記載の細胞は、当該技術分野で知られている任意の由来から得ることができる。例えば、Tリンパ球は、造血幹細胞集団からインビトロで分化させることができるか、または、被験者から得ることができる。Tリンパ球は、例えば、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織および腫瘍から得ることができる。さらに、Tリンパ球は、当該技術分野で利用可能な1つまたは複数のTリンパ球系に由来可能である。T細胞はまた、当該技術分野における当業者に知られている任意の数の技術（例えばFICOLLTM単離および/またはアフェレシス（apheresis））によって被験者から採取された血液サンプルから得ることができる。
遺伝子を細胞に導入する方法、および遺伝子を細胞に発現させる方法は、当該技術分野で知られている。ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳類、細菌、酵母または昆虫の細胞に、当該技術分野におけるいずれかの方法を用いて導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞に移すことができる。
宿主細胞に核酸を導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポソームトランスフェクション法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーションなどが含まれる。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を製造する方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, New Yorkおよび他のウイルス学および分子生物学に関するマニュアルを参照されたい。）。核酸を宿主細胞に導入するための化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系と、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リピドームを含むリポソーム系が含まれる。目的の核酸を宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクターやRNAベクターの利用が含まれる。現在広く用いられている哺乳類（例えばヒト細胞）への遺伝子挿入方法には、ウイルスベクターを用いることができ、ベクターとして用いられるウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも1種類の生物で機能する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および1種類または複数種類の任意のマーカーを含む。
医薬組成物
本発明は、上記の免疫細胞および任意に薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供した。いくつかの場合に、上記の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントを含み得る。他の場合には、医薬組成物は、賦形剤を含み得る。他の場合には、医薬組成物は、本発明に記載のCARをコードするポリヌクレオチドを含み得る。他の場合には、上記の医薬組成物は、本発明に記載のポリヌクレオチドによってコードされるCARを含み得る。他の場合には、上記の組成物は、CARを含むT細胞を含み得る。
本発明は、上記の免疫細胞および任意に薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供した。いくつかの場合に、上記の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および/またはアジュバントを含み得る。他の場合には、医薬組成物は、賦形剤を含み得る。他の場合には、医薬組成物は、本発明に記載のCARをコードするポリヌクレオチドを含み得る。他の場合には、上記の医薬組成物は、本発明に記載のポリヌクレオチドによってコードされるCARを含み得る。他の場合には、上記の組成物は、CARを含むT細胞を含み得る。
本発明の医薬組成物は、非経口送達、吸入、または消化管送達、例えば経口投与のために調製することができる。このような薬学的に許容可能な組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。いくつかの場合に、緩衝液は、該医薬組成物を生理的pHまたはわずかに低いpH、一般的には約5～～約8のpHの範囲に維持するために使用される。いくつかの場合に、非経口投与が考慮される場合、医薬組成物は、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態である。いくつかの場合に、本発明に記載の医薬組成物は、適切に保存された無菌等張液として製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、製剤は、製品の制御されたまたは持続的な放出を提供するポリマー化合物、ビーズまたはリポソームの所望の分子を含むように調製され、次にデポ注射（depot injection）によって送達されることができる。いくつかの場合に、埋め込み型の医薬品送達デバイスを使用して、所望の分子を導入することができる。
使用および方法
一方、本発明は、免疫細胞に、TMEM59タンパク質および/または少なくとも上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片を、その細胞膜上に発現させることを含む免疫細胞の増殖を促進する方法を提供した。抗原刺激後のCAR-T細胞のインビトロでの増幅はフローサイトメトリーで測定することが可能であり、再刺激を行わずに維持されたCAR-T細胞の増幅も測定できる（例えばMiloneら、Molecular Therapy 17 (8) :1453-1464(2009)を参照）。他方、上記の免疫細胞は、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を発現するように適切な条件下で培養後、カウントされることができる（例えば、セルカウンターでカウントする）。
一方、本発明は、免疫細胞に、TMEM59タンパク質および/または少なくとも上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片を、その細胞膜上に発現させることを含む免疫細胞の増殖を促進する方法を提供した。抗原刺激後のCAR-T細胞のインビトロでの増幅はフローサイトメトリーで測定することが可能であり、再刺激を行わずに維持されたCAR-T細胞の増幅も測定できる（例えばMiloneら、Molecular Therapy 17 (8) :1453-1464(2009)を参照）。他方、上記の免疫細胞は、上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を発現するように適切な条件下で培養後、カウントされることができる（例えば、セルカウンターでカウントする）。
本発明に記載の免疫細胞は、Tリンパ球を含み得る。例えば、T細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、自己T細胞、操作された自己T細胞（eACTTM）、同種T細胞、異種T細胞、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合に、T細胞はドナー被験者から得ることができる。他の場合には、ドナー被験者は、がんや腫瘍に罹患するヒト患者であり得る。他の場合、ドナー被験者は、がんまたは腫瘍に罹患していないヒト患者であり得る。
他方、本発明は、メモリー免疫細胞の産生を促進する方法を提供した。いくつかの場合に、本発明に記載の免疫細胞は、安定したインビボでのTリンパ球増殖過程を経ると共に、長期間持続することができる。他の場合には、本発明に記載の免疫細胞は、追加の腫瘍形態または成長を抑制するために再活性化することができるメモリー免疫細胞に発達することができる。例えば、本発明の免疫細胞は、インビボでの強力なT細胞増殖を経験し、血液中や骨髄中に高レベルで特異的メモリーT細胞を形成すると共に長期間持続して、キメラ抗原受容体Tリンパ球の生存期間を延長させることができる。
他方、本発明は、腫瘍を治療するための医薬品の調製における上記の免疫細胞または上記の医薬組成物の使用を提供した。いくつかの場合に、上記の腫瘍は、固形腫瘍および/または非固形腫瘍を含み得る。上記の固形腫瘍は通常、嚢胞や液体エリアを含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍には良性と悪性がある。非固形腫瘍は、例えば、血液腫瘍であり得る。血液がんは、白血病やリンパ腫などの血液や骨髄のがんである。例えば、上記の腫瘍は、Bリンパ性白血病および/または肝癌を含み得る。
他方、本発明は、上記の免疫細胞に、TMEM59タンパク質および/または少なくとも上記のTMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片をその細胞膜上に発現させることを含む腫瘍に対する免疫細胞の殺傷能を増強する方法をさらに提供した。いくつかの場合に、上記の発現は、上記の免疫細胞に上記のTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片をコードする核酸を含ませることを含み、適切な条件下で本発明に記載の核酸により細胞を形質導入する。例えば、CARをコードする核酸で細胞を形質導入する。また、例えば、細胞は、CARをコードする核酸を含むベクターで形質導入される。
本発明は、上記の免疫細胞を腫瘍細胞に接触させることを含む腫瘍細胞の増殖抑制および/または殺傷の方法をさらに提供した。ここで、上記の方法はインビトロ法またはエクスビボ法を含む。いくつかの場合に、上記の免疫細胞と腫瘍細胞の接触は、1：500～500：1またはそれらの間の任意の数の比率で行うことができる。いくつかの場合に、上記の免疫細胞と腫瘍細胞の数の比率は、1:100～100:1の範囲およびそれらの間の任意の比率であってもよい。例えば、20：1～1：20とすることができる。
以下の実施例は、いかなる理論によっても限定されることを望むことなく、本発明に係る融合タンパク質、調製方法および使用などを釈明することのみを意図しており、本願発明の範囲を限定するものではない。
実施例
実施例1. キメラ抗原受容体配列の特定
H63は、ヒト化CD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域を表し、配列構造がSEQ ID NO: 11で表され、21D4は、完全ヒトCD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域を表し、配列構造がSEQ ID NO: 12で表され、GPC3ターゲティング部分の配列構造がSEQ ID NO: 36で表され、CD22ターゲティング部分の配列構造がSEQ ID NO: 35で表され、緑色蛍光タンパク質（GFP）の配列構造がSEQ ID NO: 15で表される。
実施例1. キメラ抗原受容体配列の特定
H63は、ヒト化CD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域を表し、配列構造がSEQ ID NO: 11で表され、21D4は、完全ヒトCD19モノクローナル抗体の単鎖可変領域を表し、配列構造がSEQ ID NO: 12で表され、GPC3ターゲティング部分の配列構造がSEQ ID NO: 36で表され、CD22ターゲティング部分の配列構造がSEQ ID NO: 35で表され、緑色蛍光タンパク質（GFP）の配列構造がSEQ ID NO: 15で表される。
1.1 キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59配列の特定
キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-腫瘍特異的抗原結合単鎖可変領域-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES配列または2A配列-TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列。CD8シグナルペプチド、ヒトCD8ヒンジ領域、ヒトCD8膜貫通領域、ヒト4-1BB共刺激ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン、およびTMEM59遺伝子完全長配列は、米国国立医学図書館遺伝子データベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）から検索された。そして、コドンはヒトの細胞で発現しやすいように最適化されている。
キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-腫瘍特異的抗原結合単鎖可変領域-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES配列または2A配列-TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列。CD8シグナルペプチド、ヒトCD8ヒンジ領域、ヒトCD8膜貫通領域、ヒト4-1BB共刺激ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン、およびTMEM59遺伝子完全長配列は、米国国立医学図書館遺伝子データベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）から検索された。そして、コドンはヒトの細胞で発現しやすいように最適化されている。
ここで、CD8シグナルペプチドはSEQ ID NO: 16で表されるヌクレオチド配列、ヒトCD8ヒンジ領域はSEQ ID NO: 8で表されるヌクレオチド配列、ヒトCD8膜貫通領域はSEQ ID NO: 7で表されるヌクレオチド配列、ヒト4-1BB共刺激ドメインはSEQ ID NO: 10で表されるヌクレオチド配列、CD3ζシグナル伝達ドメインはSEQ ID NO: 9で表されるヌクレオチド配列、TMEM59遺伝子完全長配列は、SEQ ID NO: 4で表されるヌクレオチド配列を含み得る。
上記の遺伝子配列は、CD8シグナルペプチド、腫瘍特異的抗原結合単鎖可変領域、ヒトCD8ヒンジ領域、ヒトCD8膜貫通領域、ヒト4-1BB共刺激ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン、2A（SEQ ID NO: 17）またはIRES（SEQ ID NO: 18）、TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列の順で連結され、全遺伝子合成によりレンチウイルスベクター（Clontech 631988より）にライゲーションされた。
キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59配列構造は以下の通りであり、
H63 CAR-2A-TMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-H63-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-2A-TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 20で表され、
21D4 CAR-2A-TMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-21D4-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-2A- TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 22で表され、
GPC3 CAR-IRES-TMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-GPC3-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 26で表され、
CD19CD22 CAR-IRES-TMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-CD19CD22-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 29で表される。
H63 CAR-2A-TMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-H63-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-2A-TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 20で表され、
21D4 CAR-2A-TMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-21D4-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-2A- TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 22で表され、
GPC3 CAR-IRES-TMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-GPC3-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 26で表され、
CD19CD22 CAR-IRES-TMEM59配列構造：CD8シグナルペプチド-CD19CD22-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-TMEM59タンパク質完全長遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 29で表される。
1.2 TMEM59改変キメラ抗原受容体配列の特定
TMEM59改変キメラ抗原受容体配列構造：CD8シグナルペプチド-腫瘍特異的抗原結合単鎖可変領域-ヒトTMEM59ヒンジ領域-ヒトTMEM59膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン遺伝子配列。CD8シグナルペプチド、ヒトCD8ヒンジ領域、ヒトCD8膜貫通領域、ヒト4-1BB共刺激ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン、およびヒトTMEM59ヒンジ領域、ヒトTMEM59膜貫通領域配列は、米国国立医学図書館遺伝子データベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）検索された。そして、コドンはヒトの細胞で発現しやすいように最適化されている。上記の遺伝子配列は、CD8シグナルペプチド、腫瘍特異的抗原結合単鎖可変領域、ヒトTMEM59ヒンジ領域、ヒトTMEM59膜貫通領域、ヒト4-1BB共刺激ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン配列の順で連結され、全遺伝子合成によりレンチウイルスベクター（Clontechより）にライゲーションされた。
TMEM59改変キメラ抗原受容体配列構造：CD8シグナルペプチド-腫瘍特異的抗原結合単鎖可変領域-ヒトTMEM59ヒンジ領域-ヒトTMEM59膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン遺伝子配列。CD8シグナルペプチド、ヒトCD8ヒンジ領域、ヒトCD8膜貫通領域、ヒト4-1BB共刺激ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン、およびヒトTMEM59ヒンジ領域、ヒトTMEM59膜貫通領域配列は、米国国立医学図書館遺伝子データベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）検索された。そして、コドンはヒトの細胞で発現しやすいように最適化されている。上記の遺伝子配列は、CD8シグナルペプチド、腫瘍特異的抗原結合単鎖可変領域、ヒトTMEM59ヒンジ領域、ヒトTMEM59膜貫通領域、ヒト4-1BB共刺激ドメイン、CD3ζシグナル伝達ドメイン配列の順で連結され、全遺伝子合成によりレンチウイルスベクター（Clontechより）にライゲーションされた。
ここで、ヒトTMEM59ヒンジ領域はSEQ ID NO: 6で表されるヌクレオチド配列、ヒトTMEM59膜貫通領域はSEQ ID NO: 5で表されるヌクレオチド配列を含み得る。TMEM59改変キメラ抗原受容体配列構造は以下の通りであり、
21D4-59TM CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-21D4-ヒトTMEM59ヒンジ領域-ヒトTMEM59膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-GFP遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 7で表され、
GPC3-59TM CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-GPC3-ヒトTMEM59ヒンジ領域-ヒトTMEM59膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-GFP遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 14で表され、
CD19CD22-59TM CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-CD19CD22-ヒトTMEM59ヒンジ領域-ヒトTMEM59膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-GFP遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 32で表される。
21D4-59TM CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-21D4-ヒトTMEM59ヒンジ領域-ヒトTMEM59膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-GFP遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 7で表され、
GPC3-59TM CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-GPC3-ヒトTMEM59ヒンジ領域-ヒトTMEM59膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-GFP遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 14で表され、
CD19CD22-59TM CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-CD19CD22-ヒトTMEM59ヒンジ領域-ヒトTMEM59膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-GFP遺伝子配列であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 32で表される。
CD19CD22-59TM CAR配列構造：CD8シグナルペプチド-CD19CD22-ヒトTMEM59ヒンジ領域-ヒトTMEM59膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメインであり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 31で表される。
1.3 対照配列の特定
以下の配列構造は、全遺伝子合成によりレンチウイルスベクター（Clontech 631988より）にライゲーションされた。
以下の配列構造は、全遺伝子合成によりレンチウイルスベクター（Clontech 631988より）にライゲーションされた。
H63 CAR配列構造：CD8シグナルペプチド-H63-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメインであり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 19で表され、
21D4 CAR-2A-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-21D4-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-2A-緑色蛍光タンパク質であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 23で表され、
21D4 CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-21D4-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-緑色蛍光タンパク質であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 24で表され、
GPC3 CAR配列構造：CD8シグナルペプチド-GPC3-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメインであり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 25で表され、
GPC3 CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-GPC3-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-緑色蛍光タンパク質であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 27で表され、
CD19CD22 CAR配列構造：CD8シグナルペプチド-CD19CD22-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメインであり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 28で表され、
CD19CD22 CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-CD19CD22-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-緑色蛍光タンパク質であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 30で表される。
21D4 CAR-2A-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-21D4-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-2A-緑色蛍光タンパク質であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 23で表され、
21D4 CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-21D4-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-緑色蛍光タンパク質であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 24で表され、
GPC3 CAR配列構造：CD8シグナルペプチド-GPC3-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメインであり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 25で表され、
GPC3 CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-GPC3-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-緑色蛍光タンパク質であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 27で表され、
CD19CD22 CAR配列構造：CD8シグナルペプチド-CD19CD22-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメインであり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 28で表され、
CD19CD22 CAR-IRES-GFP配列構造：CD8シグナルペプチド-CD19CD22-ヒトCD8ヒンジ領域-ヒトCD8膜貫通領域-ヒト4-1BB共刺激ドメイン-CD3ζシグナル伝達ドメイン-IRES-緑色蛍光タンパク質であり、ヌクレオチド配列がSEQ ID NO: 30で表される。
実施例2. 過剰発現レンチウイルスの調製
2.1 トランスフェクション液の調合
293T細胞（ATCC CRL-3216）を、T25培養フラスコにプレーティングし、培養液がDMEM培養液であって、10%ウシ胎児血清（Gibco、10099-141）および1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液（Gibco、15140-122）が添加された。トランスフェクションのために、インキュベーターに入れて細胞密度が80～90%になるまで培養した。
2.1 トランスフェクション液の調合
293T細胞（ATCC CRL-3216）を、T25培養フラスコにプレーティングし、培養液がDMEM培養液であって、10%ウシ胎児血清（Gibco、10099-141）および1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液（Gibco、15140-122）が添加された。トランスフェクションのために、インキュベーターに入れて細胞密度が80～90%になるまで培養した。
反応液Aおよび反応液Bを、それぞれ以下のように配合し、十分に均一に混合し、静置した。
反応液Aは表1のように配合されている。
反応液Bは表2のように配合されている。
反応液Bを、反応液Aに滴下し、均一に混合後に、15分間静置した。
インキュベーターから293T細胞を取り出し、混合した反応液を細胞の液体表面に均一に滴下しながら均一に混合後に、インキュベーターに入れて37℃の条件下で培養した。16～24時間後に培養液を交換した。
2.2 ウイルスの濃縮
T25培養フラスコで培養したトランスフェクション反応液のプラスミド293T細胞の上清5mlを吸引し、遠心チューブに移した。ベンチトップ遠心分離機で4℃、4800rpmで10分間遠心分離した。上清を新しい遠心チューブに吸引し、Lenti-X Concentrator（TaKaRa、631231）で1:3の容量比で十分に混合した。ベンチトップ遠心分離機で4℃、1500 xgで45分間遠心分離した。上清を捨て、250μl PBSを加えて十分に均一に混合し、分けてパッケージング後、-80℃の条件下で保存している。
T25培養フラスコで培養したトランスフェクション反応液のプラスミド293T細胞の上清5mlを吸引し、遠心チューブに移した。ベンチトップ遠心分離機で4℃、4800rpmで10分間遠心分離した。上清を新しい遠心チューブに吸引し、Lenti-X Concentrator（TaKaRa、631231）で1:3の容量比で十分に混合した。ベンチトップ遠心分離機で4℃、1500 xgで45分間遠心分離した。上清を捨て、250μl PBSを加えて十分に均一に混合し、分けてパッケージング後、-80℃の条件下で保存している。
実施例3. ウイルス感染によって活性化されたTリンパ球
CD3抗体およびCD28抗体で活性化したヒトTリンパ球（上海sailybio社）を、12ウェル細胞培養プレートで培養した。培養液を吸い取り、異なるキメラ抗原受容体配列を有するウイルス液を加えた。インキュベーターに入れて37℃の条件で培養した。2日間の培養後、ヒトTリンパ球をふくらましてT25培養フラスコに移して、Tリンパ球培養液5mlを補充し、懸濁して培養した。CD19標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球：H63 CAR-2A-TMEM59 CAR-Tリンパ球および21D4-2A-TMEM59 CAR-Tリンパ球、CD19標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ、および対照CAR-Tリンパ球：H63 CAR-Tリンパ球および21D4-2A-GFP CAR-Tリンパ球が得られた。
CD3抗体およびCD28抗体で活性化したヒトTリンパ球（上海sailybio社）を、12ウェル細胞培養プレートで培養した。培養液を吸い取り、異なるキメラ抗原受容体配列を有するウイルス液を加えた。インキュベーターに入れて37℃の条件で培養した。2日間の培養後、ヒトTリンパ球をふくらましてT25培養フラスコに移して、Tリンパ球培養液5mlを補充し、懸濁して培養した。CD19標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球：H63 CAR-2A-TMEM59 CAR-Tリンパ球および21D4-2A-TMEM59 CAR-Tリンパ球、CD19標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ、および対照CAR-Tリンパ球：H63 CAR-Tリンパ球および21D4-2A-GFP CAR-Tリンパ球が得られた。
実施例4. CD19標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーの測定
実施例3で得られたH63 CAR-Tリンパ球、H63 CAR-2A-TMEM59 CAR-Tリンパ球、21D4-2A-GFP CAR-Tリンパ球および21D4-2A-TMEM59 CAR-Tリンパ球をそれぞれ完全に懸濁し、カウント後合計1×106個の細胞を採取し、フローチューブに移した。リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、室温下の400 xgの遠心分離パラメーターで5分間遠心分離した。上清を捨て、100μlの液体を残し、1μgのビオチン-タンパク質L（ACROBIOSYSTEMS、RPL-P814R）を1μl/チューブで加えた。4℃、遮光条件下で30分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄して、100μlの液体を残し、1μlのPE-ストレプトマイシン（BD、554061）、5μlのCD45 RA抗体（Biolegend、304122）および5μlのCD 62L抗体（BD、565535）を加えて、4℃、遮光条件下で30分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄後に、リン酸緩衝生理食塩水の400μlを加えて十分に懸濁させた。フローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリー測定を行った。CARタンパク質の単鎖可変領域の軽鎖部分は、タンパク質Lで標識されており、キメラ抗原受容体Tリンパ球が陽性であることを示している。CD45RAおよびCD62LはTリンパ球の表面メモリーマーカーであり、それらの発現量の増加は、Tリンパ球のメモリー性のアップを意味する。
実施例3で得られたH63 CAR-Tリンパ球、H63 CAR-2A-TMEM59 CAR-Tリンパ球、21D4-2A-GFP CAR-Tリンパ球および21D4-2A-TMEM59 CAR-Tリンパ球をそれぞれ完全に懸濁し、カウント後合計1×106個の細胞を採取し、フローチューブに移した。リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、室温下の400 xgの遠心分離パラメーターで5分間遠心分離した。上清を捨て、100μlの液体を残し、1μgのビオチン-タンパク質L（ACROBIOSYSTEMS、RPL-P814R）を1μl/チューブで加えた。4℃、遮光条件下で30分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄して、100μlの液体を残し、1μlのPE-ストレプトマイシン（BD、554061）、5μlのCD45 RA抗体（Biolegend、304122）および5μlのCD 62L抗体（BD、565535）を加えて、4℃、遮光条件下で30分間インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄後に、リン酸緩衝生理食塩水の400μlを加えて十分に懸濁させた。フローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリー測定を行った。CARタンパク質の単鎖可変領域の軽鎖部分は、タンパク質Lで標識されており、キメラ抗原受容体Tリンパ球が陽性であることを示している。CD45RAおよびCD62LはTリンパ球の表面メモリーマーカーであり、それらの発現量の増加は、Tリンパ球のメモリー性のアップを意味する。
結果を図1～4と以下の表3に示している。表3は、メモリー細胞の数を表している。H63 CAR-2A-TMEM59 Tリンパ球（図2）は、メモリー細胞の割合が、H63 CAR-Tリンパ球（図1）と比較して、30.66%（図1B）から48.50%（図2B）に増加した。同様に、21D4 CAR-2A-TMEM59 Tリンパ球（図4）は、メモリー細胞の割合が、21D4 CAR-2A-GFP Tリンパ球（図3）と比較して、18.90%（図3B）から48.80%（図4B）に増加した。これは、CD19 CAR-Tリンパ球でTMEM59タンパク質を追加発現させることで、CD19 CAR-Tリンパ球のメモリー細胞数を増やすことができることを示している。
実施例5. CD19標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球の増殖能の測定
実施例3で得られたCAR-T細胞をインキュベーターに入れて37℃の条件で培養した。2日間の培養後、細胞をふくらましT25培養フラスコに移し、Tリンパ球培養液5mlを追加して、懸濁培養した。培養の4日目に、Tリンパ球培養液5mlを追加した。1mlのガンで細胞を均一に吹き、十分に懸濁させ、直ちに細胞懸濁液20μlを取り、カウントプレートのサンプリングホールに注入し、Cellometer Auto 2000セルカウンターでカウントした。カウント終了後、合計10mlの細胞液があり、細胞懸濁液5mlを捨て、培養液5mlを新鮮な培養液として追加した。24時間後、上記のステップを繰り返し、8日目まで細胞をカウントした。
実施例3で得られたCAR-T細胞をインキュベーターに入れて37℃の条件で培養した。2日間の培養後、細胞をふくらましT25培養フラスコに移し、Tリンパ球培養液5mlを追加して、懸濁培養した。培養の4日目に、Tリンパ球培養液5mlを追加した。1mlのガンで細胞を均一に吹き、十分に懸濁させ、直ちに細胞懸濁液20μlを取り、カウントプレートのサンプリングホールに注入し、Cellometer Auto 2000セルカウンターでカウントした。カウント終了後、合計10mlの細胞液があり、細胞懸濁液5mlを捨て、培養液5mlを新鮮な培養液として追加した。24時間後、上記のステップを繰り返し、8日目まで細胞をカウントした。
増殖した細胞数を図5に示している。H63 CAR-2A-TMEM59-Tリンパ球は、H63 CAR-Tリンパ球と比較して、細胞数の増加が見られた。同様に、21D4 CAR-2A-TMEM59-Tリンパ球は、21D4 CAR-2A-GFP-Tリンパ球と比較して、細胞数の増加が見られた。これは、TMEM59は培養条件において、CARTリンパ球の増殖能の向上に寄与していることを示している。
実施例6. CD19標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーの測定
実施例3で得られたCD19標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーは、実施例4の方法に従って、フローサイトメーターを用いて測定された。
実施例3で得られたCD19標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーは、実施例4の方法に従って、フローサイトメーターを用いて測定された。
その結果から、21D4 59TM CAR-IRES-GFP-Tリンパ球は、21D4 CAR-IRES-GFP-Tリンパ球と比較して、メモリー細胞数の比率が増加しており、TMEM59により改変されたCD19 CAR-Tリンパ球はそのメモリー細胞数を増やすことができることを示している。
実施例7. 標的細胞NALM-6に対するCD19標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球の殺傷能の測定（ルシフェラーゼ法）
レンチウイルスに感染したTリンパ球を培養し、NALM-6細胞（Imanis LIFE SCIENCE、CL151）と共に、エフェクター細胞（Tリンパ球）：標的細胞（NALM-6細胞）比が10:1、5:1、2.5:1に従い、96ウェル丸底プレートにプレーティングし、ここで、NALM-6細胞の数が1×104/ウェルであった。培養系は10%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培養液であって、1ウェルあたり200ulの細胞懸濁液があった。
レンチウイルスに感染したTリンパ球を培養し、NALM-6細胞（Imanis LIFE SCIENCE、CL151）と共に、エフェクター細胞（Tリンパ球）：標的細胞（NALM-6細胞）比が10:1、5:1、2.5:1に従い、96ウェル丸底プレートにプレーティングし、ここで、NALM-6細胞の数が1×104/ウェルであった。培養系は10%ウシ胎児血清含有RPMI-1640培養液であって、1ウェルあたり200ulの細胞懸濁液があった。
サンプルは、以下の表4に示すように群分けされ、各群に3つの複製を作成した。
96ウェル培養プレートを、インキュベーターに入れて37℃の条件で4時間培養した。測定は、ルシフェラーゼキット（promega、E2920）の使用説明書に従って実施された。4時間培養した96ウェル培養プレートを取り出し、細胞混合液175μlを吸引し、透明底部の黒色プレートである96ウェル培養プレートのウェルに加えて、そこにルシフェラーゼ基質を25μl/ウェルで加えた。室温下で、10分間遮光してインキュベートした。マイクロプレートリーダーによって測定を行った。
結果を図6に示しているように、本実施例では、NALM-6細胞の生存数がNALM-6細胞で発現されたルシフェラーゼの活性に反映されていた。CD19（21D4）標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球（21D4-59TM CAR-IRES-GFP）およびCD19（21D4）標的キメラ抗原受容体Tリンパ球（21D4 CAR-IRES-GFP）はいずれもNALM-6細胞を溶解することができ、21D4-59TM CAR-IRES-GFP-Tリンパ球は21D4 CAR-2A-GFP-Tリンパ球よりもNALM-6細胞に対する溶解性がわずかに高かった。
実施例8. GPC3標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球の増殖能の測定
実施例3で得られたGPC3標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球の増殖能は、実施例5の方法に従って測定された。
実施例3で得られたGPC3標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球の増殖能は、実施例5の方法に従って測定された。
その結果から、GPC3標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球（GPC3 CAR-IRES-TEME59-Tリンパ球）は、GPC3 CAR-Tリンパ球およびGPC3 CAR-IRES-GFP-Tリンパ球と比較して、細胞数が増加したことを示している。
実施例9. GPC3標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーの測定
実施例3で得られたGPC3標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーは、実施例4の方法に従ってフローサイトメーターを用いて測定された。
実施例3で得られたGPC3標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーは、実施例4の方法に従ってフローサイトメーターを用いて測定された。
その結果から、GPC3-59TM CAR-IRES-GFP-Tリンパ球は、GPC3 CAR-IRES-GFP Tリンパ球と比較して、メモリー細胞数の比率が増加しており、TMEM59により改変されたGPC3 CAR-Tリンパ球は、そのメモリー細胞数を増やすことができることを示している。
実施例10. 標的細胞Huh7に対するGPC3標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球の殺傷能の測定（ルシフェラーゼ法）
標的細胞Huh7に対する実施例3で得られたGPC3標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球の殺傷能は、実施例7の方法に従って測定された。サンプルは、以下の表5に示すように群分けされ、各群に3つの複製を作成した。
標的細胞Huh7に対する実施例3で得られたGPC3標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球の殺傷能は、実施例7の方法に従って測定された。サンプルは、以下の表5に示すように群分けされ、各群に3つの複製を作成した。
その結果から、GPC3標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球（GPC3-59TM CAR-IRES-GFP）とGPC標的キメラ抗原受容体Tリンパ球（GPC3 CAR-2A-GFP）はいずれもHuh7細胞を溶解することができ、GPC3-59TM CAR-IRES-GFP-Tリンパ球はGPC3 CAR-IRES-GFP-Tリンパ球よりもHuh7細胞に対する溶解性が高かったことを示している。
実施例11. CD19 CD22標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球の増殖能の測定
実施例3で得られたCD19 CD22標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球の増殖能は、実施例5の方法に従って測定された。
実施例3で得られたCD19 CD22標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球の増殖能は、実施例5の方法に従って測定された。
その結果から、CD19 CD22標的キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59タンパク質キメラ抗原受容体Tリンパ球（CD19CD22 CAR-IRES-TEME59-Tリンパ球）は、CD19CD22 CAR-Tリンパ球およびCD19CD21 CAR-IRES-GFP-Tリンパ球と比較して、細胞数が増加したことを示している。
実施例12. CD19 CD22標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーの測定
実施例3で得られたCD19 CD22標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーは、実施例4の方法に従ってフローサイトメーターを用いて測定された。
実施例3で得られたCD19 CD22標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球のメモリーは、実施例4の方法に従ってフローサイトメーターを用いて測定された。
その結果から、CD19CD22-59TM CAR-IRES-GFP-Tリンパ球は、CD19CD22 CAR-IRES-GFP Tリンパ球と比較して、メモリー細胞数の比率が増加しており、TMEM59により改変されたCD19CD22 CAR-Tリンパ球はそのメモリー細胞数を増やすことができることを示している。
実施例13. 標的細胞NALM-6に対するCD19 CD22標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球の殺傷能の測定（ルシフェラーゼ法）
標的細胞NALM-6に対する実施例3で得られたCD19 CD22標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球の殺傷能は、実施例7の方法に従って測定された。サンプルは、以下の表6に示すように群分けされ、各群に3つの複製を作成した。
標的細胞NALM-6に対する実施例3で得られたCD19 CD22標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球の殺傷能は、実施例7の方法に従って測定された。サンプルは、以下の表6に示すように群分けされ、各群に3つの複製を作成した。
その結果から、CD19 CD22標的TMEM59改変キメラ抗原受容体Tリンパ球（CD19 CD22-59TM CAR-IRES-GFP）とCD19 CD22標的キメラ抗原受容体Tリンパ球（CD19 CD22 CAR-2A-GFP）はいずれもNALM-6細胞を溶解することができ、CD19 CD22-59TM CAR-IRES-GFP-Tリンパ球はCD19 CD22 CAR-IRES-GFP-Tリンパ球よりもNALM-6細胞に対する溶解性が高かったことを示している。
実施例14. キメラ抗原受容体が共発現するTMEM59とTMEM59改変キメラ抗原受容体キメラ抗原受容体Tリンパ球によるマウスにおける腫瘍増殖の抑制
14.1マウスの担癌モデルの確立
ルシフェラーゼを発現する自己構築された標的腫瘍細胞を、皮下注射による腫瘍形成のためにNSGマウスに接種した。上記の標的細胞2×105個を100μlのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、皮下に注入した。
14.1マウスの担癌モデルの確立
ルシフェラーゼを発現する自己構築された標的腫瘍細胞を、皮下注射による腫瘍形成のためにNSGマウスに接種した。上記の標的細胞2×105個を100μlのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、皮下に注入した。
または、ルシフェラーゼを発現する自己構築された標的腫瘍細胞であるNalm-6細胞を、静脈内注射による腫瘍形成のためにNSGマウスに接種した。上記の標的細胞2.5×105個を100μlのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁して、ラットの尾部に静脈内注射した。
14.2インビボイメージング
腫瘍形成3日後、ルシフェラーゼ基質であるLuciferinを、3mg/匹の注射量でマウスに腹腔内注射し、マウスを麻醉後小動物のインビボイメージャーに入れて結像させた。Nalm細胞注入から7日後、CD19CD22-59TM CAR（ヌクレオチド配列がSEQ ID NO：31で表される）を発現するTリンパ球をPBSで洗浄後、細胞密度を2×106/mlに調整するように無血清培養液で再懸濁させた。各マウスの尾静脈に2×106個の細胞を合計200μl注入した。無処置のマウスを対照群として設定した。実験終了後、腫瘍の除去効果を収集するために、インビボイメージングを定期的に行ない、生体蛍光測定を3～7日ごとに行い、60日目に2.5×105個のNALM6腫瘍細胞をCAR-T投与群に注入し、再発モデルチャレンジを実行した。
腫瘍形成3日後、ルシフェラーゼ基質であるLuciferinを、3mg/匹の注射量でマウスに腹腔内注射し、マウスを麻醉後小動物のインビボイメージャーに入れて結像させた。Nalm細胞注入から7日後、CD19CD22-59TM CAR（ヌクレオチド配列がSEQ ID NO：31で表される）を発現するTリンパ球をPBSで洗浄後、細胞密度を2×106/mlに調整するように無血清培養液で再懸濁させた。各マウスの尾静脈に2×106個の細胞を合計200μl注入した。無処置のマウスを対照群として設定した。実験終了後、腫瘍の除去効果を収集するために、インビボイメージングを定期的に行ない、生体蛍光測定を3～7日ごとに行い、60日目に2.5×105個のNALM6腫瘍細胞をCAR-T投与群に注入し、再発モデルチャレンジを実行した。
14.3腫瘍体積の測定
細胞を注入後、細胞注入の同日を0日目として、週2回体重を測定した。
細胞を注入後、細胞注入の同日を0日目として、週2回体重を測定した。
14.4マウス体重の測定
細胞を注入後、細胞注入の同日を0日目として、週2回腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は、腫瘍体積（mm3）= 0.5×腫瘍長径×腫瘍短径2として算出された。
細胞を注入後、細胞注入の同日を0日目として、週2回腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は、腫瘍体積（mm3）= 0.5×腫瘍長径×腫瘍短径2として算出された。
14.5腫瘍重量の測定
実験終了後、担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥がして秤量した。
実験終了後、担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥がして秤量した。
その結果から、CAR-T細胞が注入されたマウスは、対照群マウスと比較して、腫瘍体積が減少し、腫瘍重量が軽減し、体重増加の傾向が緩やかになったことが確認された。図7は、腫瘍細胞数を反映した生体蛍光強度を示し、その結果から、CD19CD22-59TM CARがトランスフェクションされたT細胞群は、生体蛍光強度が継続的に増加するCARがトランスフェクションされていないT細胞群と比較して、マウスにおける腫瘍細胞数が有意に減少し、蛍光強度がおよそ105から106の間であり、60日目に腫瘍細胞を再注入しても増加が見られないことがわかった。図8は、実験群と対照群の動物実験生存率を示し、対照となるCARがトランスフェクションされていないT細胞群のマウスは、生存率が約30日～約45日から0に減少したが、CD19CD22-59TM CARがトランスフェクションされたT細胞群のマウスは、生存率が90日後も100%を維持した。図9は、マウスのインビボイメージングの結果を示し、CARがトランスフェクションされていないT細胞群のマウスは、光強度が10日目、37日目ともに減少せず、37日目には死亡したマウスの数が減少し、CD19CD22-59TM CARがトランスフェクションされたT細胞群のマウスは、光強度が10日目に有意に減少し、37日目以降に検出不能になり、腫瘍が消滅したことが示された。
治療中、死亡した動物はなく、顕著な薬物毒性は認められず、寛容性も良好であった。
以上、詳しい説明は、解釈するか、または例を挙げるように記載されたが、添付の請求項範囲を限定するわけではない。これまで本明細書に記載の実施形態に、多様な変更などがあることが当業者に明らかであり、且つ、添付の請求項とそれに同等する実施形態の範囲に属する。
Claims (43)
- 細胞膜にあるTMEM59タンパク質、および/または、少なくとも前記TMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片を含む、
免疫細胞。 - 改変されることによって細胞膜に前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含む、
請求項1に記載の免疫細胞。 - 前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、ヒトTMEM59タンパク質および/またはその機能的断片である、
請求項1~2のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記TMEM59タンパク質の膜貫通領域は、SEQ ID NO. 1で表されるアミノ酸配列を有する、
請求項1~3のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記TMEM59タンパク質のヒンジ領域は、SEQ ID NO. 2で表されるアミノ酸配列を有する、
請求項1~4のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、SEQ ID NO. 3で表されるアミノ酸配列を有する、
請求項1~5のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体CARおよび/またはそのコード要素を含む、
請求項1~6のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記CARは、膜貫通領域を含む、
請求項7に記載の免疫細胞。 - 前記CARの膜貫通領域は、TMEM59タンパク質の膜貫通領域およびCD8の膜貫通領域から選ばれる、
請求項8に記載の免疫細胞。 - 前記CARの膜貫通領域は、SEQ ID NO. 1および37のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項8~9のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記CARは、ヒンジ領域を含む、
請求項7~10のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記CARのヒンジ領域は、TMEM59タンパク質のヒンジ領域およびCD8のヒンジ領域から選ばれる、
請求項11に記載の免疫細胞。 - 前記CARのヒンジ領域は、SEQ ID NO. 2および38のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項11~12のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記CARは、シグナル伝達ドメインおよび/または共刺激ドメインを含む細胞内ドメインを含む、
請求項7~13のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記シグナル伝達ドメインは、CD3ζのシグナル伝達ドメインを含む、
請求項14に記載の免疫細胞。 - 前記共刺激ドメインは、4-1BBの共刺激ドメインを含む、
請求項14~15のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記CARは、ターゲティング部分を含む、
請求項7~16のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記ターゲティング部分は、ScFvを含む、
請求項17に記載の免疫細胞。 - 前記ターゲティング部分は、腫瘍抗原に特異的に結合および/または認識する、
請求項17~18のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記ターゲティング部分は、CD19、CD22およびGPC3からなる群から選ばれる標的に特異的に結合および/または認識する、
請求項17~19のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含まない前記CARならびに前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含む、
請求項7~20のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記CARは、請求項9~21のいずれか一項に記載のターゲティング部分、CD8のヒンジ領域、CD8の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み、ここで、前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、前記TMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含む、
請求項21に記載の免疫細胞。 - 前記CARは、SEQ ID NO. 49、51、55および56のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項21~22のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含む前記CAR、および、前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片を含む、
請求項7~20のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記CARは、請求項9~21のいずれか一項に記載のターゲティング部分、TMEM59タンパク質のヒンジ領域、TMEM59タンパク質の膜貫通領域、CD3ζのシグナル伝達ドメイン、および4-1BBの共刺激ドメインを含み、ここで、前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片は、前記TMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含む、
請求項24に記載の免疫細胞。 - 前記CARは、SEQ ID NO. 43、57および44のいずれか1つで表されるアミノ酸配列を有する、
請求項24~25のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 前記免疫細胞は、Tリンパ球を含む、
請求項1~26のいずれか一項に記載の免疫細胞。 - 請求項1~27のいずれか一項に記載の免疫細胞および任意に薬学的に許容可能な担体を含む、
医薬組成物。 - 腫瘍を治療するための医薬品の調製における請求項1~27のいずれか一項に記載の免疫細胞または請求項28に記載の医薬組成物の使用。
- 前記腫瘍は、固形腫瘍および/または非固形腫瘍を含む、
請求項29に記載の使用。 - 前記腫瘍は、Bリンパ性白血病および/または肝癌からなる、
請求項29~30のいずれか一項に記載の使用。 - 免疫細胞に、TMEM59タンパク質および/または少なくとも前記TMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片をその細胞膜上に発現させることを含む、
免疫細胞の増殖を促進する方法。 - 免疫細胞に、TMEM59タンパク質および/または少なくとも前記TMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片をその細胞膜上に発現させることを含む、
メモリー免疫細胞の産生を促進する方法。 - 前記免疫細胞に、TMEM59タンパク質および/または少なくとも前記TMEM59タンパク質の膜貫通領域およびヒンジ領域を含むその機能的断片をその細胞膜上に発現させることを含む、
腫瘍に対する免疫細胞の殺傷能を増強する方法。 - 前記発現は、前記免疫細胞に前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片をコードする核酸を含ませることを含む、
請求項32~34のいずれか一項に記載の方法。 - 前記発現は、前記免疫細胞を、前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片をコードする核酸を含むプラスミドでトランスフェクションすることを含む、
請求項35に記載の方法。 - 前記免疫細胞は、Tリンパ球を含む、
請求項32~36のいずれか一項に記載の方法。 - 前記免疫細胞は、前記TMEM59タンパク質および/またはその機能的断片をコードする核酸を含む、
請求項32~37のいずれか一項に記載の方法。 - 前記核酸はウイルスベクターにある、
請求項35~38のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1~27のいずれか一項に記載の免疫細胞を、腫瘍細胞に接触させることを含む、
腫瘍細胞の増殖抑制および/または殺傷の方法。 - インビトロ法またはエクスビボ法を含む、
請求項40に記載の方法。 - 前記腫瘍は、固形腫瘍および/または非固形腫瘍を含む、
請求項40~41のいずれか一項に記載の方法。 - 前記腫瘍は、Bリンパ性白血病および/または肝癌からなる、
請求項40~42のいずれか一項に記載の方法。
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