CN118006535A - 一种产生耐高温高压脯肽酶的重组菌及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产生耐高温高压脯肽酶的重组菌及其制备方法和应用，涉及生物技术领域。本发明公开的重组菌为异源表达Pyprol脯肽酶的超嗜热古菌T.kodakarensis；其制备方法为：通过聚合酶链式反应扩增深海来源超嗜热古菌Pyrococcus yayanosii基因组中的pyprol基因，将纯化得到pyprol片段与线性化的质粒载体连接得到表达载体；将表达载体在超嗜热古菌Thermococcus kodakarensis中异源表达。本发明利用高生物量的超嗜热古菌T.kodakarensis作为蛋白表达宿主，克服了使用常用的中温微生物宿主表达耐高温蛋白时对活性的不利影响，构建出重组菌，并应用于制备新的脯肽酶。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种产生耐高温高压脯肽酶的重组菌及其制备方法和应用。
背景技术
脯肽酶(EC 3.4.13.9)是一类能够从二肽(Xaa-Pro)的C末端降解脯氨酸残基的肽酶。脯肽酶分布极为广泛，目前为止已经在人、细菌以及古菌中分离纯化出脯肽酶，并对其生化性质、结构以及催化反应机理做了详细的研究。一般认为，在原核生物中，脯肽酶参与细胞内脯氨酸代谢以及防御毒素。在人体中，脯肽酶参与了胶原蛋白的降解；此外，有研究者发现在乳腺癌和骨髓增生性肿瘤中，脯肽酶的活性均出现异常的增加，因此脯肽酶还是重要的癌症标记物。在工业生产过程中，脯肽酶具有多种应用，一方面，在奶酪发酵过程中添加脯肽酶可以增加脯氨酸的含量并去除苦味，另一方面，脯肽酶还可以作为有机磷化合物的解毒剂。
脯肽酶是金属肽酶，金属离子有助于稳定结构并将底物锚定在活性中心。在脯肽酶中存在两个金属结合位点，只有当两个金属结合位点均结合金属离子时，脯肽酶才能表现出最大的活性。脯肽酶中的金属结合位点高度保守，不同物种来源的脯肽酶的金属结合位点均是由Asp-Asp-His-Glu-Glu构成。但不同来源的脯肽酶在金属离子的偏好性上存在较大的差异，人源和大肠杆菌来源的脯肽酶在结合Mn2+时活性最高，而来源于超嗜热古菌Pyrococcus furiosus DSM3638以及Pyrococcus horikoshii OT3的脯肽酶在结合Co2+活性最大。更值得关注的是，来源P.furiosus DSM3638的脯肽酶在厌氧条件下还能结合Fe2+。
超嗜热古菌来源的脯肽酶在酶学性质上与人源、细菌来源的脯肽酶存在较大的差异。除了在金属离子偏好性上存在差异之外，超嗜热古菌来源的脯肽酶的最适温度达到了100℃，这在目前有报道的脯肽酶中是最高的。此外，超嗜热古菌来源的脯肽酶具有很好的热稳定性，来源P.furiosus DSM3638以及P.horikoshii OT3的脯肽酶分别在100℃下孵育12h和8h活性并没有出现明显的损失。
超嗜热古菌来源的脯肽酶最适温度达到了100℃并且具有很好的热稳定性，但目前还未有耐受高压的脯肽酶的报道。在食品工业中存在高温和高压条件下使用脯肽酶的潜在的需求。因此，本领域的技术人员致力于开发一种耐高温耐高压的脯肽酶。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何开发一种耐高温耐高压的脯肽酶。
为实现上述目的，本发明提供了一种产生耐高温高压脯肽酶的重组菌，为异源表达Pyprol脯肽酶的超嗜热古菌T.kodakarensis，Pyprol脯肽酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。
超嗜热古菌T.kodakarensis在文献Thermococcus kodakarensis Genetics:TK1827-Encoded-Glycosidase,New Positive-Selection Protocol,and Targeted andRepetitive Deletion Technology中公开，见APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,Feb.2010,p.1044–1052。
本发明还提供了一种重组菌的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、聚合酶链式反应扩增pyprol基因并纯化，得到pyprol片段，聚合酶链式反应扩增启动子Pgdh，通过Overlap PCR将启动子Pgdh与片段pyprol连接成一个片段；
步骤2、通过聚合酶链式反应扩增质粒pTE1中不包括启动子Pcsg的部分，得到线性化的载体片段；
步骤3、将步骤1得到的pyprol片段和步骤2得到的线性化载体pTE1片段构建表达载体；
步骤4、将步骤3得到的表达载体在超嗜热古菌T.kodakarensis中异源表达，得到所述重组菌。
进一步地，步骤1中还包括提取Pyrococcusyayanosii CH1基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1和引物2作用下进行PCR，其中引物1的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，引物2的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；提取Pyrococcusfuriosus DSM3638基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物3和引物4作用下进行PCR，其中引物3的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，引物4的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；通过Overlap PCR在引物2和引物3的作用下将Pgdh与片段pyprol连接成一个片段。
进一步地，步骤2还包括以质粒pTE1为模板，在引物5和引物6作用下进行PCR；其中引物5的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，引物6的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，步骤3还包括将pyprol片段和线性化载体pTE1片段按照摩尔比为2：1比例，加入ExnaseⅡ和CEⅡbuffer，混匀后在37℃孵育30min，得到连接产物；然后将连接产物通过热激的方式转入感受态细胞大肠杆菌DH5α中,含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选；挑选转化子在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中进行过夜培养，得到成功转入pyprol的质粒pTE-pyprol。
进一步地，步骤4还包括将胍丁胺营养缺陷型菌株T.kodakarensis TS559在含有胍丁胺的ASW-YT培养基中培养,培养完成之后离心收集菌体；在吹氮气的条件下加入CaCl2溶液重悬菌体，将重悬液转移至离心管中，并在冰上孵育；在吹氮气的条件下加入质粒pTE-pyprol，并在冰上孵育；孵育完成之后，热激；使用注射器将混合液转移至ASW-YT液体培养基中于培养，得到培养物；吸取培养物涂布于ASW-YT滚管中并培养；待有单菌落长出，在厌氧操作箱中挑取单克隆，在ASW-YT培养基中培养。
进一步地，含有胍丁胺的ASW-YT培养基胍丁胺浓度为1mM，T.kodakarensis TS559的培养温度为85℃，CaCl2溶液浓度为0.1M；热激的温度为85℃，热激的时间为45s。
本发明还提供了一种重组菌在制备重组脯肽酶的应用。
进一步地，将重组菌纯化，得到重组脯肽酶；纯化的方法为：用Lysis buffer重悬菌体，在冰上使用超声破碎仪破碎菌体，裂解完成之后离心，保留上清液；将上清液加入到Ni-NTA亲和层析柱中，用Wash buffer洗涤层析柱，再用Elution bffer洗脱重组脯肽酶；最后使用超滤管去除重组脯肽酶中的高浓度咪唑。
进一步地，Lysis buffer含0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0；Wash buffer含0.5mol/LNaCl，20mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；Elution bffer含0.5mol/LNaCl，250mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。
进一步地，还包括使用的超滤管为10kDa，重组脯肽酶保存在含0.5M NaCl,50mMTris-HCl，pH 8.0的缓冲液中。
本发明还提供了一种耐高温耐高压的重组脯肽酶，该脯肽酶氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了一种耐高温耐高压的重组脯肽酶在奶酪发酵过程作为添加剂的应用。
本发明还提供了一种耐高温耐高压的重组脯肽酶作为有机磷化合物的解毒剂的应用。
在本发明的较佳实施方式1中，详细说明聚合酶链式反应(PCR)扩增pyprol基因、启动子Pgdh的过程以及启动子Pgdh与基因pyprol的连接过程；
在本发明的另一较佳实施方式2中，详细说明通过聚合酶链式反应(PCR)将质粒pTE1线性化的过程；
在本发明的另一较佳实施方式3中，详细说明表达载体的构建过程；
在本发明的另一较佳实施方式4中，详细说明在超嗜热古菌T.kodakarensis中异源表达Pyprol过程；
在本发明的另一较佳实施方式5中，详细说明重组脯肽酶的纯化过程；
在本发明的另一较佳实施方式6中，详细说明重组脯肽酶酶活测定过程；
在本发明的另一较佳实施方式7中，详细说明反应温度对Pyprol活性的影响；
在本发明的另一较佳实施方式8中，详细说明反应pH对Pyprol活性的影响；
在本发明的另一较佳实施方式9中，详细说明金属离子对Pyprol活性的影响；
在本发明的另一较佳实施方式10中，详细说明Co2+浓度对Pyprol活性的影响；
在本发明的另一较佳实施方式11中，详细说明高压对Pyprol活性的影响；
在本发明的另一较佳实施方式12中，详细说明温度对Pyprol稳定性的影响；
在本发明的另一较佳实施方式13中，详细说明压力对Pyprol稳定性的影响。
本发明有益的技术效果如下：
Pyrococcusyayanosii CH1是一株严格嗜压的超嗜热古菌，最适生长温度是98℃，最适生长压力是52MPa，本发明从超嗜热嗜压古菌Pyrococcus yayanosii CH1中制备出新的脯肽酶，该脯肽酶的最适反应温度是100℃，在高压下的活性要比常压下高，最适压力是40MPa。因此，非常适合需要高温和高压的生产过程。
超嗜热古菌来源的耐高温蛋白在常用的中温微生物宿主进行异源表达时存在对蛋白活性的不利影响，本发明使用超嗜热古菌Thermococcus kodakarensis作为表达宿主，具有生物量高和操作遗传简便的优势。来源超嗜热古菌Pyrococcus yayanosii CH1的脯肽酶成功在Thermococcus kodakarensis中表达，纯化后得到重组蛋白，从而实现了该脯肽酶的制备。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例3的重组质粒pTE-pyprol图谱；
图2是本发明的一个较佳实施例5的重组脯肽酶SDS-PAGE结果图；
图3是本发明的一个较佳实施例7的温度对Pyprol活性的影响图；
图4是本发明的一个较佳实施例8的pH对Pyprol活性的影响图；
图5是本发明的一个较佳实施例9的金属离子对Pyprol活性的影响图；
图6是本发明的一个较佳实施例10的Co2+浓度对Pyprol活性的影响图；
图7是本发明的一个较佳实施例11的压力对Pyprol活性的影响图；
图8是本发明的一个较佳实施例12的温度对Pyprol稳定性的影响图；
图9是本发明的一个较佳实施例13的压力对Pyprol稳定性的影响图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1、聚合酶链式反应(PCR)扩增pyprol基因及扩增产物的纯化
提取Pyrococcus yayanosii CH1基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1(碱基序列如SEQ ID NO.3所示)和引物2(碱基序列如SEQ ID NO.4所示)作用下进行PCR。
PCR扩增体系为：2×Primestar Max Mix 25μL，引物1(10μmol/L)1μL，引物2(10μmol/L)1μL，5ng/μL Pyrococcus yayanosii CH1基因组DNA 1μL，用无菌水补足至50μL，混匀；PCR扩增反应的参数为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸8s，30循环后，最后72℃延伸3min。
扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳检测，按照SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒操作，对有阳性条带的样品进行产物回收。
实施例2、通过聚合酶链式反应(PCR)扩增启动子Pgdh及扩增产物的纯化
提取Pyrococcus furiosus DSM3638基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物3(碱基序列如SEQ ID NO.5所示)和引物4(碱基序列如SEQ ID NO.6所示)作用下进行PCR。
PCR扩增体系为：2×Primestar Max Mix 25μL，引物1(10μmol/L)1μL，引物2(10μmol/L)1μL，5ng/μL Pyrococcus furiosus DSM3638基因组DNA 1μL，用无菌水补足至50μL，混匀；PCR扩增反应的参数为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸5s，30循环后，最后72℃延伸3min。
扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳检测，按照SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒操作，对有阳性条带的样品进行产物回收。
实施例3、通过Overlap PCR将启动子Pgdh与片段pyprol连接
PCR扩增体系为：2×Primestar Max Mix 25μL，引物2(10μmol/L)1μL，引物3(10μmol/L)1μL，5ng/μL片段pyprol 1μL，5ng/μL Pgdh 1μL，用无菌水补足至50μL，混匀；PCR扩增反应的参数为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸10s，30循环后，最后72℃延伸3min。
扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳检测，按照SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒操作，对有阳性条带的样品进行产物回收。
实施例4、通过聚合酶链式反应(PCR)将质粒pTE1线性化
以质粒pTE1为模板，在引物5(碱基序列如SEQ ID NO.7所示)和引物6(碱基序列如SEQ ID NO.8所示)作用下进行PCR。
PCR扩增体系为：2×Primestar Max Mix 25μL，引物3(10μmol/L)1μL，引物4(10μmol/L)1μL，5ng/μL质粒pTE11μL，用无菌水补足至50μL，混匀；PCR扩增反应的参数为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸30s，30循环后，最后72℃延伸3min。
扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳检测，按照SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒操作，对有阳性条带的样品进行产物回收。
实施例5、表达载体的构建
将回收的pyprol片段和回收的线性化载体pTE1片段按照摩尔比为2：1比例，加入2μL ExnaseⅡ和4μL 5×CEⅡbuffer，混匀后在37℃孵育30min。然后将连接产物通过热激的方式转入感受态细胞大肠杆菌DH5α中,含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上进行筛选。挑选转化子在含有100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中进行过夜培养。培养完成之后按照质粒小量抽提试剂盒(通用型)操作提取质粒，将提取的质粒送往测序公司进行测序。将成功转入pyprol的质粒命名为pTE-pyprol。重组质粒pTE-pyprol图谱如图1所示。
实施例6、在超嗜热古菌T.kodakarensis中异源表达Pyprol
将胍丁胺营养缺陷型菌株T.kodakarensis TS559在含有1mM胍丁胺的ASW-YT培养基中于85℃下培养10h,培养完成之后在4℃下，6000rpm离心5min收集菌体；在吹氮气的条件下加入200μL 0.1M CaCl2溶液重悬菌体，将重悬液转移至1.5mL离心管中，并在冰上孵育30min；在吹氮气的条件下加入3μg质粒pTE-pyprol，并在冰上孵育1h；孵育完成之后，在85℃下热激45s；使用注射器将混合液转移至5mL ASW-YT液体培养基中于85℃下培养4h；吸取1mL培养物涂布于ASW-YT滚管中并在85℃下培养2-3天；待有单菌落长出，在厌氧操作箱中挑取单克隆，在ASW-YT培养基中于85℃下培养，将成功转入质粒pTE-pyprol的重组菌命名为TS559/pTE-pyprol。按照1％(v/v)的接种量将重组菌TS559/pTE-pyprol转接到ASW-YT培养基中，在85℃下培养15h。培养完成之后，在4℃，12000rpm离心5min收集菌体。
实施例7、重组脯肽酶的纯化
用Lysis buffer(含0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0)重悬菌体，在冰上使用超声破碎仪破碎菌体，裂解完成之后在12000rpm，4℃离心30min，保留上清液。将上清液加入到Ni-NTA亲和层析柱中，用Wash buffer(含0.5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑，50mmol/LTris-HCl，pH 8.0)洗涤层析柱，再用Elution bffer(含0.5mol/L NaCl，250mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)洗脱目的蛋白。用10kDa的超滤管去除目的蛋白中的高浓度咪唑，将目的蛋白保存在含0.5MNaCl,50mM Tris-HCl(pH8.0)的缓冲液中。纯化的蛋白经12％SDS－PAGE电泳鉴定，重组脯肽酶SDS-PAGE结果如图2所示,图中Lane 1:标准蛋白分子量Marker；Lane 2:纯化的脯肽酶。纯化的蛋白的相对分子质量在42kDa左右，与Pyprol理论相对分子质量40.8kDa相接近。因此，Pyprol成功在T.kodakarensis中表达。
实施例8、重组脯肽酶酶活测定
脯肽酶活性测定是根据水解二肽(Xaa-Pro)产生的游离脯氨酸的含量来测定酶活。具体步骤：在PCR管中加入5μL 0.5M NaH2PO4–Na2HPO4(pH 7.0)，5μL 2MNaCl，5μL 50％(v/v)甘油溶液，5μL 1mg/mL BSA蛋白溶液，1μL 60mM CoCl2，0.1mg/mL的Pyprol，最后加入超纯水将反应体系补充到50μL；在100℃下孵育5min，让金属离子与Pyprol结合；加入终浓度为10mM的Met-Pro，在100℃下孵育10min；孵育结束之后，加入50μL无水乙酸终止反应；加入50μL 3％(w/v)茚三酮溶液，在100℃下孵育10min；冷却至室温之后，使用酶标仪测定反应物在515nm处的吸光度。每个反应做3个平行。脯肽酶的酶活单位(U)定义为每分钟释放1μM的脯氨酸需要消耗的脯肽酶的量。
实施例9、反应温度对Pyprol活性的影响
以10mM Met-Pro为底物，按照实施实例6酶活测定方法将反应物分别置于40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃和100℃条件下反应10min。终止反应后进行显色，检测反应液在515nm处光吸收值，温度对Pyprol活性的影响如图3所示。
实施例10、反应pH对Pyprol活性的影响
以10mM Met-Pro为底物，在100℃条件下按照实施例6酶活测定方法将反应物在不同pH(pH 4.0～8.0)的缓冲液中进行反应，缓冲系统如下：pH 4.0到5.0为50mM HAc-NaAc缓冲液，pH 6.0到7.0为50mM NaH2PO4–Na2HPO4缓冲液，pH 8.0为50mM Tris-HCl。反应完成后，终止反应并进行显色，检测反应液在515nm处光吸收值，pH对Pyprol活性的影响如图4所示。
实施例11、金属离子对Pyprol活性的影响
将Pyprol与1.2mM的不同金属离子(Co2+，Mn2+，Zn2+，Ca2+，Cu2+，Ni2+，Mg2+)在100℃下孵育5min，孵育完成之后按照实施例6酶活测定方法，于100℃反应10min。终止反应后进行显色，检测反应液在515nm处光吸收值，金属离子对Pyprol活性的影响如图5所示。
实施例12、Co2+浓度对Pyprol活性的影响
将Pyprol分别与不同浓度的Co2+(0nM，0.6nM，1.2nM，1.8nM，2.4nM，3nM，3.6nM，4.2nM，4.8nM，5.4nM，6mM)在100℃下孵育5min，孵育完成之后按照实施例6酶活测定方法，于100℃反应10min。终止反应后进行显色，检测反应液在515nm处光吸收值，Co2+浓度对Pyprol活性的影响如图6所示。
实施例13、高压对Pyprol活性的影响
以10mM Met-Pro为底物，在100℃条件下按照实施例6酶活测定方法分别在0.1MPa，10MPa,20MPa,30MPa，40MPa，52MPa下反应10min。反应完成后，终止反应并进行显色，检测反应液在515nm处光吸收值，压力对Pyprol活性的影响如图7所示。
实施例14、温度对Pyprol稳定性的影响
将Pyprol分别在80℃，90℃，100℃下孵育5h，每隔1h取一次样，取出的样品按照实施例6酶活测定方法于100℃反应10min。终止反应后进行显色，检测反应液在515nm处光吸收值，温度对Pyprol稳定性的影响如图8所示。
实施例15、压力对Pyprol稳定性的影响
将Pyprol在80℃下分别在0.1MPa、20MPa与40MPa下孵育1h，孵育完成之后按照实施例6酶活测定方法于100℃反应10min。终止反应后进行显色，检测反应液在515nm处光吸收值，压力对Pyprol稳定性的影响如图9所示。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种产生耐高温高压脯肽酶的重组菌，其特征在于，所述重组菌为异源表达Pyprol脯肽酶的超嗜热古菌T.kodakarensis，所述Pyprol脯肽酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的重组菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1、聚合酶链式反应扩增pyprol基因并纯化，得到pyprol片段；聚合酶链式反应扩增启动子Pgdh序列并纯化，通过Overlap PCR将所述启动子Pgdh与所述pyprol片段连接成一个片段；
步骤2、通过聚合酶链式反应扩增质粒pTE1中不包括启动子Pcsg的部分，得到线性化的载体片段；
步骤3、将步骤1得到的片段连接到步骤2得到的线性化载体片段，得到表达载体；
步骤4、将步骤3得到的表达载体在超嗜热古菌T.kodakarensis中异源表达，得到所述重组菌。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中还包括以下步骤：
步骤1.1、提取Pyrococcusyayanosii CH1基因组DNA，以所述PyrococcusyayanosiiCH1基因组DNA为模板，在引物1和引物2作用下进行PCR，得到所述pyprol片段；其中所述引物1的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物2的碱基序列如SEQ ID NO.4所示；
步骤1.2、提取Pyrococcusfuriosus DSM3638基因组DNA，以所述Pyrococcus furiosusDSM3638基因组DNA为模板，在引物3和引物4作用下进行PCR，得到所述启动子Pgdh序列；其中所述引物3的碱基序列如SEQ ID NO.5所示，所述引物4的碱基序列如SEQ ID NO.6所示；
步骤1.3、通过Overlap PCR在所述引物2和所述引物3的作用下将所述启动子Pgdh与所述pyprol片段连接成一个片段。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2还包括以质粒pTE1为模板，在引物5和引物6作用下进行PCR；其中所述引物5的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，所述引物6的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3还包括将所述和所述线性化载体pTE1片段按照摩尔比为2：1比例，加入ExnaseⅡ和CEⅡbuffer，混匀后在37℃孵育30min，得到连接产物；然后将所述连接产物通过热激的方式转入感受态细胞大肠杆菌DH5α中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选；挑选转化子在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中进行过夜培养，得到成功转入pyprol的质粒pTE-pyprol。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4还包括将胍丁胺营养缺陷型菌株T.kodakarensis TS559在含有胍丁胺的ASW-YT培养基中培养,培养完成之后离心收集菌体；在吹氮气的条件下加入CaCl2溶液重悬菌体，将重悬液转移至离心管中，并在冰上孵育；在吹氮气的条件下加入所述质粒pTE-pyprol，并在冰上孵育；孵育完成之后，热激；然后使用注射器将混合液转移至ASW-YT液体培养基中培养；吸取所述培养物涂布于ASW-YT滚管中并培养；待有单菌落长出，在厌氧操作箱中挑取单克隆，在ASW-YT培养基中培养；所述含有胍丁胺的ASW-YT培养基胍丁胺浓度为1mM，所述T.kodakarensis TS559的培养温度为85℃，所述CaCl2溶液浓度为0.1M；所述热激的温度为85℃，热激的时间为45s。
7.权利要求1所述的重组菌在制备重组脯肽酶的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述重组菌纯化，得到重组脯肽酶；所述纯化的方法为：用Lysis buffer重悬菌体，在冰上使用超声破碎仪破碎菌体，裂解完成之后离心，保留上清液；将所述上清液加入到Ni-NTA亲和层析柱中，用Wash buffer洗涤层析柱，再用Elution buffer洗脱所述重组脯肽酶；最后用超滤管去除所述重组脯肽酶中的高浓度咪唑。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述Lysis buffer含0.5M NaCl，50mMTris-HCl，pH 8.0；所述Wash buffer含0.5mol/L NaCl，20mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；所述Elution buffer含0.5mol/L NaCl，250mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述超滤管为10kDa，所述重组脯肽酶保存在含0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0的缓冲液中。
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