FI104390B - Menetelmä juoman ylikuohuntatekijän määrittämiseksi - Google Patents

Description

104390 -

MENETELMÄ JUOMAN YLIKUOHUNTATEKIJÄN MÄÄRITTÄMISEKSI

Keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 johdanto-osassa määritelty menetelmä juoman ylikuohun-tatekijän määrittämiseksi.

5 Käytettäessä oluen valmistuksessa homeilla saastunutta ohraa saattaa tuotettava olut olla altis ylikuohunnalle. Ylikuohunta on ilmiö, jossa olut kuohuu liiallisesti, esim. olut saattaa syöksyä ulos pullosta pulloa avattaessa. Pahimpia ylikuohunnan aiheut-10 tajia ovat Fusarium-homeet. mutta esimerkiksi myös Ai-tenaria-. Aspergillus-, Nigrospora-. Penicillium- ja Stemphvlium-sukuihin kuuluvilla homeilla esiintyy yli-kuohunta-aktiivisuutta. Homeiden tuottamia ylikuohun-tatekijöitä on tutkittu vuosikymmenien ajan, mutta 15 niitä ei ole pystytty tarkasti osoittamaan ja karakterisoimaan. Ylikuohuntatekijoiden on todettu olevan peptidejä tai ainakin peptidejä sisältäviä yhdisteitä. Niiden on lisäksi todettu olevan hydrofobisia ja luonteeltaan happamia. Useimpien homeiden ylikuohuntateki-20 jät sisältävät varsin runsaasti kysteiiniä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat antaneet viitteitä siitä, että ylikuohuntatekijät olisivat konsentroituneet ohran * · : ’.· kuorikerrokseen.

:,j,: Tällä hetkellä oluen ylikuohuntataipumus tes- :Y: 25 tataan määrittämällä ohraerän Fusarium-homeilla saas- tuneiden jyvien osuus. Ohraerä hylätään, jos saastu- ··· neiden jyvien osuus ylittää sallitun raja-arvon. Mene- • · telmä on työläs ja hidas eikä se ole kvantitatiivinen.

• · ·

Menetelmän suurin heikkous on siinä, ettei sillä pys- . . 3 0 tytä määrittämään ylikuohunnan todellista aiheuttajaa, • · ylikuohuntateki jää. Näin ollen tulokset voivat johtaa ·, · · *·’ ’ vääriin johtopäätöksiin.

· Keksinnön tarkoituksena on poistaa edellä

i » » I

mainitut epäkohdat.

35 Erityisesti keksinnön tarkoituksena on tuoda « * : esiin luotettava ja laadunvalvontaan soveltuva mene- * ’ telmä juomien, erityisesti oluen ylikuohuntataipumuk- v> 2 104390 sen määrittämiseksi juomien raaka-aineista. Erityisesti menetelmän tarkoituksena on määrittää oluen todellisen ylikuohuntatekijän määrä viljasta.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnus-5 omaista se, mitä on esitetty patenttivaatimuksessa 1.

Keksintö perustuu suoritettuun tutkimustyöhön, jossa tutkittiin oluen ylikuohunnan aiheuttajia ja jossa havaittiin, että homeiden tuottamat hydrofobiset proteiinit, hydrofobiinit, ovat oluen ylikuohun-10 tatekijöitä.

Hydrofobiinit ovat pieniä homeiden tuottamia hydrofobisia proteiineja, jotka sisältävät yleensä esim. 100 ± 25 aminohappoa. Hydrofobiineja on tähän mennessä eristetty useista homeista ja syötävistä sie-15 nistä. Tunnusomaista hydrofobiineille ovat niiden 8 kysteiinitähdettä, jotka ovat sijoittuneet proteiiniin tietyn kaavan mukaisesti. Hydrofobiineja esiintyy homeiden myseelin ja itiöiden pinnalla sekä erittyneenä kasvualustassa. Hydrofobiinit välittävät homerihmasto-20 jen kiinnittymistä kasvualustaan ja toisiinsa sekä muodostavat ilmarihmaston ja itiöiden pinnalle vetty-miseltä suojaavan kerroksen. Hydrofobiinien on todettu kerääntyvän faasien rajapintaan, esimerkiksi kasvuliu- oksessa ilmakuplien pinnalle, jolloin ne muodostavat 25 rajapinnalle amfipaattisia kalvoja. Kalvonmuodostusky-kynsä ansiosta hydrofobiinit muuttavat aineiden pinta- I · “* ominaisuuksia hydrofobisesta hydrofiiliseksi ja päin I · * vastoin. Niiden kyky alentaa vesiliuoksen pintajänni-’ tystä on samaa luokkaa kuin eräillä synteettisillä de- 30 tergenteillä. Hydrofobiineja on kuvattu mm. seuraavis-sa artikkeleissa Wessels, J.G.H., Hydrofobins: Pro- teins that Change the Nature of the Fungal Surface, *. Advances in Microbial Physiology, vol. 38, 1997 Acade- c ·;;; mic Press Limited, s. 1-45 ja Wessels, J.G.H., Fungal 35 hydrofobins: proteins that function at an interface,

Trends in Plant Science, vol. 1, s. 9-15. Hydrofobii- • .;·· nit stabiloivat kuplia aiheuttaen kasvuliuoksen kuohu- 3 104390 mistä. Nyt homeista eristetyn hydrofobiinin on todettu aiheuttavan oluen ylikuohuntaa.

Keksinnön mukaisesti hydrofobiinin määrä juoman raaka-aineesta ja/tai juomasta, erityisesti vil-5 jasta, kuten ohrasta, maltaasta ja/tai oluesta voidaan määrittää millä tahansa hydrofobiinin määritykseen soveltuvalla menetelmällä.

Eräässä edullisessa sovellutuksessa hydrofo-biini määritetään immunologisesti hydrofobiiniantigee-10 nin ja vasta-aineen välisellä immunologisella reak tiolla. Immunologinen menetelmä voi olla immunoradio-metrinen, -entsymetrinen, -fluorometrinen tai -lumino-metrinen menetelmä. Määrityksessä tarvittavat hydrofo-biiniproteiineille spesifiset vasta-aineet valmiste-15 taan tavanomaisilla vasta-aineiden valmistusmenetel millä .

Hydrofobiiniproteiineja voidaan eristää yli-kuohunta-aktiivisuutta omaavista homekannoista ja etenkin Fusarium-kannoista. Käyttökelpoisia kantoja 20 ovat esim. Gibberella avenacea (F.avenaceum), F.culmorum. F.poae, Gibberella zeae (F.araminearum), Nigrospora sp. ja T.reesei. Hydrofobiineja voidaan eristää homemyseelistä ja/tai kasvuliuoksista tavan-

I

: omaisin menetelmin esim. uuttamalla, kuplittamalla • < « 25 ja/tai kylmäkuivaamalla.

,···, Hydrofobiini voidaan eristää myseelistä koi- i · mivaiheisella uuttomenetelmällä ja/tai kasvuliuoksesta • · ·.; kuplittamalla liuosta, jolloin hydrofobiini rikastuu • · · ’·* ’ syntyvään vaahtoon, ja/tai pakastamalla kasvuliuos, 30 jolloin hydrofobiini sakkautuu ja se voidaan erottaa • · :,V fuugaamalla liuoksen sulatuksen jälkeen.

• · · -ί ' Menetelmän eräässä edullisessa sovellutukses-

sa hydrofobiinin määrittämiseksi käytetään ELISA

’!'.! (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) -menetelmää. Mene- • * 35 telmän entsyymireaktiossa syntyvä väri tai fluoresens- • • '· si osoittaa hydrofobiinin olemassaolon ja määrän. ELI - ·:·: SA-menetelmää, vasta-aineiden valmistusta ja puhdis- . 4 104390 tusta, siinä käytettäviä entsyymejä, konjugaatteja ja substraatteja on kuvattu mm. seuraavassa artikkelissa Vaag, P., Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) in the Beverage Industries: Principles and Practice, Ana-5 lysis of Non-Alcoholic Beverages (Modern Methods of

Plant Analysis, new series vol 8), Eds. Liskens, H.H. ja Jackson, J.F., Springer-Verlag, Berlin 1988, s. 1-29.

Menetelmässä voidaan käyttää myös muita vas-10 taavia immunologisia menetelmiä, kuten EBStrALISA

(Enzyme Biotin Streptavidin Linked Immunosorbent Assay) -menetelmää. EBStrALISA-menetelmää on kuvattu mm. artikkelissa Vaag, P., Immunological detection of Fusarium in barley and malt, Proc. Eur. Brew. Conv. 15 Lisbon 1991, s. 553-560.

Menetelmän eräässä toisessa edullisessa sovellutuksessa hydrofobiini määritetään immunokromato-grafisesti käyttäen immunokromatografiaan perustuvaa testiliuskaa. Menetelmän immunologisessa reaktiossa 20 syntyvä väri osoittaa hydrofobiinin olemassaolon ja määrän.

Käytettävä testiliuska voi käsittää esim.

: ’ : kromatografisen membraanin, jossa on liikkuvia leima- : partikkeleita ja kaksi paikallaan pysyvää hydrofobii- * * * 25 nin vasta-ainealuetta. Näyte absorboidaan testiliuskan

• I

.···. membraaniin, jossa reagoi leiman kanssa ja kulkeutuu • · V’.m membraanin vasta-ainealueille. Jos näyte sisältää hyd- • · · t,I rofobiinia vasta-ainealueille muodostuu immunologises- i « sa reaktiossa syntyvät värilliset testi- ja kontrolli-30 viivat. Mikäli näyte ei sisällä hydrofobiinia muodos- • · tuu ainoastaan kontrolli viiva.

• · · ·,· ' Keksinnön ansiosta teollisuuden laadunvalvon- nassa käytössä oleva puolikvantitatiivinen, Fusarium- t sienen osoittamiseen perustuva detektiomenetelmä voi-

« I

35 daan korvata uudella luotettavalla täsmämenetelmällä I f < '·· määritettäessä viljasta primäärinen ylikuohuntatekijä.

Valitsemalla käytettävä vilja, erityisesti ohra uuden 5 104390 menetelmän avulla voidaan turhien ja kalliiksi osoittautuneiden varotoimenpiteiden tarvetta vähentää erityisesti riskivuosina, jolloin viljan laatu on huonoa ja ylikuohuntaa esiintyy runsaasti viljasta tuotetussa 5 oluessa.

Edelleen uusi immunologinen detektiomenetelmä tarjoaa aiempaa nopeamman ja yksinkertaisemman ja siten halvemman menetelmän ohran ylikuohuntataipumuksen määrittämiseksi.

10 Seuraavassa keksintöä kuvataan yksityiskoh taisemmin oheisissa esimerkeissä.

Esimerkki 1. Hvdrofobiinien eristys ia osoittaminen

Hydrofobiinia eristettiin ylikuohunta-15 aktiviteettia omaavista homekannoista: Gibberella ave-nacea (F.avenaceum) (VTT-D-80141), F.culmorum (VTT-D-80148), F.poae (VTT-D-82182), Gibberella zeae (F.graminearum) (VTT-D-95470) , Nigrospora sp. (VTT-D-79122) ja T.reesei (VTT-D-74075).

20 Homeita kasvatettiin kolmella erilaisella alustalla, agarilla, kasvuliuoksessa ja ohrassa. Hyd-rofobiini eristettiin kolmivaiheisella uuttomenetel-mällä sekä kasvuliuosta kuplittamalla. Näytteen sisäl-; tämien proteiinien molekyylijakauma selvitettiin gee- , \ 25 lielektroforeesilla. T.reesei-kannan tuottama hydrofo- ^ biini on kooltaan noin 7,5 kDa. Nigrospora sp.-kannan i · !*It (myseeliuutto) ja F.poae-kannan (kasvuliuoksen kupli- < · · tus) tuottamat hydrofobiinit olivat kooltaan- samaa i · · ’·’ suuruusluokkaa. Gibberella zeae-kannan myseelistä uu- 30 tettu hydrofobiini oli kooltaan noin 20 kDa.

• · ·.·.· Hydrofobiinien osoittamiseen näytteestä käy-

IM

*t* · tettiin immunologista ELISA-testiä. Testissä käytettä- I:. vä vasta-aine valmistettiin käyttämällä seuraavaa im- munisointiprotokollaa. Kani immunisoitiin puhdistetul- '1' 35 la T. reesei-homeen tuottamalla hydrofobiinilla, jota « · • '* sekoitettiin Freund'n adjuvanttiin. Pistoksia annet- tiin 4 kertaa kolmen kuukauden aikana. Tiitterin ke- 6 104390 hittymistä seurattiin määrittämällä kaksi kertaa veren vasta-ainepitoisuus ELISA-menetelmällä. Immunisointi-jakson loputtua kanin veri kerättiin talteen ja verestä erotettiin seerumi. Seerumin reaktiivisuus testattiin määrittämällä se seerumilaimennos, joka vielä antaa vasteen ELISA-menetelmässä. Laimennos oli yli 1/100 000.

Testissä hydrofobiininäytettä pipetoitiin mikrotiitterilevyn kuoppiin, jolloin näytteen proteiinit kiinnittyivät kuoppien seinämiin. Seuraavaksi lisätty hydofobiinivasta-aine tunnisti seinämistä hydro-fobiiniproteiinin ja kiinnittyi siihen. Tämän jälkeen lisätty konjugaatti kiinnittyi vuorostaan vasta-aineeseen. Konjugaatti sisälsi entsyymin, joka muutti kuoppiin pipetoidun substraatin värilliseksi. Substraatin värin voimakkuus oli suoraan verrannollinen näytteen hydrofobiinipitoisuuteen.

Korkeimmat vasteet saatiin F.poaen. Niarospo-ra sp.:n ja T.reesein hydrofobiininäytteistä.

Esimerkki 2. Hvdrofobiinin määritys ohranävt- teestä

Ohraa kontaminoitiin esimerkin 1 Fusarium-: kannoilla ja T.reesei-kannalla kaksi viikkoa. Ohrauute : valmistettiin sekoittamalla 50 g ohraa/100 ml vettä 1 «Il min ajan. Ohra-vesiseosta fuugattiin 15 min nopeudella • .··. 4000 g. Supernatanttiuute otettiin talteen ja uutteen • · sisältämä hydrofobiini määritettiin suoralla ELISA- • · · I,! menetelmällä käyttäen T. reesein hydrofobiinia vastaan • · · valmistettua vasta-ainetta.

Mikrotiitterilevyille pipetoitiin 150 • · # V * μΐ/kuoppa ohrauutelaimennosta 1/10 ja 1/100. Laimen- • · · V * nokset tehtiin natriumfosfaattipuskuriin (10 mM natri- umfosfaattia pH 7,3, 150 mM natriumkloridia = PBS- t w . liuos). Levyn annettiin olla yön yli jääkaapissa. Seu- a · raavana päivänä levylle pipetoitiin 100 μΐ/kuoppa PBS- a · liuosta, jossa oli 0,1 % naudan seerumin albumiinia ja : 0,05 % Tween 20 -liuosta (=BSA/PBS-liuos) . Levyn an- 104390 nettiin olla yli yön kylmässä, minkä jälkeen se pestiin PBS-liuoksella, johon oli lisätty 0,01 % Tween 20 -liuosta (PBST-liuos). Hydrofobiinivasta-aineesta tehtiin laimennos 1/100 BSA/PBS-liuokseen. Vasta-5 ainelaimennosta pipetoitiin levylle 100 μΐ/kuoppa ja levyä inkuboitiin 2 h +37 °C:ssa. Levy pestiin PBST-liuoksella. Seuraavaksi levylle pipetoitiin 100 μΐ/kuoppa konjugaattia: vuohen anti-kani IgG alkaali-nen fosfataasi, laimennos 1/1000 BSA/PBS-liuokseen. 10 Levyä inkubointiin 2 h +37 °C:ssa ja pestiin PBST-liuoksella. Viimeiseksi levylle pipetoitiin 100 μΐ/kuoppa substraattia: 1 tabletti p-nitrofenyyli- fosfaattia/5 ml dietyleeniamiini+MgCl2 -puskuria. Levyä inkuboitiin ravistelijassa 30 min huoneeniämpöti-15 lassa. Absorbanssi mitattiin 405 nm aallonpituudella Multiscan-fotometrillä. Värin intensiteetti on suoraan verrannollinen näytteen sisältämän hydrofobiinin määrään. Ohrauutenäytteiden absorbanssit on esitetty taulukossa 1.

20 Taulukko 1.

Näyte Näytelaimennos _1/10 1/100

Kontrolli 0,551 0,388 i ' l·"" “ VTT-D-80141 1,823 1,360 VTT-D-80148 0,452 0,374 lii VTT - D- 82182 1,088 0,898 • · ........* — " " VTT-D-95470 0,664 0,634 « m · ™' 1 " ' l''J ' VTT - D- 74075 0,863 1,914 «»· · r - - - • · · ’·* ' Korkeimmat hydrofobiinipitoisuudet määritet tiin homekannoilla Gibberella avenacea. F.poae ja • · . :.V T.reesei kontaminoiduista ohranäytteistä.

:§: : Menetelmä soveltuu hyvin myös mallasnäytteil- 25 le.

• II I

'l Esimerkki 3. Oluen vlikuohuntakokeet • · '•,·' Oluen ylikuohuntakoe suoritettiin lisäämällä • « ] '·· olutpulloon 0,5 - 1 ml hydrofobiininäytettä. Pulloa • · 104390 ravisteltiin 3 vuorokautta huoneenlämmössä, jonka jälkeen se avattiin ja ylikuohuvan oluen määrä määritettiin pullon painonmuutoksesta.

T.reesein (myseeliuutto) ja F.ooaen (kasvu-5 liuoksen kuplitus) hydrofobiininäytteet aiheuttivat erityisen voimakasta ylikuohuntaa. Edellinen näyte aiheutti jopa yli 50 % ja jälkimmäinen 30 - 45 % ylikuohuntaa. Niarospora sp.:n (myseeliuutto) hydrofobiini-näyte aiheutti toistuvaa 1 - 10 % ylikuohuntaa. Myös 10 muiden tutkittujen homeiden hydrofobiininäytteet aiheuttivat oluen ylikuohuntaa vaihtelevasti.

Tehtyjen kokeiden perusteella hydrofobiini-proteiinit aiheuttavat oluen ylikuohuntaa.

Keksintöä ei rajata pelkästään edellä esitet-15 tyjä sovellutusesimerkkejä koskevaksi, vaan monet muunnokset ovat mahdollisia pysyttäessä patenttivaatimusten määrittelemän keksinnöllisen ajatuksen puitteissa .

• · • · · • · • · • · · • Il • · · • · • t · • · · • · · « • · • · · « · · • · • Il II» • · ·

I I f I

111«

III I I

I

• I · • I « • · • I · « ·

Claims (4)

9 104390

1. Menetelmä juoman ylikuohuntatekijän määrittämiseksi, tunnettu siitä, että hydrofobiinin määrä määritetään juoman raaka-aineesta ja/tai juomas- 5 ta.

2, Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritetään ylikuohuntatekijä oluessa siten, että hydrofobiinin määrä määritetään viljasta, maltaasta ja/tai oluesta.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen mene telmä, tunnettu siitä, että hydrofobiini määritetään immunologisesti hydrofobiiniantigeenin ja vasta-aineen välisellä immunologisella reaktiolla.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen 15 menetelmä, tunnettu siitä, että hydrofobiini määritetään ELISA-menetelmällä, EBStrALISA-menetelmällä j a/tai immunokromatografisesti. f • · • * « i * · m « • · m • « • » • · · * * • · * • · · • · « · · • · · • · · • · • · · • * · v t · • · · • · · • · · I · < • IM • · • · « I « • I · « « 104390