CN106432463A - 一种肿瘤特异性抗原tsp70及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤特异性抗原TSP70及其应用。一种肿瘤特异性抗原TSP70，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌及乳腺癌等肿瘤特异性抗原TSP70在制备非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌及乳腺癌等肿瘤诊断试剂中的应用。本发明提供了新的一种肿瘤特异性抗原TSP70，该抗原在人非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌及乳腺癌等肿瘤细胞中表达阳性率高，表达特异性也高，免疫电镜证实TSP70蛋白位于细胞的胞膜、胞浆和胞核中；既可作为标准品用于制备非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌及乳腺癌等肿瘤诊断试剂，也可用于制备治疗或预防非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌及乳腺癌等肿瘤的药物。

Description

一种肿瘤特异性抗原TSP70及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种肿瘤特异性抗原TSP70及其应用。
背景技术
非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤是当今世界范围内最常见、恶性程度及死亡率高的恶性肿瘤。随着人口持续增长和人口老龄化的加剧，加之生活方式、社会、经济、环境等变化，恶性肿瘤，尤其是肺癌的发病率和死亡率呈明显上升趋势。每年确诊的肺癌病例约161万，占恶性肿瘤的12.7％，肺癌相关死亡约138万例，占癌症相关死亡的18.2％。肺癌也是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国大多数地区占第一位。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌总数的80％～85％，包括肺腺癌、肺鳞癌和大细胞肺癌等。然而，目前尚无理想的非小细胞肺癌等肿瘤的特异性标志物。
单克隆抗体是寻找肿瘤相关抗原的重要工具。然而，单克隆抗体针对的并非某个蛋白质的全序列，而是蛋白质上由数个氨基酸或糖基组成抗原表位。抗原表位可以由蛋白质上连续的数个氨基酸构成，称之为线性表位；也可以由蛋白质序列上彼此不连续，但形成一定空间构象的数个氨基酸构成，称之为构象表位。最小的抗原表位只含有4～6个氨基酸残基或糖基。由于不同的蛋白质可以具有相同的抗原表位，因此单克隆抗体通常会对应携带相同表位的多个蛋白质。所以，从已知单克隆抗体无法直接推断其所针对蛋白抗原的氨基酸序列。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤的特异性抗原TSP70。
本发明的又一目的是提供该抗原的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种肿瘤特异性抗原TSP70，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的肿瘤选自非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌。TSP70蛋白是通过免疫亲和层析的方法分离得到，测序结果与数据库比对结果显示其为一种尚未见报导的新蛋白。
所述的肿瘤抗原TSP70的氨基酸序列在其蛋白质三维结构分析其相应配体的设计和筛选中的应用。
本发明所述的肿瘤特异性抗原TSP70在制备治疗肿瘤的药物中的应用；所述的肿瘤选自非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌。
本发明所述的肿瘤特异性抗原TSP70优选在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用。
本发明所述的肿瘤特异性抗原TSP70在制备非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤诊断试剂中的应用。
本发明所述的肿瘤特异性抗原TSP70优选在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用。
一种肿瘤诊断试剂，含有本发明所述的肿瘤特异性抗原TTSP70；所述的肿瘤选自非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌；优选非小细胞肺癌。
一种治疗或预防人肿瘤的药物组合物，至少含有本发明所述的肿瘤特异性抗原TSP70；所述的肿瘤选自非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌；优选非小细胞肺癌。本发明所述的肿瘤特异性抗原TSP70能够刺激机体产生免疫反应，同适量的佐剂一起制备成预防肿瘤的药物。
TSP70在肿瘤细胞中特异性高表达，并对肿瘤细胞的增殖和转移具有促进作用，因此TSP70在抗肿瘤药物筛选中具有应用价值。同时，TSP70也可以作为抗癌药物作用靶点。
与本发明所述的肿瘤抗原TSP70特异性结合的抗体。
所述的抗体优选单克隆抗体或多克隆抗体。
有益效果：
本发明提供了新的一种非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤特异性抗原TSP70，该抗原在人非小细胞肺癌等肿瘤中表达阳性率高，表达特异性也高，免疫电镜证实TSP70蛋白位于细胞的胞膜、胞浆和胞核中；流式细胞分析与Tranwells实验表明TSP70具有抗细胞凋亡和促侵袭转移的功能。该抗原既可作为标准品用于制备非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤诊断试剂，也可用于制备治疗或预防非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等肿瘤的药物。
附图说明
图1纯化的TSP70抗原的SDS-PAGE电泳结果
图2 TSP70蛋白的Western blot结果
图3免疫电镜鉴定TSP70蛋白的亚细胞定位
图4 TSP70抗细胞凋亡的流式细胞分析结果
图5 TSP70促细胞侵袭转移的Transwell检测结果
A.TSP70处理组；B.对照组
图6 TSP70作为ELISA标准品检测的标准曲线
生物材料样品的保藏信息
杂交瘤细胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C201172。
具体实施方式
实施例1 TSP70蛋白的分离和纯化
1.人肺癌细胞系SPC-A1细胞裂解液的制备
1)培养SPC-A1细胞，弃去SPC-A1细胞培养液，Hanks液洗2遍，胰酶消化2分钟后，加培养液重悬细胞，将细胞悬液转移至15mL(或50mL)离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清；
2)预冷的PBS洗1遍细胞，1000rpm离心5分钟；将细胞转移至1.5mL EP管中，PBS洗，12000pm离心5分钟；
3)将IP细胞裂解液提前置于冰上融解。取适量裂解液(50uL/106细胞)，按1:100的比例加入100mM蛋白酶抑制剂PMSF、PHI和PI；
4)将裂解液加入细胞团中，吹打混匀；
5)冰上孵育30分钟，每5分钟涡旋振荡1次；
6)12000pm，4℃离心5分钟；
7)将上清转移至新的EP管，即为SCPA1细胞裂解液；
2.亲和层析法纯化TSP70蛋白
1)亲和层析柱的平衡
以10倍柱体积的pH7.4、0.02mol/LPBS缓冲液缓慢冲洗包被NJ001抗体(制备方法见CN102391992A)的亲和层析柱；
2)上样
将柱中液体排空，夹闭流出管，取样本SCP-A1细胞裂解液缓缓加入亲和层析柱中，用加样枪轻轻吹打混匀，放至4℃过夜；
3)洗去未结合的杂蛋白
以5倍柱体积的pH7.4、0.02mol/L PBS缓冲液冲洗亲和层析柱；
以10倍柱体积的pH7.4、0.02mol/L PBS缓冲液(含0.5mol/L NaCl)冲洗亲和层析柱；
4)洗脱目的TSP70蛋白
以5倍柱体积的0.01mol/L、pH2.5Gly-HCl Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱峰；
5)洗脱液的中和
将一定体积的0.2mol/L NaOH溶液加入洗脱液中的，使pH中和至7.0。
3.按照本实施例中步骤1的方法，分别使用胰腺癌细胞株SW1990、卵巢癌细胞株SK-OV-3和乳腺癌细胞株MCF-7，也可制备胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌细胞的裂解液，并按步骤2的方案通过亲和层析的方法分别从胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌细胞的裂解液中纯化获得TSP70蛋白。
实施例2 TSP70蛋白的SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定
1 SDS-PAGE测定蛋白质分子量
分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度5％，样品煮沸3min后加样电泳，同时加入标准分子量作对照。开始电压为80V，样品浓缩成线进入分离胶后加大到120V，总共电泳约2.5h，剥胶后考马斯亮蓝染色。电泳结果见图1.电泳后根据标准蛋白分子量和其相对迁移率在半对数坐标纸上作分子量标准曲线，然后根据待测蛋白的相对迁移率从标准曲线上查知其分子量为70Kda，结果见图1。
2 Western blot鉴定
样品经SDS-PAGE后，将凝胶上蛋白条带在80V下转印2h，至硝酸纤维膜上。用1％BSA室温封闭1h，加1.5mL PBST稀释的NJ001单克隆抗体(1:1000)，室温振荡孵育2h，PBST洗涤后加入1.5mL酶标二抗羊抗鼠IgG-HRP(1:2000)，室温振荡孵育2h。洗涤后加入1.5mL底物液反应，化学发光显影。结果如图2所示，在70Kda处见一特异条带。
实施例3 TSP70蛋白的氨基酸序列测定
1.用8mol/L尿素处理，拆分多肽链。
2.通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，确定多肽链的数目。
3.在8mol/L尿素存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键断裂还原为巯基。
4.测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。
5.分析多肽链的N-末端和C-末端。
6.多肽链断裂成多个肽段，并将其分离开来。
7.测定每个肽段的氨基酸顺序。
8.确定肽段在多肽链中的次序，利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
9.采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。
10.获得TSP70蛋白质序列，如SEQ ID NO.1所示。测序结果与NCBI数据库比对结果显示其为一种尚未见报导的新蛋白。且从胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌中纯化获得的蛋白质测序结果完全一致。
实施例4免疫电镜鉴定TSP70蛋白的亚细胞定位
1.收集SPC-A1细胞，制作50～70nm超薄切片，切片载于镍网或金网上；
2.将1％H2O2滴于蜡板上。镍网的载切片面向下轻轻浮于液滴表面，室温10分钟。
3.PBS漂洗3次，每次5分钟；
4.以1％BSA封闭，室温孵育30分钟；
5.滴加单抗NJ001，先置4℃，12小时；然后室温1小时，使抗体充分渗透并结合。
6.PBS漂洗3次，每次5分钟；
7.将载网置含1％BSA的PBS(pH 8.2)中：
8.滴加胶体金标记的羊抗小鼠二抗，室温孵育20―30分钟；
9.双蒸水洗3次，每次5分钟；
10.电镜观察。结果见图3，免疫电镜证实TSP70蛋白位于细胞的胞膜、胞浆和胞核中。
实施例5 TSP70抗细胞凋亡的流式细胞分析
1.将终浓度为20ng/mL的TSP70蛋白加入SPC-A1细胞培养液中，作为实验组；取未加TSP70蛋白的SPC-A1细胞为对照。同时加入终浓度为10ng/mL的TNF-α试剂诱导细胞凋亡。
2.24h后用0.25％胰酶消化细胞，收集1×106细胞，制备单细胞悬液，转入流式管中1500rpm离心5min，弃上清。
3.用预冷的PBS洗涤细胞3次，加入500μL Binding Buffer重悬细胞，再加入Annexin V-FITC和PI各5μL，轻轻混匀。
4.室温避光反应15min，用流式细胞仪检测细胞凋亡。激发波长Ex＝488nm，发射波长Em＝530nm，Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测，PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。结果如图4所示，经TSP70处理的SPC-A1细胞的凋亡率，在12h和48h(1.1％，1.8％)均显著低于未处理组(6.2％，28.7％)，提示TSP70有抗细胞凋亡的功能。
实施例6 TSP70促细胞侵袭转移的Transwell检测
1.基底膜的包被：将Transwell小室放入无菌24孔板中，将基质胶与不含抗生素及血清的培养液按1:9稀释，取70μl混合液轻轻加至Transwell小室的上室面，避免出现气泡，加好后放入37℃培养箱3h-4h待胶凝固。
2.细胞悬液的制备：将终浓度为20ng/mL的TSP70蛋白加入SPC-A1细胞培养液中，作为实验组；取未加TSP70蛋白的SPC-A1细胞为对照。48h后，用0.25％胰酶消化细胞，重悬后，调至6.0×105个/mL。
3.细胞接种：在Transwell小室的上室加入100μl细胞悬液。下室中加入500μL含10％FBS的培养液。注意去除气泡。
4.细胞培养：将细胞培养板放入37℃，5％CO 2培养箱中培养24h。
5.染色计数：用棉棒轻柔地将上室的基质胶和未穿过胶的细胞擦掉，用PBS轻轻冲洗两遍，将膜晾干；弃去下室培养液，用PBS洗去残留培养液，随即加入500μL 0.1％结晶紫溶液，将Transwell小室放入孔中，室温下染色15-20min，染色完毕后，晾干。用PBS轻轻冲洗，将无细胞处结晶紫洗去。光学显微镜下观察穿透基质胶的细胞，并拍照计数。结果如图5所示，经TSP70处理的SPC-A1细胞的穿膜数显著高于未处理组，提示TSP70能促进肿瘤细胞的侵袭转移。
实施例7 TSP70作为ELISA标准品的检测
将实施例1纯化的蛋白TSP70采用Lowry法测定蛋白的浓度，根据蛋白定量的结果，将纯化的TSP70蛋白投入含添加剂的PBS中，制成不同浓度的TSP70标准品，分别为3.75ng/mL、7.5ng/mL、15ng/mL和30ng/mL。
用兔抗TSP70多克隆抗体包被酶标板(5μg/mL,100μL/孔，4℃过夜)，用1％BSA 4℃封闭过夜。加TSP70标准品100μL/孔，37℃温育60分钟，PBST洗涤4次。每孔内加入100μLPBST稀释的NJ001单克隆抗体(1:3000)，37℃温育30分钟，PBST洗涤4次。每孔内加入100μLPBST稀释的兔抗鼠IgG-HRP(1:2000)，37℃温育30分钟，PBST洗涤5次。每孔内加入100μLTMB显色液，室温避光15分钟，每孔内再加入50μL终止液。用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值，将每个标准品的光密度值与其相对应的浓度值进行线性回归得到标准曲线。结果如图6所示，线性相关系数r＞0.9900。
本发明中所述的NJ001单克隆抗体为发明人前期制备的非小细胞肺癌单克隆抗体，为TSP70的一个单克隆抗体，由杂交瘤细胞株NM001-1(CCTCC NO：C201172)分泌。NJ001单克隆抗体的制备方法见CN102391992A实施例2。
<110>南京麦科林生物科技有限公司
<120>一种肿瘤特异性抗原TSP70及其应用
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<212>PRT
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<223>肿瘤特异性抗原TSP70氨基酸序列
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Ala Leu Ala Leu Glu Glu Asn Ala Thr Ser Gln Lys Val Leu Asp
1 5 10 15
Ile Phe Glu Gln Arg Leu Glu Gln Val Glu Ser Gly Leu His Arg
20 25 30
Ala Leu Arg Leu Gln Arg Phe Phe Gln Gln Ala His Glu Trp Val
35 40 45
Asp Glu Gly Phe Ala Arg Leu Ala Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu
50 55 60
Ala Val Leu Ala Ala Leu Ala Leu Arg Arg Ala Pro Glu Pro Ser
65 70 75
Ala Gly Thr Phe Gln Glu Met Arg Ala Leu Ala Leu Asp Leu Gly
80 85 90
Ser Pro Ala Ala Leu Arg Glu Trp Gly Arg Cys Gln Ala Arg Cys
95 100 105
Gln Glu Leu Glu Arg Arg Ile Gln Gln His Leu Gly Glu Glu Ala
110 115 120
Ser Pro Arg Gly Tyr Arg Arg Arg Arg Ala Asp Gly Ala Trp Met
125 130 135
His Gln Lys Gly Leu Gly Pro Arg Ser Pro Ser Pro Ser Leu Ser
140 145 150
Ser Leu Leu Leu Pro Ser Ser Pro Gly Pro Arg Pro Ala Pro Ser
155 160 165
His Cys Ser Leu Ala Pro Cys Gly Glu Asp Tyr Glu Glu Ala Leu
170 175 180
Thr Met Leu Ala Glu Ala Pro Glu Gly Arg Pro Pro Arg Ala Val
185 190 195
Leu Ile Arg Gly Leu Glu Val Thr Ser Thr Glu Val Val Asp Arg
200 205 210
Thr Cys Ser Pro Arg Glu His Val Leu Leu Gly Arg Ala Arg Gly
215 220 225
Pro Asp Gly Pro Trp Gly Val Gly Thr Pro Arg Met Glu Arg Lys
230 235 240
Arg Ser Ile Ser Ala Gln Gln Arg Leu Val Ser Glu Leu Ile Ala
245 250 255
Cys Glu Gln Asp Tyr Val Ala Thr Leu Ser Glu Pro Val Pro Pro
260 265 270
Pro Gly Pro Glu Leu Thr Pro Glu Leu Arg Gly Thr Trp Ala Ala
275 280 285
Ala Leu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Arg Ser Phe His Arg Thr His
290 295 300
Phe Leu Arg Glu Leu Gln Gly Cys Ala Thr His Pro Leu Arg Ile
305 310 315
Gly Ala Cys Phe Leu Arg His Gly Asp Gln Phe Ser Leu Tyr Ala
320 325 330
Gln Tyr Val Lys His Arg His Lys Leu Glu Asn Gly Leu Ala Ala
335 340 345
Leu Ser Pro Ser Ser Lys Gly Ser Met Glu Ala Gly Pro Tyr Leu
350 355 360
Pro Arg Ala Leu Gln Gln Pro Leu Glu Gln Leu Thr Arg Tyr Gly
365 370 375
Arg Leu Leu Glu Glu Leu Gln Ser Glu Asp Leu Pro Glu Leu Ser
380 385 390
Ser Glu Cys Arg Ala Leu Gly Ala Ala Val Gln Leu Leu Arg Glu
395 400 405
Gln Glu Ala Arg Gly Arg Ala Leu Leu Asn Val Ser Ile Ser Arg
410 415 420
Glu Gly Lys Ile Asp Leu Lys Glu Gln Gly Gln Leu Leu His Arg
425 430 435
Asp Pro Phe Thr Val Ile Cys Gly Arg Lys Lys Cys Leu Arg His
440 445 450
Val Phe Leu Phe Glu His Leu Leu Leu Phe Ser Lys Leu Lys Gly
455 460 465
Pro Glu Gly Gly Ser Glu Met Phe Val Tyr Lys Gln Ala Phe Lys
470 475 480
Thr Ala Asp Met Gly Leu Ala Met Asn Ile Gly Cys Met Glu Leu
485 490 495
Cys Phe Glu Leu Trp Phe Arg Arg Arg Arg Ala Arg Glu Ala Tyr
500 505 510
Thr Leu Gln Ala Thr Ser Pro Glu Ile Lys Leu Lys Trp Thr Ser
515 520 525
Ser Ile Ala Gln Leu Leu Trp Arg Gln Ala Ala His Asn Lys Glu
530 535 540
Leu Arg Val Gln Gln Met Val Ser Met Gly Ile Gly Asn Lys Pro
545 550 555
Phe Leu Asp Ile Lys Ala Leu Gly Glu Arg Thr Leu Ser Ala Leu
560 565 570
Leu Thr Gly Arg Gly Glu Gly Gln Gly Ala Gly Gly Trp Pro Pro
575 580 585
Gly Val Lys Thr Leu Thr Met Arg Ile Gln Arg Gly Gly Met Val
590 595 600
Glu Ser Gln Glu Arg His Leu Val Pro Lys Ser Val Gly Leu Ala
605 610 615
Gly Arg Pro Ser Val Arg Leu Arg Val Ile Pro Gly Ser Gln Glu
620 625 630
Gly Phe Pro Thr Pro Ala Pro His Pro Pro Leu Pro Thr Leu Cys
635 640 645
Ser Arg Pro

Claims (11)

1.一种肿瘤抗原TSP70，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的肿瘤选自非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌。
2.权利要求1所述的肿瘤抗原TSP70的氨基酸序列在其蛋白质三维结构分析其相应配体的设计和筛选中的应用。
3.权利要求1所述的肿瘤抗原TSP70在制备治疗肿瘤药物中的应用；所述的肿瘤选自非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌。
4.权利要求1所述的肿瘤抗原TSP70在制备肿瘤诊断试剂中的应用；所述的肿瘤选自非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于权利要求1所述的肿瘤抗原TSP70在制备非小细胞肺癌诊断试剂中的应用。
6.一种非小细胞肺癌诊断试剂，其特征在于含有如权利要求1所述的TSP70抗原作为标准物质。
7.一种治疗或预防恶性肿瘤的药物组合物，其特征在于至少含有权利要求1所述的TSP70抗原；所述的恶性肿瘤选自非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌。
8.TSP70在筛选抗肿瘤药物中的应用。
9.TSP70作为抗肿瘤药物作用靶点的应用。
10.与权利要求1所述的肿瘤抗原TSP70特异性结合的抗体。
11.根据权利要求10所述的抗体，其特征在于所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
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