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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein verbessertes Immunoassay-Verfahren zur Bestimmung von IgA-Antikörpern, die
sich gegen Acetaldehyd-Addukte von Proteinen richten. Diese Art
von Assays ist hilfreich zur Diagnose hoher Alkoholaufnahme, wozu sowohl
nicht alkoholabhängige
schwere Trinker als auch Alkoholiker zählen.
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Kürzlich
ist das Vorliegen von Antikörpern, die
sich gegen mit Acetaldehyd modifizierte Proteinepitope richten,
im Plasma von Alkoholikern mit Alkoholmissbrauch in Verbindung gebracht
worden. Diese Antikörper
werden jedoch auch bei Patienten mit nicht alkoholabhängigen Lebererkrankungen
beobachtet und sind als solche nicht als spezifisch für hohe Alkoholaufnahme
anzusehen (Niemela et al., Hepatology 7(1987)1210–1214; Hoerner
et al., Hepatology 8(1988)569–574;
Worrall et al., Alcohol Alcoholism 25(1990)509–511). Man hat gezeigt, dass IgA-Antikörper gegen
Acetaldehyd-modifizierte Proteine bei Alkoholikern (Worrall et al.,
Eur. L. Clin. Invest. 21(1991)90–95) und schweren Trinkern
(Worrall et al., Alcoholism: Clin. Exp. Res. 20(1996)836–840) im
Vergleich zu Geselligkeitstrinkern erhöht sind, und im Gegensatz zur
gesamten Ig-Reaktivität
war die IgA-Reaktivität
bei nicht alkoholabhängigen
Lebererkrankungen nicht erhöht.
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Die zur Bestimmung der IgA-Antikörpertiter gegen
Protein-Acetaldehyd-Addukte verwendeten Verfahren nutzen Immunoassays,
die auf der Bildung und dem Nachweis/Bestimmung des Komplexes anti-IgA – Proben-IgA – Addukt beruhen. Addukt
steht für
ein in vitro gebildetes Acetaldehyd-Addukt eines Proteins und wirkt
im Assay als Antigen. Das zur Synthese des Addukts verwendete Protein
war Rinderserumalbumin oder Rinderhämoglobin. Der Begriff Proben-IgA
ist selbsterläuternd. Anti-IgA
steht für
zugefügte
Antikörper
mit Spezifität für IgA. Man
fand, dass sich die Korrelation mit hoher Alkoholaufnahme verbessert,
wenn man die adduktspezifische Reaktivität(ASR) verwendet, die man dadurch
erhält,
dass man den mit dem unmodifizierten Antigen erhaltenen IgA-Titer
von dem IgA-Titer abzieht, den man mit dem entsprechenden Addukt
erhält
(Worrall et al., Alcoholism: Clin. Ex. Res. 20(1996)836–840).
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Man konnte zeigen, dass sich Acetaldehyd, der
primäre
Metabolit von Ethanol, nach chronischer Ethanolaufnahme im Blut
und der Leber ansammelt (Nuutinen et al., Alcoholism: Clin. Exp.
Res. 7(1983)163–168
und Nuutinen et al., Eur. J. Clin. Invest. 14(1984)306). In vitro
bilden sich mit Proteinen (Donohue et al., Arch. Biochem. Biophys 220(1983)239–246), Lipiden,
Nukleinsäuren
und Kohlenhydraten (Nicholls et al., Int. J. Biochem. 24(1992)1899–1906) mehrere
Acetaldehydaddukte unterschiedlicher Stabilität. In vitro gebildete Hämoglobin-Addukte
sind von Sillanaukee et al. (Alcohol. Clin. Exp. Res. 14(1990) 842–846, Hazelett
et al. (Alcohol. Clin. Exp. Res. 17(1992)1107–1111) und Itälä et al.,
(Anal. Biochem. 224 (1995)323–329),
und in vivo von Sillanaukee et al. (Alcohol Alcoholism. 26(1991)5– 6) Sillanaukee
et al., (Alcohol 8(1991)377–381)
und Sillanaukee et al., J. Lab. Clin. Med. 120(1992)42–47) nachgewiesen
worden.
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Die Serum/Plasma-Konzentrationen
von Acetaldehyd-Protein-Addukten sind mittels ELISA-Verfahren unter
Einsatz polyklonaler Antikörper bestimmt
worden (Lin et al., Alcohol. Clin. Exp. Res. 3(1993)669–674; Sillanaukee
et al J. Lab. Clin. Med. 120 (1992)42–47; Niemelä und Israel, Lab. Invest. 67(1992)246–252; Niemelä et al.,
Alkohol. Clin. Exp. Res. 14(1990)838–841; und Lin et al., Alcohol.
Clin. Esp. Res. 14 (1990)438–443),
die gegen Acetaldehyd-Addukte von Hämoglobin oder synthetischen Peptiden
herangezogen sind, welche solche Sequenzen der Hämoglobin-β-Kette nachahmen sollen, die
theoretisch mit Acetaldehyd reagieren können (Lin et al., Alcohol.
Clin. Exp. Res. 3(1993)669–674). Monoklonale
Antikörper
gegen synthetische Peptid-Addukte sind beschrieben worden (Klassen
et al., Alcohol. Clin. Exp. Res. 18(1994)164–171; Thiele et al., Biochem.
Pharmacol. 48(194)183–189;
und Lin et al., Alcohol. Clin. Exp. Res. 19(1995) 314–319). Die Verwendung
monoklonaler Antikörper
zur Bestimmung klinisch relevanter Serum/Plasma-Konzentrationen
von Acetaldehyd-Addukten ist bislang nicht beschrieben worden.
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Acetaldehyd kann mit primären und
sekundären
Aminogruppen in Proteinen, d. h. Lysin und den N-terminalen Aminogruppen
der Proteine, reagieren. Das primäre Produkt ist eine Schiffbase,
die durch Weiterreaktion zu einem ethylierten Amin oder, bei N-terminalen
Aminogruppen, auch zu einem 2-Methylimidazolidin-4-on stabilisiert werden
kann. Die Adduktbildung mit aminoterminalen Peptiden, die sich von
der Hämoglobin-β-Kette ableiten
(VHLTPEK und VHLTPEC), unter verschiedenen Bedingungen ist untersucht
worden (Lin et al., Alcohol. Clin. Exp. Res. 19(1995) 314–319) und
Sillanaukee et al., Eur. J. Biochem. 240(1996)30–36).
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Es bleibt klärungsbedürftig, welche Proteinteilsequenzen
für die
Bildung von Acetaldehydprodukten in vivo wichtig sind und welche
Adduktstrukturen in dem Sinne immunogen sind, dass sie eine erhöhte IgA-Reaktivität aufgrund
hoher Alkoholaufnahme erzeugen.
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Aufgaben der
Erfindung
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Eine erste Aufgabe der Erfindung
liegt in der Bereitstellung synthetischer definierter und einfacher Acetaldehydaddukte,
die zur Bestimmung humaner IgA-Antikörper mit Spezifität für Acetaldehyd-Protein-Addukte
verwendet werden können,
die in vivo in Folge hoher Alkoholaufnahme bei Alkoholikern und schweren
Trinkern gebildet werden.
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Eine zweite Aufgabe ist die Minimierung
der Proben-IgA-Reaktivität
gegenüber
dem im Assay verwendeten unmodifizierten Antigen.
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Eine dritte Aufgabe liegt in der
Bereitstellung verbesserter Verfahren zur Diagnose hoher Alkoholaufnahme.
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Die Erfindung
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Wir haben nun gefunden, dass diese
Aufgaben gelöst
werden, wenn man ein Addukt zwischen Acetaldehyd und einem nativen
Protein durch ein Addukt zwischen Acetaldehyd und einem Fragment
eines nativen Proteins ersetzt.
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Demzufolge ist der Hauptgegenstand
der Erfindung ein nachstehend definiertes Immunoassay-Verfahren
zur Bestimmung von IgA-Antikörpern mit
Spezifität
für Acetaldehyd-Addukte
in Körperflüssigkeiten.
Das kennzeichnende Merkmal besteht darin, dass ein Addukt zwischen
Acetaldehyd und einem Fragment eines nativen Proteins als Antigen verwendet
wird.
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Die am besten geeigneten Proteine
sind Albumin und Hämoglobin,
d. h. die Proteine, die am häufigsten
in der in Betracht gezogenen Körperflüssigkeit
vorkommen. Fragmente humaner Proteins sind bevorzugt.
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Unter Fragment wird eine Teilsequenz
eines nativen Proteins/Polypeptids verstanden. Das Fragment kann
entweder durch Spaltung einer längeren Peptidkette
und anschließende
Isolierung bestimmter Fragmente oder durch direkte rekombinante
Herstellung oder chemische Peptidsynthese des gesuchten Fragments
erhalten werden. Beim gegenwärtigen
Wissensstand leiten sich die am meisten bevorzugten Fragmente von
aminoterminalen Enden nativer Proteine oder von lysinund/oder tyrosinhaltigen,
an der Oberfläche
exponierten Teilen nativer Proteine ab. Geeignete aminoterminale
Fragmente finden sich zum Beispiel in der β-Kette von Hämoglobin. Vgl. z. B. San George
und Haberman, J. Biol. Chem. 261(1986)6811– 6821 und Stevens et al.,
J. Clin. Invest. 67(1981)361–369.
Die Länge
der Fragmente kann von 5 Aminosäureresten
(wobei wenigstens ein Rest eine freie Aminogruppe zur Verfügung stellt,
die auch im nativen Protein vorliegt) aufwärts betragen. Typischerweise
umfassen die zu verwendenden Fragmente weniger als 50 %, z. B. weniger als
10%, der gesamten nativen Polypeptidkette. Im gegenwärtigen Stadium
ist es bevorzugt, Fragmente mit nativen Sequenzen von 5 bis 10 Aminosäureresten
zu verwenden.
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Die Fragmente können kovalent an analytisch
nachweisbare Gruppen oder Träger
gebunden sein, wie nachstehend beschrieben. Zwischen dem Fragment
und einem Nachweisstoff oder einem Träger können Spacergruppen eingeschoben
sein, um eine wirksame Antikörper-Bindungsaktivität des Fragments
zu bewahren. Beispiele für
Spacer sind vorzugsweise hydrophile Oligopeptide, die sich nicht vom
nativen Protein ableiten.
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Die Acetaldehyd-Addukte können durch
Umsetzung des Fragments mit Acetaldehyd unter geeigneten Bedingungen, üblicherweise
entweder reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen, synthetisiert
werden. Reduzierende Bedingungen führen zu Addukten, die Ethylaminogruppen
umfassen, während
nicht reduzierende Bedingungen zu Schiffbasen und gegebenenfalls
auch 2-Methylimidazolidin-4-on-Strukturen
führen.
Zu weiteren Details siehe den experimentellen Teil und frühere Arbeiten, bei
denen eine Adduktbildung erfolgte (Sillanaukee et al. (Eur. J. Biochem.
240(1996)30–36);
Sillanaukee et al. J. Lab. Clin. Med. 120(1992)42–47); Lin
et al (Alcohol. Clin. Exp. Res. 17(1993)882–886); Thiele et al. (Biochem.
Pharmacol. 48 (1994)183–189);
und Klassen et al. (Alcohol. Clin. Exp. Res. 18(1994)164–171), Lin
et al. (Alcohol. Clin. Exp. Res. 19(1995)314–319).
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Man kann herkömmliche antigenspezifische IgA-Immunonoassays
verwenden. Diese beruhen sämtlich
auf der Bildung eines ternären
immunkomplexes anti-IgA --- IgA ---
Antigen/Hapten worin
IgA der zu bestimmende Acetaldehyd-spezifische Antikörper in
der Probe ist und Antigen/Hapten dem vorstehend definierten Addukt
entspricht. Der Anti-IgA oder das Addukt können in unlöslicher oder nicht solubilisierbarer
Form verwendet werden, wie es fachüblich ist. Unlösliche Formen
bedingen, dass der IgA oder das Addukt stabil an einen Träger, wie eine
feste Phase, z. B. eine Röhrchenwand,
Vertiefung einer Mikrotiterplatte, einen monolithischen oder teilchenförmigen Träger usw.
stabil gebunden ist. Monolithische und teilchenförmige Träger sollten vorzugsweise hydrophil
und/oder porös
sein. Zur Bestimmung des ternären
Komplexes kann entweder der Anti-IgA oder das Addukt mit einer analytisch nachweisbaren
Gruppe, z. B. einem Isotop, einem Enzym, einem Enzymsubstrat, einem
Enzymcofaktor, einem Fuorophor, einem Chromophor, einer chemolumineszierenden
Gruppe, einem Teilchen, Biotin, Hapten usw., markiert sein. Ausführungsformen
von Immunoassays, die sich markierter Reaktanden in Verbindung mit
unlöslichen
oder nicht solubilisierbaren Immunreaktanden und einer Abtrennung
des an die unlöslichen
oder nicht solubilisierbaren Immunreaktanden gebundenen markierten
Reaktanden vom nicht an die unlöslichen
oder nicht solubilisierbaren Immunreaktanden gebundenen markierten
Reaktanden bedienen, werden oft als heterogene Assays bezeichnet.
Ein weiterer Typ von Immunoassays wird als homogene Assays bezeichnet
und umfasst meistens nur lösliche
Reaktanden ohne das Erfordernis der Abtrennung. Zum Nachweis der
Bildung des vorstehend angesprochenen ternären Komplexes eignen sich Nephelometrie-
oder Biosensor-Verfahren, wobei wahlweise unlösliche oder nicht solubilisierbare
oder markierte Reaktanden verwendet werden können.
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Die Bedingungen und die Reihenfolge
der Zugabe der verschiedenen Reaktanden sind im Prinzip die gleichen
wie bei den vorstehend angesprochenen herkömmlichen Assays, d. h. die
die IgA-Antikörper
der gesuchten Spezifität
enthaltende Probe wird mit Anti-IgA-Antikörper und einem Acetaldehyd-Addukt
eines Proteinfragments inkubiert, wobei sich der ternäre Komplex
bildet. Die gewählte
Menge jedes Reagenzes, die Reihenfolge der Zugabe, die Inkubationszeiten,
die Temperatur, der pH usw. werden so gewählt, damit sich der Komplex
in einer Menge bildet, die in Bezug zur Menge des Proben-IgA mit Spezifität für das Addukt
steht. Erfindungsgemäß bedeutet
dies, dass der Anti-IgA und das Addukt normalerweise im Überschuss
vorliegen sollen. Typische Reihenfolgen der Zugabe sind: Addukt,
Probe, Anti-IgA; Anti-IgA, Probe, Addukt; Probe, Anti-IgA, Addukt;
Addukt, Anti-IgA, Probe; Probe, Addukt, Anti-IgA; und Anti-IgA,
Addukt, Probe. Für
den Fall, dass entweder der Anti-IgA oder das Produkt unlöslich oder
nicht solubilisierbar ist, ist es möglich, den gebildeten Immunkomplex
in einem Schritt von überschüssigen Reagenzien
abzutrennen, bevor man die folgenden Reagenzien zusetzt. Die Verfahren
zur Abtrennung können
Waschschritte umfassen, um die in einem früheren Schritt verwendeten überschüssigen Komponenten
wirksam zu entfernen.
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Typische Reaktionszeiten für jeden
Inkubationsschritt bewegen sich oft im Bereich von einer bis mehreren
Minuten bis mehreren Stunden. Erforderlichenfalls können sogar
Inkubationen über
Nacht verwendet werden. Die genaue Zeit hängt von Faktoren, wie der Reaktivität/Affinität des Anti-IgA,
pH, Temperatur, und gegebenenfalls Art der Festphase ab. Im Fall
der Verwendung unlöslicher
Formen, wobei z. B. der Anti-IgA oder das Addukt an eine Festphase
gebunden ist, können
sehr kurze Inkubationszeiten in dem Fall erreicht werden, dass die
Festphase in poröser
Form vorliegt, die zur Absorption des vollständigen Volumens des Inkubierungsgemisches
in der Lage ist und Porengrößen aufweist,
die zur Verminderung der Diffusionszeiten an den Porenoberflächen optimiert
sind (siehe z. B.
US 4,708,932 (Pharmacia
AB)).
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Die Temperatur sollte im Bereich
von 0–40°C liegen,
wobei 15–40°C bevorzugt
sind. Der pH liegt normalerweise im Bereich von 3–11, wobei
4–10 bevorzugt
ist. Es ist kritisch, dass sowohl der pH als auch die Temperatur
so gewählt
werden, dass die Bedingungen für
die beteiligten Reaktanden nicht denaturierend sind.
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Die Körperflüssigkeitsprobe kann aus Speichel,
Blut, Serum oder Plasma oder einer beliebigen anderen Körperflüssigkeit
gewonnen werden, die adduktspezifische IgA-Antikörper enthalten kann.
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Ein Gegenstand der Erfindung ist
ein diagnostisches Verfahren, das sich eines Immunoassays bedient,
worin ein vorstehend definiertes Acetaldehyd-Addukt eines Proteinfragments
verwendet wird. Erhöhte
Konzentrationen an IgA-Titern (im Vergleich zur Konzentration für gesunde,
normale, nicht alkoholabhängige
Verbraucher) werden als Anzeichen hoher Alkoholaufnahme gewertet.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
ist ein Kit, der Anti-IgA-Antikörper
und ein vorstehend definiertes Acetaldehyd-Addukt eines Fragments
eines nativen Proteins enthält.
Der Anti-IgA-Antikörper und
das Addukt können
markiert, unlöslich
oder nicht solubilisiert sein, wie vorstehend beschrieben. Sie können in
löslicher
und/oder vordispergierter Form oder in trockener Form, z. B. lyophilisiert
oder sprühgetrocknet,
vorliegen und zur Rekonstitution im geeigneten Puffer für den beabsichtigen
Assay geeignet sein.
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Beste Ausführungsform
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Die beste Ausführungsform der Erfindung zum
Anmeldetag wird durch den experimentellen Teil verkörpert.
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EXPERIMENTELLER
TEIL
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Beispiel 1A: Synthese
des Acetaldehyd-Addukts eines Proteinfragments (die fünf ersten
Aminosäuren des
N-terminalen Endes von humanem Hämoglobin mit
Carboxy-terminierendem Cystein(VHLTPEC)).
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Das Peptid wurde synthetisiert wie
bereits beschrieben (Sillanaukee et al., Eur. J. Biochem. 249(1996)0–46). Man
löste das
Peptid in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in PBS pH 7,4. Zu 10
ml der Lösung
gab man dann 5 ml 250 mM Natriumcyanborhydrid (NaCNBH3)
in PBS. Man ließ das
Gemisch in einem dicht verschlossenen Behälter bei Zimmertemperatur 48
Stunden inkubieren. Die Peptidlösung kann
bei –20 – +4°C in Aliquoten
von 0,5 ml aufbewahrt werden.
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Beispiel 1B: Synthese
des Addukts mit Rinderserumalbumin
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Das Addukt wurde hergestellt, wie
bei Worrall et al., Alcoholism: Clin. Exp. Res. 20 (1996)836–840 beschrieben.
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Beispiel 1C: Synthese
des Addukts mit humanem Hämoglobin
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Das Addukt wurde hergestellt, wie
für Rinderserumalbumin
bei Worrall et al., Eur. J. Clin. Invest. 21(1991)90–95 beschrieben.
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Beispiel 2: Assay IgA-reaktiver
Antikörper
im Serum von Patienten und Kontrollpersonen
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Patienten: Man sammelte Seren nicht
alkoholabhängiger
Frauen und Männer
mit gut dokumentierten Trinkgewohnheiten, die sich einer freiwilligen Gesundheitsuntersuchung
unterzogen, und von Alkoholikern bei Einlieferung in ein Entgiftungszentrum in
Tampere, Finnland. Die Seren waren zuvor mittels ELISA mit Acetaldehydmodifiziertem
BSA als immobilisiertem Antigen analysiert worden (Worrall et al., Alcoholism:
Clin. Exp. Res. 20(1996)836–840).
Auf der Basis der ELISA-Ergebnisse wurden 10 Proben mit hoher Addukt-spezifischer
IgA-Reaktivität
(ASR) als positive Kontrollen und 10 Proben mit niedriger Addukt-spezifischer
IgA-Reaktivität
(ASR) wurden als negative Kontrollen ausgewählt.
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Ergebnisse: 1 stellt das Ergebnis von Beispiel 2A
(Peptid-Addukt) dar. 2 stellt
die Ergebnisse von Beispiel 2B (Hämoglobin-Addukt) dar, 3 stellt die Ergebnisse
von Beispiel 3B (Albumin-Addukt) dar.
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Beispiel 2 A: Assay-Protokoll – Peptid-Addukt:
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Vorbereitung der Mikrotiterplatten:
Man gab Aliquote von 100 μl
von modifiziertem bzw. nicht modifiziertem Peptid (50 μg/ml) in
Natriumbicarbonatpuffer pH 9,6 in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte und
ließ 1
Stunde bei Zimmertemperatur inkubieren. Die Vertiefungen wurden
dann viermal mit PBS-Tween gewaschen, worauf man in jede Vertiefung
200 μl Blockierlösung (1%
BSA in PBS, pH 7,4) einfüllte
und 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubierte, worauf die Vertiefungen
viermal mit PBS-Tween gewaschen wurden.
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Assay: Man gab 100 μl Patientenserum,
das 1: 20 verdünnt
worden war (10 Hühnerserum-PBS)
in jede Vertiefung und inkubierte 1 Stunde bei Zimmertemperatur
worauf die Vertiefungen viermal mit PBS-Tween gewaschen wurden.
Man gab in jede Vertiefung 100 μl β-Galaktosidase-Fab-anti-IgA-Antikörper-Konjugat
(2,64 μg/ml),
inkubierte 1 Stunde bei 37°C
und wusch viermal mit PBS-Tween. Dann gab man 100 μl O-Nitrophenol-β-galaktosid
in jede Vertiefung und ließ 1
Stunde bei 37°C
inkubieren. Man setzte 100 μl
Stopplösung
zu und bestimmte das Absorptionsvermögen (405 nm).
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Die Ergebnisse sind in den 1a bis c dargestellt. 1a zeigt die Ergebnisse
mit nicht modifiziertem Peptid, 1b das
Ergebnis mit modifiziertem Peptid (AA) und 1c das Ergebnis für den Fall, dass das Absorptionsvermögen für das nicht modifizierte
Peptid vom Absorptionsvermögen
für das
modifizierte Peptid abgezogen wird (adduktspezifische Reaktivität = ASR).
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Beispiel 2B: Assay-Protokoll – Hämoglobin-Addukt
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Das Protokoll entspricht dem für das Peptid-Addukt,
außer
dass man das Peptidantigen durch das entsprechende Addukt von Hämoblobin
ersetzte (Beispiel 1c). Die Ergebnisse sind in 2a bis c dargestellt.
Jede der 2a bis c entspricht der entsprechenden 1a bis c.
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Beispiel 2C: Assay-Protokoll – Albumin-Addukt
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Das Protokoll entspricht dem des
Peptid-Addukts, außer
dass man das Peptid-Antigen
durch das entsprechende Addukt von Rinderserumalbumin (Beispiel
1B) ersetzte. Die Ergebnisse sind in 3a bis c dargestellt. Jede der 3a bis c entspricht
der entsprechenden 1a bis c.
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Schlussfolgerungen
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Die Ergebnisse zeigen, dass die Addukte von
Proteinfragmenten denen von Proteinaddukten überlegen sind. Erstens konnte
die unspezifische Bindung an das Trägerprotein, die man beim Hämoglobin-Acetaldehyd-Addukt
beobachten konnte, unter Verwendung eines Peptidaddukts vermieden
werden. Zweitens zeigte das Peptidaddukt eine verstärkte Empfindlichkeit
und Spezifität
im Vergleich zu dem BSA-Addukt. Drittens könnte die Tatsache, dass Alkoholiker
und Kontrollen keinen signifikanten Reaktivitätsunterschied gegenüber unmodifiziertem
Peptid zeigten, die alleinige Verwendung der AA-Werte ermöglichen.