JP3357743B2 - ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット - Google Patents
ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキットInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビールにおける混濁の
原因物質のひとつであるＨａｚｅ蛋白を、Ｈａｚｅ蛋白
に特異的な抗体を用いて特異的に測定することにより、
ビールの混濁安定性を測定する方法および該方法に使用
するキットに関する。
原因物質のひとつであるＨａｚｅ蛋白を、Ｈａｚｅ蛋白
に特異的な抗体を用いて特異的に測定することにより、
ビールの混濁安定性を測定する方法および該方法に使用
するキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ビールは麦芽を主原料として糖化によっ
て麦汁を得、この麦汁を酵母を用いて主発酵を行い、次
いで若ビールを後発酵（貯酒）工程に付し、濾過、ビン
詰め工程を経て製造されている。
て麦汁を得、この麦汁を酵母を用いて主発酵を行い、次
いで若ビールを後発酵（貯酒）工程に付し、濾過、ビン
詰め工程を経て製造されている。
【０００３】このようにして製造されているビールは、
製造されてから消費されるまでの間に濁りを生じないよ
うな、いわゆる「混濁安定性」がビールの品質上きわめ
て重要な項目である。
製造されてから消費されるまでの間に濁りを生じないよ
うな、いわゆる「混濁安定性」がビールの品質上きわめ
て重要な項目である。
【０００４】ビール混濁の原因は、微生物の混入に起因
する生物学的混濁と、ビールの成分自体の変性による混
濁、つまり蛋白質成分とポリフェノールの会合によって
生じるＨａｚｅ蛋白と総称される蛋白質成分（K. Asano
et al., ASBC Journal 40:147-154, 1982；J.A.Delcou
r et al., MBAA Technical Quarterly, 25:62-66, 198
8）の生成による非生物学的混濁の２つに大別出来る。
一般に、普通に生じうる混濁とは、この非生物学的混濁
である。
する生物学的混濁と、ビールの成分自体の変性による混
濁、つまり蛋白質成分とポリフェノールの会合によって
生じるＨａｚｅ蛋白と総称される蛋白質成分（K. Asano
et al., ASBC Journal 40:147-154, 1982；J.A.Delcou
r et al., MBAA Technical Quarterly, 25:62-66, 198
8）の生成による非生物学的混濁の２つに大別出来る。
一般に、普通に生じうる混濁とは、この非生物学的混濁
である。
【０００５】従来、ビールの混濁安定性を評価する場合
には、強制劣化試験を実施したり、実際に２０℃で長期
保存して混濁安定度を測定し、評価を行なってきた。例
えば、後述する方法によって、試料の全混濁度を１週間
ごとに測定し、全混濁度の週ごとの測定値をグラフに描
き、全混濁度が１００Ｈｅｌｍとなる週を読み取り、こ
れをＦＴテスト値とする。そしてこのＦＴテスト値から
換算式を用いて混濁安定度を予測していた。しかしなが
ら、これらの方法では結果判定までに数日から数十週間
を必要とし、多大な労力と時間を必要とした。
には、強制劣化試験を実施したり、実際に２０℃で長期
保存して混濁安定度を測定し、評価を行なってきた。例
えば、後述する方法によって、試料の全混濁度を１週間
ごとに測定し、全混濁度の週ごとの測定値をグラフに描
き、全混濁度が１００Ｈｅｌｍとなる週を読み取り、こ
れをＦＴテスト値とする。そしてこのＦＴテスト値から
換算式を用いて混濁安定度を予測していた。しかしなが
ら、これらの方法では結果判定までに数日から数十週間
を必要とし、多大な労力と時間を必要とした。
【０００６】また、従来の方法ではＨａｚｅ蛋白のみを
特異的に測定する方法がないために、Ｈａｚｅ蛋白によ
る混濁とその他の生物学的混濁とを区別して測定するこ
とができなかった。そのため、迅速かつ正確に混濁安定
性を予測する方法が色々試みられてきた（European Bre
wery Convention、Analytica-EBC、第４版、1987等参照）
が、いずれもＨａｚｅ蛋白を簡単かつ特異的に定量する
ことはできず、満足する結果は得られなかった。
特異的に測定する方法がないために、Ｈａｚｅ蛋白によ
る混濁とその他の生物学的混濁とを区別して測定するこ
とができなかった。そのため、迅速かつ正確に混濁安定
性を予測する方法が色々試みられてきた（European Bre
wery Convention、Analytica-EBC、第４版、1987等参照）
が、いずれもＨａｚｅ蛋白を簡単かつ特異的に定量する
ことはできず、満足する結果は得られなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】そこで、ビール最終製
品及びビール製造工程におけるビール試料の混濁安定
性、更には製造過程で用いられているビール安定化剤の
評価を迅速かつ正確に測定する方法の開発が望まれてい
た。本発明は、ビールにおける混濁の原因物質のひとつ
であるＨａｚｅ蛋白を、免疫学的手法を応用して特異的
に定量し、迅速かつ正確にビールの混濁安定性を測定す
る方法を提供することを目的とする。さらに本発明は該
方法に使用するキットを提供することを目的とする。
品及びビール製造工程におけるビール試料の混濁安定
性、更には製造過程で用いられているビール安定化剤の
評価を迅速かつ正確に測定する方法の開発が望まれてい
た。本発明は、ビールにおける混濁の原因物質のひとつ
であるＨａｚｅ蛋白を、免疫学的手法を応用して特異的
に定量し、迅速かつ正確にビールの混濁安定性を測定す
る方法を提供することを目的とする。さらに本発明は該
方法に使用するキットを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、Ｈａｚｅ蛋白
を抗原とし、該抗原から得られる抗体を用いる免疫学的
測定法によって、ビールの最終製品及びビールの製造工
程におけるビール試料中のＨａｚｅ蛋白含有量を測定す
ることからなる、ビールの混濁安定性を測定する方法を
提供する。
を抗原とし、該抗原から得られる抗体を用いる免疫学的
測定法によって、ビールの最終製品及びビールの製造工
程におけるビール試料中のＨａｚｅ蛋白含有量を測定す
ることからなる、ビールの混濁安定性を測定する方法を
提供する。
【０００９】本発明の測定方法において抗原として使用
するＨａｚｅ蛋白は、常法に従い市販のビールを氷冷保
存してＨａｚｅ蛋白を生成させ、これを濾過することに
より得られる。得られたＨａｚｅ蛋白はＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動および等電点電気泳動により、分
子量は約４００００、等電点は４．０〜５．０の領域に
分布していることが判った。
するＨａｚｅ蛋白は、常法に従い市販のビールを氷冷保
存してＨａｚｅ蛋白を生成させ、これを濾過することに
より得られる。得られたＨａｚｅ蛋白はＳＤＳ−ポリア
クリルアミド電気泳動および等電点電気泳動により、分
子量は約４００００、等電点は４．０〜５．０の領域に
分布していることが判った。
【００１０】また、Ｈａｚｅ蛋白に特異的な抗体の作成
にあたっては、常法（新生化学実験講座１、タンパク質
Ｉ、p389-397、1992参照）に従い、抗原（Ｈａｚｅ蛋
白）を動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取す
ることにより得ることができる。なお、本発明において
得られたポリクローナル抗体の力価は１００００ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｇであった。
にあたっては、常法（新生化学実験講座１、タンパク質
Ｉ、p389-397、1992参照）に従い、抗原（Ｈａｚｅ蛋
白）を動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取す
ることにより得ることができる。なお、本発明において
得られたポリクローナル抗体の力価は１００００ｕｎｉ
ｔｓ／ｍｇであった。
【００１１】ビール最終製品及びビール製造工程におけ
るビール試料中に含まれるＨａｚｅ蛋白をこのようにし
て得られた抗体を用いて免疫学的測定法によって測定す
る。
るビール試料中に含まれるＨａｚｅ蛋白をこのようにし
て得られた抗体を用いて免疫学的測定法によって測定す
る。
【００１２】本発明で用いる免疫学的測定法としては、
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎ
ｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）に代表されるエンザイ
ムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫蛍
光法、免疫比濁法などを含むが、特にＥＬＩＳＡ法が好
ましい。ＥＬＩＳＡ法としては酵素標識抗体を用いる標
準ＥＬＩＳＡ法を用いることができるが、特にアビジン
・ビオチンを用いる固相法によるＥＬＩＳＡ法（蛋白質
核酸 酵素、別冊No.31, p.13-26, 1987 参照）が好
ましい。このとき標識酵素としてはアビジン結合アルカ
リフォスファターゼを用い、第二抗体としてはビオチン
化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを用いる。
ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎ
ｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）に代表されるエンザイ
ムイムノアッセイ法、ラジオイムノアッセイ法、免疫蛍
光法、免疫比濁法などを含むが、特にＥＬＩＳＡ法が好
ましい。ＥＬＩＳＡ法としては酵素標識抗体を用いる標
準ＥＬＩＳＡ法を用いることができるが、特にアビジン
・ビオチンを用いる固相法によるＥＬＩＳＡ法（蛋白質
核酸 酵素、別冊No.31, p.13-26, 1987 参照）が好
ましい。このとき標識酵素としてはアビジン結合アルカ
リフォスファターゼを用い、第二抗体としてはビオチン
化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンを用いる。
【００１３】本発明によるビールの混濁安定度を測定す
る方法を以下に説明する。まず、試料吸着用緩衝液を用
いて、目的とする抗原（ビール試料）をマイクロプレー
トに分注してインキュベートし、上清を除去した後、洗
浄液を用いて洗浄する。同様に、ブロッキング溶液、抗
体、第二抗体、標識酵素の順に分注、インキュベート、
洗浄を繰り返す。最後に、基質溶液を分注し、室温で保
持した後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、別途Ｈ
ａｚｅ蛋白の標準希釈系列から作成した検量線を用いる
ことにより、ビール試料に含まれるＨａｚｅ蛋白の濃度
を算定することができる。
る方法を以下に説明する。まず、試料吸着用緩衝液を用
いて、目的とする抗原（ビール試料）をマイクロプレー
トに分注してインキュベートし、上清を除去した後、洗
浄液を用いて洗浄する。同様に、ブロッキング溶液、抗
体、第二抗体、標識酵素の順に分注、インキュベート、
洗浄を繰り返す。最後に、基質溶液を分注し、室温で保
持した後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、別途Ｈ
ａｚｅ蛋白の標準希釈系列から作成した検量線を用いる
ことにより、ビール試料に含まれるＨａｚｅ蛋白の濃度
を算定することができる。
【００１４】試料吸着用緩衝液としては、例えば、ウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンあるいはオボアル
ブミンを含むＰＢＳ（−）緩衝液等を使用できる。洗浄
液としては、例えば、ＮａＮ3およびＴｗｅｅｎ−２０
を含むＰＢＳ（−）緩衝液、ＮａＣｌおよびＴｗｅｅｎ
−２０を含むトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）等を使
用できる。また、ブロッキング溶液としては、例えば、
１〜３％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）緩衝液、１〜５％ス
キムミルクを含むＰＢＳ（−）緩衝液等を使用できる。
抗体は、ブロッキング用の溶液で０．０１〜１．０μｇ
／ｍｌに希釈して使用することができる。第二抗体の標
識酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、酸性フォ
スファターゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ等を用いる。また、基質溶液としては、例え
ば、標識酵素がアルカリフォスファターゼの場合にはｐ
−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（ＰＮＰＰ）
を、β−ガラクトシダーゼの場合にはｏ−ニトロフェニ
ルβ−ガラクトシダーゼ等、標識酵素に合わせて適宜選
択し、使用することができる。
血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチンあるいはオボアル
ブミンを含むＰＢＳ（−）緩衝液等を使用できる。洗浄
液としては、例えば、ＮａＮ3およびＴｗｅｅｎ−２０
を含むＰＢＳ（−）緩衝液、ＮａＣｌおよびＴｗｅｅｎ
−２０を含むトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）等を使
用できる。また、ブロッキング溶液としては、例えば、
１〜３％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）緩衝液、１〜５％ス
キムミルクを含むＰＢＳ（−）緩衝液等を使用できる。
抗体は、ブロッキング用の溶液で０．０１〜１．０μｇ
／ｍｌに希釈して使用することができる。第二抗体の標
識酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ、酸性フォ
スファターゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ等を用いる。また、基質溶液としては、例え
ば、標識酵素がアルカリフォスファターゼの場合にはｐ
−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム塩（ＰＮＰＰ）
を、β−ガラクトシダーゼの場合にはｏ−ニトロフェニ
ルβ−ガラクトシダーゼ等、標識酵素に合わせて適宜選
択し、使用することができる。
【００１５】このようにしてビール最終製品及びビール
の製造工程におけるビール試料中のＨａｚｅ蛋白含有量
を測定することにより、ビールの混濁安定性を評価する
ことができる。また、ビールの製造工程においては混濁
を防止して品質を保持するために各種安定化剤を加える
が、本発明の測定法はこのような安定化剤の効力判定等
にも利用することができる。
の製造工程におけるビール試料中のＨａｚｅ蛋白含有量
を測定することにより、ビールの混濁安定性を評価する
ことができる。また、ビールの製造工程においては混濁
を防止して品質を保持するために各種安定化剤を加える
が、本発明の測定法はこのような安定化剤の効力判定等
にも利用することができる。
【００１６】さらに、本発明は該方法に使用するキット
を提供する。本発明のキットには、Ｈａｚｅ蛋白を抗原
として得られた抗体を含む。抗体は上記の希釈液中に希
釈された抗体希釈液、あるいは抗体凍結乾燥品の形であ
りうる。本発明のキットには、該抗体の他に、９６ウェ
ルプレート、試料吸着用緩衝液、洗浄液、ブロッキング
溶液、基質溶液、第二抗体希釈液ならびに検量線グラフ
などを含む。
を提供する。本発明のキットには、Ｈａｚｅ蛋白を抗原
として得られた抗体を含む。抗体は上記の希釈液中に希
釈された抗体希釈液、あるいは抗体凍結乾燥品の形であ
りうる。本発明のキットには、該抗体の他に、９６ウェ
ルプレート、試料吸着用緩衝液、洗浄液、ブロッキング
溶液、基質溶液、第二抗体希釈液ならびに検量線グラフ
などを含む。
【００１７】
【実施例】次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。
する。
【００１８】実施例１ Ｈａｚｅ蛋白の調製 室温にて約１年間保管した市販のビール最終製品（サン
トリー（株）社製）を、０℃で３日間氷冷保存してＨａ
ｚｅ蛋白を生成させる。このＨａｚｅ蛋白を生成したビ
ールをさらに氷冷しながら、脱ガスを行う。脱ガスした
ビールをポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ
ー（Cellulose Nitrate,Advantec Toyo社製）を用いて
濾過して、Ｈａｚｅ蛋白粗生成物を得る。このＨａｚｅ
蛋白粗生成物を氷冷した４％エタノール水溶液で洗浄す
ることにより、Ｈａｚｅ蛋白が得られる。
トリー（株）社製）を、０℃で３日間氷冷保存してＨａ
ｚｅ蛋白を生成させる。このＨａｚｅ蛋白を生成したビ
ールをさらに氷冷しながら、脱ガスを行う。脱ガスした
ビールをポアサイズ０．４５μｍのメンブランフィルタ
ー（Cellulose Nitrate,Advantec Toyo社製）を用いて
濾過して、Ｈａｚｅ蛋白粗生成物を得る。このＨａｚｅ
蛋白粗生成物を氷冷した４％エタノール水溶液で洗浄す
ることにより、Ｈａｚｅ蛋白が得られる。
【００１９】実施例２ ポリクローナル抗体の作成 実施例１で得られたＨａｚｅ蛋白を蒸留水で懸濁し、生
理食塩液（０．９ｗ／ｗ％ＮａＣｌ水溶液）を用いて適
当な蛋白質濃度（１ｍｇ／ｍｌ）に調製する。これを完
全フロイントアジュバントと容量３：２の比率で混合し
て油中水型乳剤を作成する。日本白色家兎（ＳＰＦ（sp
ecial pathogen free）、１２週齢、雌）２匹に初回免
疫として抗原０．５ｍｇ／rabbit相当量を足蹠及び側腹
部皮下にそれぞれ注射する。追加免疫は、不完全フロイ
ントアジュバントを用いて同様に乳剤を作成して抗原
０．２５ｍｇ／rabbit相当量を家兎の背部皮下に数カ所
に分けて注射する。追加免疫は、１週間から１０日間の
間隔で３回実施する。最終免疫の約１０日後に耳動脈又
は頚動脈から無菌的に全採血を行い、遠心分離機にかけ
て血漿を分離する。
理食塩液（０．９ｗ／ｗ％ＮａＣｌ水溶液）を用いて適
当な蛋白質濃度（１ｍｇ／ｍｌ）に調製する。これを完
全フロイントアジュバントと容量３：２の比率で混合し
て油中水型乳剤を作成する。日本白色家兎（ＳＰＦ（sp
ecial pathogen free）、１２週齢、雌）２匹に初回免
疫として抗原０．５ｍｇ／rabbit相当量を足蹠及び側腹
部皮下にそれぞれ注射する。追加免疫は、不完全フロイ
ントアジュバントを用いて同様に乳剤を作成して抗原
０．２５ｍｇ／rabbit相当量を家兎の背部皮下に数カ所
に分けて注射する。追加免疫は、１週間から１０日間の
間隔で３回実施する。最終免疫の約１０日後に耳動脈又
は頚動脈から無菌的に全採血を行い、遠心分離機にかけ
て血漿を分離する。
【００２０】次に、得られた血漿を温浴中で５６℃、３
０分間加熱処理し、２〜１５℃で血漿に０．０１Ｍ Ｐ
ＢＳ（−）緩衝液（０．１％ＮａＮ3を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４）を等容量加えて
希釈する。そこへ、予めアンモニア水で調製した飽和硫
酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７．４）を希釈液と等容量
加える。これを高速冷却遠心機に掛けた後（４℃、３０
分間、14000rpm；1000×Ｇ）、上清を除去する。沈渣に
生理食塩液を加えて完全に溶解させてから、透析又はSe
phadex G25M カラムに掛けて残存する硫酸アンモニウム
を除去する。硫酸アンモニウムの除去の確認は、ネスラ
ー試薬（ナカライテスク社製）を用いて行う。
０分間加熱処理し、２〜１５℃で血漿に０．０１Ｍ Ｐ
ＢＳ（−）緩衝液（０．１％ＮａＮ3を含む０．０１Ｍ
リン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．４）を等容量加えて
希釈する。そこへ、予めアンモニア水で調製した飽和硫
酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７．４）を希釈液と等容量
加える。これを高速冷却遠心機に掛けた後（４℃、３０
分間、14000rpm；1000×Ｇ）、上清を除去する。沈渣に
生理食塩液を加えて完全に溶解させてから、透析又はSe
phadex G25M カラムに掛けて残存する硫酸アンモニウム
を除去する。硫酸アンモニウムの除去の確認は、ネスラ
ー試薬（ナカライテスク社製）を用いて行う。
【００２１】次に、冷却した清透化剤（Friegen,Behrin
gwerke;trichlorotrifluoroethane）を用いて透析内液
と等量の清透化剤を混合し、振盪後遠心し、内液層を分
取する。この脱脂操作を３回繰り返し、ＩｇＧ粗画分
（ポリクローナル抗体画分）を得る。
gwerke;trichlorotrifluoroethane）を用いて透析内液
と等量の清透化剤を混合し、振盪後遠心し、内液層を分
取する。この脱脂操作を３回繰り返し、ＩｇＧ粗画分
（ポリクローナル抗体画分）を得る。
【００２２】実施例３ 酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ
法）によるビール試料中のＨａｚｅ蛋白の定量 実施例２で得られたポリクローナル抗体をアビジン・ビ
オチンを用いた固相法によるＥＬＩＳＡ法に応用し（蛋
白質 核酸 酵素、別冊Ｎｏ．３１、Ｐ１３−２６、１
９８７参照）、ビールに含まれるＨａｚｅ蛋白の定量を
行なう。
法）によるビール試料中のＨａｚｅ蛋白の定量 実施例２で得られたポリクローナル抗体をアビジン・ビ
オチンを用いた固相法によるＥＬＩＳＡ法に応用し（蛋
白質 核酸 酵素、別冊Ｎｏ．３１、Ｐ１３−２６、１
９８７参照）、ビールに含まれるＨａｚｅ蛋白の定量を
行なう。
【００２３】まず、試料吸着用緩衝液（ＢＳＡを含むＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（−）緩衝液）を用いて、
ビール試料を９６ウェルマイクロプレートに分注して３
７℃で１時間インキュベートする。別途、Ｈａｚｅ蛋白
の検量線を作成する目的で、Ｈａｚｅ蛋白の標準希釈系
列を作成して上記と同様に試料吸着用緩衝液を用いて９
６ウェルマイクロプレートに分注してインキュベートす
る。
ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（−）緩衝液）を用いて、
ビール試料を９６ウェルマイクロプレートに分注して３
７℃で１時間インキュベートする。別途、Ｈａｚｅ蛋白
の検量線を作成する目的で、Ｈａｚｅ蛋白の標準希釈系
列を作成して上記と同様に試料吸着用緩衝液を用いて９
６ウェルマイクロプレートに分注してインキュベートす
る。
【００２４】次に、この標準希釈系列及びビール試料の
上清を除去し、洗浄液（ＮａＮ3及びＴｗｅｅｎ−２０
を含む０．０１〜０．１Ｍ ＰＢＳ（−）緩衝液）を用
いて３回洗浄した後、ブロッキング溶液（ＢＳＡ及びＮ
ａＮ3を含む０．０１〜０．１Ｍ ＰＢＳ（−）緩衝
液、ｐＨ７．５〜８．５）を２００μl/wellずつ分注し
て、３７℃で３０分間インキュベートする。
上清を除去し、洗浄液（ＮａＮ3及びＴｗｅｅｎ−２０
を含む０．０１〜０．１Ｍ ＰＢＳ（−）緩衝液）を用
いて３回洗浄した後、ブロッキング溶液（ＢＳＡ及びＮ
ａＮ3を含む０．０１〜０．１Ｍ ＰＢＳ（−）緩衝
液、ｐＨ７．５〜８．５）を２００μl/wellずつ分注し
て、３７℃で３０分間インキュベートする。
【００２５】一方、希釈液（０．０５〜０．５％ＢＳＡ
及び０．０５〜０．１％ＮａＮ3を含む０．０１〜０．
１ＭＰＢＳ（−）緩衝液、ｐＨ７．５〜８．５）を用い
て実施例２で得られたポリクローナル抗体を希釈する
（抗体希釈液）。
及び０．０５〜０．１％ＮａＮ3を含む０．０１〜０．
１ＭＰＢＳ（−）緩衝液、ｐＨ７．５〜８．５）を用い
て実施例２で得られたポリクローナル抗体を希釈する
（抗体希釈液）。
【００２６】上記のマイクロプレートを洗浄液で３回洗
浄後、抗体希釈液を１００μl/wellずつ分注し、３７℃
で１時間インキュベートする。
浄後、抗体希釈液を１００μl/wellずつ分注し、３７℃
で１時間インキュベートする。
【００２７】これを洗浄液で３回洗浄して、第二抗体と
してビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（1000倍希
釈、Amersham社製）を１００μl/wellずつ分注し、３７
℃で１時間インキュベートする。
してビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン（1000倍希
釈、Amersham社製）を１００μl/wellずつ分注し、３７
℃で１時間インキュベートする。
【００２８】更に、これを同様に洗浄液で３回洗浄し
て、アビジン結合アルカリフォスファターゼ（1000倍希
釈、Dakopatts社製）を１００μl/wellずつ分注し、３
７℃で３０分間インキュベートする。
て、アビジン結合アルカリフォスファターゼ（1000倍希
釈、Dakopatts社製）を１００μl/wellずつ分注し、３
７℃で３０分間インキュベートする。
【００２９】続いて、このプレートをさらに洗浄液で３
回洗浄して、基質溶液（ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナ
トリウム塩（ＰＮＰＰ）をＭｇＣｌ2を含むジエタノー
ルアミン溶液（ｐＨ９．０〜９．５）で希釈したもの）
を１００μl/wellずつ分注し、室温もしくは３７℃で１
０〜１５分間保持した後、自動吸光度測定機を用いて４
０５ｎｍにおける吸光度を測定する。
回洗浄して、基質溶液（ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナ
トリウム塩（ＰＮＰＰ）をＭｇＣｌ2を含むジエタノー
ルアミン溶液（ｐＨ９．０〜９．５）で希釈したもの）
を１００μl/wellずつ分注し、室温もしくは３７℃で１
０〜１５分間保持した後、自動吸光度測定機を用いて４
０５ｎｍにおける吸光度を測定する。
【００３０】標準希釈系列の吸光度測定値をプロット
し、Ｈａｚｅ蛋白の検量線を作成する（図１）。この検
量線を用いることにより、各々のビール試料に含まれる
Ｈａｚｅ蛋白の濃度を算定することができる。
し、Ｈａｚｅ蛋白の検量線を作成する（図１）。この検
量線を用いることにより、各々のビール試料に含まれる
Ｈａｚｅ蛋白の濃度を算定することができる。
【００３１】実施例４ ポリクローナル抗体の吸収実験 次に、Ｈａｚｅ蛋白特異抗体の吸収試験を行い、ＥＬＩ
ＳＡ法における結果が、抗原抗体反応に起因するものか
どうか検証する。
ＳＡ法における結果が、抗原抗体反応に起因するものか
どうか検証する。
【００３２】まず、陽性対照試料としてのパパイン溶液
およびＨａｚｅ蛋白溶液の希釈系列（１０．５〜０．０
１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ作成する。希釈液は、０．１
％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）緩衝液を用いる。なお、対
照陰性試料として希釈液を用いる。
およびＨａｚｅ蛋白溶液の希釈系列（１０．５〜０．０
１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ作成する。希釈液は、０．１
％ＢＳＡを含むＰＢＳ（−）緩衝液を用いる。なお、対
照陰性試料として希釈液を用いる。
【００３３】次に、実施例２で得られたポリクローナル
抗体画分の５０００倍希釈液を作成する（０．２μｇ／
ｍｌ）。
抗体画分の５０００倍希釈液を作成する（０．２μｇ／
ｍｌ）。
【００３４】上記の各抗原希釈液とポリクローナル抗体
希釈液を等量混合する。反応は３７℃で１時間行う。
希釈液を等量混合する。反応は３７℃で１時間行う。
【００３５】次にＨａｚｅ蛋白溶液（１０μｇ／ｍｌ）
を吸着させた９６ウェルマイクロプレートに、上記条件
で反応させた混合液を分注し、実施例３に準拠して、反
応した抗体をＥＬＩＳＡ法にて検出し、４０５ｎｍにお
ける吸光度を測定する。結果を図２に示す。
を吸着させた９６ウェルマイクロプレートに、上記条件
で反応させた混合液を分注し、実施例３に準拠して、反
応した抗体をＥＬＩＳＡ法にて検出し、４０５ｎｍにお
ける吸光度を測定する。結果を図２に示す。
【００３６】希釈濃度に拘らず、パパイン溶液のＯＤ挙
動はコントロールと一致し、ほぼ一定の値となった。一
方Ｈａｚｅ抗原を用いたテスト群は、希釈系列の低い方
から高い方に移るに従い明らかに吸光度が上昇し、この
ポリクローナル抗体画分との間に抗原抗体反応があるこ
とがわかった。
動はコントロールと一致し、ほぼ一定の値となった。一
方Ｈａｚｅ抗原を用いたテスト群は、希釈系列の低い方
から高い方に移るに従い明らかに吸光度が上昇し、この
ポリクローナル抗体画分との間に抗原抗体反応があるこ
とがわかった。
【００３７】実施例５ 各種安定化剤の評価（１） 同一の醸造条件によって作成したビールを、各種安定化
剤を用いて処理し、得られたビールについて従来から実
施されている混濁安定性予測法（参考例１参照）と本発
明のＥＬＩＳＡ法による測定を行ない、比較した。ただ
し、従来の混濁安定性予測法においては全混濁度が１０
０Ｈｅｌｍを越える週まで測定を行ない、１００Ｈｅｌ
ｍの時の週を読み取り、ＦＴテスト値とし、このＦＴテ
スト値から換算値を用いて混濁安定度を予測するが、今
回は２週目まで測定し、ＥＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋
白濃度との比較を行なった。
剤を用いて処理し、得られたビールについて従来から実
施されている混濁安定性予測法（参考例１参照）と本発
明のＥＬＩＳＡ法による測定を行ない、比較した。ただ
し、従来の混濁安定性予測法においては全混濁度が１０
０Ｈｅｌｍを越える週まで測定を行ない、１００Ｈｅｌ
ｍの時の週を読み取り、ＦＴテスト値とし、このＦＴテ
スト値から換算値を用いて混濁安定度を予測するが、今
回は２週目まで測定し、ＥＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋
白濃度との比較を行なった。
【００３８】貯酒終了もろみをパイロットタンクに受
け、ここに６種類の通常用いられている安定化剤（Ａ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）を一定量添加し、０℃で１５分間
撹拌した。撹拌終了後、濾紙濾過し、炭酸ガスを調整後
瓶詰した。これを分析用試料とし、使用した。
け、ここに６種類の通常用いられている安定化剤（Ａ、
Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）を一定量添加し、０℃で１５分間
撹拌した。撹拌終了後、濾紙濾過し、炭酸ガスを調整後
瓶詰した。これを分析用試料とし、使用した。
【００３９】結果を以下の表１に示す。
【００４０】 表１安定化剤 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ 免疫学的定量 ELIZA(mg/100ml) 3.76 3.57 7.14 3.45 8.62 4.81 混濁度安定性試験 FT 1 week (helm) 33 31 45 25 53 29 FT 2 week (helm) 34 35 52 27 77 41 上記試験で得た各安定化剤を添加した試料についてのＥ
ＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋白の量を横軸に、混濁度安
定性試験で得たＨｅｌｍ値を縦軸に示したものが図３で
ある。本発明のＥＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋白濃度と
ＦＴ１週目、２週目の相関係数は、それぞれ０．９５
０、０．９６４となり、非常に高い相関があることが確
認された。
ＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋白の量を横軸に、混濁度安
定性試験で得たＨｅｌｍ値を縦軸に示したものが図３で
ある。本発明のＥＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋白濃度と
ＦＴ１週目、２週目の相関係数は、それぞれ０．９５
０、０．９６４となり、非常に高い相関があることが確
認された。
【００４１】実施例６ 各種安定化剤の評価（２） 実際に２０℃で１年間保存したビール試料を用いて参考
例１に記載の方法によって永久混濁度を測定し、実施例
５で測定した本発明のＥＬＩＳＡ法と比較した。
例１に記載の方法によって永久混濁度を測定し、実施例
５で測定した本発明のＥＬＩＳＡ法と比較した。
【００４２】結果を以下の表２に示す。
【００４３】 表２安定化剤 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ 免疫学的定量 ELIZA(mg/100ml) 3.76 3.57 7.14 3.45 8.62 4.81 永久混濁度P-Haze (helm) 26 26 54 29 66 42 上記試験で得た永久混濁度とＥＬＩＳＡ法による測定の
結果を図４に示す。永久混濁度とＥＬＩＳＡ法によるＨ
ａｚｅ蛋白濃度間の相関係数は、０．９８５となり、良
好な相関性が確認された。
結果を図４に示す。永久混濁度とＥＬＩＳＡ法によるＨ
ａｚｅ蛋白濃度間の相関係数は、０．９８５となり、良
好な相関性が確認された。
【００４４】実施例７ 各種安定化剤の評価（３） 従来行なわれている２種類の蛋白定量法（窒素定量法
（参考例２）、蛋白定量法（参考例３）参照）と実施例
５で測定したＥＬＩＳＡ法について比較を行なった。分
析用試料は、実施例５と同様にして作成した。
（参考例２）、蛋白定量法（参考例３）参照）と実施例
５で測定したＥＬＩＳＡ法について比較を行なった。分
析用試料は、実施例５と同様にして作成した。
【００４５】結果を以下の表３に示す。
【００４６】 表３安定化剤 Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ Ｆ 免疫学的定量 ELIZA(mg/100ml) 3.76 3.57 7.14 3.45 8.62 4.81 窒素定量法T-N法 (mg/100ml) 79.5 78.7 79.8 79.1 80.9 80.9 蛋白定量法MgSO4-N法 (mg/100ml) 18.3 16.1 16.9 17.6 17.5 18.2 上記試験で得たＥＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋白の量を
横軸に、窒素定量法（Ｔ−Ｎ法）および蛋白定量法（Ｍ
ｇＳＯ4−Ｎ法）による窒素含量を縦軸に示したものが
図５である。従来の２種類の窒素定量法は、いずれの場
合もＥＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋白濃度との相関性は
認められず、これらの方法ではＨａｚｅ蛋白だけを特異
的に測定することはできないことを示している。
横軸に、窒素定量法（Ｔ−Ｎ法）および蛋白定量法（Ｍ
ｇＳＯ4−Ｎ法）による窒素含量を縦軸に示したものが
図５である。従来の２種類の窒素定量法は、いずれの場
合もＥＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋白濃度との相関性は
認められず、これらの方法ではＨａｚｅ蛋白だけを特異
的に測定することはできないことを示している。
【００４７】参考例１ 混濁安定性予測法 （１）全混濁度（Ｔ−Ｈａｚｅ）の測定方法 試料を０℃の恒温水槽に入れて４８時間保持する。試料
を均一にするために軽く撹拌する。気泡が消えるまで再
び０℃の恒温水槽に入れて数分間保持してから、速やか
に濁度計（Process-Photometer,Sigrist社製）を用い
て、５６０ｎｍにおける混濁度を測定する。
を均一にするために軽く撹拌する。気泡が消えるまで再
び０℃の恒温水槽に入れて数分間保持してから、速やか
に濁度計（Process-Photometer,Sigrist社製）を用い
て、５６０ｎｍにおける混濁度を測定する。
【００４８】（２）永久混濁度（Ｐ−Ｈａｚｅ）の測定
方法 全混濁度を測定した試料を２０℃の恒温水槽に入れて１
時間保持する。その後、軽く撹拌して気泡の消えるのを
待って濁度計により５６０ｎｍにおける混濁度を測定す
る。
方法 全混濁度を測定した試料を２０℃の恒温水槽に入れて１
時間保持する。その後、軽く撹拌して気泡の消えるのを
待って濁度計により５６０ｎｍにおける混濁度を測定す
る。
【００４９】（３）全混濁度及び永久混濁度による混濁
安定性の予測方法 全混濁度及び永久混濁度を測定した試料を測定保護箱に
入れて、５０℃恒温器に５日間入れておく。その後、室
温に１時間放置後、０℃恒温水槽に４８時間入れてお
き、上記方法に従い１週間後の全混濁度及び永久混濁度
を測定する。２週間後、３週間後と順次全混濁度及び永
久混濁度を測定し、測定は全混濁度が１００Ｈｅｌｍを
越えるまで継続する。
安定性の予測方法 全混濁度及び永久混濁度を測定した試料を測定保護箱に
入れて、５０℃恒温器に５日間入れておく。その後、室
温に１時間放置後、０℃恒温水槽に４８時間入れてお
き、上記方法に従い１週間後の全混濁度及び永久混濁度
を測定する。２週間後、３週間後と順次全混濁度及び永
久混濁度を測定し、測定は全混濁度が１００Ｈｅｌｍを
越えるまで継続する。
【００５０】全混濁度の週毎の測定値をグラフに表し、
１００Ｈｅｌｍの時の週を読み取り、ＦＴテスト値とす
る。このＦＴテスト値から換算値を用いて混濁安定度を
予測する。換算式はＦＴテスト値と経過時間により回帰
式を作成して換算式を求める（European Brewery Conve
ntion、Analytica-EBC、第４版、1987参照）。
１００Ｈｅｌｍの時の週を読み取り、ＦＴテスト値とす
る。このＦＴテスト値から換算値を用いて混濁安定度を
予測する。換算式はＦＴテスト値と経過時間により回帰
式を作成して換算式を求める（European Brewery Conve
ntion、Analytica-EBC、第４版、1987参照）。
【００５１】参考例２ 窒素定量法（Ｔ−Ｎ法；セミミ
クロケルダール法） ビール試料の窒素含有量をケルテック全窒素分析機で分
析する。
クロケルダール法） ビール試料の窒素含有量をケルテック全窒素分析機で分
析する。
【００５２】試料を濃硫酸で分解すると、窒素分はアン
モニア態になり、硫酸との反応で硫酸アンモニウムの形
になる。そこへＮａＯＨ溶液を加えてから加熱するとア
ンモニアが遊離し、これを硼酸でトラップする。これを
濃度既知の硫酸で滴定することによって、窒素量を求め
る（European Brewery Convention、Analytica-EBC、第４
版、1987参照）。
モニア態になり、硫酸との反応で硫酸アンモニウムの形
になる。そこへＮａＯＨ溶液を加えてから加熱するとア
ンモニアが遊離し、これを硼酸でトラップする。これを
濃度既知の硫酸で滴定することによって、窒素量を求め
る（European Brewery Convention、Analytica-EBC、第４
版、1987参照）。
【００５３】参考例３ 蛋白定量法（ＭｇＳＯ4−Ｎ
法） ビール試料に硫酸マグネシウム水溶液を加えると、試料
中の高分子蛋白（分子量２６００以上）が結合して巨大
分子となって沈殿する。この沈殿物を硫酸マグネシウム
水溶液を用いてよく洗浄してから、セミミクロケルダー
ル法により窒素含量を測定する（Brautechnische Analy
senmethoden Band II、p253-254、1979参照）。
法） ビール試料に硫酸マグネシウム水溶液を加えると、試料
中の高分子蛋白（分子量２６００以上）が結合して巨大
分子となって沈殿する。この沈殿物を硫酸マグネシウム
水溶液を用いてよく洗浄してから、セミミクロケルダー
ル法により窒素含量を測定する（Brautechnische Analy
senmethoden Band II、p253-254、1979参照）。
【００５４】
【発明の効果】従来、ビールの混濁安定性予測法の実施
においては、数日から数十週間の期間を必要とし、評価
結果を得るまでに、多大な労力と時間を必要とした。し
かし、本発明の免疫学的測定法を適用することによっ
て、迅速かつ正確に混濁安定性を測定することが可能に
なった。また、本発明の免疫学的測定法は、ビールの安
定化剤の効力判定等にも利用できる。
においては、数日から数十週間の期間を必要とし、評価
結果を得るまでに、多大な労力と時間を必要とした。し
かし、本発明の免疫学的測定法を適用することによっ
て、迅速かつ正確に混濁安定性を測定することが可能に
なった。また、本発明の免疫学的測定法は、ビールの安
定化剤の効力判定等にも利用できる。
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡ法によるＨａｚｅ蛋白の検
量曲線を示す。図中、ＲＡＨ−１およびＲＡＨ−２は２
匹のウサギを用いて行ったそれぞれの結果を示す。
量曲線を示す。図中、ＲＡＨ−１およびＲＡＨ−２は２
匹のウサギを用いて行ったそれぞれの結果を示す。
【図２】図２は、対照（希釈液）、パパイン溶液、およ
びＨａｚｅ蛋白溶液のそれぞれについてウサギ２匹を用
いて行った、Ｈａｚｅ蛋白吸収試験の結果を示す。
びＨａｚｅ蛋白溶液のそれぞれについてウサギ２匹を用
いて行った、Ｈａｚｅ蛋白吸収試験の結果を示す。
【図３】図３は、混濁安定性予測法とＥＬＩＳＡ法によ
るＨａｚｅ蛋白濃度の関係を示す。
るＨａｚｅ蛋白濃度の関係を示す。
【図４】図４は、永久混濁度とＥＬＩＳＡ法によるＨａ
ｚｅ蛋白濃度の関係を示す。
ｚｅ蛋白濃度の関係を示す。
【図５】図５は、窒素定量法、蛋白定量法とＥＬＩＳＡ
法によるＨａｚｅ蛋白濃度の関係を示す。
法によるＨａｚｅ蛋白濃度の関係を示す。
フロントページの続き (72)発明者 石橋 義彦 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１ 号 サントリー株式会社 ビール研究所 内 (56)参考文献 特開 平６−311894（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−105698（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−46881（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−333223（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−306100（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−263800（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−72570（ＪＰ，Ａ) Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｂｒｏｗ Ｃｈｅ ｍ，Ｖｏｌ．51，Ｎｏ．１（1993）ｐ. 21−28 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/14
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｈａｚｅ蛋白を抗原とし、該抗原から得
られる抗体を用いる免疫学的測定法によって、ビールの
最終製品及びビールの製造工程におけるビール試料中の
Ｈａｚｅ蛋白含有量を測定することからなる、ビールの
混濁安定性を測定する方法。 - 【請求項２】 免疫学的測定法がＥＬＩＳＡ法である請
求項１記載の方法。 - 【請求項３】 分子量約４００００、等電点４．０〜
５．０であるＨａｚｅ蛋白を抗原とする請求項１記載の
方法。 - 【請求項４】 Ｈａｚｅ蛋白を抗原とし、該抗原から得
られる抗体、ならびに９６ウェルプレート、試料吸着用
緩衝液、洗浄液、ブロッキング溶液、基質溶液、第二抗
体希釈液および検量線グラフから選択される１または２
以上を含む、ビールの混濁安定性を測定するためのキッ
ト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11280894A JP3357743B2 (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11280894A JP3357743B2 (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07318558A JPH07318558A (ja) | 1995-12-08 |
| JP3357743B2 true JP3357743B2 (ja) | 2002-12-16 |
Family
ID=14596055
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11280894A Expired - Fee Related JP3357743B2 (ja) | 1994-05-26 | 1994-05-26 | ビールの混濁安定性測定法および該測定法に使用するキット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3357743B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4628559B2 (ja) * | 2001-02-19 | 2011-02-09 | アサヒビール株式会社 | 強制劣化装置及び混濁能予測方法 |
| JP4575822B2 (ja) * | 2005-03-29 | 2010-11-04 | サントリーホールディングス株式会社 | 醸造酒の混濁安定性を予測する方法 |
| JP2006311831A (ja) * | 2005-05-09 | 2006-11-16 | Suntory Ltd | ヘイズの生成を抑制した醸造酒の製造方法 |
| CN104165951B (zh) * | 2014-07-28 | 2016-05-11 | 北京燕京啤酒股份有限公司 | 一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定方法 |
| JP2021106540A (ja) * | 2019-12-27 | 2021-07-29 | サントリーホールディングス株式会社 | ビールテイスト飲料 |
-
1994
- 1994-05-26 JP JP11280894A patent/JP3357743B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｂｒｏｗ Ｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．１（１９９３）ｐ．２１−２８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07318558A (ja) | 1995-12-08 |
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