CN104165951B - 一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于啤酒参数检测技术领域的一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的快速高效测定方法。啤酒及麦汁经过简单预处理后，由高效凝胶过滤色谱法进行分析。将啤酒及麦汁样品进行适量稀释后，进样分析，随其中蛋白质分子量大小的不同自大而小依次流出色谱柱，得到峰面积各不相同的多个色谱峰。记录各色谱峰的保留时间和峰面积，代入标准曲线并乘以适当的稀释倍数即得到啤酒及麦汁中蛋白质的分布和含量的2条标准曲线。将待测啤酒及麦汁的测定结果与上述标准样品色谱图及标准曲线比对，就得到啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量。本方法简便快速，准确性高，重复性好，准确定量测定啤酒的非生物稳定性、泡沫稳定性和风味稳定性提供必要的技术支持。
Description
技术领域
本发明属于啤酒参数检测技术领域；特别涉及一种快速测定啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的方法，首次实现对啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的定性定量分析。
背景技术
啤酒中的蛋白质主要来源于原料大麦，而经过制麦、糖化和麦汁煮沸过程，原料大麦中的蛋白质都会出现不同程度的水解，与原有蛋白质构成发生较大变化。再经过发酵、贮酒，使最终啤酒中的蛋白质分布和含量与麦汁又存在不同。这种蛋白质分布及含量上的差异反映了整个啤酒制备过程中蛋白质自身的变化，而其最终的变化结果更会影响啤酒的质量稳定性。啤酒中蛋白质的含量和分布是啤酒非生物稳定性和泡沫稳定性的直接影响因素。所以对啤酒中蛋白质分布和含量的研究对啤酒生产企业而言有着重要的现实意义。
国内外啤酒中蛋白质含量的测定方法很多，包括Kjeldahl法、考马斯亮蓝法、ELISA法、分光光度法、双缩脲法等。但这些方法主要集中在对啤酒中蛋白总量的测定，却无法实现蛋白质分布和含量的测定。现有方法中蛋白质分布的测定有粘度法、凝胶层析法、SDS-PAGE凝胶电泳法和凝胶色谱法。前3种方法应用较多，而凝胶色谱法是伴随液相色谱技术的发展而应运而生的。作为一项全新的技术，目前它多应用于对多聚物的分析，在啤酒蛋白质的分析领域却未见应用。截止目前，国内外对啤酒中蛋白质含量和分布的测定主要集中在凝胶层析法和SDS-凝胶电泳法。其中前者由于应用常压手工进样方式，凝胶填料刚性较差且难于均匀，所以存在涡流扩散、分子扩散较严重，传质阻力大等特点，直接影响到所得图谱的分离度和准确性；SDS-PAGE电泳方法可以对蛋白质分子量的分布特点进行定性，但由于每一批次样品染色深度的差异，造成其只能达到对结果的半定量分析。而高效凝胶过滤色谱法(highperformancegelfiltrationchromatography，HPGFC)是根据溶剂分子尺寸的不同进行分离的一种液相色谱法，利用高分子溶液通过填充有多孔的特种凝胶离子的柱子，把分子按从大到小的顺序流出进行分离。它是一种设备简单、操作方便的分离分析技术，对高分子物质有很好的分离效果。而应用保留时间(保留体积)、峰面积和标准样品的相对分子量对数就可达到对蛋白质分子量分布和含量的分析。
发明内容
本发明的目的是提供一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定方法，其特征在于，依据高效凝胶过滤色谱法的全多孔改性硅胶，对不同分子量的标准样品进行柱分离分析；随后将啤酒及麦汁样品进行适量稀释后，进样分析，随其中蛋白质分子量大小的不同自大而小依次流出色谱柱，得到峰面积各不相同的多个色谱峰。依据标准样品的保留时间RT-相对分子质量对数LgM和保留时间RT-峰面积A，分别得到2条标准曲线，代入标准曲线并乘以适当的稀释倍数即得到啤酒及麦汁中蛋白质的分布和含量；具体步骤如下：
1)标准曲线的获得
(1.1)样品预处理：将啤酒及麦汁分别按蛋白质含量高低以终浓度为100-500mg/L稀释后，以0.45μm有机滤膜过滤，得到清液；
(1.2)标准样品制备：取不同分子量的蛋白质标准样品各0.05g，溶解在50mL的容量瓶中，以超纯水定容，配制成各标准样品的浓度为1mg/mL，随后以0.45μm有机滤膜过滤，得到清液备用；
(1.3)高效凝胶过滤色谱法分析：采用AgilentSEC-5，5μm，，7.8×300mm色谱柱；流动相：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；进样量：5μL；吸收波长：200-220nm；流速：1.0-1.2mL/min，柱温：20-25℃，检测时间为60min；分别得到啤酒及麦汁的标准样品色谱图；
(1.4)标准曲线，从上述标准样品色谱图中得到不同分子量蛋白质的保留时间及峰面积对蛋白质含量及分布的计算,通过一定浓度标准品的保留时间和峰面积确定：根据各种标准品的保留时间RT和相对分子质量对数LgM确定：(1)RT(x)对LgM(y)作标准曲线，得到相关性方程：即y＝ax+b；(2)将HPGFC色谱图得到样品的色谱峰分区，进而得到相应色谱峰的保留时间RT值和峰面积A值；将二者带入上述方程，便得到LgM值，计算M值、样品峰对应RT处的单位面积值A’，将c＝A/A’×C可知样品不同色谱峰(不同分子量区段)对应的含量；其中C为标准样品浓度，mg/L；以RT(x)对A’(y)作标准曲线，得到相关性方程：即y＝cx+d；同时得到R2值；分别绘制啤酒及麦汁的标准曲线；
2)啤酒及麦汁中蛋白质含量的测定，
(2.1)样品预处理：将啤酒及麦汁分别按蛋白质含量高低以终浓度为100-500mg/L稀释后，以0.45μm有机滤膜过滤，得到清液；
(2.2)分别采用高效凝胶过滤色谱法分析：采用AgilentSEC-5，5μm，，7.8×300mm色谱柱；流动相：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；进样量：5μL；吸收波长：200-220nm；流速：1.0-1.2mL/min，柱温：20-25℃进行检测，检测时间为60min；分别得到啤酒及麦汁的样品色谱图；
(2.3)测定结果：从上述(2.2)得到啤酒及麦汁的样品色谱图得到啤酒及麦汁的样品浓度的保留时间和峰面积，与上述(1.4)方法相同对蛋白质含量及分布进行计算，分别得到啤酒及麦汁的样品曲线；
(2.4)将上述(2.2)得到的样品色谱图和(2.3)测定结果与上述标准样品色谱图及标准曲线比对，就可以得到啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量。
所述各类啤酒及麦汁，且其中蛋白质含量不低于1mg/L。
本发明有益效果是依据高效凝胶过滤色谱法独有的全多孔改性硅胶，对不同分子量的样品进行柱分离分析，对啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定分离度高、结果准确，快速。与以往的凝胶层析法相比，本发明在涡流扩散、分子扩散和传质阻力等方面都有明显的优势。同时本发明的定量分析方法也具有很好的线性关系，为高效凝胶过滤色谱法的准确定量提供可靠依据。为啤酒及麦汁中不同分子量蛋白质影响啤酒非生物稳定性、泡沫稳定性和风味稳定性等问题提供必要的技术支持。
附图说明
图1是本发明所获取的4种不同分子量蛋白质标准样品凝胶过滤色谱图。
图2是本发明所获取的保留时间—相对分子量对数标准曲线图。
图3是本发明所获取的保留时间—峰面积标准曲线图。
图4是本发明所获取的某品牌啤酒样品的凝胶过滤色谱图。
图5是本发明所获取的某品牌啤酒样品的凝胶过滤色谱图。
具体实施方式
本发明提供一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定方法，下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
本发明将啤酒及麦汁经过预处理后，由高效凝胶过滤色谱法进行分析；依据标准样品的保留时间-相对分子质量对数和保留时间-峰面积分别得到2条标准曲线；随后将啤酒及麦汁样品进行适量稀释后，进样分析，随其中蛋白质分子量大小的不同自大而小依次流出色谱柱，得到峰面积各不相同的多个色谱峰。记录各色谱峰的保留时间(保留体积)和峰面积，代入标准曲线并乘以适当的稀释倍数即得到啤酒及麦汁中蛋白质的分布和含量；下列实施例中未注明实施例具体条件的实验方法，按照常规方法和条件。
实施例1
准确称取4种蛋白质的标准样品各0.05g共同溶解在50mL的容量瓶中，以超纯水定容，配制成各标准样品的浓度为1mg/mL。随后以0.45μm有机滤膜过滤，备用。
高效凝胶过滤色谱法分析条件：采用AgilentSEC-5，5μm，，7.8×300mm色谱柱；流动相：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；进样量：5μL；吸收波长：200-220nm；流速：1.0-1.2mL/min，柱温：20-25℃，检测时间为60min。
所得蛋白质标准样品凝胶过滤色谱图见图1。
根据4种标准品的保留时间和相对分子质量对数确定：RT(x)对LgM(y)作标准曲线，得到相关性方程：即y＝ax+b；同时得到R2值。
所得保留时间——相对分子量对数标准曲线图见图2。
根据4种标准品的保留时间和峰面积确定：RT(x)对A’(y)作标准曲线，得到相关性方程：即y＝cx+d；同时得到R2值。
所得保留时间——峰面积标准曲线图见图3。
实施例2
取某品牌啤酒样品以0.45μm有机滤膜过滤，备用。
高效凝胶过滤色谱法分析条件：采用AgilentSEC-5，5μm，，7.8×300mm色谱柱；流动相：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；进样量：5μL；吸收波长：200-220nm；流速：1.0-1.2mL/min，柱温：20-25℃，检测时间为60min。
所得某品牌啤酒样品的凝胶过滤色谱图见图4。
将HPGFC色谱图得到样品的色谱峰分区，进而得到相应色谱峰的保留时间RT值和峰面积A值。将二者带入上述方程，便可得到LgM值(可计算M值)、样品峰对应RT处的单位面积值A’，将c＝A/A’×C可知样品不同色谱峰(不同分子量区段)对应的含量。(其中C为标准样品浓度，mg/L)
实施例3
准确量取某品牌麦汁样品5mL，以流动相将其定容于50mL容量瓶中。随后以0.45μm有机滤膜过滤，备用。其中各类啤酒及麦汁，且其中蛋白质含量不低于1mg/L。
高效凝胶过滤色谱法分析条件：采用AgilentSEC-5，5μm，，7.8×300mm色谱柱；流动相：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；进样量：5μL；吸收波长：200-220nm；流速：1.0-1.2mL/min，柱温：20-25℃，检测时间为60min。
所得某品牌麦汁样品的凝胶过滤色谱图见图5。
将HPGFC色谱图得到样品的色谱峰分区，进而得到相应色谱峰的保留时间RT值和峰面积A值。将二者带入上述方程，便可得到LgM值(可计算M值)、样品峰对应RT处的单位面积值A’，将c＝A/A’×C×稀释倍数，可知样品不同色谱峰(不同分子量区段)对应的含量(其中C为标准样品浓度，mg/L)。
Claims (3)
1.一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定方法，依据高效凝胶过滤色谱法的全多孔改性硅胶，对不同分子量的标准样品进行柱分离分析；随后将啤酒及麦汁样品进行适量稀释后，进样分析，随其中蛋白质分子量大小的不同自大而小依次流出色谱柱，得到峰面积各不相同的多个色谱峰；依据标准样品的保留时间RT-相对分子质量对数LgM和保留时间RT-峰面积A分别得到2条标准曲线，其次，将按照测量标准样品的方法测定啤酒及麦汁中蛋白质含量的参数，代入标准曲线并乘以适当的稀释倍数即得到啤酒及麦汁中蛋白质的分布和含量；其特征在于，包括：
所述标准曲线的获得步骤如下：
(1.1)样品预处理：将啤酒及麦汁分别按蛋白质含量高低以终浓度为100-500mg/L稀释后，以0.45μm有机滤膜过滤，得到清液；
(1.2)标准样品制备：取不同分子量的蛋白质标准样品各0.05g，溶解在50mL的容量瓶中，以超纯水定容，配制成各标准品的浓度为1mg/mL，随后以0.45μm有机滤膜过滤，得到清液备用；
(1.3)高效凝胶过滤色谱法分析：采用AgilentSEC-5，5μm，7.8×300mm色谱柱；流动相：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；进样量：5μL；吸收波长：200-220nm；流速：1.0-1.2mL/min，柱温：20-25℃，检测时间为60min；分别得到啤酒及麦汁的标准样品色谱图；
(1.4)标准曲线，从上述标准样品色谱图中得到不同分子量蛋白质的保留时间及峰面积对蛋白质含量及分布的计算,通过一定浓度标准品的保留时间和峰面积确定：根据各种标准品的保留时间RT和相对分子质量对数LgM确定：(1)RT(x)对LgM(y)作标准曲线，得到相关性方程：即y＝ax+b；同时得到R2值；然后将HPGFC色谱图得到样品的色谱峰分区，进而得到相应色谱峰的保留时间RT值和峰面积A值；将二者带入上述方程，便得到LgM值，计算M值、样品峰对应RT处的单位面积值A’，将c＝A/A’×C可知样品不同色谱峰即不同分子量区段对应的含量；其中C为标准样品浓度，mg/L；以RT(x)对A’(y)作标准曲线，得到相关性方程：即y＝cx+d；同时得到R2值；分别绘制啤酒及麦汁的标准曲线；
所述啤酒及麦汁中蛋白质含量的测定步骤：
(2.1)样品预处理：将啤酒及麦汁分别按蛋白质含量高低以终浓度为100-500mg/L稀释后，以0.45μm有机滤膜过滤，得到清液；
(2.2)分别采用高效凝胶过滤色谱法分析：采用AgilentSEC-5，5μm，7.8×300mm色谱柱；流动相：磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；进样量：5μL；吸收波长：200-220nm；流速：1.0-1.2mL/min，柱温：20-25℃进行检测，检测时间为60min；分别得到啤酒及麦汁的样品色谱图；
(2.3)测定结果：从上述(2.2)得到啤酒及麦汁的样品色谱图得到啤酒及麦汁的样品浓度的保留时间和峰面积，用与上述(1.4)标准曲线相同的方法对蛋白质含量及分布进行计算，分别得到啤酒及麦汁的样品曲线；
(2.4)将上述(2.2)得到的样品色谱图和(2.3)测定结果与上述标准样品色谱图及标准曲线比对，就能得到啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量。
2.根据权利要求1所述一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定方法，其特征在于，所述啤酒及麦汁中蛋白质含量不低于1mg/L。
3.根据权利要求1所述一种啤酒及麦汁中蛋白质分布和含量的测定方法，其特征在于，色谱峰的积分范围从5min到20min。
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| Title |
|---|
| Beer proteomics analysis for beer quality control and malting barley breeding;Takashi Iimure 等;《Food Research International》;20131130;第54卷(第1期);第1013-1020页 * |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104165951A (zh) | 2014-11-26 |
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