EA016145B1

EA016145B1 - Новые низкомолекулярные ингибиторы mdm2 и их применение

Info

Publication number: EA016145B1
Application number: EA200900360A
Authority: EA
Inventors: Шаомэн Ван; Дунгуан Цинь; Цзяньюн Чэнь; Шанхай Юй
Original assignee: Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Мичиган
Priority date: 2006-08-30
Filing date: 2007-08-30
Publication date: 2012-02-28
Also published as: CA2661354C; AU2007297823B2; EP2063887B1; CN101528223A; NZ575193A; CA2661354A1; JP2010502620A; AU2007297823A1; ZA200901224B; JP5399904B2; WO2008036168A2; WO2008036168A3; SG174107A1; EP2063887A4; MX2009002306A; EP2063887A2; CN101528223B; EA200900360A1; ES2425965T3; BRPI0715506A2

Abstract

Настоящее изобретение имеет отношение к низкомолекулярным веществам, которые являются ингибиторами взаимодействия p53 и MDM2. Изобретение также имеет отношение к применению этих веществ для подавления клеточного роста, индукции гибели клеток, индукции остановки клеточного цикла и/или повышения чувствительности клеток к другим агентам.

Description

Агрессивный фенотип опухолевых клеток является результатом множества различных генетических и эпигенетических повреждений, которые приводят к нарушению регуляции межклеточных сигнальных механизмов (Ропбег, Ыа!иге 411:336 (2001)). Общей чертой всех опухолевых клеток является нарушение выполнения программы апоптоза и отсутствие нормального апоптоза вследствие нарушения его механизмов (Ьоте и а! а1., Сагсшодепеб1б 27:485 (2000)). Неспособность опухолевых клеток выполнять программу апоптоза вследствие нарушения механизмов нормального апоптоза часто связана с возрастанием устойчивости к химиотерапии, облучению или иммуноиндуцированному апоптозу. Первичная или приобретенная устойчивость опухолей человека различного происхождения к существующим протоколам лечения вследствие нарушения механизмов апоптоза является серьезной проблемой современной онкологии (Ьоте и а! а1., Сагс1подепеб1б 21:485 (2000), №сНо1боп, Ыа!иге 407:810 (2000)). Следовательно, усилия, направленные на разработку и развитие новых молекулярных специфических противоопухолевых лекарственных средств, способных увеличить выживаемость и качество жизни пациентов с опухолевыми заболеваниями, должны включать разработку стратегий, воздействующих на резистентность опухолевых клеток к апоптозу. В этом отношении многообещающей терапевтической стратегией по созданию новых противоопухолевых препаратов является воздействие на ключевые отрицательные регуляторы, которые играют основную роль в прямом подавлении апоптоза в опухолевых клетках.

Супрессор опухолевого роста р53 играет основную роль в контроле над клеточной прогрессией и апоптозом (Уоде1б!ет и а! а1., Ыа!иге 408:307 (2000)). Этот ген - привлекательная терапевтическая мишень для создающихся лекарственных средств, поскольку стимуляция его противоопухолевой активности приводит к эрадикации опухолевых клеток (Уоде1б!ет и а! а1., Ыа!иге 408:307 (2000), СНепе, Ν;·ιΙ. Кеу. Сапсег 5:102 (2003)). Новый способ стимуляции активности гена р53 - это ингибирование его взаимодействия с белком ΜΌΜ2 при помощи небелковых низкомолекулярных ингибиторов (СНепе, Ν;·ιΙ. Кеу. Сапсег 5:102 (2003); Уаббйеу и а! а1., 8с1епсе 505:844 (2004)). ΜΌΜ2 и р53 являются частью петли, саморегулирующейся по принципу обратной связи (Аи и а! а1., Оепеб Эеу. 7:1126 (1993)). Транскрипция ΜΌΜ2 активируется р53, а ΜΌΜ2, в свою очередь, подавляет активность р53 по меньшей мере по трем различным механизмам (Аи и а! а1., Оепеб Эеу. 7:1126 (1993)). Первый механизм: белок ΜΌΜ2 непосредственно связывается с доменом трансактивации р53 и ингибирует р53-опосредованную трансактивацию. Второй механизм: белок ΜΌΜ2 содержит сигнальную последовательность ядерного экспорта и, связываясь с р53, индуцирует ядерный экспорт р53, предотвращая связывание р53 с целевыми ДНК. Третий механизм: белок ΜΌΜ2 является убихитин-лигазой Е2 и, связываясь с р53, способен вызывать разрушение р53. Следовательно, действуя как мощный эндогенный клеточный ингибитор активности р53, ΜΌΜ2 эффективно подавляет р53-опосредованные апоптоз, остановку клеточного цикла и репарацию ДНК (СНепе, Ыа!. Кеу. Сапсег 5:102 (2003); Уаббйеу и а! а1., 8с1епсе 505:844 (2004)).

Высокоаффинные белковые ингибиторы были успешно разработаны в прошлом (Оагаа-ЕсНеуегла и а! а1., Μеб. СНет. 43:3205 (2000)). Однако эти ингибиторы не могут быть лекарственными средствами вследствие низкой проницаемости клеточных мембран в отношении этих веществ и низкой биодоступности этих соединений т у1уо. Несмотря на интенсивные усилия фармацевтической промышленности, успех поиска хорошо проникающих, мощных небелковых низкомолекулярных ингибиторов был очень ограничен. Следовательно, необходим небелковый, низкомолекулярный ингибитор взаимодействия ΜΌΜ2 и р53, который смог бы стать лекарственным средством.

Создание небелковых низкомолекулярных ингибиторов взаимодействия ΜΌΜ2 и р53 в настоящее время рассматривается как привлекательная стратегия создания противоопухолевого средства (СНепе, Ыа!. Кеу. Сапсег 5:102 (2003); Уаббйеу и а! а1., 8с1епсе 505:844 (2004)). Структурные основы этого взаимодействия изучены при помощи рентгеновской кристаллографии (Кибб1е и а! а1., 8с1епсе 274:948 (1996)). Структура кристаллов показывает, что взаимодействие ΜΌΜ2 и р53 главным образом опосредовано тремя гидрофобными остатками (Фен19, Три23 и Лей26) р53 и маленькой, глубокой гидрофобной нишей в молекуле ΜΌΜ2. Гидрофобная ниша является идеальным местом для воздействия низкомолекулярного ингибитора, способного нарушить взаимодействие ΜΌΜ2 и р53 (СНепе, Ыа!. Кеу. Сапсег 5:102 (2003)).

Резюме изобретения

Хорошо известно, что неспособность опухолевых клеток (или поддерживающих клеток) к апоптозу вследствие наличия генетических дефектов или в ответ на воздействие индукторов апоптоза, таких как противоопухолевые препараты или облучение, является основным фактором появления и прогрессии опухоли. Индукцию апоптоза опухолевых клеток или поддерживающих клеток (т.е. неоваскулярных кле

- 1 016145 ток в системе кровоснабжения опухоли) можно считать универсальным механизмом действия практически всех эффективных противоопухолевых лекарственных средств или облучения, применяющихся в клинической практике на сегодняшний день. Одной из причин неспособности клеток к апоптозу является уменьшение в этих клетках супрессорной активности р53, что во многом опосредовано действием ΜΌΜ2 на р53 в опухолевых клетках с функциональным р53. Подавление активности р53 приводит к повреждению механизма апоптоза, а также механизма регуляции клеточного цикла.

Настоящее изобретение предполагает, что воздействие на животных с опухолевым заболеванием терапевтически эффективных концентраций препарата (препаратов) (т.е. низкомолекулярных веществ), которые увеличивают активность р53 и р53-связанных белков (т.е. р63, р73) путем подавления взаимодействия р53 или р53-связанных белков с ΜΌΜ2 или МОМ2-связанными белками (т.е. ΜΌΜΧ), приведет к полному подавлению роста опухолевых клеток или поддерживающих клеток и/или сделает популяцию этих клеток более чувствительной к индукции клеточной смерти противоопухолевыми препаратами или облучением. В частности, ингибиторы, о которых идет речь в изобретении, могут увеличивать время полужизни р53 путем нарушения взаимодействия р53 и ΜΌΜ2, которое в норме способствует разрушению р53. Настоящее изобретение предполагает, что подавление взаимодействия р53 или р53связанных белков и ΜΌΜ2 и Μ^Μ2-связанных белков соответствует потребности в лечении различных видов опухолей - как в виде монотерапии для индукции подавления клеточного роста, апоптоза и/или остановки клеточного цикла опухолевых клеток, так и в виде совместного применения с дополнительными препаратами, такими как другие препараты, индуцирующие гибель клеток или прерывающие клеточный цикл лучевой терапией (комбинированной терапией). Также предполагается, что это приводит к увеличению доли опухолевых клеток (или поддерживающих клеток), более склонных к выполнению программы апоптоза, по сравнению с соответствующей долей клеток опухоли животных, получающих лечение только одним противоопухолевым препаратом или только лучевой терапией.

В определенных вариантах реализации данного изобретения комбинированная терапия животных терапевтически эффективными количествами соединения, представленного в изобретении, и другим противоопухолевым препаратом или лучевой терапией приводит к более выраженному ответу со стороны опухоли и большей клинической эффективности по сравнению с животными, которые получали лечение только этим соединением или другим противоопухолевым препаратом либо облучением по отдельности. Другими словами, данные соединения снижают порог апоптоза всех клеток, поэтому возрастает доля клеток, которые успешно выполняют программу апоптоза в ответ на повышение активности апоптоза, применение противоопухолевых препаратов или облучения. С другой стороны, соединения настоящего изобретения будут использоваться для обеспечения возможности назначения более низкой, а значит, менее токсичной и более переносимой дозы противоопухолевого препарата/облучения. Дозы всех одобренных к использованию противоопухолевых препаратов и облучения известны, и в настоящем изобретении предлагают различные комбинации этих средств с представленными соединениями. Кроме того, поскольку соединения, представленные в настоящем изобретении, могут хотя бы частично стимулировать апоптотическую и подавляющую клеточный цикл активность р53 и р53-связанных белков, воздействие на опухолевые клетки (или поддерживающие клетки) терапевтически эффективных количеств данных соединений должно совпадать во времени с попытками заставить клетки выполнять программу апоптоза в ответ на противоопухолевую или лучевую терапию. Таким образом, в некоторых вариантах реализации изобретения применение соединений, представленных в настоящем изобретении, в определенное время в связи с применением других средств предоставляет возможность особенно эффективного терапевтического воздействия.

В других вариантах применения данного изобретения ингибиторы взаимодействия р53 или р53связанных белков и ΜΌΜ2 и ΜΌΜ2-связанных белков могут защитить нормальные клетки от токсических эффектов определенных химиотерапевтических средств и облучения, возможно, благодаря способности ингибиторов вызывать остановку клеточного цикла. В частности, ингибиторы, представленные в данном изобретении, могут вызывать остановку клеточного цикла в клетках с р53 дикого типа, не влияя на опухолевые клетки с мутантными или отсутствующими р53. Дифференциальный защитный эффект может позволить провести более эффективное лечение опухоли благодаря применению более высоких доз и более длительного курса терапии химиотерапевтических средств или применению схем лечения без увеличения токсического побочного эффекта такого лечения.

Настоящее изобретение имеет отношение к соединениям, которые могут быть использованы для подавления взаимодействия р53 или р52-связанных белков и ΜΌΜ2 и ΜΌΜ2-связанных белков и для увеличения чувствительности клеток к индукторам апоптоза и/или остановки клеточного цикла. В одном из вариантов реализации изобретения соединения имеют формулу Χ

- 2 016145

или их фармацевтически приемлемую соль, где Κ₁ представляет собой С₆_1₄арил, необязательно замещенный одной или двумя галогеногруппами;

К₅ представляет собой С_1-18алкил, необязательно замещенный С_3-8циклоалкилом, С_6-14арилом или С_1-6алкоксигруппой, С_3-8циклоалкил или С_2-18алкенил;

К₇ представляет собой Н или СО₂К';

Κ' представляет собой С_1-18алкил;

К₉ представляет собой 6-хлор- и 5-фторгруппу;

Κ₁₀ представляет собой атом водорода и

Κ₁₁ представляет собой С_3-8циклоалкил-С_1-6алкил, где указанный С_3-8циклоалкил необязательно замещен одной или двумя гидроксигруппами; или моноцикло-С_3-8гетероцикло-С_1-6алкил, где указанный моноцикло-С_3-8гетероцикло необязательно замещен одной или двумя гидроксигруппами; или дигидрокси-С_1-6алкильную группу, не содержащую гидроксильную группу в положении 3 алкильной группы;

либо Κ₁₀ и Κ₁₁ вместе образуют моноцикло-С_3-8гетероциклогруппу, необязательно замещенную С_1-6алкилом.

Настоящее изобретение имеет отношение к соединениям, представленным формулой X, которые являются ингибиторами взаимодействия р53 или р53-связанных белков и ΜΌΜ2 и МОМ2-связанных белков. Изобретение имеет отношение к применению этих соединений для индукции остановки клеточного цикла и/или апоптоза в клетках, содержащих функциональный р53 или р53-связанные белки. Изобретение также имеет отношение к использованию этих соединений для повышения чувствительности клеток к дополнительным средствам, таким как индукторы апоптоза и/или остановки клеточного цикла, а также для хемопротекции нормальных клеток путем индукции остановки клеточного цикла перед началом применения химиотерапевтических средств. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения это изобретение имеет отношение к способам создания резистентности нормальных клеток по отношению к химиотерапевтическим препаратам или другим способам лечения, путем контакта этих клеток с соединением изобретения. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения это изобретение имеет отношение к способам защиты нормальных клеток животных с гиперпролиферативными заболеваниями от токсических побочных эффектов химиотерапевтических препаратов или других средств лечения путем назначения этим животным соединения изобретения. В определенном варианте реализации изобретения оно направлено на лечение, уменьшение, профилактику нарушений, побочных эффектов или состояний, вызванных назначением химиотерапевтических препаратов, в нормальных неопухолевых клетках путем применения у животных, получающих химиотерапию, соединения, представленного в настоящем изобретении. К примерам таких нарушений и состояний, вызванных химиотерапией, относятся воспаление слизистых оболочек, стоматит, сухость во рту, диспепсические явления и облысение.

Соединения изобретения используются для лечения, уменьшения или профилактики нарушений, вызванных индукцией апоптоза клеток, т.е. нарушений, характеризующихся нарушением регуляции апоптоза, в том числе гиперпролиферативные заболевания (опухоли). В определенных вариантах реализации данного изобретения эти соединения могут использоваться для лечения, уменьшения или профилактики опухолей, характеризующихся резистентностью к противоопухолевой терапии (т.е. опухолей с хеморезистентными, гормонрезистентными клетками, клетками, резистентными к лучевой терапии, и т.д.). В других вариантах реализации настоящего изобретения эти соединения могут использоваться для лечения гиперпролиферативных заболеваний, характеризующихся экспрессией функционального р53 или р53-связанных белков. В других вариантах реализации данного изобретения оно имеет отношение к использованию этих соединений для защиты нормальных (т. е. негиперпролиферативных) клеток от токсических побочных эффектов химиотерапевтических препаратов и других средств лечения путем индукции остановки клеточного цикла в этих клетках.

Настоящее изобретение представляет лекарственные композиции, включающие соединение согласно формуле X в терапевтически эффективном количестве, необходимом для индукции апоптоза в клетках или повышения чувствительности клеток к индукторам апоптоза.

Настоящее изобретение представляет наборы, включающие соединение согласно формуле X, а также инструкции по применению этого соединения у животных. Эти наборы могут включать и другие те

- 3 016145 рапевтические средства, т.е. противоопухолевые препараты или апоптозмодулирующие препараты.

Изобретение также представляет способы получения соединений согласно формуле X.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение имеет отношение к соединениям, соответствующим формуле X, которые являются ингибиторами взаимодействия р53 или р53-связанных белков и ΜΌΜ2 или МЭМ2-связанных белков. Подавляя угнетающий эффект ΜΌΜ2 или ΜΌΜ2-связанных белков на р53 или р53-связанные белки, эти соединения увеличивают чувствительность клеток к индукторам апоптоза и/или остановки клеточного цикла, а также при некоторых обстоятельствах сами индуцируют апоптоз или остановку клеточного цикла. Следовательно, это изобретение имеет отношение к способам повышения чувствительно сти клеток к индукторам апоптоза и/или остановки клеточного цикла, а также к способам индукции апоптоза и/или остановки клеточного цикла, включающим контакт этих клеток с соединением, соответствующим формуле X, по отдельности или в сочетании с дополнительными агентами (индукторами апоптоза или прерывателями клеточного цикла). Изобретение также имеет отношение к способам лечения, уменьшения или профилактики нарушений у животных, вызванных индукцией апоптоза, включающим применение у животных соединения, соответствующего формуле X, и дополнительных агентов индукторов апоптоза. К таким нарушениям относятся состояния, характеризующиеся нарушением регуляции апоптоза и пролиферацией клеток, экспрессирующих функциональный р53 или р53-связанные белки. В других вариантах реализации изобретения оно имеет отношение к способам защиты нормальных (негиперпролиферативных) клеток животных от токсических побочных эффектов химиотерапевтических препаратов или способов лечения, включающим применение у животных соединения, соответствующего формуле X.

Использующиеся здесь термины противоопухолевый агент и противоопухолевый препарат соответствуют всем лекарственным средствам (например, химиотерапевтическим соединениям и/или молекулярным лекарственным соединениям), способам антисмысловой терапии, лучевой терапии, хирургическим вмешательствам, которые используются при лечении гиперпролиферативных заболеваний, таких как опухолевые заболевания (например, у млекопитающих).

Использующийся здесь термин пролекарство соответствует фармакологически неактивному производному молекулы лекарства, требующему биотрансформации (как спонтанной, так и ферментной) в целевой физиологической системе, что приведет к высвобождению или превращению (ферментному, физиологическому, механическому, электромагнитному) пролекарства в активное лекарство (активный препарат). Пролекарства создаются для преодоления проблем, связанных с устойчивостью, токсичностью, недостаточной специфичностью или ограниченной биодоступностью. Примером пролекарства является активное лекарство с защитной химической группой (т.е. группой, которая обратимо подавляет активность этого лекарства). Некоторые пролекарства являются вариантами или производными соединений, которые включают в свой состав группы, отщепляющиеся при определенных метаболических условиях. Эти пролекарства становятся фармакологически активными ίη νίνο и ίη νίΐτο при растворении в физиологических условиях, при ферментном разрушении или при других биохимических превращениях (например, фосфорилировании, гидрогенизации, дегидрогенизации, гликозилировании). Пролекарства обладают преимуществами в растворимости, тканевой совместимости или свойством замедленного высвобождения в организме млекопитающих (примеры: Випбдатб, Эсчдп οί РгобисК р. 7-9, 21-24, ЕГсисг. АтЧсгбаш (1985); §1ксттап, Т11С Отдашс СйспйЧгу οί Эгид Эсчдп апб Эгид Асйоп, р. 352-401, Асабспйс Ргсхч §ап Ό^ο, СА (1992)). Часто пролекарства являются производными кислот, такими как эфиры, получающиеся при взаимодействии родительской кислоты с соответствующим спиртом (например, низшим алканолом), амиды, получающиеся при взаимодействии родительской кислоты с амином, или же представлены ацилированными производными основаниями, получающимися при соединении с основными группами (например, низшие алкиламиды).

Использующийся здесь термин фармакологически приемлемая соль соответствует любой соли (полученной при взаимодействии с кислотой или основанием) соединения настоящего изобретения, являющейся физиологически совместимой с организмом целевого животного (например, млекопитающего). Соли соединений настоящего изобретения могут являться солями органических и неорганических кислот и оснований. К примерам кислот относятся хлороводородная, бромоводородная, серная, азотная, перхлорная, фумаровая, малеиновая, фосфорная, гликолевая, молочная, салициолвая, яблочная, толуен-рсульфоновая, винная, уксусная, лимонная, метансульфоновая, этансульфоновая, муравьиная, бензойная, малоновая, сульфоновая, нафтален-2-сульфоновая, бензенсульфоновая и другие подобные кислоты. Некоторые кислоты, такие как щавелевая, не являющиеся фармакологически приемлемыми, могут быть задействованы в получении промежуточных продуктов при синтезе соединений изобретения и их фармакологически приемлемых кислых солей.

К примерам оснований относятся гидроксиды щелочных металлов (например, натрия), гидроксиды щелочно-земельных металлов (например, магния), аммиак и соединения с формулой ЫГС₄ ⁺, где ГС - это алкил с 1-4 атомами С, и другие подобные соединения.

К примерам солей относятся ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензенсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсуль- 4 016145 фат, этансульфонат, фумарат, фторогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, хлорид, бромид, иодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, мезилат, метансульфонат, 2нафталенсульфонат, никотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат, ундеканоат и другие подобные соли. К другим примерам солей относятся анионы соединений настоящего изобретения, связанные с такими катионами, как Ν;ί, ΝΗ₄ ⁺, Ν^₄ ⁺, где - это алкильная группа с 1-4 атомами С, и другие подобные соли. Предполагается, что при терапевтическом использовании соли соединения настоящего изобретения являются фармакологически приемлемыми. Тем не менее, соли кислот и оснований, не являющиеся фармакологически приемлемыми, также могут оказаться полезными, например, при получении или очистке фармакологически приемлемого соединения.

Использующийся здесь термин терапевтически эффективное количество соответствует количеству лекарственного препарата, достаточному для уменьшения проявления одного или большего числа симптомов нарушения, предотвращения прогрессирования нарушения или вызывания регрессии нарушения. Например, в отношении к лечению опухолевых заболеваний в одном из вариантов реализации изобретения терапевтически эффективное количество будет соответствовать количеству лекарственного средства, которое снижает скорость опухолевого роста, уменьшает объем опухоли, уменьшает число метастазов, увеличивает время прогрессии опухоли, увеличивает время выживания по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 100%.

Использующиеся здесь термины увеличивать чувствительность, увеличение чувствительности соответствуют увеличению восприимчивости клетки животного или клетки в животном организме при помощи применения первого агента (например, соединения, представленного формулой X) к биологическим эффектам второго агента (например, к стимуляции или замедлению определенных клеточных функций: деления клеток, клеточного роста, пролиферации, инвазии, ангиогенезу, некрозу или апоптозу). Эффект увеличения чувствительности первым агентом в отношении целевой клетки может быть выражен как различия между биологическим эффектом (например, стимуляцией или торможением клеточных определенных клеточных функций: клеточного роста, пролиферации, инвазии, ангиогенеза или апоптоза), наблюдаемым при применении второго агента в сочетании с первым агентом или без него. Ответ при повышении чувствительности клетки может быть увеличен по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 250%, по меньшей мере на 300%, по меньшей мере на 350%, по меньшей мере на 400%, по меньшей мере на 450%, по меньшей мере на 500% по сравнению с ответом в отсутствие первого агента.

Использующийся здесь термин нарушение регуляции апоптоза соответствует любому отклонению от способности (например, предрасположенности) клетки к гибели через апоптоз. Нарушение регуляции апоптоза вызывается или связано с различными условиями, к которым относятся аутоиммунные расстройства (например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь трансплантат против хозяина, миастения гравис, синдром Шегрена), хронические воспалительные заболевания (например, псориаз, астма или болезнь Крона), гиперпролиферативные заболевания (например, опухоли, Вклеточные лимфомы, Т-клеточные лимфомы), вирусные инфекции (например, герпес, папиллома, ВИЧ) и другие состояния, такие как остеоартрит и атеросклероз. Необходимо отметить, что когда нарушение регуляции вызвано или связано с вирусной инфекцией, то эта вирусная инфекция может не определяться ко времени появления или обнаружения нарушения регуляции. Это значит, что нарушение регуляции, вызванное вирусной инфекцией, может появляться даже после исчезновения симптомов инфекции.

Использующийся здесь термин функциональный р53 соответствует р53 дикого типа, который экспрессируется в нормальных, высоких и низких количествах, а также мутантному р53, активность которого составляет по меньшей мере 5% активности р53 дикого типа, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50% активности р53 дикого типа или больше.

Использующийся здесь термин р53-связанный белок соответствует белку, который характеризуется по меньшей мере 25% гомологичностью последовательности по сравнению с р53, обладает супрессивной активностью по отношению к опухолям и подавляется при взаимодействии и ΜΌΜ2 или ΜΌΜ2связанными белками. К примерам р53-связанных белков относятся р63, р73 и некоторые другие белки.

Использующийся здесь термин Μ^Μ2-связанный белок соответствует белку, который характеризуется по меньшей мере 25% гомологичностью последовательности по сравнению с ΜΌΜ2, взаимодействует с р53 или р53-связанными белками и подавляет их активность. К примерам Μ^Μ2-связанных белков относится ΜΌΜΧ и ΗΌΜ2, а также другие белки.

Использующийся здесь термин гиперпролиферативное заболевание соответствует любому со

- 5 016145 стоянию, при котором локализованная популяция пролиферирующих клеток животного не подчиняется обычным ограничителям нормального роста. К примерам гиперпролиферативных нарушений относятся опухоли, новообразования, лимфомы и другие подобные состояния. Новообразование считается доброкачественным, если оно не является инвазивным или не образует метастазы, и злокачественным, если является инвазивным или образует метастазы. Метастатическая клетка - это клетка, которая обладает способностью к инвазии и разрушению других структур тела. Гиперплазия - эта форма клеточной пролиферации, которая заключается в увеличении числа клеток ткани или органа без значительного нарушения структуры или функции. Метаплазия - это форма контролируемого клеточного роста, при котором полностью дифференцированные клетки одного типа замещаются дифференцированными клетками другого типа.

Патологический рост активированных лимфоидных клеток часто приводит к появлению аутоиммунных расстройств или хронических воспалительных заболеваний. Использующийся здесь термин аутоиммунное расстройство соответствует такому состоянию, при котором в организме образуются антитела или иммунные клетки к собственным молекулам, клеткам и тканям организма. К примерам таких аутоиммунных расстройств относятся аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, болезнь Бергера, или 1дЛ-нефропатия, брюшной спру, синдром хронической усталости, болезнь Крона, дерматомиозит, фибромиалгия, болезнь трансплантат против хозяина, болезнь Грэйва, тиреоидит Хашимото, идиопатическая тромбопеническая пурпура, красный плоский лишай, множественный склероз, миастения гравис, псориаз, ревматическая лихорадка, ревматический артрит, склеродерма, синдром Шегрена, системная красная волчанка, сахарный диабет I типа, язвенно-некротический колит, витилиго и другие подобные заболевания.

Использующийся здесь термин опухолевое заболевание соответствует любому ненормальному клеточному росту как доброкачественному, так и злокачественному.

Использующийся здесь термин нормальная клетка соответствует клетке, которая не характеризуется ненормальным клеточным ростом или делением.

Нормальные клетки являются неопухолевыми и не вовлечены в гиперпролиферативное заболевание или расстройство.

Использующийся здесь термин противоопухолевый препарат соответствует любому соединению, которое замедляет пролиферацию, рост или распространение целевой (например, злокачественной) опухоли.

Использующиеся здесь термины предотвращать, предотвращение или профилактика соответствуют заболеванию с образованием патологических клеток (например, гиперпролиферативных или опухолевых клеток) у животных. Профилактика может быть полной, например полное отсутствие патологических клеток в организме субъекта. Профилактика может также быть частичной, например, когда число патологических клеток в организме субъекта меньше по сравнению с числом клеток, которые бы образовались без этого вмешательства.

Использующийся здесь термин апоптозмодулирующие агенты соответствует агентам, которые участвуют в модуляции (например, ингибировании, уменьшении, увеличении, способствовании, стимулировании) апоптоза. К примерам апоптозмодулирующих агентов относятся белки, которые включают в свой состав домен гибели клеток, такой как Рак/СИ95, ТКАМР, ΤΝΡ К1, ΌΚ1, ΌΚ2, ΌΚ3, ΌΚ4, ΌΚ5, ΌΚ6, ΡΆΌΌ и К1Р, а также другие домены гибели клеток. К другим примерам апоптозмодулирующих агентов относятся ΤΝΡα, лиганд Рак, антитела к Рак/СИ95 и другим рецепторам семейства ΤΝΡ, ТКЛ1Б (известный также как лиганд Аро2, или Аро2/ТКА1Ь), антитела к ТКА1Б-К1 или ТКА1Б-К2, В1с-2, р53, ВАХ, ВАИ, Ак1, САИ, киназа Р13, РР1 и каспазные белки. К модулирующим агентам также относятся агонисты и антагонисты рецепторов семейства Т№ и лиганды семейства Т№. Апоптозмодулирующие агенты могут быть растворимыми или связанными с мембранами (например, лиганд или рецептор). К апоптозиндуцирующим агентам относятся также индукторы апоптоза, такие как Т№ или Т№-связанный лиганд, в частности лиганд ТКАМР, лиганд Рак/СИ95, лиганд ΙΝΡΚ.-1, или ТКА1Ь.

В одном из аспектов настоящего изобретения ингибитором взаимодействия р53 и МЭМ2 является соединение, соответствующее формуле X

или его фармацевтически приемлемая соль, где К! представляет собой С_6-1₄арил, необязательно замещенный одной или двумя галогеногруппа

- 6 016145 ми;

К₅ представляет собой С1_1₈алкил, необязательно замещенный С₃_₈циклоалкилом, С₆_1₄арилом или С1_₆алкоксигруппой, С_3-8циклоалкил; или С_2-18алкенил;

К₇ представляет собой Н или СО₂К';

К' представляет собой С_1-18алкил;

К₁₀ представляет собой атом водорода и

К₁₁ представляет собой С_3-8циклоалкил-С_1-6алкил, где указанный С_3-8циклоалкил необязательно замещен одной или двумя гидроксигруппами; или моноцикло-С_3-8гетероцикло-С_1-6алкил, где указанный моноцикло-С3-8гетероцикло необязательно замещен одной или двумя гидроксигруппами; или дигидрокси-С_1-6алкильную группу, не содержащую гидроксильную группу в положении 3 алкильной группы;

либо К₁₀ и К₁₁ вместе образуют моноцикло-С_3-8гетероциклогруппу, необязательно замещенную С_1-6алкилом.

К примерам замещенных циклоалкилалкильных групп относятся алкилы С_1-6, замещенные циклоалкильной группой, как это описано ниже, которая, в свою очередь, замещена одной или большим числом гидроксильных групп. К примерам гетероциклоалкильных групп относятся алкилы С1-6, замещенные моноциклогетероциклоалкильной группой, как это описано ниже.

К частным примерам циклоалкилалкильных групп относятся 2-(3-гидроксициклопентил)этиламинои 3-(3-гидроксициклопентил)пропиламиногруппы. Гидроксильные группы могут иметь К- или 8конфигурации.

К частным примерам замещенных гетероциклоалкильных групп относятся 2-(1морфолинил)этиламино- и 3-(1-морфолинил)пропиламиногруппы.

К частным примерам дигидроксиалкиламинных групп относятся К- и 8-4,5дигидроксипентиламино- и 4-гидрокси-3-(метилгидрокси)бутиламиногруппы.

Ожидается, что если гидроксильная группа в 3-положении алкильной группы отсутствует, то соединение может проявлять свойства высокой устойчивости при его получении. Не ограничиваясь какойлибо теорией, высокая устойчивость может объясняться отсутствием нуклеофильной 3-гидроксигруппой, которая может замещать аминогруппу в амиде, образуя при этом 6-членное эфирсодержащее кольцо. Считается, что дигидроксиалкильные группы, не содержащие 3-гидроксигруппы, не будут вступать в такую реакцию, будут более устойчивыми и окажутся способными дать более высокий выход конечного продукта.

В другом варианте реализации изобретения соединения, соответствующие формуле X, описывают-

Вю Вт Вм

XX XXI XXII «ю Яц> «ю

XXIV XXV XXVI где К₁, К₅, К₇, К₉, К₁₀ и К₁₁ соответствуют описанию, приведенному выше.

- 7 016145

Частные варианты реализации настоящего изобретения включают без ограничения следующие соединения или их фармацевтически приемлемые соли

- 8 016145

- 9 016145

- 10 016145

- 11 016145

- 13 016145

- 14 016145

- 15 016145

- 16 016145

- 17 016145

- 18 016145

- 19 016145

- 20 016145

- 21 016145

- 22 016145

ΝΜθ

К другим частным вариантам реализации настоящего изобретения относятся без ограничения следующие соединения или их фармацевтически приемлемые соли

- 23 016145

- 24 016145

- 25 016145

- 26 016145

- 27 016145

К пригодным алкильным группам относятся алкильные группы С_1-18 с прямой и разветвленной цепью, а именно метил, этил, пропил, изопропил, трет-бутил, втор-бутил, 3-пентил, адамантил, нормобутил и 3-гексил.

К пригодным алкенильным группам относятся алкенильные группы С_2-18 с прямой и разветвленной цепью, а именно этенил, пропенил, изопропенил, бутенил, изобутенил и гексенил.

К пригодным алкенильным группам относятся алкенильные группы С_2-18, а именно этинил, пропинил, бутенил и 2-бутинил.

К пригодным циклоалкильным группам относятся циклоалкильные группы С_3-8. К типичным циклоалкильным группам относятся циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и циклогептил.

К пригодным арильным группам относятся арильные группы С6-18, а именно фенил, нафтил, фенантернил, антраценил, инденил, азуленил, бифенил, бифениленил и фторенил.

К пригодным гетероарильным группам относятся тиенил, бензо [Ь]тиенил, нафто [2,3-Ь]тиенил, тиантренил, фурил, пиранил, изобензофуранил, хроменил, ксантенил, феноксантенил, 2Н-пирролил, пирролил, имидазолил, пиразолил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, индолизинил, изоиндолил, 3Н-индолил, индолил, индазолил, пуринил, 4Н-хинолизинил, изохинолил, хинолил, фтальзинил, нафтиридинил, хинозалинил, хиннолинил, птеридинил, карбазолил, β-карболинил, фенантридинил, акридинил, перимидинил, фенантролинил, феназинил, изотиазолил, фенотиазолил, изоксазолил, фуразанил, феноксазинил, 1,4-дигидрохиноксалин-2,3-дион, 7-аминоизокумарин, пиридо[1,2-а]пиримидин-4-он, 1,2-бензоизоксазол-3-ил, бензимидазолил, 2-оксиндилол и 2-оксобензимидазолил. Если гетероарильная группа содержит атом азота в кольце, то этот атом азота может участвовать в образовании Ν-оксида, например пиридил-Ы-оксида, пиразинил-Ы-оксида, пиримидинил-Ы-оксида и других подобных соединений.

К пригодным гетероциклическим группам относятся моноциклические гетероциклические группы, такие как тетрагидрофуранил, пиранил, пиперидинил, пиперазинил, пирролидинил, имидазолидинил, имидазолинил, морфолинил, пиразолидинил, пиразолинил и другие подобные группы. К мультициклогетероциклическим группам относятся индолинил, изоиндилинил, хинуклидинил, хроманил, изохроманил, тетроноил, тетрагидроизохиниолинил, а также гетероциклические группы, сшитые с гетероарильным кольцом, например замещенный или незамещенный 5,6-дигидро-8Н-[1,2,4]триазоло[4,3А]пиразинил.

К заместителям относятся один или несколько алкилов; галоген; галогеналкил; циклоалкил; арил, замещенный или незамещенный одним или несколькими низшими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами; арилоксигруппа, замещенная или незамещенная одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами; аралкил; гетероарил, замещенный или незамещенный одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами; гетероарилоксигруппа, замещенная или незамещенная одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами; алкоксигруппа; алкилтиогруппа; арилтиогруппа; амидогруппа; аминогруппа; аминоалкил; алкиламиногруппа; ацилоксигруппа; арилацилоксигруппа, замещенная или незамещенная одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами; дифенилфосфенилоксигруппа, замещенная или незамещенная одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами; гетероциклическая группа, замещенная или незамещенная одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами, аминокислотнозамещенными сульфонилами, сульфонилами, замещенными производными аминокислот; гетероциклоацил, замещенный или незамещенный одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами; гетероциклоалкоксигруппа, замещенная или незамещенная одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами; частично ненасыщенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами; частично ненасыщенная гетероциклоалкилоксигруппа, замещенная или незамещенная одним или несколькими алкилами, низшими алкоксигруппами, метилендиоксигруппами, галогенами, галогеналкилами, аминосульфонилами, арилами или гетероарилами.

Определенные соединения настоящего изобретения могут существовать в виде стереоизомеров, в том числе и оптических изомеров. Изобретение включает все стереоизомеры как чистые отдельные препараты стереоизомеров, так и обогащенные каждым изомером препараты, а также рацемические смеси таких стереоизомеров и отдельные энантиомеры, которые можно разделить хорошо известными специалистам способами.

- 28 016145

Соединения и способы настоящего изобретения становятся более понятными при помощи следующих схем синтеза, которые иллюстрируют способы получения соединений изобретения. Исходные материалы могут быть получены в виде коммерческих препаратов или получены по способам, представленным в литературе и известным специалистам. Специалистам в данной области совершенно ясно, что соединения, о которых шла речь выше, могут быть синтезированы при замене соответствующих реагентов в синтезах, приведенных ниже.

Соединения, имеющие общую структуру, соответствующую формуле X, синтезируются с использованием асимметрического 1,3-диполярного циклоприсоединения в качестве ключевого этапа (схема 1). Схема 1

Реагенты и условия: а) СН₂С1₂-СН₂-СН₃СИ, КР-Л1₂О₃, микроволны или орошение метанолом, пиперидином; Ь) молекулярные сита 4А, толуен, 70°С; с) амин, г.1.; б) РЬ(ОЛе)₄, СН₂-С1₂-МеОН (1:1), 0°С или аммония церия(1У) нитрат (САИ), СН₃СИ, К₂СО₃, Γ.ΐ.

Один из аспектов изобретения имеет отношение к способам получения ингибитора МЭМ2. В одном из вариантов реализации изобретения оно имеет отношение к способам получения соединения с формулой X, представленным:

а) конденсированием соединения с формулой 1 и соединения с формулой 2, например, в растворителе или смеси растворителей (например, СН₂С1₂ и СИ₃СИ) в присутствии микроволн и катализатора (например, КР-Л1₂О₃) или в присутствии основания в подходящем растворителе, что приводит к образованию соединения с формулой 3;

2 3

Ь) конденсированием соединения с формулой 3, соединения с формулой 4 и соединения с формулой 5, например, в неполярном растворителе (например, толуене) в присутствии дегидратирующего агента (например, молекулярного сита 4А) при повышенной температуре (например, около 70°С), что приводит к образованию соединения с формулой 6; и

4 5 6

с) обработкой соединения с формулой 6 окислителем (например, РЬ(ОАс)₄, аммония серия нитратом) в растворителе или смеси растворителей (например, СН₂С1₂ и МеОН, СН₃СИ) при подходящей температуре (например, около 0°С или комнатная температура), что приводит к образованию соединения с формулой X.

- 29 016145

Важным аспектом настоящего изобретения является то, что соединения, соответствующие формуле Χ, индуцируют остановку клеточного цикла и/или апоптоз, а также потенцируют индукцию остановки клеточного цикла и/или апоптоза сами по себе или в сочетании с дополнительными сигналами, индуцирующими апоптоз. Следовательно, можно предположить, что эти соединения увеличивают чувствительность клеток к индукции остановки клеточного цикла и/или апоптоза, в том числе и клеток, резистентных к таким индуцирующим стимулам. Ингибиторы взаимодействия р53 или р53-связанных белков и ΜΌΜ2 или Μ^Μ2-связанных белков, которые представлены в настоящем изобретении, могут использоваться для индукции апоптоза при каком-либо заболевании, которое можно лечить, уменьшать проявления или предотвращать при помощи индукции апоптоза. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения ингибиторы могут использоваться для индукции апоптоза в клетках с функциональными р53 или р53-связанными белками.

В другом варианте реализации настоящего изобретения оно имеет отношение к модуляции состояний, связанных с апоптозом, при помощи одного или нескольких апоптозмодулирующих агентов. К примерам апоптозмодулирующих агентов относятся Ра§/СИ95, ΤΚΑΜΡ, ΤΝΡ ΚΙ, ИВ1, ИВ2, ИВ3, ИВ4, ИВ5, ИВ6, РАИИ, ΡΙΚ, ΤΝΡα, лиганд Рак, ТКЛ1Ь, антитела к ТКЛ1Ь-К1 или ТКЛ1Ь-К2, В1с-2, р53, ΒΑΧ, ВАИ, Ак1. САИ, киназа ΡΙ3, ΡΡ1 и каспазные белки, а также другие соединения. Сюда также относятся и другие агенты, вовлеченные в фазы апоптоза: инициации, эффекторную и деградации. К примерам апоптозмодулирующих агентов относятся агенты, активность, присутствие или изменение концентрации которых может модулировать процесс апоптоза в организме субъекта. К апоптозмодулирующим агентам относятся агенты, являющиеся индукторами апоптоза, такие как ΤΝΡ или ΤΝΡ-связанные лиганды, в частности лиганд ΤΚΑΜΡ, лиганд Рак/СИ95, лиганд ΤΝΡΒ-1, или ΤΒΑΙΕ.

В некоторых вариантах реализации изобретения соединения и способы настоящего изобретения используются для лечения пораженных клеток, тканей и органов, патологических состояний и/или заболеваний у животных (например, млекопитающих). В этом отношении способы и соединения настоящего изобретения могут быть использованы для лечения и профилактики различных заболеваний и патологических состояний. К примерам таких заболеваний относятся рак молочной железы, рак простаты, лимфома, рак кожи, рак поджелудочной железы, рак толстой кишки, меланома, злокачественная меланома, рак яичников, опухоль мозга, первичная опухоль мозга, опухоли головы и шеи, глиома, глиобластома, рак печени, рак мочевого пузыря, немелкоклеточный рак легких, карцинома головы и шеи, карцинома молочной железы, карцинома яичников, карцинома легких, мелкоклеточная карцинома легких, опухоль Вильмса, карцинома шейки матки, карцинома яичек, карцинома мочевого пузыря, карцинома поджелудочной железы, карцинома желудка, карцинома толстого кишечника, карцинома простаты, карцинома мочеполовой системы, карцинома щитовидной железы, карцинома пищевода, миелома, множественная миелома, карцинома надпочечников, почечноклеточная карцинома, эндометриальная карцинома, карцинома коркового вещества надпочечников, злокачественная инсулинома поджелудочной железы, злокачественный карциноид, хориокарцинома, грибовидный микоз, злокачественная гипрекальцемия, гиперплазия шейки матки, лейкемия (лейкоз), хронический миелогенный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, острый гранулоцитарный лейкоз, волосатоклеточный лейкоз, нейробластома, рабдомиосаркома, саркома Капоши, истинная полицитемия, эссенциальный тромбоцитоз, болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома, саркома мягких тканей, первичная макроглобулинемия, ретинобластома и другие подобные заболевания, Τ- и В-клеточно-опосредованные аутоиммунные заболевания; воспалительные заболевания; инфекции; гиперпролиферативные заболевания; СПИД; дегенеративные состояния; сосудистые заболевания и другие подобные заболевания. В некоторых вариантах реализации изобретения опухолевые клетки, на которые направлено лечение, являются метастатическими клетками. В других вариантах реализации изобретения опухолевые клетки, на которые направлено лечение, резистентны к противоопухолевым препаратам.

В некоторых вариантах реализации изобретения к инфекциям, которые можно лечить при помощи соединений и способов, представленных в настоящем изобретении, относятся инфекции, вызываемые вирусами, бактериями, грибами, микоплазмами, прионами и другими агентами.

В некоторых вариантах реализации изобретения представлены способы применения эффективного количества соединения с формулой Χ и по меньшей мере одного дополнительного лекарственного препарата (к которым относятся химиотерапевтические противоопухолевые препараты, апоптозмодули- 30 016145 рующие препараты, противомикробные препараты, противовирусные, противогрибковые и противовоспалительные препараты) и/или способа лечения (например, хирургического вмешательства и/или лучевой терапии).

Для использования в рамках способов, представленных в настоящем изобретении, предполагается использование определенного числа соответствующих противоопухолевых препаратов. Настоящее изобретение предполагает использование различных противоопухолевых препаратов, таких как препараты, индуцирующие апоптоз; полинуклеотиды (например, антисмысловые, рибозимы, δί-РНК); полипептиды (например, ферменты и антитела); биологические миметики (например, госсипол или ВН3-миметики); препараты, которые связываются (например, олигомеризуются или образуют комплексное соединение) с белками семейства Вс1-2, такими как Вах; алкалоиды; алкилирующие препараты; противоопухолевые антибиотики; антиметаболиты; гормоны; соединения платины; моноклональные или поликлональные антитела (например, антитела, конъюгированные с противоопухолевыми препаратами, токсинами, дефензинами), токсины; радионуклиды; модуляторы биологического ответа (например, интерфероны (например, ΙΕΝ-α) и интерлейкины (например, ИЛ-2)); адоптивные иммунотерапевтические препараты; гематопоэтические факторы роста; препараты, которые индуцируют дифференцировку клеток опухоли (например, транс-ретиноевая кислота); реагенты генной терапии (например, реагенты антисмысловой терапии и нуклеотиды); опухолевые вакцины; ингибиторы ангиогенеза; ингибиторы протеосом; модуляторы ΝΡ-КВ; анти-СБК-соединения; ингибиторы НБАС и другие подобные соединения. К многочисленным примерам других химиотерапевтических соединений и противоопухолевых препаратов, пригодных для совместного применения с соединениями изобретения, относятся и другие соединения, известные специалистам в данной области.

В определенных вариантах реализации изобретения противоопухолевые агенты представлены агентами, которые индуцируют или стимулируют апоптоз. К агентам, которые индуцируют апоптоз, относятся облучение (например, рентгеновское облучение, гамма-облучение, УФ); факторы, связанные с фактором некроза опухоли (ΤΝΡ) (например, рецепторные белки семейства ΤΝΡ, лиганды семейства ΤΝΡ, ТКА1Ь, антитела к ЕКАШ-Ю или ТКА1Ь-К.2); ингибиторы киназ (например, ингибитор киназы рецептора эпидермального фактора роста (ЕСЕК), ингибитор киназы сосудистого фактора роста (УСЕК.), ингибитор киназы фактора роста фибробластов (ЕСЕК), ингибитор киназы рецептора фактора роста тромбоцитарного происхождения (РБСЕК), ингибиторы киназы Всг-АЫ (такие как СЬЕЕУЕС)); антисмысловые молекулы; антитела (например, НЕКСЕРТГЫ, ΚΙΤυΧΛΝ. ΖΕΥΛΕΙΝ. ΛΥΛ^ΤΙΝ); антиэстрогенные препараты (например, ралоксифен и тамоксифен); антиандрогенные препараты (например, флютамид, бикалютамид, финастерид, аминоглтенамид, кетоконазол и кортикостероиды); ингибиторы циклооксигеназы2 (ЦОГ-2) (например, целекоксиб, мелоксикам, Ν8-398, нестероидные противовоспалительные препараты (НСПВП)); противовоспалительные препараты (например, бутазолидин, БЕС'АБКОН ^Ε^ΤА§ΟNΕ, дексаметазон, дексаметазона интенсол, БЕХО№, НЕХАБКОЬ, гидроксихлорохин, МЕ’ПСОК’ГЕ^, ОКАБЕХОН ОКА8О№, оксифенбутазон, РЕБ1АРКЕБ, фенилбутазон, РЬАриЕМЬ, преднизолон, преднизон, РКЕЬО№, ΤΕN^ΕАΚI^) и противоопухолевые химиотерапевтические препараты (например, иринотекан (САМРО8ΤАΚ), СРΤ-11, флюдарабин (ЕЬиБАКА), дакарбазин (БЛС), дексаметазон, митоксантрон, МΥ^ОΤАΚС, УР-16, цисплатин, карбоплатин, оксаплатин, 5-фторурацил, доксорубицин, гемцитабин, бортезомиб, гефитиниб, бевацизумаб, ΤАXОΤΕΚ или ΤАXО^); клеточные сигнальные молекулы; керамиды и цитокины; стауроспорин и другие подобные соединения.

В других вариантах реализации изобретения способы и соединения, представленные в настоящем изобретении, представлены соединением с формулой Χ и по меньшей мере одним из следующих антипролиферативных или противоопухолевых препаратов: алкилирующих агентов, антиметаболитов и продуктов естественного происхождения (например, соединений, полученных из трав, растений и/или от животных).

К алкилирующим агентам, подходящим для применения в способах настоящего изобретения, относятся следующие препараты: 1) нитроген мустард (например, мехлорэтамин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан (Ь-сарколизин); хлорамбуцил), 2) этиленимины и метилмеламины (например, гексаметилмеламин и тиотепа); 3) алкилсульфонаты (например, бусульфан); 4) нитрозомочевина (например, кармустин (ВСNυ); ломустин (ΟΟΝυ); семустин (метил-ССNυ); стрептозоцин (стрептозотоцин)) и 5) триазены (например, дакарбазин (БНС; диметилтриазеноимид-азолкарбоксамид).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения к примерам антиметаболитов, подходящих для использования в способах настоящего исследования, являются следующие соединения: 1) аналоги фолиевой кислоты (например, метотрексат (аметоптерин)); аналоги пиримидина (например, фторурацил (5-фторурацил; 5-ЕИ)), фторидин (фтород-оксиуридин; ЕиФК), цитарабин (цитозина арабинозид)); а также 3) аналоги пурина (например, меркаптопурин (6-меркаптопурин; 6-МР), тиогуанин (6тиогуанин, ΤΟ), пентостатин (2'-деоксикоформицин)) и другие соединения.

В других вариантах реализации настоящего изобретения к примерам химиотерапевтических препаратов, подходящих для использования в способах настоящего исследования, являются следующие препараты: 1) алкалоиды винка (всегдажива) (например, винбластин (УЪВ), винкристин); 2) эпиподофиллотоксины (например, этопозид и тенипозид); 3) антибиотики (например, дактиномицин (актиномицин В),

- 31 016145 даунорубицин (дауномицин; рубидомицин), доксорубицин, блеомицин, пликамицин (митрамицин) и митомицин (митомицин С)); 4) ферменты (например, Ь-аспарагиназа); 5) модуляторы биологического ответа (например, интерферон-альфа); 6) координационные комплексы платины (например, цисплатин (цисΌΌΡ) и карбоплатин); 7) антраценедионы (например, митоксантрон); 8) замещенные мочевины (например, гидроксимочевина); 9) производные метилгидразина (например, прокарбазин (Ν-метилгидразин; ΜΙΗ)); 10) супрессоры коры надпочечников (например, митотан (ο,ρ'-ΌΌΌ) и аминоглютетимид); 11) адренокортикостероиды (например, преднизолон); 12) прогестины (например, гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат); 13) эсторгены (например, диэтилстильбэстрол и этинил эстрадиол); 14) антиэстрогены (например, тамоксифен); 15) андрогены (например, тестостерона пропионат и фтороксиместерон); 16) антиандрогены (например, флютамид); 17) аналоги гонадотропин-высвобождающего гормона (например, лейпролид) и другие препараты.

Все противоопухолевые препараты, которые обычно используются при лечении опухолей, находят свое использование в способах настоящего изобретения. Например, существует перечень противоопухолевых препаратов Управления по продуктам и лекарствам США (ϋ.8. ΕΌΑ), одобренных для использования в США. Есть также международные аналоги этого перечня. В табл. 1 представлен перечень противоопухолевых препаратов, одобренных для использования в США. Специалистам в данной области известно, что конкретные марки этих препаратов, одобренных в США, имеют одобренные показания к использованию, информацию о дозировании, данные о токсичности и т.д.

Таблица 1

Альдеслейкин (дес-аланил-1, серин-125 человеческий интерлейкин-2)	Пролейкин	Хирон Корп., Эмеривиль, Калифорния
Алемтузумаб (1§С 1 к анти-СО52-антитела)
Алитретионин (9-цис-ретиноевая кислота)
Аллопуринол (1,5-дигвдро-4Н-пиразоло[3,44]пиримидин-4-она мононатриевая соль)
Альтретамин (Ν,Ν,Ν’,Ν’,Ν”,Ν”,-Γβκε3ΜβΤΗΠ- 1,3,5-триазин-2,4,6-триамин)
Амифостин (этацэтиол, 2-((3- аминопропил)амино]-лигидрофосфат (эфир))
Анастрозол (1,3-Бензендиацетонитрил,а,а,а’,а’· тетраметил-5-( 1Н-1,2,4-триазо-1-илметил))
Мышьяка триоксид
Аспарагиназа (Ь-аспарагиновая амидогидролаза, тип ЕС-2_
Живая БЦЖ (лиофилизированный препарат аттенуированного штамма МкоЪастепшю 6ονΐ3 (бациллы Кальметта-Герена [БЦЖ], подштамм Монреаль)
Гель бексаротена
Блеомицин (цитотоксический гликопептидный антибиотик, выделяемый ЗйерЮшусез νβτίίοΐΐΐιΐδ; блеомицин Аг и блеомицин В₂)
Капецитабин (5’-деокси-5-фторо- И[(фенилокси)карбонил]-цитидин
Карбоплатин (платины диаммин[ 1,1циклобугандикарбоксилато(2-)-0,0’]-,(8Р-4-2))
Кармустин (1,3-бис-(2-хлороэтил)-1нитрозомочевина)
Кармустин и Полифероспан 20 Имплант
Цепекоксиб (как 4-[5-(4-метилфенил)-3(трифтор0метил)-1 Н-пиразол-1 ил]бензеисульфонамид)
Хлорамбуцил (4-[бис(2хлорэтил)амино]бензенбутановая кислота)
Цисплатин (РОДНеЫг)
Кладрибин (2-хлоро-2’-деокси-Ь-С-аденозин)
Циклофосфамид (2-[бис(2-хлорэгил)амино] тетрагидро-2Н-13,2-оксазафосфорин-2-оксида моногидрат)
Цитарабин (1 -Ь-О-Арабинофур аиозилцитозин,

- 32 016145

Ο₉Η_Ι3Ν₃Ο₅)
липосомальный цитарабин
Дакарбазин (5-(3,3-диметил-1 -триазено)имидазол-4-карбоксамид (ДТИК))
Дактиномицин, актиномицин Э (актиномицин, выделяемый 81тер1отусез раг/цПиз, СяВДгО,*)
Дарбепоэтин альфа (рекомбинантный белок)
Даунорубицин липосомальный ((88-цис)-8ацетил-10-[(3-амино-2,3,6-тридеокси-а-Ь-ликсо· гескопиранозил)оксил]-7,8,9,10-тетрагидро6,8,11-тригидрокси-1-метокси-5,12нафтацендиона гидрохлорид)
Даунорубицин НС1, дауномицин ((18,38)-3ацетил-1,2,3,4,6,11-гексагидро-3,5,12тригидрокси-10-метокси-6,11 -диоксо-1 нафтаценил-3-амино-2,3,6-тридеокси-(алъфа)-Ьликсо-гексапиранозидагидрохлорид
Денилейкина дифтитокс (рекомбинантный белок)
Дексразоксан ((8)-4,4’-(1-метил-1,2этанедиил)бис-2,6-пиперазиндион)

К противоопухолевым препаратам, кроме того, относятся соединения, которые, как известно, обладают противоопухолевой активностью, но в настоящее время или не одобрены для использования Управлением по продуктам и лекарствам США либо аналогичными агентствами, или исследуются. К примерам таких соединений относятся 3-АР, 12-О-тетрадеканоил-форбол-13-ацетат, 17 ААС, 852А, ΑΒΙ007, АВИ-217620, АВТ-751, АО1-РЕС 20, АЕ-941, АС-0123736, АСИО100, аланозин, АМС 706, антитело С250, антинеопластоны, АР23573, апазихион, АРС8015, атипримод, АТЫ-161, атрасентен, азацитидин, ВВ-10901, ВСХ-1777, бевацизумаб, ВС00001, бикалютамид, ВМ8 247550, бортезомиб, бриостатин-1, бусерелин, кальцитриол, СС1-779, СОВ-2941, цефиксим, цетуксимаб, СС0070, циленгитин, клофарабин, комбретастатин А4 фосфат, СР-675,206, СР-724,714, СрС 7909, куркумин, децитабин, ИЕЫ8РМ, доксеркальциферол, Е7070, Е7389, эктеинасцидин 743, эфапроксирал, эфлорнитин, ЕКВ-569, энзастаурин, эрлотиниб, эксисулинд, фенретидин, флавопиридол, флюдарабин, флютамид, фотемустин, ГИ901228, С17ИТ, галиксимаб, гефитиниб, генистеин, глюфосфамид, СТ1-2040, гистрелин, ΗΚΙ-272, гомогаррингтонин, Н8РРС-96, Ни14.18-интерлейкин-2-сшитый белок, НиМах-СО4, илопрост, имиквимод, инфликсимаб, интерлейкин-12, 1Р1-504, ирофульвен, иксабепилон, лапатиниб, леналидомид, лестауртиниб, лейпролид, ЬМВ-9 иммунотоксин, лонафарниб, линуликсимаб, мафосфамид, МВ07133, МОХ-010, ΜΓΝ-010, моноклональное антитело 3Р8, моноклональное антитело 1591, мотексафин, М8-275, МУА-МиС1-Ш2, нилутамид, нитрокампотецин, нолатрекседа дигидрохлорид, нолвадекс, N8-9, О6-бензилгуанин, облимерсен-натрий, ΟΝΥΧ-015, ореговомаб, Ο8Ι-774, панитумумаб, параплатин, РЭ-0325901, пеметрексед, РНУ906, пиоглитазон, пирфенодин, пикаснтрон, Р8-341, Р8С 833, РХО101, пиразолоакридин, И115777, ИА0001, ранпирназа, аналог ребеккамицина, белок гРиАнгиостатин, гРиМаб 2С4, росиглитазон, рубитекан, 8-1, 8-8184, сатраплатин, 8В-, 15992, 8СЫ-0010, 8СЫ-40, сорафениб, 8И31747А, 8Т1571, 8И011248, собероиланилидгидроксамовая кислота, сурамин, талабостат, талампанел, тариквидар, темсиролимус, ТОРа-РЕ38-иммунотоксин, талидомид, тимальфасин, типифамиб, тирапазимин, ТБК286, трабектедин, триметрексата глюкуронат, ТгоУах, ИСЫ-1, вальпроевая кислота, винфлумин, УЫР40101М, волоциксимаб, вориностат, УХ-680, ΖΏ1839, ΖΏ6474, зилеутон и зосиквидара тригидрохлорид.

Более подробное описание противоопухолевых препаратов и других лекарственных препаратов содержится в справочных руководствах, к примерам которых относится РРуыиап'з Иезк ИеГегепсе и РРагшасеи!1са1 Ваыз оГ ТРегареиРсз Гудмана и Гилмана (СооРшап апР СПшап), 10 изд., Ейз. НаРгшап е! а1., 2002.

Соединения с формулой X могут применяться вместе с лучевой терапией. Изобретение не ограничено видами, дозами и системами доставки терапевтической дозы облучения животному. Например, животное может получать фотонную терапию, лучевую терапию пучком частиц, другие виды лучевой терапии и их комбинации. В некоторых вариантах реализации изобретения облучение доставляется животному при помощи линейного ускорителя. В некоторых вариантах реализации изобретения облучение доставляется при помощи гамма-ножа.

Источник облучения может быть наружным или внутренним по отношению к самому животному. Чаще всего применяется наружная лучевая терапия. К этому виду лечения относится направление высокоэнергетического пучка облучения на область опухоли через поверхность кожи с помощью, например, линейного ускорителя. Хотя пучок облучения локализован в области опухоли, все же практически невозможно избежать облучения нормальных, здоровых тканей. Тем не менее, наружное облучение, как правило, хорошо переносится животными. Внутреннее облучение включает имплантацию источника, испускающего облучение, например шариков, проволок, пеллетов, капсул, частиц и т. д., в организм в

- 33 016145 опухоль или вблизи нее. К этому виду терапии относится использование систем доставки облучения, которые специфически воздействуют на опухолевые клетки (например, использование частиц, прикрепленных к лигандам, связывающимся с раковыми клетками). Такие имплантанты могут быть удалены после окончания лечения или же оставлены в неактивном виде внутри организма. К видам внутреннего облучения относятся брахитерапия, интерстициальная иррадиация, внутриполостная иррадиация, радиоиммунотерапия, а также другие подобные способы терапии.

Животное может получать или не получать радиосенситизаторы (например, метронидазол, мисонидазол, внутриартериальный Вийг, внутривенный иододеоксиуридин (1ийК), нитоимидазол, 5замещенные-4-нитроимидазолы, 2Н-изоиндоледионы, [[(2-бромоэтил)амино]метил]нитро-1Н-имидазол1-этанол, производные нитроанилина, ДНК-аффинные гипоксические селекстивные цитотоксины, галогенированные лиганды ДНК, 1,2,4-бензотриазиноксиды, производные 2-нитроимидазола, фторсодержащие нитроазольные производные, бензамид, никотинамид, акридин-интеркалатор, производные тиотретазола, 3-нитро-1.2,4-триазол, производные 4,5-динитроимидазола, гидроксилированные тексафрины, цисплатин, митомицин, тирипазамин, нитрозомочевина, мераптопурин, метотрексат, фтороурацил, блеомицин, винкристин, карбоплатин, эпирубицин, боксорубицин, циклофосфамид, виндезин, этопозид, паклитаксел, тепло (гипертермия), а также другие подобные радиосенситизаторы), радиопротекторы (например, цистеамин, аминоалкилдигидрофосфоротиоаты, амифостин (XV К 2721), ИЛ-1, ИЛ-6 и другие подобные соединения). Радиосенситизаторы повышают эффективность уничтожения опухолевых клеток. Радиопротекторы защищают здоровые ткани от вредного воздействия облучения.

Животных можно подвергать воздействию облучения любого вида, если доза этого облучения переносится животным без неприемлемых отрицательных побочных эффектов. К подходящим видам лучевой терапии относятся, например, ионизирующая (электромагнитная) лучевая терапия (например, рентгеновские лучи или гамма-лучи) или лучевая терапия пучком частиц (например, облучение высоких линейных энергий). Ионизирующее облучение - это облучение, которое представлено частицами или фотонами с энергией, достаточной для ионизации, т.е. для потери или присоединения электронов (как это описано, например, в патенте И.8. 5770581 для справочных целей, полностью включенном в настоящее сообщение). Воздействие облучения может, по меньшей мере, частично контролироваться врачом. В одном из вариантов реализации настоящего изобретения доза облучения разделена на фракции для максимальной экспозиции целевых клеток и уменьшения токсичности.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения общая доза облучения, направленного на животное, составляет примерно от 0,01 Грей (Гр) до 100 Гр. В другом варианте реализации изобретения доза составляет примерно от 10 до 65 Гр (например, около 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 или 60 Гр), т.е. это общая доза за весь курс лечения. Хотя в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения полная доза облучения может применяться в течение всего дня, лучше всего, чтобы общая доза была разделена на фракции и излучена в течение нескольких дней. Желательно, чтобы лучевая терапия назначалась на курс по меньшей мере из трех дней, например на курс из 5, 7, 14, 17, 21, 25, 28, 32, 35, 38, 42, 46, 52 или 56 дней (около 1-8 недель). В соответствии с этим дневная доза облучения составит примерно 1-5 Гр (например, около 1, 1,5, 1,8, 2, 2,5, 2,8, 3, 3,2, 3,5, 3,8, 4, 4,2 или 4,5 Гр) или 1-2 Гр (например, 1,5-2 Гр). Ежедневная доза облучения должна быть достаточной, чтобы вызвать разрушение целевых клеток. В течение всего периода лечения в одном из вариантов реализации изобретения облучение не применяется ежедневно, предоставляя тем самым животному отдых и позволяя проявиться эффектам терапии. Например, облучение желательно применяется в течение 5 последовательных дней, затем не применяется в течение 2 дней на каждую неделю терапии, тем самым оставляя 2 дня в неделю для отдыха. Как бы то ни было, облучение может применяться 1 день в неделю, 2 дня в неделю, 3 дня в неделю, 4 дня в неделю, 5 дней в неделю, 6 дней в неделю, 7 дней в неделю, в зависимости от ответа животного на терапию и развития серьезных побочных эффектов. Лучевая терапия может быть начата в любое время всего периода лечения заболевания. В одном из вариантов реализации изобретения облучение было начато на 1 или 2 неделе и применялось в течение 1-6 или 2-6 недель периода лечения заболевания. Например, облучение применяется на 1-6 или 2-6 неделях периода лечения заболевания, составляющего 6 недель при лечении, например, солидной опухоли. Или же облучение применяется на 1-5 или 2-5 неделях периода лечения заболевания, составляющего 5 недель. Тем не менее, настоящее изобретение не ограничено этими примерами применения лучевой терапии.

Противомикробные лекарственные препараты также могут быть использованы в качестве лекарственных препаратов в настоящем исследовании. Любой препарат, который может уничтожать, подавлять, ослаблять функции микробов, может быть использован в данном изобретении, равно как любой препарат, который, как предполагается, обладает такой активностью. К противомикробным препаратам относятся природные и синтетические антибиотики, антитела, ингибиторные белки (например, дефензины), антисмысловые нуклеиновые кислоты, агенты, разрушающие мембраны и другие препараты, по отдельности и в сочетаниях. Так, может быть использован любой антибиотик, а также антибактериальные, противовирусные, противогрибковые и другие препараты.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение с формулой X и один или несколько лекарственных препаратов (или противоопухолевых препаратов) применяются у животных

- 34 016145 при одном или нескольких следующих условиях: с различной периодичностью, с различной длительностью, в различных концентрациях, различными способами введения и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение применяется перед лекарственным (противоопухолевым) препаратом, например, за 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 или 18 ч, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней, 1, 2, 3 или 4 недели до применения лекарственного (противоопухолевого) препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение применяется после лекарственного (противоопухолевого) препарата, например, через 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 или 18 ч, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 дней, 1, 2, 3, или 4 недели после применения лекарственного (противоопухолевого) препарата. В некоторых вариантах реализации изобретения соединение применяется одновременно с лекарственным (противоопухолевым) препаратом, но по различным схемам назначения, например соединение применяется ежедневно, тогда как лекарственный (противоопухолевый) препарат применяется один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели или один раз в четыре недели. В других вариантах реализации изобретения соединение применяется один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели или один раз в четыре недели.

Сочетания в рамках настоящего изобретения включают все сочетания, в которых соединения настоящего изобретения содержатся в количествах, эффективных для достижения заданной цели. Индивидуальные потребности варьируют, поэтому определение оптимального диапазона эффективных количеств каждого компонента осуществляется компетентными в данной области специалистами. Как правило, соединения могут применяться у млекопитающих, например людей, перорально в дозах примерно от 0,0025 до 50 мг/кг или в эквивалентных количествах фармакологически приемлемых солей этих соединений, в день - для лечения нарушений, вызванных индукцией апоптоза. В одном из вариантов реализации изобретения для лечения, уменьшения проявлений и профилактики таких нарушений перорально применяется примерно от 0,01 до 25 мг/кг этого соединения. Доза для внутримышечного введения составляет около половины пероральной дозы. Например, соответствующая внутримышечная доза составит примерно от 0,0025 до 25 мг/кг или примерно от 0,01 до 5 мг/кг.

Стандартная пероральная доза составляет примерно от 0,01 до 1000 мг, например примерно от 0,1 до 100 мг соединения. Стандартная доза может применяться один или большее число раз в день, как одна или большее число таблеток или капсул, каждая из которых содержит примерно от 0,1 до 10 мг или около 0,25 до 50 мг соединения или его сольвата.

В препарате для местного применения соединение может присутствовать в концентрации от 0,01 до 100 мг на 1 г носителя. В одном из вариантов реализации изобретения соединение присутствует в концентрации около 0,07-1,0 мг/мл, например около 0,1-0,5 мг/мл, а в одном варианте реализации изобретения - около 0,4 мг/мл.

В дополнение к применению соединения как сырьевого препарата соединения изобретения могут применяться в качестве части лекарственного препарата, содержащего подходящие фармакологически приемлемые носители, которые представляют собой формообразующие и вспомогательные вещества, которые облегают превращение соединений в препараты, предназначенные для фармацевтического использования. Препараты, особенно препараты, которые применяются перорально или местно и которые могут применяться только по одному из путей назначения, такие как таблетки, драже, леденцы замедленного высвобождения и капсулы, жидкость для полоскания и промывания рта, жидкие суспензии, ополаскиватель волос, гель для волос, шампунь, а также препараты, которые можно применять ректально, такие как суппозитории, а также подходящие растворы для применения в виде внутривенной инфузии, инъекции, местного или перорального применения, которые содержат примерно от 0,01 до 99%, а в одном из вариантов изобретения - около 0,25 до 75% активного соединения, а также формообразующего вещества.

Фармацевтические композиции изобретения могут применяться у всех животных, у которых это может принести определенную пользу. Животные, прежде всего, - это млекопитающие, например человек, хотя изобретение не ограничено этим видом. К другим животным относятся ветеринарные животные (коровы, овцы, свиньи, лошади, собаки и другие животные).

Соединения и фармацевтические композиции изобретения могут применяться любыми путями, приводящими к достижению целевого эффекта. Например, применение может быть парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, чрезкожным, буккальным, интратекальным, внутричерепным, интраназальным или местным. Вместе с этим применение препарата может быть и пероральным. Назначенная доза будет зависеть от возраста, состояния здоровья, веса реципиента, вида сопутствующего лечения, кратности приема препарата и желаемого эффекта.

Фармацевтическое препараты настоящего изобретения производятся по известным технологиям, например при помощи смешивания, гранулирования, формирования драже, растворения, лиофилизации. Таким образом, фармацевтические препараты для перорального применения могут быть получены при сочетании активных соединений с твердыми формообразующими компонентами, возможном измельчении полученной смеси и обработке смеси гранул, затем добавлении подходящих вспомогательных веществ, при необходимости, что приводит к получению таблеток или сердцевин для драже.

К подходящим формообразующим веществам, в частности, относятся наполнители в виде сахаридов, например лактозы или сахарозы, маннитол или сорбитол, препараты целлюлозы и/или фосфаты

- 35 016145 кальция, например трикальция фосфат или кальция гидрофосфат, а также такие связывающие вещества, как крахмальный клей из кукурузного, пшеничного, рисового, картофельного крахмала, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и/или поливинилпирролидон. При желании могут быть добавлены препараты, способствующие распаду, такие как вышеупомянутые крахмалы, карбоксиметилкрахмал, поперечно-связанный поливинилпирролидон, агар, алгриновая кислота или ее соль, например алгринат натрия. К вспомогательным веществам, прежде всего, относятся агенты, регулирующие поток препарата, и смазочные вещества, такие как кремнезем, тальк, стеаровая кислота или ее соль, например стеарат магния или стеарат кальция, полиэтиленгликоль. Сердцевины драже покрываются подходящими оболочками, которые при желании могут быть устойчивыми к действию желудочного сока. Для этих целей могут быть использованы концентрированные растворы сахаридов, которые могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лакировочные растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Для получения оболочки, устойчивой к действию желудочного сока, используются растворы подходящих препаратов целлюлозы, такие как ацетилцеллюлозы фталат или гидроксипропилметилцеллюлозы фталат. В таблетки или оболочки драже могут быть добавлены красители или пигменты, например, для идентификации лекарственной формы или для характеристики комбинации доз активных соединений.

К другим фармацевтическим препаратам, которые могут применяться перорально, относятся заполненные желатиновые капсулы, а также мягкие капсулы, сделанные из желатина с пластификатором, такие как глицерол или сорбитол. Такие заполненные капсулы могут содержать активное соединение в форме гранул, смешанных с такими наполнителями, как лактоза, связывающими веществами, такими как крахмалы, и/или смазочными веществами, такими как тальк или магния стеарат, а также со стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения в одном из вариантов реализации изобретения растворены или суспензированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла или жидкий парафин. В дополнение к этому могут быть добавлены стабилизаторы.

Возможные фармацевтические препараты для ректального применения могут включать, например, суппозитории, которые включают один или нескольких активных компонентов и суппозиторной основы. Подходящими суппозиторными основами, например, являются природные или синтетические триглицериды, парафиновые углеводороды. В дополнение к этому также возможно применение желатиновых ректальных капсул, которые состоят из комбинации активных соединений и определенной основы, к возможным материалам основы относятся, например, жидкие триглицериды, полиметиленгликоли, парафиновые углеводороды.

Подходящими лекарственными формами для парентерального применения являются водные растворы активных соединений в водорастворимой форме, например водорастворимые соли и щелочные растворы. В дополнение к этому могут использоваться масляные инъекционные суспензии. Подходящими липофильными растворителями или носителями являются жирные кислоты, например сезамовое масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицерид полиэтиленгликоля400. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, например натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбитол и/или декстран. Кроме того, суспензия также может содержать стабилизаторы.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения композиции для местного применения представлены маслами, кремами, лосьонами, мазями и т.д. в зависимости от соответствующего носителя. К подходящим носителям относятся растительные или минеральные масла, белый вазелин (белый мягкий парафин), жиры или масла с разветвленной цепью, животные жиры и высокомолекулярные спирты (выше С₁₂). В носителях может растворяться активное соединение. Также в состав этих препаратов могут включаться эмульгаторы, стабилизаторы, гигроскопические вещества, антиоксиданты, а также агенты, которые придают препарату цвет или запах. Кроме того, в препаратах для местного применения могут использоваться усилители чрезкожного проникновения. К примерам таких усилителей относятся соединения, описанные в патентах США №№ 3989816 и 4444762.

Кремы могут получаться при смешивании минерального масла, самоэмульгирующегося пчелиного воска и воды, к которой добавляется активный ингредиент, растворенный в малом количестве такого масла, как миндальное. Типичным примером такого крема является крем, который состоит из 40 ч. воды, примерно 20 ч. пчелиного воска, 40 ч. минерального масла и примерно 1 ч. миндального масла.

Мази могут получаться при смешивании раствора активного ингредиента в растительном масле, таком как миндальное, с теплым мягким парафином и с последующим охлаждением. Типичный пример такой мази состоит примерно из 30 мас.% миндального масла и примерно 70 мас.% белого мягкого парафина.

Лосьоны могут получаться при растворении активного ингредиента в подходящем высокомолекулярном спирте, таком как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Следующие примеры иллюстрируют способы и композиции настоящего изобретения, хотя изобретение не ограничено этими примерами. Другие подходящие модификации и адаптации различных условий и параметров, которые обычно встречаются в клинической практике и являются хорошо знакомыми

- 36 016145 специалистам в данной области, также находятся в рамках настоящего изобретения. Пример 1. 6-Хлоро-4'-(3-хлорофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид

'|| ЯМР (300 МГц, С1ЯО11): δ 7.70 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.40-7.20 (т, 3Н), 7.09 (т, 1Н), 6.88 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.22 (б, 1Н, 1=11.4 Гц), 4,39 (т, 1Н), 4.11 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 3.65-3.32 (т, 1Н), 1.85 (т, 1Н), 1.60 (т, 1Н), 1.41 (т, 1Н), 1.19 (т, 1Н), 0.84 (б, 9Н).

Пример 2.

6-Хлоро-4'-(3-хлорофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2,3-дигидроксипропил)амид

'Н ЯМР (300 МГц, СЭ₃ОН): δ 7.74 (б, 1Н, 1=7.5 Гц), 7.35-7.15 (т, 3Н), 7.11 (т, 1Н), 6.88 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.22 (б, 1Н, 1=11.4 Гц), 4.33 (т, 1Н), 4.28 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 3.67 (т, 2Н), 3.65-3.32 (т, 1Н), 2.05 (т, 1Н), 1.90 (т, 1Н), 1.56 (т, 1Н), 0.87 (б, 9Н).

Пример 3. 6-Хлоро-4'-(3-хлорофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,5-дигидроксипентил)амид

'|| ЯМР (300 МГц, СЭ₃ОН): δ 7.72 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.35-7.15 (т, 3Н), 7.10 (т, 1Н), 6.88 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 6.88 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.23 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.65 (т, 1Н), 4.13 (б, 1Н, 1=11.4 Гц), 3.61 (т, 2Н), 3.65-3.32 (т, 5Н), 2.02 (т, 1Н), 1.93 (т, 1Н), 1.56 (т, 3Н), 1.15 (т, 1Н), 0.92 (б, 9Н).

Пример 4.

6-Хлоро-4'-(3-хлорофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты [2-(3-дигидроксициклопентил)этил]амид

'|| ЯМР (300 МГц, СО₃ОН): δ 7.69 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.40-7.20 (т, 3Н), 7.10 (т, 1Н), 6.86 (т, 1Н),

5.24 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.35 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 4.09 (т, 1Н), 3.61-3.32 (т, 2Н), 2.96 (т, 1Н), 2.21-1.12 (т, 11Н), 0.85 (б, 9Н).

Пример 5.

- 37 016145

Ή ЯМР (300 МГц, СО₃ОН): δ 7.69 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.40-7.20 (т, 3Н), 7.10 (т, 1Н), 6.86 (т, 1Н),

5.24 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.48 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 4.12 (т, 1Н), 3.64-3.32 (т, 2Н), 2.96 (т, 1Н), 2.20-1.10 (т, 11Н), 0.85 (8, 9Н).

Пример 6.

5.24 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.47 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 4.11 (т, 1Н), 3.65-3.32 (т, 2Н), 2.96 (т, 1Н), 2.20-1.10 (т, 11Н), 0.91 (8, 9Н).

Пример 7.

Ή ЯМР (300 МГц, СО₃ОН): δ 7.72 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.38-7.22 (т, 3Н), 7.10 (т, 1Н), 6.87 (т, 1Н),

5.23 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.48 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 4.12 (т, 1Н), 3.56-3.25 (т, 2Н), 2.98 (т, 1Н), 2.20-1.10 (т, 11Н), 0.86 (8, 9Н).

Пример 8.

6-Хлоро-4'-(3-хлорофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (4,5-дигидроксипентил)амид

Ή ЯМР ((1)01), 300 МГц): δ 7.73 (б, 1=8.4 Гц, 1Н), 7.41 (б, 1=7.0 Гц, 1Н), 7.14 (б, 1=6.7 Гц, 2Н),

5.25 (б, 1=11.3 Гц, 1Н), 4.49 (б, 1=6.6 Гц, 1Н), 4.15 (б, 1=6.4 Гц, 1Н), 3.48-3.10 (т, 5Н), 1.94 (бб, 1=8.1, 15.4 Гц, 1Н), 1.70-1.10 (т, 5Н), 0.92 (8, 9Н).

Пример 9.

6-Хлоро-4'-(3-хлорофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3-морфолин-4-илпропил)амид

Ή ЯМР ((1)01), 300 МГц): δ 7.82-7.19 (т, 4Н), 6.90 (б, 1=5.56, 1Н), 5.39 (б, 1=9.9 Гц, 1Н), 4.55 (б, 1=6.9 Гц, 1Н), 4.28 (б, 1=9.3 Гц, 1Н), 4.20-3.85 (т, 4Н), 3.70-3.40 (т, 2Н), 3.25-3.00 (т, 4Н), 2.20-1.85 (т,

- 38 016145

3Η), 1.69 (ά, 1=15.3 Гц, 2Η), 0.934 (8, 9Η), 0.70 (ΐ, 1=11.3 Гц, 1Η).

Пример 10.

6-Хлоро-4'-(3-хлорофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'-

Ίΐ (300 МГц С1);О1)): δ 8.56 (8 Ьг, 1Η), 7.68 (ΐ, 1=6.6 Гц, 1Η), 7.42 (ΐ, 1=7.2 Гц, 1Η), 7.25 (ΐ, 1=7.8 Гц, 1Η), 7.05 (ά, 1=8.7 Гц, 1Η), 6.95 (ά, 1=6.0 Гц, 1Η), 5.22 (ά, 1=10.5 Гц, 1Η), 4.54 (ά, 1=10.5 Гц, 1Η), 4.34-4.31 (т, 1Η), 3.51-3.49 (т, 4Η), 3.36-3.32 (т, 2Η), 2.08 (άά, 1=15.3, 7.5 Гц, 1Η), 1.53-1.49 (т, 2Η), 1.33 (άά, 1=15.3, 2.7 Гц, 1Η), 0.93-0.89 (т, 1Η), 0.86 (8, 9Η).

Пример 11

'Н (300 МГц СО₃ОП): δ 8.56 (8 Ьг, 1Η), 7.65 (ΐ, 1=6.6 Гц, 1Η), 7.45 (ΐ, 1=7.2 Гц, 1Η), 7.26 (ΐ, 1=7.8 Гц, 1Η), 7.01 (ά, 1=8.7 Гц, 1Η), 6.95 (ά, 1=6.0 Гц, 1Η), 5.14 (ά, 1=10.5 Гц, 1Η), 4.51 (ά, 1=10.5 Гц, 1Η), 4.26 (т, 1Η), 3.55-3.50 (т, 2Η), 3.37-3.31 (т, 3Η), 2.08-2.02 (т, 1Η), 1.71-1.45 (т, 2Η), 1.35-1.23 (т, 3Η), 0.86 (8, 9Η).

Пример 12. 6-Хлоро-4'-(3-хлорофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид

' Η (300 МГц, СО₃ОП): δ 8.55 (8 Ьг, 1Η), 7.66 (ΐ, 1=6.6 Гц, 1Η), 7.42 (ΐ, 1=7.8 Гц, 1Η), 7.28-7.23 (т, 2Η), 7.01 (ά, 1=8.7 Гц, 1Η), 6.95 (ά, 1=6.0 Гц, 1Η), 5.20 (ά, 1=10.5 Гц, 1Η), 4.53 (ά, 1=10.5 Гц, 1Η), 4.26 (т, 1Η), 3.52 (т, 1Η), 3.40-3.33 (т, 4Η), 2.03 (т, 1Η), 1.71-1.45 (т, 2Η), 1.35-1.28 (т, 1Η), 0.86 (8, 9Η).

Пример 13.

6-Хлоро-4'-(3-хлорофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2-морфолин-4-илэтил)амид

Ίΐ ЯМР (300 МГц, СЭ₃ОН): δ 7.74 (ά, 1Η, 1=7.5 Гц), 7.35-7.15 (т, 3Η), 7.11 (т, 1Η), 6.88 (ά, 1Η, 1=6.0 Гц), 5.22 (ά, 1Η, 1=11.4 Гц), 4.55 (ά, 1Η, 1=9.6 Гц), 4.24 (ά, 1Η, 1=6.3 Гц), 4.20-3.85 (т, 4Η), 3.70-3.40 (т, 4Η), 3.25-3.00 (т, 4Η), 2.09 (т, 1Η), 1.27 (т, 1Η), 0.934 (8, 9Η).

Пример 14.

- 39 016145

¹Н ЯМР (СИзОИ, 300 МГц): δ 7.72 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.38-7.22 (т, 3Н), 7.10 (т, 1Н), 6.87 (т, 1Н), 5.23 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.55 (б, 1=6.9 Гц, 1Н), 4.28 (б, 1=9.3 Гц, 1Н), 4.20-3.85 (т, 4Н), 3.70-3.40 (т, 2Н), 3.25-3.00 (т, 4Н), 2.20-1.85 (т, 4Н), 1.69 (б, 1=15.3 Гц, 2Н), 0.934 (8, 9Н).

Пример 15.

¹Н ЯМР (С1АО17. 300 МГц): δ 7.69 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.40-7.20 (т, 3Н), 7.10 (т, 1Н), 6.86 (т, 1Н),

5.24 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.51 (б, 1=10.5 Гц, 1Н), 4.26 (т, 1Н), 3.55-3.50 (т, 2Н), 3.37-3.31 (т, 3Н), 2.08-2.02 (т, 2Н), 1.71-1.45 (т, 2Н), 1.35-1.23 (т, 3Н), 0.86 (8, 9Н).

Пример 16.

Ή ЯМР (300 МГц, СИ₃ОН): δ 7.69 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.40-7.20 (т, 3Н), 7.10 (т, 1Н), 6.86 (т, 1Н),

5.24 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.54 (б, 1=10.5 Гц, 1Н), 4.34-4.31 (т, 1Н), 3.51-3.49 (т, 4Н), 3.36-3.32 (т, 2Н), 2.08 (бб, 1=15.3, 7.5 Гц, 1Н), 1.53-1.49 (т, 2Н), 1.33 (бб, 1=15.3, 2.7 Гц, 1Н), 0.93-0.89 (т, 1Н), 0.86 (8, 9Н).

Пример 17.

(2'К,38,38,4'К,5'К) 6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид (М-319)

Формула: С- 1Р-СМ-АОН1С1 (соль НС1).

Ή ЯМР (300 МГц, МеОИ): δ 8.44 (т, 1Н), 7.70 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.41 (т, 1Н), 7.14 (т, 2Н), 6.90 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.20 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.47 (б, 1Н, 1=8.1 Гц), 4.14 (б, 1Н, 1=10.8 Гц), 3.47 (т, 4Н), 1.91 (бб, 1Н, 1=15.6, 8.4 Гц), 1.57 (т, 1Н), 1.43 (т, 1Н), 1.21 (бб, 1Н, 1=15.6, 1.8 Гц), 0.92 (8, 9Н); ¹³С ЯМР (75 МГц, МеОИ): δ 176.28, 166.52, 157.03, 153.19, 139.65, 130.67, 129.58, 129.48, 128.46, 128.40, 124.54, 124.44, 122.58, 122.33, 121.41, 121.17, 117.21, 116.93, 113.37, 113.03, 112.41, 69.69, 66.05, 64.36, 62.93, 61.91, 55.48, 42.25, 36.99, 32.59, 29.84, 28.40.

- 40 016145

Пример 18 (М1-219)

Пример 19.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-циклопентилметил-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид (МОМ2-319-1)

'Н ЯМР (300 МГц, СОзОО): δ 7.72 (б, 1Н, 1=8.5 Гц), 7.46-7.40 (т, 1Н), 7.23-7.12 (т, 2Н), 6.88 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.12 (б, 1Н, 1=11.3 Гц), 4.39-4.35 (т, 1Н), 4.14 (б, 1Н, 1=11.3 Гц), 3.41-3.28 (т, 5Н), 1.92-1.78 (т, 2Н), 1.62-1.42 (т, 8Н), 1.28 (б, 1Н, 1=15.8 Гц), 1.10-0.90 (т, 2Н).

Пример 20 (МОМ2-319-2)

Пример 21 (МЭМ2-319-3)

Пример 22.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-циклогексил-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид (МОМ2-319-4)

'|| ЯМР (300 МГц, СО₃ОП): δ 8.54-8.40 (т, 2Н), 7.56 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.31-7.29 (т, 1Н), 7.16-7.11 (т, 2Н), 6.82 (б, 1Н, 1=6.1 Гц), 4.99-4.95 (т, 1Н), 4.21-4.01 (т, 2Н), 3.39-3.19 (т, 5Н), 2.50-2.40 (т, 1Н), 2.00-1.83 (т, 2Н), 1.63-1.54 (т, 4Н), 1.44-1.09 (т, 6Н).

- 41 016145

Пример 23 (МОМ2-319-5)

Пример 24.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты [2-(3-гидроксициклопентил)этил]амид (МЭМ2-319-6)

¹Н ЯМР (300 МГц, С1);О1)): δ 8.52-8.49 (т, 1Н), 7.72 (ά, 1Н, 1=8.5 Гц), 7.40 (ά, 1Н, 1=10.0 Гц), 7.167.15 (т, 2Н), 6.90 (ά, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.27-5.23 (т, 1Н), 4.49 (ά, 1Н, 1=8.2 Гц), 4.14-4.07 (т, 2Н), 3.24-3.22 (т, 1Н), 3.10-3.02 (т, 1Н), 1.93-1.83 (т, 2Н), 1.75-1.18 (т, 7Н), 1.05-0.93 (т, 1Н), 0.92 (к, 9Н), 0.85-0.81 (т, 1Н).

Пример 25 (М1-319-7)

Пример 26.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-циклопентил-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид (М1-319-8)

’Н ЯМР (300 МГц, СО₃ОП): δ 7.68 (ά, 1Н, 1=8.5 Гц), 7.40-7.37 (т, 1Н), 7.16-7.11 (т, 2Н), 6.86 (ά, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.15 (ά, 1Н, 1=11.6 Гц), 4.27 (ά, 1Н, 1=11.0 Гц), 4.15 (ά, 1Н, 1=11.6 Гц), 3.39-3.24 (т, 5Н), 2.30-

2.28 (т, 1Н), 2.10-2.05 (т, 1Н), 1.62-1.31 (т, 7Н), 1.15-1.12 (т, 1Н), 0.78-0.75 (т, 1Н).

Пример 27.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-5'-(4-метилпиперазин-1карбонил)-1Н-спиро[индол-3,3'-пирролидин]-2-он (М1-319-9)

’Н ЯМР (300 МГц, СО₃ОП): δ 7.73-7.70 (т, 1Н), 7.58-7.51 (т, 1Н), 7.29-7.19 (т, 2Н), 6.93-6.89 (т, 1Н), 5.83-5.80 (т, 1Н), 4.70-4.68 (т, 1Н), 4.44-4.25 (т, 2Н), 3.98-3.52 (т, 3Н), 3.36-3.22 (т, 2Н), 2.92-2.85 (т, 3Н), 2.40-1.89 (т, 2Н), 1.20 (ά, 1Н, 1=15.3 Гц), 0.95-0.90 (т, 9Н).

- 42 016145

Пример 28 (ΜΙ-319-10)

Пример 29 (ΜΙ-319-11)

Пример 30 (ΜΙ-319-11-Α)

Пример 31 (ΜΌΜ2-319-12)

Пример 32.

1'-Ацетил-6-хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид (ΜΙ-319-13)

п ¹Н ЯМР (300 МГц, СО₃С1): δ 8.08 (5, 1Н), 7.19-7.12 (т, 1Н), 6.93-6.77 (т, 4Н), 4.93 (б, 1Н, 1=10.2 Гц), 4.75 (б, 1Н, 10.2 Гц), 4.00-3.98 (т, 1Н), 3.78-3.30 (т, 5Н), 2.80-2.77 (т, 1Н), 2.23 (5, 3Н), 1.76-1.64 (т, 1Н), 1.56-1.52 (т, 2Н), 0.92 (5, 9Н).

Пример 33.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1'-окси-1,2,4',5'тетрагидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (3,4-дигидроксибутил)амид (ΜΙ-319-14)

- 43 016145

Ή ЯМР (300 МГц, СИ₃С1): δ 7.35-7.27 (т, 1Н), 7.09-7.07 (т, 1Н), 6.92-6.89 (т, 1Н), 6.79-6.75 (т, 2Н), 5.55 (й, 1Н, 1=11.0 Гц), 4.20 (й, 1Н, 1=11.0 Гц), 3.67-3.65 (т, 2Н), 3.44-3.32 (т, 3Н), 2.80 (й, 1Н, 1=13.1 Гц), 1.80 (й, 1Н, 1=13.1 Гц), 1.70-1.60 (т, 2Н), 0.84 (к, 9Н).

Пример 34. {['6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2дигидроспиро [индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбонил]амино }уксусная (ΜΙ-319-15)

Ή ЯМР (300 МГц, СИ₃ОИ): δ 7.64 (й, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.38 (й, 1Н, 1=6.2 Гц), 7.27-7.21 (т, 1Н), 7.107.07 (т, 1Н), 6.90-6.84 (т, 1Н), 5.08 (й, 1Н, 1=9.9 Гц), 4.22-3.88 (т, 4Н), 1.76-1.68 (т, 1Н), 1.12-1.06 (т, 1Н), 0.84 (к, 9Н).

Пример 35 (ΜΙ-319-16)

Пример 36.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2-имидозол-1-илэтил)амид (ΜΙ-319-17)

Ή ЯМР (300 МГц, СИ₃ОИ): δ 8.99 (к, 1Н), 7.78 (й, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.50-7.45 (т, 2Н), 7.37-7.35 (т, 1Н), 7.19-7.11 (т, 2Н), 6.89 (й, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.32 (й, 1Н, 1=11.4 Гц), 4.52 (й, 1Н, 1=6.8 Гц), 4.41-4.36 (т, 2Н),

4.19 (й, 1Н, 1=11.4 Гц), 3.73-3.31 (т, 2Н), 1.99-1.91 (т, 1Н), 1.21-1.16 (т, 1Н), 0.92 (к, 9Н).

Пример 37.

7-{[6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбонил]амино}-3,5-дигидроксигептановая кислота (ΜΙ-31918)

Ή ЯМР (300 МГц, СИ₃ОИ): δ 7.60 (й, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.37 (й, 1Н, 1=7.5 Гц), 7.08-7.06 (т, 2Н), 6.87

- 44 016145

6.84 (т, 1Н), 4.84 (б, 1Н, 1=10.2 Гц), 4.15-4.08 (т, 1Н), 4.00-3.96 (т, 2Н), 3.80-3.75 (т, 1Н), 3.36-3.32 (т, 2Н), 2.49-2.43 (т, 2Н), 1.65-1.55 (т, 6Н), 1.04 (т, 1Н), 0.92 (8, 9Н).

Пример 38.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2,3,4-тригидроксибутил)амид (М1-319-19)

Ίΐ ЯМР (300 МГц, СО₃ОП): δ 7.83-7.66 (т, 1Н), 7.30-7.10 (т, 3Н), 6.92-6.88 (т, 1Н), 5.30-5.11 (т, 1Н), 4.48-4.21 (т, 1Н), 4.15-3.95 (т, 1Н), 3.64-3.60 (т, 2Н), 3.51-3.47 (т, 2Н), 3.32-3.24 (т, 2Н), 1.95-1.88 (т, 1Н), 1.23-1.13 (т, 1Н), 0.92-0.82 (т, 9Н).

Пример 39. 6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2-гуанидиноэтил)амид (М1-319-20)

Ίΐ ЯМР (300 МГц, СО₃ОП): δ 7.69 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.39 (б, 1Н, 1=6.7 Гц), 7.14-7.04 (т, 2Н), 6.89 (б, 1Н, 1=5.8 Гц), 5.24 (б, 1Н, 1=11.3 Гц), 4.44 (б, 1Н, 1=8.0 Гц), 3.80-3.65 (т, 2Н), 3.08-3.00 (т, 2Н), 1.89-1.87 (т, 1Н), 1.71-1.64 (т, 2Н), 1.40-1.33 (т, 1Н), 0.91 (8, 9Н).

Пример 40 (М1-319-21)

Пример 41.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-5-фторо-2'-(2-метилпропенил)-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты(3,4-дигидроксибутил)амид

Ίΐ ЯМР (300 МГц, СО₃С1): δ 8.19-8.11 (т, 1Н), 7.28-7.19 (т, 3Н), 6.96-6.85 (т, 2Н), 6.68 (б, 1Н, 1=5.9 Гц), 4.97 (б, 1Н, 1=8.9 Гц), 4.60-4.55 (т, 1Н), 4.30-4.27 (т, 1Н), 3.82 (б, 1Н, 1=9.2 Гц), 3.71-3.23 (т, 4Н), 1.58-1.54 (т, 5Н), 1.46 (8, 3Н).

Пример 42.

6-Хлоро-4'-(3-хлоро-4-фторофенил)-2'-(2,2-диметилпропил)-5-фторо-2-оксо-1,2-дигидроспиро[индол-3,3'-пирролидин]-5'-карбоновой кислоты (2-уреидоэтил)амид

п

- 45 016145 '|| ЯМР (300 МГц, ΟΌ₃ΟΌ): δ 7.71 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.43 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 7.15-7.12 (т, 2Н), 6.93-

6.89 (т, 1Н), 5.19 (б, 1Н, 1=11.2 Гц), 4.48 (б, 1Н, 1=11.2 Гц), 4.16-4.13 (т, 1Н), 3.32-3.23 (т, 2Н), 2.97-2.89 (т, 2Н), 1.95-1.90 (т, 1Н), 1.57-1.53 (т, 2Н), 1.23-1.18 (т, 1Н), 0.92 (8, 9Н).

Пример 43. (2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлоро-Ы-((8)-3,4-дигидроксибутил)-5-фторо-4'-(3-фторофенил)-2'-(неопентил)-2оксоспиро[индолин-3,3'-пирролидин]-5'-карбоксамид (ΜΙ-519-1)

+ ЯМР (300 МГц, ΟΌ₃ΟΌ): δ 8.43 (т, 1Н), 7.72 (б, 1Н, 1=8.4 Гц), 7.30-7.15 (т, 1Н), 7.06 (б, 2Н, 1=8.88 Гц), 6.95 (б, 1Н, 1=7.8 Гц), 6.88 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.28 (б, 1Н, 1=11.3 Гц), 4.51-4.40 (т, 1Н), 4.16 (б, 1=11.3 Гц), 3.50-3.20 (т, 5Н), 1.93 (бб, 1Н, 1=8.3, 15.5 Гц), 1.62-1.36 (т, 2Н), 1.23-1.13 (т, 1Н), 0.92 (8, 9Н).

Пример 44. (2'К,38,4'8,5'К)-6-Хлоро-4'-(2,3-дифторофенил)-Ы-((8)-3,4-дигидроксибутил)-5-фторо-2'-(неопентил)-2-оксоспиро[индолин-3,3'-пирролидин]-5'-карбоксамид (ΜΙ-519-2)

+ ЯМР (300 МГц, ΟΌ₃ΟΌ): δ 8.47 (т, 1Н), 7.73 (б, 1Н, 1=7.2 Гц), 7.43-7.30 (т, 1Н), 7.23-7.15 (т, 2Н), 6.89 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.29 (б, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.64 (б, 1Н, 1=11.4 Гц), 4.58-4.50 (т, 1Н), 3.50-3.20 (т, 5Н), 1.93 (бб, 1Н, 1=8.3, 15.5 Гц), 1.67-1.36 (т, 2Н), 1.23-1.13 (т, 1Н), 0.92 (8, 9Н).

Пример 45.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлоро-4'-(2,3-дифторофенил)-Х-((8)-3,4-дигидроксибутил)-5-фторо-2'-(неопентил)-2-оксоспиро[индолин-3,3'-пирролидин]-5'-карбоксамид (ΜΙ-519-3)

+ ЯМР (300 МГц, ΟΌ₃ΟΌ): δ 8.43 (т, 1Н), 7.73-7.69 (т, 1Н), 7.27-7.10 (т, 2Н), 6.97-6.94 (т, 1Н),

6.90 (б, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.26-5.23 (т, 1Н), 4.49 (б, 1Н, 1=7.5 Гц), 4.16-4.13 (т, 1Н), 3.50-3.15 (т, 5Н), 1.961.88 (т, 1Н), 1.62-1.40 (т, 2Н), 1.23-1.13 (т, 1Н), 0.92 (8, 9Н).

Пример 46.

(2'К,38,4'8,5'К)-6-Хлоро-4'-(2,5-дифторофенил)-Ы-((8)-3,4-дигидроксибутил)-5-фторо-2'-(неопентил)-2-оксоспиро[индолин-3,3'-пирролидин]-5'-карбоксамид (ΜΙ-519-5)

- 46 016145

он ’Н ЯМР (300 МГц, СО₃ОП): δ 8.49 (т, 1Н), 7.71 (ά, 1Н, 1=7.2 Гц), 7.45-7.40 (т, 1Н), 7.15-7.00 (т, 2Н), 6.89 (ά, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.23 (ά, 1Н, 1=11.1 Гц), 4.63 (ά, 1Н, 1=11.4 Гц), 4.58-4.50 (т, 1Н), 3.50-3.20 (т, 5Н), 1.93 (άά, 1Н, 1=8.3, 15.5 Гц), 1.67-1.36 (т, 2Н), 1.18 (άά, 1Н, 1=1.9, 15.5 Гц), 0.92 (к, 9Н).

Пример 47.

(2'К,38,4'8,5'К)-6-Хлоро-№((8)-3,4-дигидроксибутил)-5-фторо-4'-(2-фторофенил)-2'-(неопентил)-2оксоспиро[индолин-3,3'-пирролидин]-5'-карбоксамид (М1-519-6)

’Н ЯМР (300 МГц, СО₃ОП): δ 8.43 (т, 1Н), 7.70-7.64 (т, 2Н), 7.40-7.18 (т, 2Н), 7.01-6.94 (т, 1Н), 6.85 (ά, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.25 (ά, 1Н, 1=11.3 Гц), 4.62 (ά, 1Н, 1=12 Гц), 4.55-4.52 (т, 1Н), 3.50-3.20 (т, 5Н),

1.91 (άά, 1Н, 1=8.3, 15.5 Гц), 1.62-1.32 (т, 2Н), 1.18 (άά, 1Н, 1=1.8, 15.3 Гц), 0.92 (к, 9Н).

Пример 48.

(2'К,38,4'К,5'К)-6-Хлоро-№((8)-3,4-дигидроксибутил)-5-фторо-4'-(4-фторофенил)-2'-(неопентил)-2оксоспиро[индолин-3,3'-пирролидин]-5'-карбоксамид (М1-519-7)

’Н ЯМР (300 МГц, СО₃ОП): δ 8.39 (т, 1Н), 7.70 (ά, 1Н, 1=8.5 Гц), 7.25-7.21 (т, 2Н), 7.03-6.96 (т, 2Н), 6.87 (ά, 1Н, 1=6.0 Гц), 5.26 (ά, 1Н, 1=11.3 Гц), 4.48 (т, 1Н,), 4.12 (ά, 1=11.4 Гц), 3.50-3.20 (т, 5Н), 1.92 (άά, 1Н, 1=8.3, 15.5 Гц), 1.62-1.32 (т, 2Н), 1.20 (άά, 1Н, 1=2.0, 15.3 Гц), 0.92 (к, 9Н).

Пример 49.

Подавление клеточного роста.

Основным преимуществом небелковых низкомолекулярных ингибиторов по сравнению с белковыми ингибиторами является их большая клеточная проникающая способность. Прогнозируется, что мощные небелковые ингибиторы взаимодействия р53 и МЭМ2 будут эффективно подавлять клеточный рост и деление опухолевых клеток с р53 дикого типа благодаря стимуляции активности р53. Более того, прогнозируется, что эти ингибиторы будут обладать селективностью к опухолевым клеткам без р53 или с мутантным, нефункциональным р53. Для проверки этих прогнозов был проведен анализ клеточного роста клеточных линий рака простаты человека (ЬЖ'аР (р53 дикого типа) и РС-3 (без р53)). Были исследованы токсические эффекты соединений настоящего изобретения.

Клетки помещались на 96-луночные плоскодонные планшеты для культур клеток с плотностью 34х10³ клеток на лунку и инкубировались в присутствии соединений в течение 4 дней. Подавление клеточного роста после обработки клеток возрастающими концентрациями соединений определялось с помощью ^8Т-8 (2-(2-метокси-4-нитрофенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2Н-тетразолия мононатриевой соли) (Όο_)ίηάο Мо1еси1аг Тсе1то1од1ск 1пс., Гейтерсберг, Мериленд). \У8Т-8 в конечной концентрации 10% вносился во все лунки, затем планшеты инкубировались при 37°С 2-3 ч. Оптическая плотность образцов измерялась при длине волны 450 нм на планшет-ридере (Мо1еси1аг ^еν^се-ΤΕСАN ИЬКА). При сравнении оптической плотности необработанных клеток и клеток, обработанных соедине

- 47 016145 ниями изобретения, определялась концентрация соединений, которая подавляла клеточный рост на 50% (ПК50). Как показано в табл. 2, соединения изобретения оказались в 5-50 раз более эффективными в плане подавления клеточного роста клеток линии ЬЫСаР (р53-положительных) по сравнению с клетками линии РС3 (р53-отрицательными).

Соединения настоящего изобретения аналогично исследовались на клеточных линиях рака толстой кишки НСТ116 (р53 дикого типа) и НТ029 (мутантный р53). Как показано в табл. 2, большинство исследованных соединений проявляло более высокую способность подавлять клеточный рост линии РСТ116 (р53-положительной) по сравнению с линией НТ-29 (р53-отрицательной), причем максимальное различие эффективности составило около 25 раз.

Нормальные клетки также обладают р53 дикого типа, поэтому возможная проблема в разработке новых противоопухолевых препаратов на основе ингибиторов взаимодействия р53 и ΜΌΜ2 состоит в том, что эти препараты могут быть неселективными и одинаково эффективными в уничтожении опухолевых и нормальных клеток. Для подтверждения хорошей селективности по отношению к опухолевым клеткам соединения будут исследоваться на нормальных клетках простаты человека (РгЕС) с р53 дикого типа.

Таблица 2

Соединение	ГЖ^СО (мкмоль/л)* (К1±СО) (мкмоль/л) (μΜ)* (Κί±8ϋ) (μΜ)	ЫЧСаР пк₅₀ (мкмоль/л) 1С₅₀ (иМ)	РСЗ пк_5й (мкмоль/л) Юда (иМ)	НСТ116 ПК_5О (мкмоль/л) р53\УТ 1С_5О (μΜ)	НТ-29 пк_5а(мкмоль/л) Р53КО 1С₃₀ (μΜ)
МРМ2-319	0,076	0,2738	15,4	0,7174	11,83
	(0,0063)	0,1839	9,08	0,6145	12,2
	0,077	0,2291	1,35	0,2466	14,23
	(0,006)	0,2289	11,61±3,3	0,52 ±0,24	12,75 ± 1,29

- 48 016145

	0,064 (0,005) 0,092 0,115 0,122 0,13 0,18 0,17 0,16 0,10	±0,04
ΜΏΜ2-319-1	0,194 0,072	0,2612 0,3602	НСТ116	0,9085 1,364	12,66 10,39
ΜΏΜ2-319-2	175 (16,43) >80	3,474 3,378 4,005 3,61 ±0,3	14,39 19,64 19,58 17,87 ±3,01	15,46 21,3 8,508 15,08 ±6,4	22,24 19,49 25,44 22,39 ±2,97
МОМ2-319-3	0,37 (0,034) 0,45 0,23	1,758 1,241 0,8472 1,28 ± 0,4	16,65 17,45 22,16 18,75 ±2,97	3,813 4,109 2,826 3,58 ±0,67	13,84 24,78 16,72 18,44 ±5,67
МЛМ2-319-4	0,71 (0,066) 1,16 0,46	1,417 1,294 0,8902 1,21 ±0,29	18,53 23,38 25,6 22,5 ±3,61	5,03 5,801 2,413 4,41 ± 1,77	13,13 26,48 13,39 17,6 ±7,6
МОМ2-319-5	0,055 0,040	0,6020 0,4653 0,6341 0,56 ± 0,08	9,47 5,553 8,711 7,91 ±2	0,9927 1,286 1,502 1,23 ± 0,2	10,52 5,39 8,403 8,1 ±2,5
ΜΏΜ2-319-6	0,5 0,55 ΡΙυ	2,583 1,223 1,931 1,91 ± 0,6	21,4 20,83 14,15 18,7 ±4	5,452 7,41 5,957 6,26 ± 1,0	14,29 16,06 14,58 14,97 ± 0,9
ΜΙ-319-7	39,33	2,17 1,917	39,74 34,29	8,22 7,954	>30 >30
ΜΙ-319-8	0,34 0,53	0,9631 0,8928 0,6625 1,46 ± 1,13	30,66 20,72 18,43 23,27 ±6,5	4,114 4,732 2,738 3,86 ± 1,02	30,95 25,48 22,69 26,3 ±4,2
ΜΙ-319-9	3,58	2,866	20,91	7,48	9,711

- 49 016145

		2,7661,7 5 2,46 ±0,61	5,547 6,09 11,12 ±8,5	9,198 4,631 7,1 ±2,3	8,189 4,52 7,47 ± 2,66
ΝΠ-319-1Ο	0,22	0,7764	10,47	1,411	11,58
	0,26	0,8283	10,36	1,947	9,84
		0,4493	8,074	1,088	5,454
		0,68 ± 0,2	9,63 ± 1,35	1,48 ± 0,4	8,9 ±3,1
ΜΙ-319-11	5,13	2,846 3,078	17,29 14,71	13,5	13,38
	5,39	4,219	24,24	15,82	18 24,68
	5,11			24,89
		3,38 ±	18,7±	18,4 ±	18,85 ±
		0,73	4,9	5,9	5,45
ΜΙ-319-11-Α	2,24	0,3078	1,765	2,153	3,966
	1,64	0,5313	2,754	2,816	2,627
		0,4624	4,024	0,9753	4,182
		0,43 ±0,11	2,84 ± 1,1	1,98 ±0,9	3,59 ±0,84
ΜΙ-319-Ι2	2,30	1,974	22,35	12,37	13,45
	2,96	2,571	20,89	13,2	17,84
		1,931	13,31	4,365	14,13
		2,15±	18,85 ±	9,97 ±	15,14 ±
		0,35	4,85	4,87	2,36
ΜΙ-319-13	5,87	3,663	17,2	3,227	32,64
	5,04	2,316	14,48	6,368	35,05
		4,85	20,28	10,98	33,02
		3,6 ±	17,32 ±	6,85 ±	33,57 ±
		1,26	2,9	3,8	1,29
ΝΠ-319-14	2,04	4,221	40,08	8,008	>30
	1,66	2,63	40,2	9,266	>30
		1,979	>30	5,738	>30
		2,94 ±		7,67 ±
		1,1		1,7
ΜΙ-319-15	0,35	4,522	>30	12,13	>30
	0,18	4,125	>30	12,89	>30
		6,113	>30	13,89	>30
		4,92 ±		12,97 ±
		1,05		0,88
ΜΙ-319-16	0,85 (Пи) 0,76 (Ни)	24,07	>30	>30	>30
ΜΙ-319-17	0,39	1,098	14	2,096	25,13
	0,49	1,548	22,02	3,792	22,33
		1,511	23,63	3,148	25,14
ΜΙ-319-18	3,51	>30	>30	>30	>30
	3,57	>30	>30	>30	>30
ΜΙ-319-19	0,50	1,235	30,68	2,68	>30
	0,49	2,398	>30	5,981	>30
		1,2	41,65	4,596	77,64
ΜΙ-319-20		27,44	>30	>30	>30
		31,59	66,12	93,54	>100
ΜΙ-319-21		2,838	21,87	4,402	11,76
		1,836	14,07	3,884	13,25

Расчет Κι: МЭМ2 [10 нмоль/л].

Г-6 [1 нмоль/л].

Новый образ белка МЭМ2: Κά: 0,88±0,41 нмоль/л (гиперболическое уравнение, использование 1 нмоль/л 6Г), Κά: 2.22±0,93 нмоль/л (диаграмма Κίοΐζ; использование 1 нмоль/л 6Г).

Пример 50.

Влияние ингибиторов ΜΌΜ2 на экспрессию Р53 и продуктов его целевого гена ΜΌΜ2 и р21.

Опухолевые клетки обрабатывались исследуемыми соединениями или 0,1% ДМСО в течение 24 ч. Клетки собирались с помощью трипсинизации и промывались холодным фосфатно-солевым буфером, рН 7,5 (ΙηνίΐΓο^βη, Карлсбад, Калифорния). Клетки лизировались в течение 30 мин ледяным литическим буфером (50 ммоль/л трис (рН 7,5), 150 ммоль/л ЫаС1, 1 ммоль/л ЭДТА (рН 8,0), 25 ммоль/л натрия фторида, 1% ΝΡ-40 и 0,1 % СДС), содержащим 2 ммоль/л натрия ортованадата, 1 ммоль/л фенилметилсульфонилфторида и смесь ингибиторов протеаз (Коске АррНей Баепсе, Индианаполис, Индиана). Затем клеточный экстракт центрифугировался при 12000 г, температуре 4°С в течение 10 мин. Получался очищенный лизат клеток. Белок определялся при помощи красителя Вю-Кай. Клеточные лизаты, содержащие 30

- 50 016145 мкг белка, растворялись в 4-20% трис-глицериновом геле (1пуйгодеп, Карлсбад, Калифорния) и переносились на поливинилидендифторидные мембраны. Иммунологическое определение белков на мембране проводилось при помощи анти-р53- (ЛЬ-6, Опсодепе Кезеагсй РгобисК Бостон, Массачусетс), антиΜΌΜ2- (8ΜΡ14, 8ап1а Сгнх В1о1есйпо1оду, Санта Круз, Калифорния) и анти-р21- (ΒΌ В1О8С1епсе8, СанДиего, Калифорния) мышиных моноклональных антител. Антитела к β-актину (81дта, Сент-Луис, Миссури) использовались для оценки белковой нагрузки. Клеточные линии рака толстой кишки ККО (р53 дикого типа) и НТ-29 (мутантный р53) обрабатывались соединениями изобретения в течение 24 ч. Ожидалось, что соединения вызовут увеличение концентрации р53 и продуктов его целевого гена только в клетках линии ККО, экспрессирующих р53 дикого типа.

Пример 51.

Гибель клеток и апоптоз, индуцированные ингибиторами ΜΌΜ2.

Клеточные линии рака толстой кишки ККО (р53 дикого типа) и НТ-29 (мутантный р53), а также нормальные фибробласты толстой кишки (ССО-18Со) обрабатывались соединениями изобретения в возрастающих дозах в течение 6 дней в 6-луночных чашках Петри. Для определения способности ингибиторов вызывать клеточную гибель проводился анализ исключения красителя триптана синего. Через 4 дня обработки соединениями проводился сбор плавающих и осажденных клеток, клетки окрашивались 0,2% раствором триптана синего (81дта, Сент-Луис, Миссури). Каждая обработка проводилась в трех экземплярах, было подсчитано по меньшей мере 100 клеток. Окрашенные в синий цвет или морфологические измененные клетки считались погибшими. Для оценки апоптоза в обработанных клетках (с использованием ингибитора или без него) было определено содержание субдиплоидной ДНК с помощью окрашивания пропидия иодидом (ПИ). После однократного промывания холодным ФСБ клетки фиксировались в 70% этаноле в течение 1 дня при -20°С. Клетки, зафиксированные в этаноле, дважды промывались ФСБ и окрашивались раствором, содержащим пропидия иодид (ПИ) в концентрации 50 мкмоль/л и РНК-азу А в концентрации 100 мкмоль/л в ФСБ. Окрашивание проводилось в течение 20 мин в темном помещении при комнатной температуре. Сбор клеток и анализ на субдиплоидную ДНК проводился с помощью поточной цитометрии с использованием программного обеспечения Се110ие51. Ожидается, что только опухолевые клетки, экспрессирующие р53 дикого типа, будут подвергаться апоптозу в ответ на применение соединений изобретения.

Пример 52.

Влияние ингибиторов ΜΌΜ2 на прогрессию клеточного цикла клеток рака толстой кишки.

Прогрессия клеточного цикла оценивалась на примере клеточных линий рака толстой кишки ККО (р53 дикого типа) и НТ-29 (мутантный р53), а также на нормальных фибробластах толстой кишки (ССЭ18Со). Проводилось определение клеток в 8-фазе при помощи включения бромодеоксиуридина (ВМИ) с последующим окрашиванием НТС-меченым анти-ВМИ антителом, а также определение общего содержания ДНК путем окрашивания 7-аминоактиномицином Ό (7-ААЭ) в соответствии с инструкциями изготовителя (ΒΌ Вю8с1епсе8, Сан-Хосе, Калифорния). Вкратце, опухолевые и нормальные клетки после инкубации в течение ночи обрабатывались в течение 22 ч раствором, содержащим или не содержащим исследуемые соединения. Затем клетки дополнительно инкубировали в течение 2 ч с 10 мкмоль/л Βτάϋ. Клетки собирались, фиксировались и окрашивались НТС-мечеными анти-Вгйи-антителами и 7-ААЭ. Распределение клеток анализировалось с помощью поточной цитометрии. Клетки собирались. Данные анализировались с использованием программного обеспечения СеПОиеМ (ВО Вюзаепсез). Ожидается, что соединения изобретения будут индуцировать дозозависимое уменьшение 8-фазы в клетках линий ККО (опухолевые клетки) и ССО-18Со (нормальные фибробласты толстой кишки), которые экспрессируют р53 дикого типа. Также ожидается, что соединения не будут оказывать значимого влияния на прогрессию клеточного цикла клеток линии НТ-29, экспрессирующих мутантный р53.

Пример 53.

Защита нормальных клеток при химиотерапии с помощью ингибиторов ΜΌΜ2.

Нормальные эпителиальные клетки простаты (РгЕС) помещались на 6-луночные планшеты и инкубировались с соединениями изобретения в течение 24 ч. Затем на 2 дня в лунки вносился ТАХОЬ (паклитаксел) в концентрации 1 мкмоль/л. Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью окрашивания триптаном синим. Ожидается, что полученные данные покажут, что нормальные простатические эпителиальные клетки, обработанные соединениями изобретения, защищены от действия ТАХОЬ.

После ознакомления с полным описанием изобретения специалистам в данной области станет понятно, что то же самое можно выполнить в широком диапазоне условий, форм препарата и других параметрах, без нарушения рамок настоящего изобретения или его вариантов реализации. Все патенты, заявки на получение патентов и цитированные публикации для справочных целей, полностью включены в настоящее сообщение.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение, имеющее формулу X

- 51 016145 или его фармацевтически приемлемая соль, где Κι представляет собой С_6-1₄арил, необязательно замещенный одной или двумя галогеногруппа ми;

К₅ представляет собой См₈алкил, необязательно замещенный С_3-8циклоалкилом, С₆₄₄арилом или С1_-6алкоксигруппой, С_3-8циклоалкил; или С_2-1₈алкенил;

К₇ представляет собой Н или СО₂К';

К' представляет собой С1_-1₈алкил;

К9 представляет собой 6-хлор- и 5-фторгруппу;

Κιο представляет собой атом водорода и

К_п представляет собой С_3-8циклоалкил-С1_-6алкил, где указанный С_3-8циклоалкил необязательно замещен одной или двумя гидроксигруппами; или моноцикло-С_3-8гетероцикло-С1_-6алкил, где указанный моноцикло-С_3-8гетероцикло необязательно замещен одной или двумя гидроксигруппами; или дигидрокси-С1-6алкильную группу, не содержащую гидроксильную группу в положении 3 алкильной группы; либо К1₀ и Кп вместе образуют моноцикло-С_3-8гетероциклогруппу, необязательно замещенную С1-6алкилом.
2. Соединение по п.1, имеющее одну из формул ΧΙ-ΧΧΥΙ

XXIII XXIV XXV XXVI или его фармацевтически приемлемая соль.
3. Соединение по п.2, имеющее формулу XI или формулу XXVI

- 52 016145 или его фармацевтически приемлемая соль.
4. Соединение, выбранное из группы, состоящей из