JP2020063238A - 分裂終了細胞の疾患および障害をターゲティングおよびモデリングするための系、方法および組成物の送達、エンジニアリングおよび最適化 - Google Patents
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Abstract
Description
2013年6月17日に出願された米国仮特許出願第61/836,123号明細書、2013年7月17日に出願された同第61/847,537号明細書、2013年8月5日に出願された同第61/862,355号明細書、2013年8月28日に出願された同第61/871,301号明細書、2013年12月12日に出願された同第61/915,203号明細書、2014年4月15日に出願された同第61/979,573号明細書、および2013年12月12日に出願されたPCT/US2013/074667号明細書からの優先権が主張され、PCT/US2013/074667号明細書に関しては、米国の目的上、この出願はまた一部継続出願であり;かつ米国の法律に基づき許容され得るとおり、本明細書に相当する米国の出願または国内段階移行時の出願が、PCT/US2013/074667号明細書およびPCT/US2013/074667号明細書が優先権を主張する出願に関して優先権をさらに主張し得るとともに、主張し得る。
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)により助成されたNIHパイオニアアワード(1DP1MH100706)のもと政府支援によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
A)−I.CRISPR−Cas系RNAポリヌクレオチド配列、場合によりキメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
(b)tracrメイト配列、および
(c)tracr配列
を含むポリヌクレオチド配列、および
II.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列
[(a)、(b)および(c)は、5’から3’配向で配置されており、
転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
CRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、かつCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである]、
または
(B)I.ポリヌクレオチドであって、
(a)真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列
を含むポリヌクレオチド、
II.CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列、および
III.tracr配列を含むポリヌクレオチド配列
[転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
CRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、およびCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである]
を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達することを含む目的ゲノム遺伝子座における標的配列の操作により生物または非ヒト生物を改変する方法を提供する。
腎臓、例えば糸球体細胞;
消化器系、例えば胃、膵臓、十二指腸、回腸および/または結腸;
心臓;
肺;
脳、詳細にはニューロン、および/または一般にCNS;
眼、例えば網膜組織;
耳、例えば内耳;
皮膚;
筋肉;
骨;および/または
一般に肝臓、しかしながらこれは別の出願の主題でもあるため、一部の実施形態では除外される。
・ 腎糸球体壁細胞;
・ 腎糸球体タコ足細胞;
・ 腎近位尿細管刷子縁細胞;
・ ヘンレ係締の細い部分の細胞;
・ 太い上行脚細胞;
・ 腎遠位尿細管細胞;
・ 腎集合管細胞;および
・ 腎間質細胞。
天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
を含む、細胞の目的のゲノム遺伝子座におけるDNA二重鎖の逆鎖上にある第1および第2の標的配列の操作によってオフターゲット改変を最小限に抑えるステップをさらに含むことができ、組成物は、
I.CRISPR−Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)第1の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第1のガイド配列、
(b)第1のtracrメイト配列、
(c)第1のtracr配列、
(d)第2の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第2のガイド配列、
(e)第2のtracrメイト配列、および
(f)第2のtracr配列
を含み、場合により、第1のtracr配列と第2のガイド配列との間にリンカー配列が存在することで第1のガイド配列と第2のガイド配列とがタンデムになっている、ポリヌクレオチド配列;および
II.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列であって、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)および(f)が5’から3’への方向に並び、ポリヌクレオチド配列が第1のtracr配列と第2のガイド配列との間にリンカー配列を含むことで第1のガイド配列と第2のガイド配列とがタンデムになっており、および転写時に第1および第2のtracrメイト配列がそれぞれ第1および第2のtracr配列にハイブリダイズし、かつ第1および第2のガイド配列が、それぞれ第1および第2の標的配列に対する第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向する、ポリヌクレオチド配列、
または
II.CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメントであって、成分IおよびIIが系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写されると第1のtracrメイト配列が第1のtracr配列にハイブリダイズし、かつ第1および第2のガイド配列が、それぞれ第1および第2の標的配列に対する第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向する、第2の調節エレメント
を含み、
第1のCRISPR複合体は、(1)第1の標的配列にハイブリダイズする第1のガイド配列、および(2)第1のtracr配列にハイブリダイズする第1のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、
第2のCRISPR複合体は、(1)第2の標的配列にハイブリダイズする第2のガイド配列、および(2)第2のtracr配列にハイブリダイズする第2のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、
CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAであり、および
第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の開裂を指向して二本鎖切断を誘導し、それによりオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物または非ヒト生物を改変する。
a)真核細胞において作動可能な、標的配列とハイブリダイズするCRISPR−Cas系ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合している第1の調節エレメント、および
b)真核細胞において作動可能な、II型Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント
[成分(a)および(b)は系の同じまたは異なるベクター上にあり、それによりガイドRNAが標的配列を標的にし、かつCas9タンパク質がDNA分子を開裂させ、それにより少なくとも1つの分裂終了細胞遺伝子産物の発現が変化し;および、Cas9タンパク質とガイドRNAとは天然では一緒に存在しない]
を含む1つ以上のベクターを含むエンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化等間隔短鎖回分リピート(CRISPR)−CRISPR関連(Cas)(CRISPR−Cas)系を導入するステップを含む。
I.第1のCRISPR−Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列、この第1のポリヌクレオチド配列は以下を含む:
(a)第1の標的配列にハイブリダイズし得る第1のガイド配列、
(b)第1のtracrメイト配列、および
(c)第1のtracr配列、
II.第2のCRISPR−Cas系chiRNAポリヌクレオチド配列、この第2のポリヌクレオチド配列は以下を含む:
(a)第2の標的配列にハイブリダイズし得る第2のガイド配列、
(b)第2のtracrメイト配列、および
(c)第2のtracr配列、および
III.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含み、かつ1つ以上の突然変異を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列、ここで(a)、(b)および(c)は、5’から3’配向で配置されており、転写されると第1および第2のtracrメイト配列がそれぞれ第1および第2のtracr配列にハイブリダイズし、かつ第1および第2のガイド配列がそれぞれ第1および第2の標的配列への第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズする第1のガイド配列、および(2)第1のtracr配列にハイブリダイズする第1のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズする第2のガイド配列、および(2)第2のtracr配列にハイブリダイズする第2のtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAであり、および第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の開裂を指向して二本鎖切断を誘導し、従ってオフターゲット改変を最小限に抑えることにより生物または非ヒト生物を改変する。
I.以下に作動可能に結合している第1の調節エレメント
(a)第1の標的配列にハイブリダイズし得る第1のガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列、
II.以下に作動可能に結合している第2の調節エレメント
(a)第2の標的配列にハイブリダイズし得る第2のガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列、
III.CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第3の調節エレメント、および
IV.tracr配列に作動可能に結合している第4の調節エレメント、
ここで成分I、II、IIIおよびIVは系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、第1および第2のガイド配列がそれぞれ第1および第2の標的配列への第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、第1のCRISPR複合体は、(1)第1の標的配列にハイブリダイズする第1のガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体は、(1)第2の標的配列にハイブリダイズする第2のガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAであり、および第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の開裂を指向して二本鎖切断を誘導し、従ってオフターゲット改変を最小限に抑えることにより生物または非ヒト生物を改変する。
a)遺伝子産物をコードする二本鎖DNA分子のそれぞれ第1の鎖および第2の鎖を標的にする2つのCRISPR−Cas系ガイドRNAの各々に作動可能に結合している第1の調節エレメント、
b)Casタンパク質に作動可能に結合している第2の調節エレメント
ここで成分(a)および(b)は系の同じまたは異なるベクター上にあり、それによりガイドRNAが、遺伝子産物をコードするDNA分子を標的にし、かつCasタンパク質が、遺伝子産物をコードするDNA分子の第1の鎖および第2の鎖の各々にニックを入れ、それにより遺伝子産物の発現が変化し;および、Casタンパク質と2つのガイドRNAとが天然で一緒に存在することはない。
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・ Genome−Scale CRISPR−Cas9 Knockout Screening in Human Cells.Shalem,O.,Sanjana,NE.,Hartenian,E.,Shi,X.,Scott,DA.,Mikkelson,T.,Heckl,D.,Ebert,BL.,Root,DE.,Doench,JG.,Zhang,F.Science Dec 12.(2013).[Epub ahead of print];
・ Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA.Nishimasu,H.,Ran,FA.,Hsu,PD.,Konermann,S.,Shehata,SI.,Dohmae,N.,Ishitani,R.,Zhang,F.,Nureki,O.Cell Feb 27.(2014).156(5):935−49;
・ Genome−wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells.Wu X.,Scott DA.,Kriz AJ.,Chiu AC.,Hsu PD.,Dadon DB.,Cheng AW.,Trevino AE.,Konermann S.,Chen S.,Jaenisch R.,Zhang F.,Sharp PA.Nat Biotechnol.(2014)Apr 20.doi:10.1038/nbt.2889、および
・ Development and Applications of CRISPR−Cas9 for Genome Engineering,Hsu et al,Cell 157,1262−1278(June 5,2014)(Hsu 2014)、
この各々が参照により本明細書に援用され、簡潔には以下のとおり考察している:
・ Cong et al.は、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)Cas9およびまた化膿性連鎖球菌(Streptoccocus pyogenes)Cas9の両方に基づき、真核細胞で使用されるII型CRISPR/Cas系をエンジニアリングし、Cas9ヌクレアーゼが低分子RNAの指図を受けてヒトおよびマウス細胞で正確なDNA開裂を誘導し得ることを実証した。この著者らの研究はさらに、ニッキング酵素に変換されるCas9を使用して、最小限の変異原活性を有する真核細胞での相同性組換え修復を促進し得ることを示した。加えて、この著者らの研究は、複数のガイド配列を単一のCRISPR配列にコードすることによって哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座部位でいくつかを同時に編集することが可能となり得ることを実証し、RNAガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性および広範な適用性を実証した。このようにRNAを使用して細胞における配列特異的DNA開裂をプログラムすることが可能となり、ゲノムエンジニアリングツールの新しいクラスが定義された。これらの研究はさらに、他のCRISPR遺伝子座が哺乳類細胞に移植可能であると見込まれ、また哺乳類ゲノム開裂も媒介し得ることを示した。重要なことに、CRISPR/Cas系のいくつかの側面をさらに改良してその効率および多用途性を高め得ることが想定され得る。
・ 本明細書で考察するとおり、微生物CRISPR−Cas系由来のCas9ヌクレアーゼが20ntガイド配列によって特異的なゲノム遺伝子座にターゲティングされ、ガイド配列はDNA標的との特定のミスマッチに耐えることができるため、従って望ましくないオフターゲット突然変異誘発を促進し得る。これに対処するため、Ran et al.は、Cas9ニッカーゼ突然変異体を対のガイドRNAと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するという手法を記載した。ゲノム中の個々のニックは高いフィデリティで修復されるため、二本鎖切断には適切にオフセットしたガイドRNAによる同時のニッキングが必要であり、これが標的開裂のために特異的に認識される塩基の数を伸長する。この著者らは、対のニッキングを使用して細胞系におけるオフターゲット活性を50〜1,500分の1に減らし、オンターゲット開裂効率を犠牲にすることなしにマウス接合体における遺伝子ノックアウトを促進し得ることを実証した。この多用途戦略により、高い特異性が要求される多種多様なゲノム編集適用が可能となる。
CRISPR−Cas系の好ましい送達は、ウイルスベクターを介した送達である。このベクターは、本明細書である程度詳しく考察するとおり、レンチウイルスベクターまたはAAVベクターであってもよい。本発明者らが特に明らかにしているのは、AAVがウイルスベクターの好ましい例であるということである。その範囲内で、本発明者らは次に、AAV8および詳細にはAAV2/8(AAV2パッケージングシグナルITRと共にパッケージングされたAAV8)が、肝臓への、特にインビボでの送達に有用であることを明らかにしている。
他の部分で考察するとおり、本発明者らはインビボで表現型の変化を検出し得ることを示すことができた。多くの場合にRNAiに突き付けられる欠陥は持続効果が見られないことであるため、これは顕著な前進である。本発明では、初めて肝臓における表現型の変化を見ることができる。これを達成する好ましい構成は、実施例36の構成を用いることである。これの重要な要素は単独または組み合わせで好ましく、すなわち以下である:
・ Sa Cas9;
・ ガイド、tracr配列およびtracrメイトを含むキメラガイドRNAの使用;
・ tracr配列について、Sa Cas9の動員にSa tracrが好ましい;
・ AAV8またはより好ましくはAAV2/8;
・ 実験目的では、Rosa26が有用な陰性対照である;
・ AAVベクターにおけるCMVプロモーターの使用は役立つが、TBGなどの肝臓特異的プロモーターの使用(肝臓ターゲティングのため)が特に有効である;
・ CRISPRは、ガイドの送達に成功しかつCss9酵素が好適に発現すると、全標的にわたって幅広い適用性を有することが示されているため、1つまたは複数の標的は広範囲に及び得る。しかしながら、それにも関わらず、肝臓における好ましい標的(ガイドの設計対象となり得る)は、PCSK9;Hmgcr;SERPINA1;ApoB;および/またはLDLの1つ以上を含む。
− 成功裏の分裂終了ニューロンにおけるAAV媒介性Cas9インビボ送達ならびに効率的なゲノム改変の初めての実証;
− Cas9およびsgRNA発現細胞からの神経核の容易な単離を可能にする核タグ標識技法の開発について;
− ニューロントランスクリプトームのRNAseq解析に向けた適用の実証;
− 電気生理学的試験および他の技法をどのようにCas9媒介性ゲノム摂動と統合して表現型の変化を決定し得るか;および
− 多重ターゲティングおよびCas9媒介性ゲノム編集を用いてげっ歯類の行動に関する遺伝子機能を調べる能力の実証。
・ モデルの作成および試験を含めた、遺伝子機能の理解および試験;および
・ 遺伝子療法
においてさらなる概念実証を提供することが分かり得る。
本明細書の本研究は、CRISPR−Cas9系を適切な部位(すなわち目的の器官または組織内にある細胞)に送達することによる、CRISPR−Cas9系を使用した分裂終了細胞の遺伝子のターゲティングを裏付ける。好ましい組織は以下の器官内にある:
・ 腎臓;
・ 胃、膵臓、十二指腸、回腸および/または結腸を含む消化器系;
・ 心臓;
・ 肺;
・ 脳、詳細にはニューロン、および/または一般にCNS;
・ 網膜組織を含む眼;
・ 内耳を含む耳;
・ 皮膚;
・ 筋肉;
・ 骨;および/または
・ 一般に肝臓。
調べることのできる病態にはハンチントン病(Huntingdon’s)が含まれるが、本質的に分裂終了細胞に認められる任意の病態、および特にインビボでの調査が有益となり得るものまたは有用なモデルがないものが含まれる。
I.CRISPR−Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第1の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が
(a)対象のゲノムにおける3つ以上の標的配列とのハイブリダイズ能を有する1つ、2つ、3つ(thee)、4つまたはそれ以上のガイド配列、
(b)tracrメイト配列、および
(c)tracr配列
を含む、第1の調節エレメント、および
II.少なくとも(at list)1つ以上の核局在化配列(NLS)を含むCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメントであって、(a)、(b)および(c)が5’から3’への方向に並ぶ、第2の調節エレメント
[成分IおよびIIは系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写時にtracrメイト配列はtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、
CRISPR複合体は、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含み、
CRISPR酵素が第1の細胞集団のゲノムを変化させることにより、1つ以上の欠損遺伝子またはノックダウン遺伝子を有する第2の細胞集団が得られる]
を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を第1の細胞集団に形質導入するステップを含む。
単一または複数の遺伝子をノックダウンしたモデルが提供される。例は、レット症候群用のげっ歯類モデル、Mecp2ノックダウンであり得る。他の例としては、Dmntファミリーノックダウン、具体的にはDmnt1、3aおよび3bノックダウンが挙げられる。このように、神経学的病態を研究するモデルが提供される。行わなければならないことの全ては、目的の標的遺伝子を同定し、好適な1つまたは複数のガイドを設計し、かつそれらを好適なCRISPR−Cas9系に含めて、それを必要に応じてインビボまたはエキソビボのいずれであろうと1つまたは複数の分裂終了細胞に送達することである。例えば、モデルが変化した樹状突起樹形態および/または棘密度を有し得ることが提供される。
実施例40のデータは、遺伝子摂動、主としてノックダウンに焦点を置いていてる。遺伝子ノックダウンは、遺伝子療法に対するCRISPR−Cas9系の可能な適用の総定足数(quorum)のうちの、重要であるにしても、ごく僅かな一部である可能性が高い。Yin and Andersonの論文で既に示されたとおり(Nature Biotech 2884 published online 30 March 2014)、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ(FAH)の(エクソン8の最後のヌクレオチドにおけるGからAへの)突然変異によって引き起こされる本来致死的な病態であって、スプライシングにおけるエクソン8のスキッピングを引き起こしてトランケート型の不安定なFAHタンパク質の形成をもたらし、毒性代謝産物の蓄積を生じる遺伝性チロシン血症I型(HTI)において、欠損突然変異の補修後に機能表現型が回復し得る。A突然変異を野生型のG遺伝子型(geneotype)に戻す補修により、表現型の回復がもたらされる。
SpCas9媒介性ゲノム摂動と集団レベルRNAseq解析との組み合わせは、転写調節を特徴付け、かつ考察中の細胞における特定の機能または疾患過程に重要であり得る遺伝子を提案する方法を提供する。詳細には、細胞は脳由来、詳細にはニューロンである。CRISPR−Cas9系などの即効性の技法は、本質的に一過性であるトランスクリプトームの研究において有利である。従って、トランスクリプトームの解析(RNAseq)における本発明に係るCRISPR−Cas9系の使用が提供される。
SpCas9を発現するニューロンの免疫蛍光法による同定を促進するため、本発明者らは、SpCas9をHA−エピトープタグ(ヒトインフルエンザ赤血球凝集素(hemagluttinin)に由来する、発現ベクターで広く用いられている一般的なエピトープタグ)でタグ標識した。
・ レポータータンパク質;および
・ 場合により、U6などの、ガイドRNAに好適なプロモーター;
ここでレポータータンパク質は、それに好適なプロモーターに作動可能に結合している核膜貫通ドメインと融合される。
・ 「リポソーム送達系、ならびに脂溶性分子とコンジュゲートしたsiRNAは血清リポタンパク質と相互作用し、続いて肝細胞に侵入して、肝細胞がそれらのリポタンパク質を取り込む」
・ ペグ化;
・ 以下のようなコンジュゲート:
a.ダイナミックポリコンジュゲート(DPC、10nmナノ粒子)、これはRNAiを送達してApoBを成功裏に抑制することが示されている(これにより、CRISPR−Cas9系によるApoBのターゲティングに関する本発明者らの研究とクロスオーバーする);および
b.三分岐GalNAcコンジュゲート
c.は「両方ともに極めて有効」である(特にGalNAc);
・ 以下を含む他のナノ粒子:
d.シクロデキストリンポリマーナノ粒子(CDP)、アダマンチン−PEG(AD−PEG)およびアダマンチン−PEG−トランスフェリン(AD−PEG−Tf)などのさらなる製剤成分を含む;
e.カチオン性またはイオン性脂質、遮蔽脂質、コレステロールおよび内因性または外因性標的リガンドを含めた、脂質ナノ粒子(LNP)。内因性標的リガンドの例は、RBP受容体を発現する肝および膵星細胞のターゲティングに有用なレチノール結合タンパク質(RBP)である。外因性標的リガンドの例はGalNacであり、これもまた肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体を介して肝臓をターゲティングする。Anlylams ALN−VSPでは併用手法が見られる;
・ 「肝臓内皮における開窓術によって直径100〜200nmの分子を血流から拡散させ、肝実質細胞および他の肝細胞に侵入させることが可能になる」;
・ GalNAcなどのリガンドは、マンノース受容体を発現する非実質肝細胞、および好適なsiRNAとGalNAcリガンドとのコンジュゲートがPCSK9を成功裏に抑制することが示されている肝細胞への送達に好適である;および
・ 予め定義された3D構造にハイブリダイズするように設計された相補的な(complimentary)DNA断片で構成されるオリゴヌクレオチドナノ粒子(ONP)。好適な3’オーバーハング(overhand)配列を使用して6個のsiRNA鎖を各粒子に、指定した位置であっても、結合させることができた。流体力学的径は約29nmであった。
いくつかの種類の粒子送達系および/または製剤は、幅広い生物医学的応用において有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送および特性に関して全体として一つの単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は直径に従いさらに分類される。粗粒子は2,500〜10,000ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は100〜2,500ナノメートルのサイズである。超微粒子、またはナノ粒子は、概して1〜100ナノメートルのサイズである。この100nmの限界は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には100nm未満の臨界長さスケールで生じるという事実に基づく。
本発明に関しては、CRISPR複合体の1つ以上の成分、例えば、CRISPR酵素またはmRNAまたはガイドRNAをナノ粒子または脂質エンベロープを使用して送達することが好ましい。他の送達系またはベクターが、本発明のナノ粒子の態様と併せて用いられてもよい。
Cas9の最適化を用いて機能を増強しまたは新規機能を開発してもよく、キメラCas9タンパク質を作成することができる。本出願人らが作成した例を実施例6に提供する。キメラCas9タンパク質は、異なるCas9ホモログの断片を組み合わせることにより作製し得る。例えば、本明細書に記載されるCas9からの2つの例示的なキメラCas9タンパク質。例えば、本出願人らは、St1Cas9のN末端(このタンパク質からの断片は太字である)をSpCas9のC末端と融合した。キメラCas9を作製する利益には、以下の一部または全部が含まれる:毒性の低下;真核細胞における発現の向上;特異性の亢進;タンパク質の分子量の低下、例えば、異なるCas9ホモログの最も小さいドメインを組み合わせてより小さいタンパク質を作製すること;および/またはPAM配列要件の変更。
トランスジェニック動物(モデル)もまた提供され、以下は、エキソビボモデル組織および組織集合、例えば、オルガノイド、オンチップ肝臓などにも同様に適用される。好ましい例としては、Cas9をコードするポリヌクレオチドまたはタンパク質それ自体という意味においてCas9を含む動物が挙げられる。マウス、ラットおよびウサギが好ましい。本明細書で例示されるとおり構築物でトランスジェニックマウスを作成するには、純粋な線状DNAを偽妊娠雌、例えばCB56雌由来の接合体の前核に注入し得る。次にファウンダーが同定され、遺伝子型が決定され、CB57マウスと戻し交配され得る。次に構築物がクローニングされ、場合により、例えばサンガーシーケンシングによって検証され得る。例えばモデルにおいて1つ以上の遺伝子がノックアウトされる場合、ノックアウトが想定される。しかしながらノックインもまた(単独でまたは組み合わせで)想定される。例示的なノックインCas9マウスを作成しており、これを例示するが、Cas9ノックインが好ましい。Cas9ノックインマウスを作成するには、本明細書に記載されるとおり(図25A〜図25Bおよび図26)、同じ構成的および条件的構築物の標的をRosa26遺伝子座に仕向け得る。Rosa遺伝子座の標的化に関するSangamo BioSciences,Inc.に譲渡された米国特許出願公開第20120017290号明細書および同第20110265198号明細書の方法を、本発明のCRISPR Cas系を利用するように改良し得る。別の実施形態において、Rosa遺伝子座の標的化に関するCellectisに譲渡された米国特許出願公開第20130236946号明細書の方法もまた、本発明のCRISPR Cas系を利用するように改良し得る。
インビボ送達の点では、AAVはいくつかの理由で他のウイルスベクターと比べて有利である:
毒性が低い(これは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心が不要であるという精製方法に起因し得る)
宿主ゲノムにインテグレートされないため挿入突然変異生成を引き起こす可能性が低い。
NHEJ媒介性遺伝子ノックアウトを達成するため:
単一ウイルスベクター:
2つ以上の発現カセットを含むベクター:
プロモーター−Cas9コード核酸分子−ターミネーター
プロモーター−gRNA1−ターミネーター
プロモーター−gRNA2−ターミネーター
プロモーター−gRNA(N)−ターミネーター(ベクターのサイズ限界に至るまで)
二重ウイルスベクター:
Cas9の発現をドライブするための1つの発現カセットを含むベクター1
プロモーター−Cas9コード核酸分子−ターミネーター
1つ以上のガイドRNAの発現をドライブするためのもう1つの発現カセットを含むベクター2
プロモーター−gRNA1−ターミネーター
プロモーター−gRNA(N)−ターミネーター(ベクターのサイズ限界に至るまで)
AAV ITRはプロモーターとして働き得る:これは、追加的なプロモーターエレメント(これはベクター中でスペースを取り得る)の必要性をなくすのに有利である。空いた追加のスペースは、追加的なエレメント(gRNA等)の発現のドライブに使用することができる。また、ITR活性は比較的弱いため、Cas9の過剰発現に起因する毒性を低下させるためにも使用することができる。
Pol IIIプロモーター、例えばU6またはH1
Pol IIプロモーターおよびイントロンカセットを使用することによるgRNAの発現
レンチウイルスは、有糸分裂細胞および分裂終了細胞の両方において感染してその遺伝子を発現する能力を有する複合レトロウイルスである。最も一般的に知られるレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス(HIV)であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して広範囲の細胞型を標的にする。
RNA送達:CRISPR酵素、例えばCas9、および/または本RNAのいずれか、例えばガイドRNAはまた、RNAの形態でも送達することができる。Cas9 mRNAはインビトロ転写を用いて作成することができる。例えば、Cas9 mRNAは、βグロビン−ポリAテール(120個以上の一連のアデニン)から以下のエレメント:T7_プロモーター−コザック配列(GCCACC)−Cas9−3’UTRを含むPCRカセットを使用して合成することができる。このカセットは、T7ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドRNAもまた、T7_プロモーター−GG−ガイドRNA配列を含むカセットからのインビトロ転写を用いて転写させることができる。
CRISPR酵素mRNAおよびガイドRNAは、ナノ粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達されてもよい。
エキソソームは、RNAおよびタンパク質を輸送する内因性ナノ小胞であり、マウスにおいて低分子干渉(si)RNAを脳に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Alvarez−Erviti et al.(2011,Nat Biotechnol 29:341)はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ターゲティングは、ニューロン特異的RVGペプチドに融合したLamp2b(エキソソーム膜タンパク質)を発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより実現された。エレクトロポレーションによって精製エキソソームに外来性siRNAを負荷した。静脈内注入したRVG標的化エキソソームはGAPDH siRNAを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンをもたらした。RVGエキソソームに対する前曝露はノックダウンを減弱せず、他の組織における非特異的な取り込みは観察されなかった。エキソソーム媒介性siRNA送達の治療可能性は、アルツハイマー病の治療標的であるBACE1の強力なmRNA(60%)およびタンパク質(62%)ノックダウンによって実証された。
本発明に係る送達または投与はリポソームで実施することができる。リポソームは、内側の水性区画を取り囲む単層膜または多重膜脂質二重層、および比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層で構成される球形小胞構造である。リポソームは生体適合性で非毒性であり、親水性および親油性の両方の薬物分子を送達し、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、かつそのロードを生体膜および血液脳関門(BBB)を越えて輸送することができるため、薬物送達担体として大きな注目を集めている(例えば、レビューについてはSpuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12 pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照のこと)。
他のカチオン性脂質、例えばアミノ脂質2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−[1,3]−ジオキソラン(DLin−KC2−DMA)を利用してCRISPR CasをSiRNAと同様に封入し得る(例えば、Jayaraman,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,8529−8533を参照のこと)。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る:それぞれモル比40/10/40/10、および約0.05(w/w)のFVII siRNA/総脂質比のアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロールおよび(R)−2,3−ビス(オクタデシルオキシ)プロピル−1−(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)プロピルカルバメート(PEG−脂質)。70〜90nmの範囲の狭い粒度分布および0.11〜0.04の低い多分散性指数(n=56)を確実にするため、CRISPR Cas RNAを添加する前に、粒子を最大3回まで80nm膜に通して押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質16を含有する粒子が使用されてもよく、ここでは4つの脂質成分16、DSPC、コレステロールおよびPEG−脂質(50/10/38.5/1.5)のモル比がインビボ活性を増強するようにさらに最適化され得る。
超荷電タンパク質は、通常高い正または負の正味理論電荷を有するエンジニアリングされたまたは天然に存在するタンパク質の一クラスである。極度に負に荷電したタンパク質および極度に正に荷電したタンパク質の両方が、熱的または化学的に引き起こされる凝集に耐える顕著な能力を呈する。極度に正に荷電したタンパク質はまた、哺乳類細胞に侵入することも可能である。カーゴをこれらのタンパク質、例えばプラスミドDNA、siRNA、または他のタンパク質と会合させることにより、インビトロおよびインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することが可能となり得る。David Liuの研究室は、2007年に超荷電タンパク質の作成および特徴付けを報告した(Lawrence et al.,2007,Journal of the American Chemical Society 129,10110−10112)。
(1)治療前日、48ウェルプレートにウェル当たり1×105細胞をプレーティングする。
(2)治療当日、精製+36GFPタンパク質を最終濃度が200nMとなるように無血清培地中に希釈する。最終濃度が50nMとなるようにsiRNAを添加する。ボルテックスして混合し、室温で10分間インキュベートする。
(3)インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、PBSで1回洗浄する。
(4)+36GFPおよびsiRNAのインキュベーション後、タンパク質−siRNA複合体を細胞に添加する。
(5)細胞を複合体と共に37℃で4時間インキュベートする。
(6)インキュベーション後、培地を吸引し、20U/mLヘパリンPBSで3回洗浄する。細胞を血清含有培地と共に、ノックダウンのアッセイに応じてさらに48時間またはそれより長くインキュベートする。
(7)免疫ブロット、qPCR、表現型アッセイ、または他の適切な方法によって細胞を分析する。
(1)治療前日、48ウェルプレートにウェル当たり1×105をプレーティングする。
(2)治療当日、精製p36 GFPタンパク質を最終濃度が2mMとなるように無血清培地中に希釈する。1mgのプラスミドDNAを添加する。ボルテックスして混合し、室温で10分間インキュベートする。
(3)インキュベーション中、細胞から培地を吸引し、PBSで1回洗浄する。
(4)p36 GFPおよびプラスミドDNAのインキュベーション後、細胞にタンパク質−DNA複合体を穏やかに添加する。
(5)細胞を複合体と共に37℃で4時間インキュベートする。
(6)インキュベーション後、培地を吸引し、PBSで洗浄する。血清含有培地中で細胞をインキュベートし、さらに24〜48時間インキュベートする。
(7)必要に応じてプラスミド送達を(例えばプラスミドドライブ遺伝子発現により)分析する。
さらに別の実施形態では、CRISPR Cas系の送達に細胞透過性ペプチド(CPP)が企図される。CPPは、様々な分子カーゴ(ナノサイズ粒子から化学的小分子および大型DNA断片まで)の細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子、リポソーム、発色団、小分子および放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴにはまた、CRISPR Cas系の任意の成分または機能性のCRISPR Cas系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法をさらに提供し、この方法は、(a)本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップと、(b)複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、髄腔内に、動脈内に(intrarterially)、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に、または局所的に投与するステップとを含む。カーゴは、共有結合による化学的結合を介するか、あるいは非共有結合性の相互作用を介してペプチドと会合する。
別の実施形態において、CRISPR Cas系の送達に植込み型装置もまた企図される。例えば、米国特許出願公開第20110195123号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出させる植込み型医療器具が、いくつかの種類のかかる装置、治療の実施態様および植え込み方法を含め、提供されることを開示する。この装置は、例えばマトリックスなどの、装置本体として使用されるポリマー基材と、薬物と、ある場合にはさらなる足場材料、例えば金属または別のポリマー、ならびに可視性およびイメージングを増強する材料とで構成される。薬物の選択は、薬物を局所的に長時間放出するという利点に基づき、ここで薬物は直接的に腫瘍、炎症、変性などの患部の細胞外マトリックス(ECM)に対して、または対症目的で、または損傷した平滑筋細胞に対して、または予防のため放出される。ある種の薬物は、限定はされないが、si RNA、sh RNA、またはアンチセンスRNA/DNA、リボザイムおよびヌクレオシド類似体を含めた、RNA干渉(RNAi)に基づく遺伝子サイレンシング薬である。従って、このシステムは、本発明のCRISPR Cas系に使用しおよび/または適合させることができる。一部の実施形態における植え込み方法は、小線源照射療法および針生検を含め、現在開発され、他の治療に使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、この発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には同じ治療手技の中で数個の装置が植え込まれる。
CRISPR酵素mRNAおよびガイドRNAはまた個別に送達されてもよい。CRISPR酵素が発現する時間を与えるため、CRISPR酵素mRNAはガイドRNAより先に送達され得る。CRISPR酵素mRNAはガイドRNA投与の1〜12時間前(好ましくは約2〜6時間前)に投与され得る。
データは表現型の変換を示す。
Oakes and Lieberman(Clin Orthop Relat Res.2000 Oct;(379 Suppl):S101−12)は、骨への遺伝子の送達を考察している。遺伝子を特定の解剖学的部位で細胞に移入させることにより、成長因子の骨誘導特性を生理学的用量で持続時間にわたり使用して、より有意な治癒反応を促進することができる。特定の解剖学的部位、骨質、および軟部組織エンベロープが、局部遺伝子治療の標的細胞の選択に影響する。骨誘導性担体で治療部位に送達される遺伝子治療ベクターが、有望な結果をもたらしている。複数の研究者が、動物モデルにおいてエキソビボおよびインビボ局部遺伝子治療を使用して面白い結果を示している。かかるシステムは、CRISPR Cas系の骨への送達に使用しおよび/または適合させることができる。
脳に関する送達の選択肢としては、DNAまたはRNAのいずれかの形態のCRISPR酵素およびガイドRNAをリポソームに封入し、分子トロイの木馬にコンジュゲートして血液脳関門(BBB)を通過させて送達することが含まれる。分子トロイの木馬は、B−gal発現ベクターを非ヒト霊長類の脳に送達するのに有効であることが示されている。同じ手法を用いて、CRISPR酵素とガイドRNAとを含有するベクターを送達することができる。例えば、Xia CF and Boado RJ,Pardridge WM(「アビジン−ビオチン技術を用いたヒトインスリン受容体を介するsiRNAの抗体媒介性ターゲティング(Antibody−mediated targeting of siRNA via the human insulin receptor using avidin−biotin technology)」Mol Pharm.2009 May−Jun;6(3):747−51.doi:10.1021/mp800194)は、受容体特異的モノクローナル抗体(mAb)およびアビジン−ビオチン技術の併用によって、培養下、およびインビボでの細胞に対する低分子干渉性RNA(siRNA)の送達がどのように可能になるかを記載している。この著者らはまた、標的化するmAbとsiRNAとの間の結合がアビジン−ビオチン技術で安定しており、標的化siRNAの静脈内投与後にインビボで脳などの遠隔部位でのRNAi効果が観察されることも報告する。
遺伝子の標的欠失が好ましい。例を実施例18に示す。従って、数ある障害の中でも特に、コレステロール生合成、脂肪酸生合成、および他の代謝疾患に関与する遺伝子、アミロイド病および他の疾患に関与する誤って折り畳まれたタンパク質をコードする遺伝子、細胞形質転換を生じさせる癌遺伝子、潜伏ウイルス遺伝子、およびドミナントネガティブな障害を生じさせる遺伝子が好ましい。ここで例示するとおり、本出願人らによれば、ウイルスまたはナノ粒子のいずれかの送達系を使用した、代謝疾患、アミロイドーシスおよびタンパク質凝集関連疾患、遺伝子突然変異および転座によって生じる細胞形質転換、遺伝子突然変異のドミナントネガティブ効果、潜伏ウイルス感染症、および他の関連症状に罹患している必要性がある対象または患者の肝臓、脳、眼、上皮、造血、または別の組織に対するCRISPR−Cas系の遺伝子送達が好ましい。
本発明のCRISPR/Cas9系を使用して、これまでTALENおよびZFNを使用して試みられたが成功は限られていた遺伝子突然変異を補修することができる。例えば、デューク大学(Duke University)の公開出願である国際公開第2013163628 A2号パンフレット、「変異遺伝子の遺伝子補修(Genetic Correction of Mutated Genes)」は、例えば、ジストロフィン遺伝子の突然変異に起因して筋肉変性を生じる劣性遺伝の致死性X連鎖性障害であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー(「DMD」)に関与するものなど、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合で補修することのできる未成熟終止コドンおよびトランケート遺伝子産物を生じさせるフレームシフト突然変異を補修する試みを記載している。DMDを引き起こすジストロフィン突然変異の大多数はエクソンの欠失であり、これがリーディングフレームを破壊し、ジストロフィン遺伝子の中途での翻訳終結を引き起こす。ジストロフィンは、筋細胞の完全性および機能の調節に関与する細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす細胞質タンパク質である。本明細書で同義的に使用されるとおりのジストロフィン遺伝子または「DMD遺伝子」は、2.2メガベースで、遺伝子座Xp21にある。一次転写は約2,400kbあり、成熟mRNAは約14kbである。79個のエクソンがタンパク質をコードし、このタンパク質は3500アミノ酸を上回る。多くの場合にDMD患者においてフレーム破壊型欠失にエクソン51が隣接し、これはオリゴヌクレオチドベースのエクソンスキッピングに関する臨床試験において標的化されている。エクソン51スキッピング化合物エテプリルセンに関する臨床試験は、最近になって、48週間にわたる有意な機能上の利益を報告しており、ベースラインと比較して平均47%のジストロフィン陽性線維であった。エクソン51の突然変異は、理想的にはNHEJベースのゲノム編集による永久的な補修に適している。
本発明はまた、CRISPR−Cas系を血液に送達することも企図する。
本発明はまた、CRISPR−Cas系を一方または両方の耳に送達することも企図する。
本発明はまた、CRISPR−Cas系を一方または両方の眼に送達することも企図する。
本発明はまた、CRISPR−Cas系を心臓に送達することも企図する。心臓に関しては、心筋向性アデノ随伴(adena−associated)ウイルス(AAVM)、詳細には心臓で優先的遺伝子導入を示したAAVM41が好ましい(例えば、Lin−Yanga et al.,PNAS,March 10,2009,vol.106,no.10を参照のこと)。投与は全身投与または局所投与であってよい。全身投与には約1〜10×1014ベクターゲノムの投薬量が企図される。例えば、Eulalio et al.(2012)Nature 492:376およびSomasuntharam et al.(2013)Biomaterials 34:7790も参照のこと。
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(CD49B、VLA−2受容体のα2サブユニット))、CABIN1(カルシニューリン結合タンパク質1)、SHBG(性ホルモン結合グロブリン)、HMGB1(高移動度群ボックス1)、HSP90B2P(熱ショックタンパク質90kDa β(Grp94)、メンバー2(偽遺伝子))、CYP3A4(シトクロムP450、ファミリー3、サブファミリーA、ポリペプチド4)、GJA1(ギャップ結合タンパク質、α1、43kDa)、CAV1(カベオリン1、カベオラタンパク質、22kDa)、ESR2(エストロゲン受容体2(ER β))、LTA(リンホトキシンα(TNFスーパーファミリー、メンバー1))、GDF15(成長分化因子15)、BDNF(脳由来神経栄養因子)、CYP2D6(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーD、ポリペプチド6)、NGF(神経成長因子(βポリペプチド))、SP1(Sp1転写因子)、TGIF1(TGFB誘導性因子ホメオボックス1)、SRC(v−src肉腫(シュミット−ルピンA−2(Schmidt−Ruppin A−2))ウイルス癌遺伝子ホモログ(トリ))、EGF(上皮成長因子(β−ウロガストロン))、PIK3CG(ホスホイノシチド−3−キナーゼ、触媒、γポリペプチド)、HLA−A(主要組織適合遺伝子複合体、クラスI、A)、KCNQ1(カリウム電位開口型チャネル、KQT様サブファミリー、メンバー1)、CNR1(カンナビノイド受容体1(脳))、FBN1(フィブリリン1)、CHKA(コリンキナーゼα)、BEST1(ベストロフィン1)、APP(アミロイドβ(A4)前駆体タンパク質)、CTNNB1(カテニン(カドヘリン関連タンパク質)、β1、88kDa)、IL2(インターロイキン2)、CD36(CD36分子(トロンボスポンジン受容体))、PRKAB1(プロテインキナーゼ、AMP活性化、β1非触媒サブユニット)、TPO(甲状腺ペルオキシダーゼ)、ALDH7A1(アルデヒドデヒドロゲナーゼ7ファミリー、メンバーA1)、CX3CR1(ケモカイン(C−X3−Cモチーフ)受容体1)、TH(チロシンヒドロキシラーゼ)、F9(凝固第IX因子)、GH1(成長ホルモン1)、TF(トランスフェリン)、HFE(ヘモクロマトーシス)、IL17A(インターロイキン17A)、PTEN(ホスファターゼ・テンシンホモログ)、GSTM1(グルタチオンS−トランスフェラーゼμ1)、DMD(ジストロフィン)、GATA4(GATA結合タンパク質4)、F13A1(凝固第XIII因子、A1ポリペプチド)、TTR(トランスサイレチン)、FABP4(脂肪酸結合タンパク質4、脂肪細胞)、PON3(パラオキソナーゼ3)、APOC1(アポリポタンパク質C−I)、INSR(インスリン受容体)、TNFRSF1B(腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー1B)、HTR2A(5−ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体2A)、CSF3(コロニー刺激因子3(顆粒球))、CYP2C9(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーC、ポリペプチド9)、TXN(チオレドキシン)、CYP11B2(シトクロムP450、ファミリー11、サブファミリーB、ポリペプチド2)、PTH(副甲状腺ホルモン)、CSF2(コロニー刺激因子2(顆粒球マクロファージ))、KDR(キナーゼ挿入ドメイン受容体(III型受容体チロシンキナーゼ))、PLA2G2A(ホスホリパーゼA2、グループIIA(血小板、滑液))、B2M(β−2−ミクログロブリン)、THBS1(トロンボスポンジン1)、GCG(グルカゴン)、RHOA(rasホモログ遺伝子ファミリー、メンバーA)、ALDH2(アルデヒドデヒドロゲナーゼ2ファミリー(ミトコンドリア))、TCF7L2(転写因子7様2(T細胞特異的、HMGボックス))、BDKRB2(ブラジキニン受容体B2)、NFE2L2(核内因子(赤血球由来2)様2)、NOTCH1(Notchホモログ1、転座関連(ショウジョウバエ属(Drosophila)))、UGT1A1(UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA1)、IFNA1(インターフェロン、α1)、PPARD(ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ)、SIRT1(サーチュイン(サイレント交配型情報調節2ホモログ)1(S.セレビシエ(S.cerevisiae)))、GNRH1(ゴナドトロピン放出ホルモン1(黄体形成放出ホルモン))、PAPPA(妊娠関連血漿タンパク質A、パパリシン1)、ARR3(アレスチン3、レチナール(X−アレスチン))、NPPC(ナトリウム利尿ペプチド前駆体C)、AHSP(αヘモグロビン安定化タンパク質)、PTK2(PTK2プロテインチロシンキナーゼ2)、IL13(インターロイキン13)、MTOR(ラパマイシンの機構的標的(セリン/スレオニンキナーゼ))、ITGB2(インテグリン、β2(補体成分3受容体3および4サブユニット))、GSTT1(グルタチオンS−トランスフェラーゼθ1)、IL6ST(インターロイキン6シグナル伝達因子(gp130、オンコスタチンM受容体))、CPB2(カルボキシペプチダーゼB2(血漿))、CYP1A2(シトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーA、ポリペプチド2)、HNF4A(肝細胞核内因子4、α)、SLC6A4(溶質輸送担体ファミリー6(神経伝達物質輸送体、セロトニン)、メンバー4)、PLA2G6(ホスホリパーゼA2、VI群(細胞質型、カルシウム非依存性))、TNFSF11(腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー11)、SLC8A1(溶質輸送担体ファミリー8(ナトリウム/カルシウム交換体)、メンバー1)、F2RL1(凝固第II因子(トロンビン)受容体様1)、AKR1A1(アルド−ケトレダクターゼファミリー1、メンバーA1(アルデヒドレダクターゼ))、ALDH9A1(アルデヒドデヒドロゲナーゼ9ファミリー、メンバーA1)、BGLAP(骨γ−カルボキシグルタミン酸(gla)含有タンパク質)、MTTP(ミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質)、MTRR(5−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼレダクターゼ)、SULT1A3(スルホトランスフェラーゼファミリー、細胞質型、1A、フェノール選択、メンバー3)、RAGE(腎腫瘍抗原)、C4B(補体成分4B(チド(Chido)血液型)、P2RY12(プリン受容体P2Y、Gタンパク質共役、12)、RNLS(リナラーゼ、FAD依存性アミンオキシダーゼ)、CREB1(cAMP応答エレメント結合タンパク質1)、POMC(プロオピオメラノコルチン)、RAC1(ras関連C3ボツリヌス毒素基質1(rhoファミリー、低分子GTP結合タンパク質Rac1))、LMNA(ラミンNC)、CD59(CD59分子、補体調節タンパク質)、SCN5A(ナトリウムチャネル、電位開口型、V型、αサブユニット)、CYP1B1(シトクロムP450、ファミリー1、サブファミリーB、ポリペプチド1)、MIF(マクロファージ遊走阻害因子(グリコシル化阻害因子))、MMP13(マトリックスメタロペプチダーゼ13(コラゲナーゼ3))、TIMP2(TIMPメタロペプチダーゼ阻害因子2)、CYP19A1(シトクロムP450、ファミリー19、サブファミリーA、ポリペプチド1)、CYP21A2(シトクロムP450、ファミリー21、サブファミリーA、ポリペプチド2)、PTPN22(タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型22(リンパ球))、MYH14(ミオシン、重鎖14、非筋肉性)、MBL2(マンノース結合レクチン(プロテインC)2、可溶性(オプソニン欠損))、SELPLG(セレクチンPリガンド)、AOC3(アミンオキシダーゼ、銅含有3(血管接着タンパク質1))、CTSL1(カテプシンL1)、PCNA(増殖細胞核抗原)、IGF2(インスリン様成長因子2(ソマトメジンA))、ITGB1(インテグリン、β1(フィブロネクチン受容体、βポリペプチド、抗原CD29はMDF2、MSK12を含む))、CAST(カルパスタチン)、CXCL12(ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド12(ストロマ細胞由来因子1))、IGHE(免疫グロブリン重鎖定常ε)、KCNE1(カリウム電位開口型チャネル、Isk関連ファミリー、メンバー1)、TFRC(トランスフェリン受容体(p90、CD71))、COL1A1(コラーゲン、I型、α1)、COL1A2(コラーゲン、I型、α2)、IL2RB(インターロイキン2受容体、β)、PLA2G10(ホスホリパーゼA2、X群)、ANGPT2(アンギオポエチン2)、PROCR(プロテインC受容体、内皮(EPCR))、NOX4(NADPHオキシダーゼ4)、HAMP(ヘプシジン抗菌ペプチド)、PTPN11(タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型11)、SLC2A1(溶質輸送担体ファミリー2(促進性グルコーストランスポーター)、メンバー1)、IL2RA(インターロイキン2受容体、α)、CCL5(ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド5)、IRF1(インターフェロン調節因子1)、CFLAR(CASP8およびFADD様アポトーシス調節因子)、CALCA(カルシトニン関連ポリペプチドα)、EIF4E(真核生物翻訳開始因子4E)、GSTP1(グルタチオンS−トランスフェラーゼπ1)、JAK2(ヤヌスキナーゼ2)、CYP3A5(シトクロムP450、ファミリー3、サブファミリーA、ポリペプチド5)、HSPG2(ヘパラン硫酸プロテオグリカン2)、CCL3(ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド3)、MYD88(ミエロイド分化一次応答遺伝子(88))、VIP(血管作動性腸管ペプチド)、SOAT1(ステロールO−アシルトランスフェラーゼ1)、ADRBK1(アドレナリン作動性、β、受容体キナーゼ1)、NR4A2(核内受容体サブファミリー4、グループA、メンバー2)、MMP8(マトリックスメタロペプチダーゼ8(好中球コラゲナーゼ))、NPR2(ナトリウム利尿ペプチド受容体B/グアニル酸シクラーゼB(心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体B))、GCH1(GTPシクロヒドロラーゼ1)、EPRS(グルタミル−プロリル−tRNAシンテターゼ)、PPARGC1A(ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、コアクチベーター1α)、F12(凝固第XII因子(ハーゲマン因子))、PECAM1(血小板/内皮細胞接着分子)、CCL4(ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド4)、SERPINA3(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードA(α−1アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン)、メンバー3)、CASR(カルシウム感知受容体)、GJA5(ギャップ結合タンパク質、α5、40kDa)、FABP2(脂肪酸結合タンパク質2、腸)、TTF2(転写終結因子、RNAポリメラーゼII)、PROS1(プロテインS(α))、CTF1(カルジオトロフィン1)、SGCB(サルコグリカン、β(43kDaジストロフィン関連糖タンパク質))、YME1L1(YME1様1(S.セレビシエ(S.cerevisiae)))、CAMP(カテリシジン抗菌ペプチド)、ZC3H12A(ジンクフィンガーCCCH型含有12A)、AKR1B1(アルド−ケトレダクターゼファミリー1、メンバーB1(アルドースレダクターゼ))、DES(デスミン)、MMP7(マトリックスメタロペプチダーゼ7(マトリライシン、子宮))、AHR(アリール炭化水素受容体)、CSF1(コロニー刺激因子1(マクロファージ))、HDAC9(ヒストン脱アセチル化酵素9)、CTGF(結合組織成長因子)、KCNMA1(大コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル、サブファミリーM、αメンバー1)、UGT1A(UDPグルクロノシルトランスフェラーゼ1ファミリー、ポリペプチドA複合遺伝子座)、PRKCA(プロテインキナーゼC、α)、COMT(カテコール−β−メチルトランスフェラーゼ)、S100B(S10
0
カルシウム結合タンパク質B)、EGR1(初期増殖応答1)、PRL(プロラクチン)、IL15(インターロイキン15)、DRD4(ドーパミン受容体D4)、CAMK2G(カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIγ)、SLC22A2(溶質輸送担体ファミリー22(有機カチオントランスポーター)、メンバー2)、CCL11(ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド11)、PGF(B321胎盤成長因子)、THPO(トロンボポエチン)、GP6(糖タンパク質VI(血小板))、TACR1(タキキニン受容体1)、NTS(ニューロテンシン)、HNF1A(HNF1ホメオボックスA)、SST(ソマトスタチン)、KCND1(カリウム電位開口型チャネル、Shal関連サブファミリー、メンバー1)、LOC646627(ホスホリパーゼ阻害因子)、TBXAS1(トロンボキサンAシンターゼ1(血小板))、CYP2J2(シトクロムP450、ファミリー2、サブファミリーJ、ポリペプチド2)、TBXA2R(トロンボキサンA2受容体)、ADH1C(アルコールデヒドロゲナーゼ1C(クラスI)、γポリペプチド)、ALOX12(アラキドン酸12−リポキシゲナーゼ)、AHSG(α−2−HS−糖タンパク質)、BHMT(ベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ)、GJA4(ギャップ結合タンパク質、α4、37kDa)、SLC25A4(溶質輸送担体ファミリー25(ミトコンドリア輸送担体;アデニンヌクレオチドトランスロケーター)、メンバー4)、ACLY(ATPクエン酸リアーゼ)、ALOX5AP(アラキドン酸5−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質)、NUMA1(核有糸分裂装置タンパク質1)、CYP27B1(シトクロムP450、ファミリー27、サブファミリーB、ポリペプチド1)、CYSLTR2(システイニルロイコトリエン受容体2)、SOD3(スーパーオキシドジスムターゼ3、細胞外)、LTC4S(ロイコトリエンC4シンターゼ)、UCN(ウロコルチン)、GHRL(グレリン/オベスタチンプレプロペプチド)、APOC2(アポリポタンパク質C−II)、CLEC4A(C型レクチンドメインファミリー4、メンバーA)、KBTBD10(ケルヒリピートおよびBTB(POZ)ドメイン含有10)、TNC(テネイシンC)、TYMS(チミジル酸シンテターゼ)、SHCl(SHC(Src相同性2ドメイン含有)形質転換タンパク質1)、LRP1(低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質1)、SOCS3(サイトカインシグナル伝達のサプレッサー3)、ADH1B(アルコールデヒドロゲナーゼ1B(クラスI)、βポリペプチド)、KLK3(カリクレイン関連ペプチダーゼ3)、HSD11B1(ヒドロキシステロイド(11−β)デヒドロゲナーゼ1)、VKORC1(ビタミンKエポキシドレダクターゼ複合体、サブユニット1)、SERPINB2(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードB(オボアルブミン)、メンバー2)、TNS1(テンシン1)、RNF19A(リングフィンガータンパク質19A)、EPOR(エリスロポエチン受容体)、ITGAM(インテグリン、αM(補体成分3受容体3サブユニット))、PITX2(ペアード様ホメオドメイン2)、MAPK7(マイトジェン活性化プロテインキナーゼ7)、FCGR3A(IgGのFc断片、低親和性111a、受容体(CD16a))、LEPR(レプチン受容体)、ENG(エンドグリン)、GPX1(グルタチオンペルオキシダーゼ1)、GOT2(グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ2、ミトコンドリア(アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ2))、HRH1(ヒスタミン受容体H1)、NR112(核内受容体サブファミリー1、グループI、メンバー2)、CRH(コルチコトロピン放出ホルモン)、HTR1A(5−ヒドロキシトリプタミン(セロトニン)受容体1A)、VDAC1(電位依存性アニオンチャネル1)、HPSE(ヘパラナーゼ)、SFTPD(サーファクタントタンパク質D)、TAP2(トランスポーター2、ATP結合カセット、サブファミリーB(MDR/TAP))、RNF123(リングフィンガータンパク質123)、PTK2B(PTK2Bプロテインチロシンキナーゼ2β)、NTRK2(神経栄養チロシンキナーゼ、受容体、2型)、IL6R(インターロイキン6受容体)、ACHE(アセチルコリンエステラーゼ(Yt血液型))、GLP1R(グルカゴン様ペプチド1受容体)、GHR(成長ホルモン受容体)、GSR(グルタチオンレダクターゼ)、NQO1(NAD(P)Hデヒドロゲナーゼ、キノン1)、NR5A1(核内受容体サブファミリー5、グループA、メンバー1)、GJB2(ギャップ結合タンパク質、β2、26kDa)、SLC9A1(溶質輸送担体ファミリー9(ナトリウム/水素交換体)、メンバー1)、MAOA(モノアミンオキシダーゼA)、PCSK9(プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型)、FCGR2A(IgGのFc断片、低親和性IIa、受容体(CD32))、SERPINF1(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードF(α−2抗プラスミン、色素上皮由来因子)、メンバー1)、EDN3(エンドセリン3)、DHFR(ジヒドロ葉酸レダクターゼ)、GAS6(成長停止特異的6)、SMPD1(スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ1、酸性リソソーム)、UCP2(脱共役タンパク質2(ミトコンドリア、プロトン担体))、TFAP2A(転写因子AP−2α(活性化エンハンサー結合タンパク質2α))、C4BPA(補体成分4結合タンパク質、α)、SERPINF2(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードF(α−2抗プラスミン、色素上皮由来因子)、メンバー2)、TYMP(チミジンホスホリラーゼ)、ALPP(アルカリホスファターゼ、胎盤(リーガン(Regan)アイソザイム))、CXCR2(ケモカイン(C−X−Cモチーフ)受容体2)、SLC39A3(溶質輸送担体ファミリー39(亜鉛トランスポーター)、メンバー3)、ABCG2(ATP結合カセット、サブファミリーG(WHITE)、メンバー2)、ADA(アデノシンデアミナーゼ)、JAK3(ヤヌスキナーゼ3)、HSPA1A(熱ショック70kDaタンパク質1A)、FASN(脂肪酸シンターゼ)、FGF1(線維芽細胞成長因子1(酸性))、F11(凝固第XI因子)、ATP7A(ATPアーゼ、Cu++輸送、αポリペプチド)、CR1(補体成分(3b/4b)受容体1(Knops血液型))、GFAP(グリア線維性酸性タンパク質)、ROCK1(Rho関連、コイルドコイル含有プロテインキナーゼ1)、MECP2(メチルCpG結合タンパク質2(レット症候群))、MYLK(ミオシン軽鎖キナーゼ)、BCHE(ブチリルコリンエステラーゼ)、LIPE(リパーゼ、ホルモン感受性)、PRDX5(ペルオキシレドキシン5)、ADORA1(アデノシンA1受容体)、WRN(ウェルナー症候群、RecQヘリカーゼ様)、CXCR3(ケモカイン(C−X−Cモチーフ)受容体3)、CD81(CD81分子)、SMAD7(SMADファミリーメンバー7)、LAMC2(ラミニン、γ2)、MAP3K5(マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ5)、CHGA(クロモグラニンA(副甲状腺分泌タンパク質1))、IAPP(膵島アミロイドポリペプチド)、RHO(ロドプシン)、ENPP1(エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ1)、PTHLH(副甲状腺ホルモン様ホルモン)、NRG1(ニューレグリン1)、VEGFC(血管内皮増殖因子C)、ENPEP(グルタミルアミノペプチダーゼ(アミノペプチダーゼA))、CEBPB(CCAAT/エンハンサー結合タンパク質(C/EBP)、β)、NAGLU(N−アセチルグルコサミニダーゼ、α−)、F2RL3(凝固第II因子(トロンビン)受容体様3)、CX3CL1(ケモカイン(C−X3−Cモチーフ)リガンド1)、BDKRB1(ブラジキニン受容体B1)、ADAMTS13(トロンボスポンジン1型モチーフを有するADAMメタロペプチダーゼ、13)、ELANE(エラスターゼ、好中球発現)、ENPP2(エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼ2)、CISH(サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質)、GAST(ガストリン)、MYOC(ミオシリン、小柱網誘導性グルココルチコイド応答)、ATP1A2(ATPアーゼ、Na+/K+輸送、α2ポリペプチド)、NF1(ニューロフィブロミン1)、GJB1(ギャップ結合タンパク質、β1、32kDa)、MEF2A(筋細胞エンハンサー因子2A)、VCL(ビンキュリン)、BMPR2(骨形成タンパク質受容体、II型(セリン/スレオニンキナーゼ))、TUBB(チューブリン、β)、CDC42(細胞分裂周期42(GTP結合タンパク質、25kDa))、KRT18(ケラチン18)、HSF1(熱ショック転写因子1)、MYB(v−myb骨髄芽球症ウイルス癌遺伝子ホモログ(トリ))、PRKAA2(プロテインキナーゼ、AMP活性化、α2触媒サブユニット)、ROCK2(Rho関連、コイルドコイル含有プロテインキナーゼ2)、TFPI(組織因子経路阻害因子(リポタンパク質関連凝固阻害因子))、PRKG1(プロテインキナーゼ、cGMP依存性、I型)、BMP2(骨形成タンパク質2)、CTNND1(カテニン(カドヘリン関連タンパク質)、δ1)、CTH(シスタチオナーゼ(シスタチオニンγ−リアーゼ))、CTSS(カテプシンS)、VAV2(vav 2グアニンヌクレオチド交換因子)、NPY2R(ニューロペプチドY受容体Y2)、IGFBP2(インスリン様成長因子結合タンパク質2、36kDa)、CD28(CD28分子)、GSTA1(グルタチオンS−トランスフェラーゼα1)、PPIA(ペプチジルプロリルイソメラーゼA(シクロフィリンA))、APOH(アポリポタンパク質H(β−2−糖タンパク質I))、S100A8(S100カルシウム結合タンパク質A8)、IL11(インターロイキン11)、ALOX15(アラキドン酸15−リポキシゲナーゼ)、FBLN1(フィビュリン1)、NR1H3(核内受容体サブファミリー1、グループH、メンバー3)、SCD(ステアロイル−CoAデサチュラーゼ(Δ−9−デサチュラーゼ))、GIP(胃抑制ポリペプチド)、CHGB(クロモグラニンB(セクレトグラニン1))、PRKCB(プロテインキナーゼC、β)、SRD5A1(ステロイド−5−アルファ−レダクターゼ、αポリペプチド1(3−オキソ−5α−ステロイドΔ4−デヒドロゲナーゼα1))、HSD11B2(ヒドロキシステロイド(11−β)デヒドロゲナーゼ2)、CALCRL(カルシトニン受容体様)、GALNT2(UDP−N−アセチル−α−D−ガラクトサミン:ポリペプチドN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ2(GalNAc−T2))、ANGPTL4(アンギオポエチン様4)、KCNN4(カリウム中間体/小コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーN、メンバー4)、PIK3C2A(ホスホイノシチド−3−キナーゼ、クラス2、αポリペプチド)、HBEGF(ヘパリン結合EGF様成長因子)、CYP7A1(シトクロムP450、ファミリー7、サブファミリーA、ポリペプチド1)、HLA−DRB5(主要組織適合遺伝子複合体、クラスII、DR β 5)、BNIP3(BCL2/アデノウイルスE1B 19kDa相互作用タンパク質3)、GCKR(グルコキナーゼ(ヘキソキナーゼ4)調節因子)、S100A12(S100カルシウム結合タンパク質A12)、PADI4(ペプチジルアルギニンデイミナーゼ、IV型)、HSPA14(熱ショック70kDaタンパク質14)、CXCR1(ケモカイン(C−X−Cモチーフ)受容体1)、H19(H19、刷り込み母性発現転写物(非タンパク質コード))、KRTAP19−3(ケラチン関連タンパク質19−3)、IDDM2(インスリン依存性真性
糖
尿病2)、RAC2(ras関連C3ボツリヌス毒素基質2(rhoファミリー、低分子GTP結合タンパク質Rac2))、RYR1(リアノジン受容体1(骨格))、CLOCK(時計ホモログ(マウス))、NGFR(神経成長因子受容体(TNFRスーパーファミリー、メンバー16))、DBH(ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ(ドーパミンβ−モノオキシゲナーゼ))、CHRNA4(コリン作動性受容体、ニコチン性、α4)、CACNA1C(カルシウムチャネル、電位依存性、L型、α1Cサブユニット)、PRKAG2(プロテインキナーゼ、AMP活性化、γ2非触媒サブユニット)、CHAT(コリンアセチルトランスフェラーゼ)、PTGDS(プロスタグランジンD2シンターゼ21kDa(脳))、NR1H2(核内受容体サブファミリー1、グループH、メンバー2)、TEK(TEKチロシンキナーゼ、内皮)、VEGFB(血管内皮増殖因子B)、MEF2C(筋細胞エンハンサー因子2C)、MAPKAPK2(マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ2)、TNFRSF11A(腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー11a、NFKBアクチベータ)、HSPA9(熱ショック70kDaタンパク質9(モルタリン))、CYSLTR1(システイニルロイコトリエン受容体1)、MAT1A(メチオニンアデノシルトランスフェラーゼI、α)、OPRL1(オピエート受容体様1)、IMPA1(イノシトール(myo)−1(または4)−モノホスファターゼ1)、CLCN2(クロライドチャネル2)、DLD(ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ)、PSMA6(プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン(macropain))サブユニット、α型、6)、PSMB8(プロテアソーム(プロソーム、マクロパイン)サブユニット、β型、8(大型多機能ペプチダーゼ7))、CHI3L1(キチナーゼ3様1(軟骨糖タンパク質−39))、ALDH1B1(アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーB1)、PARP2(ポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼ2)、STAR(ステロイド産生急性調節タンパク質)、LBP(リポ多糖結合タンパク質)、ABCC6(ATP結合カセット、サブファミリーC(CFTR/MRP)、メンバー6)、RGS2(Gタンパク質シグナル伝達の調節因子2、24kDa)、EFNB2(エフリン−B2)、GJB6(ギャップ結合タンパク質、β6、30kDa)、APOA2(アポリポタンパク質A−II)、AMPD1(アデノシン一リン酸デアミナーゼ1)、DYSF(ジスフェリン、肢帯型筋ジストロフィー2B(常染色体劣性遺伝))、FDFT1(ファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ1)、EDN2(エンドセリン2)、CCR6(ケモカイン(C−Cモチーフ)受容体6)、GJB3(ギャップ結合タンパク質、β3、31kDa)、IL1RL1(インターロイキン1受容体様1)、ENTPD1(エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ1)、BBS4(バルデー−ビードル症候群4)、CELSR2(カドヘリン、EGF LAG7回膜貫通型G型受容体2(フラミンゴホモログ、ショウジョウバエ属(Drosophila)))、F11R(F11受容体)、RAPGEF3(Rapグアニンヌクレオチド交換因子(GEF)3)、HYAL1(ヒアルロノグルコサミニダーゼ1)、ZNF259(ジンクフィンガータンパク質259)、ATOX1(ATX1抗酸化タンパク質1ホモログ(酵母))、ATF6(活性化転写因子6)、KHK(ケトヘキソキナーゼ(フルクトキナーゼ))、SAT1(スペルミジン/スペルミンN1−アセチルトランスフェラーゼ1)、GGH(γ−グルタミルヒドロラーゼ(コンジュガーゼ、ホリルポリγグルタミルヒドロラーゼ))、TIMP4(TIMPメタロペプチダーゼ阻害因子4)、SLC4A4(溶質輸送担体ファミリー4、ナトリウム・炭酸水素イオン共輸送体、メンバー4)、PDE2A(ホスホジエステラーゼ2A、cGMP刺激性)、PDE3B(ホスホジエステラーゼ3B、cGMP阻害性)、FADS1(脂肪酸デサチュラーゼ1)、FADS2(脂肪酸デサチュラーゼ2)、TMSB4X(チモシンβ4、X連鎖)、TXNIP(チオレドキシン相互作用タンパク質)、LIMS1(LIMおよび老化細胞抗原様ドメイン1)、RHOB(rasホモログ遺伝子ファミリー、メンバーB)、LY96(リンパ球抗原96)、FOXO1(フォークヘッドボックスO1)、PNPLA2(パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有2)、TRH(サイロトロピン放出ホルモン)、GJC1(ギャップ結合タンパク質、γ1、45kDa)、SLC17A5(溶質輸送担体ファミリー17(アニオン/糖輸送体)、メンバー5)、FTO(体脂肪量および肥満関連)、GJD2(ギャップ結合タンパク質、δ2、36kDa)、PSRC1(プロリン/セリンリッチコイルドコイル1)、CASP12(カスパーゼ12(遺伝子/偽遺伝子))、GPBAR1(Gタンパク質共役型胆汁酸受容体1)、PXK(PXドメイン含有セリン/スレオニンキナーゼ)、IL33(インターロイキン33)、TRIB1(トリブルズ(tribbles)ホモログ1(ショウジョウバエ属(Drosophila)))、PBX4(プレB細胞白血病ホメオボックス4)、NUPR1(核タンパク質、転写調節因子、1)、15−Sep(15kDa セレノプロテイン)、CILP2(軟骨中間層タンパク質2)、TERC(テロメラーゼRNA成分)、GGT2(γ−グルタミルトランスフェラーゼ2)、MT−CO1(ミトコンドリアにコードされたシトクロムcオキシダーゼI)、およびUOX(尿酸オキシダーゼ、偽遺伝子)を含み得る。
本発明はまた、CRISPR−Cas系を腎臓に送達することも企図する。治療用核酸の細胞取込みを誘導するための送達戦略には、物理的力またはベクター系、例えばウイルスベース、脂質ベースまたは複合体ベースの送達、またはナノ担体が含まれる。核酸が流体力学的高圧注入で全身的に腎細胞に送られたとき見込まれる臨床的意義が低い初期の適用以降、種々の動物腎疾患モデルにおいてインビボで転写後イベントを標的化するため幅広い遺伝子治療ウイルスおよび非ウイルス担体が既に適用されている(Csaba Revesz and Peter Hamar(2011)、「腎臓においてRNAを標的化する送達方法(Delivery Methods to Target RNAs in the Kidney)」、Gene Therapy Applications,Prof.Chunsheng Kang(Ed.),ISBN:978−953−307−541−9、InTech、以下から入手可能:http://www.intechopen.com/books/gene−therapy−applications/delivery−methods−to−target−rnas−in−the−kidney)。腎臓に対する送達方法は、以下のとおり要約される:
本発明はまた、CRISPR−Cas系を一方または両方の肺に送達することも企図する。
組成物を発現させるため組成物を作動可能にコードする1つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達すること
を含む目的ゲノム遺伝子座における標的配列の操作を含み、
ここでこの組成物は、
I.CRISPR−Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)好適な哺乳類細胞におけるCF標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
(b)tracrメイト配列、および
(c)tracr配列
を含むポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第1の調節エレメント、および
II.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント、
[(a)、(b)および(c)は、5’から3’配向で配置されており、
成分IおよびIIは、系の同じまたは異なるベクター上にあり、
転写されるとtracrメイト配列がtracr配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
CRISPR複合体が、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列、および(2)tracr配列にハイブリダイズするtracrメイト配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含む]を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を含む。CFに関して、好ましい標的DNA配列はCFTRΔ508突然変異を含む。好ましいPAMは上記に記載される。好ましいCRISPR酵素は任意のCas(本明細書に記載されるものであるが、特に実施例22に記載されるもの)である。
本発明はまた、CRISPR−Cas系を筋肉に送達することも企図する。
本発明はまた、CRISPR−Cas系を皮膚に送達することも企図する。
本発明はまた、B型肝炎ウイルス(HBV)の治療にも適用することができる。しかしながら、CRISPR Cas系は、内因性低分子RNA経路が過飽和になるリスクなどのRNAiの欠点を回避するように、例えば用量および配列を最適化するなどして適合させなければならない(例えば、Grimm et al.,Nature vol.441,26 May 2006を参照のこと)。例えば、ヒト当たり約1〜10×1014粒子などの低用量が企図される。
RNA干渉(RNAi)は、ハンチントン病の疾患原因遺伝子であるHTTの発現を低下させることによってこの障害に対する治療可能性を提供し(例えば、McBride et al.,Molecular Therapy vol.19 no.12 Dec.2011,pp.2152−2162を参照のこと)、従って出願人は、それをCRISPR−Cas系に使用しおよび/または適合させることができると仮定する。CRISPR−Cas系は、アンチセンス配列のオフターゲットの可能性を低下させるアルゴリズムを使用して生成され得る。CRISPR−Cas配列は、マウス、アカゲザルまたはヒトハンチンチンのいずれのエクソン52にある配列も標的とし、かつAAVなどのウイルスベクターで発現し得る。ヒトを含めた動物に、半球当たり約3回のマイクロインジェクション(合計6回の注入):最初は前交連から1mm吻側に(12μl)および残りの2回の注入(それぞれ12μlおよび10μl)は最初の注入から3および6mm尾側に離して、1e12vg/mlのAAVによって約1μl/分の速度で注入されてもよく、注入液を針先端から拡散させるため、針はその場にさらに5分間残された。
本発明は核酸を使用して標的DNA配列を結合する。核酸はタンパク質と比べて作製がはるかに容易で安価であり、かつ相同性が求められるストレッチの長さに応じて特異性を変化させることができるため、これは有利である。例えば、複数のフィンガーの複雑な三次元の配置は不要である。
一態様において、本発明は、CRISPR−Cas系のエンジニアリングおよび最適化において使用されるベクターを提供する。
一部の実施形態において、調節エレメントは、CRISPR系の1つ以上のエレメントの発現をドライブするようにCRISPR系の1つ以上のエレメントに作動可能に結合している。一般に、CRISPR(クラスター化等間隔短鎖回分リピート)は、SPIDR(スペーサー散在型ダイレクトリピート(SPacer Interspersed Direct Repeat))としても公知であり、通常、特定の細菌種に特異的であるDNA遺伝子座のファミリーを構成する。CRISPR遺伝子座は、大腸菌(E.coli)中で認識された区別されるクラスの散在型短鎖配列リピート(SSR)(Ishino et al.,J.Bacteriol.,169:5429−5433[1987];およびNakata et al.,J.Bacteriol.,171:3553−3556[1989])および関連遺伝子を含む。類似の散在型SSRが、ハロフェラックス・メディテラネイ(Haloferax mediterranei)、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、アナベナ属(Anabaena)、および結核菌(Mycobacterium tuberculosis)中で同定されている(Groenen et al.,Mol.Microbiol.,10:1057−1065[1993];Hoe et al.,Emerg.Infect.Dis.,5:254−263[1999];Masepohl et al.,Biochim.Biophys.Acta 1307:26−30[1996];およびMojica et al.,Mol.Microbiol.,17:85−93[1995]参照)。CRISPR遺伝子座は、典型的には他のSSRとリピートの構造が異なり、それは短鎖等間隔リピート(SRSR)と称されている(Janssen et al.,OMICS J.Integ.Biol.,6:23−33[2002];およびMojica et al.,Mol.Microbiol.,36:244−246[2000])。一般に、リピートは、実質的に一定の長さを有するユニーク介入配列により等間隔とされているクラスターで生じる短いエレメントである(Mojica et al.,[2000]、前掲)。リピート配列は株間で高度に保存されているが、散在型リピートの数およびスペーサー領域の配列は、典型的には、株ごとに異なる(van Embden et al.,J.Bacteriol.,182:2393−2401[2000])。CRISPR遺伝子座は、40を超える原核生物中で同定されており(例えば、Jansen et al.,Mol.Microbiol.,43:1565−1575[2002];およびMojica et al.,[2005]参照)、例として、限定されるものではないが、アエロパイラム属(Aeropyrum)、パイロバキュラム属(Pyrobaculum)、スルフォロバス属(Sulfolobus)、アーケオグロバス属(Archaeoglobus)、ハロカーキュラ属(Halocarcula)、メタノバクテリウム属(Methanobacterium)、メタノコッカス属(Methanococcus)、メタノサルシナ属(Methanosarcina)、メタノパイラス属(Methanopyrus)、パイロコッカス属(Pyrococcus)、ピクロフィラス属(Picrophilus)、サーモプラズマ属(Thermoplasma)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ストレプトマイセス属(Streptomyces)、アキフェックス属(Aquifex)、ポーフィロモナス属(Porphyromonas)、クロロビウム属(Chlorobium)、サーマス属(Thermus)、バシラス属(Bacillus)、リステリア属(Listeria)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、クロストリジウム属(Clostridium)、サーモアナエロバクター属(Thermoanaerobacter)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、アザーカス属(Azarcus)、クロモバクテリウム属(Chromobacterium)、ネイセリア属(Neisseria)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)、デスルフォビブリオ属(Desulfovibrio)、ジオバクター属(Geobacter)、ミクソコッカス属(Myxococcus)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ウォリネラ属(Wolinella)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、エルウィニア属(Erwinia)、エシェリキア属(Escherichia)、レジオネラ属(Legionella)、メチロコッカス属(Methylococcus)、パスツレラ属(Pasteurella)、フォトバクテリウム属(Photobacterium)、サルモネラ属(Salmonella)、キサントモナス属(Xanthomonas)、エルシニア属(Yersinia)、トレポネーマ属(Treponema)、およびサーモトガ属(Thermotoga)である。
1.II型CRISPR遺伝子座に隣接するゲノム配列の2Kbウィンドウに存在する;
2.20〜50bpにわたる;および
3.20〜50bpの間隔が置かれている。
1.ダイレクトリピートとの配列相同性(最大18bpのミスマッチを含むGeneiousにおけるモチーフ検索);
2.転写方向における予測されたRho非依存性転写ターミネーターの存在;および
3.tracrRNAとダイレクトリピートとの間の安定したヘアピン二次構造。
この場合にはヒトに最適化された(すなわちヒトでの発現に最適化されている)コドン最適化配列の例が本明細書に提供される(SaCas9ヒトコドン最適化配列を参照のこと)。これが好ましいが、他の例が可能であることが理解されるであろうとともに、宿主種に対するコドン最適化は公知である。
一部の実施形態において、ベクターは、1つ以上の核局在化配列(NLS)、例えば、約また約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも多い数を超えるNLSを含むCRISPR酵素をコードする。一部の実施形態において、CRISPR酵素は、アミノ末端またはその付近における約または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも多い数を超えるNLS、カルボキシ末端またはその付近における約または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも多い数を超えるNLS、またはそれらの組合せ(例えば、アミノ末端における1つ以上のNLSおよびカルボキシ末端における1つ以上のNLS)を含む。2つ以上のNLSが存在する場合、それぞれは、単一のNLSが2つ以上のコピーで存在し得るように他のものから独立して、および/または1つ以上のコピーで存在する1つ以上の他のNLSとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい実施形態において、CRISPR酵素は、多くとも6つのNLSを含む。一部の実施形態において、NLSは、NLSの最近傍アミノ酸が、NまたはC末端からポリペプチド鎖に沿って約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、またはそれよりも多いアミノ酸内である場合、NまたはC末端付近に存在するとみなす。NLSの非限定的な例としては、アミノ酸配列PKKKRKV(配列番号 )を有するSV40ウイルスラージT抗原のNLS;ヌクレオプラスミンからのNLS(例えば、配列KRPAATKKAGQAKKKK(配列番号 )を有するヌクレオプラスミン二分(bipartite)NLS);アミノ酸配列PAAKRVKLD(配列番号 )またはRQRRNELKRSP(配列番号 )を有するc−mycNLS;配列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(配列番号 )を有するhRNPA1 M9 NLS;インポーチンアルファからのIBBドメインの配列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(配列番号 );筋腫Tタンパク質の配列VSRKRPRP(配列番号 )およびPPKKARED(配列番号 );ヒトp53の配列POPKKKPL;マウスc−abl IVの配列SALIKKKKKMAP;インフルエンザウイルスNS1の配列DRLRR(配列番号 )およびPKQKKRK(配列番号 );肝炎ウイルスデルタ抗原の配列RKLKKKIKKL(配列番号 );マウスMx1タンパク質の配列REKKKFLKRR(配列番号 );ヒトポリ(ADP−リボース)ポリメラーゼの配列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(配列番号 );ならびにステロイドホルモン受容体(ヒト)グルココルチコイドの配列RKCLQAGMNLEARKTKK(配列番号 )に由来するNLS配列が挙げられる。
特に好ましいガイドは、本明細書に記載されるとおり20〜22ヌクレオチド(nt)の範囲であり、実施例39を参照のこと。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向するために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適にアラインされた場合、約または約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、またはそれよりも大きい数を超える。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Smith−Watermanアルゴリズム、Needleman−Wunschアルゴリズム、Burrows−Wheeler Transformをベースとするアルゴリズム(例えば、Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies;www.novocraft.comにおいて入手可能)、ELAND(Illumina,San Diego,CA)、SOAP(soap.genomics.org.cnにおいて入手可能)、およびMaq(maq.sourceforge.netにおいて入手可能)が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約または約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12、またはそれよりも小さい数未満のヌクレオチド長である。標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価することができる。例えば、CRISPR複合体を形成するために十分なCRISPR系の成分、例として、試験すべきガイド配列は、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、CRISPR配列の成分をコードするベクターによる形質移入により提供することができ、次いで標的配列内の優先的開裂を例えば本明細書に記載のSurveyorアッセイにより評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の開裂は、試験管中で標的配列、CRISPR複合体の成分、例として、試験すべきガイド配列および試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、試験および対照ガイド配列反応間の標的配列における結合または開裂の比率を比較することにより評価することができる。他のアッセイが考えられ、当業者はそれを認識する。
一般に、tracrメイト配列は、(1)対応するtracr配列を含有する細胞中でtracrメイト配列によりフランキングされているガイド配列の切り出し;および(2)標的配列におけるCRISPR複合体の形成(CRISPR複合体は、tracr配列にハイブリダイズされるtracrメイト配列を含む)の1つ以上を促進するためにtracr配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、2つの配列の短い方の長さに沿うtracrメイト配列およびtracr配列の最適なアラインメントに準拠する。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、二次構造、例えばtracr配列またはtracrメイト配列内の自己相補性をさらに説明し得る。一部の実施形態において、2つの短い方の長さに沿ったtracr配列とtracrメイト配列との間の相補性の程度は、最適にアラインされた場合、約または約25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97.5%、99%、またはそれよりも大きい数を超える。一部の実施形態において、tracr配列は、約または約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、tracr配列およびtractメイト配列は、単一転写物内に含有され、その結果、2つの間のハイブリダイゼーションが二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を産生する。本発明の一実施形態において、転写物または転写されるポリヌクレオチド配列は、少なくとも2つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態において、転写物は、2、3、4または5つのヘアピンを有する。本発明の別のさらなる実施形態において、転写物は、多くとも5つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、最後の「N」およびループの上流の5’側の配列の部分は、tracrメイト配列に対応し、ループの3’側の配列の部分は、tracr配列に対応する。ガイド配列、tracrメイト配列、およびtracr配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり(5’から3’に列記)、「N」は、ガイド配列の塩基を表し、第1の小文字のブロックは、tracrメイト配列を表し、第2の小文字のブロックは、tracr配列を表し、最後のポリT配列は、転写ターミネーターを表す:
一部の実施形態において、組換えテンプレートも提供される。組換えテンプレートは、本明細書に記載の別のベクターの成分であり、別個のベクター中で含有させ、または別個のポリヌクレオチドとして提供することができる。一部の実施形態において、組換えテンプレートは、例えば、CRISPR複合体の一部としてのCRISPR酵素によりニック形成または開裂される標的配列内またはその付近での相同組換えにおけるテンプレートとして機能するように設計される。テンプレートポリヌクレオチドは、任意の好適な長さ、例えば、約または約10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000、またはそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適にアラインされた場合、テンプレートポリヌクレオチドは、標的配列の1つ以上のヌクレオチド(例えば、約または約1、5、10、15、20またはそれよりも多い数を超えるヌクレオチド)と重複し得る。一部の実施形態において、テンプレート配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアラインされた場合、テンプレートポリヌクレオチドの最近傍ヌクレオチドは、標的配列から約1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000、またはそれよりも多いヌクレオチド内に存在する。HDR経路に関する考察を、例えば「CRISPR複合体」に関して本明細書に提供する。
一部の実施形態において、CRISPR酵素は、1つ以上の異種タンパク質ドメイン(例えば、CRISPR酵素の他の約または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれよりも多い数を超えるドメイン)を含む融合タンパク質の一部である。CRISPR酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、および場合により任意の2つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。CRISPR酵素に融合させることができるタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、ならびに以下の活性:メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、RNA開裂活性および核酸結合活性の1つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン(His)タグ、V5タグ、FLAGタグ、インフルエンザヘマグルチニン(HA)タグ、Mycタグ、VSV−Gタグ、およびチオレドキシン(Trx)タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)、HcRed、DsRed、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、および自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質(BFP)が挙げられる。CRISPR酵素は、DNA分子に結合し、または他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質の断片、例として、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質(MBP)、S−タグ、Lex A DNA結合ドメイン(DBD)融合物、GAL4DNA結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス(HSV)BP16タンパク質融合物をコードする遺伝子配列に融合させることができる。CRISPR酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20110059502号明細書に記載されている。一部の実施形態において、タグ化CRISPR酵素を使用して標的配列の局在を同定する。
一部の実施形態では、CRISPR酵素は誘導性システムの成分をなし得る。このシステムの誘導可能である性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集または遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギーおよび熱エネルギーを挙げることができる。誘導性システムの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Tet−OnまたはTet−Off)、小分子2ハイブリッド転写活性化システム(FKBP、ABA等)、または光誘導性システム(フィトクロム、LOVドメイン、またはクリプトクロム)が含まれる。一実施形態において、CRISPR酵素は、配列特異的に転写活性の変化を誘導する光誘導性転写エフェクター(LITE)の一部であり得る。光の成分には、CRISPR酵素、光応答性クリプトクロムヘテロ二量体(例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来)、および転写活性化/抑制ドメインが含まれ得る。誘導性DNA結合タンパク質およびその使用方法のさらなる例は、米国仮特許出願第61/736465号明細書および米国特許出願第61/721,283号明細書(本明細書によって全体として参照により組み込まれる)に提供される。
一部の態様において、本発明は、1つ以上のポリヌクレオチド、例えば、または本明細書に記載の1つ以上のベクター、1つ以上のその転写物、および/またはそれから転写された1つまたはタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、そのような細胞により産生された細胞、およびそのような細胞を含み、またはそれから産生された動物をさらに提供する。一部の実施形態において、ガイド配列との組合せの(および場合によりそれと複合体形成している)CRISPR酵素を細胞に送達する。慣用のウイルスおよび非ウイルスベース遺伝子移入法を使用して核酸を哺乳動物細胞または標的組織中に導入することができる。このような方法を使用してCRISPR系の成分をコードする核酸を培養物中の細胞に、または宿主生物中に投与することができる。非ウイルスベクター送達系としては、DNAプラスミド、RNA(例えば、本明細書に記載のベクターの転写物)、ネイキッド核酸、および送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソーム性またはインテグレートされるゲノムを有するDNAおよびRNAウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の概要については、Anderson,Science 256:808−813(1992);Nabel & Felgner,TIBTECH 11:211−217(1993);Mitani & Caskey,TIBTECH 11:162−166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167−175(1993);Miller,Nature 357:455−460(1992);Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149−1154(1988);Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35−36(1995);Kremer & Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31−44(1995);Haddada et al.,in Current Topics in Microbiology and Immunology,Doerfler and Boehm(eds)(1995);およびYu et al.,Gene Therapy 1:13−26(1994)参照。
一態様において、本発明は、真核細胞における標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボまたはインビトロであってよい。一部の実施形態では、本方法は、ヒトまたは非ヒト動物から細胞または細胞集団を採取することまたは生検を行うこと、および1つまたは複数の細胞を改変することを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。1つまたは複数の細胞は、さらには非ヒト動物に再導入されてもよい。再導入される細胞に関して、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。
一態様において、本発明は、上記の方法および組成物に開示されるエレメントの任意の1つ以上を含むキットを提供する。エレメントは個々にまたは組み合わせで提供されてもよく、および任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、またはチューブに提供されてもよい。一部の実施形態では、キットは1つ以上の言語、例えば2つ以上の言語による説明書を含む。
一態様において、本発明は、CRISPR系の1つ以上のエレメントを使用する方法を提供する。本発明のCRISPR複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変する有効な手段を提供する。本発明のCRISPR複合体は、広範な有用性、例として、非常に多数の細胞タイプ中の標的ポリヌクレオチドの改変(例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化)を有する。したがって、本発明のCRISPR複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、および予後における幅広い用途範囲を有する。例示的CRISPR複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合体形成しているCRISPR酵素を含む。ガイド配列は、次いでtract配列にハイブリダイズするtracrメイト配列に結合している。
本発明の方法を用いて、疾患モデルとして使用し得る動物または細胞を作り出すことができる。本明細書で使用されるとき、「疾患」は、対象における疾患、障害、または徴候を指す。例えば、本発明の方法を用いて、疾患に関連する1つ以上の核酸配列に改変を含む動物もしくは細胞、または疾患に関連する1つ以上の核酸配列の発現が変化している植物、動物もしくは細胞を作り出すことができる。かかる核酸配列は疾患関連タンパク質配列をコードしてもよく、または疾患関連制御配列であってもよい。従って、本発明の実施形態において植物、対象、患者、生物または細胞は、非ヒトの対象、患者、生物または細胞であり得ることが理解される。従って、本発明は、本方法により作製された植物、動物もしくは細胞、またはその子孫を提供する。子孫は、作製されたまたは動物のクローンであってもよく、またはさらに望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じてもよい。細胞は、多細胞生物、特に動物の場合にインビボまたはエキソビボであってよい。細胞が培養下にある例では、適切な培養条件が満たされる場合、かつ好ましくは細胞がこの目的に好適に適合する場合(例えば幹細胞)、細胞系が樹立され得る。ひいては細胞系もまた想定される。
例示的なII型CRISPR系は、4つの遺伝子Cas9、Cas1、Cas2、およびCsn1のクラスター、ならびに2つの非コードRNAエレメント、tracrRNAおよび非反復配列の短いストレッチ(スペーサー、それぞれ約30bp)により間隔が空いている反復配列の特徴的アレイ(ダイレクトリピート)を含有する化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)SF370からのII型CRISPR遺伝子座である。この系において、ターゲティングされるDNA二本鎖切断(DSB)を4つの連続ステップにおいて生成する(図2A)。第1に、2つの非コードRNA、プレcrRNAアレイおよびtracrRNAがCRISPR遺伝子座から転写される。第2に、tracrRNAがプレcrRNAのダイレクトリピートにハイブリダイズし、次いでそれが個々のスペーサー配列を含有する成熟crRNAにプロセシングされる。第3に、成熟crRNA:tracrRNA複合体がCas9を、crRNAのスペーサー領域とプロトスペーサーDNAとの間のヘテロ二本鎖形成を介してプロトスペーサーおよび対応するPAMからなるDNA標的に指向する。最後に、Cas9は、PAMの上流の標的DNAの開裂を媒介してプロトスペーサー内でDSBを創成する(図2A)。この例は、このRNAプログラマブルヌクレアーゼ系を適応させて真核細胞の核中のCRISPR複合体活性を指向する例示プロセスを記載する。
ヒト胚腎臓(HEK)細胞系HEK293FT(Life Technologies)を、10%のウシ胎仔血清(HyClone)、2mMのGlutaMAX(Life Technologies)、100U/mLのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で37℃において5%のCO2インキュベーションで維持した。マウスneuro2A(N2A)細胞系(ATCC)を、5%のウシ胎仔血清(HyClone)、2mMのGlutaMAX(Life Technologies)、100U/mLのペニシリン、および100μg/mLのストレプトマイシンが補給されたDMEMにより、37℃、5%のCO2で維持した。
HEK293FTまたはN2A細胞を、上記プラスミドDNAにより形質移入した。形質移入後、細胞を37℃において72時間インキュベートしてからゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAは、QuickExtractDNA抽出キット(Epicentre)を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、細胞をQuickExtract溶液中で再懸濁させ、65℃において15分間および98℃において10分間インキュベートした。抽出されたゲノムDNAを直ちに処理または−20℃において貯蔵した。
HEK293FTおよびN2A細胞を、プラスミドDNAにより形質移入し、37℃において72時間インキュベートしてから上記のとおりゲノムDNAを抽出した。相同組換え(HR)テンプレートのホモロジーアーム外側のプライマーを使用して標的ゲノム領域をPCR増幅した。PCR産物を1%のアガロースゲル上で分離し、MinElute GelExtraction Kit(Qiagen)により抽出した。精製産物をHindIII(Fermentas)により消化し、6%のNovex TBEポリアクリルアミドゲル(Life Technologies)上で分析した。
RNA二次構造予測は、Institute for Theoretical Chemistry at the University of Viennaにおいて開発されたオンラインウェブサーバーRNAfoldを使用し、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用して実施した(例えば、A.R.Gruber et al.,2008,Cell 106(1):23−24;およびPA Carr and GM Church,2009,Nature Biotechnology 27(12):1151−62参照)。
HEK293FT細胞を上記のとおり維持および形質移入した。細胞をトリプシン処理により回収し、次いでリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で洗浄した。トータル細胞RNAをTRI試薬(Sigma)により製造業者のプロトコルに従って抽出した。抽出されたトータルRNAをNaonodrop(Thermo Scientific)を使用して定量し、同一濃度に正規化した。
RNAを等容量の2×ローディング緩衝液(Ambion)と混合し、95℃に5分間加熱し、氷上で1分間冷蔵し、次いで8%の変性ポリアクリルアミドゲル(SequaGel,National Diagnostics)上に、少なくとも30分間のゲルのプレラン後にロードした。試料を40W限界において1.5時間電気泳動した。その後、RNAをHybond N+メンブレン(GE Healthcare)に300mAにおいてセミドライ転写装置(Bio−rad)中で室温において1.5時間転写した。Stratagene UV CrosslinkerのStratalinker(Stratagene)上のオートクロスリンクボタンを使用してRNAをメンブレンに架橋させた。メンブレンをULTRAhyb−オリゴハイブリダイゼーション緩衝液(Ambion)中で回転させながら42℃において30分間プレハイブリダイズさせ、次いでプローブを添加し、一晩ハイブリダイズさせた。プローブはIDTに発注し、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs)を用いて[ガンマ−32P]ATP(Perkin Elmer)により標識した。メンブレンを予備加温(42℃)された2×SSC、0.5%のSDSにより1分間1回洗浄し、次いで42℃において30分間2回洗浄した。メンブレンを蛍光スクリーンに室温において1時間または一晩曝露させ、次いでphosphorimager(Typhoon)によりスキャンした。
tracrRNA、Cas9、およびリーダーを含むCRISPR遺伝子座エレメントを、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)SF370ゲノムDNAから、ギブソン・アセンブリ(Gibson Assembly)のためのフランキングホモロジーアームを用いてPCR増幅した。2つのBsaI IIS型部位を2つのダイレクトリピート間に導入してスペーサーの容易な挿入を促進した(図8)。Gibson Assembly Master Mix(NEB)を使用してPCR産物をEcoRV消化pACYC184中にtetプロモーターの下流でクローニングした。Csn2の最後の50bpは除き、他の内因性CRISPR系エレメントは除外した。相補的オーバーハングを有するスペーサーをコードするオリゴ(Integrated DNA Technology)をBsaI消化ベクターpDC000(NEB)中にクローニングし、次いでT7リガーゼ(Enzymatics)によりライゲートしてpCRISPRプラスミドを生成した。哺乳類細胞におけるPAM発現を有するスペーサーを含有するチャレンジプラスミド(発現構築物は、図6Bに示すSurveyorアッセイの結果により決定されるとおりの機能と共に図6Aに示す)。転写開始部位を+1として標識し、転写ターミネーターおよびノザンブロットによりプロ―ビングされる配列も示す。プロセシングされたtracrRNAの発現もノザンブロットにより確認した。図6Cは、長鎖または短鎖tracrRNA、ならびにSpCas9およびDR−EMX1(1)−DRを担持するU6発現構築物により形質移入された293FT細胞から抽出されたトータルRNAのノザンブロット分析の結果を示す。左および右側のパネルは、それぞれSpRNアーゼIIIを用いず、または用いて形質移入された293FT細胞からのものである。U6は、ヒトU6snRNAをターゲティングするプローブによりブロットされたローディング対照を示す。短鎖tracrRNA発現構築物の形質移入は、十分なレベルのプロセシング形態のtracrRNA(約75bp)をもたらした。極めて少量の長鎖tracrRNAがノザンブロット上で検出される。
CRISPR系改変および代替例
配列特異的DNA開裂をプログラミングするためにRNAを使用する技能は、種々の研究および産業用途のための新たなクラスのゲノムエンジニアリングツールを定義する。CRISPR系のいくつかの態様は、CRISPRターゲティングの効率および多用途性を増加させるようにさらに改善することができる。最適なCas9活性は、哺乳動物核中に存在するものよりも高いレベルにおけるフリーMg2+の利用可能性に依存し得(例えば、Jinek et al.,2012,Science,337:816参照)、プロトスペーサーのすぐ下流のNGGモチーフについての優先性は、ヒトゲノム中で平均12bpごとでターゲティング能を制限する(図9、ヒト染色体配列のプラスおよびマイナス鎖の両方を評価)。これらの拘束の一部は、微生物メタゲノムにわたるCRISPR遺伝子座の多様性を利用することにより克服することができる(例えば、Makarova et al.,2011,Nat Rev Microbiol,9:467参照)。他のCRISPR遺伝子座を、実施例1に記載のものと同様の方法により哺乳動物細胞環境中に移植することができる。例えば、図10は、CRISPR媒介ゲノム編集を達成するための哺乳動物細胞中の異種発現のためのストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)LMD−9のCRISPR1からのII型CRISPR系の適応を説明する。図10Aは、S.サーモフィラス(S.thermophilus)LMD−9のCRISPR1の模式的説明を提供する。図10Bは、S.サーモフィラス(S.thermophilus)CRISPR系のための発現系の設計を説明する。ヒトコドン最適化hStCas9を、構成的EF1αプロモーターを使用して発現させる。tracrRNAおよびcrRNAの成熟バージョンを、U6プロモーターを使用して発現させて正確な転写開始を促進する。成熟crRNAおよびtracrRNAからの配列を説明する。crRNA配列中の小文字「a」により示される単一塩基を使用してRNApolIII転写ターミネーターとして機能するポリU配列を除去する。図10Cは、ヒトEMX1遺伝子座ターゲティングするガイド配列を示す模式図を提供する。図10Dは、Surveyorアッセイを使用する標的遺伝子座中のhStCas9媒介開裂の結果を示す。RNAガイドスペーサー1および2は、それぞれ14%および6.4%を誘導した。これらの2つのプロトスペーサー部位における生物学的複製物にわたる開裂活性の統計分析も図5に提供する。図14は、ヒトEMX1遺伝子座中のS.サーモフィラス(S.thermophilus)CRISPR系の追加のプロトスペーサーおよび対応するPAM配列標的の模式図を提供する。2つのプロトスペーサー配列を強調し、NNAGAAWモチーフを満たすそれらの対応するPAM配列を対応する強調配列に対して3’側で下線を付けることにより示す。両方のプロトスペーサーは、アンチセンス鎖をターゲティングする。
試料標的配列選択アルゴリズム
規定のCRISPR酵素についての所望のガイド配列長およびCRISPRモチーフ配列(PAM)に基づきインプットDNA配列の両方の鎖上の候補CRISPR標的配列を同定するためのソフトウェアプログラムを設計する。例えば、化膿性連鎖球菌(S.pyogenes)からのCas9についての標的部位は、PAM配列NGGを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の5’−Nx−NGG−3’を探索することにより同定することができる。同様に、S.サーモフィラス(S.thermophilus)CRISPR1のCas9についての標的部位は、PAM配列NNAGAAWを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の5’−Nx−NNAGAAW−3’を探索することにより同定することができる。同様に、S.サーモフィラス(S.thermophilus)CRISPR3のCas9についての標的部位は、PAM配列NGGNGを用いて、インプット配列およびインプットの逆相補鎖の両方の上の5’−Nx−NGGNG−3’を探索することにより同定することができる。Nx中の値「x」は、プログラムにより固定し、または使用者により規定することができ、例えば、20である。
複数のキメラcrRNA−tracrRNAハイブリッドの評価
本実施例は、異なる長さの野生型tracrRNA配列を取り込むtracr配列を有するキメラRNA(chiRNA;ガイド配列、tracrメイト配列、およびtracr配列を単一転写物中で含む)について得られた結果を記載する。図16aは、キメラRNAおよびCas9のためのバイシストロニック発現ベクターの模式図を説明する。Cas9はCBhプロモーターによりドライブされ、キメラRNAはU6プロモーターによりドライブされる。キメラガイドRNAは、からなる。示される種々の位置においてトランケートされたtracr配列(下方の鎖の最初の「U」から転写物の末端に及ぶ)に結合している20bpのガイド配列(N)からなる。ガイドおよびtracr配列は、tracrメイト配列GUUUUAGAGCUA(配列番号 )と、それに続くループ配列GAAAにより離隔している。ヒト遺伝子座EMX1およびPVALB遺伝子座におけるCas9媒介インデルについてのSURVEYORアッセイの結果を、それぞれ図16bおよび16cに説明する。矢印は、予測SURVEYOR断片を示す。chiRNAをそれらの「+n」表記により示し、crRNAは、ガイドおよびtracr配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドRNAを指す。トリプリケートで実施されたこれらの結果の定量を、図17aおよび17bにヒストグラムにより示し、それぞれ図16bおよび16cに対応する(「N.D.」は、インデルが検出されなかったことを示す)。プロトスペーサーIDおよびそれらの対応するゲノム標的、プロトスペーサー配列、PAM配列、および鎖局在を表Dに提供する。ガイド配列は、ハイブリッド系における別個の転写物の場合、プロトスペーサー配列全体に相補的であるように、またはキメラRNAの場合、下線部にのみ相補的であるように設計した。
CRISPR−Cas系は、細菌から古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外因性DNAに対する適応免疫機序である。II型CRISPR−Cas9系は、CRISPR遺伝子座中への外来DNAの「獲得」を担うタンパク質をコードする遺伝子のセット、およびDNA開裂機序の「実行」をコードする遺伝子のセットからなり;これらは、DNAヌクレアーゼ(Cas9)、非コードトランス活性化crRNA(tracrRNA)、およびダイレクトリピートによりフランキングされている外来DNA由来スペーサーのアレイ(crRNA)を含む。Cas9による成熟時、tracRNAおよびcrRNA二本鎖は、Cas9ヌクレアーゼをスペーサーガイド配列により規定される標的DNA配列にガイドし、開裂に要求され、それぞれのCRISPR−Cas系に特異的な標的DNA中の短鎖配列モチーフ付近のDNAの二本鎖切断を媒介する。II型CRISPR−Cas系は、細菌界全体にわたり見出されており、Cas9タンパク質配列およびサイズ、tracrRNAおよびcrRNAダイレクトリピート配列、それらのエレメントのゲノム構成、および標的開裂のためのモチーフ要件は高度に多様である。ある種は、複数の区別されるCRISPR−Cas系を有し得る。
本出願人らは、関連性のあるPAM配列および対応するキメラガイドRNAを同定するためCas9オルソログを分析した。拡張したPAMセットを有することにより、全ゲノムにわたるより幅広いターゲティングが提供され、またユニークな標的部位の数が大幅に増加し、かつゲノムにおいて高い特異性レベルで新規Cas9を同定できる可能性がもたらされる。
プラスミド上のU6プロモーターおよびガイドRNAをコードするよりむしろ、本出願人らはU6プロモーターをDNAオリゴと共に増幅してガイドRNAを付加した。得られたPCR産物を細胞に形質移入してガイドRNAの発現をドライブすることができる。
フォワードプライマー:
真核細胞でガイドRNAを発現させるためにpol3プロモーター、詳細にはRNAポリメラーゼIII(例えばU6またはH1プロモーター)を使用するよりむしろ、本出願人らは真核細胞でT7ポリメラーゼを発現させることにより、T7プロモーターを使用してガイドRNAの発現をドライブする。
1.Cas9の発現ベクター
2.T7ポリメラーゼの発現ベクター
3.T7プロモーターと融合したガイドRNAを含む発現ベクター
Cas9をmRNAの形態で送達することにより、細胞でのCas9の一過性発現が可能となり、毒性が低下する。例えば、ヒト化SpCas9は、以下のプライマー対を使用して増幅し得る:
フォワードプライマー(インビトロ転写用にT7プロモーターを付加するため):
本出願人らは、ゲノム改変を実行するのに必要となった場合に限りCas9発現を一過性にオンにする。誘導性システムの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Tet−OnまたはTet−Off)、小分子2ハイブリッド転写活性化システム(FKBP、ABA等)、または光誘導性システム(フィトクロム、LOVドメイン、またはクリプトクロム)が含まれる。
本出願人らは、低分子量のCas9に対してメタゲノム検索を行った。多くのCas9ホモログはかなり大きい。例えばSpCas9は約1368アミノ酸長であり、これは大き過ぎるため送達用のウイルスベクターへのパッケージングが容易でない。GenBankに寄託されている配列からCas9ホモログの長さ分布を表すグラフが作成される(図23)。配列の中には誤って注釈されているものもあり、従って各長さについての正確な度数は必ずしも正しいとは限らない。それでもなお、これによりCas9タンパク質の分布の概観が得られ、より短いCas9ホモログの存在が示唆される。
機能強化のためまたは新規機能を開発するため、本出願人らは異なるCas9ホモログの断片を組み合わせることにより、キメラCas9タンパク質を作成する。例えば、2つの例示的なキメラCas9タンパク質:
例えば、本出願人らは、St1Cas9(このタンパク質からの断片は太字とする)のN末端を、SpCas9(このタンパク質からの断片には下線を引く)のC末端と融合した。
>St1(N)Sp(C)Cas9
>Sp(N)St1(C)Cas9
毒性が低下する
真核細胞における発現が向上する
特異性が強化される
タンパク質の分子量が低下し、異なるCas9ホモログからの最も小さいドメインを組み合わせることによりタンパク質が小さくなる。
PAM配列要件の変更
本出願人らは、DNA標的の両鎖の開裂に関与する2つの触媒ドメイン(D10およびH840)を突然変異させることにより、Cas9を汎用DNA結合タンパク質として使用した。標的遺伝子座における遺伝子転写を上方制御するため、本出願人らはCas9に転写活性化ドメイン(VP64)を融合した。本出願人らは、転写因子活性化強度が標的で費やされる時間の関数であるため、Cas9−VP64融合タンパク質の強力な核局在を認めることが重要であるという仮説を立てた。従って、本出願人らは一組のCas9−VP64−GFP構築物をクローニングし、それらを293細胞に形質移入し、形質移入後12時間でその局在を蛍光顕微鏡下で評価した。
Cas9ヌクレアーゼを発現するマウスを作成するため、本出願人らは2つの一般的戦略、トランスジェニックとノックインとを提示する。これらの戦略は、目的とする任意の他のモデル生物の作成、例えばラットに適用し得る。これらの一般的戦略の各々について、本出願人らは、構成的に活性なCas9と、条件的に発現する(Creリコンビナーゼ依存性の)Cas9とを作製する。構成的に活性なCas9ヌクレアーゼは以下のコンテクストで発現する:pCAG−NLS−Cas9−NLS−P2A−EGFP−WPRE−bGHpolyA。pCAGはプロモーターであり、NLSは核局在化シグナルであり、P2Aはペプチド開裂配列であり、EGFPは高感度緑色蛍光タンパク質であり、WPREはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントであり、およびbGHpolyAはウシ成長ホルモンポリAシグナル配列である(図25A〜図25B)。条件的バージョンは、プロモーターの後ろおよびNLS−Cas9−NLSの前に1つのさらなる終止カセットエレメント、loxP−SV40 polyA x3−loxPを有する(すなわち pCAG−loxP−SV40polyAx3−loxP−NLS−Cas9−NLS−P2A−EGFP−WPRE−bGHpolyA)。重要な発現エレメントは図26のとおり可視化することができる。構成的構築物は開発全体を通して全ての細胞型で発現しなければならないが、条件的構築物は、同じ細胞がCreリコンビナーゼを発現するときに限りCas9発現を可能にし得る。この後者のバージョンは、Creが組織特異的プロモーターの発現下にあるときCas9の組織特異的発現を可能にし得る。さらに、CreをTET onまたはoffシステムなどの誘導性プロモーターの発現下に置くことにより、Cas9発現を成体マウスで誘導することができる。
CRISPR−Cas系は、細菌および古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外来性DNAに対する適応免疫機構である。II型CRISPR−Cas系は、CRISPR遺伝子座への外来DNAの「獲得」に関与するタンパク質をコードする一組の遺伝子、ならびにDNA開裂機構の「遂行」をコードする一組の遺伝子からなる;これらには、DNAヌクレアーゼ(Cas9)、非コードトランス活性化cr−RNA(tracrRNA)、および外来DNA由来のスペーサーにダイレクトリピートが隣接したアレイ(crRNA)が含まれる。Cas9による成熟時、tracrRNAおよびcrRNA二重鎖が、スペーサーガイド配列により特定されるCas9ヌクレアーゼを標的DNA配列にガイドし、開裂に必要でかつ各CRISPR−Cas系に特異的な、標的DNAの短鎖配列モチーフ近傍でのDNAの二本鎖切断を媒介する。II型CRISPR−Cas系は細菌界全体にわたり見られ、Cas9タンパク質配列およびサイズ、tracrRNAおよびcrRNAダイレクトリピート配列、これらのエレメントのゲノム構成、および標的開裂のモチーフ要件の点で高度に多様である。1つの種が複数の異なるCRISPR−Cas系を有し得る。
本実施例において、本出願人らは、以下の突然変異がSpCas9をニック形成酵素に変換し得ることを示す:D10A、E762A、H840A、N854A、N863A、D986A。
Cas9転写活性化
第2世代の構築物を設計して試験した(表1)。これらの構築物を使用して転写活性化(VP64融合構築物)および抑制(Cas9のみ)をRT−qPCRにより評価する。本出願人らは、抗His抗体を使用して各構築物の細胞局在を評価し、Surveyorヌクレアーゼアッセイを使用してヌクレアーゼ活性を評価し、およびゲルシフトアッセイを使用してDNA結合親和性を評価する。
dCas9を汎用DNA結合ドメインとして使用して遺伝子発現を抑制し得ることがこれまでに示されている。本出願人らは、改良されたdCas9設計ならびにリプレッサードメインKRABおよびSID4xに対するdCas9融合を報告する。表1におけるCas9を使用して転写を調節するため作成されたプラスミドライブラリから、以下のリプレッサープラスミドがqPCRにより機能的に特徴付けられた:pXRP27、pXRP28、pXRP29、pXRP48、pXRP49、pXRP50、pXRP51、pXRP52、pXRP53、pXRP56、pXRP58、pXRP59、pXRP61、およびpXRP62。
本出願人らは、ウイルス送達系あるいはナノ粒子送達系を用いた、代謝疾患、アミロイドーシスおよびタンパク質凝集関連疾患、遺伝子突然変異および転座により生じる細胞形質転換、遺伝子突然変異のドミナントネガティブ効果、潜伏ウイルス感染、および他の関連症状に罹患した、必要性のある対象または患者における肝組織、脳組織、眼組織、上皮組織、造血組織、または別の組織でのCRISPR−Cas系の遺伝子送達を実証する。
各候補疾患遺伝子について、本出願人らは目的のDNA配列を選択し、それにはタンパク質コードエクソン、既知のドミナントネガティブ突然変異部位を含みかつそれに隣接する配列、病的反復配列を含みかつそれに隣接する配列が含まれる。遺伝子ノックアウト手法に関して、開始コドンに最も近接した初期コードエクソンが、完全なノックアウトを達成し、かつ部分的な機能を保持するトランケート型タンパク質産物となる可能性を最小限に抑えるのに最良の選択肢を提供する。
ガイド配列は二本鎖20〜24bpオリゴヌクレオチドとして合成される。オリゴを5’−リン酸化処理し、アニーリングにより二重鎖を形成した後、オリゴを送達方法に応じた好適なベクターにライゲートする:
AAVベースのベクター(PX260、330、334、335)が他の部分に記載されている。
レンチウイルスベースのベクターは、U6プロモーターによってドライブされるキメラRNA足場と、EF1aプロモーターによってドライブされるCas9またはCas9ニッカーゼとを担持する単一のベクターにガイド配列を直接ライゲートする同様のクローニング戦略を用いる。
1.T7プロモーター−ガイド配列キメラRNAをコードするオリゴヌクレオチド二重鎖としてガイド配列を合成する。T7プロモーターをCas9の5’にPCR方法によって付加する。
ガイド配列を、上記および本出願の他の部分に記載するとおりAAVプラスミドにクローニングする。
形質移入
1.DNAプラスミド形質移入
ガイド配列を担持するプラスミドをヒト胎児腎臓(HEK293T)細胞またはヒト胚性幹(hES)細胞、他の関連性のある細胞型に、脂質ベース、化学ベースまたはエレクトロポレーションベースの方法を使用して形質移入する。HEK293T細胞の24ウェル形質移入(約260,000細胞)に対しては、500ngの総DNAを、リポフェクタミン2000を使用して各ウェルに形質移入する。hES細胞の12ウェル形質移入に対しては、1ugの総DNAを、Fugene HDを使用して単一のウェルに形質移入する。
上記に記載する精製RNAを、HEK293T細胞への形質移入に使用する。1〜2ugのRNAを、製造者の指示に従いリポフェクタミン2000を使用して約260,000個に形質移入し得る。Cas9およびキメラRNAのRNA送達を図28に示す。
形質移入後72時間で細胞を回収し、二本鎖切断の指標としてのインデル形成に関してアッセイする。
送達機構
AAVまたはレンチウイルス作製については他の部分に記載される。
市販のキットを使用して、マウスにおけるDNAプラスミドの流体力学的尾静脈注射を実施する。
Cas9およびガイド配列は、ウイルス、ナノ粒子コーティングRNA混合物、またはDNAプラスミドとして送達され、被験動物に注射される。並行する一組の対照動物に、滅菌生理食塩水、Cas9およびGFP、またはガイド配列およびGFP単独を注射する。
市販キットを使用して組織からDNAを抽出する;インデルアッセイは、インビトロ実証について記載されるとおり実施し得る。
I.遺伝子標的の同定および設計
・実施例22に記載される
II.送達系に対するガイド配列および修復テンプレートのクローニング
・上記の実施例22に記載される
・本出願人らは、罹患アレルを含む相同性アームを含めるためのDNA修復テンプレートならびに野生型修復テンプレートをクローニングする
III.細胞系に関するインビトロ検証
a.形質移入については、上記の実施例22に記載される;Ca9、ガイドRNA、および修復テンプレートを関連性のある細胞型に同時形質移入する。
b.インビトロ修復アッセイ
i.本出願人らは形質移入後72時間で細胞を回収し、修復に関してアッセイする
ii.簡潔に言えば、本出願人らは修復テンプレートの周りのゲノム領域を、高フィデリティポリメラーゼを使用してPCR増幅する。本出願人らは突然変異体アレルの発生率の低下に関して産物を配列決定する。
IV.動物におけるインビボ原理証明
a.送達機構については、上記の実施例22および34に記載される。
b.インビボ修復アッセイ
i.本出願人らは、インビトロ実証に記載するとおり修復アッセイを実施する。
V.治療適用
CRISPR−Cas系は、候補疾患遺伝子の組織特異的かつ時間的に制御された標的欠失の達成に適している。例としては、数ある障害の中でも特に、コレステロールおよび脂肪酸代謝、アミロイド病、ドミナントネガティブ疾患、潜伏ウイルス感染症に関与する遺伝子が挙げられる。
緑内障:本出願人らは、ミオシリン(mycilin)(MYOC)遺伝子の第1のエクソンをターゲティングするガイドRNAを設計する。本出願人らはアデノウイルスベクター(Ad5)を使用してCas9ならびにMYOC遺伝子をターゲティングするガイドRNAの両方をパッケージングする。本出願人らはこのアデノウイルスベクターを、細胞が緑内障の病態生理に関係付けられている小柱網に注入する。本出願人らは、初めにこれを、突然変異MYOC遺伝子を有するマウスモデルで試験して、アデノウイルスベクターが視力を改善し、および眼圧を低下させるかどうかを見る。ヒトにおける治療適用も同様の戦略を用いる。
慢性ウイルス感染症は、有意な罹患率および死亡率の原因である。これらのウイルスの多くに関しては、ウイルス複製の種々の側面を有効にターゲティングする従来の抗ウイルス治療薬が存在するが、現在の治療モダリティは、通常、「ウイルス潜伏」に起因して非治癒的な性質のものである。その性質上、ウイルス潜伏は、活性のあるウイルス産生のないウイルスのライフサイクルにおける休眠期により特徴付けられる。この期間中、ウイルスは大部分が免疫監視機構および従来の治療薬の両方を回避することができるため、ウイルスが宿主内に長期にわたるウイルスリザーバを構築することが可能となり、続いてそこから再活性化し、ウイルスの伝播および伝染を続行することができる。ウイルス潜伏の鍵は、ウイルスゲノムを安定的に維持する能力であり、これは、それぞれウイルスゲノムを細胞質に貯えるかまたはそれを宿主ゲノムにインテグレートするものであるエピソーム潜伏またはプロウイルス潜伏のいずれかによって達成される。初感染を防ぐ有効なワクチン接種がない場合、潜伏リザーバおよび溶菌作用のエピソードにより特徴付けられる慢性ウイルス感染症は重大な影響を及ぼし得る:ヒトパピローマウイルス(HPV)は子宮頸癌をもたらすことがあり、C型肝炎ウイルス(HCV)は肝細胞癌の原因となり、およびヒト免疫不全ウイルスは最終的には宿主免疫系を破壊して日和見感染に対する感受性をもたらす。このように、これらの感染症では、現在利用可能な抗ウイルス治療薬の生涯にわたる使用が必要となる。さらに問題を複雑にしているのは、これらのウイルスゲノムの多くの高い変異性であり、これが有効な治療の存在しない耐性株の進化につながっている。
本発明の態様は、CRISPR−Cas遺伝子治療粒子と生体適合性医薬担体とを含み得る医薬組成物を提供する。別の態様によれば、CFTR遺伝子に突然変異を有する対象を治療するための遺伝子治療方法は、対象の細胞に治療有効量のCRISPR−Cas遺伝子治療粒子を投与することを含む。
本出願人らは、各々が1つ以上の調節配列(Cas9用のCbhまたはEF1aプロモーター、キメラガイドRNA用のU6またはH1プロモーター)に作動可能に結合している以下の遺伝子構築物を、1つ以上のアデノウイルスまたはAAVベクターまたは任意の他の適合性ベクターにクローニングする:CFTRΔ508ターゲティングキメラガイドRNA(図31B)、ΔF508突然変異の修復テンプレート(図31C)および場合により1つ以上の核局在化シグナルまたは配列(NLS)、例えば2つのNLSを有するコドン最適化Cas9酵素。
本出願人らはヒトCFTRゲノム遺伝子座を解析し、Cas9標的部位を同定した(図31A)。(PAMはNGGまたはNNAGAAWモチーフを含み得る)。
本出願人らは、Cas9(またはCas9ニッカーゼ)およびガイドRNAを含むアデノウイルス/AAVベクター系を、F508残基を含有する相同性修復テンプレートを含むアデノウイルス/AAVベクター系と共に対象に、先に考察した送達方法の一つによって導入する。CRISPR−Cas系はCFTRΔ 508キメラガイドRNAによりガイドされ、ニックを入れられるかあるいは開裂されるCFTRゲノム遺伝子座の特定の部位を標的にする。開裂後、嚢胞性線維症をもたらしまたは嚢胞性線維症関連症状を引き起こす欠失を補修する相同組換えによって開裂部位に修復テンプレートが挿入される。適切なガイドRNAでCRISPR系を直接送達し、その全身性の導入を提供するこの戦略を用いて遺伝子突然変異をターゲティングし、表Bにあるような代謝、肝臓、腎臓およびタンパク質の疾患および障害を引き起こす遺伝子を編集または他の方法で操作することができる。
本実施例は、各細胞がノックアウトされた単一遺伝子を有する細胞ライブラリを作成する方法を実証する:
本出願人らは、ES細胞のライブラリであって、各細胞はノックアウトされた単一遺伝子を有し、かつES細胞のライブラリ全体はあらゆる単一遺伝子がノックアウトされているライブラリを作製する。このライブラリは、細胞プロセスならびに疾患における遺伝子機能のスクリーニングに有用である。
Cas9を送達する方法
方法1:本出願人らは、構成的プロモーター、例えば、Hsp70A−Rbc S2またはベータ2−チューブリンの制御下でCas9を発現するベクターを使用してCas9およびガイドRNAを送達する。
Chlamydomonas Resource Centerからのコナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)株CC−124およびCC−125を、エレクトロポレーションに使用する。エレクトロポレーションプロトコルは、GeneArt Chlamydomonas Engineeringキットからの標準的な推奨プロトコルに従う。
タンパク質コード配列の突然変異が関与する疾患:
優性障害は、ドミナントネガティブアレルを不活性化することによりターゲティングされ得る。本出願人らは、Cas9を使用してドミナントネガティブアレルにおけるユニーク配列をターゲティングし、NHEJによって突然変異を導入する。NHEJによって誘導されるインデルは、ドミナントネガティブアレルにフレームシフト突然変異を導入してドミナントネガティブタンパク質を除去することが可能であり得る。これは遺伝子がハプロ不全でない(haplo−sufficient)場合に機能し得る(例えばMYOC突然変異によって生じる緑内障およびハンチントン病)。
本出願人らは、Cas9を使用してプロモーター領域の非コード配列を破壊し、転写因子結合部位を変化させ、およびエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを変化させる。例えば、Cas9を使用して造血幹細胞のKlf1エンハンサーEHS1を切り出すことにより、BCL11aレベルを低下させ、分化した赤血球における胎児グロビン遺伝子発現を再活性化し得る。
本出願に詳説されるCas9の最適化の態様および教示を使用してCas9ニッカーゼもまた作成し得る。本出願人らは、Cas9ニッカーゼをガイドRNAのペアと組み合わせて使用して、規定のオーバーハングを有するDNA二本鎖切断を作成する。ガイドRNAの2つのペアが使用されるとき、介在するDNA断片を切り出すことが可能である。2つのガイドRNAペアで外来性DNA断片を開裂することによってゲノムDNAと適合性のオーバーハングを作成する場合、外来性DNA断片をゲノムDNAにライゲートして切り出された断片を置き換え得る。例えば、これを用いてハンチンチン(huntintin)(HTT)遺伝子のトリヌクレオチドリピート伸長を除去し、ハンチントン病を治療し得る。
Cas9およびそのキメラガイドRNA、またはtracrRNAとcrRNAとの組み合わせは、DNAとしても、あるいはRNAとしても送達することができる。Cas9およびガイドRNAを両方ともにRNA(普通のまたは塩基もしくは骨格改変を含む)分子として送達することを用いて、Cas9タンパク質が細胞内に留まる時間を低減することができる。これにより標的細胞におけるオフターゲット開裂活性のレベルが低下し得る。mRNAとしてのCas9の送達はタンパク質に翻訳されるまでに時間がかかるため、Cas9 mRNAを送達した数時間後にガイドRNAを送達して、Cas9タンパク質との相互作用に利用可能なガイドRNAのレベルを最大化することが有利であり得る。
本出願で既述したとおり、CRISPR複合体の標的ポリヌクレオチドは複数の疾患関連遺伝子およびポリヌクレオチドを含んでもよく、それらの疾患関連遺伝子の一部はトリヌクレオチドリピート障害と称される(またトリヌクレオチドリピート伸長障害、トリプレットリピート伸長障害またはコドン反復障害とも称される)一連の遺伝的障害に属し得る。
疾患がフラタキシンの発現低下に起因するため、この場合にsiRNAノックダウンは適用できない。ウイルス遺伝子療法が現在調査されている。動物モデルにおいてHSV−1ベースのベクターを使用してフラタキシン遺伝子が送達され、治療効果が示されている。しかしながら、ウイルスベースのフラタキシン送達の長期有効性は、いくつかの問題を抱えている:第一に、フラタキシンの発現を健常者の天然レベルに一致するように調節することが困難であり、第二に、フラタキシンの長期過剰発現は細胞死を引き起こす。
Cas9を使用してゲノムを改変するよりむしろ、本出願人らはまた、Cas9(ヌクレアーゼ活性欠損)ベースのDNA結合ドメインを使用して転写活性化ドメインをFXN遺伝子にターゲティングすることでFXN遺伝子を直接活性化し得る。
本出願において既述したとおり、Cas9を、以下の1つ以上の突然変異を介して一本鎖開裂を媒介し得るように突然変異させ得る:D10A、E762A、およびH840A。
ラフォラ病−ニューロンにおけるグリコーゲンを低下させるための標的GSY1またはPPP1R3C(PTG)。
標的配列をペア(LおよびR)で列挙し、ここではスペーサーにおけるヌクレオチドの数は異なる(0〜3bp)。各スペーサーそれ自体を野生型Cas9と共に使用して標的遺伝子座に二本鎖切断を導入し得る。
1.ガイドRNAの5’におけるヌクレオチドは、天然RNAのようなリン酸エステル結合よりむしろ、チオールエステル結合で連結され得る。チオールエステル結合は、内因性RNA分解機構によるガイドRNAの消化を防止し得る。
2.ガイドRNAのガイド配列(5’20bp)におけるヌクレオチドは、結合特異性を改善するためのベースとして架橋核酸(bridged nucleic acid:BNA)を使用することができる。
本発明の態様は、標的設計後3〜4日以内に遺伝子改変の効率および特異性を試験することができ、かつ2〜3週間以内に改変されたクローン細胞系を得ることができるプロトコルおよび方法に関する。
オフターゲット開裂活性の考慮点:他のヌクレアーゼと同様に、Cas9は低い頻度でゲノムにおけるオフターゲットDNA標的を開裂し得る。所与のガイド配列がオフターゲット活性を呈する程度は、酵素濃度、用いられる特定のガイド配列の熱力学、および標的ゲノムにおける同様の配列の存在量を含めた複合的な要因に依存する。Cas9の常法の適用については、オフターゲット開裂の程度を最小限に抑えるとともに、オフターゲット開裂の存在を検出可能である方法を考慮することが重要である。
SURVEYORヌクレアーゼアッセイ:本出願人らは、SURVEYORヌクレアーゼアッセイ(またはPCRアンプリコンシーケンシングのいずれかによりインデル突然変異を検出した。本出願人らのオンラインCRISPR標的設計ツールは、両方の手法に推奨されるプライマーを提供する。しかしながら、SURVEYORまたはシーケンシングプライマーはまた、ゲノムDNAから目的の領域を増幅し、かつ非特異的なアンプリコンを回避するようにNCBIプライマーBlastを使用して手動で設計されてもよい。SURVEYORプライマーは、ゲル電気泳動による開裂バンドの明確な可視化を可能にするため、Cas9標的の両側で300〜400bp(600〜800bpの総アンプリコンに対して)を増幅するように設計されなければならない。過剰なプライマー二量体形成を防ぐため、SURVEYORプライマーは、典型的には融解温度が約60℃の25nt長未満であるように設計されなければならない。本出願人らは、特定のPCRアンプリコンに対する候補プライマーの各ペアを試験し、ならびにSURVEYORヌクレアーゼ消化プロセスの間に非特異的な開裂が存在しないことについても試験することを推奨する。
sgRNA調製:
超高純度DNアーゼRNアーゼ不含蒸留水(Life Technologies、カタログ番号10977−023)
Herculase II融合ポリメラーゼ(Agilent Technologies、カタログ番号600679)
重要。標準Taqポリメラーゼ、これは3’−5’エキソヌクレアーゼ校正活性を欠いており、フィデリティが低く、増幅エラーをもたらし得る。Herculase IIは高フィデリティポリメラーゼ(Pfuと同等のフィデリティ)であり、最小限の最適化で高収率のPCR産物を生じる。他の高フィデリティポリメラーゼに代えてもよい。
Herculase II反応緩衝液(5×;Agilent Technologies、ポリメラーゼと同梱)
dNTP溶液ミックス(各25mM;Enzymatics、カタログ番号N205L)
MgCl2(25mM;ThermoScientific、カタログ番号R0971)
QIAquickゲル抽出キット(Qiagen、カタログ番号28704)
QIAprep spinミニプレップキット(Qiagen、カタログ番号27106)
超高純度TBE緩衝液(10×;Life Technologies、カタログ番号15581−028)
SeaKem LEアガロース(Lonza、カタログ番号50004)
SYBR Safe DNA染色(10,000×;Life Technologies、カタログ番号S33102)
1kb Plus DNAラダー(Life Technologies、カタログ番号10787−018)
TrackIt CyanOrangeローディング緩衝液(Life Technologies、カタログ番号10482−028)
FastDigest BbsI(BpiI)(Fermentas/ThermoScientific、カタログ番号FD1014)
Fermentas Tango緩衝液(Fermentas/ThermoScientific、カタログ番号BY5)
DL−ジチオスレイトール(DTT;Fermentas/ThermoScientific、カタログ番号R0862)
T7 DNAリガーゼ(Enzymatics、カタログ番号L602L)
重要:より一般的に用いられるT4リガーゼを代用しないこと。T7リガーゼは付着末端で平滑末端と比べて1,000倍高い活性を有し、かつ市販の高濃度T4リガーゼと比べて全体的な活性が高い。
T7 2×迅速ライゲーション緩衝液(T7 DNAリガーゼと同梱、Enzymatics、カタログ番号L602L)
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs、カタログ番号M0201S)
T4DNAリガーゼ反応緩衝液(10×;New England Biolabs、カタログ番号B0202S)
アデノシン5’−三リン酸(10mM;New England Biolabs、カタログ番号P0756S)
PlasmidSafe ATP依存性DNアーゼ(Epicentre、カタログ番号E3101K)
One Shot Stbl3化学的コンピテント大腸菌(Escherichia coli)(E.coli)(Life Technologies、カタログ番号C7373−03)
SOC培地(New England Biolabs、カタログ番号B9020S)
LB培地(Sigma、カタログ番号L3022)
LB寒天培地(Sigma、カタログ番号L2897)
アンピシリン、滅菌ろ過済み(100mg ml−1;Sigma、カタログ番号A5354)
HEK293FT細胞(Life Technologies、カタログ番号R700−07)
ダルベッコ最小イーグル培地(DMEM、1×、高グルコース;Life Technologies、カタログ番号10313−039)
ダルベッコ最小イーグル培地(DMEM、1×、高グルコース、フェノールレッド不含;Life Technologies、カタログ番号31053−028)
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS、1×;Life Technologies、カタログ番号14190−250)
ウシ胎仔血清、適格品(qualified)かつ熱失活済み(Life Technologies、カタログ番号10438−034)
Opti−MEM I低血清培地(FBS;Life Technologies、カタログ番号11058−021)
ペニシリン−ストレプトマイシン(100×;Life Technologies、カタログ番号15140−163)
TrypLE(商標)Express(1×、フェノールレッド不含;Life Technologies、カタログ番号12604−013)
リポフェクタミン2000形質移入試薬(Life Technologies、カタログ番号11668027)
Amaxa SF細胞系4D−Nucleofector(登録商標)XキットS(32 RCT;Lonza、カタログ番号V4XC−2032)
HUES 9細胞系(HARVARD STEM CELL SCIENCE)
Geltrex LDEV不含低成長因子基底膜マトリックス(Life Technologies、カタログ番号A1413201)
mTeSR1培地(Stemcell Technologies、カタログ番号05850)
Accutase細胞剥離液(Stemcell Technologies、カタログ番号07920)
ROCK阻害薬(Y−27632;Millipore、カタログ番号SCM075)
Amaxa P3初代細胞4D−Nucleofector(登録商標)XキットS(32 RCT;Lonzaカタログ番号V4XP−3032)
QuickExtract DNA抽出溶液(Epicentre、カタログ番号QE09050)
SURVEYOR、RFLP分析、またはシーケンシング用のPCRプライマー(プライマー表参照)
Herculase II融合ポリメラーゼ(Agilent Technologies、カタログ番号600679)
重要。Surveyorアッセイは一塩基ミスマッチの感度を有するため、高フィデリティポリメラーゼを使用することが特に重要である。他の高フィデリティポリメラーゼに代えてもよい。
Herculase II反応緩衝液(5×;Agilent Technologies、ポリメラーゼと同梱)
dNTP溶液ミックス(各25mM;Enzymatics、カタログ番号N205L)
QIAquickゲル抽出キット(Qiagen、カタログ番号28704)
Taq緩衝液(10×;Genscript、カタログ番号B0005)
標準ゲル電気泳動用のSURVEYOR突然変異検出キット(Transgenomic、カタログ番号706025)
超高純度TBE緩衝液(10×;Life Technologies、カタログ番号15581−028)
SeaKem LEアガロース(Lonza、カタログ番号50004)
4〜20%TBEゲル 1.0mm、15ウェル(Life Technologies、カタログ番号EC62255BOX)
Novex(登録商標)高密度TBE試料緩衝液(5×;Life Technologies、カタログ番号LC6678)
SYBR Gold核酸ゲル染色(10,000×;Life Technologies、カタログ番号S−11494)
1kb Plus DNAラダー(Life Technologies、カタログ番号10787−018)
TrackIt CyanOrangeローディング緩衝液(Life Technologies、カタログ番号10482−028)
FastDigest HindIII(Fermentas/ThermoScientific、カタログ番号FD0504)
フィルター付き滅菌ピペットチップ(Corning)
標準1.5ml微量遠心管(Eppendorf、カタログ番号0030 125.150)
Axygen96ウェルPCRプレート(VWR、カタログ番号PCR−96M2−HSC)
Axygen 8ストリップPCRチューブ(Fischer Scientific、カタログ番号14−222−250)
Falconチューブ、ポリプロピレン、15ml(BD Falcon、カタログ番号352097)
Falconチューブ、ポリプロピレン、50ml(BD Falcon、カタログ番号352070)
細胞ストレーナーキャップ付き丸底チューブ、5ml(BD Falcon、カタログ番号352235)
ペトリ皿(60mm×15mm;BD Biosciences、カタログ番号351007)
組織培養プレート(24ウェル;BD Falcon、カタログ番号353047)
組織培養プレート(96ウェル、平底;BD Falcon、カタログ番号353075)
組織培養皿(100mm;BD Falcon、353003)
プログラム可能な温度ステッピング機能付き96ウェルサーモサイクラー(Applied Biosystems Veriti、カタログ番号4375786)。
卓上微量遠心機5424、5804(Eppendorf)
ゲル電気泳動システム(PowerPac basic power supply、Bio−Rad、カタログ番号164−5050、およびSub−Cell GTシステムゲルトレー、Bio−Rad、カタログ番号170−4401)
Novex XCell SureLock Mini−Cell(Life Technologies、カタログ番号EI0001)
デジタルゲルイメージングシステム(GelDoc EZ、Bio−Rad、カタログ番号170−8270、および青色試料トレー、Bio−Rad、カタログ番号170−8273)
青色光トランスイルミネーターおよびオレンジフィルターゴーグル(SafeImager 2.0;Invitrogen、カタログ番号G6600)
ゲル定量化ソフトウェア(Bio−Rad、ImageLab、GelDoc EZと同梱、または国立衛生研究所(National Institutes of Health)のオープンソースImageJ、ウェブサイトrsbweb.nih.gov/ij/で利用可能)
紫外分光光度計(NanoDrop 2000c、Thermo Scientific)
トリス−ホウ酸EDTA(TBE)電気泳動溶液 TBE緩衝液を蒸留水に希釈し、アガロースゲルをキャスティングするためおよびゲル電気泳動用緩衝液として使用するための1×ワーキング溶液とする。緩衝液は室温(18〜22℃)で少なくとも1年間保存しておくことができる。
ターゲティング成分の設計およびオンラインツールの使用・タイミング1日
1|標的ゲノムDNA配列を入力する。本出願人らは、目的の入力配列を受け取り、好適な標的部位を同定してそれに順位を付け、および意図する標的毎にオフターゲット部位を計算的に予測するオンラインCas9ターゲティング設計ツールを提供する。あるいは、任意の5’−NGGの直ちに上流で20bp配列を同定することにより、ガイド配列を手動で選択してもよい。
3|sgRNA発現構築物を作成するため、PCRベースまたはプラスミドベースのいずれのプロトコルも用いることができる。
(i)本出願人らは希釈U6 PCRテンプレートを調製する。本出願人らはPX330をPCRテンプレートとして使用することを推奨するが、任意のU6含有プラスミドを同様にPCRテンプレートとして使用することができる。本出願人らはテンプレートを10ng/ulの濃度となるようにddH2Oで希釈した。U6によってドライブされるsgRNAを既に含んでいるプラスミドまたはカセットがテンプレートとして使用される場合、ゲル抽出を実施して、産物が意図したsgRNAのみを含み、テンプレートからのsgRNAキャリーオーバーの痕跡を含まないことを確実にする必要がある点に留意されたい。
(i)sgRNAオリゴインサートを調製する。本出願人らは、各sgRNA設計について、100uMの最終濃度となるようにオリゴの上部鎖および下部鎖を再懸濁した。オリゴを以下のとおりリン酸化およびアニーリングする:
37℃で30分
95℃で5分
毎分5℃で25℃まで下降させる。
3|ssODNを設計および注文する。センスまたはアンチセンスのいずれかのssODNを供給業者から直接購入することができる。本出願人らは、両側に少なくとも40bpおよび最適なHDR効率のためには90bpの相同性アームを設計することを推奨する。本出願人らの経験上、改変効率はアンチセンスオリゴの方がやや高い。
CRISPR−Cas系は多くの哺乳類細胞系で使用されている。細胞系毎に条件が異なり得る。以下のプロトコルは、HEK239FT細胞の形質移入条件を詳説する。ssODN媒介性HDR形質移入に関する注記として、ssODNの最適な送達のためAmaxa SF細胞系Nucleofectorキットが使用される。これは次節に記載する。
15|ターゲティングプラスミドを線状化する。ターゲティングベクターは、可能な場合には、相同性アームの一方の近傍またはいずれかの相同性アームの遠位端におけるベクター骨格中の制限部位で1回切断することにより線状化する。
hESC(HUES9)株の維持。本出願人らはHUES9細胞系をmTeSR1培地による無フィーダー条件に常法で維持する。本出願人らは、基本培地と同梱の5×サプリメントおよび100ug/ml Normocinを添加することによりmTeSR1培地を調製した。本出願人らは、10uM Rock阻害薬をさらに補給したmTeSR1培地の10mlアリコートを調製した。組織培養プレートをコーティングする。冷GelTrexを冷DMEMに1:100希釈し、100mm組織培養プレートの表面全体をコーティングする。
形質移入後24時間でFACSによるかまたは段階希釈によりクローン単離を実施し得る。
66|本出願人らは上記に記載したとおり24ウェルプレートから細胞を解離した。確実に単一細胞に解離する。細胞ストレーナーを使用して細胞の凝集を防ぐことができる。
形質移入細胞の開裂効率をアッセイする前に、本出願人らは、以下に記載するプロトコルを使用するSURVEYORヌクレアーゼ消化のステップにより陰性(形質移入されていない)対照試料でそれぞれの新規SURVEYORプライマーを試験することを推奨する。時折、シングルバンドのクリーンなSURVEYOR PCR産物であっても非特異的SURVEYORヌクレアーゼ開裂バンドを生じ、正確なインデル分析を妨げる可能性がある。
最初のステップは、SURVEYORアッセイのステップ71〜79と同じである。注:フォワードおよびリバースプライマーに適切な制限部位が付加される場合、サンガーシーケンシングにSURVEYORプライマーを用い得る。推奨されるpUC19骨格へのクローニングに関しては、フォワードプライマーにEcoRIおよびリバースプライマーにHindIIIを用い得る。
100|上記に記載したとおり、欠失させる領域を標的にするsgRNAのペアを細胞に形質移入した。
109|本出願人らは上記に記載したとおりQuickExtract溶液を使用してDNAを回収し、ゲノムDNAを100〜200ng/ulの最終濃度となるようにTEで標準化した。
ii.本出願人らは、ローディング色素を含む10ulの消化産物を、4〜20%勾配ポリアクリルアミドTBEゲル上でキシレンシアノールバンドが移動してゲルの底に達するまで泳動させた。
iii.本出願人らは15分間揺り動かしながら1×SYBR Gold色素でゲルを染色した。
iv.上記でSURVEYORアッセイの節に記載したとおり開裂産物をイメージングして定量化する。HDR効率は以下の式により推定される:(b+c)/(a+b+c)(式中、aは消化されなかったHDR PCR産物の面積強度であり、bおよびcはHindIII切断断片の面積強度である)。
オンラインCRISPR標的設計ツールは、同定された標的部位のそれぞれについて候補ゲノムオフターゲット部位を作成する。これらの部位でのオフターゲット分析は、SURVEYORヌクレアーゼアッセイ、サンガーシーケンシング、または次世代ディープシーケンシングにより実施することができる。これらの部位の多くで改変率が低いまたは検出不能である可能性を考えると、本出願人らは、高感度および高精度のためのIllumina Miseqプラットフォームによるディープシーケンシングを推奨する。プロトコルはシーケンシングプラットフォームによって異なり得る;ここで本出願人らは、シーケンシングアダプターをつなぎ合わせるための融合PCR方法について簡単に記載する。
ステップ1〜2 sgRNAオリゴおよびssODNの設計および合成:1〜5日、供給業者によって変動
ステップ3〜5 CRISPRプラスミドまたはPCR発現カセットの構築:2時間〜3日
ステップ6〜53 細胞系への形質移入:3日(1時間のハンズオン時間)
ステップ54〜70 任意選択のクローン株誘導:1〜3週間、細胞型によって変動
ステップ71〜91 SURVEYORによるNHEJの機能検証:5〜6時間
ステップ92〜124 サンガー法または次世代ディープシーケンシングによる遺伝子タイピング:2〜3日(3〜4時間のハンズオン時間)
CRISPR−Casは容易に多重化し得るため、いくつかの遺伝子の同時改変が促進され、かつ高効率で染色体微小欠失が媒介される。本出願人らは2つのsgRNAを使用することにより、HEK293FT細胞において最大68%の効率でのヒトGRIN2BおよびDYRK1A遺伝子座の同時標的化を実証した。同様に、sgRNAのペアを使用することによりエクソンの切り出しなどの微小欠失を媒介することができ、これはクローンレベルでPCRにより遺伝子型決定され得る。エクソン接合部の正確な位置は異なり得ることに留意されたい。本出願人らはまた、ssODNおよびターゲティングベクターを使用したHEK 293FT細胞およびHUES9細胞におけるCas9の野生型およびニッカーゼ突然変異体の両方によるHDRの媒介も実証した(図30)。本出願人らはCas9ニッカーゼを使用したHUES9細胞でのHDRを検出できていないことに留意されたく、これはHUES9細胞における修復活性の低い効率または潜在的な違いに起因し得る。これらの値は典型的であるが、所与のsgRNAの開裂効率にはいくらかのばらつきがあり、まれにある種のsgRNAは、未だ解明されていない理由により機能しないこともある。本出願人らは、各遺伝子座につき2つのsgRNAを設計し、かつ意図される細胞型におけるそれらの効率を試験することを推奨する。
Cas9転写モジュレーター:本出願人らは、Cas9/gRNA CRISPR系を、DNA開裂の域を越える機能が遂行され得る汎用DNA結合システムに転換しようと試みた。例えば、1つまたは複数の機能ドメインを触媒的に不活性なCas9と融合することにより、本出願人らは新規機能、例えば転写活性化/抑制、メチル化/脱メチル化、またはクロマチン改変を付与している。この目標を達成するため、本出願人らは、ヌクレアーゼ活性に必須の2つの残基D10およびH840をアラニンに変えることにより、触媒的に不活性なCas9突然変異体を作製した。これらの2つの残基を突然変異させることにより、Cas9のヌクレアーゼ活性を消失させ、一方で標的DNAとの結合能は維持する。本出願人らが自らの仮説を検証するため着目することに決めた機能ドメインは、転写活性化因子VP64ならびに転写リプレッサーSIDおよびKRABである。
材料および試薬
Herculase II融合ポリメラーゼ(Agilent Technologies、カタログ番号600679)
10× NE緩衝液 4(NEB、カタログ番号B7004S)
BsaI HF(NEB、カタログ番号R3535S)
T7 DNAリガーゼ(Enzymatics、カタログ番号L602L)
Fast Digest緩衝液、10×(ThermoScientific、カタログ番号B64)
FastDigest NotI(ThermoScientific、カタログ番号FD0594)
FastAPアルカリホスファターゼ(ThermoScientific、カタログ番号EF0651)
リポフェクタミン2000(Life Technologies、カタログ番号11668−019)
トリプシン(Life Technologies、カタログ番号15400054)
鉗子#4(Sigma、カタログ番号Z168777−1EA)
鉗子#5(Sigma、カタログ番号F6521−1EA)
10× ハンクス平衡塩類溶液(Sigma、カタログ番号H4641−500ML)
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(Life Technologies、カタログ番号P4333)
Neurobasal(Life Technologies、カタログ番号21103049)
B27サプリメント(Life Technologies、カタログ番号17504044)
L−グルタミン(Life Technologies、カタログ番号25030081)
グルタミン酸塩(Sigma、カタログ番号RES5063G−A7)
β−メルカプトエタノール(Sigma、カタログ番号M6250−100ML)
HAウサギ抗体(Cell Signaling、カタログ番号3724S)
LIVE/DEAD(登録商標)細胞イメージングキット(Life Technologies、カタログ番号R37601)
30G World Precision Instrumentシリンジ(World Precision Instruments、カタログ番号NANOFIL)
定位固定装置(Kopf Instruments)
UltraMicroPump3(World Precision Instruments、カタログ番号UMP3−4)
スクロース(Sigma、カタログ番号S7903)
塩化カルシウム(Sigma、カタログ番号C1016)
酢酸マグネシウム(Sigma、カタログ番号M0631)
トリス−HCl(Sigma、カタログ番号T5941)
EDTA(Sigma、カタログ番号E6758)
NP−40(Sigma、カタログ番号NP40)
フェニルメタンスルホニルフルオリド(Sigma、カタログ番号78830)
塩化マグネシウム(Sigma、カタログ番号M8266)
塩化カリウム(Sigma、カタログ番号P9333)
β−グリセロリン酸(Sigma、カタログ番号G9422)
グリセロール(Sigma、カタログ番号G9012)
Vybrant(登録商標)DyeCycle(商標)Ruby染色(Life technologies、カタログ番号S4942)
FACS Aria Flu−act−細胞選別機(Koch Institute of MIT、Cambridge、米国)
DNAeasy血液および組織キット(Qiagen、カタログ番号69504)
インビボで脳において使用されるgRNA多重体の構築
本出願人らは、マウスTETおよびDNMTファミリーメンバーを標的にする単一のgRNAを設計し、PCR増幅した(本明細書に記載されるとおり)。標的化効率をN2a細胞系で評価した(図33)。インビボでいくつかの遺伝子の同時改変を達成するため、効率的なgRNAをAAVパッケージングベクターに多重化した(図34)。系の効率のさらなる分析を促進するため、本出願人らは、ヒトシナプシンIプロモーターの制御下にあるGFP−KASHドメイン融合タンパク質からなる発現カセットを系に加えた(図34)。この改変により、ニューロン集団における系の効率のさらなる分析が可能になる(さらに詳細な手順は「核の選別およびインビボ結果」の節にある)。
PCR産物消化:
AAV送達系は、そのユニークな特徴にも関わらず、パッキングに限界がある−インビボでの発現カセットの送達を成功させるには、4.7kb未満のサイズでなければならない。SpCas9発現カセットのサイズを小さくして送達を促進するため、本出願人らはいくつかの変更を試験した:異なるプロモーター、より短いポリAシグナルおよび最後により小さいバージョンの黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)由来Cas9(SaCas9)(図37および図38)。試験した全てのプロモーターが、マウスMecp2(Gray et al.,2011)、ラットMap1bおよびトランケート型ラットMap1b(Liu and Fischer,1996)を含め、以前試験され、ニューロンにおいて活性であることが発表されたものである。代替的な合成ポリA配列は、同様に機能性であることが以前示されたものである(Levitt et al.,1989;Gray et al.,2011)。クローニングした全ての構築物を、リポフェクタミン2000による形質移入後にN2a細胞で発現させ、ウエスタンブロッティング法で試験した(図39)。
開発した系のニューロンにおける機能性を確認するため、本出願人らはインビトロで初代ニューロン培養物を使用する。Banker and Goslin(Banker and Goslin,1988)により既発表のプロトコルに従いマウス皮質ニューロンを調製した。
435ml H2O
50ml 10×ハンクス平衡塩類溶液
16.5ml 0.3M HEPES pH7.3
5ml ペニシリン−ストレプトマイシン溶液
ろ過(0.2μm)および保存4℃
97ml Neurobasal
2ml B27サプリメント
1ml ペニシリン−ストレプトマイシン溶液
250μl グルタミン
125μl グルタミン酸
本出願人らは、AAV送達後のニューロン培養物におけるSpCas9およびSaCas9の発現を、ウエスタンブロット法を用いて確認した(図42)。形質導入後1週間でニューロンをβ−メルカプトエタノール含有NuPage SDSローディング緩衝液に回収し、タンパク質を95℃で5分間変性させた。試料をSDS PAGEゲル上で分離し、WBタンパク質検出用のPVDF膜に移した。HA抗体でCas9タンパク質を検出した。
CRISPR系を含むAAVの毒性を評価するため、本出願人らはウイルス形質導入後1週間のニューロンの全体的な形態を調べた(図45)。加えて、本出願人らは、設計した系の潜在的毒性を、培養下の生細胞と死細胞との区別を可能にするLIVE/DEAD(登録商標)細胞イメージングキットで調べた。これは、細胞内エステラーゼ活性の存在(非蛍光カルセインAMから強度に緑色の蛍光カルセインへの酵素変換により決定されるとおりの)に基づく。他方で、キットの赤色の細胞不透過性成分は、破損した膜を有する細胞に限り侵入し、DNAに結合して死細胞で蛍光を生じる。両方のフルオロフォアとも、生細胞では蛍光顕微鏡法で容易に可視化され得る。初代皮質ニューロンにおけるCas9タンパク質および多重gRNA構築物のAAVドライブ発現は十分な忍容性を有し、非毒性であった(図43および図44)ことから、設計されたAAV系がインビボ試験に好適であることを示している。
McClure et al.,2011に記載される方法により濃縮ウイルスを作製した。HEK293FT細胞において上清ウイルス産生が生じた。
ウイルスベクター注入のため、10〜15週齢雄性C57BL/6Nマウスをケタミン/キシラジンカクテル(100mg/kgのケタミン用量および10mg/kgのキシラジン用量)で腹腔内注射により麻酔した。先制鎮痛薬(1mg/kg)としてブプレネックス(Buprenex)の腹腔内(intraperitonial)投与を使用した。動物を、耳内位置決めスタッドおよびトゥースバーを使用してKopf定位固定装置に固定化し、固定された頭蓋を維持した。手持形ドリルを使用して、ブレグマの−3.0mm後方および3.5mm側方に、海馬のCA1野における注入用の穴(1〜2mm)を開けた。30G World Precision Instrumentシリンジを2.5mmの深さで使用して、総容積1ulのAAVウイルス粒子の溶液を注入した。注入は「World Precision Instruments UltraMicroPump3」注入ポンプにより0.5ul/分の流量でモニタして組織損傷を防いだ。注入が完了した時点で注射針をゆっくりと、0.5mm/分の速度で取り出す。注入後、6−0 Ethilon縫合糸で皮膚を閉じた。動物を術後に1mLの乳酸加リンゲル液(皮下)で水分補給させ、歩行可能な回復に達するまで温度制御された(37℃)環境に収容した。術後3週間で深麻酔により動物を安楽死させ、続いて核選別のため組織を摘出するか、または免疫化学のため4%パラホルムアルデヒドを灌流させた。
本出願人らは、標識した細胞核の蛍光活性化細胞選別(FACS)ならびにDNA、RNAおよび核タンパク質の下流処理のためgRNA標的神経細胞核をGFPで特異的に遺伝的にタグ標識する方法を設計した。そのために、本出願人らの多重ターゲティングベクターが、GFPとマウス核膜タンパク質ドメインKASH(Starr DA,2011,Current biology)との間の融合タンパク質および目的の特異的遺伝子座を標的にする3つのgRNAの両方を発現するように設計された(図34)。GFP−KASHはヒトシナプシンプロモーターの制御下で発現してニューロンを特異的に標識した。融合タンパク質GFP−KASHのアミノ酸は以下であった:
いくつかの疾患モデルが特に研究されている。それらには、デノボ自閉症リスク遺伝子CHD8、KATNAL2、およびSCN2A;および症候性自閉症(アンジェルマン症候群)遺伝子UBE3Aが含まれる。これらの遺伝子および得られる自閉症モデルは当然ながら好ましいが、本発明を任意の遺伝子に適用することができ、従って任意のモデルが可能であることを示している。
本明細書には、ハイスループットスクリーニング用途のために開発された、かつそれで特に上手く機能するAAV産生系またはプロトコルが提供され、しかしながらこれは、本発明においても同様により広い適用性を有する。内因性遺伝子発現の操作は、発現速度が、調節エレメント、mRNAプロセシング、および転写物の安定性を含めた多くの要因に依存するため、種々の難題を突きつける。この難題を解消するため、本出願人らは、送達用のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベースのベクターを開発した。AAVはssDNAベースのゲノムを有し、従って組換えを起こしにくい。
500mlボトルDMEM高グルコース+Glutamax(GIBCO)
50ml Hyclone FBS(熱失活)(Thermo Fischer)
5.5ml HEPES溶液(1M、GIBCO)
細胞:低継代HEK293FT(ウイルス産生時の継代数<10、ウイルス産生には継代数2〜4の新しい細胞を解凍し、3〜5代成長させる)
50ml滅菌超高純度H2Oに50mg PEI「Max」を溶解する
pHを7.1に調整する
0.22umフリップトップフィルターでろ過する
チューブを密閉し、パラフィルムで包む
アリコートを−20℃で凍結する(保存のため、また直ちに使用してもよい)
D10+HEPES中で低継代HEK293FTを培養する
毎日1:2〜1:2.5で継代する
有利には細胞を85%より高いコンフルエンシーに至らせない
−フラスコ当たり10ml HBSS(−Mg2+、−Ca2+、GIBCO)+1ml TrypLE Express(GIBCO)を37℃に温める(ウォーターバス)
培地を完全に吸引する
−10mlの温HBSSを穏やかに添加する(培地を完全に洗い流すため)
−フラスコ当たり1mlのTrypLEを添加する
−フラスコをインキュベーター(37℃)に1分間置く
−フラスコを揺り動かして細胞を剥がす
−9mlのD10+HEPES培地(37℃)を添加する
−上下に5回ピペッティングして単一細胞懸濁液を作成する
−1:2〜1:2.5(T75には12mlの培地)の比で分割する(細胞の成長が遅い場合、廃棄して新しいバッチを解凍する、それらは最適成長でない)
−十分な(大量の細胞の取り扱いが容易になるだけの)細胞が存在するようになったら直ちにT225に移す
1000万細胞を15cmディッシュ中21.5ml培地にプレーティングする
37℃で18〜22時間インキュベートする
80%コンフルエンスでの形質移入が理想的である
22ml培地(D10+HEPES)を予熱する
5.2ug 目的のベクターのプラスミド
4.35ug AAV血清型1プラスミド
4.35ug AAV血清型2プラスミド
10.4ug pDF6プラスミド(アデノウイルスヘルパー遺伝子)・ボルテックスして混合する
434uL DMEMを添加する(無血清!)
130ul PEI溶液を添加する
5〜10秒間ボルテックスする
DNA/DMEM/PEI混合物を予熱した培地に添加する
短時間ボルテックスして混合する
15cmディッシュ中の培地をDNA/DMEM/PEI混合物に交換する
37℃インキュベーターに戻す
48時間インキュベートした後回収する(培地が過度に酸性にならないようにすること)
1.15cmディッシュから培地を慎重に吸引する(有利には細胞を押し退けない)
2.各プレートに25ml RT DPBS(Invitrogen)を添加し、細胞スクレーパーで細胞を穏やかに剥がし取る。50mlチューブに懸濁液を収集する。
3.800×gで10分間細胞をペレット化する。
4.上清を廃棄する。
5.ペレットを150mM NaCl、20mM トリス pH8.0中に再懸濁し、組織培養プレート当たり10mlを使用する。
6.dH2O中に10%デオキシコール酸ナトリウムの新鮮な溶液を調製する。これを0.5%の最終濃度で組織培養プレート当たり1.25ml添加する。ベンゾナーゼ(benzonase)ヌクレアーゼを50単位/mlの最終濃度となるように添加する。チューブを徹底的に混合する。
7.37℃で1時間(ウォーターバス)インキュベートする。
8.3000×gで15分間遠心することにより細胞残屑を除去する。新鮮な50mlチューブに移し、ヘパリンカラムの詰まりを防ぐため、全ての細胞残屑が除去されたことを確実にする。
1.蠕動ポンプを使用して、溶液が毎分1mlでカラムを通って流れるようにHiTrapヘパリンカラムをセットアップする。ヘパリンカラム内に気泡が取り込まれないよう確実にすることが重要である。
2.蠕動ポンプを使用して、10ml 150mM NaCl、20mM トリス、pH8.0でカラムを平衡化する。
3.ウイルスの結合:50mlウイルス溶液をカラムに加え、中を通って流れさせる。
4.洗浄ステップ1:カラムを20ml 100mM NaCl、20mM トリス、pH8.0で(蠕動ポンプを使用)。
5.洗浄ステップ2:3mlまたは5mlシリンジを使用して、1ml 200mM NaCl、20mM トリス、pH8.0、続いて1ml 300mM NaCl、20mM トリス、pH8.0でカラムの洗浄を続ける。
フロースルーは廃棄する。
(上記のウイルス溶液を50分間流す間、種々の緩衝液でシリンジを調製する)
6.溶出 5mlシリンジおよび軽い圧力(<1ml/分の流量)を使用して、以下を加えることによりカラムからウイルスを溶出させる:
1.5ml 400mM NaCl、20mM トリス、pH8.0
3.0ml 450mM NaCl、20mM トリス、pH8.0
1.5ml 500mM NaCl、20mM トリス、pH8.0
これらを15ml遠心管に収集する。
1.濃縮ステップ1:100,000分子量カットオフのAmicon ultra 15ml遠心フィルターユニットを使用して、溶出したウイルスを濃縮する。カラム溶出物を濃縮機にロードし、2000×gで2分間遠心する(室温で。濃縮された容積を確認する−約500μlとなるはずである。必要であれば、正しい容積に達するまで1分間隔で遠心する。
2.緩衝液交換:1mlの滅菌DPBSをフィルターユニットに添加し、正しい容積(500ul)に達するまで1分間隔で遠心する。
3.濃縮ステップ2:500ulの濃縮物をAmicon Ultra 0.5ml 100Kフィルターユニットに添加する。6000gで2分間遠心する。濃縮された容積を確認する−約100μlとなるはずである。必要であれば、正しい容積に達するまで1分間隔で遠心する。
4.回収:フィルターインサートを反転させ、新鮮な収集チューブに挿入する。1000gで2分間遠心する。
アリコートに分け、−80℃で凍結する
典型的には注入部位当たり1ulが必要であり、従って少量のアリコート(例えば5ul)が推奨される(ウイルスの凍結融解を回避する)。
qPCRを使用してDNアーゼI耐性GC粒子力価を決定する(別個のプロトコルを参照)
Amicon Ultra、0.5ml、100K;MILLIPORE;UFC510024
Amicon Ultra、15ml、100K;MILLIPORE;UFC910024
Benzonaseヌクレアーゼ;Sigma−Aldrich、E1014
HiTrapヘパリンカートリッジ;Sigma−Aldrich;54836
デオキシコール酸ナトリウム;Sigma−Aldrich;D5670
培地:D10+HEPES
500mlボトルDMEM高グルコース+Glutamax(Invitrogen)
50ml Hyclone FBS(熱失活)(Thermo Fischer)
5.5ml HEPES溶液(1M、GIBCO)
細胞:低継代HEK293FT(ウイルス産生時の継代数<10)
ウイルス産生には継代数2〜4の新しい細胞を解凍し、2〜5代成長させる
形質移入試薬:ポリエチレンイミン(PEI)「Max」
50ml滅菌超高純度H2Oに50mg PEI「Max」を溶解する
pHを7.1に調整する
0.22umフリップトップフィルターでろ過する
チューブを密閉し、パラフィルムで包む
アリコートを−20℃で凍結する(保存のため、また直ちに使用してもよい)
細胞培養
D10+HEPES中で低継代HEK293FTを培養し、毎日1:2〜1:2.5で継代する
有利には細胞を85%より高いコンフルエンシーに至らせる
T75について
−フラスコ当たり10ml HBSS(−Mg2+、−Ca2+、GIBCO)+1ml TrypLE Express(GIBCO)を37℃に温める(ウォーターバス)
−培地を完全に吸引する
−10mlの温HBSSを穏やかに添加する(培地を完全に洗い流すため)
−フラスコ当たり1mlのTrypLEを添加する
−フラスコをインキュベーター(37℃)に1分間置く
−フラスコを揺り動かして細胞を剥がす
−9mlのD10+HEPES培地(37℃)を添加する
−上下に5回ピペッティングして単一細胞懸濁液を作成する
−1:2〜1:2.5(T75には12mlの培地)の比で分割する(細胞の成長が遅い場合、廃棄して新しいバッチを解凍する、それらは最適成長でない)
−十分な(大量の細胞の取り扱いが容易になるだけの)細胞が存在するようになったら直ちにT225に移す
AAV産生(単一15cmディッシュスケール)
1000万細胞を15cmディッシュ中21.5ml培地にプレーティングする
37℃で18〜22時間インキュベートする
プレート毎に80%コンフルエンスでの形質移入が理想的である
22ml培地(D10+HEPES)を予熱する
DNA混合物を含むチューブを調製する(内毒素不含maxiprep DNAを使用する):
5.2ug 目的ベクターのプラスミド
8.7ug AAV血清型1プラスミド
10.4ug DF6プラスミド(アデノウイルスヘルパー遺伝子)
ボルテックスして混合する
434uL DMEMを添加する(無血清!)130ul PEI溶液を添加する
5〜10秒間ボルテックスする
DNA/DMEM/PEI混合物を予熱した培地に添加する
短時間ボルテックスして混合する
15cmディッシュ中の培地をDNA/DMEM/PEI混合物に交換する
37℃インキュベーターに戻す
48時間インキュベートした後回収する(有利には、培地が過度に酸性にならないよう監視する)
15cmディッシュから上清を取り出す
0.45umフィルター(低タンパク質結合)でろ過し、アリコートに分け、−80℃で凍結する
形質導入(24ウェルフォーマット、5DIVでの初代ニューロン培養)
形質導入されるニューロンの各ウェル内の完全neurobasal培地を新鮮なneurobasalに交換する(通常、ウェルにつき500ul中400ulが交換される)
37℃のウォーターバスでAAV上清を解凍する
インキュベーターで30分間平衡化させる
各ウェルに250ul AAV上清を添加する
37℃で24時間インキュベートする
培地/上清を取り出し、新鮮な完全neurobasalに交換する
48時間後に発現が目に見え始め、感染後約6〜7日で飽和する
GOI(目的の遺伝子)を含むpAAVプラスミド用の構築物は、両方のITRSを含めて4.8kbを超えてはならない。
Cas9は、RNAにガイドされるDNAヌクレアーゼであり、20bp RNAガイドの助けによりゲノムにおける特定の位置にターゲティングされ得る。しかしながら、ガイド配列はガイド配列とDNA標的配列との間のいくらかのミスマッチを許容し得る。ガイドRNAによってCas9が、ガイド配列と数塩基の違いを有するオフターゲット配列をターゲティングするき、オフターゲット開裂が起こる可能性があるため、この柔軟性は望ましくない。全ての実験的応用(遺伝子ターゲティング、作物エンジニアリング、治療適用等)について、Cas9媒介性遺伝子ターゲティングの特異性を向上させ、かつCas9によるオフターゲット改変の可能性を低下させることが重要である。
この例では、とりわけ:
・ AAV2/8は肝臓標的アデノウイルスベクターである;
・ TBGは肝臓特異的プロモーターであり、ここではこれを用いてSaCas9の発現を駆動する;
・ ここではU6を用いてsgRNA(ガイド)の発現を駆動する;
・ ApoBは脂質代謝遺伝子である。これは肝臓送達の「ゴールドスタンダード」と言われることもあり、肥満症マウスモデルで広く用いられている
・ 「標的1〜標的4」は、ApoB内の4つの標的が選択されたことを意味し、そのうち標的1および標的3(T1およびT3)が最も有用であった;
・ ここで見られるとおりのウイルスベクターからの発現を介した送達は、送達方法としてAnderson/Yin(NBT 2884)による流体力学的送達の使用の改良であり、なぜなら流体力学的送達は数mlの流体を注入する必要があり、これがマウスの体に負担をかけ、致死的となり得るためである。流体力学的送達はプラスミド(ネイキッド)DNAの送達に良く適しているが、本出願者らは、ガイド配列およびCas9配列をウイルス送達ベクター内にパッケージングすることが、効率を大幅に高める点で好ましいことを示している。実際、比較的少量を導入するだけでよく、これは静脈内(i.v.)的に行うことができ、治療上はるかに良好に容認される可能性が高い。
・ 特に有望であったのは、ApoBなどの肝臓の「ゴールドスタンダード」遺伝子に遺伝子型の変化が見られたのみならず、表現型の変化もまた記録されたことであった。PCSK9での先行研究は遺伝子型の変化を示しているが、表現型の変化は示しておらず、従ってApoBで見られた表現型の変化は、肝臓へのCRISPR送達、および肝臓で表現型の変化を生じさせるその能力の妥当性を立証している。これは、より治療的に容認される送達手段(流体力学的送達と比較したi.v.)と組み合わされる。従って、CRISPR(ガイドおよびCas9)の、特に静脈内的なウイルス送達が好ましい)。
・ 標的としては、以下が挙げられる:PCSK9、HMGCR、APOB、LDLR、ANGPTL3、F8、F9/FIX、AAT、FAH、HPD、TAT、ATP7B、UGT1A1、OTC、ARH
ウイルスおよび注射パラメータ
使用した構築物:−AAV2/8−TBG−SaCas9−U6−sgRNA(Apob−標的1〜標的4)。
インビトロ試験:全てがHepa細胞において10%〜15%の効率でApob遺伝子座の開裂を誘導した。
インビボ結果:マウス−8週、C57BL/6(各時点2匹の動物および生理食塩水を注射した野生型対照として1匹の動物)
注入量:100ulの0.8E12vp/ml(vp=ウイルス粒子)
送達ウイルス粒子:0.8E11総vp/動物
組織処理およびデータ収集は以下のとおり行った:
第1の時間点約1週間(8日)。第2の時間点約4週間。
生理食塩水灌流と、続く肝組織の急性解離。
(A)肝臓の半分をSurveyorおよびqPCRおよびウエスタンブロットタンパク質解析用に−80℃の貯蔵庫に入れた(×12チューブ/動物)。
(B)肝臓の半分をクリオスタット処理用に抗凍結剤中に入れ、急速凍結した。クリオスタット切片をH&Eおよびオイルレッド染色に供した。
各動物につき2片の肝臓からQuickExtractおよびSurveyorアッセイを使用してインデルを検出および定量化した。
インビボインデル評価
図は、ApoBガイド(標的)の経時的な(注入後4週間までの)インビボインデル評価を示す。図56Aは、ガイド(標的)1がApoBにおいて最も高い割合のインデルを誘導したことを示す。標的2および4はインデル形成を全くまたは極めて不十分にしか生じさせないという意味で、ほとんどないし全く効果がないことを示した一方、標的3はいくらかの活性を示した。図56Bは、注入後4週間のインデル形成効率に関するSurveyorヌクレアーゼゲルアッセイの結果を示す。
AAV−Cas9−sgRNA送達後のインビボでの肝臓脂質蓄積表現型を検出するオイルレッド染色を示す図57Bに見られるとおり、使用した3個のガイド中2個(標的1および3)で表現型の変化が見られた。左側の2つの図、標的1および3に溜まって示される赤色のオイル斑点が、ApoBが破壊されていることを示し、右下の対照と比較される。Apob遺伝子は、Cas9の誘導による標的ゲノム開裂の結果として破壊されており、この生理学的/表現型の変化が生じた。標的2は対照と比べて顕著な差異は示さなかったとともに、標的4は図示しない。このオイルレッドO染色は、肝臓における脂肪を組織学的染色によって可視化するアッセイである。この染色は、肝臓中の脂肪量を評価するために研究で多く用いられる。実際の臨床では、オイルレッドO染色は主に、肝移植および他の手技において肝臓中の脂肪量を評価するため、肝臓生検標本の凍結切片に対して指示される。実施例のこの態様に関するプロトコルおよび情報については、以下が挙げられる:Mehlem et al,「健康および疾患における代謝状態を分析するためのオイルレッドOによる中性脂質のイメージング(Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease)」,Nature Protocols 8,1149−1154(2013);Maczuga et al.,「アポリポタンパク質B100をターゲティングするヘアピンの治療的発現は、マウス肝臓において表現型およびトランスクリプトームの変化を誘導する(Therapeutic expression of hairpins targeting apolipoprotein B100 induces phenotypic and transcriptome changes in murine liver)」,Gene Therapy(2014)21,60−70;Koornneef et al,「AAVで送達したshRNAによるアポリポタンパク質Bノックダウンはマウスにおいて血漿コレステロールを低下させる(Apolipoprotein B Knockdown by AAV−delivered shRNA Lowers Plasma Cholesterol in Mice)」,Molecular Therapy(2011)19 4,731−740;Tadin−Strapps et al.,「siRNA誘導肝臓ApoBノックダウンはヒト様血清脂質を有するマウスモデルにおいて血清LDLコレステロールを低下させる(siRNA−induced liver ApoB knockdown lowers serum LDL−cholesterol in a mouse model with human−like serum lipids)」,Journal of Lipid Research Volume 52,1084−1097(2011)。図中のスケールバーは20ミクロンを表す。
以下を調べた:ガイド長さ最適化;イントロン試験;H1プロモーター;D10A二重ニッカーゼ試験;追加的な長さ/DN試験。
標的部位:
A1:AAVS1
E1:EMX1
T1、T2、…:標的部位の付番
TGC、GTC、…:PAMの5’末端からの位置23、22、21ntにおける塩基組成
この実験は、ガイド配列をCas9イントロン配列に挿入することができたかどうかを試験しようと試みた。
CMV−SaCas9(N末端)−イントロン(sgRNA)−SaCas9(C末端)
− レーン1〜3:EBV1−152(EBVベース、EBVゲノム由来の152bpイントロン1)を示す
− レーン4〜6:EBV2(EBVベース、EBVゲノムのWリピート由来のイントロン)を示す
− レーン7〜9:ADV(アデノウイルスベースのイントロン、Kiani et al.,「哺乳類細胞におけるCRISPR転写抑制デバイスおよび層状回路(CRISPR transcriptional repression devices and layered circuits in mammalian cells)」,Nature Methods doi:10.1038/nmeth.2969 Published online 5 May 2014およびNissim et al,「ヒト細胞における統合RNAおよびCRISPR/Casツールキットによる遺伝子ネットワークの多重化したプログラム可能な調節(Multiplexed and Programmable Regulation of Gene Networks with an Integrated RNA and CRISPR/Cas Toolkit in Human Cells)」,Volume 54,Issue 4,p698−710,22 May 2014;DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2014.04.022と同様の起源)を示す。
結果を図59に示す。これらの結果は、SaCas9イントロンへのガイド配列のパッケージングを成功させることの原理証明が確かに可能であることを提供する。ガイド配列を有するsgRNAを、アデノウイルスに由来する合成イントロン内に挿入し、次にこのイントロン−sgRNAカセット全体をSaCas9遺伝子に挿入する。イントロンは、SaCas9タンパク質の正常な発現を著しく妨げることなしにSaCas9遺伝子内のどこにでも挿入することができる。sgRNAを有する複数のイントロンを、SaCas9遺伝子内の種々の位置に挿入することができる。位置決めは柔軟であり、この広範な手法は以下の2つの形で有利である:
この実験は、U6プロモーターの代替となるプロモーターを調べようと試みた。
以下の構築物を作製した:
元のH1プロモーターが1つのsgRNA(Pcsk9−Target201またはHmgcr−NewTarget5のいずれか)を駆動するCMV−SaCas9
以下の構築物を作製した:
2つの短鎖H1プロモーターが2つのsgRNA(Pcsk9−Target201およびHmgcr−NewTarget5)を同時に駆動する、二重短鎖H1プロモーターを同じ向きおよび逆の向きで使用したTBG−SaCas9。
この実験は、構築物中の2つのガイド配列の5’末端間の距離を調べ、次にそれを、D10A SaCAs9二重ニッカーゼの開裂効率に関して測定した。標的はヒトAAT1遺伝子であった。これらの試験はプラスミドにクローニングした20bp+Gガイドで行った。
この研究は以下の要点を提示する:インビボでのAAV媒介性Cas9送達の成功ならびに分裂終了ニューロンにおける効率的なゲノム改変の初めての実証。Cas9およびsgRNA発現細胞からの神経核の容易な単離を可能にする核タグ標識技法の開発。ニューロントランスクリプトームのRNAseq解析に向けた適用の実証。電気生理学的研究とCas9媒介性ゲノム摂動との統合。および、多重ターゲティングおよびCas9媒介性ゲノム編集を用いてげっ歯類行動に関する遺伝子機能を調べる能力の実証。
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、マウス脳への組換え遺伝子の送達に一般的に用いられている4。AAV系の主な限界は、上限がITRなしに約4.5kbという5、その小さいパッケージングサイズであり、これにより単一のベクター中にパッケージングし得る遺伝物質の量が制限される。SpCas96のサイズが既に4.2kbあるため、単一のAAVベクター内で他の遺伝子エレメントに残されているのは0.3kb未満であり、本発明者らは、2つの別個のウイルスベクター上にSpCas9(AAV−SpCas9)およびsgRNA発現カセット(AAV−SpGuide)をパッケージングするデュアルベクター系を設計した(図67a)。AAV−SpCas9ベクターを設計する間、本発明者らは、SpCas9発現を最適化するため様々な短いニューロン特異的プロモーターならびにポリアデニル化シグナルを比較した。本発明者らは、その最終的な設計について、培養初代マウス皮質ニューロンで十分なレベルのSpCas9発現を達成する能力に基づきマウスMecp2プロモーター(235bp、pMecp2)7および最小ポリアデニル化シグナル(48bp、spA)8を選択した(図67−c)。SpCas9を発現するニューロンの免疫蛍光法による同定を促進するため、本発明者らはSpCas9をHA−エピトープタグでタグ標識した。AAV−SpGuideベクターについては、本発明者らは、U6−sgRNA発現カセットならびにヒトシナプシンIプロモーターによって駆動されるKASH核膜貫通ドメイン9と融合した緑色蛍光タンパク質(GFP)をパッケージングした(図63a)。GFP−KASH融合タンパク質はGFPを核外膜に指向させ(図67c、図67d)、AAV−SpGuideによって形質導入されたインタクトな神経核の蛍光に基づく同定および精製を可能にする。
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DNA構築物
SpCas9標的選択および単一ガイドRNA(sgRNA)の生成のため、5’−NGG PAM配列に先行するように20nt標的配列を選択した。オフターゲット効果を最小限に抑えるため、CRIPSR設計ツールを使用した(http://tools.genome−engineering.org)。U6プロモーターをテンプレートとして使用して、フォワードプライマー:5’−CGCACGCGTAATTCGAACGCTGACGTCATC−3’および20ntDNA標的部位(太字斜体)を有するsgRNAを含むリバースプライマー:
Neuro−2a(N2a)細胞を、5%ウシ胎仔血清(BSA)を含有するDMEM中で成長させた。HEK293FT細胞には、10%ウシ胎仔血清(FBS)を含有するDMEMを使用した。細胞は5%CO2雰囲気中37℃で維持した。Lipofectamine(登録商標)2000またはポリエチレンイミン(PEI)「MAX」試薬(Polysciences)を製造者のプロトコルに従い使用して細胞を形質移入した。
等比のAAV1およびAAV2血清型プラスミドならびにpDF6ヘルパープラスミドを使用して高力価AAV1/2粒子を作製し、ヘパリンアフィニティーカラムで精製した6。qPCRによってウイルス粒子の力価測定を行った。高力価AAV1粒子はUNC Vector Core Services(ノースカロライナ大学チャペルヒル校(University of North Carolina at Chapel Hill))によって作製された。DMEM中の低力価AAV1粒子は、以前記載があるとおり作製した7。簡潔に言えば、HEK293FT細胞に、PEI「MAX」を使用して導入遺伝子プラスミド、pAAV1血清型プラスミドおよびpDF6ヘルパープラスミドを形質移入した。48時間後に培養培地を回収し、0.45μm PVDFフィルタ(Millipore)でろ過した。
組織培養用のニューロンを得るために使用した動物を、MIT動物管理委員会(MIT CAC:Committee on Animal Care)によって承認されたプロトコルに従い犠牲にした。胚性16日目のマウス脳から初代培養物を調製した8。男女両性の胚を使用した。細胞を、ポリ−D−リジン(PDL)でコートした24ウェルプレート(BD Biosciences)またはラミニン/PDLでコートしたカバーガラス(VWR)に播いた。培養物は、B27、Glutamax(Life Technologies)およびペニシリン/ストレプトマイシン混合物を補足したNeurobasal培地において37℃および5%CO2で成長させた。
本明細書に記載する全ての動物手順がMIT CACによって承認された。成体(12〜16週齢)雄性C57BL/6Nマウスを100mg/kgケタミンおよび10mg/kgキシラジンの腹腔内(i.p.)注射で麻酔した。先制鎮痛を投与した(Buprenex、1mg/kg、i.p.)。承認された手順に従い開頭術を実施し、1μlの1:1AAV混合物(1×1013Vg/mlのsMecp2−SpCas9;6×1012Vg/mlのDNMT 3×sgRNA;3〜5×1012Vg/mlのhSyn−GFP−KASH)を背側歯状回(前側/後側:−1.7;中外側:0.6;背側/腹側:−2.15)および/または腹側歯状回(前側/後側:−3.52;中外側:2.65;背側/腹側:−3)に注入した。インビボ電気生理学記録実験については、ウイルス注入座標は3mm外側(ブレグマから)および後側縫合線から1mm前側であった。時折生理食塩水で冷却しながらdremelドリルを使用して頭蓋を薄くし、残りの硬膜を、鉱油中に懸濁したウイルスを充填したガラス製マイクロピペットを使用して穿刺した。隣接部位に200〜250μmの深さで数回の注入(3〜4回)を行った。150〜200nlの容積のウイルス混合物を各部位につき75nl/分の速度で注入した。各注入後、ピペットをその場に3〜5分間保持してから引き込み、それにより漏れを防いだ。切開を縫合し、術後3日間にわたり適切な術後鎮痛薬(メロキシカム、1〜2mg/kg)を投与した。
ウイルス注入の2週間後、マウスを電気生理学的実験に使用した。マウスを2%イソフルランで麻酔し、0.8%イソフルランを使用して維持した。皮膚を切除し、sugiで洗浄し、接着剤および歯科用アクリルを使用して頭蓋に金属ヘッドプレートを取り付け、一次視覚野(V1)上で2mm×2mm開頭術を実施した。次に露出した領域を人工脳脊髄液(aCSF;140mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、0.01mM EDTA、10mM HEPES、10mM グルコース;pH7.4)中の1.5%アガロースの薄層で覆った。実験中、動物の体温は加熱ブランケットで37.5℃に維持した。
ゲノム編集されたニューロンの方位選択性およびチューニングを評価するため、本発明者らは、Matlab PsychToolbox−3で書かれたカスタムソフトウェアを使用して定方位グレーティングを提示した。グレーティングは細胞応答性に対して最適化し、方位を0から360度まで20度刻みで段階的に変えることにより提示し、各グレーティングの提示は4秒間「オフ」に先行し、その後4秒間「オン」が続き、合計提示時間を144秒とした。データはMatlabに直接取得し、.matファイルとして保存した。スパイク検出は、手動で定義した閾値と、続いてさらなる妥当性確認のためスパイク形状テンプレートマッチングを使用した解析ルーチンによって実施した。全てのスパイクをタグ付けし、グラフィカルユーザインターフェースのスクリーンに表示して、偽陽性および偽陰性を実験者が手動で精査した。次に各刺激に応答したスパイク時間をその視覚刺激に対するタイミングに基づき「オン」期間または「オフ」期間に分類し、各刺激の「オン」スパイクを、同じ期間に観察された「オフ」スパイクの数だけデクリメントした。方位実験について、「オン」期間および「オフ」期間は同じ長さであったため、刺激当たりのスパイク数=(「オン」スパイク数)−(「オフ」スパイク数)である。
海馬または歯状回全体を氷冷DPBS(Life Sciences)中で速やかに解剖し、ドライアイスで衝撃凍結した。細胞核精製のため、組織を2mlの氷冷ホモジナイズ緩衝液(HB)(320mM スクロース、5mM CaCl、3mM Mg(Ac)2、10mM トリス pH7.8、0.1mM EDTA、0.1%NP40、0.1mM PMSF、1mM β−メルカプトエタノール)中に、2mlダウンス型ホモジナイザー(Sigma)を使用して;ペッスルAで25回、続いてペッスルBで25回、穏やかにホモジナイズした。次に、合計5mlになるまで3mlのHBを添加し、氷上に5分間置いておいた。勾配遠心のため、5mM CaCl、3mM Mg(Ac)2、10mM トリス pH7.8、0.1mM PMSF、1mM β−メルカプトエタノールを含有する5mlの50%OptiPrep(商標)密度勾配媒体(Sigma)を添加して混合した。この溶解物を、コニカル30ml遠心管(Beckman Coulter、SW28ロータ)の中の10ml 29%等浸透圧OptiPrep(商標)溶液の上に穏やかに入れた。試料を10,100×g(7,500rpm)、4℃で30分間遠心した。上清を取り除き、核ペレットを、65mM β−グリセロリン酸(pH7.0)、2mM MgCl2、25mM KCl、340mM スクロースおよび5%グリセロール中に穏やかに再懸濁した。精製した核の数および質を、明視野顕微鏡法を用いて検査した。
精製したGFP陽性(GFP+)および陰性(GFP−)のインタクトな核をVybrant(登録商標)DyeCycle(商標)Ruby染色(1:500、Life Technologies)で同時標識し、BD FACSAria III(Koch Institute Flow Cytometry Core,MIT)を使用して選別した。GFP+核およびGFP−核を、1%BSAでコーティングされた、かつ400μlの再懸濁緩衝液(65mM β−グリセロリン酸塩pH7.0、2mM MgCl2、25mM KCl、340mM スクロースおよび5%グリセロール)が入った1.5mlエッペンドルフ試験管に収集した。選別後、全ての試料を氷上に保ち、10,000×g、4℃で20分間遠心した。核ペレットを−80℃で保存し、下流処理に直接使用した。
sgRNAの機能試験のため、50〜70%コンフルエントのN2a細胞に、単一のPCR増幅したsgRNAおよびSpCas9ベクターを同時形質移入した。SpCas9のみを形質移入した細胞を陰性対照として供した。形質移入後48時間で細胞を回収し、DNeasy Blood & Tissueキット(Qiagen)を使用して、製造者のプロトコルに従いDNAを抽出した。AAV1形質導入初代ニューロンからゲノムDNAを単離するため、AAV形質導入の7日後にDNeasy Blood & Tissueキットを製造者の指示に従い使用した。
Mecp2をターゲティングするガイドを有するSpCas9(4匹の動物)またはlacZをターゲティングするgRNAを有するSpCas9(4匹の動物)の両側性ウイルス送達の2週間後、歯状回を氷冷DPBS(Life Sciences)中に速やかに解剖し、RNA−later溶液(Ambion)に直ちに移した。4℃で24時間の後、組織を−80℃に移した。100個の標的神経核の集団を、1%2−メルカプトエタノール(Qiagen)を補足した10μl TCL緩衝液中にFACS選別した。遠心後、試料を−80℃で直ちに凍結した。RNAを、AMPure RNAcleanXP SPRIビーズ(Beckman Coulter Genomics)で製造者の指示に従い精製し、80%エタノールで3回洗浄し、最終的な溶出は省いた。RNAを捕捉したビーズを風乾させて、cDNA合成用に直ちに処理した。核を含まない試料を陰性対照として使用した。cDNAライブラリの調製においては、逆転写酵素を0.1ulのMaxima H Minus酵素(200U/ul、Thermo Scientific)に置き換え、かつPCR反応を25ulの容積にスケールダウンしたことを除きSMART−seq2プロトコル12に従い、各動物につき3個の集団試料、合計24個の集団試料を使用した。Nextera XT DNA試料調製キット(Illumina)を以下の改変を伴い使用して、タグメンテーション反応および最終的なPCR増幅を行った。反応容積は全て4分の1にスケールダウンし、かつPCR増幅ステップ後に、各試料につき2.5ulを取ることによりライブラリをプールした。プールしたライブラリを、2ラウンドの0.7容積のAMPure XP SPRIビーズクリーンアップ(Beckman Coulter Genomics)を使用してクリーニングし、サイズ選択した。試料を高感度DNAチップ(Agilent)にロードしてライブラリのクオリティを確かめ、一方、Qubit高感度DNAキット(Invitrogen)で定量化を行った。プールしたライブラリを4nMの終濃度および12pmolとなるように希釈し、75bpペアエンドリードでIllumina Miseqを使用してシーケンシングした。
マウスmm9 UCSCゲノムおよび既知の遺伝子トランスクリプトーム13に基づきBowtie2インデックスを作成し、Bowtie2を使用してコマンドラインオプション−q −−phred33−quals −n 2 −e 99999999 −l 25 −I 1 −X 1000 −a −m 200 −p 4 −−chunkmbs 512でペアエンドリードをこのインデックスと直接アラインメントした。次に、Bowtie2によって作成されたアラインメントに対してRSEM v1.27をデフォルトパラメータで実行し、発現レベルを推定した。各遺伝子についてRSEM遺伝子レベル発現推定値(τ)に1,000,000を乗じて転写物百万分率(TPM)推定値を求め、log2(TPM+1)を取ることによりTPM推定値を対数空間に変換した。遺伝子は、それらの変換された発現レベルが2以上(log2(TPM+1)目盛で)である場合に検出されたと見なした。8000個未満の遺伝子が検出された場合にライブラリはフィルタリングで取り除いた。この基準に基づき4個のライブラリがフィルタリングされ、下流分析から除外された。対照動物とMecp2 sgRNAを発現する動物との間の差次的発現遺伝子を見付けるため、20回のランダムな順列ランでのスチューデントt検定(Matlab V2013b)およびクロス確認を使用し、ここでは各ランにおいて各動物から1つのライブラリがランダムに選択され、除外された(これにより毎回t検定で使用される合計12個のライブラリがもたらされた)。各試料について平均発現レベルが0.9分位点より高い(通常約5log2(TPM+1))全ての遺伝子に対してt検定を実行した。次に、順列ランの3分の1より多くで有意であった(p<0.01)遺伝子を選択した。全試料にわたるこれらの遺伝子のlog2(TPM+1)発現レベルを、階層クラスタリング(Matlab V2013b)を使用してクラスタリングした。
細胞培養:初代ニューロンの免疫蛍光染色のため、細胞をウイルス送達7日後に4%パラホルムアルデヒド(paraformaldehyd)(PFA)によって室温で20分間固定した。PBSで3回洗浄した後、細胞をPBS中5%正常ヤギ血清(NGS)(Life Technologies)、5%ロバ血清(DS)(Sigma)および0.1%Triton−X100(Sigma)によって室温で30分間ブロックした。細胞を一次抗体と共に2.5%NGS、2.5%DSおよび0.1%Triton−X100中室温で1時間または4℃で一晩インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、細胞を二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。最後に、DAPI含有VECTASHIELD HardSet封入剤(Vector Laboratories)を使用してカバーガラスをマウントし、Zeiss AxioCam Ax10顕微鏡およびAxiocam MRmカメラを使用してイメージングした。画像をZen 2012ソフトウェア(Zeiss)を使用して処理した。ImageJソフトウェア1.48hおよびニューロン検出器プラグインを使用することにより定量化を実施した。
LIVE/DEAD(登録商標)アッセイ(Life technologies)を製造者の指示に従い使用して、対照および形質導入初代ニューロンを染色した。GFP−KASH発現からのGFPシグナルへの干渉を回避するため、DEAD(エチジウムホモ二量体)およびDAPI(全ての細胞)のみについて細胞を染色した。染色した細胞を蛍光顕微鏡法を用いてイメージングし、ImageJ 1.48hソフトウェアおよびニューロン検出器プラグインを使用してDEAD、GFPおよびDAPI陽性細胞をカウントした。
形質導入初代皮質ニューロン(24ウェル、ウイルス送達7日後)および形質導入組織試料(ウイルス送達4週間後)を、0.1%SDSおよびプロテアーゼ阻害薬(Roche、Sigma)を含有する50μLの氷冷RIPA緩衝液(Cell Signaling)中に溶解した。細胞溶解物をBioruptorソニケーター(Diagenode)で5分間超音波処理し、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce Biotechnology,Inc.)を使用してタンパク質濃度を決定した。タンパク質溶解物(lysats)をSDS−PAGE試料緩衝液中に溶解し、還元条件下4〜15%トリス−HClゲル(Bio−Rad)上で分離し、一次抗体:ウサギ抗Dnmt3a(Santa Cruz、1:500)、マウス抗Dnmt1(Novus Biologicals、1:800)、ウサギ抗Mecp2(Millipore、1:400)、ウサギ抗チューブリン(Cell Signaling、1:10,000)、続いて二次抗マウスおよび抗ウサギ(rabbbit)HRP抗体(Sigma−Aldrich、1:10,000)を使用したウエスタンブロッティングによって分析した。GAPDHはウサギHRP共役抗GAPDH抗体(Cell Signaling、1:10,000)で直接可視化した。チューブリンまたはGAPDHをローディング対照として供した。ImageLab 4.1ソフトウェア(BioRad)を備えるChemiDoc(商標)MPシステムでブロットをイメージングし、ImageJソフトウェア1.48hを使用して定量化した。
12週齢C57BL/6N雄マウスの背側および腹側歯状回への両側性SpCas9/DNMT 3xsgRNA送達の8週間後、動物を実験者および行動実験室に7日間馴化させた。SpCas9/GFP−KASHを注入した同腹仔を対照として供した。DCFCの1日目、隔離された控え室にマウスケージを置き、試験前および試験後にマウスに聴覚キューが入ることを防いだ。個々のマウスをFCチャンバ(Med Associates Inc.)に置き、12分間の馴化期間を実施した。馴化後、マウスをそのホームケージに戻した。翌日(訓練日)、個々のマウスをチャンバに入れ、4分間馴化させた。さらに20秒間の(トーン前)間隔後、トーン(聴覚キュー)を85dB、2.8kHzのレベルで20秒間提示し、続いて18秒間の遅延間隔を置いた後、フットショックを提示した(0.5mA、2秒間)。フットショック後、40秒間の間隔(トーン/ショック後)を続けた後、次の同じ試行を20秒間のトーン前期間から開始した。この訓練試行を6回繰り返してからマウスをそのホームケージに戻した。3日目(試験日)、マウスを初めに条件付け文脈チャンバに3分間置いた。次に、マウスは、20秒間の間隔と、続く20秒間のトーンおよび60秒間のトーン後間隔から始まる4×100秒間の試験試行を受けた。最後に、マウスを文脈を変えた条件付けチャンバ(フラットフロア対グリッド、四分割対七分割チャンバ、バニリン芳香)に入れ、試験試行を繰り返した。フリージング行動を記録し、分析を盲検的にオフラインで手動で実施し、Noldus EthoVision XTソフトウェア(Noldus Information Technology)で確認した。
CRISPR設計ツール(http://crispr.mit.edu/)を使用して、脳においてCRISPR−SpCas9によりターゲティングされるDNMTファミリー遺伝子の潜在的なオフターゲットを見付けた。ウイルス送達の12週間後に歯状回の標的細胞核をFACS選別し、ゲノムDNAを上記に記載したとおり精製した。目的の遺伝子毎に、CRISPR標的部位に隣接するゲノム領域を融合PCR方法によって増幅し、Illumina P5アダプターならびにユニークな試料特異的バーコードを標的アンプリコンに取り付けた(オンターゲットおよびオフターゲットプライマーについては、補表3を参照のこと)15。バーコードを加え、かつ精製したDNA試料をQubit 2.0蛍光光度計(Life Technologies)によって定量化し、等モル比でプールした。次にシーケンシングライブラリをIllumina MiSeq Personalシーケンサー(Life Technologies)によってリード長さ300bpでシーケンシングした。
全ての実験は、最小2つの独立した生物学的レプリケートで行った。統計は、Prism6(GraphPad)でスチューデント両側t検定を用いて実施した。
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この実施例は、Cas9のエピトープタグ標識に関する。端的には、本発明者らは、三重エピトープタグ(具体的には3xHA)が検出シグナルを改善することを見出した。
細胞培養および形質移入
ヒト胎児腎臓(HEK)細胞系293FT(Life Technologies)またはマウスHepa1−6(Sigma−Aldrich)細胞系を、10%ウシ胎仔血清(HyClone)、2mM GlutaMAX(Life Technologies)、100U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)に37℃で5%CO2インキュベーションによって維持した。
293FTおよびHUES62細胞に、上記に記載したとおりのDNAを形質移入した。細胞を形質移入後72時間にわたり37℃でインキュベートした後、ゲノムDNAを抽出した。ゲノムDNAはQuickExtract DNA抽出溶液(Epicentre)を使用して、製造者のプロトコルに従い抽出した。簡潔に言えば、ペレット化した細胞をQuickExtract溶液に再懸濁し、65℃で15分間、68℃で15分間、および98℃で10分間インキュベートした。
HEK 293FT細胞を形質移入し、プロテアーゼ阻害薬(Roche)を補足した1×RIPA緩衝液(Sigma−Aldrich)中に溶解した。この溶解物をBolt 4−12%ビス−トリスPlusゲル(Invitrogen)にロードし、ニトロセルロース膜に移した。膜を、0.1%Tween−20および5%ブロッキング剤(G−Biosciences)を含有するトリス緩衝生理食塩水でブロックした。膜をウサギ抗FLAG(1:5,000、Abcam)、HRP共役抗GAPDH(1:5,000 Cell Signaling Technology)、およびHRP共役抗ウサギ(1:1,000)抗体でプローブし、Gel Doc XR+システム(Bio−Rad)で可視化した。
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Claims (44)
- 目的のゲノム遺伝子座における分裂終了細胞標的配列の操作によって生物または非ヒト生物を改変する方法であって、それにより前記細胞の表現型の変化を引き起こす方法において、
(A)−I.CRISPR−Cas系RNAポリヌクレオチド配列であって、
(a)真核細胞の分裂終了細胞標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、
(b)tracrメイト配列、および
(c)tracr配列
を含むポリヌクレオチド配列、および
II.CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列であって、場合により少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むポリヌクレオチド配列、
[(a)、(b)および(c)が5’から3’への方向に並び、
転写時に前記tracrメイト配列が前記tracr配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が、前記分裂終了細胞標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記CRISPR複合体が、(1)前記分裂終了細胞標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、および(2)前記tracr配列にハイブリダイズする前記tracrメイト配列と複合体形成している前記CRISPR酵素を含み、かつCRISPR酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAであり、
前記CRISPR酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列が、前記CRISPR酵素の発現の1つまたは複数の調節配列に作動可能に結合しており、従って前記CRISPR酵素の発現によって、前記分裂終了細胞において前記CRISPR複合体のアセンブリ、およびその操作がある]
を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む方法。 - 前記CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列、ガイド配列、tracrメイト配列またはtracr配列の一部または全部がRNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記CRISPR酵素をコードする配列、前記ガイド配列、tracrメイト配列またはtracr配列をコードするポリヌクレオチドがRNAであり、かつリポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、または遺伝子銃によって送達される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、1つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 目的のゲノム遺伝子座における分裂終了細胞標的配列の操作によって生物または非ヒト生物を改変する方法において、
組成物をその発現のため作動可能にコードする1つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、前記組成物が、
I.CRISPR−Cas系RNAポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第1の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列が、
(A)真核細胞の腎臓標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、
(b)tracrメイト配列、および
(c)tracr配列
を含む、第1の調節エレメント、および
II.CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメントであって、場合により少なくとも1つ以上の核局在化配列を含む第2の調節エレメント
[(A)、(b)および(c)が5’から3’への方向に並び、
成分IおよびIIが前記系の同じまたは異なるベクター上にあり、
転写時に前記tracrメイト配列が前記tracr配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が、前記腎臓標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記CRISPR複合体が、(1)前記腎臓標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、および(2)前記tracr配列にハイブリダイズする前記tracrメイト配列と複合体形成している前記CRISPR酵素を含む]
を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を含む、方法。 - 前記ウイルスベクターの1つ以上が、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、または遺伝子銃によって送達される、請求項5に記載の方法。
- 目的ゲノム遺伝子座中の腎臓標的配列の異常により引き起こされる病態の治療または阻害が必要とされる対象または非ヒト対象における目的ゲノム遺伝子座中の腎臓標的配列の異常により引き起こされる病態を治療または阻害する方法であって、前記腎臓標的配列の操作により前記対象または非ヒト対象を改変することを含み、前記病態は、
組成物を発現させるためその組成物を作動可能にコードする1つ以上のAAVまたはレンチウイルスベクターを含むAAVまたはレンチウイルスベクター系を含む天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達すること
を含む治療を提供することを含む前記腎臓標的配列の操作による治療または阻害に感受性があり、前記腎臓標的配列は発現時の前記組成物により操作され、前記組成物が、
(A)天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
I.CRISPR−Cas系RNAポリヌクレオチド配列に作動可能に結合している第1の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列が、
(A)真核細胞中の腎臓標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、
(b)tracrメイト配列、および
(c)tracr配列
を含む、第1の調節エレメント、および
II.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むCRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント
[(A)、(b)および(c)は、5’から3’配向で配置されており、
成分IおよびIIは、前記系の前記同じまたは異なるベクター上にあり、
転写されると前記tracrメイト配列が前記tracr配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がCRISPR複合体と前記腎臓標的配列との配列特異的結合を指向し、および
前記CRISPR複合体は、(1)前記腎臓標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および(2)前記tracr配列にハイブリダイズされる前記tracrメイト配列と複合体形成している前記CRISPR酵素を含む]
を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物、
または
(B)天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物であって、
I.第1の調節エレメントであって
(A)真核細胞中の腎臓標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列
に作動可能に結合している第1の調節エレメント、
II.CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメント、および
III.tracr配列に作動可能に結合している第3の調節エレメント
[成分I、IIおよびIIIは前記系の前記同じまたは異なるベクター上にあり、
転写されると前記tracrメイト配列が前記tracr配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が前記腎臓標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記CRISPR複合体は、(1)前記腎臓標的配列にハイブリダイズされる前記ガイド配列、および(2)前記tracr配列にハイブリダイズされる前記tracrメイト配列と複合体形成している前記CRISPR酵素を含む]
を含む1つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物
を含む、方法。 - インビトロ、および/またはエキソビボで実行される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 発現を誘導することを含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物または対象が真核生物である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生物または対象が非ヒト真核生物である、請求項10に記載の方法。
- 前記生物または対象が哺乳動物または非ヒト哺乳動物である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターがAAVまたはレンチウイルスベクターである、請求項4〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CRISPR酵素がCas9である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ガイド配列の発現が前記T7プロモーターの制御下にあり、T7ポリメラーゼの前記発現によってドライブされる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CRISPR酵素をコードするmRNAを細胞に送達することを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載のCRISPR酵素を送達する方法。
- 前記CRISPR酵素をコードする前記ポリヌクレオチドまたは酵素コード配列が、前記CRISPR酵素をコードするmRNAを前記細胞に送達することにより前記細胞に送達される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記AAVまたはレンチウイルスをコードする1つまたは複数の核酸分子を含有するまたはそれから本質的になる1つまたは複数のプラスミドをAAV感染細胞またはレンチウイルス感染細胞に形質移入すること、および前記AAVまたはレンチウイルスの複製およびパッケージングに必須のAAV AAVまたはレンチウイルスrepおよび/またはcapおよび/またはヘルパー核酸分子を提供することを含む、請求項7に記載のAAVまたはレンチウイルスベクターを調製する方法。
- 前記AAVまたはレンチウイルスをコードする1つまたは複数の核酸分子を含有するまたはそれから本質的になる1つまたは複数のプラスミドをAAV感染細胞またはレンチウイルス感染細胞に形質移入すること、および前記AAVまたはレンチウイルスの複製およびパッケージングに必須のAAV AAVまたはレンチウイルスrepおよび/またはcapおよび/またはヘルパー核酸分子を提供することを含む、請求項7に記載の方法で使用するAAVまたはレンチウイルスベクターを調製する方法。
- 前記AAVまたはレンチウイルスの複製およびパッケージングに必須の前記AAVまたはレンチウイルスrepおよび/またはcapが、前記細胞に1つまたは複数のヘルパープラスミドまたは1つまたは複数のヘルパーウイルスを形質移入することにより供給される、請求項18または19に記載の方法。
- 前記ヘルパーウイルスが、ポックスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスまたはバキュロウイルスである、請求項20に記載の方法。
- 前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスである、請求項21に記載の方法。
- 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項18〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が昆虫細胞であり、前記ヘルパーウイルス(存在する場合)がバキュロウイルスである、請求項18〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腎臓標的配列に5’−NRG(式中Nは任意のヌクレオチドである)がその3’末端で隣接しまたは後に続き、または前記CRISPR酵素が、コリネバクター属(Corynebacter)、ステレラ属(Sutterella)、レジオネラ属(Legionella)、トレポネーマ属(Treponema)、フィリファクター属(Filifactor)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、ラクトバシラス属(Lactobacillus)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)、バクテロイデス属(Bacteroides)、フラビイボラ属(Flaviivola)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、スフェロケタ属(Sphaerochaeta)、アゾスピリラム属(Azospirillum)、グルコンアセトバクター属(Gluconacetobacter)、ネイセリア属(Neisseria)、ロゼブリア属(Roseburia)、パービバキュラム属(Parvibaculum)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ニトラティフラクター属(Nitratifractor)、マイコプラズマ属(Mycoplasma)およびカンピロバクター属(Campylobacter)からなる群に属する属である(またはそれに由来する)、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 医薬または治療において使用される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の組成物。
- 目的ゲノム遺伝子座における腎臓標的配列の操作により生物もしくは非ヒト生物を改変する方法または目的ゲノム遺伝子座の腎臓標的配列の欠陥により引き起こされる病態を治療もしくは阻害する方法において使用される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の組成物。
- エキソビボ遺伝子またはゲノム編集における請求項1〜25のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- エキソビボ遺伝子またはゲノム編集用医薬、または目的ゲノム遺伝子座における腎臓標的配列の操作により生物もしくは非ヒト生物を改変する方法または目的ゲノム遺伝子座の腎臓標的配列の欠陥により引き起こされる病態を治療もしくは阻害する方法において使用される医薬の製造における、請求項1〜25のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- (A)−I.CRISPR−Cas系RNAポリヌクレオチド配列であって、
(A)真核細胞の腎臓標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、
(b)tracrメイト配列、および
(c)tracr配列
を含むポリヌクレオチド配列、および
II.CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列であって、場合により少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むポリヌクレオチド配列
[(A)、(b)および(c)が5’から3’への方向に並び、
転写時に前記tracrメイト配列が前記tracr配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が、前記腎臓標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記CRISPR複合体が、(1)前記腎臓標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、および(2)前記tracr配列にハイブリダイズする前記tracrメイト配列と複合体形成している前記CRISPR酵素を含み、かつCRISPR酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである]
または
(B) I.ポリヌクレオチドであって、
(A)真核細胞の腎臓標的配列とのハイブリダイズ能を有するガイド配列、および
(b)少なくとも1つ以上のtracrメイト配列
を含むポリヌクレオチド、
II.CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列、および
III.tracr配列を含むポリヌクレオチド配列
[転写時に前記tracrメイト配列が前記tracr配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が、前記腎臓標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、および
前記CRISPR複合体が、(1)前記腎臓標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、および(2)前記tracr配列にハイブリダイズする前記tracrメイト配列と複合体形成している前記CRISPR酵素を含み、かつCRISPR酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAである]
を含む組成物において、
医薬または治療において使用されるか;または目的のゲノム遺伝子座の腎臓標的配列の操作によって生物または非ヒト生物を改変する方法において使用されるか;または目的のゲノム遺伝子座の腎臓標的配列の欠陥によって引き起こされる病態を治療または阻害する方法において使用されるか;またはエキソビボ遺伝子またはゲノム編集において使用される、組成物。 - 前記ポリヌクレオチドが、1つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれる、請求項30に記載の組成物。
- 前記CRISPR−Cas系RNAがキメラRNA(chiRNA)である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
- 前記CRISPR−Cas系が、複数のキメラおよび/または複数の多ガイド配列と単一tracr配列とをさらに含む多重化CRISPR酵素系である、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
- 前記CRISPR酵素が、標的配列の位置で両鎖の開裂を指向するヌクレアーゼである、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
- 前記CRISPR酵素が1つ以上の突然変異を含む、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
- 前記CRISPR酵素が1つ以上の突然変異D10A、E762A、H840A、N854A、N863AまたはD986Aを含む、請求項35に記載の方法、使用または組成物。
- 前記1つ以上の突然変異が前記CRISPR酵素のRuvC1ドメインにある、請求項35に記載の方法、使用または組成物。
- 前記CRISPR酵素が、標的配列の位置での開裂を指向するニッカーゼである、請求項34に記載の方法、使用または組成物。
- 前記ニッカーゼが二重ニッカーゼである、請求項38に記載の方法、使用または組成物。
- 少なくとも2つ以上のNLSをさらに含む、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
- 前記CRISPR酵素が触媒ドメインに1つ以上の突然変異を有し、転写時に前記tracrメイト配列が前記tracr配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列が、前記標的配列に対するCRISPR複合体の配列特異的結合を指向し、かつ前記酵素が機能ドメインをさらに含む、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法、使用または組成物。
- 前記機能ドメインが転写活性化ドメインである、請求項41に記載の方法、使用または組成物。
- 前記転写活性化ドメインがVP64である、請求項42に記載の方法、使用または組成物。
- 天然に存在しないまたはエンジニアリングされた組成物を送達するステップ
を含む、細胞の目的のゲノム遺伝子座におけるDNA二重鎖の逆鎖上にある第1および第2の標的配列の操作によってオフターゲット改変を最小限に抑えるステップをさらに含む、請求項1〜25または32〜43のいずれか一項に記載の方法において、
前記組成物が、
I.CRISPR−Cas系キメラRNA(chiRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)前記第1の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第1のガイド配列、
(b)第1のtracrメイト配列、
(c)第1のtracr配列、
(d)前記第2の標的配列とのハイブリダイズ能を有する第2のガイド配列、
(e)第2のtracrメイト配列、および
(f)第2のtracr配列、および
を含み、場合により、前記第1のtracr配列と前記第2のガイド配列との間にリンカー配列が存在することで前記第1のガイド配列と前記第2のガイド配列とがタンデムになっている、ポリヌクレオチド配列、および
II.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列であって、(a)、(b)、(c)、(d)、(e)および(f)が5’から3’への方向に並び、前記ポリヌクレオチド配列が前記第1のtracr配列と前記第2のガイド配列との間にリンカー配列を含むことで前記第1のガイド配列と前記第2のガイド配列とがタンデムになっており、および転写時に前記第1および前記第2のtracrメイト配列がそれぞれ前記第1および第2のtracr配列にハイブリダイズし、かつ前記第1および前記第2のガイド配列が、それぞれ前記第1および第2の標的配列に対する第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向する、ポリヌクレオチド配列、
または
II.CRISPR酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に結合している第2の調節エレメントであって、成分IおよびIIが前記系の同じまたは異なるベクター上にあり、転写時に第1のtracrメイト配列が第1のtracr配列にハイブリダイズし、かつ前記第1および前記第2のガイド配列が、それぞれ前記第1および第2の標的配列に対する第1および第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を指向する、第2の調節エレメント
を含み、
前記第1のCRISPR複合体が、(1)前記第1の標的配列にハイブリダイズする前記第1のガイド配列、および(2)前記第1のtracr配列にハイブリダイズする前記第1のtracrメイト配列と複合体形成している前記CRISPR酵素を含み、
前記第2のCRISPR複合体が、(1)前記第2の標的配列にハイブリダイズする前記第2のガイド配列、および(2)前記第2のtracr配列にハイブリダイズする前記第2のtracrメイト配列と複合体形成している前記CRISPR酵素を含み、
CRISPR酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がDNAまたはRNAであり、および
前記第1のガイド配列が前記第1の標的配列の近傍で前記DNA二重鎖の一方の鎖の開裂を指向し、かつ前記第2のガイド配列が前記第2の標的配列の近傍で他方の鎖の開裂を指向して二本鎖切断を誘導し、それによりオフターゲット改変を最小限に抑えることによって前記生物または前記非ヒト生物を改変する、方法。
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