KR102424351B1

KR102424351B1 - 파브알부민 유전자 발현 억제용 CRISPR/Cas9 시스템 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102424351B1
Application number: KR1020200121612A
Authority: KR
Inventors: 이승희; 정다운; 김상규; 오영빈
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2020-09-21
Filing date: 2020-09-21
Publication date: 2022-08-05
Also published as: KR20220039034A

Abstract

본 발명은 파브알부민 유전자의 발현 억제용 CRISPR/Cas9 시스템 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 파브알부민 유전자를 표적하는 가이드 RNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 Cas9 핵산분해효소를 포함하는 파브알부민 발현 억제용 조성물, 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다. 본 발명에서는 구체적으로 파브알부민 유전자를 표적하는 가이드 RNA 발현 재조합 벡터를 제작하고 이를 마우스 두뇌에 주입한 결과 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 파브알부민 유전자의 발현이 효과적으로 억제되고, 이에 따라 마우스의 사회성 인지가 향상되며 신경활성 정도가 감소되는 것을 실질적으로 확인하였는바, 본 발명에 따른 파브알부민 유전자의 발현 억제 기술은 다양한 신경질환의 치료제 개발을 위한 기초 연구분야 및 임상에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

파브알부민 유전자 발현 억제용 CRISPR/Cas9 시스템 및 이의 용도{CRISPR/Cas9 system for suppressing of parvalbumin gene expression and use thereof}

본 발명은 파브알부민 유전자의 발현 억제용 CRISPR/Cas9 시스템 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 파브알부민 유전자를 표적하는 가이드 RNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터 및 Cas9 핵산분해효소를 포함하는 파브알부민 발현 억제용 조성물, 및 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다.

포유류는 출생 후 피질에서 GABAergic 억제성 뉴런의 성숙이 일어난다. 이때, PV-양성(PV+) 뉴런을 둘러싼 GABAergic 뉴런 및 신경세포 주위 연결망(perineuronal net; PNN)의 서브세트에서 모두 파브알부민(parvalbumin; PV)의 발현 증가가 동반된다. 파브알부민은 칼슘 결합 단백질로서, 피질의 GABAergic 뉴런에 대한 잘 알려진 유전자 마커이다. 출생 후 감각적 경험에서, 파브알부민 유전자의 발현은 감각 피질에서 활성-의존적 방식으로 상향 조절되며, 파브알부민과 마찬가지로 PNN 역시 대뇌 피질이 성숙하는 동안 증가하며 성인의 피질에서 PV+ 뉴런의 대부분을 둘러싸고 있다.

피질의 성숙은 감각적 경험의 일부로써 감각 영역에서 먼저 일어나고 이후에 운동-전두엽 및 전전두엽 피질(prefrontal cortex; PFC)에서 일어난다. 특히, 청소년기 및 청년기 동안의 사회적 경험은 인간과 설치류 모두에서 PFC의 성숙에 중요하다. 더욱이, 내측 PFC(mPFC) 및 안와전두피질(OFC)을 포함한 PFC의 하위 영역은 사회적 인지에 중요하다고 알려져 있다. 그러나 사회적 경험이 이러한 PFC 영역에서 PV+ 억제성 회로의 성숙에 필요한지 여부는 잘 알려져 있지 않다. 단, 자폐증 또는 조현병 환자들은 종종 PFC의 기능 장애뿐만 아니라 비정상적인 사회적 인지를 나타낸다고 보고되어 있다(Front Psychol 6, 1805.). 또한 이들 환자에서, 배측외측의 PFC에서 PV 및 PNN의 발현이 감소된다고 보고된바 있다. 따라서, 이러한 보고들에 근거할 때 PFC의 미성숙한 PV+ 회로는 포유동물에서 비정상적인 사회적 행동의 근간이 되는 정신적 증상을 유발할 가능성이 있다.

한편, 포유류의 사회적 행동은 성별에 따라 다른 형태로 나타나며, 청소년기 동안의 사회적 행동은 보다 성별에 특이적으로 변화하기 시작한다고 알려져 있다. 흥미롭게도, 포유동물의 뇌에서 사회적 정보를 처리하고 사회적 행동을 실행하는 것은 비대칭적으로 일어난다고 보고되었다. 최근의 연구에 따르면 설치류에서도 PFC가 사회적 행동을 매개하는데 비대칭적으로 기능한다고 보고된바 있다. 이에 따라 본 발명자들은 연구를 통해 사회적 경험이 각 성별의 전전두엽 피질과 두 반구 모두에서 PV+ 뉴런의 성숙에 영향을 미치는지 여부를 조사한 결과 청소년기 동안의 사회적 경험이 왼쪽 안와전두피질(OFCL)에서 성별에 따른 이형적인 성숙에 필요하고, 이러한 과정은 암컷 마우스에서 사회적 행동을 형성하는데 매우 중요하다는 것을 발견하였다.

종합적으로, PV+ 뉴런의 성숙과 사회성 형성의 상관관계 및 PV+에서 발현되는 파브알부민과 사회성 결핍과 관련된 다양한 신경질환 간의 연관성은 다소 연구되어 왔으나, 생체 두뇌 신경망에서 파브알부민 유전자의 발현 조절에 따른 구체적인 사회성 향상 및 이에 따른 신경질환의 치료효과를 확인한 연구결과는 보고된 바가 없다.

상기와 같은 배경 하에, 본 발명자들은 뇌의 억제성 뉴런에서 발현하는 파브알부민 유전자를 표적하는 가이드 RNA 및 이를 발현하는 재조합 벡터를 설계하고, 상기 벡터를 마우스 두뇌에 주입한 결과 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 파브알부민의 발현이 억제되며, 이에 따른 사회성 인지 향상 및 신경활성 정도의 감소 효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 파브알부민(parvalbumin) 유전자를 표적하는 가이드 RNA(guide RNA) 및 상기 가이드 RNA를 포함하는 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 가이드 RNA 벡터, 및 Cas9 핵산분해효소를 포함하는, 파브알부민 유전자 발현 억제용 CRISPR/Cas9 복합체를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 CRISPR/Cas9 복합체를 유효성분으로 포함하는, 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진, 파브알부민(parvalbumin) 유전자를 표적하는 가이드 RNA(guide RNA)를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 서열번호 1, 2, 5 또는 6의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 파브알부민 유전자의 엑손4(exon4) 영역의 서로 다른 서열을 표적하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 서열번호 3, 4, 7 또는 8의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 파브알부민 유전자의 엑손5(exon5) 영역의 서로 다른 서열을 표적하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 구조식으로 표시되는, 파브알부민(parvalbumin) 유전자를 표적하는 가이드 RNA(guide RNA) 카세트를 제공한다.

[구조식]

A-B-C

상기 구조식에서,

A는 각각 서열번호 1, 3, 5 및 7로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA이고,

C는 각각 서열번호 2, 4, 6 및 8로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA이고,

상기 B는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 tRNA이다.

본 발명의 일구현예로, 상기 가이드 RNA 카세트는 형광 단백질을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 가이드 RNA 카세트를 포함하는, 파브알부민(parvalbumin) 유전자를 표적하는 재조합 가이드 RNA(guide RNA) 벡터를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 벡터는 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus; AAV) 벡터인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 가이드 RNA 벡터; 및 Cas9(CRISPR associated protein 9) 핵산분해효소를 포함하는, 파브알부민(parvalbumin) 유전자 발현 억제용 CRISPR/Cas9 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CRISPR/Cas9 복합체를 유효성분으로 포함하는, 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 신경질환은 자폐증, 조현병, 뇌전증, 사회불안장애, 분열성성격장애, 조울증 및 뇌 인지장애로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 파브알부민 유전자의 발현을 저해함으로써 사회성 인지를 향상시키는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 파브알부민 유전자의 발현을 저해함으로써 신경활성 정도를 감소시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 신경질환 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명은 생체 두뇌 신경회로에서 파브알부민 유전자의 발현을 억제할 수 있는 기술로서, 구체적으로 파브알부민 유전자를 표적하는 가이드 RNA 발현 재조합 벡터를 제작하고 이를 마우스 두뇌에 주입한 결과 CRISPR/Cas9 시스템을 통해 파브알부민 유전자의 발현이 효과적으로 억제되고, 이에 따라 마우스의 사회성 인지가 향상되며 신경활성 정도가 감소되는 것을 실질적으로 확인하였는바, 본 발명에 따른 파브알부민 유전자의 발현 억제 기술은 다양한 신경질환의 치료제 개발을 위한 기초 연구분야 및 임상에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 마우스의 사회성이 왼쪽 안와전두피질(이하, OFC_L)에서 PNN 분해에 의한 영향을 받지 않음을 확인한 결과로서, 도 1a는 마우스의 OFC_L에서 chABC에 의한 PNN 분해를 보여주는 이미지 결과이고, 도 1b는 PBS 또는 chABC가 주입된 OFC_L에서 PV+ 및 WFA+ 뉴런의 수를 계수하여 그래프로 나타낸 결과이며, 도 1c 내지 도 1g는 대조군(PBS)과 비교하여 chABC가 주입된 마우스가 정상적인 사회적 행동을 보임을 확인한 사회성 테스트 결과를 히트맵 이미지(도 1c), 사물이 있는 영역(object) 또는 다른 마우스가 있는 영역(mouse)에서 머무른 시간(도 1d), 각 마우스의 사회성 지수(도 1e), 사회적 상호작용 동안 각 마우스의 냄새맡기 행동을 한 시간(도 1f) 및 각 마우스의 사회적 냄새맡기 행동 지수(도 1g)로 나타낸 것이다.
도 2는 CRISPR/Cas9 매개 파브알부민 유전자의 녹다운 결과를 보여주는 것으로서, 도 2a는 AAV-sgPV-tdTomato 발현 벡터의 구조 및 서열을 도시한 것이고, 도 2b는 AAV-sgPV-tdTomato 엑손4 및 엑손5의 효과를 AAV-tdTomato와 비교하여 삽입(Insertion, 파랑) 및 결실(Deletions, 빨강)로 나타낸 결과이며, 도 2c는 마우스 파브알부민 유전자의 엑손4 및 엑손5에서 SpCas9의 표적 위치를 나타내는 유전자좌를 개략적으로 도시한 결과이고, 도 2d 내지 도 2f는 AAV-tdTomato 또는 AAV-sgPV-tdTomato를 주입한 PV::Cas9 마우스에서 PV 유전자의 넉아웃 여부를 확인한 결과로서, 각각 뇌 조직에서 파브알부민(PV)을 면역염색한 형광 이미지 결과(도 2d), 상대적 파브알부민의 발현수준 결과(도 2e) 및 eGFP(Cas9)와 tdTomato(AAV) 이중 양성 세포 중 PV+ 세포의 수를 측정하여 나타낸 것이다(도 2f).
도 3은 OFC_L에서 CRISPR/Cas9 매개 파브알부민의 녹다운이 사회성을 향상시킴을 확인한 결과로서, 도 3a는 AAV-tdTomato 또는 AAV-sgPV-tdTomato이 주입된 각 마우스(tdTom 및 sgPV)의 OFCL에서 CRISPR/Cas9 매개 파브알부민의 녹다운을 여부를 보여주는 형광 이미지 결과이고, 도 3b는 도 3a의 각 마우스의 OFC_L에서 PV+ 및 WFA+ 뉴런의 수를 측정한 결과이며, 도 3c 내지 도 3g는 상기 각 마우스를 대상으로 사회성 테스트를 수행한 결과를 히트맵 이미지(도 3c), 사물이 있는 영역(object) 또는 다른 마우스가 있는 영역(mouse)에서 머무른 시간(도 3d), 각 마우스의 사회성 지수(도 3e), 사회적 상호작용 동안 각 마우스의 냄새맡기 행동을 한 시간(도 3f) 및 각 마우스의 사회적 냄새맡기 행동 지수(도 3g)로 나타낸 것이다.
도 4는 OFC_L에서 CRISPR/Cas9 매개 파브알부민의 녹다운은 사회적 냄새맡기 행동에 따른 신경 활성 정도를 감소시킴을 확인한 결과로서, 도 4a는 OFC_L에 AAV-tdTomato 또는 AAV-sgPV-tdTomato이 주입된 각 마우스(tdTom 및 sgPV)의 생체 내 기록 부위를 보여주는 뇌 이미지 결과이고, 도 4b는 상기 각 마우스의 OFC_L에서 사물 또는 사회적 남새맡기 행동과 관련된 신경 반응을 분석하여 나타낸 결과이며, 도 4c는 냄새맡기 행동 시작 후 2초 동안 현저히 증가 또는 감소된 반응을 보여주는 상위 20% OFC_L 뉴런의 Z스코어 지수를 나타낸 결과이다.

본 발명은 생체 두뇌 신경회로에서 파브알부민 유전자의 발현을 억제할 수 있는 기술로서, 이에 따른 사회성 향상 및 신경활성 정도의 감소를 통한 다양한 신경질환의 치료 가능성을 확인하였다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진, 파브알부민(parvalbumin) 유전자를 표적하는 가이드 RNA(guide RNA)를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “가이드 RNA(guide RNA; gRNA)”란 편집하고자 하는 표적하는 특정 DNA의 위치를 찾아내어 Cas 단백질을 표적 DNA로 인도하는 역할을 하는 단일 가닥의 RNA로서, 상기 가이드 RNA는 PAM(protospacer adjacent motif) 자리와 인접하며, 편집하려는 DNA의 10~25bp의 염기 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 표적 DNA 서열의 상보적 사슬과 염기쌍을 형성할 수 있는 서열의 5’ 부위 앞에 1 내지 3개의 추가적인 뉴클레오타이드, 보다 구체적으로 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 또한 가이드 RNA는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 가지는 부분(이를 Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 가지는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조 및 Terminator 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 가이드 RNA는 파브알부민 유전자를 표적하는 것으로, 파브알부민 유전자의 엑손의 서로 다른 영역을 동시에 표적하도록 쌍으로 구성된 것일 수 있다. 보다 상세하게, 상기 가이드 RNA쌍은 파브알부민 유전자의 각 엑손의 서로 다른 영역을 동시에 표적하되, 각 가이드 RNA는 동일한 엑손에서 40-80bp 이내로 겹치지 않으며 Cas9 단백질의 PAM 서열을 포함하도록 설계될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 서열번호 1 내지 4의 가이드 RNA는 마우스 유래 파브알부민 유전자를 표적하는 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 파브알부민 유전자의 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 엑손4 영역의 서로 다른 서열을 표적하는 것일 수 있고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 파브알부민 유전자의 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 엑손5 영역의 서로 다른 서열을 표적하는 것일 수 있다.

본 발명에 있어서, 서열번호 5 내지 8의 가이드 RNA는 인간 유래 파브알부민 유전자를 표적하는 것으로, 보다 구체적으로 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 파브알부민 유전자의 서열번호 16의 염기서열로 이루어진 엑손4 영역의 서로 다른 서열을 표적하는 것일 수 있고, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 파브알부민 유전자의 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 엑손5 영역의 서로 다른 서열을 표적하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 구조식으로 표시되는, 파브알부민(parvalbumin) 유전자를 표적하는 가이드 RNA(guide RNA) 카세트를 제공한다:

[구조식]

A-B-C

상기 구조식에서,

상기 B는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 tRNA이다.

본 발명에 있어서, 상기 tRNA는 가이드 RNA의 발현량을 높이기 위한 것으로, 바람직하게 상기 가이드 RNA 쌍의 서열 사이에 위치하며 하나 이상이 존재할 수 있으나 더욱 바람직하게는 하나만 포함되는 것이 벡터의 전달효율을 높이는데 더욱 적합하다.

또한, 본 발명은 상기 가이드 RNA 카세트를 포함하는, 파브알부민 유전자 표적용 재조합 가이드 RNA 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “벡터(vector)”란 목적하는 DNA 단편을 숙주 세포에 도입시켜 증식할 수 있는 DNA로써 클로닝 운반체(cloning vehicle)라고도 한다. “발현 벡터”는 목적하는 코딩서열과, 특정 숙주생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 본 발명에서 상기 벡터는 발현벡터와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터는 상기 가이드 RNA 카세트의 상류 및 하류에 각각 제1프로모터 및 제1프로모터의 종결 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게 상기 제1프로모터는 U6 프로모터일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터에서 상기 가이드 RNA 쌍이 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 경우, 상기 벡터는 서열번호 10의 염기서열로 이루어질 수 있다.

상기 벡터에서 상기 가이드 RNA 쌍이 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것일 경우, 상기 벡터는 서열번호 11의 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터에서 상기 가이드 RNA 쌍이 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 경우, 상기 벡터는 서열번호 12의 염기서열로 이루어질 수 있다.

상기 벡터에서 상기 가이드 RNA 쌍이 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 것일 경우, 상기 벡터는 서열번호 13의 염기서열로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명의 가이드 RNA 벡터는 제2프로모터 및 형광 단백질 유전자의 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 제2프로모터는 바람직하게 hsyn 프로모터이고, 형광 단백질은 tdTomato일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터는 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터, 예컨대 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 단순포진바이러스 벡터 등의 다른 형태의 발현 벡터를 이용할 수 있고, 바람직하게는 아데노-연관 바이러스 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 가이드 RNA 벡터; 및 Cas9(CRISPR associated protein 9) 핵산분해효소를 포함하는, 파브알부민 유전자 발현 억제용 CRISPR/Cas9 복합체를 제공한다.

본 발명에서, 상기 “Cas9”이란 “CRISPR-Cas9”을 지칭하며, CRISPR-Cas9는 3세대 유전자가위로써 이용하고자 하는 특정 염기서열을 인식하여 절단하고 편집하며, 게놈의 목적 장소에 특정 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 활동을 정지시키는 조작을 간단하고 신속하고 효율성 있게 실시하는데 유용하다.

Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, Cas9 단백질은 그 목적에 따라 당업자가 추가적인 도메인을 적절하게 연결할 수 있다.

본 발명에 있어서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9 뿐만아니라, 유전자 편집을 위한 핵산분해효소의 기능을 갖는 것이라면 Cas9의 변이체를 모두 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 Cas9 단백질은 그 유래가 제한되지 않으며, 비제한적인 예시로써 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 리스테리아 이노큐아(Listeria innocua), 또는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 유래일 수 있고, 당업자가 적절히 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “유전자의 발현 억제”는 유전자의 발현을 감소시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로 유전자 넉아웃(knock-out), 넉다운(knock-down), 유전자 DNA 서열에 결실, 중복, 역위, 또는 교체 등의 변이를 도입함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명자들은 구체적인 실시예에서, CRISPR/Cas9 시스템을 통하여 파브알부민 유전자를 넉아웃시킬 수 있는 가이드 RNA 발현 AAV 벡터를 재조합하였으며, 실제로 상기 벡터를 암컷 마우스의 왼쪽 안와전두피질에 주입한 결과 파브알부민 유전자의 발현이 억제됨을 확인하였다. 나아가 이러한 파브알부민 유전자의 발현 억제에 의해 상기 마우스의 사회성이 향상되고(실시예 2 참조), 사회적 냄새맡기 행동에 따른 신경활성이 감소되는 것을 되는 것을 알 수 있었다(실시예 3 참조).

이에, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CRISPR/Cas9 복합체는 유효성분으로 포함하는, 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 신경질환은 파브알부민 유전자의 비정상적인 과발현에 의해 유발되는 사회성 결핍 또는 부족과 관련된 다양한 질환을 포함할 수 있으며, 예컨대 자폐증, 조현병, 뇌전증, 사회불안장애, 분열성성격장애 및 조울증으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있고, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 신경질환 예방 또는 치료용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험재료 및 실험방법

1-1. 동물모델

본 실시예에서의 동물실험은 KAIST 동물실험윤리위원회(IACUC-18-236)로부터 승인을 받은 후 진행하였다. 실험에 이용한 마우스들은 12시간 명/암 주기(8am~8pm/8pm~8am)로 자유롭게 유지하였고, 마우스를 이중(28cm × 17cm × 14cm) 또는 단일 케이지(20cm × 10cm × 14cm)에서 사육하였다. 구체적인 마우스 종류는 다음과 같다: 야생형(WT) (C57BL / 6J), PV-Cre (JAX, # 008069) 및 Rosa26-floxed STOP-Cas9 넉-인 (JAX # 024857).

1-2. 조직학적 분석

조직학적 분석을 위해, 마우스를 이소플루란(isoflurane)으로 마취시킨 다음, 인산완충액(PBS) 및 PBS로 희석한 4% 파라포름알데히드(PFF, w/v)로 관류시켰다. 이후 마우스에서 적출한 뇌 조직을 4℃에서 4시간 동안 고정시킨 다음, 4℃에서 1-2일 동안 30% 수크로오스 용액에서 배양하였다. 다음으로, 각 뇌 조직을 최적 절삭온도 배지(OCT, Tissue-Tek, Cat # 4583)에 넣고 -80℃에서 동결시켰다. 이어서 cryostat(Leica)을 사용하여 냉동된 뇌 조직을 절단하였는데, 이때 15μm(면역염색용) 두께로 관상면으로 절단하여 조직절편을 얻었다.

이후 상기 조직절편을 이용해 면역염색을 실시하기 위하여, 조직절편을 실온에서 2시간 동안 블로킹 용액(0.1M PB 중 2% 정상 당나귀 혈청)에서 배양하고, 1차 항체(토끼 항-PV, 1:500 비율로 희석, Swant, cat#PV25, RRID: AB_10000344)를 처리하여 4℃에서 2일 동안 반응시켰다. 마지막으로, 형광 마운팅 배지로 마운팅하기 전에 형광 태그가 부착된 일차 항체(Fluorescein으로 표지된 Wisteria Floribunda Lectin, 1:500 비율로 희석, Vector labs, cat#FL-1351, RRID: AB_2336875) 및 2차 항체(PV 염색용, 1:500 비율로 희석, Alexa Fluor 594 당나귀 항-토끼 IgG, Life Technology, cat#A21207, RRID: AB_141637)를 처리하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후 스캐닝 현미경(ZEISS, Axio Scan.Z1)으로 모든 이미지를 수집하였다.

1-3. 세포 수 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1-2의 스캐닝 현미경을 통해 얻은 이미지를 마우스 뇌 아틀라스(Franklin 및 Paxinos)와 매치하여 뇌 구역의 전후 위치를 확인하였다. 다음으로, mPFC(브레그마(bregma), +1.94mm; 측면, ±0.6mm; 깊이, -1.5mm) 또는 OFC(브레그마, +2.22mm; 측면, ±1.3mm; 깊이, -2.5mm)를 포함하는 3개의 뇌 영역을 선택하였다. 이어서 3개의 대표적인 관상 부위에서 0.5 × 0.5mm²의 영역 내 PV 및 WFA 양성 뉴런의 수를 맹검법으로 계수하였다.

1-4. 사회성 테스트

사회성 테스트를 위한 행동 실험 전에 모든 마우스는 습관화 챔버 내부의 케이지에서 30-60분 동안 습관화되도록 하였다. 다음으로, 마우스를 반대쪽 양 끝에 2개의 용기(container)가 위치한 미로로 옮겼다. 사회성 테스트에는 습관화(빈 용기, 10분)에서 사회성 미로(50cm × 45cm × 20cm) 및 사회성 테스트(사물이 있는 용기 및 어린 낯선 암컷 마우스가 있는 사회적 용기, 10분)의 두 단계(phase)가 있다. 본 발명자들은 상호작용 시간을 분석하기 위해 EthoVision® XT 11.5(Noldus, RRID: SCR_000441) 소프트웨어를 이용하였다. 구체적으로, 용기(18cm × 18cm) 주변의 상호작용 영역에서 소비된 시간과 냄새맡기(sniffing) 행동 시간을 마우스의 사회성을 평가는 두 가지 지표로 이용하였으며, 사회성(Sociability)과 사회적 냄새맡기(Social sniffing) 지수를 각각 하기 수학식 1 및 2에 따라 계산하였다:

1-5. 신경세포 주위 연결망 분해

신경세포 주위 연결망(Perineuronal net degradation; PNN)을 제거하기 위해, 무 단백질분해효소 chABC(Amsbio)를 PBS로 희석하여 최종농도가 61U/ml이 되도록 하였다. 이후 출생한지 70-75일이 된 암컷 마우스의 왼쪽 안와전두피질(OFC_L)에 0.5μl의 PBS 또는 chABC를 주입하였다. 7일 후, 행동 실험을 수행하고 마우스를 희생시켜 PNN 분해 여부를 확인하였다.

1-6. In vivo extracellular recordings

1-6-1. 뉴런 활성 분석

실리콘 프로브 상의 32개 채널을 8개 그룹(그룹당 4개 채널)으로 분리하고 Klusters 소프트웨어(http://neurosuite.sourceforge.net/)에 표시되는 3가지 주요 구성요소에 근거하여 고유한 파형 클러스터를 구분하였다. 각 클러스터의 자동 코릴로그램(correlogram)은 다중-단위 오염 가능성을 배제하기 위한 2ms의 불응기가 있는지 확인하였다. 또한 Matlab(Mathworks)에서 다른 모든 분석을 수행하였다. EthoVision XT를 이용해 objectsniffing 및 socialsniffing 시간 동안 냄새맡기 행동의 시작(onset) 및 마침(offset) 시간을 수동으로 분석하였다. 구체적으로, 사물 세션 동안 수행되는 냄새맡기 시도를 object-sniffing으로, 사회적 세션 동안의 수행된 냄새맡기 시도를 social-sniffing으로 간주하였다. 이때, 냄새맡기 시도 사이에 신경 활성의 혼합을 피하기 위해, 본 발명자들은 하기 두 가지 기준을 만족하는 시도만을 이용하였다: 1) 냄새맡기 간격(현재 시험에서 냄새맡기의 시작과 다음의 시작 사이의 시간)이 > 5초인 경우, 및 2) 냄새맡기 지속 시간(한 번의 시도에서 스니핑 시작과 끝 사이의 시간)이 > 1초인 경우. 시험 세포(소성 속도, Hz) 및 모집단(Z- 점수)에서 활성의 PETH(peri-event time histogram)을 플로팅하기 위해, objectsniffing 및 socialsniffing 시도로부터 데이터를 수집하고 1초 기준 활성에 의해 발사 속도를 평균화하고 신경 활성을 보정하였다(냄새맡기 행동 시작 3~2초 전). 보정된 발사 속도는 시각화 목적을 위한 가우시안 필터(σ = 50ms)와 관련이 있었다. 기록된 뉴런의 냄새맡기에 따른 활성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 각각 사물 및 사회적 냄새맡기 시도의 시작 2초 전(시작 전 3~1초) 및 시작 후 2초(시작 후 0~2초) 동안 개별 뉴런의 발사 속도 (FRs)를 통계학적으로 비교하였다(bootstrap, p < 0.01, n = 5000). 이후 냄새맡기 시작 후 0~2초 동안의 냄새맡기 행동에 따른 신경세포의 활성(Z)을 정량화하였다.

1-6-2. 냄새맡기 행동(sniffing behaviors)의 자동적 정량화

본 발명자들은 머리가 고정된 상태에서 사물- 및 사회적 냄새맡기 행동 동안 이를 자동적으로 분석하기 위한 Matlab code를 개발하였다. 먼저 ‘rgb2gray’ 기능을 사용하여 녹화된 비디오 클립의 모든 RGB 이미지 프레임을 그레이 스케일로 전환하였다. 다음으로, 기록된 마우스의 코와 수염을 포함하여 관심 영역(ROI)을 ROI 내부에 1과 각 픽셀의 ROI 외부에 0을 갖는 이진 행렬을 만든 다음 모든 프레임을 따라 해당하는 각 픽셀(ROI_1)의 이진 행렬을 원본 이미지에 곱했다. 또한 ROI_1로부터 배경 밝기를 빼서 전체적인 밝기 변동을 제거하고(ROI_2), 각 픽셀의 평균 밝기를 빼서 ROI 내에서 밝기 편차를 계산하였다(ROI ΔF). 냄새맡기 행동을 감지하기 위해, ROI ΔF(ROI ΔF-F0)에서 이동 평균(F0, sliding window = 50 프레임)을 빼고, 유사한 방식으로 절대적 ROI ΔF-F0의 평균값에 4를 곱하여 역치값을 설정하여 멀티 유닛 스파이킹 활동을 감지하였다. ROI ΔF-F0이 임계 값을 초과하는 경우 냄새맡기 행동 기간에서 프레임을 포함하였다.

1-7. CRISPR / Cas9 실험 설계

1-7-1. PX552-sgPV-tdTomato 제작

AAV-tdTomato 벡터를 제작하기 위해, 먼저 PX552(Addgene # 60958)의 eGFP 유전자를 tdTomato로 대체하였다. 이때, tdTomato 주형은 pAAV-FLEX-tdTomato(Addgene # 28306)로부터 얻었다. 상기 방법으로 2개의 AAV-tdTomato 플라스미드를 클로닝하였고, 이 둘 모두는 파브알부민 유전자(sgPV)에서 표적화된 돌연변이를 유도하도록 하였다. 구체적으로, 하나의 벡터는 PV 유전자의 엑손4(exon4)를 표적하는 2개의 sgRNA를 발현한다: sgRNA1, 5’-AGACAAGTCTCTGGCATCTG-3’ (서열번호 1) 및 sgRNA2, 5’-AAGGATGGGGACGGCAAGAT-3’ (서열번호 2), 또 다른 바이러스는 PV 유전자의 엑손5(exon5)를 표적하는 2개의 sgRNA를 발현하는 것이다: sgRNA3, 5’-GCTGGTGGTGGTGCTGGGAGCT-3’ (서열번호 3) 및 sgRNA4, 5’-GGCCGCGAGAAGGACTGAGA-3’ (서열번호 4).

AAV-tdTomato 벡터를 클로닝한 후, 본 발명자들은 패키징 플라스미드를 HEK293T 세포에 형질감염시켜 AAV-sgPV-tdTomato(엑손4 및 엑손5) 및 AAV-tdTomato를 생산하였다. 72시간 후, 세포 용해물로부터 AAV(AAV2) 입자를 회수하고 이오딕사놀(iodixanol) 구배 초원심분리를 수행하였다. 다음으로, Amicon Ultra Centrifugal Filter(Millipore)로 바이러스 입자를 농축시키고, 마지막으로 정량적 PCR로 바이러스 입자의 농도를 확인하였다(AAV-tdTomato 3.92 × 10¹⁴ gc/ml; AAV-sgPV(엑손4)-tdTomato 3.07 × 10¹² gc/ml; AAV-sgPV(엑손5)-tdTomato 7.17 × 10¹² gc/ml).

1-7-2. Neuro2a 세포에서 CRISPR/Cas9의 검증

CRISPR/Cas9 시스템의 효율성을 확인하기 위해 Neuro2a 세포에 Cas9-eGFP 발현 벡터(PX458)와 상기 실시예 1-7-1의 방법으로 클로닝한 AAV 벡터를 함께 형질감염시켰다. 72시간 후, 세포를 회수하고 BD FACSAria Ⅱ(BD Biosciences)를 이용하여 tdTomato/eGFP 이중 양성세포를 분류하였다. 다음으로, 분류된 세포로부터 게놈 DNA를 정제하고 PCR을 수행하여 표적 부위를 증폭시켰다. 마지막으로 Miniseq(Illumina)로 샘플을 분석하고 CRISPR RGEN Tools(http://www.rgenome.net/)을 이용하여 데이터를 분석하였다.

1-7-3. CRISPR/Cas9 마우스에서의 행동 및 생리학적 실험

파브알부민(이하, PV) 양성 뉴런에서 Cas9을 선택적으로 발현시키기 위해, 본 발명자들은 PV-Cre(JAX # 008069) 마우스와 Rosa26-floxed STOP-Cas9 녹-인(JAX # 024857) 마우스를 교배시켰다. 또한, AAV 바이러스 벡터를 이용해 PV를 표적하는 sgRNA를 전달하였다. 다음으로, 상기 교배를 통해 태어난 출생 후 50~65일째인 PV::Cre×Cas9-eGFPfl/fl 마우스에 AAV-tdTomato(tdTom) 또는 AAV-sgPV-tdTomato(sgPV)를 주입하였다. 이후 출생한지 78-85일째에 행동 테스트 및 생체 기록(in vivo recording)을 수행하였다.

AAV가 안와전두피질의 PV을 효과적으로 표적하는지 검증하기 위해, 실험 후 마우스를 희생시키고 뇌를 적출하여 조직절편을 제작한 후 면역염색을 수행하였다. 이때, 항체는 1차 항체 및 2차 항체는 다음과 같은 항체들을 이용하였다: 1차 항체(PV 염색의 경우 토끼 항-PV, Cas9 염색의 경우 염소 항-GFP) 및 2차 항체(Alexa Fluor 405 당나귀 항-염소 IgG 및 Alexa Fluor 647 당나귀 항-토끼 IgG).

1-8. Experimental design & Statistical analysis

모든 통계분석은 Shapiro-Wilk 정규성 검정을 이용하여 정규 분포를 검증한 후 IBM SPSS 통계 21(IBM, RRID : SCR_002865)의 사용자 정의 코드를 사용하여 수행되었다. 또한, 다음과 같은 모수 검정법(parametric test)을 이용하였다: 다중 그룹간의 비교를 위해서는 단방향 분산분석(ANOVA)을 이용하였고, 반복 측정이 적용된 양방향 ANOVA를 사용하여 사회성 테스트 동안 냄새맡기 행동 시간을 비교하였다. 더욱이 하기의 비모수적 검정법을 이용하였다: 윌콕슨 부호순위검정(Wilcoxon signed-rank test)를 이용해 두 그룹 내에서 비교하고 Mann-Whitney U 검정을 통해 두 그룹 사이에서 비교하였다.

실시예 2. 왼쪽 안와전두피질에서 파브알브민 양성(PV+) 뉴런에 의한 사회적 행동 형성 확인

본 발명자들은 이유 기간 후 사회적 고립(post-weaning social isolation; PWSI)이 왼쪽 안와전두피질(이하, OFC_L)에서 파브알부민 양성(이하, PV+) 뉴런의 성숙을 막고 사회적 행동을 증가시키는 것을 발견함에 따라, 사회적 행동을 형성하는데 있어서 성숙한 PV+ 뉴런의 역할을 조사하고자 하였다. 이를 위해, 먼저 OFCL에서 프로테오글리칸의 설페이트 측쇄를 제거하여 신경세포 주위 연결망(perineuronal nets; PNN)을 분해하는 효소인 콘드로이틴분해효소 ABC(chondroitinase ABC; chABC)를 처리하였다. 그 결과 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이 chABC가 처리된 경우 PV 발현에는 영향을 미치지 않고 PV+ 뉴런을 둘러싼 PNN을 제거하여 PV+/WFA+ 뉴런의 수를 현저한 수준으로 감소시키는 것을 확인하였다.

다음으로, 본 발명자들은 chABC가 처리된 마우스에서 사회성 테스트를 수행하였다. 그 결과 도 1c 내지 도 1g의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, PBS 대조군 그룹과 비교하여 상기 chABC가 처리된 마우스는 정상적인 사회적 행동을 보이는 것을 관찰하였다. 종합적으로, 상기 결과들은 안와전두피질에서 PV+ 뉴런에 대한 PNN-형성은 암컷 마우스에서 사회적 행동을 형성하는데 중요한 인자가 아님을 나타내는 것이다.

다음으로, 본 발명자들은 OFC_L에서의 PV 발현이 사회적 행동에 중요한지 여부를 조사하고자 하였다. 이를 위해, CRISPR/Cas9 시스템을 이용해 PV 유전자를 선택적으로 넉아웃하여 OFC_L에서 PV의 발현을 넉다운하였다. 구체적으로, 도 2a 내지 도 2c에 나타낸 바와 같이 PV 유전자의 4번째 및 5번째 엑손을 표적하기 위한 2쌍의 가이드 RNA(guide RNAs; gRNAs)를 디자인하였고, 이들 gRNAs와 Cas9을 형질감염시킨 Neuro2a 세포의 85% 이상에서 표적 서열상의 결실 또는 삽입에 의해 PV 유전자가 넉아웃된 것을 확인하였다.

상기 결과에 기반하여 다음으로 생체 내 뉴런으로 gRNA를 전달하기 위한 아데노연관바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터를 제작하였다. 또한, PV+ 개재뉴런(interneurons)에서 PV 유전자를 선택적으로 넉아웃시키기 위해 PV-Cre와 Cas9fl/fl-eGFP 마우스의 교배를 통해 얻어진 마우스의 OFC_L에 상기에서 제작한 AAV 벡터를 주입하였다(그림 S3E-S3G). 또한, AAV는 tdTomato 유전자를 전달하였고, 대조군 AAV는 gRNA 없이 tdTomato만을 전달하도록 하였다(tdTom). 따라서 eGFP와 tdTomato를 모두 발현하는 OFC_L 뉴런은 PV 유전자가 넉아웃된 PV+ 뉴런임을 알 수 있으며, 도 3a의 결과를 통해 본 발명에 따른 AAV 벡터(sgPV)를 주입함으로써 PV+ 뉴런에서 PV 유전자가 넉아웃된 것을 확인하였다. 다음으로, PV 및 PNN에 대하여 면역조직화학염색을 수행한 결과 도 3b에 나타낸 바와 같이 eGFP+/tdTomato+ 뉴런이 PNN의 발현 감소 없이 PV에 따라 선택적으로 넉다운된 것을 확인하였다. PV의 넉다운에 의해 PV+/WFA+ 뉴런의 수가 약 25% 감소하였으며, 이는 PWSI의 효과와 유사하였다.

다음으로, OFC_L에서 PV의 발현이 넉다운된 암컷 마우스를 대상으로 상기와 동일하게 사회성 테스트를 수행하였다. 흥미롭게도, 도 3c 내지 도 3g에 나타낸 바와 같이 PV의 발현이 넉다운된 마우스에서 현저한 사회성 증가가 나타난 것을 확인하였다. 그러나 동일한 조건의 수컷 마우스에서는 이러한 사회성 증가가 나타나지 않았으며, 이러한 결과는 OFC_L에서 PV 발현이 암컷 마우스에서 사회적 행동을 형성하는데 중요한 반면 수컷 마우스에서는 그렇지 않다는 것을 보여주는 것이다.

실시예 3. OFCL에서 PV의 발현 넉다운에 의한 사회적 냄새맡기 행동에 따른 신경 활성 감소 확인

본 발명자들은 이전 연구에서 이유 후 사회적 격리된 암컷 마우스에서 감소된 냄새맡기 행동에 따른 신경 활성(Social-Sniffing-Induced Activity)의 감소가 나타나는 것을 관찰하였다. 따라서 PV 넉다운의 경우에도 동일한 결과가 나타날지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 도 4a에서 볼 수 있는 바와 같이 OFC_L에 sgPV AAVs 벡터를 주사한 암컷 마우스에서 생체 내 기록을 수행하였다. 그 결과, 도 4b 및 도 4c에 나타낸 바와 같이 PV 넉다운은 냄새맡기 행동에 따른 신경 활성을 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, OFC_L에서 PV의 넉다운은 tdTomato 대조군 마우스에서와 유사한 수준으로 냄새맡기 행동의 수 및 지속시간을 나타낸 것으로 보아 냄새맡기 행동 자체에 영향을 미치지는 않는 것을 확인하였다. 또한 OFC_L에서 tdTomato의 발현은 암컷 마우스의 냄새맡기 행동에 따른 신경 활성을 변화시키지 않았다. 종합적으로 상기 결과들은 OFC_L에서 PV의 감소된 발현이 암컷 마우스에서 냄새맡기 행동에 따른 신경 활성의 감소를 나타냄을 보여주었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> CRISPR/Cas9 system for suppressing of parvalbumin gene expression and use thereof <130> PD20-159 <160> 17 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV exon4_sgRNA1_mouse <400> 1 agacaagtct ctggcatctg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV exon4_sgRNA2_mouse <400> 2 aaggatgggg acggcaagat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV exon5_sgRNA1_mouse <400> 3 gctaagtggc gctgactgct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV exon5_sgRNA2_mouse <400> 4 ggccgcgaga aggactgaga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV exon 4_sgRNA1_human <400> 5 agacaggtct ctggcatctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV exon 4_sgRNA2_human <400> 6 aaagatgggg acggcaaaat 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV exon 5_sgRNA1_human <400> 7 gctaagaagc actgactgcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PV exon 5_sgRNA2_human <400> 8 ggtggcgaga ggggccgaga 20 <210> 9 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tRNA <400> 9 aacaaagcac cagtggtcta gtggtagaat agtaccctgc cacggtacag acccgggttc 60 gattcccggc tggtgca 77 <210> 10 <211> 305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-sgPV-tdTomato_mouse PV Exon4 target <400> 10 tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg agacaagtct ctggcatctg gttttagagc 60 tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt 120 cggtgcaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc 180 gggttcgatt cccggctggt gcaaaggatg gggacggcaa gatgttttag agctagaaat 240 agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 300 tttttt 306 <210> 11 <211> 305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-sgPV-tdTomato_mouse PV Exon5 target <400> 11 tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg gctaagtggc gctgactgct gttttagagc 60 tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt 120 cggtgcaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc 180 gggttcgatt cccggctggt gcaggccgcg agaaggactg agagttttag agctagaaat 240 agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 300 tttttt 306 <210> 12 <211> 305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-sgPV-tdTomato_human PV Exon4 target <400> 12 tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg agacaggtct ctggcatctg gttttagagc 60 tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt 120 cggtgcaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc 180 gggttcgatt cccggctggt gcaaaagatg gggacggcaa aatgttttag agctagaaat 240 agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 300 tttttt 306 <210> 13 <211> 305 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV-sgPV-tdTomato_human PV Exon5 target <400> 13 tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg gctaagaagc gctgactgcc gttttagagc 60 tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt 120 cggtgcaaca aagcaccagt ggtctagtgg tagaatagta ccctgccacg gtacagaccc 180 gggttcgatt cccggctggt gcaggtggcg agaggggccg agagttttag agctagaaat 240 agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 300 tttttt 306 <210> 14 <211> 110 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> parvalbumin_exon4 <400> 14 gtccattctg aagggcttct cctcagatgc cagagacttg tctgctaaag aaacaaagac 60 gcttctggcc gctggagaca aggatgggga cggcaagatt ggggttgaag 110 <210> 15 <211> 581 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <223> parvalbumin_exon5 <400> 15 aattctccac tctggtggct gaaagctaag tggcgctgac tgcttgggtc ccccacctct 60 ccatccccaa cgccccatct cagtccttct cgcggccctc ctgagtttct gttcagtttg 120 tttgtgttat tttttactcc cccatcctct atggccctcg gatgacgcca ttcttctgga 180 aatgctggag aaacaataaa ggctgtacca atcggacacc acctgtaggg aggacccagg 240 cctggcaggg tgttggtttg gcaagttttt tttctttctt tttagggcag tgggggtata 300 gtagaaaaag tgagataagt caaaggacaa cgccccgata tctcctgcct gcttggtact 360 gagtgctcat gtgggccacc tcgttcaatc tctgcacctt tcccacaagg agatgggggt 420 gatggatcgt ccatcttaaa gatacagaaa ctgcctttta aagagcagaa gggaagggaa 480 ggggttgagt ccttcaggac tagctagatc aaaggactcc aatgacactc tatcaattgc 540 ttttgacttt gctgtgataa aatacctgaa aagagaaact t 581 <210> 16 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> parvalbumin_exon4 <400> 16 attcatccta aaaggcttct ccccagatgc cagagacctg tctgctaaag aaaccaagat 60 gctgatggct gctggagaca aagatgggga cggcaaaatt ggggttgacg 110 <210> 17 <211> 235 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> parvalbumin_exon5 <400> 17 aattctccac tctggtggct gaaagctaag aagcactgac tgcccctggt cttccacctc 60 tctgccctga acacccaatc tcggcccctc tcgccaccct cctgcatttc tgttcagttc 120 gtttatgtta ttttttactc ccccatcccc tgtggccctc taatgacacc attcttctgg 180 aaaatgctgg agaagcaata aaggttgtac cagtcagact ctgcttgctc aggaa 235

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열로 이루어진, 파브알부민(parvalbumin) 유전자를 표적하는 가이드 RNA(guide RNA).
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1, 2, 5 또는 6의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 파브알부민 유전자의 엑손4(exon4) 영역의 서로 다른 서열을 표적하는 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 파브알부민 유전자의 엑손5(exon5) 영역의 서로 다른 서열을 표적하는 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA.
하기의 구조식으로 표시되는, 파브알부민(parvalbumin) 유전자를 표적하는 가이드 RNA(guide RNA) 카세트:
[구조식]
A-B-C
상기 구조식에서,
A는 각각 서열번호 1, 3, 5 및 7로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA이고,
C는 각각 서열번호 2, 4, 6 및 8로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 염기서열로 이루어진 가이드 RNA이고,
상기 B는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 tRNA이다.
제4항에 있어서,
상기 가이드 RNA 카세트는 형광 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA(guide RNA) 카세트.
제4항의 가이드 RNA 카세트를 포함하는, 파브알부민 유전자를 표적하는 재조합 가이드 RNA 벡터.
제6항에 있어서,
상기 벡터는 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus; AAV) 벡터인 것을 특징으로 하는, 가이드 RNA 벡터.
제6항의 가이드 RNA 벡터; 및
Cas9(CRISPR associated protein 9) 핵산분해효소를 포함하는, 파브알부민 유전자 발현 억제용 CRISPR/Cas9 복합체.
제8항의 CRISPR/Cas9 복합체를 유효성분으로 포함하는, 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 신경질환은 자폐증, 조현병, 뇌전증, 사회불안장애, 분열성성격장애, 조울증 및 뇌 인지장애로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 파브알부민 유전자의 발현을 저해함으로써 사회성 인지를 향상시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 조성물은 파브알부민 유전자의 발현을 저해함으로써 신경활성 정도를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.