JP2013538562A - Ｈｌａ遺伝子座の修飾のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

ＨＬＡ遺伝子座の発現を調節するため、又はＨＬＡ遺伝子座又はＨＬＡ遺伝子を選択的に欠失させる、又は操作するための、方法及び組成物を開示する。

Description

技術分野
本開示は遺伝子発現、ゲノム工学及び遺伝子療法の分野にある。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年７月２１日出願の米国特許仮出願６１／４００，００９号及び２０１０年１０月６日出願の米国特許仮出願６１／４０４，６８５号の利益を請求し、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

連邦支援研究下に行った発明の権利に関する陳述
適応なし。

背景
ＭＨＣ抗原は、最初は移植反応において主要な役割を果たす蛋白として特徴付けされた。拒絶は移植された組織の表面上の組織適合性抗原に対して反応するＴ細胞により媒介され、そしてこれらの抗原の最大の群は腫瘍組織適合性抗原（ＭＨＣ）である。これらの蛋白は全ての高等脊椎動物の表面で発現され、そしてマウスにおいてはＨ−２抗原（組織適合性−２抗原を意味する）及びヒト細胞においてはＨＬＡ抗原（ヒト白血病抗原を意味する）と称される。

ＭＨＣ蛋白はＴ細胞刺激において重要な役割を果たしている。抗原提示細胞（頻繁には樹状細胞）はＭＨＣ上の細胞表面上の外来性蛋白の分解性生物であるペプチドを提示する。同時刺激シグナルの存在下においては、Ｔ細胞が活性化され、そしてそれと同じペプチド／ＭＨＣ複合体をやはり提示する標的細胞に作用することになる。例えば、刺激されたＴヘルパー細胞は自身のＭＨＣと共に抗原を提示するマクロファージを標的とすることになるか、又は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が外来性ウィルスペプチドをディスプレイしているウィルス感染細胞に対して作用することになる。

ＭＨＣ蛋白には２つのクラス、即ちＩとＩＩがある。クラスＩのＭＨＣ蛋白は２つの蛋白、即ち、ＭＨＣ１遺伝子によりコードされる膜貫通蛋白であるα鎖、及び、ＭＨＣ遺伝子クラスター内部には存在しない遺伝子によりコードされる小型細胞外蛋白であるβ２ミクログロブリン鎖のヘテロ２量体である。α鎖は３つの球状のドメインに折り畳まれ、そしてβ２ミクログロブリン鎖が会合すると、球状構造の複合体は抗体複合体と同様となる。外来性ペプチドは最も可変でもある２つの最Ｎ末端側ドメイン上に存在する。クラスＩＩのＭＨＣ蛋白もまたヘテロ２量体であるが、そのヘテロ２量体はＭＨＣ複合体内部の遺伝子によりコードされる２つの膜貫通蛋白を含む。クラスＩＭＨＣ：抗原複合体は細胞傷害性Ｔ細胞と相互作用し、クラスＩＩＭＨＣはヘルパーＴ細胞に対する抗原を提示する。更に又、クラスＩのＭＨＣ蛋白は殆ど全ての有核細胞及び血小板（及びマウスにおける赤血球）において発現される傾向があるが、クラスＩＩのＭＨＣ蛋白はより選択的に発現される。典型的には、クラスＩＩのＭＨＣ蛋白はＢ細胞、いくつかのマクロファージ及び単球、ランゲルハンス細胞、及び樹状細胞の上に発現される。

ヒトにおけるクラスＩのＨＬＡ遺伝子クラスターは３つの主要な遺伝子座、即ちＢ、Ｃ及びＡ、並びに数個の副次的な遺伝子座を含む。クラスＩＩのＨＬＡクラスターもまた、３つの主要な遺伝子座、即ちＤＰ、ＤＱ及びＤＲを有し、そしてクラスＩ及びクラスＩＩの遺伝子クラスターは両方とも、集団内においてクラスＩ及びクラスＩＩの遺伝子の両方の数種の異なる対立遺伝子が存在する点において多形である。更に又ＨＬＡ機能における役割を果たす幾つかのアクセサリー蛋白が存在する。Ｔａｐ１及びＴａｐ２サブユニットはクラスＩのＨＬＡ複合体上にペプチド抗原を負荷する場合に必須であるＴＡＰトランスポーター複合体の部分であり、そしてＬＭＰ２及びＬＭＰ７プロテオソームサブユニットはＨＬＡ上のディスプレイのための抗原からペプチドへの蛋白分解性の分解において役割を果たしている。ＬＭＰ７の低下は、恐らくは安定化の欠如を介して細胞表面におけるＭＨＣクラスＩの量を低下させる（Fehling等、(1999)Science 265:1234- 1237参照)。ＴＡＰ及びＬＭＰのほかに、タパシン遺伝子も有り、その産物はＴＡＰ複合体とＨＬＡクラスＩ鎖の間の架橋を形成し、そしてペプチドの負荷を増強する。タパシンの低下は障害を有するＭＨＣクラスＩアセンブリを有する細胞、低下したＭＨＣクラスＩの細胞表面発現、及び、障害を有する免疫応答をもたらす（Grandea 等、(2000)Immunity vol 13:213-222及びGarbi等、(2000)Nat Immunol 1:234-238参照）。

クラスＩの発現の調節は一般的に転写レベルにおいてであり、そして数種の刺激、例えばウィルス感染等が転写の変化を起こし得る。クラスＩ遺伝子はいくつかの特定の組織においてはされ、そしてこの下方調節の原因はプロモーター及び３’遺伝子間配列の内部にあると考えられる（Cohen等、(2009)PLos ONE 4(8):e6748参照）。更に又、マイクロＲＮＡがいくつかのクラスＩＭＨＣ遺伝子を調節することができる証拠も存在する（Zhu等、(2010)Am.J.Obstet Gynecol 202(6):592参照）。

クラスＩＩのＭＨＣ発現の調節はＭＨＣＩＩエンハンセオソーム複合体の活性に依存している。エンハンセオソームの成分（エンハンセオソーム複合体の最も高度に研究されている成分の１つはＲＦＸ５遺伝子産物である（Villard等、(2000)MCB 20(10):3364-3376)参照））はほぼ普遍的にに発現され、そしてこれらの成分の発現はＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の組織特異的発現又はそれらのＩＦＮ−γ誘導上方調節を制御していないと考えられる。それよりは寧ろ、非ＤＮＡ結合蛋白質であるＣＩＩＴＡ（クラスＩＩトランスアクチベーター）として知られる蛋白質がＭＣＨＩＩ発現のマスター制御因子として作用していると考えられる。他のエンハンセオソームメンバーとは対照的に、ＣＩＩＴＡは組織特異的発現を呈し、ＩＦＮ−γにより上方調節され、そしてＭＨＣクラスＩＩ発現の下方調節を起こすことができる数種の細菌及びウィルスにより阻害されることがわかっている（免疫監視を免れようとする細菌の試行の部分と考えられる(LeibundGut-Landmann等、(2004)Eur.J.Immunol 34:1513-1525参照））。

クラスＩ又はＩＩの遺伝子の調節は一部の腫瘍の存在下において撹乱される場合があり、そしてそのような撹乱は患者の予後の結果に影響する場合がある。例えば、いくつかの黒色腫において、Ｔａｐ１、Ｔａｐ２及びＨＬＡクラスＩ抗原の低下が観察されることは、原発腫瘍の場合よりも転移黒色腫においてより一般的である（ｐ＜０．０５）ことがわかっている（例えばKagashita等、(1999)Am Jour of Pathol 154(3):745-754参照）。

ヒトにおいては、数種の疾患への易罹患性はＨＬＡハプロタイプと関連することが疑われている。これらの疾患にはとりわけ、アジソン病、強直性脊椎炎、ベーチェット病、バーガー病、セリアック病、慢性活動性肝炎、グレーブズ病、若年性慢性関節リューマチ、乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リューマチ、シェーグレン症候群、及び全身エリテマトーデスが挙げられる。

ＨＬＡハプロタイプは又、移植片拒絶において主要な役割を果たす。移植変拒絶の急性期は約１〜３週間以内に生じ得、そして通常はドナーのクラスＩ及びクラスＩＩのＨＬＡ分子に対する宿主系の感作が原因のドナー組織に対する宿主Ｔリンパ球の作用が関与している。大部分の場合においては、トリガーする抗原はクラスＩのＨＬＡである。最良の結果のためにはドナーをＨＬＡハプロタイプに関して分類し、そして可能な限り完全に患者レシピエントに対してマッチさせる。しかしながら、高パーセントのＨＬＡハプロタイプ同一性を共有することができるファミリーメンバーの間の提供でさえも、なお、良好に行えない場合が多い。したがって、レシピエント内部の移植片組織を温存するためには、拒絶を防止するための徹底した免疫抑制療法に患者を付さなければならない場合が多い。そのような療法は患者が克服困難である日和見感染による合併症及び顕著な罹患率をもたらす場合がある。

細胞療法はある特定の型の細胞（例えば腫瘍抗原に反応性のＴ細胞又はＢ細胞）がレシピエントに与えられる移植の特殊な型である。細胞療法は自系（レシピエントから誘導）又は同種異系（ドナーから誘導）の何れかである細胞を用いて行うことができ、そして細胞は非成熟細胞、例えば幹細胞、又は完全成熟の機能性の細胞、例えばＴ細胞であってよい。実際、ある特定の癌のようないくつかの疾患においては、Ｔ細胞は、腫瘍を根絶する試みにおいて、特定の腫瘍抗原に対するそれらのアビディティーを増大させるためにエクスビボで操作され、増殖させ、そしてその癌の型に罹患している患者内に導入され得る。これは、内因性Ｔ細胞応答が腫瘍自身により抑制される場合に特に有用である。しかしながら、同じ注意事項が、拒絶に関して更に良く知られた固形臓器移植片に対して適用されるように細胞療法に対しても適用される。ドナーのＴ細胞はクラスＩのＨＬＡ抗原を発現し、そしてこのため、レシピエントの内因性免疫系から拒絶応答を引き出すことができる。

したがって、ＨＬＡ遺伝子及び細胞における遺伝子発現の操作ための組成物及び方法がなおも必要とされている。

ＨＬＡ遺伝子複合体又はＨＬＡ遺伝子発現を操作するための方法及び組成物を本明細書において開示する。特に本発明はＨＬＡ関連障害、例えば個人のＨＬＡハプロタイプに関連するヒトの障害を治療するためにＨＬＡ遺伝子の発現を調節するための方法及び組成物を提供する。更に又、ＨＬＡ遺伝子を欠失させるか抑制することによりＨＬＡヌル細胞、細胞フラグメント（例えば血小板）、組織又は完全生物を作成するための方法及び組成物を提供する。更に又、これらの方法及び組成物は、１つのみのＨＬＡ遺伝子、又は１つより多いＨＬＡ遺伝子に関してヌルであるか、又は全てのＨＬＡ遺伝子に対して完全にヌルである細胞,細胞フラグメント、組織又は生物を作成するために使用し得る。ある特定の実施形態において、ＨＬＡヌル細胞又は組織は移植における使用のために好都合であるヒトの細胞又は組織である。

即ち、１つの態様において、ＨＬＡ対立遺伝子の発現を調節する操作されたＤＮＡ結合ドメイン（例えば亜鉛フィンガー蛋白質又はＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメイン蛋白質）を提供する。ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは非天然存在の操作された亜鉛フィンガー蛋白質並びに予備選択標的部位に結合するように自身の認識ヘリックスが改変（例えば選択及び／又は合理的設計による）されている亜鉛フィンガー蛋白質を含む。本明細書に記載する亜鉛フィンガー蛋白質の何れも、亜鉛フィンガー蛋白質１、２、３、４、５、６つ以上を包含し得、各々亜鉛フィンガーは選択された配列（例えば遺伝子）における標的サブ部位に結合する認識ヘリックスを有する。いくつかの実施形態においては、亜鉛フィンガー蛋白質の亜鉛フィンガードメインの認識ヘリックス１つ以上は非天然存在である。ある特定の実施形態において、亜鉛フィンガー蛋白質は表１に示す認識ヘリックスを有する。他の実施形態において、亜鉛フィンガー蛋白質は表２に示す標的部位に結合する。他の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインはＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（例えば天然に存在する、及び／又は非天然存在のＴＡＬＥ結合ドメインを含むＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン）を含む。

ある特定の実施形態において、本明細書に記載するＤＮＡ結合蛋白質(例えば亜鉛フィンガー蛋白質（ＺＦＰ）又はＴＡＬＥ ＤＮＡ結合蛋白質）は融合蛋白質の部分として調節ドメイン(又は機能性ドメイン）との作動可能な連結関係に置かれることができる。ある特定の実施形態において、調節ドメインはＤＮＡ結合ドメインとの融合のための活性化ドメイン又は抑制ドメインであり、そしてそのような融合蛋白質(例えばＺＥＰ−又はＴＡＬＥ−転写因子融合物すなわちそれぞれＺＦＰ−ＴＦ及びＴＡＬＥ−ＴＦ）を遺伝子発現の活性化又は抑制の何れかのために使用できる。いくつかの実施形態においては、ＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡ遺伝子発現のモジュレーターに優先的に結合できるリプレッサーが提供される。ある特定の実施形態において、調節ドメインの活性は、細胞の転写機序との相互作用が外因性リガンドの非存在下に起こらないように外因性の小分子又はリガンドにより調節される。そのような外部リガンドは転写機序とのＺＦＰ−ＴＦ又はＴＡＬＥ−ＴＦの相互作用の程度を制御する。

１つの実施形態において、リプレッサーは特定のＨＬＡ Ａ、ＨＬＡ Ｂ又はＨＬＡ Ｃ転写調節領域に結合することができ、そして、上記遺伝子の１つのみにおける発現を抑制することができる。別の態様においては、ＨＬＡ Ａ、ＨＬＡ Ｂ又はＨＬＡ Ｃに共通の転写調節領域と、３遺伝子全てが１つのＤＮＡ結合ドメイン(例えばＺＦＰ ＴＦ又はＴＡＬＥ ＴＦ）で調節されるように、相互作用することができるリプレッサーが提供される。別の実施形態においては、リプレッサーはＨＬＡクラスＩＩの発現又は機能のレギュレーター(例えばＣＩＩＴＡ又はＲＦＸ５）に結合することによりその活性を抑制し、そしてこれにより、ＨＬＡクラスＩＩの発現又は機能を抑制することができる。

他の実施形態において、既知のＨＬＡハプロタイプに優先的に結合することにより１つのみの対立遺伝子の発現を抑制する抑制性ＤＮＡ結合ドメイン−転写因子融合物を提供する。

別の態様において、ＨＬＡ遺伝子の発現を特異的に活性化するＤＮＡ結合ドメイン−転写因子融合物を提供する。そのような融合物はレギュレーターの発現を増大させることにより、あるクラスのＨＬＡ遺伝子を上方調節し得、又は、これらの遺伝子が通常では発現されない組織において、そのようなクラスの発現を誘発し得る。別の実施形態においては、所望に応じて特定のＨＬＡ遺伝子を活性化するＤＮＡ結合ドメイン−転写因子融合物(例えばＺＥＰ ＴＦ又はＴＡＬＥ ＴＦ）を提供する。

別の態様において、 融合蛋白質はヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ又はＴＡＬＥＮ）を含む機能性ドメインとの作動可能な連結関係にある本明細書に記載するＤＮＡ結合蛋白質(例えばＺＦＰ又はＴＡＬＥ）を含む。ある特定の実施形態において、１つのＨＬＡ遺伝子を切断する、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又はヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）に融合したＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインを提供する。ある特定の実施形態において、ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮはヒトＨＬＡクラスＩ遺伝子における標的部位及び／又はヒトＨＬＡクラスＩＩ遺伝子における標的部位に結合する。いくつかの実施形態においては、これらのヌクレアーゼによるＨＬＡ遺伝子内部の切断はＨＬＡ遺伝子の永久撹乱(例えば突然変異）をもたらす。ある特定の実施形態において、ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮの２対を用いてより大きい欠失を誘発してよい。欠失は１つのＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーター遺伝子の小型部分を含むか、又はより大きいセグメントを含んでよい。いくつかの実施形態において、ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮにより誘発された欠失はＨＬＡ遺伝子１つ以上を欠失させ得、又は、全ＨＬＡ遺伝子複合体（即ちクラスＩＨＬＡ遺伝子の全て、又はＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の全て）を欠失させ得る。欠失はまた、ＨＬＡ遺伝子のあるクラスのサブセットの欠失も包含し得る。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合蛋白質は、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の亜鉛フィンガーを包含し得、各亜鉛フィンガーは、標的遺伝子中の標的サブ部位に結合する認識ヘリックスを有する。ある特定の実施形態において、亜鉛フィンガー蛋白質は４又は５又は６つのフィンガーを含み（この場合、フィンガーはＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５及びＦ６と標記され、そしてＮ末端からＣ末端にＦ１からＦ４又はＦ５又はＦ６と順位付けされる）、そしてフィンガーは表１に示す認識領域のアミノ酸配列を含む。

本明細書に記載するＺＦＮ又はＴＡＬＲＥＮ蛋白質のいずれも更に切断ドメイン及び／又は切断ハーフドメイン（例えば野生型又は操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメイン）を含んでよい。したがって、本明細書に記載するＺＦＮ又はＴＡＬＥＮの何れにおいても、ヌクレアーゼドメインは野生型のヌクレアーゼドメイン又はヌクレアーゼハーフドメイン（例えばＦｏｋＩ切断ハーフドメイン）を含んでよい。他の実施形態において、ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮは操作された(非天然存在の）ヌクレアーゼドメイン又はハーフドメイン、例えば必然的にヘテロ２量体を形成する操作されたＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む。例えば米国特許公開番号２００８０１３１９６２を参照のこと。

別の態様において、本開示は本明細書に記載する蛋白質のいずれかをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書に記載するポリヌクレオチドの何れも又、ＨＬＡ遺伝子内への標的化された挿入のための配列(ドナー又はパッチ配列）を含んでよい。

更に別の態様において、本明細書に記載するポリヌクレオチドの何れかを含む遺伝子送達ベクターを提供する。ある特定の実施形態において、ベクターはアデノウィルスベクター（例えばＡｄ５／Ｆ３５ベクター）、レンチウィルスベクター（ＬＶ）、例えば組み込みコンピテント又は組み込み欠損性のレンチウィルスベクター、又はアデノ関連ウィルスベクター（ＡＡＶ）である。したがって、本明細書に記載するヌクレアーゼ少なくとも１つ（例えばＺＦＮ又はＴＡＲＥＮ）をコードする配列、及び／又は、標的遺伝子内への標的化された組み込みのためのドナー配列を含むアデノウィルス（Ａｄ）ベクター、ＬＶ又はアデノ関連ウィルスベクター（ＡＡＶ）も提供される。ある特定の実施形態において、ＡｄベクターはキメラＡｄベクター、例えばＡｄ５／Ｆ３５ベクターである。ある特定の実施形態において、レンチウィルスベクターはインテグラーゼ欠損レンチウィルスベクター（ＩＤＬＶ）又は組み込みコンピテントレンチウィルスベクターである。ある特定の実施形態において、ベクターはＶＳＶ−Ｇエンベロープを有するか、他のエンベロープを有する擬似型である。

追加の実施形態において、標的遺伝子はＨＬＡ発現を調節する(例えばヒト細胞中の）遺伝子である（ＨＬＡレギュレーター遺伝子）。ある特定の実施形態において、ＣＴＩＩＡ、ＲＦＸ５遺伝子、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２又はタパシン遺伝子、又はこれらの組み合わせを調節(例えば活性化、抑制及び／又は不活性化）のために標的とする。いくつかの実施形態においては、標的とされる遺伝子はＨＬＡ遺伝子を調節することができるマイクロＲＮＡをコードする。本明細書に記載するベクターは又、ドナー配列を含んでよい。追加の実施形態において、ドナー配列は宿主細胞にとって内因性ではないヒトＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態においては、目的のＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーター遺伝子は内因性のＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーター遺伝子の箇所内に挿入され、他の実施形態においては、目的のＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーター遺伝子は無作為に選択された遺伝子座内に、又はゲノムワイドの送達の後に別個の遺伝子座内に挿入される。いくつかの実施形態においては、ＨＬＡ導入遺伝子又はＨＬＡレギュレーター導入遺伝子の挿入のための別個の遺伝子座はＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座である（米国特許公開番号２００８０２９９５８０参照）。他の実施形態において、ＨＬＡ導入遺伝子又はＨＬＡレギュレーター導入遺伝子はＣＣＲ−５遺伝子座内に挿入される。いくつかの態様において、ドナーは目的の別の核酸を含む。例示に過ぎないが、このドナーは目的のポリペプチドをコードする遺伝子を含有し得、又は、構造ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ等）をコードする配列を含み得る。いくつかの実施形態において、目的のＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーター遺伝子が所望の様式（例えばノックアウト、補正等）に操作されており、そしてドナー及び１つ以上の追加のＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮが別の遺伝子座（例えばＡＡＶＳ１）内にドナーを挿入するために与えられている細胞が提供さる。

ある特定の実施形態において、単一のベクターが本明細書に記載するヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮ)１つ以上をコードする配列及びドナー配列を含む。他の実施形態において、ドナー配列は第１のベクターに含有され、そしてヌクレアーゼコード配列は第２のベクターに存在する。

更に別の態様において、 本開示は本明細書に記載する蛋白質、ポリヌクレオチド及び／又はベクターのいずれかを含む細胞(例えば単離された細胞）を提供する。ある特定の実施形態において、細胞は幹／先祖細胞、リンパ球、Ｂ細胞、又はＴ細胞（例えばＣＤ４＋Ｔ細胞）よりなる群から選択される。他の実施形態において、細胞は、血小板を包含するがこれに限定されない細胞フラグメントである。

別の態様において、本明細書に記載する蛋白質、ポリヌクレオチド及び／又はベクターの１つ以上を導入することにより細胞におけるＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーター遺伝子を不活性化する方法を本明細書に記載する。これらの方法の何れにおいても、ヌクレアーゼは細胞性ＤＮＡ配列の標的化された突然変異誘発、標的化された欠失、標的化された挿入を誘発、及び／又は、既定の染色体遺伝子座における標的化された組み換えを促進し得る。したがって、ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼ(例えばＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮ）は標的とする遺伝子においてヌクレオチド１つ以上の欠失及び／又は挿入を行う。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ遺伝子はヌクレアーゼ（ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮ）切断により、そしてその後の非相同末端接合により、不活性化される。他の実施形態において、標的遺伝子中のゲノム配列を、例えば、本明細書に記載するＺＦＮ（又は該ＺＦＮをコードするベクター）の１対以上、及び／又は、ＴＡＬＥＮ１つ以上、及び、ＺＦＮ及び／又はＴＡＫＥＮを用いた標的化された切断の後に遺伝子内に挿入される「ドナー」配列を用いて置き換える。ドナー配列はヌクレアーゼ融合ベクター中に存在するか、別個のベクター（例えばＡｄ、ＡＡＶ又はＬＶベクター）中に存在してよく、或いは、異なる核酸送達機序を用いて細胞内に導入してよい。いくつかの実施形態においては、ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮはそれらをコードするｍＲＮＡを用いて送達される。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーション又はネイキッド核酸の送達に適する他の手法により核酸を送達してよい。

別の態様において、細胞又は細胞系統においてＨＬＡ遺伝子を突然変異するため、及び／又はＨＬＡ機能を不活性化するための、ＤＮＡ結合蛋白質及びその融合物を用いる方法を提供する。したがって、ヒト細胞においてＨＬＡ遺伝子を不活性化するための方法を提供し、その方法は本明細書に記載する蛋白質又はポリヌクレオチドの何れかを細胞に投与することを含む。何れかのモデル生物体においてＭＨＣ機能を改変するための方法も本明細書に記載する。

別の態様において、本明細書に記載する組成物及び方法は、例えば、何れかのＨＬＡ関連障害(即ちＨＬＡハプロタイプに関連するもの)の治療又は防止又は改善において使用できる。方法は典型的には、（ａ）ＨＬＡ又はＨＬＡレギュレーター遺伝子が不活性化されるようにヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ又はＴＡＬＥＮ）を用いて単離された細胞(例えばＴ細胞又はリンパ球）中の内因性ＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーターを切断すること；及び（ｂ）対象内に細胞を導入することによりＨＬＡ関連障害を治療又は防止することを含む。ある特定の実施形態において、ＨＬＡ関連障害は対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）である。ヌクレアーゼはｍＲＮＡとして、蛋白質形態において、及び／又はヌクレアーゼをコードするＤＮＡ配列として導入することができる。ある特定の実施形態において、対象に導入される単離された細胞は更に、追加的なゲノム修飾、例えば組み込まれた外因性配列（例えば切断されたＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子又は異なる遺伝子、例えばセイフハーバー遺伝子内に）及び／又は追加の遺伝子、例えば１つ以上のＴＣＲ遺伝子の不活性化(例えばヌクレアーゼ媒介）を含む。外因性配列はベクター(例えばＡｄ、ＡＡＶ、ＬＶ）を介して、又はエレクトロポレーションのような手法を用いることにより、導入してよい。いくつかの態様において、組成物は単離された細胞フラグメント及び／又は分化した細胞を含んでよい。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載するヌクレアーゼ融合物は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、間葉性幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）又はニューロン幹細胞のような幹細胞を標的とするために利用してよく、これらにおいては、ヌクレアーゼ融合物の活性は欠失を含有するＨＬＡ対立遺伝子をもたらすことになる。いくつかの実施形態において、方法は１つより多いＨＬＡ遺伝子が改変されている幹細胞を作成するために使用してよい。他の実施形態において、本発明はＨＬＡヌル表現型を有する幹細胞を生産するための方法を提供する。いくつかの態様において、幹細胞は１つ以上、又はすべてのＨＬＡクラスＩＩ遺伝子発現に関してヌルであり得る。別の態様において、幹細胞は１つ以上、又はすべてのＨＬＡクラスＩ遺伝子発現に関してヌルであり得る。いくつかの態様において、幹細胞はすべてのＨＬＡ遺伝子発現に関してヌルである。他の実施形態において、ＨＬＡ遺伝子座において修飾されている幹細胞は、その後分化される。

修飾された幹細胞を含む医薬組成物も提供される。そのような医薬組成物は予防的又は施療的に使用してよく、ｉＰＳＣｓ、ｈＥＳ、ＭＳＣｓ、ＨＳＣｓ又はこれらの組み合わせ及び／又は誘導体を含んでよい。他の実施形態において、そのような修飾された幹細胞から誘導された細胞、細胞フラグメント(例えば血小板)又は組織は、そのような組織が所望に応じてＨＬＡ遺伝子座において修飾されるように提供される。いくつかの態様において、そのような細胞は部分的に分化し(例えば造血幹細胞）、他の態様においては、完全に分化した細胞が提供され（例えばリンパ球又はメガカリオサイト）、そして更に別の態様においては、分化した細胞のフラグメントが提供される。他の実施形態において、改変されたＨＬＡ又はＨＬＡレギュレーター遺伝子を含有する幹細胞及び／又はその分化した子孫が提供され、そしてそれらは又、目的の別の遺伝子座におけるドナーＤＮＡの欠失、改変又は挿入を包含する追加的遺伝子修飾を含有することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載するＤＮＡ結合ドメイン又は融合蛋白質（例えばＺＦＰ−ＴＦ、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインＴＦ、ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮ）で処理される細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞又はＮＫ細胞のような成熟細胞であってよい。そのような細胞はＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーター遺伝子の調節のために本明細書に記載するＤＮＡ結合ドメインを含む蛋白質を含んでよく、又、ＨＬＡ遺伝子内への欠失及び／又は挿入の導入のためのヌクレアーゼ融合物（例えばＺＦＮ又はＴＡＬＥＮ）を含んでよい。いくつかの態様において、そのようなＺＦＮ又はＴＡＬＥＮを含む細胞は更に、外因性ＤＮＡ配列を含んでよい。いくつかの態様において、細胞療法のため、例えばＴ細胞移植のために成熟細胞を使用してよい。他の実施形態において、Ｔ細胞移植において使用するための細胞は目的の別の遺伝子修飾を含有する。１つの態様において、Ｔ細胞は癌マーカーに特異的な挿入されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有する。更なる態様において、挿入されたＣＡＲはＢ細胞悪性疾患に特徴的なＣＤ１９マーカーに対して特異的である。そのような細胞はＨＬＡハプロタイプにマッチさせる必要なく患者を治療するための治療用組成物中で有用であり、そしてそのため、「既製」の治療薬として、それを要する何れの患者のためにも使用できるであろう。いくつかの態様において、ＴＣＲα及び／又はＴＣＲβ鎖をコードする遺伝子が操作されているか、又は、所望の特異性及び親和性を有するＴＣＲ鎖をコードする遺伝子が導入されている細胞を提供する。他の実施形態において、血小板減少症又は他の出血障害のような障害の治療における施療的用途のためのＨＬＡ修飾血小板を提供する。

更なる他の態様において、本発明はＨＬＡ障害の研究のための特定のモデル系の作成のための方法及び組成物を提供する。ある特定の実施形態において、細胞及び動物系統の作成のために胚性幹細胞中で突然変異体ＨＬＡ対立遺伝子を作成したモデルを提供する。ある特定の実施形態において、モデル系はインビトロの細胞系統を含み、他の実施形態においては、モデル系はトランスジェニック動物を含む。他の実施形態において、本発明は突然変異したＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーターを補正するための方法及び組成物を提供し、そして又、あるＨＬＡ対立遺伝子を別のもので置き換えるための方法及び組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、標的対立遺伝子（例えば特異的ＨＬＡハプロタイプ）を発現マーカーでタグ付けしたＨＬＡ障害に関するモデル系を提供する。ある特定の実施形態において、突然変異体対立遺伝子(例えば突然変異体ＨＬＡ又はＨＬＡレギュレーター）をタグ付けする。ある特定の実施形態において、モデル系はインビトロの細胞系統を含み、他の実施形態においては、モデル系はトランスジェニック動物を含む。

更に又、核酸及び／又はＤＮＡ結合ドメイン（又はＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白質）を含有する医薬組成物も提供される。例えばある特定の組成物は、製薬上許容しうる担体又は希釈剤と組み合わせて調節配列に作動可能に連結した本明細書に記載するＺＦＰ及び／又はＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインの１つをコードする配列を含む核酸を包含し、その場合、その調節配列は細胞中での核酸の発現又は抑制を可能にする。ある特定の実施形態において、コードされるＺＦＰ及び／又はＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインはＨＬＡ対立遺伝子に対して特異的である。蛋白質系組成物は本明細書に記載するＺＦＰＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインの１つ及び製薬上許容しうる担体又は希釈剤を包含する。

本明細書に記載する方法の何れもインビトロ、インビボ及び／又はエクスビボで実施できる。ある特定の実施形態において、方法はエクスビボにおいて、例えば、それを要する対象を治療するために使用する前にＴ細胞又はＮＫ細胞を修飾するために使用される。

以上及び他の態様は全体として開示を参照すれば当業者には自明であるはずである。

ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩのクラスターの遺伝子のいくつかの模式図である。 パネルＡ及びＢは、ＨＬＡＡ３（図２Ａ）及びＨＬＡＡ２（図２Ｂ）を標的とするＺＦＮに関するＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイ（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ^TM、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）の結果を示すゲルを示す。アッセイは増幅されたゲノムＤＮＡフラグメントとのミスマッチ率（％）を分析するものであり、それにより、ＺＦＮ形成ＤＳＢのＮＨＥＪ修復後に生じたＤＮＡ配列における改変の量（％）の定量を可能にする。両方のゲルはＨＥＫ２９３細胞内への各ゲルのレーンの下に示す擬似トランスフェクション、ＧＦＰコードプラスミドによるトランスフェクション、及びＺＦＮ対をコードするプラスミドによるトランスフェクションに関する結果を示している。遺伝子修飾率はレーン下部に示す。 パネルＡ〜Ｄは、ＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示しており、ここでは、ＨＬＡＡ２、ＨＬＡＡ３のいずれか、又はＨＬＡＡ２とＡ３の両方が特定のＺＦＮ投与の後に撹乱されている。図３Ａ（「親」）は如何なるＺＦＮ投与も欠いている親ＨＥＫ２９３細胞を示す。左カラムはＨＬＡＡ２対立遺伝子に関する染色を示し、右カラムはＨＬＡＡ３対立遺伝子に関する染色を示す。各パネルの最も左のピークはアイソタイプ対照(バックグラウンド）を示す。親細胞において、最も左側のピークはＢ−ＬＣＬクローン（陽性対照）を染色している抗体に関する結果を示す。左から２番目のピークはサイトカイン(ＩＦＮガンマ）投与の前のＡ２又はＡ３陽性細胞の量を示し、右から２番目のピークはサイトカイン投与後のＨＬＡＡ２又はＡ３の発現に関する結果を示す。細胞クローン１８−１（Ａ２＋Ａ３−）（図３Ｂ）、８．１８（Ａ２−Ａ３＋）（図３Ｃ）及び８３（Ａ２−Ａ３−）（図３Ｄ）に相当する図３Ｂ〜３Ｄは図３Ａに示すものと同じ分析を含む（ただし、親パネルにおいて最も右側のラインを染色している陽性Ｂ細胞は図示しない）。したがって、これらのデータは目的の対立遺伝子が撹乱されるとサイトカイン刺激時においても細胞マーカーの発現は観察されないことを示している。 パネルＡ及びＢは、それぞれＨＬＡＡ２又はＨＬＡＡ３を標的とする特異的ＣＴＬによるＨＬＡ−ＡノックアウトＨＥＫ２９３クローン、１８−１、８．１８及びＢ細胞クローン（図３に関して上記）の細胞溶解の分析を示すグラフである。この実験において、ＨＬＡ複合体上にディスプレイされればＣＴＬ作用を刺激する特異的ペプチドエピトープ（配列番号１３５及び配列番号１３６）と組み合わせてＨＬＡＡ２又はＨＬＡＡ３の何れかに限定したＣＴＬを使用した。図４ＡはＨＬＡＡ３特異的ＣＴＬ及びＨＥＫ２９３標的細胞を、それらのペプチド抗原の濃度を上昇させながら使用した場合の結果を示す。未修飾のＡ３ＨＬＡ遺伝子産物を含有する細胞は溶解される（親、８．１８及びＢ−ＬＣＬ）。図４Ｂにおいて、特異的ペプチド抗原と組み合わせてＨＬＡＡ２に特異的なＣＴＬを用いて溶解実験を実施した。漸増濃度のペプチドを使用する場合、ＣＴＬは未損傷のＨＬＡＡ２遺伝子産物を含有する細胞（親ＨＥＫ２９３、１８−１及びＢ−ＬＣＬ）を溶解することができる。したがって、ＣＴＬにより標的とされたＨＬＡＡ遺伝子の発現が撹乱されると、細胞はもはやＣＴＬ指向溶解に対して感受性ではなくなる。 パネルＡ及びＢは、ＨＬＡＡ２染色のＦＡＣＳ分析の結果を示す。この実験において、ＨＬＡＡ２特異的ＺＦＮをコードするｍＲＮＡの種々の量（左パネルに示す２．５μｇ、中央パネルに示す５．０μｇ、及び右パネルに示す１０μｇ）を用いたヌクレオフェクションに一次Ｔ細胞を付した。図５Ａはトランスフェクションの後に標準的細胞培養条件を用いた場合の結果を示し、図５Ｂは「一過性コールドショック」法を用いた場合の結果を示す。細胞のほぼ４２％までが「コールドショック」法を用いた場合にＨＬＡＡ２撹乱特性を示すことができる。 図５において分析した一次Ｔ細胞に関するＣｅｌ−Ｉミスマッチの結果を示すゲルを示す。レーンは野生型ＦｏｋＩ触媒ドメインを有するＺＦＮ対（「ｗｔ」）、及び「ＥＬＤ／ＫＫＲ」ヘテロ２量体ドメインを有するＺＦＮ対（「ｍｕｔ」）を、記載されたＺＦＮ濃度（左パネルに示す２．５μｇ、中央パネルに示す５．０μｇ、及び右パネルに示す１０μｇ）で用いた場合の結果を示す。このアッセイにより検出された遺伝子修飾率（「標的化された撹乱（％）」）は各レーンの下部に示す通りであり、そして結果はＦＡＣＳ分析と整合している。 パネルＡ及びＢは、ＨＬＡＣ（図７Ａ）及びＨＬＡＢ（図７Ｂ）遺伝子に特異的なＺＦＮに関するＣｅｌ−Ｉミスマッチ分析の結果を示す。矢印は遺伝子修飾を示すゲル上のバンドを示す。 パネルＡは、ＨＬＡＣ遺伝子の下流の標的配列（「ＨＬＡＣ−ｄｏｗｎ」）及びＨＬＡＢ遺伝子の上流の標的配列（「ＨＬＡＣ−ｕｐ」）に対して特異的なＺＦＮに関するＣｅｌ−Ｉミスマッチ分析の結果を示すゲルを示す。図８ＡはＨＬＡＣ−ｄｏｗｎ特異的ＺＦＮ対に関する結果を示しており、ここでは野生型ＦｏｋＩ触媒ドメインを含有するＺＦＮ（ｗｔ）及びＥＬ／ＫＬヘテロ２量体ＦｏｋＩドメインを含有するＺＦＮ対（ｍｕｔ）を示す。矢印は、ミスマッチを示すバンドを示す。検出された遺伝子修飾率は各レーンの下部に示す（「％ＮＨＥＪ」）。図８Ｂは２つのＨＬＡＢ−ｕｐＺＦＮ対に関する結果を示し、ここでは矢印は遺伝子修飾を示すバンドを指している。 パネルＢは、ＨＬＡＣ遺伝子の下流の標的配列（「ＨＬＡＣ−ｄｏｗｎ」）及びＨＬＡＢ遺伝子の上流の標的配列（「ＨＬＡＣ−ｕｐ」）に対して特異的なＺＦＮに関するＣｅｌ−Ｉミスマッチ分析の結果を示すゲルを示す。図８ＡはＨＬＡＣ−ｄｏｗｎ特異的ＺＦＮ対に関する結果を示しており、ここでは野生型ＦｏｋＩ触媒ドメインを含有するＺＦＮ（ｗｔ）及びＥＬ／ＫＬヘテロ２量体ＦｏｋＩドメインを含有するＺＦＮ対（ｍｕｔ）を示す。矢印は、ミスマッチを示すバンドを示す。検出された遺伝子修飾率は各レーンの下部に示す（「％ＮＨＥＪ」）。図８Ｂは２つのＨＬＡＢ−ｕｐＺＦＮ対に関する結果を示し、ここでは矢印は遺伝子修飾を示すバンドを指している。 パネルＡは、ＨＬＡＢ及びＨＬＡＣの遺伝子座の両方を包含する大型の欠失をもたらすように設計された実験を示す。図９ＡはＨＬＡＢ及びＨＬＡＣの領域におけるＨＬＡ遺伝子複合体の模式図であり、そしてＨＬＡＢ−ｕｐ及びＨＬＡＣ−ｄｏｗｎのＺＦＮにより標的とされた領域を示す。欠失を可視化するためにＰＣＲで使用されたプライマーの箇所もまた示されている。図９ＢはＫ５６２細胞におけるＨＬＡＢ−ｕｐ及びＨＬＡＣ−ｄｏｗｎのＺＦＮを用いた切断の後の欠失特異的ＰＣＲの結果を示す。ゲルの左側のレーンはＰＣＲからのシグナルを定量するためにプラスミド内に本発明者等が挿入した欠失ＰＣＲ産物の連続希釈物である。欠失ＰＣＲはヌクレオフェクション後３日及び１０日に単離したＤＮＡに対して実施し、そして使用したＺＦＮは野生型（「ｗｔ」）又は突然変異体（「ｍｕｔ」）のＦｏｋＩ触媒ドメインの何れかを含有していた（図８において記載したとおり）。結果は第３日において対立遺伝子の約５％がＨＬＡＢ及びＨＬＡＣの欠失を含有していたことを示している。 パネルＢは、ＨＬＡＢ及びＨＬＡＣの遺伝子座の両方を包含する大型の欠失をもたらすように設計された実験を示す。図９ＡはＨＬＡＢ及びＨＬＡＣの領域におけるＨＬＡ遺伝子複合体の模式図であり、そしてＨＬＡＢ−ｕｐ及びＨＬＡＣ−ｄｏｗｎのＺＦＮにより標的とされた領域を示す。欠失を可視化するためにＰＣＲで使用されたプライマーの箇所もまた示されている。図９ＢはＫ５６２細胞におけるＨＬＡＢ−ｕｐ及びＨＬＡＣ−ｄｏｗｎのＺＦＮを用いた切断の後の欠失特異的ＰＣＲの結果を示す。ゲルの左側のレーンはＰＣＲからのシグナルを定量するためにプラスミド内に本発明者等が挿入した欠失ＰＣＲ産物の連続希釈物である。欠失ＰＣＲはヌクレオフェクション後３日及び１０日に単離したＤＮＡに対して実施し、そして使用したＺＦＮは野生型（「ｗｔ」）又は突然変異体（「ｍｕｔ」）のＦｏｋＩ触媒ドメインの何れかを含有していた（図８において記載したとおり）。結果は第３日において対立遺伝子の約５％がＨＬＡＢ及びＨＬＡＣの欠失を含有していたことを示している。 パネルＡ及びＢは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＬＡ調節遺伝子を標的とするＺＦＮを用いた切断の結果を示すゲルを示す。図１０ＡはＴＡＰ１遺伝子を標的とするＺＦＮを用いたＣｅｌＩミスマッチアッセイの結果を示し、図１０ＢはＺＦＮがＴＡＰ２遺伝子を標的とした場合の結果を示す。使用したＺＦＮは適切なレーンの上部に示す。これらの結果はＺＦＮが標的ＤＮＡを切断する活性を有することを示している。 ＨＥＫ２９３細胞におけるタパシン遺伝子を標的とするＺＦＮ（ＺＦＮの番号はレーン１及び２の上部に示す）を用いたＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示す。遺伝子修飾率を各レーンの下部に示す。これらのデータはこのＺＦＮ対がこの標的に対して活性であることを明らかにしている。 Ｋ５６２細胞におけるＤＰＢ２遺伝子の上流(ＤＰＢ２ｕｐ）又はＤＲＡ遺伝子の下流（ＤＲＡｄｏｗｎ）の標的箇所の一ずれかを標的とするＺＦＮを用いたＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果を示すゲルを示す。トランスフェクションでは野生型ＦｏｋＩ触媒ドメイン（「ｗｔ」）、及びＥＬ／ＫＫヘテロ２量体ＦｏｋＩ触媒ドメイン（「ｍｕｔ」）をの何れかを含有する記載されたＺＦＮを用いた。このアッセイにより計測した場合の遺伝子修飾率を各レーンの下部に示す。「ｗｔ」レーンは２つの異なるトランスフェクション日付において実施された２連のトランスフェクションを示す。 図９において実施したものと同様の欠失ＰＣＲの結果を示すゲルを示す。図９に関して記載したとおり、ゲルの左側のレーンは欠失を含有する対立遺伝子の頻度の定量において使用するためのサブクローニングされたＰＣＲ産物の連続希釈物を含有している。欠失ＰＣＲはトランスフェクション後３日及び１０日に細胞から単離下ＤＮＡに対して実施し、そして使用したＺＦＮは 野生型ＦｏｋＩ触媒ドメイン（「ｗｔ」）、及びＥＬ／ＫＫヘテロ２量体ＦｏｋＩ触媒ドメイン（「ｍｕｔ」）をの何れかを含有していた。結果は対立遺伝子の約０．０４％が大型の欠失を含有していたことを示している。 図１３に示した欠失ＰＣＲ産物の配列決定により得られた配列決定結果を示す。１〜４行（配列番号１３７）はＰＣＲによる個々の核酸であり、５行(配列番号１３８）は１５９０９ＺＦＮ標的部位を包囲するゲノム配列及びその下流の配列を示す。６行（配列番号１３９）は１５８７３標的部位を包囲するゲノム配列及びその上流の配列を示す。７行（配列番号１３７）はラ１〜４行からのコンセンサス配列を示す。これらの結果は、ＤＢＰ２ｕｐ及びＤＲＡｄｏｗｎのＺＦＮによる切断の後、結果として生じるＤＮＡが各ＺＦＮ対の遠位の標的部位を含有するような末端の再接合により、大型の欠失が形成されていることを示している。 上記のＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの後の結果を示すゲルを示す。ＨＬＡクラスＩＩレギュレーター遺伝子ＣＩＩＴＡ又はＲＦＸ５の何れかを標的とするＺＦＮをＫ５６２細胞において使用し、そして遺伝子修飾率（％）をレーンの下部に示す。ＺＦＮ無添加（「擬似」）又はＧＦＰコードプラスミドトランスフェクション（「ｇｆｐ」）の何れかを用いて実施した実験の結果を含む対照レーンも示す。 上記のＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの後の結果を示すゲルを示す。Ｋ５６２細胞（「Ｋ」）又はＲＡＪＩ細胞（「Ｒ」）の何れかにおいてＣＩＩＴＡターゲティングＺＦＮを使用した。このアッセイにより検出された遺伝子修飾率（％）をレーンの下部に示し、そして矢印は修飾活性を示すバンドを示す。これらの結果はＣＩＩＴＡを標的とするＺＦＮがＲＡＪＩ細胞並びにＫ５６２細胞で機能できることを示している。「ｎ．ｃ．」はトランスフェクションの間、如何なるＺＦＮコードＤＮＡも用いることなく実施した陰性対照を示す。 パネルＡ〜Ｄは、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体（ＣＤ１９ＣＡＲ）に関して予めトランスジェニックにされているＴ細胞に対して実施したＦＡＣＳ分析の結果を示す。これらのＣＤ１９ＣＡＲ修飾Ｔ細胞をＨＬＡＡ２遺伝子を標的とするＺＦＮをコードするｍＲＮＡによるヌクレオフェクションに付し、そしてＨＬＡ−Ａ２陰性細胞をＨＬＡ−Ａ２抗体を用いた陰性ビーズソーティングにより富化し、そしてＨＬＡＡ２特異的抗体を用いてＦＡＣＳ分析を実施した。結果は、ＨＬＡＡ２ノックアウト細胞は、その集団が９５．３％のＨＬＡＡ２ノックアウトを含有するように富化されていたことを示している。 ＨＬＡＡ２特異的ＺＦＮを投与され（Ａ２ｎｅｇ ＣＤ１９ＲＣＡＲ−Ｔ細胞）、そしてＨＬＡ−Ａ２特異的抗体を用いて富化されるか、又は擬似トランスフェクトされている（Ａ２ｐｏｓＣＤ１９ＲＣＡＲ−Ｔ細胞）かの何れかであるＨＬＡＡ２特異的ＣＤ１９ＣＡＲ含有Ｔ細胞を用いた溶解アッセイの結果を示すグラフである。特異的ペプチドエピトープの漸増量と共に細胞をインキュベートした。陽性対照としてＡ２ｐｏｓＢ細胞を使用した。結果は、ＨＬＡＡ２遺伝子産物を欠損している細胞はＨＬＡＡ２特異的ＣＴＬ誘導溶解に対して耐性であることを示している。 パネルＡ〜Ｇは幾つかのＦＡＣＳ分析の結果を示す。ＴＣＲβ（「ＴＲＢＣ」、図１９Ａ〜図１９Ｄ）又はＴＣＲα（「ＴＲＡＣ」、図１９Ｅ〜１９Ｇ）の何れかに特異的なＺＦＮをコードするｍＲＮＡを、上記ＦＡＣＳで示したとおり、２．５μｇ〜１０μｇの範囲で使用した。アッセイはＴＣＲの存在に依存する複合体である細胞表面上のＣＤ３を採点するように設計されている。結果は、ＴＣＲβ特異的ＺＦＮは集団の約９％の細胞がＣＤ３マーカーを消失するように誘導できるのに対し、ＴＣＲα特異的ＺＦＮは約２８％の細胞がＣＤ３マーカーを消失するように誘導できることを示している。 パネルＡ及びＢは、ＴＣＲβ特異的ＺＦＮ（ＴＲＢＣ、図２０Ａ）をコードするか又はＴＣＲα特異的ＺＦＮ（ＴＲＡＣ、図２０Ｂ）をコードするｍＲＮＡの何れかを使用する場合の、存在する遺伝子修飾の量を評価するための上記のＣｅｌ−Ｉアッセイの結果を示すゲルを示す。この例において、ｍＲＮＡをヌクレオフェクトし、そして標準的な条件によるか、又は「一過性コールドショック」条件を用いて培養した。結果は、図１９の結果と全般的に合致しており、そして両方のＺＦＮのセットがそれらの意図する標的を切断できることを示している。

ＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーターを標的とするための、ＤＮＡ結合ドメイン(例えばＺＦＰ及び／又はＴＡＬＥＤＮＡ結合蛋白質）及びこれらのＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白質（例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＰ−ＴＦ及びＴＡＬＥ−ＴＦ）を開示する。本明細書に記載する蛋白質は特定のＨＬＡ遺伝子を抑制又は活性化し、そしてその発現を変化させることができる。同様に、本明細書に記載するＤＮＡ結合蛋白質はＨＬＡレギュレーターを標的とすることができ、そしてその発現を調節することを介してＨＬＡ発現を変化させることができる。ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮを包含する組成物及びＨＬＡ遺伝子を改変するための方法も開示し、提供する。これらは、操作されたＤＮＡ結合ドメイン、即ち所定の核酸標的配列に結合する非天然存在の蛋白質を使用した組成物及び方法を包含する。本明細書に記載するＤＮＡ結合ドメイン及びこれらのＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白質は所望のＨＬＡ遺伝子に対して効率的及び特異的に作用することができ、特定の遺伝子の欠失及び／又は標的とされる遺伝子座内への目的の代替遺伝子の導入をもたらすことができる。この態様において標的化された細胞は治療薬、例えば移植片として使用することができ、又は、ＨＬＡ遺伝子機能を研究するためのインビトロ又はインビボの何れかのモデル系を作成するために使用できる。そのような細胞は又、ＨＬＡ発現に対して作用することになる化合物を求めるための、小分子又は他の型の治療薬を単離して特性化するための薬物スクリーニングツールとしても使用できる。所望のＨＬＡ遺伝子のノックアウトの後に細胞表面上で発現されるＨＬＡ遺伝子産物を変化させるために他のＨＬＡ遺伝子を挿入してよい細胞もまた作成できる。更に又、ＨＬＡ遺伝子が操作されている細胞内に他の目的の遺伝子を挿入しても良い。

したがって、本明細書に記載する方法及び組成物はＨＬＡ関連障害の治療のための方法を提供し、そしてこれらの方法及び組成物は標的遺伝子を調節することができる亜鉛フィンガー転写因子並びに操作された亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含むことができる。
全般

本明細書に開示した方法の実施、並びに組成物の調製及び使用は、特段の記載が無い限り、当該分野で知られている通り、分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、コンピューター化学、細胞培養、組み換えＤＮＡ及び関連の分野における従来の手法を使用する。これらの手法は文献において十分に説明されている。例えばSambrook等、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989及びThird edition,2001;Ausubel等、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987及び定期的更新;シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;及びMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999を参照のこと。
定義

「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、線状又は環状の構造における、そして１本鎖又は２本鎖の形態における、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを指す。本開示の目的のためには、これらの用語は重合体の長さに関して限定的であるとは解釈されない。これらの用語は天然のヌクレオチドの知られている類似体、並びに塩基、糖及び／又はホスフェート部分(例えばホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含することができる。一般的に、特定のヌクレオチドの類似体は同じ塩基対形成特異性を有し；即ち、Ａの類似体はＴと塩基対形成することになる。

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「蛋白質」という用語はアミノ酸残基の重合体を指すために互換的に使用される。この用語はまた、アミノ酸の１つ以上が相当する天然に存在するアミノ酸の化学的類似体又は修飾された誘導体であるアミノ酸重合体にも適用される。

「結合」とは巨大分子間（例えば蛋白質と核酸の間）の配列特異的、非共有結合的な相互作用を指す。全体としての相互作用が配列特異的である限り、結合相互作用の全ての成分が配列特異的（例えばＤＮＡ骨格中のホスフェート残基と接触する）である必要は無い。そのような相互作用は一般的に１０^-6Ｍ^-1以下の解離定数（Ｋ_d）により特徴付けられる。「親和性」とは、結合の強度を指し：より高い結合親和性は、より低いＫ_dと相関する。

「結合蛋白質」とは別の分子に非共有結合的に結合できる蛋白質である。結合蛋白質は例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合蛋白質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合蛋白質）及び／又は蛋白質分子(蛋白質結合蛋白質）に結合できる。蛋白質結合蛋白質の場合、それは自身に結合（ホモ２量体、ホモ３量体等）することができ、及び／又は、それは異なる蛋白質の分子１つ以上に結合できる。結合蛋白質は１つより多い種類の結合活性を有することができる。例えば、亜鉛フィンガー蛋白質はＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合及び蛋白質結合活性を有する。

「亜鉛フィンガーＤＮＡ結合蛋白質」（又は結合ドメイン）は亜鉛イオンの配位を介して自身の構造が安定化する結合ドメイン内部のアミノ酸配列の領域である亜鉛フィンガー１つ以上を介して配列特異的態様においてＤＮＡに結合する蛋白質又はより大きな蛋白質内部のドメインである。亜鉛フィンガーＤＮＡ結合蛋白質という用語は頻繁に亜鉛フィンガー蛋白質又はＺＦＰと略記される。

「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」又は「ＴＡＬＥ」とはＴＡＬＥリピートドメイン／単位１つ以上を含むポリペプチドである。リピートドメインはＴＡＬＥのその同族体標的ＤＮＡ配列への結合に関与している。単一の「リピート単位」（「リピート」とも称する）は典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、そして天然に存在するＴＡＬＥ蛋白質内部の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともある程度の配列相同性を呈する。

亜鉛フィンガー結合ドメインは例えば天然に存在する亜鉛フィンガー蛋白質の認識へリックス領域の操作（アミノ酸１つ以上の改変）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」されることができる。同様に、ＴＡＬＥは例えばＤＮＡ結合に関与するアミノ酸（リピート可変ジ残基、即ちＲＶＤ残基）の操作により所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」されることができる。従って操作された亜鉛フィンガー蛋白質又はＴＡＬＥ蛋白質は非天然存在の蛋白質である。亜鉛フィンガー蛋白質及びＴＡＬＥを操作するための非限定的な例は設計及び選択である。設計された蛋白質は自身の設計／組成が主に合理的な基準から生じている非天然存在の蛋白質である。設計の合理的な基準は置換規則及び既存のＺＦＰ又はＴＡＬＥの設計及び結合データの情報を保存しているデータベース中の情報を処理するためのコンピューター化されたアルゴリズムの適用を包含する。例えば米国特許６，１４０，０８１；６，４５３，２４２；及び６，５３４，２６１を参照でき；又、ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６も参照のこと。

「選択された」亜鉛フィンガー蛋白質又はＴＡＬＥは、自身の生産が主に実験的プロセス、例えばファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択から生じる天然には存在しない蛋白質である。例えばＵＳ５，７８９，５３８；ＵＳ５，９２５，５２３；ＵＳ６，００７，９８８；ＵＳ６，０１３，４５３；ＵＳ６，２００，７５９；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ＷＯ０１／８８１９７及びＷＯ０２／０９９０８４を参照のこと。

「組み換え」とは２つのポリヌクレオチドの間の遺伝子情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のためには、「相同組み換え（ＨＲ）」とは例えば相同性指向型修復機序を介した細胞中の２本鎖切断の修復中に起こる交換の特殊化された形態を指す。このプロセスはヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（即ち２本鎖切断を経験したもの）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、そして「非クロスオーバー遺伝子変換」又は「ショートトラクト遺伝子変換」として多様に知られているが、その理由はそれがドナーから標的への遺伝子情報の転移をもたらすからである。特定の理論に制約することを望むののではないが、そのような転移には破壊された標的とドナーとの間に形成されるヘテロデュプレックスＤＮＡのミスマッチ補正、及び／又は標的の部分になる遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存性鎖アニーリング」及び／又は関連プロセスが関与している場合がある。そのような特殊化されたＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の部分又は全てが標的ポリヌクレオチド内に取り込まれるような標的分子の配列の改変をもたらす。

本開示の方法においては、本明細書に記載する標的化ヌクレアーゼの１つ以上が所定の部位において標的配列（例えば細胞クロマチン）中に２本鎖破壊をもたらし、そして破壊領域のヌクレオチド配列と相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドが細胞内に導入されることができる。２本鎖破壊の存在はドナー配列の組み込みを促進することがわかっている。ドナー配列は物理的に組み込まれて良く、或いは、ドナーポリヌクレオチドは相同組み換えを介した破壊の修復のための鋳型として用いられることにより、ドナー中にある状態でヌクレオチド配列の全て又は部分の細胞クロマチン内への導入がもたらされる。したがって、細胞クロマチンの第１の配列を改変することができ、そしてある特定の実施形態において、ドナーポリヌクレオチド中に存在する配列に変換することができる。したがって、「置き換える」又は「置き換え」という用語の使用はあるヌクレオチド配列の別のものによる置き換え（即ち情報的意味においての配列の置き換え）を示すと理解することができ、必ずしもあるヌクレオチドの別のものによる物理的又は化学的な置き換えを必要としない。

本明細書に記載する方法の何れにおいても、細胞内部の追加的標的部位の追加的２本鎖切断のために、亜鉛フィンガー蛋白質の追加的対を用いることができる。

細胞クロマチン中の目的の領域における配列の標的化された組み換え及び／又は置き換え及び／又は改変のための方法のある特定の実施形態において、染色体配列を外因性の「ドナー」ヌクレオチド配列との相同組み換えにより改変する。そのような相同組み換えは、破壊領域に相同である配列が存在すれば、細胞クロマチン中の２本鎖破壊の存在により刺激される。

本明細書に記載する方法の何れにおいても、第１のヌクレオチド配列（「ドナー配列」）は目的の領域のゲノム配列と相同であるが同一ではない配列を含有することができ、それにより目的の領域中に非同一配列を挿入するための相同組み換えを促進することができる。したがって、ある特定の実施形態において、目的の領域の配列に相同であるドナー配列の部分は置き換えられるゲノム配列と約８０〜９０％（又はその間の何れかの整数）の配列同一性を呈する。他の実施形態において、ドナーとゲノム配列の間の相同性は、例えばドナーと１００超の連続塩基対のゲノム配列の間のものとして僅か１ヌクレオチドのみが異なる場合に、９９％より高値となる。ある特定の場合において、新しい配列が目的の領域内に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は目的の領域中には存在しない配列を含有することがでる。これらの場合において、非相同配列は一般的に、５０〜１０００塩基対（又はその間の何れかの整数）の配列、又は目的の領域中の配列と相同又は同一である１０００個より多い塩基対の何れかの数に隣接して配置される。他の実施形態において、ドナー配列は第１の配列と非相同であり、そして非相同組み換え機序によりゲノム内に挿入される。

本明細書に記載する方法の何れをも、目的の遺伝子の発現を撹乱させるドナー配列の標的化された組み込みにより細胞中の標的配列１つ以上の部分的又は完全な不活性化のために使用できる。部分的又は完全に不活性化された遺伝子を有する細胞系統もまた提供される。

更に又、本明細書に記載する標的化された組み込みの方法は外因性配列１つ以上を組み込むためにも使用できる。外因性核酸配列は例えば１つ以上の遺伝子又はｃＤＮＡ分子、又は何れかの型のコーディング又は非コーディング配列、並びに１つ以上の制御エレメント(例えばプロモーター）を含むことができる。更に又、外因性核酸配列は１つ以上のＲＮＡ分子（例えば小型ヘアピンＲＮＡ(ｓｈＲＮＡ）、阻害ＲＮＡ（ＲＮＡｉｓ）、マイクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ）等）を生成し得る。

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断はホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を包含するがこれらに限定されない種々の方法により開始することができる。１本鎖切断及び２本鎖切断の両方が可能であり、そして、２本鎖切断は２つの区別可能な１本鎖切断事象の結果として起こることができる。ＤＮＡ切断は平滑末端又は互い違いの末端の何れかの生成をもたらす場合がある。ある特定の実施形態において、融合ポリペプチドは標的化された２本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。

「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同じか又は異なる）と一緒になって切断活性（好ましくは２本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。「第１及び第２の切断ハーフドメイン」、「＋及び−切断ハーフドメイン」、及び「右及び左切断ハーフドメイン」という用語は互換的に使用され、２量体化する切断ハーフドメインの対を指す。

「操作された切断ハーフドメイン」とは、別の切断ハーフドメイン（例えば他の操作された切断ハーフドメイン）と強制的ヘテロ２量体を形成するように修飾されている切断ハーフドメインである。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２００５／００６４４７４、２００７０２１８５２８及び２００８／０１３１９６２を参照のこと。

「配列」という用語は任意の長さのヌクレオチド配列を指し、これはＤＮＡ又はＲＮＡであることができ；線状、環状又は分枝鎖であることができ、そして１本鎖又は２本鎖であることができる。「ドナー配列」という用語はゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は任意の長さ、例えば２〜１００００ヌクレオチド長（又はその間又はその上の何れかの整数値）、好ましくは約１００〜１０００ヌクレオチド長（又はその間の何れかの整数）、より好ましくは約２００〜５００ヌクレオチド長であることができる。

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核蛋白質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にＤＮＡ、及び蛋白質、例えばヒストン及び非ヒストン染色体蛋白質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分はヌクレオソームの形態で存在し、そこでは、ヌクレオソームのコアはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４の各々２つを含む８量体と会合したＤＮＡの約１５０塩基対を含み；そしてリンカーＤＮＡ（生物に応じて種々の長さ）がヌクレオソームとコアの間に伸長している。ヒストンＨ１の分子は一般的にリンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的のために、「クロマチン」という用語は原核生物及び真核生物の両方の細胞核蛋白質の全ての型を包含することが意図される。細胞クロマチンは染色体及びエピソームのクロマチンの両方を包含する。

「染色体」は、細胞のゲノムの全て又は一部分を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムはしばしばその核型により特性化され、それは細胞のゲノムを含む染色体の全ての集合である。細胞のゲノムは染色体１つ以上を含むことができる。

「エピソーム」とは、複製する核酸、核蛋白質複合体又は細胞の染色体核型の部分ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例はプラスミド及びある特定のウィルスゲノムを包含する。

「標的部位」又は「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在すれば結合分子が結合することになる核酸の一部分を画定する核酸配列である。例えば配列５’ＧＡＡＴＴＣ３’はＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼに対する標的部位である。種々の標的化されたＺＦＰに対する例となる標的部位を表２に示す。

「外因性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、遺伝子的、生化学的又は他の方法の１つ以上により細胞内に導入できる分子である。「細胞中の通常の存在」は細胞の特定の発生段階及び環境条件に対して決定される。したがって、例えば筋肉の胚性発生の間のみ存在する分子は成熟筋細胞に対しては外因性分子である。同様に、熱ショックにより誘導される分子は非熱ショック細胞に対しては外因性分子である。外因性分子は例えば機能不全の内因性分子の機能性のバージョン又は正常機能の内因性分子の機能不全バージョンを含むことができる。

外因性分子は特に小分子、例えばコンビナトリアル化学プロセスにより形成されるもの、又は、巨大分子、例えば蛋白質、核酸、炭水化物、脂質、糖蛋白質、リポ蛋白質、多糖類、上記分子の何れかの修飾された誘導体、又は上記分子の１つ以上を含む何れかの複合体であることができる。核酸はＤＮＡ及びＲＮＡを包含し、１本鎖又は２本鎖であることができ；直鎖、分枝鎖又は環状であることができ；そして任意の長さであることができる。核酸は二重鎖並びに三重鎖形成核酸を形成することができるものを包含する。例えば米国特許５，１７６，９９６及び５，４２２，２５１号を参照のこと。蛋白質は、ＤＮＡ結合蛋白質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合蛋白質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジラーゼ及びヘリカーゼを包含するが、これらに限定されない。

外因性分子は内因性分子と同じ型の分子、例えば外因性蛋白質又は核酸であることができる。例えば、外因性核酸は細胞内に導入された感染性のウィルスゲノム、プラスミド又はエピソーム、又は通常は細胞内に存在しない染色体を含むことができる。細胞内に外因性分子を導入するための方法は当該分野で知られており、脂質媒介転移(即ちリポソーム、例えば中性及びカチオン性の脂質）、エレクトロポレーション、直接の注入、細胞融合、粒子衝突、リン酸カルシウム同時沈殿、ＤＥＡＥデキストラン媒介転移及びウィルスベクター媒介転移を包含するがこれらに限定されない。外因性分子はまた、内因性分子と同じ型の分子であるが、細胞の誘導元とは異なる種から誘導されることができる。例えば、ヒト核酸配列をマウス又はハムスターから元々誘導された細胞系統内に導入してよい。

一方、「内因性」分子は特定の環境条件下の特定の発生段階における特定の細胞中に通常は存在するものである。例えば内因性核酸は染色体、ミトコンドリア、クロロプラスト又は他のオルガネラのゲノム、又は天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。追加的な内因性分子は例えば転写因子及び酵素を包含し得る。

「融合」分子は２つ以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合的に連結されている分子である。サブユニット分子は同じ化学的な型の分子であることができ、又は、異なる化学的な型の分子であることができる。融合分子の第１の型の例は、融合蛋白質(例えばＺＦＰＤＮＡ結合ドメインと１つ以上の活性化ドメインの間の融合物）及び融合核酸（例えば上記融合蛋白質をコードする核酸）を包含するがこれらに限定されない。融合分子の第２の型の例は三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合物及びマイナーグルーブバインダーと核酸の間の融合物を包含するがこれらに限定されない。

細胞中での融合蛋白質の発現は、細胞への融合蛋白質の送達に起因するか、又は細胞への融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの送達によるものであって、その場合、ポリヌクレオチドは転写され、そして転写物が翻訳されて融合蛋白質を形成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断及びポリペプチドのライゲーションもまた細胞中での蛋白質の発現に関与している。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチドの送達のための方法は本開示において別途記載する。

「遺伝子」は、本開示の目的のためには、遺伝子産物（下記参照）をコードするＤＮＡ領域、並びに遺伝子産物の生産を調節する全てのＤＮＡ領域を包含し、そのような調製配列がコーディング及び／又は転写された配列であるか否かに関わらない。従って、遺伝子はプロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボソーム結合部位及び内部リボソームエントリー部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位及び遺伝子座制御領域を包含するが、必ずしもこれらに限定されない。

「遺伝子発現」とは、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は遺伝子の直接の転写産物(例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ又は何れかの他の型のＲＮＡ）又はｍＲＮＡの翻訳により生産された蛋白質であることができる。遺伝子産物は又、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集のようなプロセスにより修飾されたＲＮＡ、及び例えばメチル化、アセチル化、ホスホリル化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化及びグリコシル化により修飾された蛋白質を包含する。

遺伝子発現の「調節」とは遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節は遺伝子活性化及び遺伝子抑制を包含するがこれらに限定されない。ゲノムエディティング（例えば切断、改変、不活性化、ランダム突然変異）を用いて発現をモジュレートできる。遺伝子不活性化は本明細書に記載するＺＦＰを包含しない細胞と比較した場合の遺伝子発現の低下を指す。即ち、遺伝子不活性かは部分的又は完全であってよい。

「目的の領域」とは、例えば外因性分子に結合することが望まれる遺伝子、又は、遺伝子内部又はそれに隣接する非コーディング配列のような、細胞クロマチンの何れかの領域である。結合は標的化されたＤＮＡ切断及び／又は標的化された組み換えを目的とすることができる。目的の領域は染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えばミトコンドリア、クロロプラスト）、又は例えば感染性ウィルスゲノム中に存在できる。目的の領域は遺伝子のコーディング領域の内部、転写された非コーディング領域、例えばリーダー配列、トレーラー配列又はイントロンの内部、又は非転写領域の内部であって、コーディング領域の上流又は下流の何れかにあることができる。目的の領域は１ヌクレオチド対のように短いか、又は２０００ヌクレオチド対の長さまで、又は何れかの整数値のヌクレオチド対であることができる。

「真核生物」細胞はカビ細胞（例えばコウボ）、植物細胞、動物細胞、哺乳類細胞及びヒト細胞(例えばＴ細胞）を包含するがこれらに限定されない。

「作動可能な連結」及び「作動可能に連結した」という用語は２つ以上の成分（例えば配列エレメント）の並置に言及して互換的に使用され、この場合、成分は両方の成分が正常に機能し、そして成分の少なくとも一方が他の成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができる可能性を与えるように配置される。説明すれば、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が転写調節因子１つ以上の存在又は非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合に、コード配列に作動可能に連結している。転写調節配列は一般的に、コード配列とはシスで作動可能に連結しているが、それに直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーはコード配列に作動可能に連結している転写調節配列であるが、それらが連続していなくてもよい。

融合ポリペプチドに関しては、「作動可能に連結」という用語は、成分の各々が、それらがそのように連結していない場合と同様の機能を他成分との連結において各成分が行うという事実を指す場合がある。例えば、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインが活性化ドメインに融合している融合ポリペプチドに関しては、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメイン部分はその標的部位及び／又はその結合部位に結合することができ、活性化ドメインが遺伝子発現を上方調節できる場合に、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインは作動可能な連結にある。ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合している融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメイン部分はその標的部位及び／又はその結合部位に結合することができ、切断ドメインが標的部位の近接部のＤＮＡを切断できる場合に、ＺＦＰＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインは作動可能な連結にある。

蛋白質、ポリペプチド又は核酸の「機能性フラグメント」は、自身の配列が完全長の蛋白質、ポリペプチド又は核酸とは同一ではないが、なお、完全長の蛋白質、ポリペプチド又は核酸と同じ機能を保持している蛋白質、ポリペプチド又は核酸である。機能性フラグメントは相当する自然の分子より多い、少ない、又は同じ数の残基を保有することができ、及び／又は、１つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドの置換を含有できる。核酸の機能（例えばコード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を測定するための方法は当該分野で良く知られている。同様に蛋白質機能を測定するための方法も良く知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えばフィルター結合、電気泳動の運動性のシフト、又は免疫沈降アッセイにより測定できる。ＤＮＡ切断はゲル電気泳動により試験できる。上出のAusubel等を参照のこと。ある蛋白質が別の蛋白質と相互作用する能力は例えば、同時免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ又は遺伝子的及び生化学的な相補により測定できる。例えばFields等、(1989)Nature 340:245-246;米国特許５，５８５，２４５及びＰＣＴＷＯ ９８/４４３５０を参照のこと。

「ベクター」は遺伝子配列を標的細胞に転移させることができる。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」及び「遺伝子転移ベクター」は目的の遺伝子の発現を指向することができ、そして遺伝子配列を標的細胞に転移することができる任意の核酸を意味する。即ち、この用語はクローニング、及び発現ベヒクル、並びに組み込みベクターを包含する。

「レポーター遺伝子」又は「レポーター配列」とは好ましくは必ずしも定型的なアッセイにおいてではないが、容易に計測できる蛋白質産物を生産する何れかの配列を指す。適当なレポーター遺伝子は抗生物質耐性(例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介する蛋白質をコードする配列、着色又は蛍光又はルミネセント蛋白質（例えば緑色蛍光蛋白質、増強緑色蛍光蛋白質、赤色蛍光蛋白質、ルシフェラーゼ）をコードする配列、及び増強された細胞成長及び／又は遺伝子増幅を媒介する蛋白質（例えばジヒドロフォレート還元酵素）を包含するがこれらに限定されない。エピトープタグは例えばＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡ又は何れかの検出可能なアミノ酸配列のコピー１つ以上を包含する。「発現タグ」は目的の遺伝子の発現をモニタリングするために所望の遺伝子配列に作動可能に連結していて良いレポーターをコードする配列を包含する。
ＤＮＡ結合ドメイン

ＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡレギュレーターを含む何れかの遺伝子における標的部位に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む組成物を提供する。何れかのＤＮＡ結合ドメインをも本明細書に開示した組成物及び方法において使用できる。

ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは亜鉛フィンガー蛋白質を含む。好ましくは、亜鉛フィンガー蛋白質は選択された標的部位に結合するように操作されるという点において非天然存在である。例えば全て参照により全体が本明細書に組み込まれるBeerli等、(2002)Nature Biotechnol.20:135-141;Pabo等、(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalan等、(2001)Nature Biotechnol.19:656-660;Segal等、(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Choo等、(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416;米国特許６，４５３，２４２；６，５３４，２６１；６，５９９，６９２；６，５０３，７１７；６，６８９，５５８；７，０３０，２１５；６，７９４，１３６；７，０６７，３１７；７，２６２，０５４；７，０７０，９３４；７，３６１，６３５；７，２５３，２７３；及び米国特許公開番号２００５／００６４４７４；２００７／０２１８５２８；２００５／０２６７０６１を参照のこと。

操作された亜鉛フィンガー結合ドメインは天然に存在する亜鉛フィンガー蛋白質と比較して新規の結合特異性を有することができる。操作方法は合理的設計及び種々の型の選択を包含するがこれらに限定されない。合理的設計は例えばトリプレット(又はクアドルプレット）のヌクレオチド配列及び個々の亜鉛フィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを包含し、その場合、各トリプレット又はクアドルプレットのヌクレオチド配列は特定のトリプレット又はクアドルプレットの配列に結合する亜鉛フィンガーのアミノ酸配列１つ以上と会合している。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる共有米国特許６，４５３，２４２及び６，５３４，２６１を参照のこと。

例となる選択方法、例えばファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムは米国特許５，７８９，５３８；５，９２５，５２３；６，００７，９８８；６，０１３，４５３；６，４１０，２４８；６，１４０，４６６；６，２００，７５９；及び６，２４２，５６８；並びにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７及びＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。更に又、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば共有されているＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。

更に又、上記及び他の参考文献に開示されている通り、亜鉛フィンガードメイン及び／又はマルチフィンガーの亜鉛フィンガー蛋白質は、例えば５アミノ酸長以上のリンカーを包含する何れかの適当なリンカー配列を使用して連結してよい。また６アミノ酸長以上のリンカー配列の例については例えば、米国特許６，４７９，６２６；６，９０３，１８５；及び７，１５３，９４９を参照のこと。本明細書に記載する蛋白質は、蛋白質の個々の亜鉛フィンガーの間の適当なリンカーの何れかの組み合わせを包含してよい。更に又、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は例えば共有しているＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。

標的部位の選択；ＺＦＰ及び融合蛋白質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築のための方法は当該分野で知られており、米国特許６，１４０，０８１５；７８９，５３８；６，４５３，２４２；６，５３４，２６１；５，９２５，５２３；６，００７，９８８；６，０１３，４５３；６，２００，７５９；ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６に詳述されている。

更に又、上記及び他の参考文献に開示されている通り、亜鉛フィンガードメイン及び／又はマルチフィンガーの亜鉛フィンガー蛋白質は、例えば５アミノ酸長以上のリンカーを包含する何れかの適当なリンカー配列を使用して連結してよい。また６アミノ酸長以上のリンカー配列の例については例えば、米国特許６，４７９，６２６；６，９０３，１８５；及び７，１５３，９４９を参照のこと。本明細書に記載する蛋白質は、蛋白質の個々の亜鉛フィンガーの間の適当なリンカーの何れかの組み合わせを包含してよい。

或いは、ＤＮＡ結合ドメインはヌクレアーゼから誘導してよい。例えばI-SceI,I-CeuI,PI-PspI,PI-Sce,I-SceIV,I-CsmI,I-PanI,I-SceII,I-PpoI,I-SceIII,I-CreI,I-TevI,I-TevII and I-TevIIIのようなホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼの認識配列が知られている。更に又、米国特許５，４２０，０３２；米国特許６，８３３，２５２； Belfort等、(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388;Dujon等、(1989)Gene 82:115-118;Perler等、(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127;Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228;Gimble等、(1996)J.Mol.Biol.263:163-180;Argast等、(1998)J.Mol.Biol.280:345-353及びNew England Biolabs catalogueも参照のこと。更に又、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性を、非天然存在の標的部位に結合するように操作できる。例えばChevalier等、(2002)Molec.Cell 10:895-905;Epinat等、(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962;Ashworth等、(2006)Nature 441:656-659;Paques等、(2007)Current Gene Therapy 7:49-66;米国特許公開２００７０１１７１２８号を参照のこと。

ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＨＬＡ遺伝子又はＨＬＡ調節遺伝子における標的部位に結合（配列特異的な態様において）してＨＬＡの発現を調節する、操作された亜鉛フィンガー蛋白質である。ＺＦＰは目的の特定のハプロタイプに特異的に結合することができる。米国の集団において発見されたＨＬＡハプロタイプ及び種々の人種によるそれらの頻度の考察に関しては、参照により本明細書に組み込まれるMaiers等、(2007)Human Immunology 68:779- 788を参照のこと。更に又、Ｔａｐ１、Ｔａｐ２、タパシン、ＣＴＦＩＩＡ、及びＲＦＸ５を包含するがこれらに限定されない機能性ＨＬＡレギュレーター遺伝子に結合するＺＦＰを提供する。ＨＬＡ標的部位は典型的には少なくとも１つの亜鉛フィンガーを包含するが、複数の亜鉛フィンガー（例えば２，３，４，５，６つ以上のフィンガー）を包含できる。通常は、ＺＦＰは少なくとも３つのフィンガーを包含する。ＺＦＰのある特定のものは４、５又は６つのフィンガーを包含する。３つのフィンガーを包含するＺＦＰは典型的には９又は１０ヌクレオチドを包含する標的部位を認識し；４つの フィンガーを包含するＺＦＰは典型的には１２〜１４ヌクレオチドを包含する標的部位を認識し；６つのフィンガーを有するＺＦＰは１８〜２１ヌクレオチドを包含する標的部位を認識することができる。ＺＦＰは又、調節ドメイン１つ以上を含む融合蛋白質であることもでき、そのドメインは転写活性化又は抑制ドメインであることができる。

標的化されるＺＦＰの特定の例を表１に開示する。この表の第１の列はＺＦＰに関する内部の参照名称（番号）であり、表２の列１の同じ名称に対応する。「Ｆ」はフィンガーを指し、そして「Ｆ」の後の数はどの亜鉛フィンガーであるかを指している（例えば「Ｆ１」はフィンガー１を指す）。

これらの蛋白質の標的部位に関する配列を表２に開示する。表２は記載の亜鉛フィンガー蛋白質に関する標的配列を示す。ＺＦＰ認識ヘリックスが接触する標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示し；非接触ヌクレオチドは小文字で示す。

いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは植物病原体Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ（Boch等、(2009)Science 326:1509-1512及びMoscou and Bogdanove,(2009)Science326:1501参照）及びＲａｌｓｔｏｎｉａ（Heuer等、(2007)Applied and Environmental Microbiology 73(13):4379-4384）;米国特許出願１３／０６８，７３５及び米国特許公開２０１１０１４５９４０参照）から誘導したものと同様のＴＡＬエフェクターに由来する操作されたドメインである。

融合蛋白質
本明細書に記載するＤＮＡ結合蛋白質（例えばＺＦＰ又はＴＡＬＥ）及び非相同の調節(機能性）ドメイン（又はその機能性フラグメント）を含む融合蛋白質も提供される。共通ドメインは例えば転写因子ドメイン(アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー）、サイレンサー、癌遺伝子（例えばｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバー等）；ＤＮＡ修復酵素及びその関連因子及びモディファイアー；ＤＮＡ再配列酵素及びその関連因子及びモディファイアー；クロマチン関連蛋白質及びそれらのモディファイアー（例えばキナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ）；及びＤＮＡ修飾酵素（例えばメチル転移酵素、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）及びその関連因子及びモディファイアーを包含する。ＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼ切断ドメインの融合に関する詳細は参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２００５００６４４７４；２００６０１８８９８７及び２００７／０２１８５２８を参照のこと。

活性化を達成するために適するドメインはHSV VP16活性化ドメイン（例えばHagmann等、J.Virol.71,5952-5962(1997)参照)核ホルモン受容体（例えばTorchia等、Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998)参照）；核因子カッパＢのｐ６５サブユニット(Bitko & Barik,J.Virol.72:5610-5618(1998)及びDoyle&Hunt,Neuroreport 8:2937-2942(1997)）;Liu等、Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))、又は人工キメラ機能性ドメイン、例えばVP64（Beerli等、(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:14623-33）、及びデグロン（Molinari等、(1999)EMBO J.18,6439-6447）を包含する。追加の例となる活性化ドメインはＯｃｔ１、Ｏｃｔ−２Ａ、Ｓｐ１、ＡＰ−２及びＣＴＦ１（Seipel等、EMBO J.11,4961-4968(1992)）並びにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ及びＥＲＦ−２を包含する。例えば、Robyr等、(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347;Collingwood等、(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255-275;Leo等、(2000)Gene 245:1-11;Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77-89;McKenna等、(1999)J.Steroid Biochem.Mol.Biol.69:3-12;Malik等、(2000)Trends Biochem.Sci.25:277-283;及びLemon等、(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504を参照のこと。追加の例となる活性化ドメインは、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５，−６，−７及び−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ及びＴＲＡＢ１を包含するがこれらに限定されない。例えばOgawa等、(2000)Gene 245:21-29;Okanami等、(1996)Genes Cells 1:87-99;Goff等、(1991)Genes Dev.5:298-309;Cho等、(1999)Plant Mol.Biol.40:419-429;Ulmason等、(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:5844-5849;Sprenger-Haussels等、(2000)Plant J.22:1-8;Gong等、(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44;及びHobo等、(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:15,348-15,353を参照のこと。

当業者には明白であるように、ＤＮＡ結合ドメインと機能性ドメインとの間の融合蛋白質（又はそれをコードする核酸）の形成においては、活性化ドメイン又は活性化ドメインと相互作用する分子の何れかが機能性ドメインとして適している。活性化複合体及び／又は活性化活性（例えばヒストンアセチル化）を標的遺伝子まで動員できる本質的に如何なる分子も、融合蛋白質の活性化ドメインとして有用である。融合分子における機能性ドメインとしての使用に適するインシュレータードメイン、局在化ドメイン及びクロマチンリモデリング蛋白質、例えばＩＳＷＩ含有ドメイン及び／又はメチル結合ドメイン蛋白質は例えば共有米国特許出願２００２／０１１５２１５及び２００３／００８２５５２及び共有ＷＯ０２／４４３７６に記載されている。

例となる抑制ドメインはＫＲＡＢＡ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ−ベータ−誘導初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ−ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えばＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ及びＭｅＣＰ２を包含するがこれらに限定されない。例えばBird等、(1999)Cell 99:451-454;Tyler等、(1999)Cell 99:443-446;Knoepfler等、(1999)Cell 99:447-450;及びRobertson等、(2000)Nature Genet.25:338-342を参照のこと。追加の例となる抑制ドメインはＲＯＭ２及びＡｔＨＤ２Ａを包含するがこれらに限定されない。例えばChem等、(1996)Plant Cell 8:305-321;及びWu等、(2000)Plant J.22:19-27を参照のこと。

融合分子は当該分野で良く知られているクローニング及び生化学的コンジュゲーションの方法により構築される。融合分子はＤＮＡ結合ドメイン及び機能性ドメイン（例えば転写活性化又は抑制ドメイン）を含む。融合分子は又、場合により、核局在化シグナル（例えばＳＶ４０ｍｅｄｉｕｍＴ抗原）及びエピトープタグ（例えばＦＬＡＧ及びヘマグルチニン）を含む。融合蛋白質（及びそれをコードする核酸）は翻訳読み枠が融合物の成分間で温存されるように設計される。

一方では機能性ドメインのポリペプチド成分（又はその機能性フラグメント）、そして他方では非蛋白質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば抗生物質、インターカレーター、マイナーグルーブバインダー、核酸）との間の融合物は当該分野で知られている生化学的コンジュゲーションの方法により構築される。例えばPierce Chemical Company(Rockford,IL)Catalogueを参照のこと。マイナーグルーブバインダーとポリペプチドの間の融合物を作成するための方法及び組成物はMapp等、(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3930-3935に記載されている。

ある特定の実施形態において、亜鉛フィンガー蛋白質により結合される標的部位は細胞クロマチンの接触可能な領域中に存在する。接触可能な領域は例えば共有の国際公開ＷＯ０１／８３７３２に記載される通り測定できる。標的部位が細胞クロマチンの接触可能な領域中に存在しない場合は１つ以上の接触可能な領域を共有のＷＯ０１／８３７９３に記載される通り作成できる。追加の実施形態において、融合分子のＤＮＡ結合ドメインは、その標的部位が接触可能な領域にあるか否かに関わらず、細胞クロマチンと結合することができる。例えば、そのようなＤＮＡ結合ドメインはリンカーＤＮＡ及び／又はヌクレオソームＤＮＡに結合できる。「パイオニア」ＤＮＡ結合ドメインのこの型の例は特定のステロイド受容体中、及び、肝細胞核因子３（ＨＮＦ３）中に存在する。Cordingley等、(1987)Cell 48:261-270;Pina等、(1990)Cell 60:719-731;及びCirillo等、(1998)EMBO J.17:244-254。

融合分子は当該分野で知られる通り、製薬上許容しうる担体と共に製剤してよい。例えばRemington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,1985；及び共有のＷＯ００／４２２１９を参照のこと。

融合分子の機能性成分／ドメインは、融合分子がそのＤＮＡ結合ドメインを介して標的配列に結合すれば、遺伝子の転写に影響できる種々異なる成分の何れかから選択できる。従って、機能性成分は、種々の転写因子ドメイン、例えばアクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー及びサイレンサーを包含することができるがこれらに限定されない。

追加の例となる機能性ドメインは例えば共有の米国特許６，５３４，２６１及び米国特許出願公開２００２／０１６０９４０に開示されている。

外因性の小分子又はリガンドにより調節される機能性ドメインもまた選択してよい。例えばＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（商標登録）技術を用いてよく、その場合、機能性ドメインは、外部のＲｈｅｏＣｈｅｍ^TMリガンドの存在下のみで、その活性な構造を呈する（例えばＵＳ２００９０１３６４６５参照）。したがって、ＺＦＰは調節可能な機能性ドメインに作動可能に連結して良く、その場合、結果として生じるＺＦＰ−ＴＦの活性は外部リガンドにより制御される。

ヌクレアーゼ
ある特定の実施形態において、融合蛋白質はＤＮＡ結合ドメイン及び切断（ヌクレアーゼ）ドメインを含む。したがって、遺伝子修飾はヌクレアーゼ、例えば操作されたヌクレアーゼを用いて活性化できる。操作ヌクレアーゼ技術は天然に存在するＤＮＡ結合蛋白質の操作に基づいている。例えばテーラードＤＮＡ結合特異性を有するホーミングエンドヌクレアーゼの操作が記載されている。Chames等、(2005)Nucleic Acids Res 33(20):e178;Arnould等、(2006)J.Mol.Biol.355:443-458を参照のこと。更に又、ＺＦＰの操作も記載されている。例えば米国特許６，５３４，２６１；６，６０７，８８２；６，８２４，９７８；６，９７９，５３９；６，９３３，１１３；７，１６３，８２４；及び７，０１３，２１９を参照のこと。

更に又、ＺＦＰ及び／又はＴＡＬＥをヌクレアーゼドメインに融合することによりＺＦＮ及びＴＡＬＥＮが作成されており、これは、自身の操作された（ＺＦＰ又はＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインを介して自身の意図する核酸標的を認識し、そしてヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡ結合部位近傍でＤＮＡが切断されるようにすることができる機能性の実体である。例えばKim等、(1996)Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160を参照のこと。より最近では、そのようなヌクレアーゼは種々の生物のゲノムの修飾のために使用されている。例えば米国特許公開２００３０２３２４１０；２００５０２０８４８９；２００５００２６１５７；２００５００６４４７４；２００６０１８８９８７；２００６００６３２３１；及び国際公開ＷＯ０７／０１４２７５を参照のこと。

したがって、本明細書に記載する方法及び組成物は広範に適用でき、そして目的の如何なるヌクレアーゼも関与してよい。ヌクレアーゼの非限定的な例はメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ及び亜鉛フィンガーヌクレアーゼを包含する。ヌクレアーゼは非相同ＤＮＡ結合及び切断ドメイン（例えば亜鉛フィンガーヌクレアーゼ；非相同切断ドメインを有するメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）を含み得、又は、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを選択された標的部位に結合するように改変してよい（例えば同族体結合部位とは異なる部位に結合するように操作されているメガヌクレアーゼ）。

ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼはメガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）である。天然に存在するメガヌクレアーゼは１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般的には４つのファミリー、即ちＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓｔボックスファミリー及びＨＮＨファミリーにグループ分けされる。例となるホーミングエンドヌクレアーゼはＩ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ及びＩ−ＴｅｖＩＩＩを包含する。それらの認識部位は既知である。米国特許５，４２０，０３２；米国特許６，８３３，２５２；Belfort等、(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388;Dujon等、(1989)Gene 82:115-118;Perler等、(1994)Nucleic Acids Res.22,1125-1127;Jasin(1996)Trends Genet.12:224-228;Gimble等、(1996)J.Mol.Biol.263:163-180;Argast等、(1998)J.Mol.Biol.280:345-353及びNew England Biolabs catalogueを参照のこと。

主にＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに属する天然に存在するメガヌクレアーゼに由来するＤＮＡ結合ドメインは、植物、コウボ、ショウジョウバエ、哺乳類細胞及びマウスにおける部位特異的ゲノム修飾を促進するために使用されてきたが、この研究法はメガヌクレアーゼ認識配列を保存している相同遺伝子の修飾（Monet等、(1999),Biochem.Biophysics.Res.Common.255:88-93)又は認識配列が導入されている操作前ゲノム(Route等、(1994),Mol.Cell.Biol.14:8096-106;Chilton等、(2003),Plant Physiology.133:956-65;Puchta等、(1996),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:5055-60;Rong等、(2002),Genes Dev.16:1568-81;Gouble等、(2006),J.Gene Med.8(5):616-622）のいずれかに限定されてきた。従って、医学的又は生物工学的に適切な部位において新規な結合特異性を呈するようにメガヌクレアーゼを操作しようとする試みが行われてきた（Porteus等、(2005),Nat.Biotechnol.23:967-73;Sussman等、(2004),J.Mol.Biol.342:31-41;Epinat等、(2003),Nucleic Acids Res.31:2952-62;Chevalier等、(2002)Molec.Cell 10:895-905;Epinat等、(2003)Nucleic Acids Res.31:2952-2962;Ashworth等、(2006)Nature 441:656-659;Paques等、(2007)Current Gene Therapy 7:49-66;米国特許公開２００７０１１７１２８；２００６０２０６９４９；２００６０１５３８２６；２００６００７８５５２；及び２００４０００２０９２）。更に又、天然に存在する又は操作されたメガヌクレアーゼ由来のＤＮＡ結合ドメインも又、非相同ヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）由来の切断ドメインに作動可能に連結されている。

他の実施形態において、ヌクレアーゼは亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）又はＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインヌクレアーゼ融合物（ＴＡＬＥＮ）である。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは選択された遺伝子の標的部位及び切断ドメイン又は切断ハーフドメインに結合するように操作されているＤＮＡ結合ドメイン（亜鉛フィンガー蛋白質又はＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン）を含む。

上記詳述した通り、亜鉛フィンガー結合ドメイン及びＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作されることができる。例えばBeerli等、(2002)Nature Biotechnol.20:135-141;Pabo等、(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalan等、(2001)Nature Biotechnol.19:656-660;Segal等、(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Choo等、(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416を参照のこと。操作された亜鉛フィンガー結合ドメイン又はＴＡＬＥ蛋白質は天然に存在する蛋白質と比較して新しい結合特異性を有することができる。操作方法は合理的設計及び種々の型の選択を包含するがこれらに限定されない。合理的設計は例えばトリプレット(又はクアドルプレット）のヌクレオチド配列及び個々の亜鉛フィンガー又はＴＡＬＥアミノ酸配列を含むデータベースを用いることを包含し、その場合、各トリプレット又はクアドルプレットのヌクレオチド配列は特定のトリプレット又はクアドルプレットの配列に結合する亜鉛フィンガー又はＴＡＬＥリピート単位のアミノ酸配列１つ以上と会合している。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる共有米国特許６，４５３，２４２及び６，５３４，２６１を参照のこと。

例となる選択方法、例えばファージディスプレイ及びツーハイブリッド系は米国特許５，７８９，５３８；５，９２５，５２３；６，００７，９８８；６，０１３，４５３；６，４１０，２４８；６，１４０，４６６；６，２００，７５９；及び６，２４２，５６８；並びにＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７及びＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。更に又、亜鉛フィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば共有されているＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。

標的部位の選択；及び融合蛋白質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築のための方法は当該分野で知られており、そして参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願２００５００６４４７４及び２００６０１８８９８７に詳述されている。

更に又、上記及び他の参考文献に開示されている通り、亜鉛フィンガードメイン、ＴＡＬＥ及びマルチフィンガーの亜鉛フィンガー蛋白質は、例えば５アミノ酸長以上のリンカーを包含する何れかの適切なリンカー配列を用いて共に連結してよい。（例えばＴＧＥＫＰ（配列番号１３１）、ＴＧＧＱＲＰ（配列番号１３２）、ＴＧＱＫＰ（配列番号１３３）及び／又はＴＧＳＱＫＰ（配列番号１３４））。６アミノ酸長以上の例となるリンカー配列は例えば米国特許６，４７９，６２６；６，９０３，１８５；及び７，１５３，９４９を参照のこと。本明細書に記載する蛋白質は、蛋白質の個々の亜鉛フィンガーの間の適当なリンカーの何れの組み合わせも包含してよい。また、米国特許暫定出願６１／３４３，７２９も参照のこと。

ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及び／又はメガヌクレアーゼのようなヌクレアーゼは又、ヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断ハーフドメイン）を含む。上記の通り、切断ドメインはＤＮＡ結合ドメイン、例えば亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びヌクレアーゼ由来の切断ドメイン又はメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン及び異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインに対して非相同であってよい。非相同切断ドメインは何れのエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼからも得ることができる。切断ドメインの誘導元となり得る例となるエンドヌクレアーゼは制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼを包含するがこれらに限定されない。例えば2002-2003 Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA;and Belfort等、(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388を参照のこと。ＤＮＡを切断する追加的酵素も知られている（例えばＳ１ヌクレアーゼ;大豆ヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅＩ；マイクロコッカスヌクレアーゼ；コウボＨＯエンドヌクレアーゼ；同様にLinn等、(eds.)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照のこと）。これらの酵素（又はその機能性フラグメント）の１つ以上を切断ドメイン及び切断ハーフドメインの原料として使用できる。

同様に、切断活性のためには２量体化を必要とする上記の様な何れのヌクレアーゼ又はその部分からも、切断ハーフドメインを誘導することができる。一般的に、融合蛋白質が切断ハーフドメインを含む場合には、２つの融合蛋白質が切断のために必要になる。或いは、２つの切断ハーフドメインを含む単一の蛋白質を使用できる。２つの切断ハーフドメインを同じエンドヌクレアーゼ（又はその機能性フラグメント）から誘導することができ、又は、各切断ハーフドメインを異なるエンドヌクレアーゼ（又はその機能性フラグメント）から誘導できる。更に又、２つの融合蛋白質に関する標的部位は、２つの融合蛋白質のそれらのそれぞれの標的部位への結合が、切断ハーフドメインが例えば２量体化により機能性切断ドメインを形成できるようになる空間的方向に切断ハーフドメインを配するように、相互に対して好ましく配置される。したがって、ある特定の実施形態において、標的部位の近接端部は５〜８ヌクレオチドにより、又は１５〜１８ヌクレオチドにより隔てられている。しかしながら、何れかの整数個数のヌクレオチド又はヌクレオチド対が２つの標的部位の間に介在することができる（例えば２〜５０ヌクレオチド対以上）。一般的に切断部位は標的部位の間に存在する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合（認識部位において）すること、及び結合部位又はその近傍においてＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えばＩＩＳ型）は認識部位から除去された部位においてＤＮＡを切断し、そして分離可能な結合と切断のドメインを有する。例えばＩＳＳ型酵素であるＦｏｋＩは、１つの鎖上ではその認識部位から９ヌクレオチド、そして他方の上ではその認識部位から１３ヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの２本鎖切断を触媒する。例えば米国特許５，３５６，８０２；５，４３６，１５０及び５，４８７，９９４；並びにLi等、(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279;Li等、(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768;Kim等、(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887;Kim等、(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982を参照のこと。したがって、１つの実施形態において、融合蛋白質は少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素に由来する切断ドメイン（又は切断ハーフドメイン）及び操作されていてもされていなくてもよい１つ以上の亜鉛フィンガー結合ドメインを含む。

切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例となるＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素は２量体として活性である。Bitinaite等、(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570-10,575。従って、本開示の目的のために、開示した融合蛋白質において使用されるＦｏｋＩ酵素の部分が切断ハーフドメインとみなされる。したがって、亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合物を用いた細胞配列の標的化された２本鎖切断及び／又は標的化された置き換えのためには、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合蛋白質を使用することにより触媒的に活性な切断ドメインを再建することができる。或いは、亜鉛フィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子も使用できる。亜鉛フィンガー−ＦｏｋＩ融合物を用いた標的化された切断及び標的化された配列改変のためのパラメーターは本開示において別途記載する。

切断ドメイン又は切断ハーフドメインは切断活性を保持しているか、又は、多量体化（例えば２量体化）することにより機能性切断ドメインを形成する能力を保持している蛋白質の何れの部分でもあることができる。

例となるＩＩＳ型の制限酵素は参照により全体が本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。追加の制限酵素もまた、分離可能な結合と切断のドメインを含有し、そしてこれらは本開示の企図するものである。例えばRoberts等、(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420を参照のこと。

ある特定の実施形態において、切断ドメインは、例えば全ての開示が参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２００５００６４４７４、２００６０１８８９８７及び２００８０１３１９６２に記載されている通り、ホモ２量体化を最小限にするか防止する操作された切断ハーフドメイン（２量体化ドメイン突然変異体とも称する）１つ以上を含む。ＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７及び５３８位のアミノ酸残基は、全てＦｏｋＩ切断ハーフドメインの２量体化に影響するための標的である。

強制的にヘテロ２量体を形成する、例となるＦｏｋＩの操作された切断ハーフドメインは、第１の切断ハーフドメインがＦｏｋＩの４９０及び５３８位のアミノ酸残基における突然変異を包含し、そして第２の切断ハーフドメインがアミノ酸残基４８６及び４９９における突然変異を含む対を包含する。

したがって、１つの実施形態において、４９０における突然変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８における突然変異は（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６における突然変異は（Ｑ）をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；そして４９９における突然変異はＩｓｏ（Ｉ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、本明細書に記載する操作された切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフドメインにおいて４９０（Ｅ→Ｋ）及び５３８（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて“Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ”と標記される操作された切断ハーフドメインを形成することにより、及び、もう１つの切断ハーフドメインにおいては４８６（Ｑ→Ｅ）及び４９９（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて“Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ”と標記される操作された切断ハーフドメインを形成することにより調製した。本明細書に記載する操作された切断ハーフドメインは、異常な切断が最小限とされるか根絶される強制的ヘテロ２量体突然変異体である。例えば参照により開示全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開２００８／０１３１９６２を参照のこと。ある特定の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４８６，４９９及び４９６位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）における突然変異、例えば４８６位の野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基で、４９９位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基で、そして４９６位の野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）又はＧｌｕ（Ｅ）残基（それぞれ「ＥＬＤ」及び「ＥＬＥ」ドメインと称する）で置き換える突然変異を含む。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４９０，５３８及び５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）における突然変異、例えば４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、５３８位の野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、そして５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基又はＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ「ＫＫＫ」及び「ＫＫＲ」ドメインと称する）で置き換える突然変異を含む。他の実施形態において、操作された切断ハーフドメインは、４９０及び５３７位（野生型ＦｏｋＩに対して付番）における突然変異、例えば４９０位の野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基で、そして５３７位の野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基又はＡｒｇ（Ｒ）残基（それぞれ「ＫＩＫ」及び「ＫＩＲ」ドメインと称する）で置き換える突然変異を含む。（米国特許出願１２／９３１，６６０を参照）。

本明細書に記載する操作された切断ハーフドメインは何れかの適当な方法、例えば米国特許２００５００６４４７４及び２００８０１３１９６２に記載されるような野生型切断ハーフドメイン（ＦｏｋＩ）の部位指向性突然変異誘発により調製できる。

或いは、ヌクレアーゼはいわゆる「スプリット酵素」技術を用いて核酸標的部位においてインビボで組み立ててよい（例えば米国特許公開２００９００６８１６４参照)。そのようなスプリット酵素の成分は別個の発現コンストラクト上で発現させてよく、又は、１つのオープンリーディングフレーム中で連結させることができ、その場合、個々の成分は例えば自己切断２Ａペプチド又はＩＲＥＳ配列により分離される。成分は個々の亜鉛フィンガー結合ドメイン又はメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってよい。

ヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮ）は例えばＷＯ２００９／０４２１６３及び２００９００６８１６４に記載の通りコウボ系の染色体系において使用前に活性に関してスクリーニングできる。ヌクレアーゼ発現コンストラクトは当該分野で知られている方法を用いながら容易に設計できる。例えば米国特許公開２００３０２３２４１０；２００５０２０８４８９；２００５００２６１５７；２００５００６４４７４；２００６０１８８９８７；２００６００６３２３１；及び国際公開ＷＯ０７／０１４２７５を参照のこと。ヌクレアーゼの発現は構成プロモーター又は誘導プロモーター、例えばラフィノース及び／又はガラクトースの存在下で活性化（脱抑制）され、そしてグルコースの存在下で抑制されるガラクトキナーゼプロモーターの制御下にあってよい。

送達
本明細書に記載する蛋白質（例えばＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＺＦＮ及び／又はＴＡＬＥＮ）、これらをコードするポリヌクレオチド、及び蛋白質及び／又はポリヌクレオチドを含む組成物は例えば蛋白質又はｍＲＮＡの注射を包含する何れかの適当な手段により標的細胞に送達してよい。適当な細胞は真核生物及び原核生物の細胞及び／又は細胞系統を包含するがこれらに限定されない。そのような細胞又はそのような細胞から形成される細胞系統の非限定的な例はＴ−ｃｅｌｌｓ、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えばＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えばＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、及びｐｅｒＣ６細胞並びに昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、又はカビ細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを包含する。ある特定の実施形態において、細胞系統はＣＨＯ−Ｋ１、ＭＤＣＫ又はＨＥＫ２９３細胞系統である。適当な細胞は又、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、造血幹細胞、ニューロン幹細胞及び間葉系幹細胞を包含する。

本明細書に記載するＤＮＡ結合ドメインを含む蛋白質を送達する方法は例えば全て参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，４５３，２４２；６，５０３，７１７；６，５３４，２６１；６，５９９，６９２；６，６０７，８８２；６，６８９，５５８；６，８２４，９７８；６，９３３，１１３；６，９７９，５３９；７，０１３，２１９；及び７，１６３，８２４に記載されている。

本明細書に記載するＤＮＡ結合ドメイン及びこのようなＤＮＡ結合ドメインを含む融合蛋白質はまた、ＤＮＡ結合蛋白質１つ以上をコードする配列を含有するベクターを用いて送達してよい。更に又、ドナー核酸もまたこれらのベクターを介して送達してよい。プラスミドベクター、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ポックスウィルスベクター；ヘルペスウィルスベクター及びアデノ関連ウィルスベクターを包含するがこれらに限定されない何れかのベクター系を使用してよい。例えば参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許６，５３４，２６１；６，６０７，８８２；６，８２４，９７８；６，９３３，１１３；６，９７９，５３９；７，０１３，２１９；及び７，１６３，８２４も参照のこと。更に当然ながら、これらのベクターの何れも１つ以上のＤＮＡ結合蛋白質コード配列及び／又はドナー核酸を適宜含んでよい。したがって、本明細書に記載するＤＮＡ結合蛋白質１つ以上及び適宜ドナーＤＮＡを細胞内に導入する場合、それらは同じベクター上、又は異なるベクター上に担持されていてよい。多数のベクターを使用する場合、各ベクターは所望に応じて１つ又は多数のＤＮＡ結合蛋白質をコードする配列及びドナー核酸を含んでよい。

従来のウィルス及び非ウィルス系の遺伝子転移方法を用いて、細胞（例えば哺乳類細胞）及び標的組織中に操作されたＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸を導入し、そして所望によりドナーを同時導入することができる。そのような方法は又、インビトロで細胞にＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸を投与するためにも使用できる。ある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸をインビボ又はエクスビボの遺伝子療法用途において投与する。非ウィルスベクター送達系はＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸及びリポソーム又はポロキサマーのような送達ベヒクルと複合体化した核酸を包含する。ウィルスベクター送達系はＤＮＡ及びＲＮＡウィルスを包含し、これらは細胞への送達後はエピソーム又は組み込まれたゲノムの何れかを有する。遺伝子療法の操作法の考察に関してはAnderson,Science 256:808-813(1992);Nabel & Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani & Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993);Miller,Nature 357:455-460(1992);Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988);Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995);Kremer & Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995);Haddada等、Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm(eds.)(1995)；及びYu等、Gene Therapy 1:13-26(1994)を参照のこと。

核酸の非ウィルス送達の方法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質；核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及びＤＮＡの剤増強取り込みを包含する。例えばＳｏｎｉｔｒｏｎ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いたソノポレーションもまた核酸の送達のために使用できる。

追加の例となる核酸送達系はＡｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ，（例えばＵＳ６００８３３６参照）により提供されるものを包含する。リポフェクションは例えば米国特許５，０４９，３８６、４，９４６，７８７及び４，８９７，３５５に記載されており、そしてリポフェクション試薬は市販されている（例えばＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ^TM及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^TM）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適するカチオン性及び中性の脂質はFelgner、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４に記載のものを包含する。送達は細胞に対して（エクスビボ投与）又は標的組織に対して（インビボ投与）行うことができる。

イムノ脂質複合体のような標的化されたリポソームを包含する脂質：核酸複合体の調製は当該分野で良く知られている（例えばCrystal,Science 270:404-410(1995);Blaese等、Cancer Gene Ther.2:291-297(1995);Behr等、Bioconjugate Chem.5:382-389(1994);Remy等、Bioconjugate Chem.5:647-654(1994);Gao等、Gene Therapy 2:710-722(1995);Ahmad等、Cancer Res.52:4817-4820(1992)；米国特許４，１８６，１８３号、４，２１７，３４４号、４，２３５，８７１号、４，２６１，９７５号、４，４８５，０５４号、４，５０１，７２８号、４，７７４，０８５号、４，８３７，０２８号及び４，９４６，７８７を参照のこと）。

送達のさらなる方法はＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ベヒクル（ＥＤＶ）内に送達すべき核酸をパッケージングする使用法を包含する。これらのＥＤＶは、抗体の１つのアームが標的組織に対する特異性を有し、そして他方がＥＤＶに対する特異性を有している二重特異性抗体を用いて標的組織に特異的に送達される。抗体は標的細胞表面にＥＤＶを運び、そして次にＥＤＶがエンドサイトーシスにより細胞内に持ち込まれる。細胞内に入ると、内容物が放出される（MacDiarmid等、(2009)Nature Biotechnology vol 27(7)p.643参照）。

操作されたＤＮＡ結合蛋白質をコードする核酸及び所望によりドナーの送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウィルスに基づく系の使用は、身体の特定の細胞にウィルスを標的化し、そしてウィルス担持物を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用している。ウィルスベクターは患者に直接投与されることができ（インビボ）、又は、それらはインビトロで細胞を処理して、修飾された細胞を患者に投与するするために使用されることもできる（エクスビボ）。ＤＮＡ結合蛋白質及びドナーの送達のための従来のウィルスに基づく系は、遺伝子転移用の、レトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、アデノ関連、ワクシニア及び単純疱疹ウィルスのベクターを包含するがこれらに限定されない。宿主ゲノム中の組み込みはレトロウィルス、レンチウィルス、及びアデノ関連ウィルスの遺伝子転移方法を用いて可能となり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期間の発現がもたらされる。更に又、高い形質導入効率が多くの種々異なる細胞型及び標的組織において観察されている。

レトロウィルスの向性を外来性のエンベロープ蛋白質を取り込むことにより改変し、標的細胞の可能性のある標的集団を拡大させることができる。レンチウィルスベクターは非分裂細胞に形質導入又は感染し、そして典型的には高いウィルス力価をもたらすことができるレトロウィルスベクターである。レトロウィルス遺伝子転移系の選択は標的組織に依存する。レトロウィルスベクターは外来性の配列６〜１０ｋｂまでのパッケージング容量を有するシス作用の長末端リピートを含む。最小のシス作用ＬＴＲが、後に治療遺伝子を標的細胞に組み込んで永久的な導入遺伝子発現をもたらすために使用されるベクターの複製及びパッケージングのために十分である。広範に使用されているレトロウィルスベクターはネズミ白血病ウィルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウィルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、及びこれらの組み合わせに基づくものを包含する（例えばBuchscher等、J.Virol.66:2731-2739(1992);Johann等、J.Virol.66:1635-1640(1992);Sommerfelt等、Virol.176:58-59(1990);Wilson等、J.Virol.63:2374-2378(1989);Miller等、J.Virol.65:2220-2224(1991);ＰＣＴ/ＵＳ９４/０５７００参照）。

一過性の発現が好ましい用途においては、アデノウィルスに基づく系を使用できる。アデノウィルス系ベクターは多くの細胞型において極めて高い形質導入効率を示すことができ、そして細胞分裂を要しない。そのようなベクターを使用して、高い力価及び高い発現レベルが得られている。このベクターは比較的簡素な系において大量に生産できる。アデノ関連ウィルス（「ＡＡＶ」）ベクターもまた例えば、核酸及びペプチドのインビトロの生産において、および、インビボ及びエクスビボの遺伝子療法の操作法のために、標的核酸を有する細胞を形質導入するために使用される（例えばWest等、Virology 160:38-47(1987);米国特許４，７９７，３６８;ＷＯ９３/２４６４１;Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994);Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)を参照のこと）。組み換えＡＡＶベクターの構築は多くの公開文献、例えば米国特許５，１７３，４１４;Tratschin等、Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985);Tratschin,等、Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984);Hermonat & Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984);及びSamulski等、J.Virol.63:03822-3828(1989)に記載されている。

少なくとも６種のウィルスベクターの手順が臨床治験において遺伝子転移のために使用可能であり、これらは形質導入剤を形成するためにヘルパー細胞系統に挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補が関与する手順を利用している。

ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ-Ｓは臨床治験において使用されているレトロウィルスベクターの例である（Dunbar等、Blood 85:3048-305(1995);Kohn等、Nat.Med.1:1017-102(1995);Malech等、PNAS 94:22 12133-12138(1997)）。ＰＡ３１７/ｐＬＡＳＮは遺伝子療法治験において使用された最初の治療用ベクターである（Blaese等、Science 270:475-480(1995)）。５０％以上の形質導入効率がＭＦＧ−Ｓパッケージベクターで観察されている（Ellem等、Immunol Immunother.44(1):10-20(1997);Dranoff等、Hum.Gene Ther.1:111-2(1997)）。

組み換えアデノ関連ウィルスベクター（ｒＡＡＶ）は欠損性及び非病原性のパルボウィルスアデノ関連２型ウィルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ１４５ｂｐ逆位末端リピートのみを保有しているプラスミドから誘導される。形質導入された細胞のゲノム内への組み込みによる効率的な遺伝子転移及び安定な導入遺伝子送達がこのベクター系の重要な特徴である（Wagner等、Lancet 351:9117 1702-3(1998),Kearns等、Gene Ther.9:748-55(1996)）。他のＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６，ＡＡＶ８、ＡＡＶ９及びＡＡＶ１０もまた本発明に従って使用できる。

複製欠損組み換えアデノウィルスベクター（Ａｄ）は高い力価で生産することができ、そして多くの異なる種類の細胞型に容易に感染する。大部分のアデノウィルスベクターは導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作されており；その後、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞中で複製欠損ベクターを増殖させる。Ａｄベクターは肝臓、腎臓及び筋肉中に検出されるもののような非分裂性の分化した細胞を包含するインビボの組織の多数の方を形質導入することができる。従来のＡｄベクターは大量の担持容量を有する。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法に関与した（Sterman等、Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998)）。臨床治験における遺伝子転移のためのアデノウィルスベクターの使用の追加の例はRosenecker等、Infection 24:1 5-10(1996);Sterman等、Hum.Gene Ther.9:7 1083-1089(1998);Welsh等、Hum.Gene Ther.2:205-18(1995);Alvarez等、Hum.Gene Ther.5:597-613(1997);Topf等、Gene Ther.5:507-513(1998);Sterman等、Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)を包含する。

宿主細胞に感染できるウィルス粒子を形成するためにパッケージング細胞を使用する。そのような細胞はアデノウィルスをパッケージする２９３細胞、及びレトロウィルスをパッケージするψ２細胞又はＰＡ３１７細胞を包含する。遺伝子療法に使用されるウィルスベクターは通常はウィルス粒子内に核酸ベクターをパッケージするプロデューサー細胞系統により形成される。ベクターは典型的にはパッケージング及びその後の宿主への組み込み（適宜）のために必要な最小限のウィルス配列を含有し、その他のウィルス配列は発現すべき蛋白質をコードする発現カセットにより置き換えられている。失われたウィルス機能はパッケージング細胞系統によりトランスに供給される。例えば遺伝子療法において使用されるＡＡＶは典型的には、パッケージング及び宿主ゲノム内への組み込みのために必要なＡＡＶゲノム由来の逆位末端リピート（ＩＴＲ）を保有するのみである。ウィルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ちｒｅｐ及びｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含有するがＩＴＲ配列を欠いている細胞系統中にパッケージされる。細胞系統は又ヘルパーとしてのアデノウィルスによっても感染される。ヘルパーウィルスはＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠いているために意味のある量ではパッケージされない。アデノウィルスの夾雑は例えばＡＡＶよりもアデノウィルスがより感受性である熱処理により低減できる。

多くの遺伝子療法用途において、遺伝子療法ベクターは特定の組織型に対して高度な特異性を持って送達されることが望ましい。従って、ウィルスベクターはウィルスの外表面上のウィルス皮膜蛋白質との融合蛋白質としてリガンドを発現することにより所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾できる。リガンドは目的の細胞型の上に存在することがわかっている受容体に対する親和性を有するように選択される。例えばHan等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)は、モロニーネズミ白血病ウィルスはｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように修飾でき、そして組み換えウィルスは、ヒト表皮成長因子受容体を発現している特定のヒト乳癌細胞に感染すると報告している。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、そしてウィルスが細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合蛋白質を発現する他のウィルス−標的細胞の対にも拡張することができる。例えば、実質的に如何なる選択された細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体フラグメント（例えばＦＡＢ又はＦｖ）をディスプレイするように糸状ファージを操作することができる。上記は主にウィルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウィルスベクターに対しても適用できる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みに好都合である特異的取り込み配列を含有するように操作されることができる。

遺伝子療法ベクターは典型的には、後述するとおり、全身投与（例えば静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、又は頭蓋内の注入）又は局所適用による個別の患者への投与によりインビボで送達できる。或いは、ベクターは個別患者から体外移植された細胞（例えばリンパ球、骨髄吸引物、組織生検物）、又は、ユニバーサルドナーの造血幹細胞のようなエクスビボの細胞に送達することができ、その後、通常はベクターを組み込んだ細胞を選択した後に、患者内に細胞を再移植する。

診断、研究、移植又は遺伝子療法のためのエクスビボの細胞トランスフェクション（例えば宿主生物内へのトランスフェクトされた細胞の再注入を介する）は当該分野で良く知られている。好ましい実施形態においては、細胞を対象生物から単離し、ＤＮＡ結合蛋白質核酸（遺伝子又はｃＤＮＡ）でトランスフェクトし、そして対象生物（例えば患者）内に再注入により戻す。エクスビボトランスフェクションに適する種々の細胞型は当該分野で良く知られいる（患者由来の細胞をどのように単離して培養するかに関する考察については例えばFreshney等、Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique(3rd ed.1994)及びその引用文献を参照）。

１つの実施形態においては、細胞トランスフェクション及び遺伝子療法のためのエクスビボの操作法において幹細胞を使用する。幹細胞を使用することの利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができる、又は、それらが哺乳類（例えば細胞のドナー）内に導入され、そこでそれらが骨髄中に定着することになることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのようなサイトカインを用いた臨床上重要な免疫細胞型にインビトロのＣＤ３４＋細胞を分化させるための方法は知られている（例えばInaba等、J.Exp.Med.176:1693-1702(1992)参照）。

幹細胞は知られた方法を用いて形質導入及び分化のために単離できる。例えば幹細胞はＣＤ４＋及びＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、及びＩａｄ（分化した抗原提示細胞)のような望ましくない細胞に結合する抗体を用いて骨髄細胞をパニングすることにより骨髄細胞から単離される（Inaba等、J.Exp.Med.176:1693-1702(1992)参照）。

修飾されている幹細胞もまたいくつかの実施形態において使用され得る。例えば、アポトーシスに対して耐性とされているニューロン幹細胞を治療用組成物として使用してよく、その場合、幹細胞も本発明のＺＦＰＴＦを含有している。アポトーシスに対する耐性は例えば、幹細胞においてＢＡＸ−又はＢＡＫ−特異的ＺＦＮを用いてＢＡＸ及び／又はＢＡＫをノックアウトすること（米国特許出願１２／４５６，０４３参照）により生じさせるか、又は例えばここでもカスパーゼ−６特異的ＺＦＮを用いてカスパーゼを撹乱させたものであってよい。このような細胞はＨＬＡを調節することがわかっているＺＦＰ ＴＦでトランスフェクトすることができる。

治療用ＤＮＡ結合蛋白質（又はそのような蛋白質をコードする核酸）を含有するベクター（例えばレトロウィルス、アデノウィルス、リポソーム等）は又、インビボの細胞の形質導入のために生物に直接投与できる。或いは、ネイキッドＤＮＡを投与できる。投与は注射、注入、局所適用及びエレクトロポレーションを包含するがこれらに限定されない血液又は組織細胞との究極的接触に分子を導くために通常使用される経路の何れかによる。そのような核酸を投与する適当な方法は当業者が使用でき、そして良く知られているものであり、そして特定の組成物を投与するために１つより多い経路を使用できるが、特定の経路が別の経路よりも迅速で効果的な反応を可能にする場合が多い。

造血幹細胞にＤＮＡを導入するための方法は、例えば米国特許５，９２８，６３８に開示されている。造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞内への導入遺伝子の導入に適するベクターはアデノウィルス３５型を包含する。

免疫細胞（例えばＴ細胞）内への導入遺伝子の導入に適するベクターは非組み込みレンチウィルスベクターを包含する。例えばOry等、(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11382-11388;Dull等、(1998)J.Virol.72:8463-8471;Zuffery等、(1998)J.Virol.72:9873-9880;Follenzi等、(2000)Nature Genetics 25:217-222を参照のこと。

製薬上許容しうる担体は部分的には投与される特定の組成物により、並びに組成物を投与するために使用される特定の方法により決定される。従って、後述する通り使用可能な医薬組成物の適当な製剤は広範な種類が存在する（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,1989を参照のこと）。

上記の通り、開示した方法及び組成物は、原核生物細胞、カビ細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳類細胞及びヒト細胞、例えばＴ細胞及び何れかの型の幹細胞を包含するがこれらに限定されない細胞の何れかの型においても使用できる。蛋白質発現のための適当な細胞系統は当該分野で知られており、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、昆虫細胞、例えばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）、及びカビ細胞、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを包含するがこれらに限定されない。これらの細胞系統の子孫、変異体及び誘導体もまた使用できる。

用途
開示された組成物及び方法はＨＬＡ遺伝子及び／又はＨＬＡレギュレーターを調節することが望ましい何れの用途のためにも使用できる。特に、これらの方法及び組成物は、治療及び研究用途を包含するがこれらに限定されないＨＬＡ対立遺伝子の調節又は修飾が望ましい場合に使用できる。

ＨＬＡに関連する疾患及び状態は、特にアジソン病、強直性脊椎炎、ベーチェット病、バーガー病、セリアック病、慢性活動性肝炎、グレーブズ病、若年性慢性関節リューマチ、乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リューマチ、シェーグレン症候群、及び全身エリテマトーデスを包含する。更に又、ＨＬＡ遺伝子の修飾は目的の細胞の他の遺伝子修飾と組み合わせて有用である場合がある。例えば標的細胞、例えばＣＴＬの、キメラ抗原受容体を用いたＣＴＬの特異性を変化させるための修飾は、大部分の必要患者で使用し得る細胞治療薬を開発するためにエクスビボのＨＬＡ修飾と組み合わせてよい。

更に又、本発明の物質及び方法は対宿主性移植片病の治療、予防又は改善において使用できる。対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）は同種異系Ｔ細胞（例えば骨髄及び／又は血液の輸液）を患者に投与する場合の一般的な合併症である。注入された物質中の機能性免疫細胞はレシピエントを「外来性」と認識し、免疫学的攻撃を仕掛ける。同種異系Ｔ細胞におけるＨＬＡ及び／又はＴＣＲの発現を調節することにより、対宿主性移植片病の危険性が低減又は排除されるため、「薬物」として「既製」のＴ細胞（例えばＣＤ１９−特異的Ｔ細胞）を要時投与できる。

方法及び組成物は又、幹細胞内部のＨＬＡ対立遺伝子のコピーがＨＬＡ特異的又はＨＬＡレギュレーター特異的なＺＦＮを用いて修飾されている幹細胞組成物を包含する。例えば、ＨＬＡ修飾された造血幹細胞を骨髄剥離後の患者内に導入できる。これらの改変されたＨＳＣは拒絶に起因する移植片の損失を伴うことなく患者の再コロニー化を可能にする。導入された細胞は又、後の療法（例えば化学療法耐性）の間、伏在する疾患を治療するために役立つ他の改変も有してよい。

本発明の方法及び組成物は又、例えば治療薬として使用するためのＨＬＡ修飾血小板の開発のためにも有用である。したがって、ＨＬＡ修飾血小板は血小板減少性の障害、例えば特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病及び薬物誘導性血小板減少性紫斑病（例えばヘパリン誘導性血小板減少症）を治療するために使用してよい。本発明のＨＬＡ修飾血小板で治療してよい他の血小板障害はゴシェ病、再生不良性貧血、オニアライ、胎児母体同種異型免疫性血小板減少症、ヘルプ症候群、癌及びいくつかの化学療法剤の副作用を包含する。ＨＬＡ修飾血小板は又、外傷患者の緊急救命室状況における「既製」治療として使用される。

本発明の方法及び組成物は異種移植において使用できる。とりわけ、例示に過ぎないが、ブタＭＨＣ遺伝子が欠失及び／又はヒトＨＬＡ遺伝子で置き換えられているブタの臓器をヒトへの移植に使用することができる。有用な遺伝子突然変異を含有するブタの系統を発生させることができ（内因性ＭＨＣ遺伝子が撹乱するように自身内に注入されているｍＲＮＡによりコードされるＨＬＡターゲティングＺＦＮを有していたブタ胚から、又は、自身のＨＬＡ遺伝子を良好にターゲティングされている細胞の核を用いたブタ胚内への体細胞核転移により）、これらの動物を最終的臓器採取のために育成してよい。これはヒトにおけるこれらの臓器の拒絶を予防し、そして移植成功の可能性を高めることになる。

本発明の方法及び組成物はまた、インビトロ及びインビボのモデル、例えばＨＬＡ又は他の障害の研究を可能にするそのような障害の動物モデルの設計及び実施のためにも有用である。

実施例１：亜鉛フィンガー蛋白質ヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の設計、構築及び一般の特徴付け
本質的にUrnov等、(2005)Nature 435(7042):646-651,Perez等、(2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816に記載の通り、そして米国特許６，５３４，２６１に記載の通り、亜鉛フィンガー蛋白質を設計し、そしてプラスミド又はアデノウィルスベクターに取り込んだ。更に又、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣに標的化されたＺＦＮに関しては米国特許仮出願６１/２８０，８６３を参照のこと。表１は例となるＺＦＰのＤＮＡ結合ドメイン内部の認識ヘリックスを示し、表２はこれらのＺＦＰに関する標的部位を示す。ＺＦＰ認識ヘリックスにより接触される標的部位中のヌクレオチドは大文字で示し；非接触ヌクレオチドは小文字で示す。

実施例２：ＨＬＡクラスＩ遺伝子に特異的なＺＦＮ
ＨＬＡ複合体はゲノムの同じ一般的区域内部に同時局在化する数種のファミリーメンバーを含有する場合が多い。図１はＨＬＡクラスＩの主な遺伝子の配置及び染色体６上に観察されるクラスＩの遺伝子座の模式図である。
ＨＬＡ遺伝子座に対して指向されたＺＦＮ

ＨＬＡＡ遺伝子座を標的とするためにＺＦＮ対を作成し、いくつかはＡ２対立遺伝子に対して特異的に作成し、他はＡ３遺伝子座又は両方を標的とするように作成した。Ａ２及びＡ３対立遺伝仔に関して、ＺＦＮ１８８８９が１８８８１と対になり、そして１８８８９もまた２４８５９と対になるように２つの対を試験した。ＺＦＮの対形成の成功により所望の箇所においてＤＳＢが形成されれば、その部位は非相同末端連結（ＮＨＥＪ）を用いて頻繁に修復される。このプロセスは頻繁には修復された接合の部位におけるヌクレオチドの少数の挿入又は欠失をもたらし、そのため、接合部周辺のＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、そして次にそれぞれのプライマーで増幅された産物を用いて例えば米国特許公開２００８００１５１６４；２００８０１３１９６２及び２００８０１５９９９６（Ｓｕｒｖｅｙｏｒ^TM、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）に記載の通りＣｅｌ−Ｉミスマッチアッセイに付した場合、これらの挿入又は欠失（まとめて「ｉｎｄｅｌ」と称する）の頻度は、アッセイの産物をゲル電気泳動に付せば計算することができる。したがって、Ａ２／Ａ３特異的対をそれらの標的に対する活性に関してＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて検査した。示すように細胞をＧＦＰ対照又はＺＦＮの対の各々によりトランスフェクトした。ＤＮＡはトランスフェクション一日後に細胞から調製し、結果を図２に示す。矢印は、ＺＦＮ対を含有する試料のみにおいて切断が観察され、ＧＦＰに対して特異的なＺＦＮで細胞をトランスフェクトした対照試料では観察されなかったことを示している。遺伝子修飾率を各レーン下部に示す。

ＨＥＫ２９３細胞内にＺＦＮをコードするプラスミドをトランスフェクトした場合、１８８８９／１８８８１対は約３％の遺伝子修飾を示したのに対し、１８８８９／２４８５９対はＨＬＡＡ２遺伝子に対して約６％のＮＨＥＪを示した。Ａ３対立遺伝子に関しては、１８８８９／１８８８１対は９％を示し、そして１８８８９／２４８５９対は１０％ＮＨＥＪ活性を示した。これらの対はＡ２及びＡ３対立遺伝子の両方を切断することができるため、Ａ２／Ａ３ダブルノックアウト細胞系統を形成することが可能である。

細胞表面上のＨＬＡＡマーカーの存在を標準的なＦＡＣＳ分析により分析した。要するに、Ａ２、Ａ３又はＡ２、Ａ３が撹乱されるＨＥＫ２９３細胞は染色された。ＨＬＡ−Ａ２染色は抗ＨＬＡ−Ａ２ＰＥ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、クローンＢＢ７．２）により実施した。マウスＩｇＧ２ｂｋＰＥ（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）をアイソタイプ対照のために使用した。ＨＬＡ−Ａ３に関しては、本発明者等は先ずこれらの細胞をビオチニル化抗ＨＬＡ−Ａ３Ａｂ（Ａｂｃａｍ、クローン４ｉ５３）で、次にＳＡ−ＰＥ（ＢＤ）で染色した。各実験の陰性対照は、ＨＬＡ−Ａ３Ａｂ非存在でのＨＬＡ−Ａ２−ｉｇＧ２ｂＫＰＥ、ＨＬＡ−Ａ３−ＳＡ−ＰＥ染色とした。

これらの実験において、全試料で一定である黒線として図中に結果を示した上記アイソタイプ対照抗体を用いて陽性対照を実施した。次に４８時間ＩＦＮガンマ（６００ＩＵ／ｍＬ）＋ＴＮＦ（１０ｍｇ／ｍＬ）を添加することにより培養物のＨＬＡ発現を刺激するか、又は刺激非存在下に使用した。

図３に示す通り、アイソタイプ対照ピークに最も近い線は刺激を欠く試料であり、シフトしたピークはＩＦＮγ及びＴＮＦの存在下のものである（図の凡例参照）。左側のコラムの図のセットは全て、抗ＨＬＡＡ２抗体でプローブし、右側コラムのものは抗ＨＬＡＡ３抗体でプローブされている。示すとおり、示されているＨＬＡマーカーは相当するＨＬＡ遺伝子が機能的に撹乱されている場合にはもはや検出不可能である。

次に、ＨＬＡＡノックアウトＨＥＫ２９３細胞系統を分析することにより、それらがＨＬＡ−Ａ制限ＣＴＬ細胞系統により溶解できるか調べた。これらの実験のための方法は以下の通りである。標的細胞を２時間０．１ｍＣｉの⁵¹Ｃｒで標識した。１０％ＦＢＳ添加氷冷ＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄した後、標識細胞を希釈し、そして９６穴のｖ底プレート中ウェル当たり１ｘ１０³標的細胞／１００μＬで分注した。ペプチドの１０倍連続希釈物と共に室温で３０分間インキュベートした後、示すエフェクター標的比でＣＴＬを添加した。３７℃の５％ＣＯ₂インキュベーターで４時間インキュベートした後、５０μＬの上澄みを収集し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上で計数した。全てのアッセイを３連で実施した。親ＨＥＫ２９３細胞系統及びＨＬＡノックダウンＨＥＫ２９３クローンに、アッセイ前４８時間、６００ＩＵ／ｍＬのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（商標登録））及び１０ｎｇ／ｍＬの組織壊死因子−α（ＴＮＦ−α；Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ（商標登録））を投与した。特異的溶解率（％）を以下の通り計算した：（（実験ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−自発的ｃｐｍ））×１００。これらの例においては、ペプチド抗原標的を添加することにより、何れかの機能性のＨＬＡクラスＩ複合体によるディスプレイを行い、そして機能性のＨＬＡＡ−ペプチド複合体の存在下においては、ＣＴＬクローンは細胞を攻撃して溶解を誘発することができる。

図４に示す通り、Ａ２又はＡ３ＨＬＡマーカーを欠失しているＨＥＫ２９３クローンは、それらの同族体ペプチド抗原の存在下で、７Ａ７ＰＡＮＥ１／Ａ３ＣＴＬクローン（パネルＡ）又はＧＡＳ２Ｂ３−５Ｃ１９ＯＲＦ４８／Ａ２ＣＴＬクローン（パネルＢ）の何れかにより誘導される溶解に対して耐性であった。

ＺＦＮ媒介ＨＬＡノックアウトを一次Ｔ細胞において反復した。１８８８９（ＫＫＲ ＦｏｋＩ変異体含有）及び２４８５９（ＥＬＤ ＦｏｋＩ変異体含有）ＺＦＮをコードするｍＲＮＡを以下の通りホモ接合のＨＬＡＡ２遺伝子型の一次Ｔ細胞内にヌクレオフェクトした。製造元（Ｌｏｎｚａ）により供給された１００μＬ中反応当たり各ｍＲＮＡ２．５〜１０μｇを用い、ＺＦＮコードｍＲＮＡでＡｍａｘａＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標登録）システム（プログラムＴ２０）を使用して、５ｘ１０⁶の一次Ｔ細胞（標準的方法により単離）をヌクレオフェクトした。これらの細胞を次にＦＡＣＳ分析することにより、ＨＬＡ Ａ２マーカーが細胞表面上に存在するかどうか、標準的方法により分析した。

図５に示す通り、ＨＬＡ−Ａ発現を欠失している細胞のパーセントはこの投与の後に約１９〜４２％の範囲となった。図５Ａは標準的投与条件下のＨＬＡ−Ａ２欠失細胞のパーセントを示し、図５Ｂは「一過性コールドショック」投与条件を用いたＨＬＡ−Ａ２欠失細胞のパーセントを示す（共有米国特許出願１２／８００，５９９参照）。

更に又、本発明者等はＨＬＡ−Ａ２発現の消失は、ＨＬＡ−Ａ２遺伝子のＺＦＮ媒介修飾により誘発されたことを、前述のＣｅｌ−Ｉ分析により確認した。図６はＣｅｌ−Ｉのデータを示しており、ここではＺＦＮ標的部位で決定されたパーセントＮＨＥＪ活性は３〜２８％の範囲であった。この図において、「ｗｔ」は野生型ＦｏｋＩドメインを指し、「ｍｕｔ」は上記のＥＬ／ＫＫＦｏｋＩ突然変異体対を指す。これらのデータは、本発明の方法及び組成物を、ＨＬＡ Ａ発現を欠失させ、そしてＨＬＡ Ａヌル細胞系統及び一次Ｔ細胞を作成するために使用できることを明らかにしている。

ＨＬＡＡノックアウト細胞を富化することにより存在するＨＬＡ Ａヌル細胞の比率を上昇させることができる。細胞の低比率がＨＬＡ ＡヌルであるＺＦＮにより処理したＴ細胞の集団を、フィコエリスリン（ＰＥ）をタグ付け下抗ＨＬＡ−Ａ２抗体（ＢＤＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓクローン７．２）で処理した。次に抗ＰＥ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）をタグ付けしたビーズを用いて、製造元の指示に従ってＨＬＡ−Ａ２を発現する細胞に結合させ、これによりＨＬＡ−Ａ２ヌル細胞から分離した。この手法を用いると、細胞集団は、ＦＡＣＳ分析でアッセイした場合に、５．１〜３４％ＨＬＡ Ａヌル細胞の範囲から９２〜９５％ＨＬＡ Ａ２ヌルの範囲となった。
ＨＬＡ Ｂ及びＣ遺伝子座に指向されたＺＦＮ

ＨＬＡＢ及びＣの遺伝子座を標的とするためにＺＦＮを構築し、そして上記の通りＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて試験した。

図７に示す通り、これらのＺＦＮはこれらの遺伝子の両方の内部において遺伝子修飾を良好に誘導することができた（ＺＦＮ２５５８８／２５５８９を用いたＨＬＡＣノックアウトはパネルＡに示し、パネルＢのＨＬＡＢノックアウトはＺＦＮ対２５３１６／２５３１７を用いて作成した）。これらの標的は遺伝子配列の内部に所在し、そのため、ＨＬＡＢ及びＨＬＡＣノックアウトクローンを作成するために使用できる。

ＭＨＣクラスＩ複合体の大型欠失
ＺＦＮはまた、ＨＬＡＢ及びＨＬＡＣ遺伝子を同時に欠失させるＨＬＡクラスＩ遺伝子座による大型欠失を可能にするように設計した。ＺＦＮのこれらのセットは、ＨＬＡＢ遺伝子の上流（ＨＬＡＢ−ｕｐ）及びＨＬＡＣ遺伝子の下流（ＨＬＡＣ−ｄｏｗｎ）を切断するように設計した。これらのＺＦＮ対は、ＮＨＥＪ活性によりアッセイした場合の切断の程度を調べるために、上記の通りＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて個別に試験した。

図８ＡはｗｔＦｏｋＩドメイン（ｗｔ）及びＥＬ／ＫＫＦｏｋＩドメイン（ｍｕｔ）の両方について、対１５２９６／１５２９８に関するＨＬＡＣ−ｄｏｗｎの結果を示す。図８ＢはＫ５６２細胞におけるＨＬＡＢ−ｕｐ対１５２６７／１５２６５及び１７４５４／１７４５６に関する同様のセットのデータを示す。遺伝子修飾率をレーン下部に示す（「％ＮＨＥＪ」）。これらのＺＦＮを次に使用して、ＺＦＮ、これらの２つのセットの組み合わせによりＨＬＡＢ及びＨＬＡＣ遺伝子を欠失させることができるかどうかを試験した。図９は使用したアッセイのダイアグラムを示し（パネルＡ）、そして又、ＰＣＲの結果を示す（パネルＢ）。Ｋ５６２細胞を２つのセットのＺＦＮでトランスフェクトし、そして示すようにトランスフェクション後３〜１０日に細胞からＤＮＡを単離した。

図９Ａに示す通りＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃの間の領域に隣接するするプライマーを用いてＰＣＲを実施した。良好な二重欠失により大量のＤＮＡ（約１００Ｋｂ）が欠失するはずであるため、ＰＣＲ反応は欠失が生じている場合にのみ成功することとなる。図９Ｂは２つのＺＦＮ対で処理した後のＰＣＲ反応によるゲルを示す。ゲルの左側はゲルの右側に存在する欠失ＰＣＲ産物の量の大まかな定量のために使用するプラスミドの連続希釈物を示す。この図において、「ｗｔ」は野生型のＦｏｋＩドメインを指し、「ｍｕｔ」はＥＬ／ＫＫＦｏｋＩ突然変異体対を指す。結果は存在するＤＮＡの約５％が欠失を含有していたことを示している。

この実験から誘導されたクローンを、クラスＩ複合体全体、及び特にＨＬＡＢ及びＣの遺伝子に特定して発現を観察するために、ＦＡＣＳ分析に付した。これはクラスＩの発現を分析するためには抗クラスＩ抗体を、そしてＨＬＡＢＣを分析するためには抗ＨＬＡＢＣ抗体を用いて上記の通り実施した。結果によれば、親Ｋ５６２細胞系統においては、細胞の９．０２％が全般的にクラスＩ複合体を発現しており、そして細胞の１５．９８％がＨＬＡＢ及びＣを発現していた。１つのノックアウト系統においては、クラスＩ発現レベルは３．８８％であり、そしてＨＬＡＢＣ発現は７．８２％であった。この系統はＨＬＡＢＣ対立遺伝子の両方に関してノックアウトを含有しているのではない可能性が高く、従って、発現が消失するのではなく単に減少するということは意外ではない。

実施例３：ＨＬＡクラスＩレギュレーター遺伝子に特異的なＺＦＮ
クラスＩＨＬＡ遺伝子に特異的なＺＦＮの作用を検討することに加えて、本発明者等は、可能性のあるクラスＩレギュレーター、即ちＴＡＰ１、ＴＡＰ２及びタパシンに指向したＺＦＮの作用も試験した。これらの遺伝子標的に対してＺＦＮを作成し、そしてそれらの設計の詳細を表１及び２に示す。

ＺＦＮをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、そして上記のＣｅｌ−Ｉアッセイにより遺伝子修飾活性に関して試験した。

図１０及び１１に示す通り、ＺＦＮ対はそれらの標的を修飾した、図１０Ａはデータが約３９％の遺伝子修飾活性を示しているＴＡＰ１に特異的なＺＦＮ（対２８３８６／２８３８５）の結果を示す。図１０ＢはＺＦＮ対２８３９４／２８３９３が約４９％の効率でＴａｐ２を修飾することを示している。図１１はタパシン遺伝子に対して特異的なＺＦＮ（対２８４０６／２８４０５及び対２８４０４／２８４０３）に関する同様の結果を示しており、ここではデータはそれぞれ約３４％及び６４％の遺伝子修飾を示している。

実施例４：ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子に対して特異的なＺＦＮ
クラスＩ遺伝子に関して上の実施例２で記載した通り、クラスＩＩ遺伝子クラスターにおいても大型欠失を作成した。それぞれＤＢＰ２遺伝子の上流（１５８７２及び１５８７３）及びＤＲＡ遺伝子の下流（１５９０９及び１５９１０）の標的ＤＮＡを切断する２つのＺＦＮ対を特定した。各対を上記の通りＫ５６２細胞におけるＣｅｌ−Ｉ分析により分析した。図１２に示すＣｅｌ−Ｉ分析によれば、１５８７２／１５８７３対に関しては、野生型（ｗｔ）ＦｏｋＩドメインを含有するＺＦＮバージョンを用いた場合に１３％のＮＨＥＪが観察されたのに対し、前述の通りＥＬ／ＫＫＦｏｋＩ対（ｍｕｔ）を用いて対を作成した場合にはＮＨＥＪ活性は約２８％であった。１５９０９／１５９１０対に関しては、野生型（ｗｔ）ＦｏｋＩドメインを含有するＺＦＮを用いた場合に６％及び１１％ＮＨＥＪ活性が観察されたのに対し、ＥＬ／ＫＫＦｏｋＩドメイン対（ｍｕｔ）の場合は１４％のＮＨＥＪ活性が観察された。

２つのＺＦＮ対を共に用いながらＤＢＰ２及びＤＲＡの間のＤＮＡのセクションを欠失させ、そして次に上の実施例２において記載した通り欠失に隣接するプライマーによるＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を分析し、連続希釈物と比較することにより存在する欠失のパーセントを推定した。図１３に示す通り、存在する対立遺伝子の約０．０４％が欠失の証拠を示していた。

接合セクションに渡る接合を配列決定し、そして結果を図１４に示す。６行はＤＰＢ２の上流のＺＦＮ１５８７３の標的部位におけるゲノム参照配列を示す（ＺＦＮ結合部位そのものは下線）。５行はＤＲＡの下流のＺＦＮ１５９０９の結合部位付近のゲノム参照配列を示す（ＺＦＮ結合部位そのものは下線）。１〜４行は上記のＰＣＲ産物の４つの別個のサブクローンの配列を示し、両方の標的配列が存在することを明らかにしており、欠失後にＺＦＮ切断部位において２末端が接合していることを示している。７行は欠失産物のコンセンサスを示す。

これらの結果は、ＨＬＡクラスＩＩ複合体の部分を欠失させるために大型欠失（約７００Ｋｂ）を生じさせることができることを示している。
実施例５：ＨＬＡクラスＩＩレギュレーター遺伝子に対して特異的なＺＦＮ

前述の通り、クラスＩＩ複合体はマスター調節分子ＣＩＩＴＡにより調節されると考えられる。したがって、ＣＩＩＴＡ遺伝子を撹乱又は操作した場合、全体としてＨＬＡクラスＩＩ発現を撹乱又は改変する可能性があり得る。したがって、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするようにＺＦＮ対を作成した。更に又、ＲＦＸ５遺伝子産物はクラスＩＩエンハンスソームの部分であると考えられ、そのため、この遺伝子の撹乱もまたＨＬＡクラスＩＩ発現を撹乱又は改変し得る。従って、この遺伝子を標的とするＺＦＮ対も作成して試験した。ＺＦＮの両方のセットをＫ５６２細胞において上記の通りＣｅｌ−Ｉアッセイを用いて試験した。

図１５に示す通り、Ｃｅｌ−Ｉミスマッチアッセイの結果は、ＣＩＩＴＡを標的とするＺＦＮ対(15486/15487)が対立遺伝子の約１５％において遺伝子修飾を誘発することができ、ＲＦＸ５を標的とするＺＦＮ対(15506/15507)は対立遺伝子の約２％において遺伝子修飾を誘発したことを示している。対照反応はＤＮＡ無添加の擬似トランスフェクション及びＧＦＰ発現プラスミドを用いたトランスフェクションを包含する。

次に、ＣＩＩＴＡターゲティングＺＦＮ対をＲＡＪＩ細胞内へのトランスフェクションにより試験した。これらの細胞はＨＬＡクラスＩＩを発現することがわかっているリンパ芽球様細胞系統である。

図１６に示したゲルはＫ５６２細胞とＲＡＪＩ細胞のＣｅｌ−Ｉ活性を対比させたものである。「Ｋ」はＫ５６２細胞における結果を示し、「Ｒ」はＲＡＪＩ細胞における結果を示す。「ｎ．ｃ．」はトランスフェクション中に如何なるＺＦＮも添加しなかった細胞における陰性対照を示す。結果によれば、Ｋ５６２細胞においては約１２〜１５％の遺伝子修飾活性が観察され、そしてＲＡＪＩ細胞においては約１％であり、ＲＡＪＩ細胞におけるトランスフェクション効率が乏しいことを反映していると考えられた。
実施例６：別の一般的に修飾と組み合わせたＨＬＡノックアウト細胞の使用

ＣＤ１９マーカーは全てのＢ細胞悪性疾患の９５％上で発現される細胞表面マーカーである。これは造血幹細胞上やＢ直系外の正常組織上では発現されず、Ｂ細胞から成熟プラズマ細胞への分化時に消失する。したがって、ＣＤ１９はＢ細胞リンパ腫及びＢ−ＡＬＬ細胞の治療のための標的化免疫療法のための興味深い標的となっている。ＣＤ１９に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有するＴ細胞が、トランスポゾン支援ゲノム挿入を介して作成されている（Davies等、(2010)Cancer Res 70(10):3915-24参照）。ＨＬＡマーカーの欠失は、そのような細胞療法製品を、マッチしたＨＬＡハプロタイプを有する者のみではなく多くの患者のために使用可能とする。したがって、実施例２において上記の通りＣＡＲ−１９修飾Ｔ細胞をＨＬＡＡ特異的ＺＦＮで処理した。次に細胞を上記の通りＦＡＣＳ分析により分析した。

図１７に示す通り、陰性（アイソタイプ）対照抗体（マウス抗ＩｇＧ２（ＢＤ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ））を用いた細胞の分析によれば、ＨＬＡ−Ａ２（上記）発現に関しては０．３％の陰性（非特異的結合）シグナルが観察された。擬似トランスフェクト細胞をＨＬＡ−Ａ２抗体を用いて分析した場合（ｍＲＮＡ非存在）、細胞の１．６％がＨＬＡ−Ａ２を発現しなかった。ＺＦＮ処理したＴ細胞のバルク集団が、細胞の１７．６％がＨＬＡ−Ａ２ヌルであることを示していたが、上の実施例２に記載のＨＬＡ−Ａ２非発現体に関して富化した後は、細胞の９５．３％が図１７においてＨＬＡ−Ａ２ヌル（「富化」を「ＨＬＡ−Ａ．ＺＦＮバルクと比較）であった。

次にＨＬＡ−Ａ２ヌルＴ細胞をＨＬＡ−Ａ２特異的ＣＴＬで処理した。図１８に示す通り、ＨＬＡ−Ａ２ヌルであった細胞はＣＴＬによる溶解に対して耐性であった。これらの実験は前述したとおり実施した。使用したＣＴＬは前述の通りＧＡＳ２Ｂ３−５Ｃ１９ＯＲＦ４８／Ａ２細胞（ＣＩＰＰＤＳＬＬＦＰＡエピトープ）であり（実施例２参照）、そして、ＨＬＡ−Ａ２に対して特異的なものである。

これらのデータによれば、ＺＦＰ媒介ＨＬＡノックアウトは別の有用な遺伝子修飾を担持している細胞においてもたらすことができ、そしてそのため、これらの治療薬の広範な使用を可能にする。

実施例７：ＴＣＲノックアウト
上の実施例６において記載のＣＡＲ−１９修飾Ｔ細胞の使用は、内因性ＴＣＲαβ発現のため、同種異系の状況においては妨害される可能性があり得る。したがって、ＴＣＲα又はＴＣＲβ定常領鎖の何れかを撹乱するように設計されたＺＦＮ試薬を一次Ｔ細胞において試験した。ＺＦＮ対２５５３９／２５５４０をＴＣＲαノックアウトのために使用し、そしてＺＦＮ対１６７８３／１６７８７をＴＣＲβノックアウトのために使用した。これらの実験において、百万個の一次Ｔ細胞を上記の通りＺＦＮコードｍＲＮＡを用いてＡｍａｘａ系を用いたヌクレオフェクションに付した。次に細胞をＦＡＣＳ及びＣｅｌ−Ｉ分析の両方に付した。

図１９に示す通り、ＣＤ３発現を欠失する細胞は、ヌクレオフェクトＴＣＲＺＦＮｍＲＮＡの非存在下の２．４％から１０μｇＴＣＲβ特異的ＺＦＮｍＲＮＡの存在下では９．４％まで増大する。１０μｇのＴＣＲα特異的ＺＦＮｍＲＮＡの存在下では、ＣＤ３陰性細胞のパーセントは２８．１％まで上昇する。ＦＡＣＳデータは、ＴＲＣβデータを上部（「ＴＲＢＣターゲティングＺＦＮ」）、そしてＴＣＲαデータを下部（「ＴＲＡＣターゲティングＺＦＮ」）として示す。ＴＣＲα又はＴＣＲβ鎖の何れかの発現の欠失を、細胞表面上の安定な提示のためには機能性ＴＣＲが必要になるＣＤ３複合体の存在によりアッセイする。

図２０は一過性の低温又は標準的条件下にインキュベートした試料に対して上記の通り実施したＣｅｌ−Ｉ分析の結果と共にゲルを示しており、遺伝子修飾活性パーセントデータ（各レーンの下部に示す）は、３７℃でインキュベートした細胞に対して実施したＦＡＣＳ分析と概ね合致している。

本明細書において言及した全ての特許、特許出願及び公開は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

開示は理解の明確化を目的として説明及び例示により幾分詳細に提示したが、当業者の知る通り、開示の精神又は範囲から外れることなく種々の変化及び変更を行うことができる。従って、上記説明及び例は限定的と捉えてはならない。

Claims (21)

1. 内因性遺伝子中の表２に示す標的部位に結合する非天然存在の亜鉛フィンガー蛋白質を含む単離されたポリペプチド。
2. 請求項１に記載の単離されたポリペプチド及び機能性ドメインを含む融合蛋白質。
3. 機能性ドメインが活性化ドメイン、リプレッションドメイン又はヌクレアーゼドメインを含む、請求項２に記載の融合蛋白質。
4. 機能性ドメインがＨＬＡ Ａ、ＨＬＡ Ｂ、ＨＬＡ Ｃ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、タパシン、ＣＴＩＩＡ、ＲＦＸ５、ＴＲＡＣ，又はＴＲＡＢ遺伝子の１つ以上の発現を調節する、請求項２又は３に記載の融合蛋白質。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合蛋白質のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド。
6. 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項５記載のポリヌクレオチドを含む単離された細胞。
7. 細胞が幹細胞、先祖細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、幹細胞の部分分化子孫細胞又は幹細胞の完全分化子孫細胞よりなる群から選択される、請求項６に記載の単離された細胞。
8. 細胞におけるＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子１つ以上を不活性化する方法であって、
   請求項３に記載の融合蛋白質又は請求項５に記載のポリヌクレオチドでＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子を切断し、ここで機能性ドメインはＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子１つ以上が不活性化されるようにヌクレアーゼを含むものであること、
   を含む、方法。
9. 切断がＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子１つ以上の内部に欠失をもたらす、請求項８に記載の方法。
10. 対象におけるＨＬＡ関連障害を治療する方法であって、
    ａ）単離された細胞中の内因性ＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子を、ＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子が不活性化されるように請求項８記載の方法に従って切断すること；及び
    ｂ）対象に細胞を導入し、それによってＨＬＡ関連障害を治療又は防止すること、
    を含む、方法。
11. 対象に導入された単離された細胞が更に、細胞のゲノム内への外因性配列の組み込み、追加の１つ以上の遺伝子の不活性化、及びこれらの組み合わせよりなる群から選択される追加的ゲノム修飾を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 追加のゲノム修飾が外因性配列の組み込みを含み、そして更に、外因性配列が切断されたＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子内に組み込まれる、請求項１１に記載の方法。
13. 追加のゲノム修飾が外因性配列の組み込みを含み、そして更に外因性配列がポリペプチドである、癌マーカーに対して特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする、請求項１１又は１２記載の方法。
14. 追加のゲノム修飾が外因性ＴＣＲ遺伝子１つ以上の不活性化を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 障害が対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 細胞がＴ細胞又は幹細胞である、請求項１６に記載の方法。
18. 幹細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、間葉性幹細胞（ＭＳＣ）又はニューロン幹細胞よりなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. ＨＬＡ障害に関するモデル系であって、ＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子の１つ以上が、請求項８〜１８のいずれか１項に記載の方法に従って不活性化される細胞系統又は動物を含む、モデル系。
20. 細胞移植片を必要とする患者を治療するための方法であって、
    請求項１３に記載の方法に従って単離された細胞中のＨＬＡ又はＨＬＡ調節遺伝子の１つ以上を不活性化すること；及び、
    細胞又は細胞のフラグメントを、それを必要としている患者内に移植すること、
    を含む、方法。
21. 細胞又は細胞フラグメントがＴ細胞、幹細胞及び血小板よりなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。

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