JP2020058398A - 養子細胞治療製品を製造するための誘導多能性幹細胞の適用 - Google Patents

Abstract

【課題】養子細胞治療製品を製造するための人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の適用及び免疫受容体の潜在毒性をスクリーニングするためのｉＰＳＣの使用を提供する。【解決手段】いくつかの態様では、ＨＬＡ遺伝子（例えばＨＬＡ−Ａ）を発現しないｉＰＳＣ及びｉＰＳＣから分化された細胞を提供している。本明細書で提供される方法は、例えば、ＨＬＡ−Ａｎｅｇ、ＨＬＡホモ接合人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の製造方法であって、（ａ）ＨＬＡホモ接合ドナーから細胞集団を得て、（ｂ）ＨＬＡ−Ａを発現しないように前記細胞を操作し、それによってＨＬＡ−Ａｎｅｇ細胞を製造し、及び（ｃ）ｉＰＳＣを生成するように前記ＨＬＡ−Ａｎｅｇ細胞をリプログラミングし、それによってＨＬＡ−ＡｎｅｇｉＰＳＣを製造することを含む、前記方法である。【選択図】なし

Description

説明

本出願は２０１４年４月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／９８３，７２２号の優先権を主張し、参照により本明細書に援用される。

配列表の援用

ファイル名「ＵＴＦＣＰ１２３５ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」に含まれる配列表は、２ＫＢであり（マイクロソフトＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）、２０１５年４月１５日に作成され、電子申請により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に援用される。

本発明は、医学、細胞生物学、及び分子生物学の分野に一般的に関係している。特定の態様では、本発明の分野は免疫療法に関係している。より具体的には、本発明は免疫療法及び再生医療、ならびに免疫受容体の潜在毒性をスクリーニングするための養子細胞治療製品に関する。

自家またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合した同種異系ドナー細胞を使用した細胞療法は、がんを含む多種の疾患、及び再生医療にとって有望な治療法である。しかし、自家細胞は、時には、特にがん患者において疾患自体または毒性のある薬の反復投与を原因とする機能的な欠陥がある。同種異系細胞の場合、患者は、同種異系の免疫応答を回避するために、適切なＨＬＡ適合ドナーを見つける必要がある。例えば、同種異系造血幹細胞（ＨＳＣ）は、レシピエントのＨＳＣの不在または機能不全を回復させるために注入され、特異的造血細胞を生成するための供給源として提供される。しかし、ＨＬＡ系の多様性は、ＨＬＡ適合ドナーを見つけることのハードルとなり、そのハードルは人種的な遺伝子多型の影響によって増長される。適切なＨＬＡ適合産物を患者に提供するために、ロバストなドナー数が必要とされる。臍帯血（ＵＣＢ）単位の事前バンク及び国立骨髄ドナープログラム（ＮＭＤＰ）を通じて登録された成人ドナーにアクセスするにもかかわらず、多くのレシピエント、特にドナープールに不足している人種及び民族マイノリティのレシピエントにとって、適切なＨＬＡ適合産物を見つけることは困難なままである。実際には、ＮＭＤＰに登録されているドナー９００万人では米国の人口をカバーするのに十分ではない。さらに、細胞治療製品を準備するために大幅な時間及び金銭的費用がかかる。このように、同種異系の免疫細胞媒介性拒絶反応を回避し、患者からの細胞培養物を増やす必要なく患者に注入することができる細胞製品が必要とされている。

本開示は、免疫療法、再生医療の養子細胞治療製品を製造するための人工多能性幹細胞の適用、及び免疫受容体の潜在毒性のスクリーニングを提供している。

一態様では、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ、ＨＬＡホモ接合人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造する方法を提供し、（ａ）ＨＬＡホモ接合ドナーから細胞の集合を得て、（ｂ）ＨＬＡ−Ａを発現しないように前記細胞を操作し、それによってＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ細胞を製造し、及び（ｃ）ｉＰＳＣを生成するように前記ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ細胞をリプログラムし、それによってＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇｉＰＳＣを製造することを含む。

一態様では、細胞集団は臍帯血細胞の集団であってもよい。一態様では、ドナーはＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１のＨＬＡ−ホモ接合であってもよい。

いくつかの態様では、ＨＬＡ−Ａが発現しないように細胞を操作することは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を特異的に標的とする人工ヌクレアーゼを前記細胞に導入することを含んでもよい。様々な態様では、人工ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であってもよい。様々な態様では、人工ヌクレアーゼを細胞に導入することは、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含んでもよい。

いくつかの態様では、リプログラミング細胞（例えばＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ細胞）はＳｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、Ｋｌｆ４、ｍｙｃ（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、または形質転換が欠損しているｍｙｃ変異体）及び／またはＳＶ４０ＬＴから成る群から選択されるリプログラミング因子を細胞に導入することを含んでもよい。いくつかの態様では、例えば、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ細胞等のリプログラミング細胞は、リプログラミング因子Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−ｍｙｃタンパク質を細胞に導入することを含む。さらなる態様では、リプログラミングは、Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｍＲＮＡをコードするｃ−ｍｙｃを細胞に導入することを含んでもよい。さらに別の態様では、リプログラミングは、Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−ｍｙｃをコードする１つまたは複数の発現カセットを細胞に導入することを含んでもよい。１つまたは複数の発現カセットは、１つまたは複数のエピソームベクターに含まれてもよい。１つまたは複数の発現カセットは、１つまたは複数のウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはセンダイウイルスベクター）に含まれてもよい。

特定の態様では、前記方法は、例えば、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）等の自殺遺伝子をステップ（ｂ）の細胞に導入することをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、導入は遺伝子導入を含んでもよい。いくつかの態様では、導入は、スリーピングビューティートランスポゾン／トランスポザーゼ系等のトランスポゾン／トランスポザーゼ系を含んでもよい。

特定の態様では、前記方法はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ、遺伝的にセーフハーバープロファイルを有するＨＬＡ−ホモ接合ｉＰＳＣを同定することを含んでもよい。本明細書で使用するとき、「セーフハーバー」プロファイルとは、導入遺伝子発現が保持されている（すなわち遺伝子発現停止されていない）部位のゲノムに外来遺伝子物質を挿入することを指し、内因性遺伝子の発現を妨害しない。例えば、「遺伝的セーフハーバープロファイル」とは、内因性遺伝子のコーディング及び発現制御領域の外側に位置する遺伝子導入イベントを指してもよい。いくつかの態様では、同定は、全ゲノム配列決定または組込み部位解析の実行を含んでもよい。

特定の態様では、前記方法はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ、ＨＬＡホモ接合ｉＰＳＣを分化させることをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、分化は人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の使用を含んでもよい。いくつかの態様では、ａＡＰＣは遺伝子改変されたＫ５６２細胞であってもよい。

いくつかの態様では、ｉＰＳＣは、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞等の免疫細胞に分化されてもよい。いくつかの態様では、前記免疫細胞は、腫瘍特異的またはウイルス特異的ＴＣＲαβをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、前記免疫細胞は、腫瘍特異的キメラ抗原受容体をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、前記免疫細胞は、免疫抑制分子（例えば、ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４）を削除するようにさらに遺伝的に編集されてもよい。いくつかの態様では、前記ｉＰＳＣは造血幹細胞に分化されてもよい。いくつかの態様では、前記ｉＰＳＣは心筋細胞、肺上皮細胞、ベータ膵島細胞、腎細胞、または神経細胞に分化されてもよい。

さらなる実施形態では、単離された哺乳動物細胞を提供し（例えばヒト細胞）、当該細胞はホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子（例えばホモ接合ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ及び／またはＨＬＡＤＲＢ１対立遺伝子）及びＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ表現型の少なくとも１つのセットを含んでいる。いくつかの態様では、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ表現型を有する細胞は、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ遺伝子の全てまたは一部の削除を含み、または遺伝子または遺伝子産物の一方または両方を非機能性にする変異をＨＬＡ−Ａに含む。例えば、いくつかの態様では、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の一方または両方はジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、または遺伝子または遺伝子産物を非機能にするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって生成された欠失を含む。さらなる態様では、ホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子の少なくとも１つのセットを含む実施形態の細胞は、ホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子の少なくとも２つまたは３つのセットを含む。例えば、前記細胞はホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、ホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子、ホモ接合ＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子またはホモ接合ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子を含むことができる。

いくつかの態様では、実施形態のホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子及びＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ表現型の少なくとも１つのセットを含む単離された哺乳動物細胞は、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、臍帯血細胞、表皮細胞、膵臓細胞、肝細胞、造血細胞、間葉細胞、神経細胞またはＮＫ細胞もしくはＴ細胞等の免疫細胞（例えばＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞）である。さらなる態様では、実施形態の細胞集団を提供する。例えば、いくつかの態様では、実施形態の約１×１０^３〜１×１０^４、１×１０^６、１×１０^６、または１×１０^７個の細胞集団が提供される。

いくつかの態様では、実施形態のホモ接合性のＨＬＡ対立遺伝子及びＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ表現型の少なくとも１つのセットを含む単離された哺乳動物細胞は、導入遺伝子をさらに含む。例えば、前記細胞は、レポーターをコードしている導入遺伝子、薬物選択マーカー、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／または自殺遺伝子（例えばチミジンキナーゼまたは誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）を含んでもよい。さらに別の態様では、実施形態の哺乳動物細胞は、１つまたは複数の内因性遺伝子の減少した発現または活性をさらに含む。例えば、いくつかの態様では、前記細胞は発現を欠いている、またはＰＤ−１もしくはＣＴＬＡ−４等の１つまたは複数の免疫抑制分子の発現が減少している。さらなる態様では、前記細胞は、発現を欠いている、または１つまたは複数のＴ細胞受容体成分の発現が減少している。例えば、いくつかの態様では、前記細胞は発現を欠いている、またはＴＣＲα、ＴＣＲβまたはＴＣＲα及びＴＣＲβの発現が減少している。

さらなる実施形態では、細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセットは、少なくとも第１及び第２の人工多能性幹細胞株を含んで提供され、前記第１及び第２の細胞株は、ホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を含み、第１の細胞株のホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及び／またはＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子は第２の細胞株のホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及び／またはＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子と異なっており、第１及び第２の細胞株は両方ともＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである。特定の態様では、細胞株のセットは少なくとも５〜１０個の異なる人工多能性幹細胞株をさらに含んでもよく、各細胞株は固有のホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の組み合わせを含み、各細胞株はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである。特定の態様では、細胞株のセットは少なくとも２０個の異なる人工多能性幹細胞株をさらに含み、各細胞株は固有のホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の組み合わせを含み、各細胞株はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである。特定の態様では、細胞株のセットは少なくとも２７個の異なる人工多能性幹細胞株をさらに含み、各細胞株は固有のホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の組み合わせを含み、各細胞株はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである。特定の態様では、細胞株のセットは少なくとも２７個の異なる人工多能性幹細胞株をさらに含み、各細胞株は表１に記載のホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の固有の組み合わせを含み、各細胞株はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである。

いくつかの態様では、各細胞株は誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）等の自殺遺伝子をさらに含んでもよい。いくつかの態様では、細胞株は本発明の実施形態の方法に従って作製することができる。

一実施形態では、免疫受容体の特異性をスクリーニングする方法を提供し、（ａ）本発明の実施形態に記載のｉＰＳＣ株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセットを得て、（ｂ）任意に、前記ｉＰＳＣを系譜特異的な細胞に分化し、（ｃ）ｉＰＳＣまたは系譜特異的な細胞を目的の免疫受容体を発現するＴ細胞に暴露し、及び（ｄ）ｉＰＳＣまたは系譜特異的な細胞と目的の免疫受容体を発現するＴ細胞との相互作用を検出し、それによって免疫受容体の特異性をスクリーニングすることを含む。

いくつかの態様では、前記Ｔ細胞は、目的の免疫受容体の標的抗原を認識した後にのみＧＦＰを発現するＴ急性リンパ芽球性白血病細胞株であってもよい。この態様では、ステップ（ｄ）はＴ急性リンパ芽球性白血病細胞株中のＧＦＰの発現を検出することを含んでもよく、それによってｉＰＳＣまたは標的抗原を発現する系譜特異的な細胞を同定する。

いくつかの態様では、前記方法は細胞死レポーター構築物をステップ（ａ）の細胞に導入することをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、細胞死レポーター構築物はカスパーゼ３の活性化の検出を可能にし得る。これらの態様では、ステップ（ｄ）は細胞死レポーター構築物の活性化を検出することを含んでもよく、それによって免疫受容体の特異性をスクリーニングする。

いくつかの態様では、前記方法は、系譜特異的な転写因子プロモーター駆動レポーター遺伝子をステップ（ａ）の細胞に導入することをさらに含んでもよい。この態様では、ステップ（ｄ）は、レポーター遺伝子の発現の喪失を検出することを含んでもよく、それによって免疫受容体の特異性をスクリーニングする。

いくつかの態様では、目的の免疫受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であってもよい。いくつかの態様では、前記ＴＣＲはクローニングされても、または操作されてもよい。

一実施形態では、治療の必要な患者の疾患を治療する方法を提供し、（ａ）前記患者とＨＬＡが適合する本発明の実施形態のいずれか１つの記載の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセットから細胞株を選択し、（ｂ）選択された細胞株を系譜特異的な細胞に分化し、（ｃ）治療有効量の分化された細胞を患者に投与することを含む。

特定の態様では、前記方法は免疫療法を提供する方法であってもよい。いくつかの態様では、系譜特異的な細胞は、造血幹細胞または免疫エフェクター細胞であってもよい。いくつかの態様では、前記疾患はがん、自己免疫疾患、または感染症であってもよい。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びｉＮＫＴ細胞であってもよい。

特定の態様では、前記方法はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体をステップ（ａ）の細胞に導入することをさらに含んでもよい。いくつかの態様では、前記疾患はがんであり得、前記ＣＡＲは例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児抗原、α−フェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ｍｅｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、またはＶＥＧＦＲ２等の癌細胞抗原を標的としてもよい。

いくつかの態様では、前記疾患は自己免疫疾患であってもよく、前記ＣＡＲは自己免疫細胞を標的としてもよい。自己免疫疾患の例として、以下に限定されないが、セリアック病、１型糖尿病（ＩＤＤＭ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性硬化症（ＭＳ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ（ＲＡ）、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺性症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ポストストレプトコッカス腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活動性肝炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎／多発性筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、及び線維性肺胞炎が挙げられる。

いくつかの態様では、前記疾患は病原体によって生じる感染性疾患であり得（例えば真菌、ウイルス、または病原性微生物）、前記ＣＡＲは病原体抗原を標的とすることができる。

特定の態様では、前記方法は再生医療を提供する方法であってもよい。この態様では、系譜特異的な細胞は心筋細胞、神経細胞、ベータ膵島細胞、腎細胞、肺細胞、上皮細胞、膵臓細胞、肝細胞、造血細胞または間葉細胞であってもよい。

いくつかの態様では、実施形態の方法は抗原提示細胞（ＡＰＣ）を得て製造すること、または使用することをさらに含む。いくつかの態様では、ＡＰＣは樹状細胞であり得る。特定の態様では、前記ＡＰＣは人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）であり、ａＡＰＣはＡＰＣのように機能するように操作されている。例えば、いくつかの態様では、前記ａＡＰＣは放射線照射等で不活性化される。当該ＡＰＣを作製する方法は当技術分野で知られており、本明細書にさらに詳述する。したがって、いくつかの態様では、実施形態の細胞（例えばＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ表現型を有する免疫細胞）はＴ細胞集団を増殖するために、一定時間、ｅｘ ｖｉｖｏでＡＰＣと共培養される。ＡＰＣと共培養させる細胞のステップは、例えば、インターロイキン２１（ＩＬ−２１）及び／またはインターロイキン−２（ＩＬ−２）を含む培地で行うことができる。いくつかの態様では、共培養は、約１０：１〜約１：１０、約３：１〜約１：５、または約１：１〜約１：３の免疫細胞（例えばＴ細胞）とＡＰＣの比で行われる。例えば、免疫細胞及びＡＰＣの共培養は、約１：１、約１：２または約１：３の比で行うことができる。

いくつかの実施形態では、方法は医学的状態にある個体を治療する方法を提供し、本明細書に記載の細胞集団から有効量の細胞を提供するステップを含み、いくつかの態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上離して１回以上投与することを含む。特定の実施形態では、医学的状態はがんまたは感染性疾患である。

「ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ」表現型は、本明細書で使用するとき、その表面に機能的ＨＬＡ−Ａを発現する細胞を指す。例えば、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ表現型を有する細胞は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子の一方ンまたは両方の全てまたは一部の欠失を含んでいてもよい。例えば、ＨＬＡ−Ａ遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって導入される欠失を含んでもよい。同様に、いくつかの態様では、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ表現型を有する細胞は、遺伝子または遺伝子構築物を非機能にする変異をＨＬＡ−Ａ遺伝子の一方または両方に含んでもよい。

本明細書で使用されるとき、特定の成分において「本質的に含まない」は、指定された成分のいずれも意図的に組成物に処方されていない及び／または汚染物質としてのみ、または微量に存在していることを意味するために本明細書で使用される。組成物の意図しない汚染から得られる指定された成分の合計量は０．０５％よりはるかに下回る、好ましくは０．０１％以下である。最も好ましいのは、指定された成分が標準的な分析方法で全く検出されない生成物である。

明細書及び特許請求の範囲で本明細書で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは複数を意味し得る。明細書及び特許請求の範囲で本明細書で使用されるとき、「含む」という用語と一緒に使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という単語は１つまたは複数を意味し得る。明細書及び特許請求の範囲で本明細書で使用されるとき、「別の」または「さらなる」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味し得る。

明細書及び特許請求の範囲で本明細書中で使用されるとき「約」という用語は、値に、装置の固有の変動、値を定量するために使用される方法の固有の変動、または研究対象に存在する変動が含まれることを示すために使用される。

本発明の他の目的、特徴及び利点は以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の特定の実施形態を示す一方で、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正はこの詳細な説明から当業者に明らかとなるため、説明するためだけに示されていることを理解されたい。

本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ、ＨＬＡホモ接合人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の製造方法であって、
（ａ）ＨＬＡホモ接合ドナーから細胞集団を得て、
（ｂ）ＨＬＡ−Ａを発現しないように前記細胞を操作し、それによってＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ細胞を製造し、及び
（ｃ）ｉＰＳＣを生成するように前記ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ細胞をリプログラミングし、それによってＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇｉＰＳＣを製造することを含む、前記方法。
（項目２）
前記細胞集団は臍帯血細胞の集団である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ドナーはＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、及びＨＬＡ−ＤＲＢ１のＨＬＡホモ接合である、項目１に記載の方法。
（項目４）
ＨＬＡ−Ａを発現しないように前記細胞を操作することは、前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子座を特異的に標的とする人工ヌクレアーゼを前記細胞に導入することを含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記人工ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９である、項目４に記載の方法。
（項目６）
人工ヌクレアーゼを前記細胞に導入することは前記人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを前記細胞に導入することを含む、項目４に記載の方法。
（項目７）
リプログラミングはＯｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−ｍｙｃタンパク質を前記細胞に導入することを含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
リプログラミングはＯｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｍＲＮＡをコードするｃ−ｍｙｃを前記細胞に導入することを含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
リプログラミングはＯｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−ｍｙｃをコードする１つまたは複数の発現カセットを前記細胞に導入することを含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記１つまたは複数の発現カセットは１つまたは複数のエピソームベクターに含まれる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記発現カセットはウイルスベクターに含まれる、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ウイルスベクターはレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはセンダイウイルスである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
自殺遺伝子をステップ（ｂ）の前記細胞に導入することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記自殺遺伝子は誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）である、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
誘導は遺伝子導入を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
導入はトランスポゾン／トランスポサーゼ系を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記トランスポゾン／トランスポサーゼ系はスリーピングビューティートランスポゾン／トランスポサーゼ系である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
ｉＰＳＣ中のＴＲＡＣ遺伝子を崩壊させることをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
崩壊は前記ＴＲＡＣ遺伝子座を特異的に標的とする人工ヌクレアーゼを前記細胞に導入することを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記ｉＰＳＣをキメラ抗原受容体で形質導入することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
遺伝的にセーフハーバープロファイルを有するＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ、ＨＬＡホモ接合ｉＰＳＣを同定することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記同定は全ゲノム配列決定または組込み部位解析によって実施される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ、ＨＬＡホモ接合ｉＰＳＣを分化することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２４）
分化は抗原提示細胞（ＡＰＣ）の使用を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ＡＰＣは人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記ａＡＰＣは遺伝的に改変されたＫ５６２細胞である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記ｉＰＳＣは免疫細胞に分化される、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記免疫細胞は腫瘍特異的またはウイルス特異的ＴＣＲαβをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記免疫細胞は腫瘍特異的キメラ抗原受容体をさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記免疫細胞は免疫抑制分子を排除するために遺伝的にさらに編集される、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
前記免疫抑制分子はＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４である、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記ｉＰＳＣは造血幹細胞に分化される、項目２７に記載の方法。
（項目３４）
前記ｉＰＳＣは心筋細胞、肺上皮細胞、ベータ膵島細胞、腎細胞、または神経細胞に分化される、項目２７に記載の方法。
（項目３５）
ホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子及びＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ表現型の少なくとも１つのセットを含む単離された哺乳動物細胞。
（項目３６）
前記細胞は臍帯血、心筋細胞、腎臓、肺、表皮、膵臓、ベータ膵島、肝臓、造血、間葉、または神経細胞である、項目３５に記載の単離された細胞。
（項目３７）
前記細胞は胚性幹細胞またはｉＰＳ細胞である、項目３５に記載の単離された細胞。
（項目３８）
前記細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である、項目３５に記載の単離された細胞。
（項目３９）
前記細胞はホモ接合ＨＬＡ対立遺伝子の少なくとも２つのセットを含む、項目３５に記載の単離された細胞。
（項目４０）
細胞はホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子、ホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子またはホモ接合ＨＬＡ−Ｃ及びＨＬＡ−ＨＬＡ−ＤＲＢ１対立遺伝子を含む、項目３５に記載の単離された細胞。
（項目４１）
細胞は少なくとも１つの前記ＨＬＡ−Ａ遺伝子の全てまたは一部分の欠失を含む、項目３５に記載の単離された細胞。
（項目４２）
細胞は前記遺伝子を非機能性にする変異を有する少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ遺伝子を含む、項目３５に記載の単離された細胞。
（項目４３）
前記細胞は導入遺伝子を含む、項目３５に記載の細胞。
（項目４４）
前記導入遺伝子は自殺遺伝子を含む、項目４３に記載の細胞。
（項目４５）
前記自殺遺伝子は誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）である、項目４４に記載の細胞。
（項目４６）
前記細胞は機能性ＴＣＲα及び／またはＴＣＲβ遺伝子を欠損している、項目３５に記載の細胞。
（項目４７）
前記細胞は腫瘍特異的またはウイルス特異的ＴＣＲαβをさらに含む、項目３５に記載の細胞。
（項目４８）
前記細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、項目３５に記載の細胞。
（項目４９）
前記細胞は１つまたは複数の免疫抑制分子の発現を欠損している、項目３５に記載の細胞。
（項目５０）
前記免疫抑制分子はＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４である、項目４９に記載の細胞。
（項目５１）
項目３５に記載の細胞集団。
（項目５２）
少なくとも１つの第１及び第２の人工多能性幹細胞株を含む細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセットであって、前記第１及び第２の細胞株はホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子を含み、前記第１の細胞株のホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及び／またはＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子は第２の細胞株のＨＬＡ−Ｂ及び／またはＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子と異なっており、前記第１及び第２の細胞株は両方ともＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである、前記細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセット。
（項目５３）
少なくとも５〜１０個の異なる人工多能性幹細胞株をさらに含み、各細胞株はホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の固有の組み合わせを含み、各細胞株はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである、項目５２に記載の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセット。
（項目５４）
少なくとも２０個の異なる人工多能性幹細胞株をさらに含み、各細胞株はホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の固有の組み合わせを含み、各細胞株はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである、項目５３に記載の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセット。
（項目５５）
少なくとも２７個の異なる人工多能性幹細胞株をさらに含み、各細胞株はホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の固有の組み合わせを含み、各細胞株はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである、項目５４に記載の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセット。
（項目５６）
前記セットは２７個の異なる人工多能性幹細胞株を含み、各細胞株は表１に記載のホモ接合ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子の固有の組み合わせを含み、各細胞株はＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇである、項目５４に記載の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセット。
（項目５７）
各細胞株は自殺遺伝子をさらに含む、項目５２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞株のセット。
（項目５８）
前記自殺遺伝子は誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）である、項目５７に記載の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセット。
（項目５９）
前記細胞株は項目１に記載の方法に従って製造される、項目５２に記載の細胞株のｉｎ
ｖｉｔｒｏのセット。
（項目６０）
（ａ）項目５２に記載のｉＰＳＣ細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセットを得て、
（ｂ）前記ｉＰＳＣを系譜特異的な細胞に任意に分化し、
（ｃ）前記ｉＰＳＣまたは系譜特異的な細胞を目的の免疫受容体を発現するＴ細胞に暴露し、
（ｄ）前記ｉＰＳＣまたは系譜特異的な細胞と目的の免疫受容体を発現するＴ細胞との相互作用を検出し、それによって免疫受容体の特異性をスクリーニングすることを含む、免疫受容体の特異性のスクリーニング方法。
（項目６１）
前記Ｔ細胞は、目的の免疫受容体の標的抗原を認識した後に、ＧＦＰのみを発現するＴ急性リンパ芽球性白血病細胞株である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
ステップ（ｄ）は前記Ｔ急性リンパ芽球性白血病細胞株中のＧＦＰの前記発現を検出し、それによって標的抗原を発現するｉＰＳＣまたは系譜特異的な細胞を同定することを含む、項目６１に記載の方法。
（項目６３）
細胞死レポーター構築物を前記ステップ（ａ）の細胞に導入することをさらに含む、項目６０に記載の方法。
（項目６４）
前記細胞死レポーター構築物はカスパーゼ３の活性化を検出することができる、項目６３に記載の方法。
（項目６５）
ステップ（ｄ）は前記細胞死レポーター構築物の活性化を検出し、それによって免疫受容体の特異性をスクリーニングすることを含む、項目６３に記載の方法。
（項目６６）
系譜特異的転写因子プロモーター駆動レポーター遺伝子を前記ステップ（ａ）の細胞に導入することをさらに含む、項目６０に記載の方法。
（項目６７）
ステップ（ｄ）は前記レポーター遺伝子の発現の喪失を検出し、それによって免疫受容体の特異性をスクリーニングすることを含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記目的の免疫受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、項目６０に記載の方法。
（項目６９）
前記ＴＣＲはクローニングされ、または操作されている、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
治療の必要な患者の疾患の治療方法であって、
（ａ）前記患者とＨＬＡが適合する項目５２に記載の細胞株のｉｎ ｖｉｔｒｏのセットから細胞株を選択し、
（ｂ）前記選択された細胞株を系譜特異的な細胞に分化し、及び
（ｃ）治療有効量の前記分化された細胞を前記患者に投与することを含む、前記方法。
（項目７１）
前記方法は免疫療法を提供する方法である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
前記系譜特異的な細胞は造血幹細胞または免疫エフェクター細胞である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
前記疾患はがん、自己免疫疾患、または感染性疾患である、項目７１に記載の方法。
（項目７４）
前記免疫エフェクター細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、及びｉＮＫＴ細胞である、項目７１に記載の方法。
（項目７５）
前記方法はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体を前記ステップ（ａ）の細胞に導入することをさらに含む、項目７１に記載の方法。
（項目７６）
前記疾患はがんであり、前記ＣＡＲは癌細胞抗原を標的とする、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記癌細胞抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児抗原、α−フェトプロテイン、ＣＡ−１２５、５Ｔ４、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、ｍｅｏｔｈｅｌｉｎ、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒａｌｐｈａ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、またはＶＥＧＦＲ２である、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
前記疾患は自己免疫疾患であり、前記ＣＡＲは自己免疫疾患細胞を標的とする、項目７５に記載の方法。
（項目７９）
前記疾患は病原体によって生じる感染性疾患であり、前記ＣＡＲは病原体抗原を標的とする、項目７５に記載の方法。
（項目８０）
前記病原体は、真菌、ウイルス、または病原性微生物である、項目７９に記載の方法。
（項目８１）
前記方法は再生医療をもたらす方法である、項目７０に記載の方法。
（項目８２）
前記系譜特異的な細胞は、心筋細胞、神経細胞、ベータ膵島細胞、腎細胞、または肺細胞である、項目８１に記載の方法。
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様を説明するために含まれている。本発明は、本明細書に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて１つまたは複数の図面を参照することによってもっと理解することが可能となる。

ＮＭＤＰでＨＬＡ適合ドナーを発見する確率。図１Ａ：８／８適合。図１Ｂ：ＨＬＡ−Ａなし６／６。図１Ｃ：ＨＬＡ−Ｂなし６／６。図１Ｄ：ＨＬＡ−Ｃなし６／６。各バーの下部は８／８対立遺伝子が適合するドナーを発見する確率を示している。各バーの上部は、対応するＨＬＡ遺伝子座が現在のＨＬＡ適合要件から除外された場合の６／６対立遺伝子適合ドナーを発見する確率を示している。Ｘ軸は民族を示す。 ＮＭＤＰでＨＬＡ適合ドナーを発見する確率。図１Ａ：８／８適合。図１Ｂ：ＨＬＡ−Ａなし６／６。図１Ｃ：ＨＬＡ−Ｂなし６／６。図１Ｄ：ＨＬＡ−Ｃなし６／６。各バーの下部は８／８対立遺伝子が適合するドナーを発見する確率を示している。各バーの上部は、対応するＨＬＡ遺伝子座が現在のＨＬＡ適合要件から除外された場合の６／６対立遺伝子適合ドナーを発見する確率を示している。Ｘ軸は民族を示す。 ｉＰＳＣを用いた免疫受容体の毒性のスクリーニング。ｉＰＳＣは系譜特異的な細胞に直接分化される（左パネル）、またはデスレポーター遺伝子（中央パネル）もしくは系譜特異的なレポーター遺伝子（右パネル）で改変された後に分化される。分化した細胞の潜在的な認識は、免疫受容体媒介性認識（左パネル）を使用する、または免疫受容体を発現するＴ細胞と共培養することによってモニターされる。 ｉＰＳＣを用いた免疫受容体の毒性のスクリーニング。ｉＰＳＣは系譜特異的な細胞に直接分化される（左パネル）、またはデスレポーター遺伝子（中央パネル）もしくは系譜特異的なレポーター遺伝子（右パネル）で改変された後に分化される。分化した細胞の潜在的な認識は、免疫受容体媒介性認識（左パネル）を使用する、または免疫受容体を発現するＴ細胞と共培養することによってモニターされる。 ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇＨＬＡ−Ｂ／Ｃ／ＤＲＢ１ホモ接合ｉＰＳＣを分化することによって、疾患を治療する方法を説明している図。 レポーター遺伝子発現を媒介するＳｅＶベクター。図４Ａ：活性化Ｔ細胞は指定されたＭＯＩ及び細胞数でＧＦＰをコードするＳｅＶベクターに感染した。１日目のフローサイトメトリーのデータを示している。Ｘ軸：ＧＦＰ発現、Ｙ軸：ＣＤ３。ＭＦＩ：平均蛍光強度。右上の象限の数字はＣＤ３＋ＧＦＰ＋細胞の割合を表している。図４Ｂ：１日目から７日目のＧＦＰ発現。毎日ＭＦＩを測定し、グラフにプロットした。黒四角：ＳｅＶなし、白丸：ＭＯＩ＝１、１×１０^６、黒丸：ＭＯＩ＝３、１×１０^６、白ひし形：ＭＯＩ＝１、５×１０^５、黒ひし形：ＭＯＩ＝３、５×１０^５。 レポーター遺伝子発現を媒介するＳｅＶベクター。図４Ａ：活性化Ｔ細胞は指定されたＭＯＩ及び細胞数でＧＦＰをコードするＳｅＶベクターに感染した。１日目のフローサイトメトリーのデータを示している。Ｘ軸：ＧＦＰ発現、Ｙ軸：ＣＤ３。ＭＦＩ：平均蛍光強度。右上の象限の数字はＣＤ３＋ＧＦＰ＋細胞の割合を表している。図４Ｂ：１日目から７日目のＧＦＰ発現。毎日ＭＦＩを測定し、グラフにプロットした。黒四角：ＳｅＶなし、白丸：ＭＯＩ＝１、１×１０^６、黒丸：ＭＯＩ＝３、１×１０^６、白ひし形：ＭＯＩ＝１、５×１０^５、黒ひし形：ＭＯＩ＝３、５×１０^５。 Ｔ細胞のｉＰＳＣ細胞へのリプログラミング。ｉＰＳＣの位相コントラストビュー。１６日目にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ 抗−ＴＲＡ−１−６０抗体でＴＲＡ−１−６０の生きている状態で染色した。 ｉＰＳコロニーの免疫蛍光染色。固定後、指定された抗体及びＡｌｅｘａ４８８複合二次抗体でｉＰＳコロニーを染色した。蛍光顕微鏡で撮像する直前にＤＡＰＩ染色を行った。 ｉＰＳＣのヌクレオフェクション。ＤＮＡプラスミドまたはｅＧＦＰレポーターをコードするｍＲＮＡをヌクレオフェクションによってｉＰＳＣに導入した。端的には、百万個の完全に分離したｉＰＳＣを、Ｐ３緩衝液２０μｌに再懸濁し、ｍＲＮＡまたはＤＮＡと混合し、ストリップに移し、４Ｄヌクレオフェクター（プログラム：ＣＡ−１３７）を使用してヌクレオフェクトした。ｉＰＳＣ中の１日目のＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによって評価した。示すデータはＴＲＡ−１−６０陽性集団にゲートされている。 ジンクフィンガーヌクレアーゼによるＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ遺伝子の破壊。ゲル画像内の矢印は、Ｃｅｌ−１酵素によって媒介される消化されたＰＣＲ産物を示し、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ標的ＺＦＮがＺＦＮ標的部位で所望の変異を導入することを示している。 配列決定によるＴＲＡＣ遺伝子破壊の解析。ＷＴ＝配列番号１；＃１３−１＝配列番号２；＃１３−２＝配列番号３。 ｓｓＯＤＮ＋ＺＦＮによるＴＣＲ遺伝子の崩壊。ＴＲＡＣ標的部位内の終止コドンを導入するために、一本鎖オリゴヌクレオチドをＴＲＡＣ標的ＺＦＮを有する細胞に導入した。１０〜１４日間培養した後、ＺＦＮ標的部位での意図された突然変異がデジタルドロップレットＰＣＲにより検出された。 ｓｓＯＤＮ＋ＺＦＮによるＴＣＲ遺伝子の崩壊。ＴＲＡＣ標的部位内の終止コドンを導入するために、一本鎖オリゴヌクレオチドをＴＲＡＣ標的ＺＦＮを有する細胞に導入した。１０〜１４日間培養した後、ＺＦＮ標的部位での意図された突然変異がデジタルドロップレットＰＣＲにより検出された。 スリーピングビューティー及びレンチウイルスによるＣＡＲ導入の構築物。この図は、ｉＣａｓｐ９及びＣＤ１９標的ＣＡＲを導入するためのＳＢ系のプラスミド及びレンチウイルスの概略図を示している。 スリーピングビューティー及びレンチウイルスによるＣＡＲ導入の分析。 ｉＰＳ細胞からＴ細胞を再分化するプロトコル及び分析。ｉＰＳＣから造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化するために、適切なサイトカインを含むＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレート中の培地に胚様体を形成した。１３日目に、ＣＤ３４^ｐｏｓ及びＣＤ４３^ｐｏｓ造血幹細胞をフローサイトメトリーによって検出した。 ｉＰＳ細胞からＴ細胞を再分化するプロトコル及び分析。ｉＰＳＣから造血幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ分化するために、適切なサイトカインを含むＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）プレート中の培地に胚様体を形成した。１３日目に、ＣＤ３４^ｐｏｓ及びＣＤ４３^ｐｏｓ造血幹細胞をフローサイトメトリーによって検出した。

Ｉ．実施形態の態様

本明細書は、大規模な患者集団に適用可能な養子細胞治療製品を製造するための人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ細胞）の適用を記載している。（例えば免疫受容体の）潜在毒性をスクリーニングするための当該ｉＰＳＣの使用も記載している。本明細書で詳しく説明している細胞によって、広範囲の疾患の治療に使用される治療薬がもたらされる。特に、前記細胞は治療を受けることができる以上のより広範囲の患者集団に使用しても差し支えない改変されたＨＬＡ遺伝子を含む。特定の態様では、実施形態の細胞は、ＨＬＡ対立遺伝子の１つまたは複数のペアにホモ接合性であり、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ表現型を含む。これらの特徴によって、前記細胞を多数の患者にとって有効な免疫適合性のある細胞にし、それによって個別の患者のために開発された治療法よりはるかに低コストで生み出すことができる細胞ベースの治療法を提供する。

図３に示すように、ｉＣａｓｐ９^＋ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ細胞等のＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ細胞は、ＨＬＡ−Ａコード遺伝子の選択的崩壊によってＨＬＡホモ接合細胞から生成することができる。例えば、ｉ）ｉＣａｓｐ９遺伝子（またはその他の自殺遺伝子）を導入するためのスリーピングビューティー（ＳＢ）トランスポゾン／トランスポサーゼ系（またはその他の遺伝子導入方法）、及びｉｉ）ＨＬＡ−Ａを除去するためのジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはその他の人工ヌクレアーゼ（例えばＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）で遺伝子改変されることによるＨＬＡホモ接合臍帯血細胞。これらの細胞は、リプログラミング因子を導入する（例えばＯｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２、及びｃ−ｍｙｃをコードするセンダイウイルスを使用する）ことによってｉＰＳＣにリプログラムすることができる。あるいは、ｉＰＳＣクローンをＳＢ及びＺＦＮで直接的に遺伝子改変し、言い換えれば、前記細胞をまずリプログラムし、その後遺伝子改変してもよい。遺伝的にセーフハーバープロファイルを有することが確認されているｉＰＳＣクローンを単離した後に、前記細胞を系譜特異的な細胞に分化することができ、当該細胞を免疫治療及び／または再生医療のために患者に投与してもよい。ｉＰＳＣを分化するための１つのアプローチは、遺伝子改変されたＫ−５６２細胞に由来する細胞等の人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）の使用を伴う。

Ａ．ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇＨＬＡ−ホモ接合性ｉＰＳＣの生成及びその使用方法

本発明の実施形態は、免疫療法及び再生医療のための同種異系細胞治療のための同種異系ｉＰＳＣバンクを提供する。事前準備されオンデマンド注入することができる特徴を有した製品を製造することは、利用可能というより必要なときに、集中的に製造し、細胞ベースの治療を送達することができる大きな魅力を有している。さらに、ｉＰＳＣの遺伝子操作及びクローンの特徴付けによって、下流の臨床グレード製品を製造することが可能になる。この技術によって、臨床医が同種異系治療用細胞をオンデマンドで注入する治療プロセスが促進され、ドナー間異種性が減少し、また、細胞治療製品を調製するコストを低減する。

既存のドナープールへのアクセスを改善する方法は、臨床的影響を与えることが予想される。実際に、国立骨髄ドナープログラム（ＮＭＤＰ）は、米国で約１万人の患者が血縁関係のない同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の恩恵を受けることができると試算している。同種異系ＨＳＣがＨＬＡ−Ａ遺伝子座の発現を排除するように遺伝的に編集されれば、既に登録されているドナーの臨床適用が著しく増加すると思われる。ＮＭＤＰのモデリングによると、ＨＬＡ−Ａ適合の必要性がなくなり、ＨＬＡ−Ｂ、−Ｃ、及び−ＤＲのみに適合すれば、アフリカ系アメリカ人のレシピエントがＨＬＡ適合ドナーを見つける機会が１８％から７３％に増加することが示されている。操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（または例えばＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９といったその他の人工ヌクレアーゼ）は、遺伝的に編集されたＴ細胞及び細胞株中のＨＬＡ−Ａ発現を排除することができる。ＺＦＮを使用してＨＳＣ中のＨＬＡ−Ａ発現を排除することによって、ＨＬＡ適合ドナーを見つける機会が増える魅力的な方法が提供される。このことによって、特に少数民族に属する患者にとって同種異系ＨＳＣＴの臨床適用を広げることが予想される。

ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇＨＬＡホモ接合ｉＰＳＣのバンクの作成が、複数のレシピエントに注入することができるため、これらの問題を解決する。前記バンクの作成は、臍帯血に由来するｉＰＳＣ等の（表１参照、ＨＬＡ−Ｂ、−Ｃ、及び−ＤＲＢ１がホモ接合の）約２７名の固有のドナーから、（例えばデザイナージンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して）ＨＬＡ−Ａをノックアウトすることによって達成することができる。これらのｉＰＳＣバンクは免疫治療及び再生医療を改善するために遺伝子を挿入する、及び削除するように操作することができる。これらのＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇｉＰＳＣ及びそれから分化された細胞（例えば免疫細胞、心細胞、腎細胞）は、免疫細胞ならびにその他の治療用細胞、例えば、限定されないが、サブタイプを含む心細胞、膵臓、腎臓、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞、及びＴ細胞を生成するために使用することができる非常に価値のあるリソースになる。これは、疾患（例えばがん、自己免疫疾患、感染症）の治療及び再生医療を生み出す。

しかしながら、注入された同種異系Ｔ細胞上の内因性αβＴ-細胞受容体（ＴＣＲ）は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を引き起こすレシピエントの主要及び非主要組織適合性を認識し得る。これを克服するために、不要な同種異系免疫反応を引き起こす内因性ＴＣＲαβ及びγδ発現を排除することができる。このステップはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を導入する、例えば、ＴＣＲα定常領域またはβ定常領域を標的にすることを含む適切な方法で行うことができる。

Ｂ．オフターゲットの毒性及びレシピエントによる認識を回避するためのｉＰＳＣの使用

標的抗原の発現を同定する現在のスクリーニング方法は限定されている。本発明の実施形態は、ｉＰＳＣ／ｉＰＳＣ由来の細胞のスクリーニングを提供し、免疫受容体の潜在毒性を予測するための現在の問題を解決する。それ自体として、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇＨＬＡホモ接合ｉＰＳＣのバンクは、免疫療法のために潜在的に操作された免疫細胞から生じる毒性をスクリーニングするための細胞の供給源として使用することができる。ｉＰＳＣを使用して、意図しない有害事象（オンターゲット及びオフターゲット毒性）をスクリーニングすることによって、内因性または導入された免疫受容体による予期できないオフターゲット毒性の可能性を減少させることによって、養子Ｔ細胞療法（及び他の免疫細胞を注入する療法）が改善する。例えば、ヒトに適用する前に、クローン化／操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及びキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の潜在的な毒性をスクリーニングする必要がある。このスクリーニングは操作されたｉＰＳＣのパネル及びその分化した子孫を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで達成することができる。

ＩＩ．実施形態の細胞

本発明の特定の実施形態では、人工多能性幹細胞を生成するためにリプログラミング因子を導入することによって、体細胞がリプログラムされる。これらの細胞の子孫は以下に記載される様々な態様の胚性幹細胞と同一であってもよく、当該技術分野で周知である。胚性幹細胞の特徴を理解することによって、これらの方法によって作製される人工多能性幹細胞の選択に役立つ可能性がある。幹細胞のリプログラミングの研究から知られているリプログラミング因子をこれらの方法に使用することができる。

「細胞」という用語は、当該技術分野で最も広義の意味で本明細書で使用され、多細胞生物の組織の構造単位である生体を意味し、外部から分離している膜構造によって取り囲まれ、自己複製する能力、発現するための遺伝情報及び機序を有する。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞あっても、人工的に改変された細胞（例えば融合細胞、遺伝子改変細胞等）であってもよい。

「分化された細胞」という用語は、本明細書で使用されるとき、未分化の表現型から特定化された表現型に開発された細胞を指すことができる。例えば、胚細胞は腸の内層の上皮細胞に分化することができる。分化された細胞は、例えば胎児または出生した動物から単離することができる。

「未分化細胞」という用語は本明細書で使用されるとき、未分化表現型を有する、及び分化することができる前駆細胞を指すことができる。未分化細胞の例は幹細胞である。

本明細書で使用するとき、「幹細胞」という用語は、自己複製及び多分化能が可能な細胞を指す。「多能性」は、細胞がその子孫を介して、成体動物を含む全ての細胞型を生じることができることを意味し、生殖細胞及び全ての３つの胚葉、内胚葉（内部胃内層、消化管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、または外胚葉（上皮組織及び神経系）を含む。本明細書の幹細胞は、限定されないが、胚性幹（ＥＳ）細胞、組織幹細胞（組織特異的幹細胞または体性幹細胞とも呼ばれる）、または人工多能性幹細胞であってもよい。上述の能力を有する人工的に作製された細胞（例えば融合細胞、リプログラムされた細胞または本明細書で使用される細胞等）は幹細胞であってもよい。

「胚性幹（ＥＳ）細胞」という用語は、本明細書で使用されるとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培地で維持されている胚から単離された多能性細胞を指すことができる。このような細胞は、生殖細胞を含む成体動物を含む全ての細胞型をｉｎ ｖｉｖｏで生み出す能力を培地で保持している培養胚から単離された培養細胞を急速に分裂している。胚性幹細胞は、丸い細胞形態を有していてもよいし、支持細胞層上の丸みを帯びた細胞塊中で増殖することができる。胚性幹細胞は当業者に知られている。

組織幹細胞は細胞が由来する部位に基づいてカテゴリーに分けられ、例えば、皮膚系（例えば表皮幹細胞、毛包幹細胞等）、消化器系（例えば膵（共通）幹細胞、肝幹細胞等）、骨髄系（例えば造血幹細胞、間葉系幹細胞等）、神経系（例えば神経幹細胞、網膜幹細胞、等）がある。

一般にｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと略記される「人工多能性幹細胞」は、非多能性細胞、典型的には成体体細胞、または線維芽細胞等の最終分化細胞、造血細胞、筋細胞、神経細胞、上皮細胞等の一時的に分化された細部から、リプログラミング因子を発現させることによって、人工的に調製された多能性幹細胞の種類を指す。

「自己再生」とは、未分化状態を維持しながら、細胞分裂の多くのサイクルを通過する能力を指す。

本明細書で使用するとき、「体細胞」という用語は、卵、精子等の生殖細胞以外の任意の細胞を指し、次の世代にＤＮＡを直接転送しない。典型的には、体細胞は多能性が限定されているか全く有さない。本明細書で使用される体細胞は、天然または遺伝的に改変されてもよい。

細胞に関連して「培養された」という用語は、本明細書で使用されるとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境で細胞分化をしている、または細胞分化をしていない１つまたは複数の細胞を指す。ｉｎ ｖｉｔｒｏの環境は、例えば適切な液体培地または寒天等のｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を維持するのに適した当該技術分野で周知の培地であってもよい。

本発明の実施形態に記載の培地は、血清を含むまたは無血清培地であってもよい。無血清培地は、未処理または未精製の血清を含まない培地を指し、したがって精製された血液由来成分または動物組織由来成分（例えば、増殖因子等）を有する培地を含むことができる。異種の動物由来成分の混入を防止する観点から、血清は幹細胞と同じ動物に由来してもよい。

本発明の実施形態に記載の培地は血清の代替物を含んでいても、含んでいなくてもよい。血清の代替物として、アルブミン（脂質が豊富なアルブミン、組み換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（またはその他の鉄トランスポーター）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、または３’−チオルギイセロール、またはその等価物を適切に含む物質が挙げられる。

Ａ．幹細胞

幹細胞は全てでないにしても多細胞生物に最も多く見いだされる細胞である。幹細胞は有糸分裂細胞の分裂によって自身を更新する能力、及び多様な範囲の特定化された細胞型に分化することによって特徴付けられる。哺乳動物の幹細胞は２つの大きな種類、胚盤胞に見いだされる胚性幹細胞及び成体組織で見いだされる成体幹細胞がある。発達中の胚では、幹細胞はあらゆる特定化された胚組織に分化することができる。成体では、幹細胞及び前駆細胞は身体にとって修復システムとして機能し、特定化された細胞を補充するだけでなく、血液、皮膚または腸組織等の再生性の臓器の正常な代謝回転を維持する。

幹細胞は増殖し、細胞培地によって、筋肉または神経等の様々な組織の細胞と一致する特徴を有する特定化された細胞に形質転換されるため、医薬療法における幹細胞の使用が提案されている。成体細胞を人工多能性幹細胞にリプログラミングすることは大きな可能性を有する。

これまでのほとんど全ての研究は、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳ）またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を使用して行われている。両者は本質的な幹細胞の特徴を有しているが、未分化状態を維持するのにかなり異なる環境を必要とする。マウスＥＳ細胞はゼラチン層で増殖し、白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在を必要とし得る。ヒトＥＳ細胞はマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層で増殖し、多くの場合、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）の存在を必要とし得る。最適な培養条件または遺伝子操作（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、２００３）がなければ、胚性幹細胞は急速に分化する。

ヒト胚性幹細胞はいくつかの転写因子及び細胞表面タンパク質の存在によって規定することができる。転写因子Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２は分化及び多能性の維持を導く遺伝子を確実に抑制するコア制御ネットワークを形成する（Ｂｏｙｅｒら、２００５）。ｈＥＳ細胞を同定するために最も多く使用される細胞表面抗原として、糖脂質ＳＳＥＡ３及びＳＳＥＡ４ならびにケラタン硫酸抗原Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１が挙げられる。

Ｂ．リプログラミング因子

ｉＰＳ細胞の生成は誘導に使用される遺伝子に依存している。Ｏｃｔ３／４、ＫＬＦ４、Ｓｏｘ２及び／またはｃ−ｍｙｃといった因子またはそれらの組合せを使用することができる。これらのリプログラミング因子をコードする核酸は、単シストロン性または多シストロン性発現カセットに含まれ得る。同様に、前記単シストロン性または多シストロン性発現カセットをコードする核酸は、１つのリプログラミングベクターまたは複数のリプログラミングベクターに含まれ得る。

Ｏｃｔ３／４は、多能性の維持に重要な役割を果たしている。卵割球及び胚性幹細胞等のＯｃｔ３／４^＋細胞にＯｃｔ３／４が不在であることによって、自発的な栄養膜の分化が導かれ、Ｏｃｔ３／４の存在によって胚性幹細胞の多能性及び分化能が生じる。

遺伝子のＫｌｆファミリーのＫＬＦ４は、初めにマウスｉＰＳ細胞の生成のための因子として同定され、後にヒトｉＰＳ細胞の生成のための因子であることが証明された。Ｋｌｆ２及びＫｌｆ４はｉＰＳ細胞を生成することができる因子であることが見いだされ、関係する遺伝子Ｋｌｆ１及びＫｌｆ５も効果は低いものの同様の能力が見いだされた。

遺伝子のＳｏｘファミリーはＯｃｔ３／４と同様に多能性の維持に関連するが、Ｏｃｔ３／４と対照的に多能性と単能性に関連し、多能性幹細胞にもっぱら発現する。Ｓｏｘ２はＹａｍａｎａｋａら（２００７）、Ｊａｅｎｉｓｃｈら（１９８８）とＹｕら（２００７）による誘導に使用された最初の遺伝子であり、Ｓｏｘファミリーの他の遺伝子も同様に、誘導の過程で動作することが分かっている。Ｓｏｘ１はＳｏｘ２と同様の効率でｉＰＳ細胞を生み出し、遺伝子Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、及びＳｏｘ１８も効率が低いもののｉＰＳ細胞を生成する。

遺伝子のＭｙｃファミリーは、がんに関与する癌原遺伝子である。Ｙａｍａｎａｋａら（２００７）及びＪａｅｎｉｓｃｈら（１９８８）は、ｃ−ｍｙｃがマウスｉＰＳ細胞の生成に関与する因子であることを証明し、Ｙａｍａｎａｋａら（２００７）は、ｃ−ｍｙｃがヒトｉＰＳ細胞の産生に関与する因子であることを証明した。Ｎ−ｍｙｃ及びＬ−ｍｙｃは、ｃ−ｍｙｃと同様の効率で多能性を誘導することが確認されている。

特定の実施形態では、１つまたは複数のリプログラミング因子で細胞を誘導する他に、ＨＤＡＣ阻害因子、Ｗｎｔ経路阻害因子、Ｏｃｔ４活性化因子、ヒドロコルチゾン、幹細胞因子、ＥＰＯ、ＩＬ−３、ＣＨＩＲ９９０２１、Ａ−８３−０１、ｈＬＩＦ、及び／またはｂＦＧＦを含むリプログラミング培地で細胞は処理される。このような分子を使用することにより、リプログラミング効率及び速度を改善することができ、それによって一次リプログラミング培養中のｉＰＳ細胞の同定を容易にし、ｉＰＳ細胞のクローン性を維持する。

Ｃ．人工多能性細胞の生成方法

ｉＰＳ細胞は、特定の幹細胞関連遺伝子を成体線維芽細胞または臍帯血細胞等の非多能性細胞にトランスフェクションすることによって典型的に生じる。トランスフェクションは、レトロウイルス等の統合ウイルスベクター、またはセンダイウイルス等の非統合ウイルスベクターによって達成することができる。臨界期後、少数のトランスフェクトされた細胞は、多能性幹細胞に形態的及び生化学的に類似し始め、形態学的選択、倍加時間、レポーター遺伝子の発現、及び／または抗生物質耐性によって単離することができる。

ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２をコードするレトロウイルスベクターを用いて人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の先駆的な生成の後、これらの因子を多くの種類の細胞に導入する様々な方法が開発されている。このなかでも、センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクターは、分化されたＴ細胞からｉＰＳＣを効率的に生成するために使用されている。ＳｅＶは約１５ｋｂの一本鎖、ネガティブセンス、非分節ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。組換えセンダイウイルスベクターは、感染細胞の細胞質中でのみ複製し、ＤＮＡの相を通過または宿主ゲノムに統合されない。ＳｅＶベクターは、維持の間にＴ細胞をｉＰＳＣにリプログラムした後に減少する。

人工多能性幹細胞の生成過程は、ゆっくりとしており、非効率で、大部分の細胞が失敗する。この過程の効率を改善するために、導入遺伝子サイレンシングは多能性細胞に非常に効果的であるため、リプログラミング因子及び任意にレポーターを含む構築物を使用するベクターを使用して、最初にレポーターの存在で選択し、後にレポーター遺伝子の発現に対して選択することによってトランスフェクションの効率を最適化することができる。

異所性リプログラミング因子の強制的な持続的な発現は、腫瘍形成の頻度の増加に繋がり得、この問題は導入遺伝子を含まないｉＰＳ細胞の生成によって解決する。導入された遺伝子の一式は、リプログラミングプロセスを開始するために必要となり得るが、細胞自身の内因性多能性遺伝子が徐々に活発になり、導入された遺伝子は確率的な再活性化の能力で発現抑制される。細胞が自律的な多能性状態に至るには、外因性の要因が最低でも約１０〜１６日間必要とされ得る（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋら、２００８；Ｓｔａｄｔｆｅｌｄら、２００８）。導入遺伝子発現の最小長の決定によって、ｉＰＳ細胞を生じさせる非組み込み送達方法の開発が可能になる。

ヒト体細胞からの多能性幹細胞の誘導は、リプログラミング遺伝子の異所性発現のためにレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを用いて達成される。モロニーマウス白血病ウイルス等の組換えレトロウイルスは、逆転写酵素の機能によって安定的に宿主ゲノムに統合する能力を有している。レンチウイルスはレトロウイルスのサブクラスである。レンチウイルスは非分裂及び分裂細胞のゲノムに統合する能力によって、ベクターとして広く適用されている。ウイルスベクターを用いたｉＰＳ細胞のリプログラミングの方法は、当該技術分野で周知である。

統合ウイルスベクターの使用は、内因性遺伝子の突然変異を引き起こし得、またはウイルスベクターは宿主細胞の染色体のランダムな配置に遺伝子の統合を媒介するため、内因性癌遺伝子の活性化を引き起こし得る。したがって、ｉＰＳ細胞は、リプログラミング因子を統合するゲノムがなくても調製することができる。このような方法は、米国特許第８，５４６，１４０号及び８，２６８，６２０号に記載され、その全体が参照により本明細書に援用される。例えば、ＥＢＶまたはその変異体を含むエピソームベクター要素を使用してもよい。さらなる態様では、ｉＰＳ細胞のエピソームのベクター要素をリプログラミング後に除去してもよい。

標的細胞に対する外因性の遺伝的改変を導入することを回避するための１つの可能な方法は、送達された遺伝子型からの転写に頼るよりも、リプログラミングタンパク質を細胞に直接送達することであると思われる。先行研究によると、ＨＩＶ Ｔａｔ及びポリアルギニン等のタンパク質の形質導入を媒介する短いペプチドをタンパク質に結合させることによって、様々なタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで細胞に送達することができることを証明している。最近の研究では、組み換えリプログラミングタンパク質を直接送達することによって、マウス線維芽細胞を多能性幹細胞に完全にリプログラムすることができることを証明している（Ｚｈｏｕら、２００９）。

出発細胞と分化された細胞は、一般的に培養培地及び条件に関して異なる要件を有する。分化因子を導入した後に、培地の存在下、及び出発細胞の増殖に適することが知られている培養条件下で、培養の少なくとも初期段階を行うことが一般的である。これは、分化培地の存在下で、及び分化された細胞に適することが知られている条件下で、培養の次の期間も続けられる。分化に十分な時間が経過した後、分化された細胞は、拡充培地で分化された細胞を拡大するためにさらに培養してもよい。このような拡充培地は１つまたは複数のシグナル伝達阻害剤を含んでいてもよく、またはこれらの阻害剤が本質的に含まれない培地を含んでいてもよい。分化条件はフィーダー細胞を本質的に含まなくてもよい。さらなる態様では、分化培地は化学的に規定されていてもよい。

Ｄ．リプログラムされた細胞の選択

実施形態のある態様では、リプログラミングベクターを体細胞に導入した後に、これらの体細胞は拡大するために培養される。細胞は、トランスフェクトされた細胞を濃縮するために、レポーターまたは選択マーカー等のベクター要素の存在で選択してもよい。リプログラミングベクターは、これらの細胞にリプログラミング因子を発現し、複製し、細胞分裂と一緒に分割する。これらの発現されたリプログラミング因子は、体細胞ゲノムをリプログラムし、自己持続性多能性状態を確立し、ベクターの存在の正の選択を除去する間または除去した後に、外因性の遺伝要素は、非統合ベクターが使用される実施形態で徐々に失われる。導入遺伝子の発現のこのサイレンシングは、単にレポーター遺伝子の発現を遮断するか、または他の胚性幹細胞の特徴（例えば形態、増殖特性、幹細胞マーカー、幹細胞遺伝子、テロメラーゼ活性、多能性、奇形腫形成、胚様体形成、胚盤胞注入、プロモーターの脱メチル化、及びヒストン脱メチル化）で選択することと組み合わせてレポーター遺伝子の発現を遮断することによって、人工多能性幹細胞を選択することを可能にする。これは、このような他の胚性幹細胞の特徴が多能性胚性幹細胞と実質的に同じであることが予想されるためである。リプログラミングベクターＤＮＡの不在を試験するまたは選択マーカーを使用することによって、外因性遺伝子要素を本質的に含まないｉＰＳ細胞の選択を加速しまたは助けるために、追加の負の選択工程を使用することもできる。

実施形態の方法で使用されるレポーター遺伝子の性質に依存して、いくつかの方法のいずれか１つで、検出可能なシグナルを生成してもよい。例えば、検出可能なシグナルは例えばＧＦＰ等の蛍光シグナルであってもよい。フローサイトメトリー、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）はレポーター遺伝子の発現に基づいた検出可能なシグナルを選択するのに一般に使用される。ルシフェラーゼはまた、アッセイのための基礎として使用することができる。酵素ベースのアッセイは、検出が必ずしも蛍光を介していないことを除いて、ルシフェラーゼベースのアッセイと同様に行われる。検出技術は酵素に依存し、したがって、光学的であってもよい（例えば、βガラクトシダーゼ等）。実施形態のレポーター遺伝子の発現を同定しまたは定量するために、物理的及び生化学的手法もまた使用してもよい。これらの方法は当業者に知られている。

体細胞をｉＰＳＣにリプログラミングした後に、細胞集団から１つまたは複数の細胞のサブ集団を実質的に精製し、または分離することが望ましい場合がある。ＦＡＣＳ、またはｍａｇｎｅｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ等のフローサイトメトリーを使用した細胞分離の方法を用いて、不均一な細胞集団からｉＰＳ細胞を分離してもよい。例示的な細胞分離のプロトコルは、以下の実施例にも示す。

Ｅ．リプログラムされた細胞の培養

多能性細胞は培養され、種々の方法を用いて未分化状態で維持することができる。特定の実施形態では、多能性細胞を培養し、ＴｅＳＲまたはＥ８培地等の既定のフィーダー非依存培養システムを使用して、本質的に未分化状態に維持してもよい（例えばＣｈｅｎら（２０１１）を参照のこと、参照により本明細書に援用される）。ＴｅＳＲ培地は、例えば、未分化ヒト胚性幹細胞を培養するために使用することができる培地として確定している。ＴｅＳＲ培地はＴｅＳＲ１培地及びｍＴｅＳＲ培地の両方を含む。ＴｅＳＲは、ｂＦＧＦ、ＬｉＣｌ、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ピペコリン酸及びＴＧＦβを含み、ＴｅＳＲを利用した種々の方法は以前から記載されており、例えば、米国特許第７，４４９，３３４号、及びＬｕｄｗｉｇら（２００６ａ、２００６ｂ）があり、その全体が参照により本明細書に援用される。あるいは、未確定の条件を使用してもよく、例えば、肝細胞を未分化状態に維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞、または線維芽細胞フィーダー細胞に暴露されている培地で、多能性細胞を培養してもよい。

フィーダー非依存の培養システム及び培地を使用して、ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣ等の多能性細胞を培養し維持してもよい。これらの方法は、ヒト胚性幹細胞を、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とすることなく、本質的に未分化状態にすることができる。本明細書に記載されるように、必要に応じてコストを削減するために、これらの方法に様々な修正をしてもよい。

いくつかの態様では、実質的または本質的に未分化状態で、多能性細胞を培養し、維持するために、マトリックス成分が既定の培地に含まれていてもよい。適切な半固体マトリックスに培養すると、コロニー形成細胞（ＣＦＣ）と呼ばれる個々の前駆細胞が増殖し、分離した細胞クラスターまたはコロニーを形成することができる。ＣＦＣアッセイは、細胞懸濁液を栄養素及びサイトカインを補充したメチルセルロースまたはコラーゲン等の半固体培地に配置し、例えば約３７℃でインキュベーションすることによって行うことができる。

様々なマトリックス成分を使用してｈＥＳＣまたはｉＰＳＣ等の多能性細胞を培養し維持することができる。例えば、Ｌｕｄｗｉｇら（２００６ａ）の記載のように、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチンを組み合わせて使用し、胚性細胞の培養及び維持のための固体支持体をもたらしてもよい。

Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を使用して多能性細胞の細胞培養及び維持の基質をもたらしてもよい。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）はマウス腫瘍細胞によって分泌されるゼラチン状のタンパク質混合物であり、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州、米国）から市販されている。前記混合物は、多くの組織に見られる複雑な細胞外環境に似ており、細胞培養のための基質として、細胞生物学者によって使用されている。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）と共に規定の培地でヒト胚性幹細胞を培養し維持する方法は例えばＬｕｄｗｉｇら（２００６ａ）に記載があり、多能性細胞を培養するために使用してもよい。ヒト胚性幹細胞を培養し維持する方法の追加の方法は、当業者に周知であり、本発明の実施形態と共に使用してもよいことは理解される。

Ｆ．リプログラムされた細胞の分化

「分化」は、分化のない同じ条件下というより、培養またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、あまり特定化されていない細胞がより特定化された細胞になっていく過程である。特定の条件下では、あまり特定化されていない細胞から、より特定化された細胞の特徴を有する子孫を形成する割合は、増加する優先順に少なくとも約１％、５％、２５％以上であり得る。

実施形態に従って様々な方法を使用して、限定されないが、造血幹細胞、免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫＴ細胞）、筋細胞（例えば心筋細胞）、神経細胞、ベータ膵島細胞、腎細胞、肺細胞、線維芽細胞及び表皮細胞、ならびにそれに由来する組織または器官を含む細胞系譜に、ｉＰＳ細胞を分化させてもよい。

１．造血幹細胞

ｉＰＳＣは造血前駆細胞または造血幹細胞に培養及び／または分化されてもよい。しかしながら、当業者は、種々の方法が多能性細胞から造血前駆細胞を生成するために使用されてもよいことを認識する。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第８，３７２，６４２号は、造血前駆細胞を生成するために非常に効率的な培養システムを詳述している。

造血前駆細胞は、規定の培養条件を用いて、フィーダー細胞を用いて生成してもよい。例えば、部分的に、本質的に、または完全に多能性細胞を分離しまたは個別化した後、前記細胞を規定の培地でさらに培養し、造血分化を促進してもよい。成長因子の特定の組み合わせは、実質的に多能性細胞を造血前駆細胞及び造血細胞系統へ分化することを促進することができることが認められている。成長因子の特定の組み合わせの連続した適用を、多能性細胞の分化をさらに促進するために使用してもよい。特定の実施形態では、成長因子の特定の組み合わせは、多能性細胞の造血分化に重要である。例えば、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、及びＧＭＣＳＦの組み合わせを、造血分化を促進するために使用してもよい。特定の態様では、細胞培養物をＢＭＰ４及びＶＥＧＦ（任意にＦＧＦ−２）を含む第一の培地に連続して暴露し、次にＦｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、及びＧＭＣＳＦを含む第二の培地で培養することによって、多能性細胞の造血前駆細胞及び造血細胞への分化を増加させることができる。

多能性細胞の造血前駆細胞への分化は規定のまたは規定されていない条件を使用して行うことができるが、得られる細胞がヒト対象に投与されることを意図する場合、規定の条件が実施形態では一般的に好ましいことが分かる。造血幹細胞は、規定の条件下で多能性細胞から培養されてもよい（例えばＴｅＳＲ培地及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）等のマトリックス成分またはＥ８培地を使用する）。

例えば、規定の培地は造血性ＣＤ３４^＋分化を誘導するように使用してもよい。上述のように、規定の培地は、成長因子ＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３及び／またはＧＭＣＳＦを含んでもよい。実質的に低酸素条件（例えばＯ_２が２０％未満）は、造血または内皮細胞の分化をさらに促進することができる。

多能性細胞の造血前駆細胞への分化のための規定された方法の使用は特定の例では好まれる場合もあるが、規定されていない方法を様々な実施形態で使用してもよい。ｉＰＳＣからの造血幹細胞の分化のための１つの未定義の方法は、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層、またはＣＤ３４^＋への強固な分化を誘導するマウス間質細胞株ＯＰ９等のフィーダー細胞でｉＰＳＣを培養することを含む。規定の条件とは対照的に、ＯＰ９細胞の使用は、一般的にＣＤ３４^＋分化を誘導するための余分な増殖因子を必要としない。

２．造血幹細胞

ｉＰＳＣ等の多能性幹細胞は、適切な条件下で分化を誘導されまたは補助されるとき、骨髄、赤血球、及び巨核球造血細胞系統を生じる能力を維持しながら、無制限の自己再生が可能である。

造血細胞へのｉＰＳ細胞の分化の例示的な方法として、例えば、米国特許第８，５５７，５８０号及び８，３７２，６４２号及びＷＯ１２／１０９２０８によって開示された方法（これらはすべて参照により全体が本明細書に援用される）、またはその他の方法（Ｃｈａｄｗｉｃｋら、２００３；Ｎｇら、２００５）が挙げられる。Ｗａｎｇら（２００７）に例示されるように、フィブロネクチンの分化の方法は血液系譜分化に使用してもよい。米国特許出願公開第２００３／０１５３０８２号に記載されるように、造血細胞は造血サイトカイン及び骨形成タンパク質で幹細胞を培養することによって作製することもできる。

ａ．キメラ抗原受容体及びＴ細胞受容体

本明細書で使用されるとき、「抗原」という用語は抗体またはＴ細胞受容体によって結合することができる分子である。抗原はＢ及び／またはＴリンパ球の作製を導く体液性免疫応答及び／または細胞免疫応答を追加的に誘導することができる。「腫瘍関連抗原」及び「腫瘍細胞抗原」という用語は、本明細書で交換可能に使用される。それぞれの場合で、前記用語は、癌細胞によって特異的または優先的に発現されるタンパク質、糖タンパク質または炭水化物を指す。

「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、例えば、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指してもよく、特定の免疫エフェクター細胞に人工的な特異性を移植する操作された受容体を含んでもよい。ＣＡＲはモノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与するために使用してもよく、それによって、例えば養子細胞治療で使用する多数の特異的Ｔ細胞を生成することができる。特定の実施形態では、ＣＡＲは例えば、腫瘍関連抗原に細胞の特異性を導く。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様では、ＣＡＲはＣＤ３−ゼータ膜貫通ドメイン及びエンドドメインに融合される、モノクローナル抗体から生じる一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）の融合を含む。他のＣＡＲの設計の特異性は、受容体のリガンド（例えばペプチド）、またはデクチン等のパターン認識受容体に由来してもよい。例えば、Ｂ系分子、ＣＤ１９に特異的なＣＡＲを使用することによるＴ細胞の特異性を再指示することによって、悪性Ｂ細胞を標的とすることができる。特定の場合では、抗原認識ドメインのスペーシングは、活性化誘導細胞死を減少させるために変更することができる。特定の場合では、ＣＡＲはＣＤ３−ゼータ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／またはＯＸ４０等の追加の共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。いくつかの場合では、分子はＣＡＲと共発現することができ、共刺激分子、イメージング（例えば陽電子放射型断層撮影法）のためのレポーター遺伝子、プロドラッグの添加でＴ細胞を条件付きで切断する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン及びサイトカイン受容体を含む。

本発明の実施形態は核酸を含み、抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドをコードする核酸を含み、免疫原性を低減するためにヒト化されたＣＡＲ（ｈＣＡＲ）を含み、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つまたは複数のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは１つまたは複数の抗原との間の共有スペースから成るエピトープを認識することができる。デクチン−１等のパターン認識受容体は、炭水化物抗原に対する特異性を生じさせるために使用してもよい。特定の実施形態では、前記結合領域は、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の可変領域、及び／またはその抗原結合断片の領域の相補性決定領域を含むことができる。別の実施形態では、その特異性は受容体に結合するペプチド（例えばサイトカイン）から生じる。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原を補完し、特定の抗原についての特異性を有する受容体を提供する抗原受容体（例えば免疫グロブリン及びＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメインで見いだされる短いアミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。抗原受容体は２つのポリペプチド鎖から典型的に構成され、抗原と接触することができる各抗原受容体について６つのＣＤＲ―各重鎖及び軽鎖が３つのＣＤＲを含む―がある。免疫グロブリン及びＴ細胞受容体に関連する大部分の配列多様性がＣＤＲに見いだされるため、これらの領域は超可変ドメインと呼ばれることがある。そのなかでも、ＣＤＲ３はＶＪ（重鎖及びＴＣＲαβ鎖の場合のＶＤＪ）領域の組み換えによってコードされるため、最大の可変性を示す。

「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」という用語は、本明細書で使用されるとき、いくつかの細胞ではＴＣＲはガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖から構成されるが、アルファ（α）及びベータ（β）鎖のヘテロダイマーから構成されるＴ細胞上のタンパク質受容体を指す。本発明の実施形態では、ＴＣＲはＴＣＲを含む細胞で改変されてもよく、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びガンマデルタＴ細胞を含む。「キメラＴＣＲ」は細胞内シグナル伝達、膜貫通、及び細胞外ドメインを含む受容体を意味し、細胞外ドメインは、ＭＨＣが無制限の状態で、Ｔ細胞受容体によって通常は結合されない抗原を、その状態で特異的に結合させることができる。適切な条件下で抗原によるＴ細胞の刺激によって、細胞の増殖（拡大）及び／またはＩＬ−２の作製がもたらされる。前記方法は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、腎細胞癌、及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０及びｇｐ４１に特異的なキメラＴＣＲ等の標的抗原に特異的なキメラＴＣＲをトランスフェクションすることに適用することができる。他の細胞表面標的抗原として、限定されないが、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、メソセリン、ＲＯＲ１、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＤ５６、ＧＤ２、ＧＤ３、アルファフェトプロテイン、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ１２３、ＩＬ−１１Ｒアルファ、カッパ鎖、ラムダ鎖、ＣＤ７０、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＥＧＦＲ及びバリアント、上皮腫瘍抗原等が挙げられる。

ヒト化ＣＡＲ核酸は、ヒト患者に対する細胞免疫療法を向上させるために、ヒト遺伝子に由来することが想定される。特定の実施形態では、本発明は完全長ＣＡＲのｃＤＮＡまたはコード領域を含む。抗原結合領域またはドメインは、米国特許第７，１０９，３０４号（参照により本明細書に援用される）に記載されるように、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌ鎖の断片を含むことができる。前記断片はまた、いくつかのヒト抗原特異的抗体の異なる抗原結合ドメインであってもよい。より特定の実施形態では、前記断片はヒト細胞での発現のためにヒトのコドンの使用に最適化される配列によってコードされた抗原特異的ｓｃＦｖである。

その配置は二重特異性抗体または多量体等の多量体である可能性がある。前記多量体は、軽鎖及び重鎖の可変部分を二重特異性抗体にクロスペアリングすることによって形成される可能性が最も高い。前記構造物のヒンジ部分は、完全な削除から、最初のシステインを維持するまで、セリンよりプロリンの置換まで、最初のシステインまで切断するまで、複数の選択肢を有することができる。Ｆｃ部分を削除することができる。安定し及び／または二量体化するタンパク質がこの目的に適している。Ｆｃドメイン、例えばヒト免疫グロブリンからのＣＨ２またはＣＨ３ドメインのいずれかの１つだけ使用することができる。前記ヒンジ、二量体化を改善するために改変されたヒト免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３領域を使用することもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分を使用することもできる。ＣＤ８アルファの部分を使用することもできる。

実施形態のキメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン（細胞質ドメインと呼ばれることもある）は、キメラ受容体が配置された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化の原因となっている。「エフェクター機能」という用語は分化された細胞の特定化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌等の細胞溶解活性またはヘルパー活性であってもよい。ナイーブ、メモリ、またはメモリタイプのＴ細胞のエフェクター機能は、抗原依存性増殖を含む。そのため、「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞を導き、特定化された機能を実行するタンパク質の部分を指す。通常、全体の細胞内シグナル伝達ドメインが使用されるが、多くの場合、全体の細胞内ポリペプチドを使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が依然としてエフェクター機能シグナルを伝達する限り、当該切断部分を無傷の鎖の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断部分を含むことを意味する。例として、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖またはそのホモログのいずれか（例えばイータ、デルタ、ガンマまたはイプシロン）、ＭＢ１鎖、Ｂ２９、Ｆｃ ＲＩＩＩ、Ｆｃ ＲＩ、及びＣＤ３ζ及びＣＤ２８等の１つまたは複数のシグナル伝達分子の全てまたは一部の組合せ、ＣＤ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬ−２Ｒベータ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２Ｒアルファ／ＣＤ１３２、ＣＤ４０、ならびにそれらの組み合わせ、ならびにその他の類似の分子及びフラグメントが挙げられる。ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩ等の活性化タンパク質のファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分を使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインに内因性Ｔ細胞受容体複合体の任意の部分を使用する。いわゆる第三世代ＣＡＲは例えば相加的または相乗的効果のために一緒に融合された少なくとも２つまたは３つのシグナル伝達ドメインを有するため、１つまたは複数の細胞質ドメインを使用してもよい。

抗原特異的な細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＩｇＧ_４Ｆｃヒンジ及びＦｃ領域等の膜貫通ドメインによって連結されてもよい。代替として、ヒトＣＤ４膜貫通ドメイン、ヒトＣＤ２８膜貫通ドメイン、膜貫通ヒトＣＤ３ζドメイン、またはシステイン変異ヒトＣＤ３ζドメイン、またはＣＤ１６及びＣＤ８及びエリスロポエチン受容体等のその他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質からのその他の膜貫通ドメインが挙げられる。

いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸は、膜貫通ドメイン及び修飾ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン等のその他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体として、限定されないが、１つまたは複数のＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられる。ヒトＣＡＲに挿入されたヒト共刺激受容体によって提供される追加のシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化のために重要であり、ｉｎ ｖｉｖｏの持続及び養子免疫療法の治療の成功を改善するのを助けることができる。

特定の実施形態では、本発明は単離された核酸セグメント及びＣＡＲをコードするＤＮＡ配列を組み込んでいる発現カセットに関する。実施形態のベクターは、調節された真核生物プロモーター、例えば、ＭＮＤＵ３プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、またはユビキチンプロモーターの制御下で、細胞に所望の遺伝子を送達するために、主に、設計されている。また、前記ベクターは他に理由がないとしても、ｉｎ ｖｉｔｒｏの操作を容易にするために選択的マーカーを含んでもよい。他の実施形態では、ＣＡＲはＤＮＡテンプレートから転写されたｉｎ ｖｉｔｒｏのｍＲＮＡから発現することができる。

キメラ抗原受容体分子は組換えであり、抗原に結合する能力と、細胞質側末端に存在する免疫活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を経由して活性化シグナルを伝達する能力の両方によって区別される。抗原結合部分（例えば一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）から生成される）を使用する受容体構築物は、受容体構築物がＨＬＡ非依存的様式で、標的細胞表面で天然抗原を結合する点で「ユニバーサル」であるという追加の利点を与える。再指示されたＴ細胞エフェクターの機序は、ＣＴＬによる腫瘍認識及び溶解を含む。

いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。抗原結合領域の供給源としてのヒト抗体の使用が好ましい。ＣＡＲにおけるヒト配列の使用は、免疫媒介性認識を回避し、その結果、レシピエントに属し、ＨＬＡとの関連で処理された抗原を認識する内因性Ｔ細胞による削除を回避することができる。

キメラ抗原受容体の特定の実施形態では、受容体の抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと称してもよい）は腫瘍関連抗原または病原体特異的抗原結合ドメインを含み、デクチン−１等のパターン認識受容体によって認識される炭水化物抗原を含んでもよい。

腫瘍関連抗原は腫瘍細胞の細胞表面上に発現されるような種類の抗原であってもよい。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ等が挙げられる。特定の実施形態では、少量の腫瘍関連抗原がある場合に、ＣＡＲは膜結合サイトカインと共発現し、持続性を改善することができる。例えば、ＣＡＲは膜結合ＩＬ−１５と共発現することができる。

特定の実施形態では、ＨＡ−１、サバイビン、ＷＴ１、及びｐ５３等の細胞内腫瘍関連抗原を標的化してもよい。これは、ＨＬＡとの関連で細胞内腫瘍関連抗原から記述された処理されたペプチドを認識するＣＡＲによって達成することができる。さらに、ユニバーサルＴ細胞は、ＨＬＡとの関連で細胞内処理された腫瘍関連抗原を認識するＴ細胞受容体ペアを発現するように遺伝的に改変されてもよい。

病原体は、いかなる種類でもよいが、特定の実施形態では、病原体は、例えば、真菌、細菌またはウイルスである。例示的なウイルス病原体として、アデノウイルス科のファミリー、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＳＶ、ウイルスのＨＨＶファミリー、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、及びトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）が挙げられる。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ、及び風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌として、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラスマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ニューモシスチス（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）、及びスタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）が挙げられる。例示的な病原性細菌として、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ）、及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）が挙げられる。一実施形態では、病原体受容体デクチン−１は、真菌の細胞壁の炭水化物構造を認識するＣＡＲを生成するために使用することができる。デクチン−１の特異性に基づくＣＡＲを発現させるために遺伝的に改変されたＴ細胞は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）を認識し、菌糸増殖を標的とする。別の実施形態では、ＣＡＲはウイルス決定基（例えばＣＭＶ及びエボラからの糖タンパク質）を認識する抗体に基づいて作製され、ウイルス感染及び病変を遮断することができる。

実施形態に記載のキメラ抗原受容体は、当業者に周知の方法によって作製することができるが、好ましくは組み換えＤＮＡ技術を用いて作製される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列は、分子クローニングの標準的な技術（ゲノムライブラリースクリーニング、ＰＣＲ、プライマー補助連結反応、酵母及び細菌からのｓｃＦｖライブラリー、部位特異的変異誘発等）によって調製され、完全なコード配列に組み立てることができる。得られたコード領域を発現ベクターに挿入し、例えば、ｉＰＳＣといった目的の細胞を形質転換するために使用することができる。

ｂ．抗原提示細胞

いくつかの場合では、ＡＰＣは治療用組成物及び実施形態の細胞治療製品を調製するのに有用である。人工ＡＰＣを使用するシステム等の抗原提示システムの調製及び使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば米国特許第６，２２５，０４２号、第６，３５５，４７９号、第６，３６２，００１号、第６，７９０，６６２号、第７，９９３，６３８号、及び第８，１２４，４０８号ならびに米国特許出願公開第２００９／０００４１４２号を参照されたい。

ＡＰＣは、典型的には、追加の処理を行わないで、ペプチドをＭＨＣ分子に直接結合することを可能にする最適な長さのペプチドでインキュベートする。あるいは、前記細胞は（すなわちＭＨＣ非依存の抗原認識の場合）目的の抗原を発現することができる。ペプチドＭＨＣ分子または目的の抗原の他に、ＡＰＣシステムはまた、少なくとも１つの外因性の補助分子を含んでもよい。適切な数及び組み合わせの補助分子を使用することができる。補助分子は、共刺激分子及び接着分子等の補助分子から選択することができる。例示的な共刺激分子として、ＣＤ８６及びＢ７．１（Ｂ７．１はＢ７として以前から知られており、ＣＤ８０としても知られている）を含み、とりわけＴ細胞の表面でＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ−４分子と結合し、それによって、例えば、Ｔ細胞の拡大、Ｔｈ１分化、短期間のＴ細胞の生存、及びインターロイキン（ＩＬ）−２等のサイトカイン分泌に影響を与える（Ｋｉｍら、２００４を参照）。接着分子として、セレクチン等の炭水化物結合糖タンパク質、インテグリン等の膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリン等のカルシウム依存性タンパク質、及び細胞接着分子（ＩＣＡＭ）等のシングルパス膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質が挙げられ、例えば、細胞−細胞または細胞−マトリックス接触を促進する。例示的な接着分子として、ＩＣＡＭ−１等のＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ類が挙げられる。共刺激分子及び接着分子を含む例示的な補助分子の選択、クローニング、調製及び発現に有用な技術、方法、及び試薬は、例えば米国特許第６，２２５，０４２号、第６，３５５，４７９号、及び第６，３６２，００１号に例示されている。

人工ＡＰＣとなるために選択された細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチド輸送、及び／または細胞内ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子−ペプチド負荷に欠損を有し、または変温性であり（すなわち哺乳動物細胞株より温度変化に敏感ではない）、または欠陥と変温特性との両方を有している。いくつかの態様では、ＡＰＣになるように選択された細胞は、また、外因性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ及び前記細胞に導入される補助分子成分に対して、少なくとも１つの内因性対応物（例えば内因性ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子及び／または前述の内因性補助分子）を発現する能力を欠損している。さらに、人工ＡＰＣは、いくつかの場合では、ａＡＰＣを生成するために改変される前に、前記細胞によって保有された欠陥及び変温特性を保持している。例示的なａＡＰＣは、昆虫細胞株等の抗原プロセシング（ＴＡＰ）欠損細胞株に関連するトランスポーターから構成されるか生じるかのいずれかである。例示的な変温性昆虫細胞株はシュナイダー２細胞株等のショウジョウバエの細胞株である（例えばＳｃｈｎｅｉｄｅｒ、１９７２を参照）。シュナイダー２細胞の調製、増殖、及び培養のための例示的な方法は、米国特許第６，２２５，０４２号、第６，３５５，４７９号、及び第６，３６２，００１号に提供されている。

一実施形態では、ＡＰＣはまた、凍結融解サイクルに供される。例示的な凍結融解サイクルでは、ＡＰＣは、ＡＰＣを含む容器を適切な量の液体窒素、固体二酸化炭素（すなわちドライアイス）、または急速な凍結を起こすような類似の低温の材料に接触させることによって凍結してもよい。凍結したＡＰＣは、低温の材料からＡＰＣを取り除き、周囲室温温度条件に暴露するか、またはぬるま湯の浴もしくは温かい手により短い回答時間で融解を促す容易な解凍プロセスのいずれかによって融解する。さらに、ＡＰＣは解凍する前に長期間凍結し保存してもよい。凍結したＡＰＣはまた、融解し、さらに使用する前に凍結乾燥することができる。好ましくは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及び他の防腐剤等の凍結融解手順に有害な影響を与える可能性のある防腐剤は、凍結融解サイクルを受けるＡＰＣを含む培地に存在しない、または当該防腐剤が本質的に存在しない培地にＡＰＣを移動させることによって本質的に取り除かれる。

他の特定の実施形態では、異種間核酸及びａＡＰＣに対して内因性の核酸を、不活化の後に細胞増殖、核酸の複製または発現が本質的に発生しないように、架橋結合によって不活性化してもよい。一実施形態では、ａＡＰＣは、外因性ＭＨＣ及び補助分子を発現し、当該分子をａＡＰＣの表面に提示し、選択された１つまたは複数のペプチドと共に提示されたＭＨＣ分子を負荷した後に、ある時点で不活性化される。したがって、不活性化及び選択されたペプチドを負荷されたａＡＰＣは、本質的に増殖または複製することができないが、選択されたペプチドの提示機能は保持している。好ましくは、架橋結合によって、ａＡＰＣの抗原提示細胞の機能を実質的に低下させることなく、細菌及びウイルス等の汚染微生物が本質的にないａＡＰＣがもたらされる。そのため、架橋結合によって、ａＡＰＣを使用して開発された細胞治療製品の安全性についての懸念を軽減することを助けながら、ａＡＰＣの重要なＡＰＣ機能は維持される。架橋結合及びａＡＰＣに関係する方法については、例えば参照により本明細書に援用される米国特許第８，１２４，４０８号を参照されたい。

３．肝細胞

米国特許第６，４５８，５８９号及び第６，５０６，５７４号に記載されているように、肝細胞は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤を用いて多能性幹細胞から分化することができる。多能性幹細胞を肝細胞に分化するための段階的なプロトコルは、米国特許第７，４７３，５５５号に記載されている。本発明の特定の態様では、肝細胞は、米国特許第８，２８３，１６８号に記載されているように、培地で多能性幹細胞を培養し、幹細胞に分化するように指示することによって作製することができる。本発明の特定の態様では、肝細胞は、前記細胞を肝細胞にプログラミングすることを促進するのに十分な肝細胞プログラミング因子の細胞内レベルを増加させる条件下で、多能性幹細胞またはその他の非肝細胞を培地で培養することによって作製することができる。

４．神経細胞

神経細胞は、米国特許第６，８３３，２６９号及び７，２５０，２９４号、米国特許出願公開第２０１２／０２７６０６３号、及びＣａｒｐｅｎｔｅｒら、２００１に記載される方法に従って多能性幹細胞から生成することができる。オリゴデンドロサイトは多能性幹細胞から生成することができ、米国特許第７，２８５，４１５号及びＫｅｉｒｓｔｅａｄら、２００５を参照されたい。網膜色素上皮細胞の誘導も報告されている（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａら、２００４）。

５．心細胞

本明細書で提供されるｉＰＳ細胞は、米国特許第８，４１５，１５５号に記載の方法に従って心筋細胞に分化することができる。心筋細胞または心筋細胞前駆体は、米国特許第７，７６３，４６４号で提供される方法に従って、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から生成することができる。ｉＰＳ細胞の心筋分化の例示的な方法として、胚様体（ＥＢ）の方法（Ｚｈａｎｇら、２００９）、ＯＰ９間質細胞の方法（Ｎａｒａｚａｋｉら、２００８）、または成長因子／化学的方法（米国特許第７，８９７，３８９号、第７，９５５，８４９号及び８，９５１，７９８号、その全体が参照により本明細書に援用される、を参照）が挙げられる。

６．膵臓細胞

膵島細胞は多能性幹細胞から分化することができる（ＷＯ０３／０５０２４９）。

７．その他の細胞型

間葉系前駆細胞及び線維芽細胞はＷＯ０３／００４６０５に記載される方法に従って多能性幹細胞から生成することができる。幹細胞由来の間葉系細胞は、骨形態形成タンパク質（特にＢＭＰ４）、ヒトＴＧＦ−β受容体のリガンド、またはヒトビタミンＤ受容体のリガンド（ＷＯ０３／００４６０５）等の骨形成因子を含む培地で、骨芽細胞系細胞にさらに分化することができる。

Ｇ．バイオリアクター及び自動化

幹細胞の培養及び／またはそこから分化された細胞についての１つまたは複数のステップは自動化してもよい。ロボットまたはその他の自動化を使用してプロセスを自動化することによって、細胞の製造、培養、及び分化により効率的で経済的な方法を可能にすることができる。例えば、ロボットによる自動化は、例えば、磁気分離またはＦＡＣＳを使用して、人工多能性幹細胞の培養、継代培養、培地の添加、分化培地の添加、分化培地の培養、及び細胞型の分離を１つまたは複数を組み合わせて利用することができる。

バイオリアクターもまた、本発明の実施形態に従って細胞を培養、維持、及び／または分化するために、本発明の実施形態と組み合わせて使用することができる。バイオリアクターは増加した量の細胞を作製するために、プロセスの「スケールアップ」を可能にする利点をもたらす。様々なバイオリアクターは、バッチバイオリアクター、流加バイオリアクター、連続バイオリアクター（例えば連続攪拌タンク反応器モデル）、及び／またはケモスタットを含む本発明の実施形態と共に使用することができる。たとえば、スピナーフラスコは、多能性細胞の維持及び／または分化の方法をスケールアップし、増加した量の細胞を作製することができるように使用してもよい。

本発明の実施形態との使用に特に想定されるロボットによる自動化は、例えばＴｅｃａｎ（カリフォルニア州、米国）から得ることができる。ロボット工学はキャップピアシングプローブ及びサンプル間のキャリーオーバーを最小にするための使い捨てチップ等の液体ハンドリング冶具を含んでもよい。種々の実施形態では、ロボット工学は、細胞の培養のために１つまたは複数のバイオリアクターと組み合わせて使用してもよい（例えばｉＰＳＣが維持または増殖している最中、ｉＰＳＣを肝細胞に分化させている最中、または肝細胞を赤血球等の次の系統に分化させている最中）。

特定の実施形態では、ロボットによる自動化は、本発明の実施形態の小型化または「スケールダウン」に有用であり得る。これらのアプローチは、例えば前記方法がハイスループットスクリーンを含む場合に特に有用であり得る。ハイスループットスクリーンはキメラ抗原受容体の１つまたは複数の特性を評価するために使用してもよい。前記方法の小型化は低付着プレート（例えば９６ウェルプレート）の使用及び／または低酸素（例えば約２５％以下のＯ_２または５％以下のＯ_２）条件下での細胞培養を含んでもよい。

本発明の実施形態の方法は、細胞を単一細胞としてプレートに付着するように誘導するために、培地にＲＯＣＫ阻害剤ＨＡ１００及び／またはＨ１１５２を含むことによって、ロボットによる自動化を使用して、単一細胞アッセイに利用してもよい。培養系への小分子ＨＡ１００またはＨ１１５２またはＹ−２７６３２の添加によって、ｉＰＳＣを含む多能性細胞の生存率を大幅に向上させることができる。特定の実施形態では、ＴｅＳＲ培地での多能性細胞の生存は、ＲＯＣＫ阻害剤またはＰＫＣ阻害剤を含むことによって、とりわけ細胞が凝集塊にタンパク分解的または機械的に分離し、または個別化した後に改善することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は個別化したｉＰＳ細胞が表面に付着し、増殖するのを促すことができる。多能性細胞の維持または増殖、ならびに造血性前駆体細胞または特定の造血系統に分化させるプロセスのいくつかまたはすべてを自動化することができる。自動化された方法の一部分を既定の条件で利用することができる。

ＩＩＩ．治療方法

Ａ．免疫システム及び免疫療法

いくつかの実施形態では、医学的障害は、特定の免疫応答を誘発する免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）の移動によって治療される。そのため、免疫学的応答の基本的な理解が必要とされる。

適応免疫系の細胞はリンパ球と呼ばれる白血球の一種である。Ｂ細胞及びＴ細胞はリンパ球の主要なタイプである。Ｂ細胞及びＴ細胞は同じ多能性造血幹細胞に由来し、分化するまで互いを区別することができない。Ｔ細胞が細胞媒介性免疫応答に密に関与しているのに対し、Ｂ細胞は体液性免疫応答で大きな役割を担っている。Ｔ細胞はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれる細胞表面に、特別な受容体が存在することによって、Ｂ細胞及びＮＫ細胞等の他のリンパ球の種類と区別することができる。ほぼすべての他の脊椎動物では、Ｂ細胞及びＴ細胞は、骨髄の幹細胞によって作製される。Ｔ細胞はその名前の由来から胸腺に移動し発生する。ヒトでは、リンパ球プールの約１％〜２％が毎時再循環し、抗原特異的リンパ球が二次リンパ組織内で特異的抗原を見つける機会を最適化している。

Ｔリンパ球は、骨髄の造血幹細胞から生じ、典型的には胸腺に移行し成熟する。Ｔ細胞は細胞膜上で固有の抗原結合受容体（Ｔ細胞受容体）を発現し、他の細胞の表面で主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と関連して、抗原のみを認識することができる。Ｔ細胞には、ヘルパーＴ細胞及び傷害性Ｔ細胞として知られる少なくとも２つの集団が存在する。ヘルパーＴ細胞及び傷害性Ｔ細胞は、膜結合糖タンパク質ＣＤ４及びＣＤ８のそれぞれに結合される細胞膜の表示によって主に区別される。ヘルパーＴ細胞はＢ細胞、傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、及び免疫系のその他の細胞の活性化に欠かせない様々なリンホカインを分泌する。対照的に、抗原ＭＨＣ複合体を認識する傷害性Ｔ細胞は、増殖し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。ＣＴＬは細胞溶解をもたらす物質を生成することによって、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞等の抗原を表す身体の細胞を除去する。ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は先天性免疫系の主要成分を構成する細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞は腫瘍及びウイルスに感染した細胞の拒絶反応で主要な役割を果たす。細胞は、標的細胞をアポトーシスによって死亡させるパーフォリン及びグランザイムと呼ばれるタンパク質の小さな細胞質顆粒を放出することによって殺す。

マクロファージ、Ｂリンパ球、及び樹状細胞を含む抗原提示細胞は、特定のＭＨＣ分子の発現によって区別される。ＡＰＣは、抗原を内在化し、それらの細胞外膜のＭＨＣ分子と一緒に、その抗原の一部を再発現する。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）は、複数の遺伝子座を有する大規模な遺伝的複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩ及びクラスＩＩＭＨＣを指すＭＨＣ膜分子の２つの主要なクラスをコードする。Ｔヘルパーリンパ球は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連する抗原を一般的に認識し、Ｔ細胞傷害性リンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原を認識する。ヒトでは、ＭＨＣはＨＬＡ複合体と呼ばれ、マウスではＨ−２複合体と呼ばれる。

Ｔ細胞受容体またはＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合された抗原を認識することを通常担うＴリンパ球（またはＴ細胞）の表面に見られる分子である。Ｔ細胞の５％がガンマ及びデルタ鎖から成るＴＣＲを有するが、Ｔ細胞の９５％はアルファ及びベータ鎖から成るヘテロ二量体である。ＴＣＲを抗原及びＭＨＣに結合させることによって、関連の酵素、共受容体、及び特定のアクセサリー分子によって媒介される一連の生化学的事象によって、そのＴリンパ球が活性化する。

自己免疫疾患、または自己免疫は、自身の（サブ分子レベルに至る）成分を「自己」として認識できない生物の障害であり、自身の細胞及び組織に対して免疫応答を起こすことになる。このような異常な免疫応答から生じる疾患は自己免疫疾患と呼ばれる。

Ｂ．細胞の増殖及び管理

特定の態様では、細胞はｉＰＳＣから分化される。一態様では、ｉＰＳＣから分化したＴ細胞は、例えば、遺伝子導入によってＣＡＲまたはＴＣＲの導入により、組換え作製されてもよい。特定の態様では、前記細胞は、数日間、数週間、または数ヶ月間、遺伝子導入後、約１、２、３、４、５日超以内にバルク集団としてｅｘ ｖｉｖｏで増殖してもよい。さらなる態様では、前記組換えＴ細胞をクローニングしてもよく、単一統合された、またはエピソーム的に維持された発現カセットまたはプラスミドの存在を示すクローンをｅｘ ｖｉｖｏで増殖する。組換えＴ細胞は、ＩＬ−２または共通のガンマ鎖（例えばＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１等）を結合する他のサイトカインで刺激することによって増殖してもよい。組換えＴ細胞は人工抗原提示細胞で刺激することによって増殖してもよい。組換えＴ細胞は人工抗原提示細胞で、またはＴ細胞表面でＣＤ３と架橋結合するＯＫＴ３等の抗体で増殖してもよい。さらなる態様では、遺伝的に改変された細胞を凍結保存してもよい。

本発明の特定の実施形態では、ＣＡＲ^＋細胞は、がん、自己免疫疾患、または感染症の個体等、治療を必要とする個体に送達される。前記細胞は個体の免疫系を強化し、それぞれの癌または病原性細胞を攻撃する。いくつかの場合では、抗原特異的なＣＡＲ^＋Ｔ細胞の１つまたは複数の用量が個体に投与される。抗原特異的なＣＡＲ^＋Ｔ細胞の２つ以上の用量を個体に投与する場合には、投与間の期間は、個体で増殖するのに十分な時間を取るべきであり、特定の実施形態では投与間の期間は１、２、３、４、５、６、７日超である。

治療効果を得るための免疫エフェクター細胞の適切な用量は、例えば好ましくは一連の投与サイクルで、用量あたり少なくとも１０^５または約１０^５〜約１０^１０細胞であると思われる。例示的な投与レジメンは漸増用量の４回の１週間の投与サイクルから成り、０日目に少なくとも約１０^５細胞から始まり、例えば、患者内用量増加スキームの開始から数週間以内に、約１０^１０細胞の標的用量まで漸増する。適切な投与形態として、静脈内、皮下、腔内（例えばリザーバーアクセスデバイスによって）、腹腔内、及び腫瘍塊への直接注入が挙げられる。

実施形態に従った医薬組成物は、単独で、またはがんもしくは感染性疾患の治療に有用な他の十分に確立された薬剤と組み合わせて使用することができる。単独でまたは他の薬剤と組み合わせて送達しても、実施形態の医薬組成物は、特定の効果を達成するために、様々な経路を介して、哺乳動物、特にヒトの体内の様々な部位に送達することができる。１つまたは複数の投与経路を使用することができるが、特定の経路は別の経路より迅速かつ効果的に提供することができると当業者は認識する。例えば、メラノーマの治療には、皮内送達が吸入より有利に使用することができる。局所または全身送達は、体腔への製剤の適用または滴下注入を含む投与、エアロゾルの吸入または吹送、または筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹腔内、皮下、または皮内投与を含む非経口導入によって達成することができる。

実施例の組成物は、単位剤形で提供することができ、各用量単位、例えば注射は、単独またはその他の活性剤と適切に組み合わせて、所定の量の組成物を含む。単位剤形という用語は、本明細書で使用されるとき、ヒト及び動物対象のための単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は単独でまたは他の活性剤と組み合わせて実施形態の組成物の所定量を含み、適宜、薬学的に許容可能な希釈剤、単体、またはビヒクルと関連して、所望の効果を生み出すのに十分な量で計算される。実施形態の新規の単位剤形の仕様は、特定の対象における医薬組成物に関連する特定の薬力学に依存する。

有効量または十分な数の細胞は前記組成物に存在し、長期に、特異的な腫瘍応答が確立し、当該治療が存在しない場合と比べて、腫瘍サイズが減少するまたは腫瘍の成長または再成長が排除されるように、対象に導入されることが望ましい。対象に再導入される細胞の総量によって、当該細胞が存在しない同じ条件と比べて、腫瘍サイズが１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％減少することが望ましい。

したがって、投与される細胞の量は、投与経路に配慮すべきであり、所望の治療応答を達成できるように十分な数の細胞を導入すべきである。さらに、本明細書に記載の組成物に含まれる各活性薬剤の量（例えば接触される各細胞あたりの量または体重あたりの量）は、異なる適用ごとに変化させることができる。一般的に、細胞の濃度は、望ましくは、少なくとも約１×１０^６〜約１×１０^９の導入細胞、さらに望ましくは約１×１０^７〜約５×１０^８の導入細胞、上述のいずれかを適切な量として使用することができるが、例えば５×１０^８超の細胞もしくはそれ以下、例えば１×１０^７以下の細胞を、治療を受ける対象に投与するのに十分であるべきである。投与スケジュールは、確立された細胞ベースの治療に基づくことができ（例えばＴｏｐａｌｉａｎ ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、１９８７；米国特許第４，６９０，９１５号）、または代替の連続注入方式も適用することができる。

これらの値は、実施形態の方法を最適化する際に医師によって利用される細胞の範囲の一般的なガイダンスを提供している。本明細書で当該範囲の列挙は、特定の適用で保証されるように、成分のより高いまたは低い量の使用を決して排除しない。例えば、実際の用量及びスケジュールは、前記組成物が他の医薬組成物と併用して投与されるかによって、または薬物動態、薬物の性質、及び代謝の個体差によって変化させることができる。当業者は特定の状況の緊急性に応じて、必要な調整を容易に行うことができる。

ＩＶ．ベクター構築と送達

「ベクター」または「構築物」（遺伝子送達または遺伝子導入「ビヒクル」を指すこともある）は、宿主細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで送達されるポリヌクレオチドを含む巨大分子または分子の複合体を指す。「プラスミド」はベクターの１種であり、染色体ＤＮＡから独立して複製することができる染色体ＤＮＡとは別個の染色体外のＤＮＡ分子である。特定の場合には、プラスミドは円形で二本鎖である。

特定の実施形態では、リプログラミングベクターまたはＣＡＲベクター等のベクターは、ウイルスベクター、例えば細胞中のこれらのタンパク質を発現するレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってもよい。特定の実施形態では、ベクターは染色体外複製ベクターであってもよく、宿主細胞ゲノムに組み込まれず、複製の世代の間に失われてもよい。これらのベクターの成分及び送達方法の詳細は以下に開示する。

当業者は標準的な組み換え技術によってベクターを構築する能力が備わっている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１及びＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。ベクターとして、限定されるものではないが、プラスミド、コスミド、ウイルス（例えばバクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、人工染色体（例えばＹＡＣ）、レトロウイルスベクター（例えばモロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶ等に由来する）、レンチウイルスベクター（例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶ等に由来する）、複製コンピテントを含むアデノウイルス（Ａｄ）、複製欠損及びその活力のない形態、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン−バーウイルス、ヘルペスウイルスベクター、ワクチンウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター、及びラウス肉腫ウイルスベクターが挙げられる。

Ａ．調節エレメント

ベクターはまた、遺伝子送達及び／または遺伝子発現をさらに調節するか、そうでなければ標的細胞に有益な特性を提供する他の成分または機能を含むことができる。このような他の成分として、例えば、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす成分（細胞型または組織特異的結合を媒介する成分を含む）、細胞によるベクター核酸の取り込みに影響を及ぼす成分、取り込み後の細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分（核局在化を媒介する薬剤等）、及びポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分が挙げられる。

ベクターに含まれる真核生物発現カセットは、（５’から３’方向に）タンパク質コード配列に操作可能に連結される真核生物転写プロモーター、介在配列を含むスプライスシグナル、及び転写終結／ポリアデニル化配列を含んでいてもよい。

１．プロモーター／エンハンサー

「プロモーター」は、転写の開始及び速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。「操作可能に配置される」、「操作可能に連結される」、「制御下」、及び「転写制御下」という語句は、プロモーターが転写開始及び／または配列の発現を制御するために、核酸配列に対して正しい機能的位置及び／または方向にあることを意味する。プロモーターは、「エンハンサー」と組み合わせて使用してもしなくてもよく、核酸配列の転写活性に関与するシス作用制御配列を指す。

用いるプロモーターは構成的、組織特異的、誘導的、及び／または組み換えタンパク質及び／またはペプチドを大規模に製造する点に利点があるように、導入されたＤＮＡセグメントを高レベルで発現するように仕向ける適切な条件下で有用であり得る。プロモーターは異種または内因性であってもよい。プロモーターの非限定的な例として、ＳＶ４０初期または後期プロモーター等の初期または後期ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）早期プロモーター、真核生物伸長因子１αプロモーター等の真核細胞プロモーター、連結された応答配列プロモーターが挙げられる。

２．開始シグナル

特定の開始シグナルもまた、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供される必要があり得る。開始コドンは、挿入全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことが知られている。

３．スプライス部位

大部分の転写された真核生物ＲＮＡ分子は、一次転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを受ける。ゲノム真核生物配列を含むベクターは、タンパク質発現のために転写物の適切なプロセシングを確実にするために、ドナー及び／またはアクセプタースプライシング部位を必要とされ得る。

４．終結シグナル及びポリアデニル化シグナル

実施形態のベクターまたは構築物は、少なくとも一つの終結シグナルを含んでいてもよい。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列から構成されている。望ましいメッセージレベルを達成するためにターミネーターがｉｎ ｖｉｖｏで必要とされ得る。真核生物系では、ターミネーター領域はまた、ポリアデニル化部位を露出するように、新しい転写物の部位特異的切断を可能にする特定のＤＮＡ配列を含んでいてもよい。実施形態に従って使用するために考えられたターミネーターとして、本明細書に記載される、または当業者に知られている周知の転写のターミネーターが挙げられ、限定されないが、例えばウシ成長ホルモンターミネーターまたは例えばＳＶ４０ターミネーター等のウイルス終結配列等の遺伝子の終結配列が挙げられる。

Ｂ．マルチクローニング部位

ベクターはマルチクローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができ、ＭＣＳは複数の制限酵素部位を含む核酸領域であり、ベクターを消化するために標準的な組み換え技術と組み合わせて使用することができる。「制限酵素消化」とは、核酸分子中の特定の位置でのみ機能する酵素で核酸分子を触媒的に切断することを指す。「ライゲーション」は互いに連続してもしなくてもよい２つの核酸断片間にホスホジエステル結合を形成するプロセスを指す。制限酵素及びライゲーション反応を含む技術は、組換え技術の当業者に周知である。

Ｃ．複製の起源

宿主細胞でベクターを増殖させるために、複製部位（「ｏｒｉ」と呼ばれることが多い）の１つまたは複数の起源、例えば、上述のＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、または複製が開始される特定の核酸配列である、リプログラミングの際に類似または向上した機能で遺伝子操作されたｏｒｉＰを含んでいてもよい。あるいは、上述のその他の染色体外で複製するウイルスの複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。

Ｄ．内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）及びプロテアーゼ切断部位／自己切断ペプチド

ＩＲＥＳ配列は実施形態の態様に含まれ、ポリシストロニック転写物の生成を可能にする。ＩＲＥＳ配列は単一の遺伝子座から複数のタンパク質の同時発現を可能にする。ＩＲＥＳエレメントは異種オープンリーディングフレームに連結することができる。複数のオープンリーディングフレームは、一緒に転写することができ、それぞれＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロニックメッセージを作成する。ＩＲＥＳエレメントによって各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセスすることができる。単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを用いて複数の遺伝子を効率的に発現させることができる。いくつかの場合では、ｉＰＳ細胞の生成効率を向上させるためにＩＲＥＳ依存性ポリシストロニックシステムを使用してもよい。

一実施形態は、所望の組み換え産物とレポーターとの両方のコード配列を同じポリシストロニック転写物に含むことを伴う。形質転換に成功した事象は、所望のリプログラミング因子と容易に検出可能なレポーターとの両方の発現を特徴とし、トランスフェクションに成功した細胞の選択を容易にする。

Ｅ．レポーター

本発明の特定の実施形態では、発現ベクターにマーカーを含むことによって、実施形態の核酸構築物を含む細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで同定することができる。このようなマーカーは、前記細胞に識別可能な変化を与え、発現ベクターを含む細胞を容易に同定することを可能にする。一般的に、選択マーカーは選択を可能にする特性を付与するマーカーである。ポジティブ選択マーカーはマーカーが存在することで選択を可能にするが、負の選択マーカーはその存在が選択を妨げるものである。ポジティブ選択マーカーの例は薬物耐性マーカーである。

薬物選択マーカーを含むことは通常、形質転換体のクローニング及び同定を補助し、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は有用な選択マーカーである。条件の実施に基づいた形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーの他に、蛍光タンパク質及びβガラクトシダーゼ等のスクリーニング可能なマーカーを含むその他の種類のマーカーも考えられる。あるいは負の選択マーカーのようなスクリーニング可能な酵素、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を利用してもよい。当業者はおそらくＦＡＣＳ分析と組み合わせて免疫マーカー（例えば細胞表面タンパク質）を使用する方法も知っている。使用されるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することが可能である限り、重要であるとは考えられない。選択及びスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は当業者に知られている。実施形態の一つの特徴は、リプログラミング因子が細胞のリプログラミングに影響を与えた後、ベクターを含まない細胞を選択するために、選択及びスクリーニング可能なマーカーを使用することを含む。追加の利点は沈黙レポーターの発現で人工多能性幹細胞を豊富にすることである。

Ｆ．ベクター送達

実施形態に従ってリプログラミングベクターを体細胞に導入することは、本明細書に記載されている、または当業者に知られている細胞の形質転換のために核酸を送達する適切な方法を使用してもよい。その方法として、限定されないが、ｅｘ ｖｉｖｏのトランスフェクションによるＤＮＡの直接送達、マイクロインジェクションを含む注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストランの後にポリエチレングリコール、直接的な音波の負荷、リポソーム媒介トランスフェクション、受容体媒介トランスフェクション、微粒子銃、炭化ケイ素繊維との攪拌、アグロバクテリウム形質転換、プロトプラストのＰＥＧ媒介形質転換、乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込み、及び当該方法の組み合わせが挙げられる。このような技術の適用を通して、細胞は安定にまたは一過性に形質転換することができる。

Ｖ．実施形態のキット

本明細書に記載の組成物はキットに含まれてもよい。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇｉＰＳＣはキットで提供され、培地、ａＡＰＣ、成長因子、抗体（例えば、細胞の選別または特徴付け）及び／またはＣＡＲまたはトランスポザーゼをコードするプラスミ等の細胞を増殖し及び／または分化するのに適した試薬を含んでもよい。

非限定的な例では、キットはキメラ受容体発現構築物、キメラ受容体発現構築物を生成するための１つまたは複数の試薬、発現構築物のトランスフェクションのための細胞、及び／または発現構築物をトランスフェクションするための同種異系細胞を得るための１つまたは複数の装置（当該装置はシリンジ、ピペット、鉗子、及び／または医学的に認められている装置であってもよい）を含む。

いくつかの実施形態では、内因性ＨＬＡ−Ａ発現を削除するための発現構築物、発現構築物を生成するための１つまたは複数の試薬、及び／またはＣＡＲ発現構築物をキットで提供する。いくつかの実施形態では、キットはジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をコードする発現構築物を含む。

いくつかの態様では、キットは細胞のエレクトロポレーションのための試薬または装置を含む。

キットは、実施形態の組成物を生成するために、１つまたは複数の適切に分割した実施形態の組成物または試薬を含んでもよい。キットの成分は水性媒体または凍結乾燥形態でパッケージされてもよい。キットの容器の手段は、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器の手段を含んでもよく、その中に成分が配置され、好ましくは適切に分割されてもよい。キットに複数の成分がある場合、キットはまた、追加の成分を別々に配置できる第二、第三、またはその他の追加の容器を一般的に含んでいる。しかし、成分の種々の組み合わせはバイアルに含まれてもよい。実施形態のキットはまた、市販のために厳重に閉じられた状態で細胞、構築物、及びその他の試薬の容器を含む手段を典型的に含んでいる。そのような容器は例えば、所望のバイアルが保持される射出成型またはブロー成型を含んでもよい。

ＶＩ．実施例

以下の特定かつ非限定的な実施例は、単に例示として解釈されるべきであり、決して本開示を限定するものではない。さらに詳述することがなくても、当業者は、本明細書の記載に基づいて、最大限に本開示を利用することができると考えられる。本明細書で引用した全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。ＵＲＬまたはそのほかの識別子またはアドレスで参照を示す場合、当該識別子は変化し、インターネット上の特定の情報は移り変わるが、同等の情報をインターネットで検索することで見つけることができる。そこにある言及は当該情報の利用可能性及び公共への普及を証明している。

実施例１：ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ造血幹細胞の生成
同種異系ＨＳＣがＨＬＡ−Ａ遺伝子座の発現を削除するように遺伝的に編集されれば、登録されているＮＭＤＰドナーの臨床使用を著しく増加させることができる。操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（または人工ヌクレアーゼ、例えばＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）は、遺伝的に編集されたＴ細胞及び細胞株のＨＬＡ発現を削除するために使用することができる。造血幹細胞（ＨＳＣ）への遺伝子編集を拡張するために、ＨＬＡ−Ａの遺伝子座を標的とするＺＦＮを導入することによって、ＨＬＡ−Ａ発現を崩壊させた。ＣＤ３４＋系統^ｎｅｇＨＳＣ（純度９９％）を、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ６１、及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）に対するビオチン化抗ヒト抗体の混合物を使用して系譜^ｐｏｓ細胞を最初に枯渇させ、ビオチン結合常磁性ビーズを使用して枯渇させて臍帯血（ＵＣＢ）から単離した。次に、ＣＤ３４＋細胞を抗ＣＤ３４磁気ビーズを用いて単離した。ＨＬＡ−Ａ特異的ＺＦＮをコードするｉｎ ｖｉｔｒｏに転写されたｍＲＮＡ種の電気泳動転写によって、既定のサイトカイン（ＦＬＴ３−Ｌ、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＩＬ−６）及びアリール炭化水素受容体アンタゴニスト（ｓｔｅｍ ｒｅｇｉｎｉｎ−１、ＳＲ−１）でｅｘ
ｖｉｖｏ培養してから１週間後に、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇＨＳＣが３０％生成した。ＤＮＡ配列分析は、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇＨＳＣがＺＦＮ標的部位で期待されたヌクレオチド変化を示すことを明らかにした。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイはＨＬＡ−Ａ^ｐｏｓＨＳＣとＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇＨＳＣとの間の系譜特異的コロニー形成に有意な差を示さなかった。さらに、ｉｎ ｖｉｖｏ生着アッセイはＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄＩｌ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを使用し、操作されたＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇＨＳＣが生着及びＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ多系譜造血細胞に分化する能力を維持していることを示した。

実施例２：ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇｉＰＳＣの生成 必要なドナーの数を最小化する一つの方法として、ＨＬＡ−ホモ接合ドナーから１つのＨＬＡ遺伝子座を削除してもよい。ドナー細胞からのＨＬＡ−Ａ除去が適切なＨＬＡ適合ドナーを見つける確率（図１）に有意な影響を有し得ることが判明した。したがって、ＨＬＡホモ接合ドナーからＨＬＡ−Ａ発現を排除することによって、ＨＬＡ適合患者に注入することができるバンクされたｉＰＳＣの必要数が減少する。不必要な同種異系免疫反応を引き起こす内在性ＴＣＲαβ及びγδ発現のさらなる削除を移植片対宿主病を減少させるために実施してもよい。ｉＰＳＣはさらに、疾患及び再生医療のための同種異系ｉＰＳＣ治療の安全性を確保するために自殺遺伝子（例えばｉＣａｓｐ９、誘導性カスパーゼ９）を発現するようにさらに改変することができる。全ゲノム配列決定及び統合部位の分析（例えば導入遺伝子の発現が維持され、内因性遺伝子の発現を崩壊させない統合部位）によってアッセイされるように、「セーフハーバー」遺伝子プロファイル（Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕら、２０１１、参照により本明細書に援用される）を有するｉＰＳＣクローンを単離する。この自殺遺伝子^＋、ＴＣＲ^ｎｅｇ、ＨＬＡ−Ａ^ｎｅｇ、ＨＬＡホモ接合ｉＰＳＣバンクは、広い範囲の患者に有用な同種異系細胞産物を調製するために使用することができる。このｉＰＳＣバンクは治療可能性を向上し、多数のレシピエントに投与するための細胞の開始プールを有効にする。これらのｉＰＳＣの一つの有力な即時使用は、ｉ）免疫治療のために腫瘍またはウイルス特異性免疫受容体（例えばＴＣＲαβまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を発現する免疫細胞（Ｔ細胞（Ｔｈｅｍｅｌｉら、２０１３）、ＮＫ細胞（Ｋｎｏｒｒら、２０１３）、ＮＫＴ細胞等を含む）であり、ｉｉ）血液系腫瘍または先天性障害のための造血幹細胞移植である。さらに、同種異系ｉＰＳＣは、例えば再生医療のための心筋細胞、肺上皮細胞、腎細胞、及び神経細胞を生成するために使用することができる。ｉＰＳＣはまた、クローニング及び強固な増殖のために比較的高い効率で安全に細胞操作を行うために使用することもできる。例えば、ｉＰＳＣは治療用遺伝子（例えばＣＡＲ）を発現させるために改変することができ、人工ヌクレアーゼ（例えばＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）によって遺伝的に編集し、免疫抑制分子（例えばＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＣＲアルファ定常領域）を削除することもできる。

センダイウイルスベクター媒介性遺伝子のＴ細胞への導入。ＨＬＡホモ接合ＵＣＢ（表２）に由来するＴ細胞からｉＰＳＣを生成するためにセンダイウイルスベクターを使用した。まず、ＧＦＰレポーター遺伝子を有するＳｅＶベクターを用いて、ＳｅＶの有効性をＴ細胞で試験した。抗ＣＤ３モノクロナール抗体（ｍｏＡｂ）及び抗ＣＤ２８ ｍｏＡｂでＴ細胞を活性化してから２日後に、細胞をＧＦＰ−ＳｅＶ粒子に感染させた。ＳｅＶからのＧＦＰ発現は非常に高く、その発現は１週間後も維持された（トランスフェクトされていないＴ細胞よりＭＦＩが約３ｌｏｇも高い）（図４）。

ＨＬＡホモ接合ＵＣＢに由来するＴ細胞からのｉＰＳＣの生成。ＨＬＡホモ接合ＵＣＢユニットをＭＤアンダーソンがんセンターの臍帯血バンクから入手した。１つの方法では、Ｔ細胞を単離後、ｉ）ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２（ポリシストロン性ベクター）、ｉｉ）ｃＭＹＣ、及びｉｉｉ）ＭＯＩのＫＬＦ４（それぞれ５、５、３）をコードするＳｅＶベクターを当該細胞に感染させた。ＭＥＦフィーダー培地またはＭａｒｉｇｅｌ上で１２日後に、ｉＰＳコロニーが出現し、これらのコロニーを１６日目にＴＲＡ−１−６０染色を用いて評価した（図５）。ＭＥＦフィーダー条件での初期誘導の後、ｉＰＳＣをｍＴｅＳＲ１培地でフィーダーのない（Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングされた）プレートでさらに培養した。ｉＰＳＣはこの条件下で多能性細胞様の形態を維持し、ｉＰＳＣによる多能性マーカーの発現を免疫経口染色で確認した（図６）。

ＤＮＡプラスミドのエレクトロポレーションまたはｉＰＳＣへのｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏの転写。スリーピングビューティートランスポゾン／トランスポザーゼ系をがんに対する養子免疫療法のためのＴ細胞を発現するキメラ抗原受容体を生成するために適用した。この系はウイルスベースの遺伝子改変よりもはるかに安価である。この系はヌクレオフェクションによってＤＮＡプラスミド（またはｍＲＮＡ）のトランスフェクションに依存するため、ＣＭＶプロモーター駆動ＧＦＰをコードするＤＮＡ及びＧＦＰをコードするｍＲＮＡでｉＰＳＣのヌクレオフェクションの試験を行った。４Ｄ Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｇｒａｍ：ＣＡ−１３７）を用いて、ＤＮＡプラスミド及びｍＲＮＡをｉＰＳＣに導入した（図７）。ストリップを使用して、小規模のトランスフェクション（２０μＬ）を使用したときに、高いトランスフェクション効率を達成した。

ジンクフィンガーヌクレアーゼによるＴＲＡＣ遺伝子の崩壊。図８は、ｍＲＮＡをコードしたジンクフィンガーヌクレアーゼのトランスフェクションによってＴＲＡＣ遺伝子（ＴＣＲアルファ定常領域）を崩壊するための例示的なプロトコルを提供している。ＴＲＡＣ遺伝子が崩壊したｉＰＳクローンを単離し、崩壊したＴＲＡＣ遺伝子を有するクローンを同定するために、ゲノムＤＮＡ配列決定によって分析した（図９）。ＴＲＡＣ遺伝子が崩壊したｉＰＳクローンがＯＣＴ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０、及びＴＲＡ−１−８１を含む多能性マーカーを発現することが見いだされた。

ジンクフィンガーヌクレアーゼによるＴＣＲ遺伝子の崩壊。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＴＣＲ遺伝子がｉＰＳ細胞であることを妨害するために一本鎖のドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）と組み合わせて使用した（Ｃｈｅｎら、２０１１）。液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（Ｍｉｙａｋｏａら、２０１４）（図１０）を用いて変異体をスクリーニングした。

ＣＡＲの導入。スリーピングビューティー及びレンチウイルスを用いてＣＡＲの導入を実施した（図１１）。ＳＢ媒介ＣＡＲ伝達はｉＰＳ細胞のレンチウイルス媒介ＣＡＲ形質導入に匹敵することが見出された（図１２）。ｉＰＳ細胞の分化または死亡を誘導された抗ＦＣによる正の選択（ＩｇＧ茎でＣＡＲを検出）をＣＡＲ^＋集団を増やすために使用してもよい。

ｉＰＳ細胞からのＴ細胞の再分化。図１３はフィーダーフリーの条件下でｉＰＳ細胞から造血前駆細胞（ＨＰＣ）の分化のための例示的なプロトコルを提供する。

実施例３：免疫受容体の潜在的なオフターゲット毒性のレポーター遺伝子を媒介したスクリーニング
腫瘍を標的とする免疫受容体を用いた養子Ｔ細胞療法は、腫瘍細胞を根絶する能力があるためにクリニックで行われている。しかしながら、腫瘍へ免疫細胞の特異性を再指示することの懸念事項は、意図しない予測できないオフターゲットの毒性であり、この毒性が「腫瘍特異的」養子細胞治療を受けた患者に認められたことがある（Ｃａｍｅｒｏｎら、２０１３；Ｍｏｒｇａｎら、２０１０）。組織パネルの遺伝子またはタンパク質発現の検出に基づいた標的抗原の組織分布を予測する現在の方法は、これらの毒性を予測するには十分ではない。この問題を克服し、潜在的なオフターゲットの毒性の識別を改善するために、発明者らはｉＰＳＣ及び／またはｉＰＳＣ由来の分化した細胞を用いて、免疫受容体の特異性をスクリーニングする。まず、ｉＰＳＣを健康なドナー細胞から生成し、内因性ＨＬＡ発現を人工ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）によって除去し、目的の免疫受容体の背景認識を低減した。これらのｉＰＳＣを系譜特異的細胞に分化し、除去された内因性ＴＣＲの発現及び目的の導入された免疫受容体を有する、Ｔ急性リンパ芽球性白血病細胞株に由来するレポーター細胞株を用いてスクリーニングする（図２、左パネル）。このレポーター細胞株は、導入された免疫受容体を介して標的抗原を認識した後にのみＧＦＰを発現する。そのため、ｉＰＳＣ由来の分化された細胞が標的抗原を発現すれば、ＧＦＰ発現によって検出することができる。あるいはデスレポーター遺伝子（図２、中央パネル）または系譜特異的な転写因子プロモーター駆動レポーター遺伝子（図２、右パネル）をｉＰＳＣに導入してもよい。これらの細胞を使用して、免疫受容体発現Ｔ細胞と共培養することによって、免疫受容体が媒介する認識をスクリーニングすることができる。
＊ ＊ ＊

本明細書で開示され請求された方法は全て、本開示に照らして過度の実験をしなくても作製及び実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態の観点で説明してきたが、本明細書の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法のステップまたは一連のステップに変更を加えてもよいことは当業者に明らかである。より具体的には、化学的にも生理学的にも関係する特定の薬剤は、同一または類似の結果を達成しながら本明細書に記載の薬剤の代わりとなり得ることは明らかである。当業者に明らかなこのような類似の置換及び変更は本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲にあると考えられる。

参考文献

以下の参考文献は、本明細書に記載されたものに補足する例示的な手順またはそのほかの詳細を提供する程度に、参照により特に本明細書に援用される。
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Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。