CN106754726A - 一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法 - Google Patents

Abstract

增加间充质干细胞移植后归巢的方法，它涉及间充质干细胞的移植技术领域。它包含如下步骤：获取血液或皮肤细胞；转化成无外源基因的iPS细胞；对iPS细胞采用矫正基因通过锌指核酸酶ZFN进行处理和同源重组；正确分化iPS细胞到MSCs细胞；将MSCs转染基因CXCR4、FLIP、Bcl‑2，并用凋亡蛋白酶抑制剂进行处理；利用AMD3100将干细胞从干细胞龛中调动出来，并用VEGF处理以增加血管通透性；由于改善周围的循环条件使得MSC移植效率大大提高，归巢率提高，并且血管障碍也相应减小；结合一些新的方法，MSC的移植效率比传统的方法增加100倍，从而对疾病如成骨发育不全症(OI)达到前所未有的疗效。

Description

一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法

技术领域

本发明涉及间充质干细胞的移植和基因治疗技术领域，具体涉及一种提高人间充质干细胞(MSC)移植和归巢效率的基因治疗方法。

背景技术

间充质干细胞(MSC)来自于能够产生结缔组织的中胚层细胞。MSC可以很容易地从成人的几种组织中获得，包括脂肪组织和骨髓。据推测，对非造血组织和器官骨髓移植来说，一部分疗效可能来自供体骨髓间充质干细胞或患者自体植入的MSC细胞。

对于某些严重的和缺陷性的疾病，间充质干细胞移植是一个非常有前景的治疗方法。一个实例是成骨不全症(OI)，这是一个先天性的疾病，世界各地受到影响人约1/10000。在美国约有30000人，包括越来越多的成年人，都受到这种疾病的困扰。成骨不全(OI)的患者骨头脆弱，容易骨折。严重情况从相对温和状态到不同程度的残疾，包括极端矮小。最严重的是在围产期由于肺功能不全而导致死亡，其显著的特征是不发育和胸骨骨折，目前成骨不全症还没有办法治愈。

干细胞治疗成骨不全症(OI)的应用是很有前景的。干细胞治疗的理论基础是：成骨不全症(OI)患者骨中的成骨细胞可被能合成骨基质的正常细胞取代，从而从组织具有正常的功能。这是基于移植入正常细胞合成骨基质的优势要高于OI患者身体中内源性细胞合成缺陷骨基质的前提下。从根本上说，该方法主要是进行细胞移植，移植的细胞将迁移到身体每个骨组织部位，合成并积累正常的骨基质。

两种成人干细胞已被用于治疗OI：造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)。移植造血干细胞能治疗多种疾病，如清髓后造血功能的重建是一个正在进行的常规程序。到目前为止，造血干细胞是唯一的可以通过全身移植以达到治疗效果的干细胞。通过骨髓移植(BMT)，造血干细胞可以很容易地迁移到干细胞壁龛。尽管其有向骨内膜的归巢能力，骨髓移植和造血干细胞移植(HSCT)对骨疾病如成骨不全。

在所有发表过的关于MSC移植的研究中，长期间充质干细胞移植尚未有令人信服的实例说明，虽然能经常观察到治疗的优势。众所周知，间充质干细胞经过血管移植，90％的间充质干细胞移植24小时后死亡，仅有少量的间充质干细胞在移植72小时仍可被检测到。最根本的原因是，MSCs遇到了严重的阻力-缺乏基质的支持，这种基质对于间充质干细胞移植是必须的，甚至从收获移植的细胞开始。在MSC或其他贴壁细胞为基础的治疗情况下，细胞从正常贴壁生长状态下被迫停止，一个称为“失巢凋亡”的细胞程序性死亡通路就会启动。失巢凋亡，是希腊语，意思是“无家可归”，指的是由于基质附着丧失而引起的细胞程序性死亡。

目前面临的主要问题是在现有的技术条件下,间充质干细胞向骨髓归巢的能力有限，即使在子宫内移植，但这似乎是一个效率低下的现象。

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发明内容

本发明的目的是提供一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，它是一种能够治疗严重的骨骼疾病如成骨不全症(OI)或其它疾病的MSC移植和基因治疗方法，其移植效率是传统方法100倍。

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：一种一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，它包含如下步骤：

S1、获取血液或皮肤细胞；

S2、转化成无外源基因的iPS细胞；

S3、对iPS细胞采用矫正基因通过锌指核酸酶ZFN进行处理和同源重组；

S4、正确分化iPS细胞到MSCs细胞；

S5、将MSCs转染基因CXCR4、FLIP、Bcl-2，并用凋亡蛋白酶抑制剂进行处理；

S6、利用AMD3100将干细胞从干细胞龛中调动出来，并用VEGF处理以增加血管通透性。

作为本发明的进一步改进；所述的步骤S2—步骤S4中，通过向细胞导入重编程因子OCT4，SOX2和KLF4，皮肤细胞很容易就能转变成iPS细胞；用锌指核酸酶ZFN对iPS细胞进行处理，可使疾病基因DNA双链断裂，并构建正确的与疾病基因同源重组的编码基因；修正后的iPS细胞能够分化为间充质干细胞。

作为本发明的进一步改进；所述的步骤S5中，为了使FLIP因子和Bcl-2因子导入到间充质干细胞中，采用新改进的RNA转染方法，或者使用非整合型慢病毒载体NILVs。在逆转率病毒载体中，转入的基因只在转染后的几天中表达，其他方式的瞬时基因转染包括质粒或微环DNA转染等。

移植前，对MSCs用凋亡蛋白酶抑制剂z-VAD-FMK进行处理，可抑制失巢凋亡。

在细胞回输前，对MSC进行处理，使其高表达CXCR4，可提高MSC 的归巢能力。新改进的RNA转染技术可用于瞬时过表达MSCs中的CXCR4因子；此外，低氧预处理也可以增加间充质干细胞中CXCR4的表达，增加MSC趋化作用能力。

作为本发明的进一步改进；所述的步骤S6中，VEGF是一种诱导血管通透性的因子，它是组胺通透性的5000倍。VEGF的信号导致紧密连接蛋白、粘附蛋白如VE-钙粘蛋白和相关蛋白磷酸化，因此，内皮细胞间的黏附减弱，血管的通透性增加。因此，在MSC移植前2小时，给患者注射血管内皮生长因子。

作为本发明的进一步改进；所述的步骤S6中，注射CXCR4因子的拮抗剂AMD3100可以实现11％的干细胞龛排空；添加小分子抑制剂VLA-4、bio5192连同AMD3100动员循环系统中造血干细胞的能力与仅仅使用AMD3100相比增加3倍；另外，G-CSF存在的情况下动员间充质干细胞的能力增加8倍。AMD3100和其他药物给药2小时后，循环中的干细胞达到高峰，大多数动员的干细胞将在6小时后移回干细胞龛，因此，在细胞动员2小时后进行MSCs移植治疗。大量动员的造血干细胞将与移植的间充质干细胞在循环中相互作用，进而促进MSC迁移到干细胞龛。

采用上述技术方案后，本发明具有以下有益效果：

1、由于改善周围的循环条件使得MSC移植效率大大提高，归巢率提高，并且血管障碍也相应减小。

2、结合一些新的方法，MSC的移植效率比传统的方法增加100倍，从而对疾病如成骨发育不全症(OI)达到前所未有的疗效。

附图说明

图1为本发明所提供的实施例的流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本具体实施方式采用以下技术方案：

一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，它包含如下步骤：

S1、获取血液或皮肤细胞；

S2、转化成无外源基因的iPS细胞；

S3、对iPS细胞采用矫正基因通过锌指核酸酶ZFN进行处理和同源重组；

S4、正确分化iPS细胞到MSCs细胞；

S5、将MSCs转染基因CXCR4、FLIP、Bcl-2，并用凋亡蛋白酶抑制剂进行处理；

S6、利用AMD3100将干细胞从干细胞龛中调动出来，并用VEGF处理以增加血管通透性。

本具体实施方式的原理及具体实施方法如下：

1、间充质干细胞：

iPS细胞产生，基因矫正和MSC分化：通过向细胞导入重编程因子OCT4,SOX2和KLF4，皮肤细胞很容易就能转变成iPS细胞。用锌指核酸酶(ZFN)对iPS细胞进行处理，可使疾病基因DNA双链断裂，并构建正确的与疾病基因同源重组的编码基因。修正后的iPS细胞能够分化为间充质干细胞。

iPSC来源的间充质干细胞的使用有几个突出的优势：1)iPS来源的比骨髓来源的间充质干细胞具有更强的增殖能力。2)iPS来源的间充质干细胞比骨髓间充质干细胞更小，因此移植后不大可能在肺部滞留。

2、抑制失巢凋亡：

在细胞抵御失巢凋亡的研究中，已发现几个因子在抑制失巢凋亡中发挥着重要的作用。在凋亡蛋白酶激活的死亡受体通路存在缺陷的情况下，如使caspase-8抑制剂过表达，可以使细胞抵抗失巢凋亡。同样，线粒体通路障碍，如抗凋亡Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、Bcl-x(L)、Mcl-1等)的过表达，也可以使细胞抵抗失巢凋亡。因此，过表达FLIP和Bcl-2能够增加MSCs全身移植后抵御细胞死亡的能力，为了使FLIP因子和Bcl-2因子导入到间充质干细胞中，采用一种新改进的RNA转染方法。另外，可以使用非整合型慢病毒载体(NILVs)。在逆转率病毒载体中，转入的基因只在转染后的几天中表达，其他方式的瞬时基因转染包括质粒或微环DNA转染等。

同时还发现，凋亡蛋白酶-3在诱导体外间充质干细胞失巢凋亡起着重要的作用，并且发现抑制凋亡蛋白酶-3的活性能够显著降低细胞的死亡[8]。因此，移植前，对MSCs用凋亡蛋白酶抑制剂z-VAD-FMK进行处理。

3、增加MSC趋化作用能力：

类似于造血干细胞，间充质干细胞迁移也是通过趋化因子配体/受体(SDF-1/CXCR4)轴来实现的。SDF1是由干细胞龛或伤口分泌的趋化因子，SDF-1梯度吸引表达趋化因子受体CXCR4的HSCs或MSCs向干细胞龛或创伤处迁移。为了提高MSC的归巢能力，在细胞回输前，对MSC进行处理，使其高表达CXCR4，一种新的改进的RNA转染技术可用于瞬时过表达MSCs中的CXCR4因子。此外，低氧预处理也可以增加间充质干细胞中CXCR4的表达。

4、增加血管通透性：

干细胞移植是这样一个过程，细胞在血液循环中通过瞬时消除内皮细胞粘附来穿过血管屏障。造血干细胞已经发展了所有的关于细胞动员和归巢的机制。然而，间充质干细胞的动员和归巢比造血干细胞更加困难，这可能是由于MSCs内在生物学特性以及与造血干细胞相比它们的体积比较大的缘故。

血管通透性增加是肿瘤细胞转移和间充质干细胞迁移的主要原因之一。因此，短暂地增加血管通透性能提高MSC移植效率。

血管内皮生长因子(BEGF)是一种多功能的细胞因子，在血管生成中起着重要的作用。血管内皮生长因子最初被描述为一个肿瘤分泌的蛋白，是血液循环大分子，可以使微静脉和小静脉循环具有很强的渗透性，因此，最初被称为血管通透性因子。事实上，VEGF是已知的一种最有效的诱导血管通透性的因子，它是组胺通透性的5000倍。VEGF的信号导致紧密连接蛋白、粘附蛋白如VE-钙粘蛋白和相关蛋白磷酸化，因此，内皮细胞间的黏附减弱，血管的通透性增加。

因此，在MSC移植前2小时，给患者注射血管内皮生长因子。

5、排空干细胞龛中的细胞：

间充质干细胞和造血干细胞形成独特的骨髓龛。间充质干细胞和造血干细胞处于干细胞龛附近可以相互调节。提高干细胞移植，排空干细胞龛是有必要的。稳态条件下，可用的干细胞龛不足1％，而11％的干细胞龛可以通过注射CXCR4因子的拮抗剂AMD3100来实现排空。此外，添加小分子抑制剂VLA-4、bio5192连同AMD3100动员循环系统中造血干细胞的能力与仅仅使用AMD3100相比增加3倍。另外，G-CSF存在的情况下动员间充质干细胞的能力增加8倍。

AMD3100和其他药物给药2小时后，循环中的干细胞达到高峰，大多数动员的干细胞将在6小时后移回干细胞龛，因此，在细胞动员2小时后进行MSCs移植治疗。大量动员的造血干细胞将与移植的间充质干细胞在循环中相互作用，进而促进MSC迁移到干细胞龛。

本具体实施方式的因子组合与实施方法为：在移植前8-16个小时，用Bcl-2、FLIP和CXCR4基因转染间充质干细胞(MSC)，当收获间充质干细胞，显着的基因表达水平也已经达到，在细胞分裂酶如胰蛋白酶收获前2个小时，通过z-VAD-FMK对MSCs用凋亡蛋白酶抑制剂处理。MSC收获后，迅速地将它们移植到病人体内。移植前2个小时，先对病人注射AMD3100和VEGF，这样可以增加MSC移植效率，AMD3100和VEGF可以给药2-3天，每天2-3次。一周后，可重复治疗周期，进一步增加MSC移植效率。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (7)

1.一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，其特征在于，它包含如下步骤：

(S1)、获取血液或皮肤细胞；

(S2)、转化成无外源基因的iPS细胞；

(S3)、对iPS细胞采用矫正基因通过锌指核酸酶ZFN或Crispr-Cas9进行处理和同源重组；

(S4)、正确分化iPS细胞到MSC细胞；

(S5)、将MSC转染基因CXCR4、FLIP、Bcl-2，并用凋亡蛋白酶抑制剂进行处理；

(S6)、利用AMD3100将干细胞从干细胞龛中调动出来，并用VEGF处理以增加血管通透性。

2.根据权利要求1所述的一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，其特征在于，所述的步骤(S2)—步骤(S4)中，通过向细胞导入重编程因子OCT4，SOX2和KLF4，皮肤细胞能转变成iPS细胞；用锌指核酸酶ZFN对iPS细胞进行处理，可使疾病基因DNA双链断裂，并构建正确的与疾病基因同源重组的编码基因；修正后的iPS细胞能够分化为间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，其特征在于，所述的步骤(S5)中，为了使FLIP因子和Bcl-2因子导入到间充质干细胞中，采用新改进的RNA转染方法，或者使用非整合型慢病毒载体NILVs，在逆转率病毒载体中，转入的基因只在转染后的几天中表达。

4.根据权利要求3所述的一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，其特征在于，移植前，对MSCs用凋亡蛋白酶抑制剂z-VAD-FMK进行处理，可抑制失巢凋亡；在细胞回输前，对MSC进行处理，使其高表达CXCR4，可提高MSC的归巢能力；新改进的RNA转染技术可用于瞬时过表达MSC中的CXCR4因子；此外，低氧预处理也可以增加间充质干细胞中CXCR4的表达，增加MSC趋化作用能力。

5.根据权利要求1所述的一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，其特征在于，所述的步骤(S6)中，VEGF是一种诱导血管通透性的因子，它是组胺通透性的5000倍，在MSC移植前2小时，给患者注射血管内皮生长因子，血管的通透性增加。

6.根据权利要求1或5所述的一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，其特征在于，所述的步骤(S6)中，注射CXCR4因子的拮抗剂AMD3100可以实现11％的干细胞龛排空；添加小分子抑制剂VLA-4、bio5192连同AMD3100动员循环系统中造血干细胞的能力增加3倍，G-CSF存在的情况下动员间充质干细胞的能力增加8倍。

7.根据权利要求6所述的一种提高人间充质干细胞移植和归巢效率的基因治疗方法，其特征在于，所述的步骤(S6)中，AMD3100和其他药物给药2小时后，循环中的干细胞达到高峰，大多数动员的干细胞将在6小时后移回干细胞龛，因此，在细胞动员2小时后进行MSC移植治疗；大量动员的造血干细胞将与移植的间充质干细胞在循环中相互作用，进而促进MSC迁移到干细胞龛。