JP5763530B2 - Ｂａｘ−およびＢａｋ−欠損細胞株の生成のための方法および組成物 - Google Patents

Description

本開示は、Ｂａｘおよび／またはＢａｋの発現が消失した細胞株のゲノムエンジニアリングおよび生成、ならびに蛋白質（例えば、抗体、抗原等）、ウイルスおよび／またはウイルスベクターの生成のためのＢａｘ／Ｂａｋ欠損細胞株の使用の分野におけるものである。
発明の分野

アポトーシス、またはプログラムされた細胞の死滅は外因性または内因性シグナルならびに発生合図が引き金となり得る。２つの主なアポトーシス経路が確認されている：引き続いて死滅するであろう細胞で発現された細胞表面受容体へのリガンド欠乏を介してアポトーシスが開始される外因性細胞死経路、およびアポトーシスが細胞内で開始される内因性細胞死経路。

腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーは、外因性死滅経路に関与する受容体で最良に特徴付けられたものの中にある。リガンドの係合に際して、これらの受容体は死滅−誘導シグナリング複合体の形成を開始し、これは必須のアダプター分子ＦＡＤＤを含む。ＦＡＤＤは、今度は、カスパーゼ８を動員し、これは、今度は、自己蛋白質分解プロセスを介して活性化される。一旦活性化されれば、カスパーゼ８は、カスパーゼ９およびカスパーゼ３のようなさらなるカスパーゼ活性および細胞内基質の分解双方を開始させ、これは、結局は細胞死をもたらす。ＴＮＦ受容体ファミリーはＴＮＦＲ１；Ｆａｓ；Ａｐｏ３、ＷＳＬ−１、ＴＲＡＭＰ、およびＬＡＲＤのようなＤＲ３蛋白質；ＤＲ４；ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、およびＫＩＬＬＥＲのようなＤＲ５蛋白質；およびＤＲ６を含む。

蛋白質のＢｃｌ−２ファミリーのメンバーは細胞死を変調するそれらの能力によって特徴付けられる。Ｂｃｌ−２、およびＢｃｌ−ｘ１のようなそのホモログのいくつかはアポトーシスを阻害し、他方ＢａｘおよびＢａｋのような他のファミリーのメンバーはある条件下ではアポトーシスを誘導しまたは加速する。ＢａｋおよびＢａｘ、ならびにＢｃｌ−ｘｓ、Ｂｉｄ、Ｂｉｍ、ＢａｄおよびＢｉｋはＢｃｌ−２蛋白質のプロ−アポトーシスの群を構成する。

Ｂａｘ蛋白質はＢｃｌ−２を持つ高度に保存されたドメインを保有し、そのいくつかはＢａｘ／Ｂｃｌ−２ヘテロダイマーの形成で必要であり、これは、アポトーシスシグナルに対する生存または死滅の応答で重要であると考えられる。その活性化に続いて、Ｂａｘは他のミトコンドリア膜に移動し、そこで、それはオリゴマー化し、膜を透過性とし、チトクロームＣを含めた数個の死滅−促進因子を放出する（Ｓｃｏｒｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０４：４３７−４４４）。Ｂａｘをミトコンドリアから隔離する、Ｋｕ７０蛋白質との相互作用を介して正常な細胞においてＢａｘは不活性とされ得る（Ｓａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：３２０−３２９）。

Ｂａｋもまた細胞死を促進し、Ｂｃｌ−２によって供されたアポトーシスからの保護に対向する。Ｂａｘのように、Ｂａｋの遺伝子産物は、まず、適切な刺激に続いてアポトーシス細胞死を促進する。Ｂａｋは種々の細胞型においてアポトーシスの強力なインデューサーである。

Ｂａｘおよび／またはＢａｋの発現がアンチセンス分子の導入によって低下される細胞株は記載されている。例えば、Ｍａｎｄｉｃ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１：３６８４−３６９１参照）。加えて、Ｂａｘおよび／またはＢａｋの欠乏線維芽細胞もまた細胞株を作り出すために不滅化されている。米国特許出願第２００３００９１９８２号参照。さらに、抑制ドメインに融合した天然で生じるジンクフィンガー蛋白質（Ｇｒｉｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１４５６９−１４５７３）、および遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質およびヌクレアーゼ（米国特許出願公開第２００６００６３２３１号参照）もまた、Ｂａｘおよび／またはＢａｋの不活化について記載している。遺伝子組換えジンクフィンガーヌクレアーゼもまた、内因性ジヒドロ葉酸レダクダーゼ（ｄｈｆｒ）およびＣＣＲ５遺伝子を不活化するのに用いられている。例えば、米国特許公開第２００８００１５１６４号およびＰＣＴ国際公開第２００７／１３９９８２号パンフレット参照。

しかしながら、例えば、アポトーシス−抵抗性細胞株の生成を容易とするための、ＢａｘおよびＢａｋの不活化のための方法および組成物に対する要望が依然として存在する。

ここに、例えば、広く種々の内因性死滅刺激体に対して抵抗性であるＢａｘおよび／またはＢａｋ欠損またはノックアウト細胞株を生成させるための、標的細胞におけるＢａｘおよび／またはＢａｋの部分的または全面的な不活化のための方法および組成物が開示される。慣用的な細胞株とは異なり、Ｂａｘ／Ｂａｋ−欠損細胞株は、多継代後においてさえ、培養にて高レベルの蛋白質を継続的に生産するゆえに、これらの細胞株は、有利には、組換え蛋白質（例えば、抗体、抗原、治療蛋白質）の生産で用いられる。

Ｂａｘ／Ｂａｋ欠損細胞株は、例えば、組換えレンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ−関連ウイルス（ＡＶＶ）ベクターの生成において、ウイルスベクターおよび／またはウイルスベクター発現遺伝子産物の生成用のプロデューサー細胞株としても有用である。現在、これらのウイルスベクターを生成するのに用いる方法は、適時でないアポトーシスを介してベクターを低収率に（未修飾宿主細胞において）導く宿主細胞をかなり強調している。かくして、本開示は、ウイルスベクターの生産のためのアポトーシス−抵抗性Ｂａｘ／Ｂａｃ欠損細胞株に対する要望に取り組む。

加えて、Ｂａｘおよび／またはＢａｋ欠損細胞株は、ヒトインフルエンザウイルスを標的とするもののようなワクチンのイン・ビトロ生産で有用である。そのようなワクチンプロデューサー細胞のアポトーシスは、（ｉ）低下した全収率、または（ｉｉ）ワクチンロットの失敗、およびヒトにおいてワクチンロットを用いることができないことを招きかねない汚染の重要な源である。

Ｂａｘおよび／またはＢａｋ欠損細胞株は、癌、およびアポトーシスが関与する他の病気（例えば、アルツハイマー病、パーキンソー病等）に影響する薬剤を研究するのにも有用である。同様に、Ｂａｘおよび／またはＢａｋ欠損細胞株は、基礎研究および薬物の発見のための有用なツールである。そのような系は、ある種の実験条件、例えば、エレクトロポレーション、ウイルス形質導入、リポソーム媒介−送達などのような核酸送達手法に対する応答において、および／または薬物―標的相互作用の測定、またはアポトーシス応答の不存在下におけるそのような相互作用の研究を介して基礎研究を知ることを促進できる毒性またはストレス−誘導ペイロードの送達に対する応答に対して、細胞の増大した生存を提供する。

１つの態様において、ＢＡＸ遺伝子中に結合するように作成されたジンクフィンガー蛋白質が提供される。本明細書中に記載されるジンクフィンガー蛋白質のいずれも１、２、３、４、５、６またはそれ以上のジンクフィンガーを含んでもよく、各ジンクフィンガーはＢＡＸ遺伝子中のサブサイトに結合する認識ヘリックスを有する。ある実施形態において、ジンクフィンガー蛋白質は（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４および所望によりＦ５と命名された）４つのフィンガーを含み、表１に示された認識ヘリックスのアミノ酸配列を含む。

１つの態様において、ＢＡＫ遺伝子中に結合するように作成されたジンクフィンガー蛋白質が提供される。本明細書中に記載されたジンクフィンガー蛋白質のいずれも１、２、３、４、５、６またはそれ以上のジンクフィンガーを含んでもよく、各ジンクフィンガーはＢＡＫ遺伝子中の標的サブサイトに結合する認識ヘリックスを有する。ある実施形態においては、ジンクフィンガー蛋白質は（Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４およびＦ５と命名された）４または５のフィンガーを含み、表２に示された認識ヘリックスのアミノ酸配列を含む。

ある実施形態においては、ここに、遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインが提供され、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインはＮ−末端からＣ−末端にＦ１ないしＦ４の順番の４つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここに、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦ４は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＲＳＤＨＬＳＴ（配列番号：１）；Ｆ２：ＤＲＳＨＬＡＲ（配列番号：２）；Ｆ３：ＱＳＳＨＬＴＲ（配列番号：３）；およびＦ４：ＲＳＤＮＬＲＥ（配列番号：４）。

ある実施形態において、ここに、遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインが提供され、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインはＮ−末端からＣ−末端にＦ１ないしＦ４の順番の４つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここに、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＲＳＡＮＬＳＶ（配列番号：５）；Ｆ２：ＤＲＡＮＬＳＲ（配列番号：６）；Ｆ３：ＮＲＴＤＬＩＲ（配列番号：７）；およびＦ４：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号：８）。

他の実施形態において、開示は遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインを提供し、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインはＮ−末端からＣ−末端へＦ１ないしＦ５の順番の５つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここに、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４およびＦ５は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＴ（配列番号：９）；Ｆ２：ＲＳＤＨＬＳＥ（配列番号：１０）；Ｆ３：ＲＮＤＮＲＫＴ（配列番号：１１）；Ｆ４：ＱＳＧＨＬＱＲ（配列番号：１２）；およびＦ５；ＱＳＧＨＬＳＲ（配列番号：１３）。

他の実施形態において、開示は遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインを提供し、ここに、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｎ−末端からＣ−末端へＦ１ないしＦ４の順番の４つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここに、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、およびＦ４は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＲＳＤＳＬＳＡ（配列番号：１４）；Ｆ２：ＤＲＳＳＲＴＫ（配列番号：１５）；Ｆ３：ＲＳＤＤＬＴＲ（配列番号：１６）；およびＦ４：ＲＳＤＡＬＡＲ（配列番号：１７）。

他の実施形態において、開示は遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインを提供し、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインは、Ｎ−末端からＣ−末端へＦ１ないしＦ５の順番の４つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここに、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４およびＦ５は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＤＲＳＤＬＳＲ（配列番号：４５）；Ｆ２：ＮＲＴＤＬＩＲ（配列番号：７）；Ｆ３：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号：８）；Ｆ４：ＲＳＤＴＬＳＱ（配列番号：４６）；およびＦ５：ＤＲＳＡＲＴＲ（配列番号：４７）。

他の実施形態において、開示は遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ―結合ドメインを提供し、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインはＮ−末端からＣ−末端へＦ１ないしＦ５の順番の４つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここに、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４およびＦ５は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＲＳＤＡＬＳＶ（配列番号：４８）；Ｆ２：ＤＳＳＨＲＴＲ（配列番号：４９）；Ｆ３：ＱＮＡＨＲＫＴ（配列番号：５０）；Ｆ４：ＲＳＤＨＬＳＴ（配列番号：１）；およびＦ５：ＴＳＧＨＬＳＲ（配列番号：５１）。

他の実施形態において、開示は遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインを提供し、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインはＮ−末端からＣ−末端へＦ１ないしＦ５の順番の４つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここにＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４およびＦ５は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＱＮＡＨＲＫＴ（配列番号：５０）；Ｆ２：ＱＳＧＤＬＴＲ（配列番号：５３）；Ｆ３：ＱＳＧＤＬＴＲ（配列番号：５３）；Ｆ４：ＱＳＳＮＬＡＲ（配列番号：５４）；およびＦ５：ＴＳＳＮＲＫＴ（配列番号：５５）。

他の実施形態において、開示は遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインを提供し、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインはＮ−末端からＣ−末端へＦ１ないしＦ６の順番の４つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここにＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＲＳＤＮＬＡＲ（配列番号：５７）；Ｆ２：ＱＳＧＤＬＴＲ（配列番号：５３）；Ｆ３：ＤＮＲＱＬＩＴ（配列番号：５８）；Ｆ４：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号：８）；Ｆ５：ＲＳＤＴＬＳＲ（配列番号：５９）；およびＦ６：ＲＮＤＤＲＩＴ（配列番号：６０）。

他の実施形態において、開示は遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインを提供し、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインはＮ−末端からＣ−末端へＦ１ないしＦ５の順番の４つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここにＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４およびＦ５は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＲＳＤＮＬＴＴ（配列番号：６２）；Ｆ２：ＲＳＤＨＬＳＲ（配列番号：６３）；Ｆ３：ＱＳＳＤＬＲＲ（配列番号：６４）；Ｆ４：ＱＳＳＨＬＴＲ（配列番号：３）；およびＦ５：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号：６５）。

他の実施形態において、開示は遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインを提供し、ここに、ＤＮＡ−結合ドメインはＮ−末端からＣ−末端へＦ１ないしＦ６の順番の４つのジンクフィンガー認識領域を含み、ここにＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５およびＦ６は以下のアミノ酸配列を含む：Ｆ１：ＱＳＧＳＬＴＲ（配列番号：６７）；Ｆ２：ＴＳＳＮＲＫＴ（配列番号：５５）；Ｆ３：ＤＲＳＨＬＴＲ（配列番号：６８）；Ｆ４：ＲＳＤＤＲＫＴ（配列番号：６９）；Ｆ５：ＮＲＴＤＬＩＲ（配列番号：７）およびＦ６：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号：８）。

もう１つの態様において、本明細書中に記載されたジンクフィンガー蛋白質のいずれか、および少なくとも１つの切断ドメインまたは少なくとも１つの切断ハーフ−ドメインを含む融合蛋白質も提供される。ある実施形態において、切断ハーフ−ドメインは野生型ＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインである。他の実施形態において、切断ハーフ−ドメインは遺伝子組換えＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインである。

なおもう１つの態様において、本明細書中に記載された蛋白質のいずれかをコードするポリヌクレオチドが提供される。

なおもう１つの態様において、本明細書中に記載された蛋白質および／またはポリヌクレオチドのいずれかを含む単離された細胞も提供される。ある実施形態において、Ｂａｘおよび／またはＢａｋが不活化された細胞株は、本明細書中に記載された蛋白質および／またはポリヌクレオチドのいずれかを含む細胞を培養して、Ｂａｘおよび／またはＢａｋ欠損細胞株を生成させることによって生成される。ある実施形態において、ＢａｘまたはＢａｋは細胞または細胞株において（部分的にまたは全面的に）不活化される。

加えて、細胞または細胞株においてＢａｘおよび／またはＢａｋを不活化する方法においてジンクフィンガー蛋白質およびその融合を用いる方法が提供される。ある実施形態において、細胞中でのＢａｘおよび／またはＢａｋの不活化は、細胞の継代に続いてＢａｘおよび／またはＢａｋが不活化されたままである細胞株を生じさせ、それにより、アポトーシスに対して抵抗性である細胞を作り出す。

かくして、もう１つの態様において、ここに、細胞において細胞のＢＡＸおよび／またはＢＡＫ遺伝子（例えば、内因性ＢＡＫ／ＢＡＸ遺伝子（類））を不活化する方法が提供され、その方法は：（ａ）第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を細胞に導入することを含み、ここに、その第１のポリペプチドは、そのポリペプチドが細胞中で発現されるように、：（ｉ）内因性ＢＡＫおよび／またはＢＡＸ遺伝子中の第１の標的部位に結合するように作成されたジンクフィンガーＤＮＡ−結合ドメイン；および（ｉｉ）切断ドメインを含み、それにより、そのポリペプチドは標的部位に結合し、ＢＡＫおよび／またはＢＡＸを切断する。ある実施形態において、その方法は、さらに、第２のポリペプチドをコードする核酸を導入することを含み、ここに、第２のポリペプチドは、その第２のポリペプチドが細胞中で発現されるように（ｉ）、ＢＡＫおよび／またはＢＡＸ遺伝子中の第２の標的部位に結合するように作成されたジンクフィンガーＤＮＡ−結合ドメイン；および（ｉｉ）切断ドメインを含み、それにより、第１および第２のポリペプチドはそれらの各標的部位に結合し、ＢＡＫおよび／またはＢＡＸ遺伝子を切断する。第１および第２のポリペプチドは第１の核酸によってまたは異なる核酸によってコードされていてもよい。ある実施形態において、１以上のさらなるポリヌクレオチドまたはポリペプチドが細胞に導入され、例えば、さらなるジンクフィンガー蛋白質をコードするポリヌクレオチドである。

もう１つの態様において、ここに、Ｂａｋおよび／またはＢａｘ発現が消失した（すなわち、Ｂａｋおよび／またはＢａｘの発現が低下した、または排除された）細胞株を生産する方法が提供される。ある実施形態において、その方法は、１以上の遺伝子組換えジンクフィンガーヌクレアーゼ（または遺伝子組換えヌクレアーゼをコードする核酸）を導入し、その細胞を引き続いて培養して、Ｂａｘおよび／またはＢａｋに関して欠損した細胞株を生成させることによってＢａｋおよび／またはＢａｘを部分的にまたは全面的に不活化することを含む。

なおもう１つの態様において、開示は、Ｂａｋおよび／またはＢａｘが不活化された宿主細胞または細胞株において注目する蛋白質またはウイルスまたはウイルスベクターを生産する方法を提供する。ある実施形態において、その方法は（ａ）内因性ＢＡＸおよび／またはＢＡＫ遺伝子を含む宿主細胞を供し；（ｂ）本明細書中に記載された方法のいずれかによって宿主細胞の内因性ＢＡＸおよび／またはＢＡＫ遺伝子を不活化し；次いで、（ｃ）導入遺伝子を含む発現ベクター、注目するウイルスまたはウイルスベクターを宿主細胞に導入するステップを含み、その導入遺伝子は蛋白質をコードする配列を含み、それにより、注目する蛋白質、ウイルスまたはウイルスベクターを生産する。他の実施形態において、その方法は：Ｂａｋ−および／またはＢａｘ−欠損細胞株を供し；注目する少なくとも１つの組換え蛋白質をコードするポリヌクレオチド、ウイルス、またはウイルスベクターを、組換え蛋白質が細胞株で発現されるような条件下で、その細胞株に導入するステップを含む。その蛋白質をコードするポリヌクレオチド、ウイルス、または注目するウイルスベクターは、Ｂａｋ−および／またはＢａｘ−結合細胞株に安定におよび／または一過的に導入してもよい。本明細書中に記載された方法のいずれかにおいて、注目する蛋白質は抗体、例えば、モノクローナル抗体を含む。他の実施形態において、注目する蛋白質は、ワクチンのような抗原として有用な蛋白質、例えば、インフルエンザウイルスに由来するＨＡ蛋白質を含む。さらなる実施形態において、その方法を用いて、全ウイルスワクチンを生産する。さらに他の実施形態において、組換えウイルスベクターは、前記した方法、例えば、（ａ）内因性ＢＡＸおよび／またはＢＡＫ遺伝子を含む宿主細胞を供し；（ｂ）本明細書中に記載された方法のいずれかによって宿主の内因性ＢＡＸおよび／またはＢＡＫ遺伝子を不活化し；次いで、（ｃ）組換えウイルスベクター系を含む１以上の発現ベクターを導入し、それにより、注目する組換えベクターを生産するステップを含む方法によって生産される。

本明細書中に記載された細胞、細胞株および方法のいずれにおいても、粗細胞またはその細胞株はＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８―Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ＰｅｒＣ.６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）；ＥＢｘ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｇｒｏｕｐ）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Sｆ）のような昆虫細胞、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞、または当該分野で知られた、またはｄｅ ｎｏｖｏ開発された他の細胞株であり得る。

これらおよび他の態様は、全体としての開示に照らして当業者に容易に明らかにあろう。

図１は、ＢＡＫ遺伝子のエクソン２が、遺伝子組換えジンクフィンガーヌクレアーゼを用いてノックアウトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞の遺伝子型決定を示す。（野生型と比較した）欠失された塩基はコロンによって示される。頂部線（３９Ｆ／３８Ｒ）は野生型配列であって、ボックスに入れた部分は開始コドンを示す。クローン８Ｈ６は、対立遺伝子Ａが対立遺伝子Ｂとは異なる塩基対欠失パターンを示す合成異型接合体ノックアウト（ＫＯ）である。クローン８Ｄ４はホモ接合ノックアウトである。 図２のパネルＡないしＤは、ＺＦＮによるＭＤＣＫ細胞におけるＢＡＫおよびＢＡＸ遺伝子の修飾を示す。図２Ａは、ＢＡＫ−標的化ＺＦＮ−処理細胞プール（１７６２３／１７６２２または１７６２７／１７６２６）および非−ＺＦＮ−処理細胞（「ベクターのみ」）におけるＣＥＬ−Ｉアッセイでの切断反応に由来するＰＣＲ産物を示すゲルである。ＢＡＫ遺伝子座がＺＦＮによって修飾された対立遺伝子のパーセンテージは、２つの最も左側のレーン直下に示す。図２Ｂは、ＢＡＸ−標的化ＺＦＮ−処理細胞プール（１７６５８／１７６５９）および非−ＺＮＦ処理細胞（「ベクターのみ」）におけるＣＥＬ−Ｉアッセイでの切断反応に由来するＰＣＲ産物を示すゲルである。ＢＡＸ遺伝子座がＺＦＮによって修飾された対立遺伝子のパーセンテージは最も右側のレーン直下に示す（８％）。図２Ｃは、ＢＡＫ−標的化ＺＦＮで処理された種々のＭＤＣＫクローンのＰＣＲ結果を示す。クローンの数は各レーンの頂部に示し、各ＢＡＫ対立遺伝子における突然変異はゲルの下方に示す。図２ＤはＢＡＸ−特異的ＺＦＮで処理されたＭＤＣＫ細胞のＰＣＲ分析のまとめを示す。図面から分かるように、ＢＡＸ単一ノックアウトは一方の対立遺伝子での３０ｂｐの欠失、および他方の対立遺伝子での１ｂｐの挿入で得られた。ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウトでは、ＢＡＸ対立遺伝子は、ＢＡＸ−特異的ＺＦＮを用いてＢａｋ−欠損クローンにおいて標的化された。理解できるように、数個の異型接合体クローンが同定され、それは１つの野生型ＢＡＸ対立遺伝子、および１つの突然変異したＢＡＸ対立遺伝子を含有した。 図２Ａに同じ。 図２Ａに同じ。 図２Ａに同じ。 図３は、Ｂａｋノックアウト細胞におけるＲＮＡ分析を示す。示されたゲルのレーン１ないし５は、示されたクローンおよび対照からのエクソン１ないし４からのＢａｋ転写体のＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。レーン６ないし１０は、同一クローンおよび対照におけるエクソン４ないし６からのＢａｘ転写体のＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。レーン４における矢印によって示されるように、クローン８Ｈ６（合成異型接合体クローン）から形成された転写体のほとんどがエクソン２をスキップする。 図４のパネルＡおよびＢは、Ｂａｋ８Ｈ６ノックアウトのバックグラウンドで生じた２１の陽性Ｂａｋ／Ｂａｘ二重ノックアウトクローンのＰＣＲ産物の分析を示す。クローン番号は各レーンの上方に示す。分析した７９のクローンの内、２１（２７％）はＢｓｌ Ｉで消化され、ＺＬＮ切断の部位における突然変異を示す。図４ＡにおけるＢｓｌＩ−抵抗性対立遺伝子の配列は図４Ｂに示される。頂部線（５２Ｆ／１１４Ｒ）は、整列を容易とするために４ｂｐのギャップが挿入された野生型配列である。３０、３５、４５、７１および９７と命名されたクローンについての挿入および欠失は大きく、従って、示していない。クローン＃１００の遺伝子型は決定しなかった。 図４Ａに同じ。 図５は、Ｂａｘ／Ｂａｋ二重ノックアウト細胞におけるＢａｘおよびＢａｋ蛋白質の発現を示す。クローン番号は各レーンの上方に示し、検出で用いた抗体は各ゲルの下方に示す（Ｂａｘ蛋白質についてのＡｂｃａｍ ＃７９７７，およびＢａｋ蛋白質についてのＳｉｇｍａ Ｂ５８７７）。示されるように、二重ＫＯ細胞は全長または切断型ＢａｘおよびＢａｋ蛋白質を生産しない。 図６は、アポトーシスを示すカスパーゼ活性（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｃａｓｐａｓｅｓ Ａｓｓａｙ（ホモジニアス カスパーゼアッセイ）、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって測定されたＢａｘ／Ｂａｋ二重ＫＯ細胞におけるアポトーシスを示すグラフである。白色の棒線は１ ｕＭスタウロスポリンでの誘導後のカスパーゼ活性を示し；灰色の棒線は未誘導細胞を示す。テストしたＢａｘ−Ｂａｋ−／−クローンは；クローン４７（左から２番目の棒線）；クローン７１（右から２番目の棒線）；およびクローン９１（最も右側の棒線）であった。 図７は、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫノックアウト細胞クローンにおける蛋白質（モノクローナル抗体）産生を示すグラフである。菱形は野生型ＣＨＯ細胞における抗体の産生を示し、四角はクローン８Ｈ６−７１ ＢＡＸ−ＢＡＫ−／−ＣＨＯ細胞における蛋白質産生を示す。

詳細な説明
ＢＡＫ遺伝子および／またはＢＡＸ遺伝子の部分的または全面的な不活化のための組成物および方法を本明細書中に記載する。また、これらの組成物（試薬）を作成し、およびそれを用いて、例えば、標的細胞においてＢａｋおよびＢａｘの一方または双方を不活化する方法が開示される。標的細胞におけるＢａｋおよび／またはＢａｘの不活化を用いて、アポトーシスに対して抵抗性であって抗体のような組換え蛋白質、組換えウイルスベクターを生産するのに、およびワクチン（例えば、１以上の抗原性蛋白質、全ウイルスワクチン等）を製造するのに有用な細胞株を作り出すことができる。

哺乳動物細胞において、ＢａｘおよびＢａｋはプログラムされた細胞死を促進するのに関与していることが示されている。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：９８９−９９２参照。かくして、本明細書中に記載された方法および組成物は、Ｂａｘおよび／またはＢａｋ欠損細胞株の生成を可能とするＢａｘおよび／またはＢａｋの（部分的または全面的な）標的化遺伝子ノックアウトのための高度に有効な方法を提供する。Ｂａｘ／Ｂａｋ−欠損細胞株は多くの不滅化細胞株で見られる異常な増殖を受けることなく、イン・ビトロにて長期間培養することができる。かくして、本明細書中に記載された細胞株は、組換え蛋白質（例えば、抗体）、ワクチンまたは組換えウイルスベクターを生産するにおいて、およびアポトーシス関連疾患および病態を研究するにおいて有用である。

一般
本明細書中に開示された方法、ならびに組成物の調製および使用の実施は、そうでないことが示されるのでなければ、当業者の技量内にあるように、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡおよび関連分野の従来の技術を使用する。このような技術は文献で徹底して説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＬＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，第２版,Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９および第３版，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈn Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期的更新物；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ, Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ, Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，第３版、Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ,Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．ＷａｓｓａｒｍａｎおよびＡ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ編），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９；およびＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ編）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ,１９９９参照。

定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は相互交換可能に用いられ、線状または環状立体配座であって、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーをいう。本開示の目的では、これらの用語はポリマーの長さに関して限定されると解釈されるべきではない。その用語は天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸基が修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を含むことができる。一般に特定のヌクレオチドのアナログは同一の塩基−対合特異性を有し；すなわち、ＡのアナログはＴと塩基−対合するであろう。

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「蛋白質」は互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーをいう。その用語は、１以上のアミノ酸が対応する天然アミノ酸の化学的アナログまたは修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「結合」とは、マクロ分子の間の（例えば、蛋白質および核酸の間の）配列−特異的非−共有結合相互作用をいう。結合相互作用が全体として配列−特異的である限り、その相互作用の全ての成分が配列−特異的（例えば、ＤＮＡ骨格中のリン酸残基との接触）である必要はない。そのような相互作用は１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）によって一般的に特徴付けられる。「親和性」とは結合の強度をいい：結合親和性が高まるとＫｄが低下する。

「結合蛋白質」は、もう１つの分子に非―共有結合的に結合することができる蛋白質である。結合蛋白質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ−結合蛋白質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ−結合蛋白質）および／または蛋白質分子（蛋白質−結合蛋白質）に結合することができる。蛋白質−結合蛋白質の場合には、それはそれ自体に結合して（ホモダイマー、ホモトリマー等を形成）することができる、および／またはそれは異なる蛋白質もしくは蛋白質類の１以上の分子に結合することができる。結合蛋白質は結合活性の１を超えるタイプを有することができる。例えば、ジンクフィンガー蛋白質はＤＮＡ−結合、ＲＮＡ−結合および蛋白質結合活性を有する。

「ジンクフィンガーＤＮＡ−結合蛋白質」（または結合ドメインは）、蛋白質、あるいはその構造が亜鉛イオンの配位を通じて安定化された結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１以上のジンクフィンガーを通じて配列−特異的にＤＮＡに結合するより大きな蛋白質内のドメインである。その用語「ジンクフィンガーＤＮＡ結合蛋白質は、しばしば、ジンクフィンガー蛋白質またはＺＦＰと省略される。

ジンクフィンガー結合ドメインは、例えば、天然のジンクフィンガー蛋白質の認識ヘリックス領域の工学（１以上のアミノ酸の改変）を介して所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作する」ことができる。従って、遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質は、それが非天然の認識ヘリックス領域を含有する点で、非天然の蛋白質である。ジンクフィンガー蛋白質を操作する方法の非限定的例は設計および選択である。設計されたジンクフィンガー蛋白質は、その設計／組成が原理的には合理的基準に由来する性質が起こらない蛋白質である。設計のための合理的基準は、現存のＺＦＰ設計および結合データのデータベース貯蔵情報中の情報を処理するための置換規則および計算されたアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；第６，４５３，２４２号；および第６，５３４，２６１号参照；また、国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレットおよび国際公開第０３／０１６４９６号パンフレット参照。

「選択された」ジンクフィンガー蛋白質は、その生産が、主として、ファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択のような経験的プロセスに由来する性質が見出されない蛋白質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；米国特許第５，９２５，５２３号；米国特許第６，００７，９８８号；米国特許第６，０１３，４５３号；米国特許第６，２００，７５９号；国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレットおよび国際公開第０２／０９９０８４号パンフレット参照。

用語「配列」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得；線状、環状または分岐のものであり得、かつ一本鎖または二本鎖いずれかであり得る、いずれかの長さのヌクレオチド配列をいう。用語「ドナー配列」とは、ゲノムに挿入されたヌクレオチド配列をいう。ドナー配列はいずれの長さのものとすることもでき、例えば、長さは２および１０，０００ヌクレオチドの間（またはその間またはそれを超えるいずれかの整数値）、好ましい長さは約１００および１，０００ヌクレオチドの間（またはその間のいずれかの整数）、より好ましくは長さが約２００および５００ヌクレオチドの間であり得る。

「相同な非−同一配列」とは、第２の配列とある程度の配列同一性を保有するがその配列は第２の配列のそれと同一ではない第１の配列をいう。例えば、突然変異体遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドはその突然変異体遺伝子の配列に対して相同であって、非−同一である。ある実施形態において、２つの配列の間の相同性の程度は、通常の細胞メカニズムを利用するそれらの間の相同組換えを可能とするのみ全面的なものである。２つの相同な非−同一配列はいずれの長さのものでもあり得るが、非−相同性のそれらの程度は（例えば、標的化相同組換えによるゲノム点突然変異の修正のためには）単一ヌクレオチド程度小さくすることができ、あるいは（例えば、染色体中の所定の異所性の部位における遺伝子の挿入のためには）１０キロベース以上程度大きくすることができる。相同非−同一配列を含むポリヌクレオチドは同一の長さである必要はない。例えば、２０および１０，０００ヌクレオチドのまたはヌクレオチド対の間の外因性ポリヌクレオチド（すなわち、ドナーポリヌクレオチド）を用いることができる。

核酸およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術は当該分野で知られている。典型的にはそのような技術は、遺伝子についてのｍＲＮＡヌクレオチド配列を決定し、および／またはそれによりコードされるアミノ酸配列を決定し、これらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸と比較することを含む。また、ゲノム配列を決定し、このようにして比較することもできる。一般に、同一性とは、各々、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の正確なヌクレオチド−対−ヌクレオチドまたはアミノ酸−対−アミノ酸対応性をいう。２以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらのパーセント同一性を決定することによって比較することができる。２つの配列のパーセント同一性は、核酸またはアミノ酸配列を問わず、２つの整列させた配列の間の正確なマッチの数をより短い配列の長さで割り、１００を掛けたものである。本明細書中に記載された配列に関しては、配列同一性の所望の程度の範囲はほぼ８０％ないし１００％、およびその間のいずれかの整数値である。典型的には配列の間のパーセント同一性は、少なくとも７０ないし７５％、好ましくは８０ないし８２％、より好ましくは８５ないし９０％、なおより好ましくは９２％、依然としてより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。

別法として、ポリヌクレオチドの間の配列類似性の程度は、相同領域の間の安定なデュプレックスの形成を可能とする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼイション、続いての一本鎖で−特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化された断片のサイズ決定によって決定することができる。２つの核酸、または２つのポリペプチド配列が、前記方法を用いて決定して、分子の規定された長さにわたって、少なくとも約７０％ないし７５％好ましくは８０％ないし８２％、より好ましくは８５％ないし９０％、なおより好ましくは９２％、依然としてより好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を呈する場合、その配列は相互に実質的に相同である。本明細書中で用いるように、実質的に相同なとは、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して全面的な同一性を示す配列もいう。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、その特定の系で定義されたストリンジェントな条件下にてサザーンハイブリダイゼイション実験で同定することができる。適切なハイブリダイゼイション条件を定義することは当該分野の技量内のものである。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ．ａｌ．，上記を参照；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，編集者Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ参照。

２つの核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは以下のように決定することができる。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、そのような分子の間のハイブリダイゼーション事象の有効性および強度に影響する。部分的に同一な核酸配列は、標的分子に対する全面的に同一な配列のハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害するであろう。全面的に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該分野でよく知られたハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、サザーン（ＤＮＡ）ブロット、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット、溶液ハイブリダイゼーション等、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）を用いて評価することができる。そのようなアッセイは、種々の程度の選択性を用い、例えば、ストリンジェンシーを低度から高度に変える条件を用いて実施することができる。低ストリンジェンシーの条件を使用するならば、非−特異的結合の不存在は、非−特異的結合事象の不存在下で二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、部分的程度さえの配列同一性を欠如する二次プローブ（例えば、標的分子に対して約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて評価することができる。

ハイブリダイゼイション−ベースの検出系を利用する場合、参照核酸配列に対して相補的な核酸プローブを選択し、次いで、適切な条件の選択によって、そのプローブおよび参照配列は選択的に相互にハイブリダイズし、または結合して、デュプレックス分子を形成する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、選択された核酸プローブの配列に対して少なくともほぼ７０％の配列同一性を有する長さが少なくとも約１０ないし１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を可能とする条件下で典型的にはハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、選択された核酸プローブの配列に対して約９０ないし９５％よりも大きな配列同一性を有する長さが少なくとも約１０ないし１４ヌクレオチドの標的核酸配列の検出を典型的には可能とする。プローブおよび参照配列が特定の程度の配列同一性を有する場合、プローブ／参照配列ハイブリダイゼーションでいうようなハイブリダイゼーション条件は当該分野で知られているように決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｒｏａｃｈ，編集者Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ参照）。

ハイブリダイゼーションについての条件は当業者によく知られている。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチしたヌクレオチドを含有するハイブリッドの形成に対して不都合な程度をいい、ストリンジェンシーが高いとミスマッチしたハイブリッドの許容性が低くなる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する因子は当業者によく知られており、限定されるものではないが温度、ｐＨ、イオン強度、および例えば、ホルムアミドおよびジメチルスルホキシドのような有機溶媒の濃度を含む。当業者に知られているように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度、およびより低い溶媒濃度によって増加する。

ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関しては、多数の同等な条件を使用して、例えば、以下の因子：配列の長さおよび性質、種々の配列の塩基組成、塩および他のハイブリダイゼーション溶液の成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液中のブロッキング剤（例えば、デキストラン硫酸、およびポリエチレングリコール）の有無、ハイブリダイゼーションの反応温度および時間パラメータ、ならびに洗浄条件を変化させることによって特定のストリンジェンシーを確立できるのは当該分野でよく知られている。ハイブリダイゼーション条件の特定の組の選択は、当該分野における標準的な方法に従って選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．参照）。

「組換え」とは、２つのポリヌクレオチドの間の遺伝子情報の交換のプロセスをいう。本開示の目的では、「相同組換え（ＨＲ）」とは、例えば、細胞中の２本鎖破壊の修復の間に起こるそのような変化の特殊化された形態をいう。このプロセスはヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖破壊を経験したもの）の鋳型修復に対して「ドナー」分子を用い、「非−クロスオーバー遺伝子変換」または「短トラクト遺伝子変換」として種々に知られている。なぜならば、それはドナーからの遺伝的情報の標的への移動に導くからである。いずれかの特定の理論によって拘束されるつもりはないが、その様な移動は破壊された標的およびドナーの間に形成されるヘテロデュプレックスＤＮＡのミスマッチ修正、ドナーを用いて標的の一部となるであろう遺伝的情報を再度合成する「合成−依存性ストランドアニーリング」および／または関連プロセスに関与することができる。そのような特殊化されたＨＲは、しばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような、標的分子の配列の改変をもたらす。

「切断」とは、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊をいう。切断は、限定されるものではないが、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解を含めた種々の方法によって開始することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の双方が可能であり、および二本鎖切断は、２つの区別される一本鎖事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端いずれかの生成をもたらし得る。ある実施形態においては、融合ポリペプチドが、標的化二本鎖ＤＮＡ切断で用いられる。

「切断ハーフ−ドメイン」は、（同一または異なるいずれかの）第２のポリペプチドと一緒に、切断活性（好ましくは二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第一または第二の切断ハーフ−ドメイン」；「＋および−切断ハーフ−ドメイン」および「右側および左側切断ハーフ−ドメイン」は、二量体化する切断ハーフ−ドメインの対をいうのに相互交換可能に用いられる。

「遺伝子組換え切断ハーフ−ドメイン」は、もう１つの切断ハーフ−ドメイン（例えば、もう１つの遺伝子組換え切断ハーフ−ドメイン）とで絶対的ヘテロダイマーを形成するように修飾されている切断ハーフ−ドメインである。また、その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願第１０／９１２，９３２号および第１１／３０４，９８１号および（２００６年５月２５日に出願された）米国仮出願第６０／８０８，４８６号も参照。

「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核蛋白質構造である。細胞クロマチンは核酸、主としてＤＮＡ、およびヒストンおよび非−ヒストン染色体蛋白質を含めた蛋白質を含む。真核生物細胞クロマチンの大部分はヌクレオソームの形態で存在し、ここに、ヌクレオソームコアはヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４の２つの各々を含むオクタマーと会合したＤＮＡのほぼ１５０塩基対を含み；および（生物に依存して可変長さの）リンカーＤＮＡはヌクレオソームコアの間に延びる。ヒストンＨ１の分子は、一般に、リンカーＤＮＡと会合している。本開示の目的では、用語「クロマチン」は、原核生物および真核生物の双方の、細胞核蛋白質の全てのタイプを含めことを意図する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの双方を含む。

「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、しばしば、細胞のゲノムを含む染色体の全てのコレクションであるその核型によって特徴付けられる。細胞のゲノムは１以上の染色体を含むことができる。

「エピソーム」は、複製する核酸、核蛋白質複合体、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例はプラスミドおよびある種のウイルスゲノムを含む。

「接近可能な領域」は、標的部位を認識する外因性分子によって、核酸に存在する標的部位が結合され得る細胞クロマチン中の部位である。いずれかの特定の理論によって拘束されるつもりはないが、接近可能な領域は、ヌクレオソーム構造にパッケージされないものであると考えられる。接近可能な領域の区別される構造は、しばしば、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって検出することができる。

「標的部位」または「標的配列」は、結合分子が結合する核酸の一部を規定する核酸配列であり、但し、結合のための十分な条件が存在するものとする。例えば、配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、Ｅｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼについての標的部位である。

「外因性」分子は、細胞に通常は存在しないが、１以上の遺伝子的、生化学的または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞における通常の存在」は、細胞の特定の発生段階および環境的条件に関して決定される。かくして、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、生体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、非−熱−ショック細胞に関して外因性分子である。外因性分子が、例えば、機能不全内因性分子の機能的バージョン、または通常に機能する内因性分子の機能不全バージョンを含むことができる。

外因性分子は、とりわけ、コンビナトーリアル化学プロセスによって生じるような小分子、または蛋白質、核酸、炭水化物、脂質、糖蛋白質、リポ蛋白質、多糖、前記分子のいずれか修飾された誘導体または前記分子の１以上を含むいずれかの複合体のようなマクロ分子であり得る。核酸はＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本鎖または二本鎖であり得；線状、分岐状または環状であり得；およびいずれの長さのものでもあり得る。核酸は、デュプレックスを形成することができるもの、ならびにトリプレックス−形成性核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および第５,４２２,２５１号参照。蛋白質は、限定されるものではないが、ＤＮＡ−結合蛋白質、転写因子、クロマチン再形成因子、メチル化ＤＮＡ結合蛋白質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、フォスファターゼ、インテグラーゼ、レコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイラーゼおよびヘリカーゼを含む。

「外因性」分子は、内因性分子と同一タイプの分子、例えば、外因性蛋白質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は感染性ウイルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドまたはエピソーム、または細胞において通常は存在しない染色体を含むことができる。外因性分子を細胞に導入する方法は当業者に知られており、限定されるものではないが、脂質−媒介導入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含めたリポソーム）、エレクトロポレーション、直接的注入、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共−沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介導入およびウイルスベクター−媒介導入を含む。外因性分子は、内因性分子と同一タイプの分子でもあり得るが、細胞が由来するのとは異なる種に由来することもできる。例えば、配列決定されたヒト核酸は、マウスまたはハムスターに元来は由来する細胞株に導入することができる。

対照的に、「内因性」分子は、特定の環境的条件下で特定の発生段階において特定の細胞に通常は存在するものである。例えば、内因性核酸は染色体、ミトコンドリア、葉緑体または他のオルガネラのゲノム、あるいは天然のエピソーム核酸を含むことができる。さらなる内因性分子は蛋白質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。

「融合」分子は、２以上のサブユニット分子が好ましくは共有結合により連結された分子である。サブユニット分子は同一の化学的タイプの分子であり得るか、あるいは異なる化学的タイプの分子であり得る。第１のタイプの融合分子の例は、限定されるものではないが、融合蛋白質（例えば、ＺＦＥ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインの間の融合）、および融合核酸（例えば、前記文献に記載された融合蛋白質をコードする核酸）を含む。第２のタイプの融合分子の例は、限定されるものではないが、トリプレックス−形成性核酸およびポリペプチドの間の融合、および従たる溝バインダーおよび核酸の間の融合を含む。

細胞中での融合蛋白質の発現は、融合蛋白質の細胞への送達から、あるいは融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって由来することができ、ここに、ポリヌクレオチドは転写され、および転写体は翻訳され、融合蛋白質を生じる。トランス−スプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチド連結もまた細胞での蛋白質の発現に関与することができる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示において他の個所に提示する。

「遺伝子」は、本開示での目的では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（後記参照）、ならびに調節配列がコーディングおよび／または転写された配列に隣接するか否かに拘わらず、遺伝子産物の生産を調節するＤＮＡ領域を含む。従って、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位のような転写調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位および遺伝子座制御領域を含む。

「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれた情報の遺伝子産物への変換をいう。遺伝子産物は遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡまたはいずれかの他のタイプのＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって生じた蛋白質であり得る。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集のようなプロセスによって修飾されたＲＮＡ、および例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ-リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾された蛋白質を含む。

遺伝子発現の「変調」とは、遺伝子の活性の変化をいう。発現の変調は、限定されるものではないが、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を含むことができる。遺伝子不活化とは、本明細書中に記載されたようにＺＦＰを含まない細胞と比較した、遺伝子発現のいずれの低下もいう。かくして、遺伝子不活化は部分的または全面的なものであってよい。

「真核生物」細胞は、限定されるものではないが、（酵母のような）真菌細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ−細胞）を含む。

「細胞株」とは、初代培養からの組織培養で樹立された細胞の集団をいう。かくして、ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて生じさせた細胞株は、１以上の標的遺伝子（例えば、ＢＡＫおよび／またはＢＡＸが１以上のジンクフィンガーヌクレアーゼによって部分的にまたは全面的に不活化されており、かつ細胞（または細胞株）の子孫が培養における多数の継体後に部分的または全面的な不活化表現型を保有する細胞（または細胞株）から生起する。さらに、細胞または細胞株は、遺伝子（類）の発現が低下し、または排除された場合に（ノックアウト）、１以上の示された発現は「欠乏」している。かくして、Ｂａｘ／Ｂａｋ−欠損細胞株は、ＢａｘおよびＢａｋの低下した、またはノックアウトされた発現を示す。

「注目する領域」は、例えば、外因性分子にそれが結合することが望ましい、遺伝子、または遺伝子内の、または遺伝子に隣接する非−コーディング配列のような細胞クロマチンのいずれかの領域である。結合は、標的化ＤＮＡ切断および／または標的化組換えの目的であり得る。注目する領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）、または感染性ウイルスゲノムに存在し得る。注目する領域は、遺伝子のコーディング領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列またはイントロンのような転写された非−コーディング領域内、あるいはコーディング領域の上流または下流いずれかの、非−転写領域内にあり得る。注目する領域は、長さが単一ヌクレオチド対と同程度に小さいか、または２，０００ヌクレオチド対まで、あるいはヌクレオチド対のいずれかの整数値であり得る。

用語「操作可能な連結」および「操作可能に連結した」（または「操作可能なように連結した」）は、成分が、双方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つに働く機能を媒介できる可能性を可能とするように配置される、２以上の（配列エレメントのような）成分の並置を参照して相互交換可能に用いられる。説明として、プロモーターのような転写調節配列は、もし転写調節配列が、１以上の転写調節因子の存在または不存在に応答してコーディング配列の転写のレベルを制御するならばコーディング配列に操作可能に連結している。転写調節配列は、一般に、コーディング配列に対してシスにて操作可能に連結されているが、それに直接的に隣接する必要なない。例えば、エンハンサーは、たとえそれが連続していなくても、コーディング配列に操作可能に連結された転写調節配列である。

融合ポリペプチドに関しては、用語「操作可能に連結した」とは、成分の各々が、あたかもそれがその様に連結していないかのごとく他の成分への連結において同一機能を行うという事実をいうことができる。例えば、ＺＦＰ ＤＮＡ−結合ドメインが切断ドメインに融合した融合ポリペプチドに関しては、ＺＦＰ ＤＮＡ−結合ドメインおよび切断ドメインは、もし融合ポリペプチドにおいて、ＺＥＰ ＤＮＡ−結合ドメイン部分がその標的部位および／またはその結合部位に結合でき、他方、切断ドメインが標的部位に隣接したＤＮＡを切断できるならば、操作可能に連結している。

蛋白質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長蛋白質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長蛋白質、ポリペプチドまたは核酸と同一の機能を保有する蛋白質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応する天然分子よりも多くの、より少ない、または同一数の残基を保有でき、および／または１以上のアミノ酸またはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コーディング機能、もう１つの核酸にハイブリダイズできる能力）を決定する方法は当該分野でよく知られている。同様に、蛋白質機能を決定する方法は良く知られている。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター−結合、電気泳動移動度−シフト、または免疫沈澱アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断はゲル電気泳動によってアッセイできる。Ａｕｓｕｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，前掲参照。もう１つの蛋白質と相互作用する蛋白質の能力は、例えば、遺伝子的または生化学的双方の、共−免疫沈澱、２−ハイブリアッセイまたは相補性によって決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号およびＰＣＴ 国際公開第９８／４４３５０号パンフレット参照。

本明細書中で用いる用語「抗体」はポリクローナルおよびモノクローナル調製物双方から得られた抗体、ならびに以下の：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ （１９９１）３４９：２９３−２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号）参照；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片；Ｆｖ分子（非−共有結合ヘテロダイマー、例えば、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７２）６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８０）１９：４０９１−４０９６参照）；単一−鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８８）８５：５８７９−５８８３参照）；ダイマーおよびトリマー抗体断片構築体；ミニボディー（例えば、Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９２）３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１４９Ｂ：１２０−１２６参照）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ （１９８８）３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：１５３４−１５３６；および１９９４年９月２１日に公開された英国特許公開番号ＧＢ ２，２７６，１６９参照）；およびそのような断片が親抗体分子の免疫学的結合特性を保有するそのような分子から得られたいずれかの機能的断片を含む。

本明細書中で用いるように、用語「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。その用語は抗体の種または源に関して制限されず、またそれが作成された方法によって制限される意図はない。その用語は全免疫グロブリン、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および他の断片のような断片、ならびに親モノクローナル抗体分子の免疫学的結合特性を呈するキメラおよびヒト化均一抗体集団を含む。

ワクチンとは、将来の害に対する保護が提供されるように、生きた生物の免疫系を刺激するのに用いられる剤を意味する。免疫化とは、生物が従前に暴露された病原体または抗原に対して向けられる、Ｔ−リンパ球が病原体を殺し、および／または他の細胞（例えば、食細胞）を活性化して、生物においてそれを行うことができる、抗体および／または細胞免疫応答を誘導するプロセスをいう。本明細書中で用いられる用語「免疫応答」は、例えば、多細胞生物が、生物の細胞、または生物の細胞外流体に侵入する抗原性物質に対して抗体を生じさせるメカニズムを含む。そのように生産された抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭのような免疫学的クラスのいずれかに属してよい。他のタイプの応答、例えば、細胞性および液性免疫もまた含まれる。抗原に対する免疫応答はよく研究され、広く報告されている。免疫学の概観は、例えば、Ｒｏｉｔｔ Ｉ．，（１９９４）に与えられている。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｎｄｏｎ。免疫学における方法はルーチン的であって、慣用的である（例えば、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．によって編集されたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．参照）。

「組換えウイルスベクター」とは、１以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源のものではないポリヌクレオチド配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターをいう。組換えパルボウイルスベクターの場合には、組換えポリヌクレオチドは少なくとも１つの、好ましくは２つの逆方向ターミナルリピート配列（ＩＴＲ）が近接している。

「組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶベクター）」とは、少なくとも１つの、好ましくは２つのＡＡＶ逆方向ターミナルリピート配列（ＩＴＲ）が近接する１以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源のものではないポリヌクレオチド配列）を含むポリヌクレオチドベクターをいう。そのようなｒＡＡＶベクターは、適切なヘルパーウイルスで感染されている（または適切なヘルパー機能を発現している）、かつＡＡＶ ｒｅｐを発現しておりかつ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐ蛋白質）をキャップしている宿主細胞に存在する場合、複製し、感染性ウイルス粒子にパッケージされ得る。ｒＡＡＶベクターがより大きなポリヌクレオチドに（例えば、染色体に、あるいはクローニングまたはトランスフェクションで用いるプラスミドのようなもう１つのベクターに）組み込まれる場合、ｒＡＡＶベクターは「プロ−ベクター」といってもよく、これは、ＡＡＶパッケージング機能および適切なヘルパー機能の存在下で複製およびキャプシド化によって「救済」することができる。ｒＡＡＶは、リップで複合体化され、リポソーム内にカプセル化され、最も好ましくは、ウイルス粒子、特にＡＡＶにキャプシド化された、限定されるものではないが、プラスミド、線状人工染色体を含めた多数の形態のいずれかとすることができる。ｒＡＡＶベクターをＡＡＶウイルス粒子にパッケージして、「組換えアデノ−関連ウイルス」（ｒＡＡＶ）を生成させることができる。パッケージして、感染性ウイルス粒子を生じさせることができる最大サイズのベクターはほぼ５．２ｋｂである。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ＢＡＫおよび／またはＢＡＸ遺伝子の不活化で用いることができるジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が本明細書中で記載される。ＺＦＮはジンクフィンガー蛋白質（ＺＦＰ）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含む。

Ａ．ジンクフィンガー蛋白質
ジンクフィンガー結合ドメインは、選択された配列に結合するように作成することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． １０：４１１−４１６参照。遺伝子組換えジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガー蛋白質と比較して新規な結合特異性を有することができる。遺伝子組換えによる方法は、限定されるものではないが、合理的設計および種々のタイプの選択を含む。合理的設計は、例えば、トリプレット（またはクワドルプレット）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、ここに、各トリプレットおよびクワドルプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレットまたはクワドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの１以上のアミノ酸配列に関連する。例えば、その全体が参照により組み込まれる、共有された米国特許第６，４５３，２４２号および第６，５３４，２６１号参照。

ファージディスプレイおよび２−ハイブリッド系を含めた例示的な選択方法は米国特許第５，７８９，５３８号；第５，９２５，５２３号；第６，００７，９８８号；第６，０１３，４５３号；第６，４１０，２４８号；第６，１４０，４６６号；第６，２００，７５９号；および第６，２４２，５６８号；ならびに国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレットおよび英国特許第２，３３８，２３７号明細書に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共有された国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。

標的部位の選択；融合蛋白質（およびそれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のためのＺＦＰおよび方法は当該分野で知られており、その全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号に詳細に記載されている。

加えて、これらおよび他の文献に開示されているように、ジンクフィンガードメインおよび／またはマルチフィンガードジンクフィンガー蛋白質は、例えば、長さが５以上のアミノ酸のリンカー（例えば、ＴＧＥＫＰ（配列番号：１８）、ＴＧＧＱＲＰ（配列番号：３７）、ＴＧＱＫＰ（配列番号：１９）、および／またはＴＧＳＱＫＰ（配列番号：２０））を含めたいずれかの適切なリンカー配列を用いて一緒に連結してもよい。また、長さが６以上のアミノ酸の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；第６，９０３，１８５号；および第７，１５３，９４９号も参照。本明細書中で記載された蛋白質は、蛋白質の個々のジンクフィンガーの間に適切なリンカーのいずれかの組合せを含んでもよい。

表１および２は、ＢＡＸ遺伝子（表１）およびＢＡＫ遺伝子（表２）におけるヌクレオチド配列に結合するように作成されたジンクフィンガー結合ドメインを記載する。各列は別々のジンクフィンガーＤＮＡ―結合ドメインを記載する。各ドメインについてのＤＮＡ標的配列は最初の欄に示され、第２ないし第５欄は、蛋白質中のジンクフィンガー（Ｆ１ないしＦ４またはＦ５）の各々の認識領域のアミノ酸配列を示す（ヘリックスの開始に関して、アミノ酸−１ないし＋６）。また、蛋白質についての識別番号が最初の欄にやはり掲げられる。

以下に記載するように、ある実施形態においては、表１および２に示された４−または５−フィンガー結合ドメインが、例えば、ＦｏｋＩのようなタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインのような切断ハーフ−ドメインに融合される。そのようなジンクフィンガー／ヌクレアーゼハーフ−ドメイン融合の１以上の対は、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号に開示されているように、標的化切断に用いられる。

標的化された切断では、接合部位の近くのエッジは５以上のヌクレオチド対によって分離でき、融合蛋白質の各々はＤＮＡ標的の逆ストランドに結合させることができる。典型的には、表１および２に示されたＺＦＮは、それらの標的遺伝子の切断のために対で用いられる。本開示に従い、ＺＦＮはＢＡＸまたはＢＡＫ遺伝子中のいずれかの配列に標的化することができる。

Ｂ．切断ドメイン
ＺＦＮはヌクレアーゼ（切断ドメイン、切断ハーフ−ドメイン）も含む。本明細書中に開示された切断ドメイン部分は、いずれかのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼは、限定されるものではないが、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼを含む。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ, Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｒｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２５:３３７９-３３８８参照。ＤＮＡを切断するさらなる酵素は知られている（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮａｓｅ Ｉ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；また、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（編）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９３も参照）。これらの酵素（またはその機能的断片）の１以上を、切断ドメインおよび切断ハーフ−ドメインの源として用いることができる。

同様に、切断ハーフ−ドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、前記したいずれかのヌクレアーゼまたはその部分に由来することができる。一般に、もし融合蛋白質が切断ハーフ−ドメインを含むならば、２つの融合蛋白質が切断で必要とされる。別法として、２つの切断ハーフ−ドメインを含む単一蛋白質を用いることができる。２つの切断ハーフ−ドメインは同一のエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することができるか、あるいは各切断ハーフ−ドメインは異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することができる。加えて、２つの融合蛋白質のための標的部位が、それらの各標的部位への２つの融合蛋白質の結合が、例えば、二量体化によって切断ハーフ−ドメインが機能的切断ドメインを可能とする、相互に対する空間的向きに切断ハーフ−ドメインを置くように、相互に関して、好ましくは配置される。かくして、ある実施形態においては、標的部位の近くのエッジは５ないし８ヌクレオチドだけ、または１５ないし１８ヌクレオチドだけ分離される。しかしながら、いずれかの全体数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対を２つの標的部位の間に（例えば、２ないし５０ヌクレオチド対以上）介在させることができる。一般に、切断の部位は、標的部位の間に存在する。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、（認識部位において）ＤＮＡに配列−特異的に結合することができ、および結合の部位において、または部位近くでＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、タイプＩＩＳ）は認識部位から除去された部位においてＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、タイプＩＩＳ酵素ＦｏｋIは、１つのストランド上のその認識部位から９ヌクレオチド、および他のストランド上のその認識部位から１３ヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；第５，４３６，１５０号および第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．(１９９２)Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２参照。かくして、１つの実施形態において、融合蛋白質は少なくとも１つのタイプＩＩＳ制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフ−ドメイン）、および操作されていてもいなくてもよい１以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。

その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な例示的なタイプＩＩＳ制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素はダイマーとして活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０−１０，５７５。従って、本開示の目的では、開示された融合蛋白質で用いるＦｏｋＩ酵素の部分は切断ハーフ−ドメインと考えられる。かくして、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合を用いる標的化二本鎖切断および／または細胞配列の標的化置き換えのために、各々がＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインを含む２つの融合蛋白質を用いて、触媒的に活性な切断ドメインを再構成することができる。別法として、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインを含む単一ポリペプチド分子を用いることもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合を用いる標的化切断および標的化配列改変についてのパラメータが、本開示において他の個所に提供される。

切断ドメインまたは切断ハーフ−ドメインは、切断活性を保有し、または多量体化（例えば、二量体化）して、機能的切断ドメインを形成する能力を保有する蛋白質のいずれかの部分であり得る。

例示的なタイプＩＩＳ制限酵素は、その全体が参照により組み込まれる国際公開第０７／０１４２７５号パンフレットに記載される。さらなる制限酵素もまた分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらは本開示で塾考されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０参照。

ある実施形態において、切断ドメインは、例えば、その全ての開示が、ここにその全体が参照により組み込まれる、米国特許公開第２００５００６４４７４号および第２００６０１８８９８７号、および（２００７年５月２３日に出願された）米国出願第１１／８０５，８５０号に記載されたように、ホモ二量体化を最小化し、または妨げる（二量体化ドメイン突然変異体ともいわれる）１以上の遺伝子組換え切断ハーフ−ドメインを含む。ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７、および５３８におけるアミノ酸残基は、全て、ＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインの二量体化に影響させるための標的である。

絶対ヘテロダイマーを形成するＦｏｋIの例示的な遺伝子組換え切断ハーフ−ドメインは、第１の切断ハーフ−ドメインがＦｏｋIの位置４９０および５３８のアミノ酸残基において突然変異を含み、かつ第２の切断ハーフ−ドメインがアミノ酸残基４８６および４９９において突然変異を含む対を含む。

かくして、１つの実施形態において、４９０における突然変異はＧｌｕ（Ｅ）をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；５３８における突然変異はＩｓｏ(Ｉ)をＬｙｓ（Ｋ）で置き換え；４８６における突然変異はＧｌｎ(Ｑ)をＧｌｕ（Ｅ）で置き換え；および位置４９９における突然変異はＩｓｏ(Ｉ)をＬｙｓ（Ｋ）で置き換える。具体的には、本明細書中に記載された遺伝子組換え切断ハーフドメインは、１つの切断ハーフ−ドメインにおいて位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）を突然変異させて、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名された遺伝子組換え切断ハーフ−ドメインを生じさせることにより、およびもう１つの切断ハーフ−ドメインにおける位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）を突然変異させて、「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名される遺伝子組換え切断ハーフ−ドメインを生じさせることによって調製した。本明細書中に記載された遺伝子組換え切断ハーフ−ドメインは、異常な切断が最小化されるか、または排除された絶対ヘテロダイマー突然変異体である。例えば、その開示が、全ての目的で、その全体が参照により組み込まれる（２００６年５月２５日に出願された）米国特許仮出願第６０／８０８，４８６号の実施例１参照。

本明細書中に開示される遺伝子組換え切断ハーフ−ドメインは、例えば、米国特許公開第２００５００６４４７４号（例えば、実施例５参照）；および国際公開第０７／１３９８９８に号パンフレット記載された野生型切断ハーフ−ドメイン（ＦｏｋI）の部位−特異的突然変異誘発によっていずれかの適切な方法を用いて調製することができる。

別法として、ヌクレアーゼは、いわゆる「分解酵素」技術（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号参照）を用いて核酸標的部位においてイン・ビボにて組み立ててよい。そのような分解酵素の成分は別々の発現構築体で発現してもよく、あるいは、例えば、２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列を自己−切断することによって、個々の成分が分離された１つのオープンリーディングフレームに連結することができる。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであってよい。

Ｃ．標的化切断のためのさらなる方法
ＢＡＸまたはＢＡＫ遺伝子中に標的部位を有するいずれのヌクレアーゼも、本明細書中に開示された方法で用いることができる。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼは、一旦ヒト−サイズのゲノムに入れば、統計学的ベースに基づいて、そのいくつかは存在するようである、非常に長い認識配列を有する。ＢＡＸおよび／またはＢＡＫ遺伝子中にユニークな標的部位を有するいずれのそのようなヌクレアーゼも、これらの遺伝子における標的化切断のために、ジンクフィンガーヌクレアーゼの代わりに、またはそれに加えて用いることができる。

例示的なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。それらの認識配列は知られている。また、米国特許第５，４２０，０３２号；米国特許第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．(１９９７)Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照。

ほとんどのホーミングエンドヌクレアーゼの切断特異性はそれらの認識部位に関しては絶対的でないが、その部位は、哺乳動物−サイズのゲノム当たりの単一切断反応が、その認識部位の単一コピーを含有する細胞においてホーミングエンドヌクレアーゼを発現させることによって得ることができる十分な長さのものである。また、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼの特異性は、非−天然標的部位に結合するように作成することができると報告されている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２−２９６２;Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９−６６参照。

送達
本明細書中に記載されたＺＦＮはいずれかの適切な手段によって標的細胞に送達することができる。適切な細胞は、限定されるものではないが、真核生物細胞および原核生物細胞および／または細胞株を含む。そのような細胞、またはそのような細胞から生成された細胞株の非限定的例はＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ-S、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３-F、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ）のような昆虫細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、ＰｉｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞を含む。ある実施形態において、細胞株はＣＨＯ-Ｋ１、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。

ジンクフィンガーを含む蛋白質を送達する方法は、例えば、その全ての開示が、その全体が参照により組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号；第６，５０３，７１７号；第６，５３４，２６１号；第６，５９９，６９２号；第６，６０７，８８２号；第６，６８９，５５８号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号に記載されている。

本明細書中に記載されたＺＦＮは、ＺＦＮの１以上をコードする配列を含有するベクターを用いて送達してもよい。限定されるものではないが、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ−関連ウイルスベクター等を含めたいずれのベクター系を用いてもよい。また、その全体が参照により組み込まれる米国特許第６，５３４，２６１号；第６，６０７，８８２号；第６，８２４，９７８号；第６，９３３，１１３号；第６，９７９，５３９号；第７，０１３，２１９号；および第７，１６３，８２４号も参照。さらに、これらのベクターのいずれも、１以上のＺＦＮをコードする配列を含んでもよいのは明らかであろう。かくして、ＺＦＮの１以上の対が細胞に導入される場合、ＺＦＮは同一ベクターまたは異なるベクターで行ってよい。多数のベクターを用いる場合、各ベクターは１または多数のＺＦＮをコードする配列を含んでもよい。

慣用的なウイルスおよび非−ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いて、遺伝子組換えＺＦＰをコードする核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織に導入することができる。そのような方法を用いて、ＺＦＰをコードする核酸をイン・ビトロにて細胞に投与することもできる。ある実施形態において、ＺＦＰをコードする核酸はイン・ビボまたはエクス・ビボ遺伝子療法使用のために投与される。非−ウイルスベクター送達系は、リポソームまたはポロキサマーのような送達媒体と複合化させた、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、および核酸を含む。ウイルスベクター送達系はＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む、それは、細胞への送達後にエピソームまたは組み込まれたゲノムいずれかを有する。遺伝子治療手順のレビューについては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂａｅｈｍ（編）（１９９５）；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）参照。

遺伝子組換えＺＦＰをコードする核酸の非―ウイルス送達の方法はエレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質を含む。核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの作用物質増強型取り込みである。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いるソノポレーションを、核酸の送達で用いることもできる。

さらなる例示的な核酸送達系は、Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６００８３３６号参照）によって提供されるものを含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号および米国特許第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は商業的に販売されている。（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの有効な受容体−認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質は、Ｆｅｎｇｌｎｅｒ 国際公開第９１／１７４２４号パンフレット、 国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものを含む。送達は細胞（エクス・ビボ投与）または標的組織（イン・ビボ投与）に対するものとすることができる。

免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含めた脂質：核酸複合体の調製は当業者に良く知られている（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、および第４，９４６，７８７号参照）。

遺伝子組換えＺＦＰをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースの系の使用は、身体中でウイルスを特異的細胞に標的化し、次いで、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に発達したプロセスを利用する。ウイルスベクターは患者に直接的に投与することができ（イン・ビボ）、あるいはそれを用いて、イン・ビトロにて細胞を処理することができ、修飾された細胞が患者に投与される（エクス・ビボ）。ＺＦＰの送達のための慣用的なウイルスベースの系は、限定されるものではないが、遺伝子導入用の、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連、ワクシニアおよび単純疱疹ウイルスベクターを含む。宿主ゲノムへの組込みはレトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ−関連ウイルス遺伝子導入方法で可能である、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。加えて、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織で観察されている。

レトロウイルスの向性は、外来性エンベロープ蛋白質を組み込むことによって改変することができ、標的細胞の潜在的標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、非−分裂細胞を形質導入し、または感染させ、典型的には、高いウイルス力価を生じさせることができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子導入系の選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６ないし１０ｋｂの外来性配列に対するパッケージング能力を持つシス−作用性ロングターミナルリピートよりなる。最小シス−作用性ＬＴＲはベクターの複製およびパッケージングで十分であり、これは、次いで、治療遺伝子を標的細胞に取り込んで、永久的導入遺伝子発現を提供するのに用いられる。広く用いられるレトロウイルスベクターは、ネズミ白血球ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびその組合せに基づくものを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００参照）。

ＺＦＰ融合蛋白質の一過性発現が好ましい適用において、アデノウイルスベースの系を用いることができる。アデノウイルスベースのベクターは多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターでは、発現の高い力価および高いレベルが得られてきた。このベクターは、比較的単純な系において大量に生産することができる。また、アデノ−関連ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを用いて、例えば、核酸およびペプチドのイン・ビトロ生産においておよびイン・ビボおよびエクス・ビボ遺伝子治療手順のために、標的核酸で細胞を形質導入する（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）を含めた多数の刊行物に記載されている。

少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが臨床試験における遺伝子導入で現在利用でき、これは、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠陥ベクターの相補性に関連するアプローチを利用して、形質導入剤を生じさせる。

ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験で用いられてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８５：３０４８−３０５（１９９５）；Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７−１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：２２ １２１３３−１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験で用いられた最初の治療ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４７５−４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓをパッケージしたベクターで観察されてきた（Ｅｌｌｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０−２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１：１１１−２（１９９７））。

組換えアデノ−関連ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠陥がある非病原性のパラボウイルスアデノウイルス関連ウイルス2型に基づいた有望な代替遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに近接するＡＡＶ １４５ｂｐ逆方向ターミナルリピートのみを保有するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノムへの組込みによる有効な遺伝子導入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系のための鍵となる特徴である（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２−３（１９９８），Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８−５５（１９９６））。

複製欠損性組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は高い力価で生産することができ、多数の異なる細胞型を容易に感染させることができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように作成され；引き続いて、複製欠陥ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスにて供給するヒト２９３細胞中で増殖させる。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉で見出されるもののような分裂をしていない分化した細胞を含めた多数のタイプの組織をイン・ビボにて形質導入することができる。慣用的なＡｄベクターは輸送能が大きい。臨床試験でのＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を含むものであった（Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。臨床試験における遺伝子導入用のアデノウイルスベクターの使用のさらなる例は、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２４：１ ５−１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７ １０８３−１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２０５−１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９７−６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．５：５０７−５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：１０８３−１０８９（１９９８）を含む。

細胞のパッケージングを用いて宿主細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成する。そのような細胞はアデノウイルスをパッケージする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージするΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子治療で用いるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージするプロデューサー細胞株によって生成される。そのベクターは典型的にはパッケージングおよび（もし適用可能であれば）、宿主への引き続いての取込みに必要なウイルスの最小配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるべき蛋白質をコードする発現カセットによって置き換えられている。ウイルス機能の喪失は、パッケージング細胞株によってトランスにて供給される。例えば、遺伝子治療で用いるＡＡＶベクターは典型的には、パッケージング、および宿主ゲノムへの組込みに必要なＡＡＶゲノムからの逆方向ターミナルリピート（ＩＴＲ）配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含有するが、ＩＴＲ配列を欠如する細胞株にパッケージされる。その細胞株はヘルパーとしてのアデノウイルスでも感染される。ヘルパーウイルスはＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如のためかなりの量でパッケージングされない。アデノウイルスでの汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高いアデノウイルスに対して熱処理することによって低下させることができる。

多くの遺伝子治療適用においては、遺伝子治療ベクターは、特定の組織タイプに対する高度な特異性を保ちながら送達されるのが望ましい。従って、ウイルスベクターは、ウイルスの外側表面のウイルス外皮蛋白質との融合蛋白質としてリガンドを発現されることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、注目する細胞型に存在することが知られた受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９７４７−９７５１（１９９５）は、モロニーネズミ白血病ウイルスがｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、組換えウイルスは、ヒト表皮成長因子受容体を発現するある種のヒト乳癌細胞を感染させることを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞−表面受容体に対するリガンドを含む融合蛋白質を発現する他のウイルス−標的細胞対まで拡大することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的にいずれの選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性も有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を呈するように作成することができる。先の記載は主としてウイルスベクターに適用されるが、同一の原理は非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的標的細胞による取込みに好都合な特異的取込み配列を含有するように作成することができる。

遺伝子治療ベクターは、典型的には、後に記載するような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所的適用によって、個々の患者に投与することによって、イン・ビボにて送達することができる。別法として、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸入物、組織バイオプシー）、または万能供血者の造血系幹細胞のような細胞にエクス・ビボにて投与し、通常は、ベクターが組み込まれた細胞についての選択の後に、細胞を患者に再度移植することができる。

診断、研究のためのエクス・ビボ細胞トランスフェクション、または（例えば、宿主生物への、トランスフェクトされた細胞の再−注入を介する）遺伝子治療のためのエクス・ビボ細胞トランスフェクションは当業者によく知られている。好ましい実施形態においては、細胞は対象生物から単離され、ＺＦＰ核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトされ、対象生物（例えば、患者）に再度注入して戻される。エクス・ビボトランスフェクションに適した種々の細胞型は当業者によく知られている（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａ Ｍａｍｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版 １９９４）、および患者からの細胞単離培養方法の考察について、そこで引用された文献参照）。

１つの実施形態において、幹細胞は、細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためのエクス・ビボ手法で用いられる。幹細胞を用いる利点は、それをイン・ビトロで他の細胞型に分化することができるか、あるいは骨髄移植される（細胞のドナーのような）哺乳動物に導入できることである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのようなサイトカインを用いてＣＤ３４＋細胞を臨床的に重要な免疫細胞型にイン・ビトロにて分化させる方法は知られている（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６；１７６：１６９３−１７０２（１９９２）参照）。

幹細胞は公知の方法を用いて形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）のような、望まない細胞に結合する抗体で骨髄細胞をピックアップすることによって、幹細胞は骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３−１７０２（１９９２）参照）。

治療ＺＥＰ核酸を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、イン・ビボでの細胞の形質導入のために生物に直接的に投与することもできる。別法として、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、限定されるものではないが、注射、点滴、局所適用およびエレクトロポレーションを含めた、血液または組織細胞と最終的に接触させて分子を導入するために通常用いられる経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する適切な方法は利用可能であって、当業者によく知られており、１を超える経路を用いて、特定の組成物を投与することができるが、特定経路はしばしば、もう１つの経路よりもより直ちにかつより有効な反応を供することができる。

ＤＮＡを造血系幹細胞に導入する方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に開示されている。導入遺伝子の造血系幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞への導入で有用なベクターはアデノウイルスタイプ３５を含む。

導入遺伝子を免疫細胞（例えば、Ｔ−細胞）に導入するのに適切なベクターは非組込みレンチウイルスベクターを含む。例えば、Ｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２；８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２５：２１７−２２２参照。

医薬品上許容される担体は、投与されるべき特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するのに用いる特定の方法によって、部分的には決定される。従って、後に記載するように、利用可能な医薬品組成物の広く種々の適切な処方がある（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版，１９８９参照）。

先に述べたように、開示された方法および組成物は、限定されるものではないが、原核生物細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞を含めたいずれのタイプの細胞にも用いることができる。蛋白質発現のための適切な細胞株は当業者に知られており、限定されるものではないが、ＣＯＳ、ＣＨＯ(例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１)、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、Ｈａｋ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、ｐｅｒＣ６、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）のような昆虫細胞、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，ＰｉｓｃｈｉａおよびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓのような真菌細胞を含む。これらの細胞株の子孫の変異および誘導体を用いることもできる。

キット
また、本明細書中に記載された組成物のいずれかを含む、または本明細書中に記載された方法のいずれかを実施するためのキットが提供される。キットは、典型的には、ＢａｋまたはＢａｘにおける標的部位に結合する１以上のジンクフィンガー蛋白質（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）を含有する。かくして、ＢＡＫおよび／またはＢＡＸノックアウト細胞株を生成するためのキットが提供される。キットは細胞、細胞の形質転換用の緩衝液、細胞用の培地および／またはアッセイを行うための緩衝液を含有することもできる。典型的にはキットは、キットに貼付されたまたはそうでなければ、キットの他の成分に添付された指示書、パッケージングまたは宣伝リーフレットのようないずれかの資材を含むラベルも含有する。

適用
開示された方法および組成物は、ＢＡＸおよび／またはＢＡＫゲノム配列の不活化のために用いることができる。先に記載したように、不活化は、細胞におけるＢａｘおよび／またはＢａｋ遺伝子発現の部分的または全面的な抑制を含む。Ｂａｘ−および／またはＢａｋ−欠損細胞株（例えば、二重Ｂａｘ−Ｂａｋノックアウト細胞株）を本明細書中に記載したように生成させることもできる。Ｂａｋおよび／またはＢａｘの不活化は、例えば、単一切断反応による切断、続いての、非相同末端接合によって、２つの部位における切断、続いての、２つの切断部位の間の配列を欠失させるような接合によって、ミスセンスまたはナンセンスコドンのコーディング領域への標的化組換えによって、遺伝子または調節領域を破壊するような、遺伝子またはその調節領域への無関係配列（すなわち、「スタッファー配列」）の標的化組換えによって、遺伝子または調節領域を破壊するような注目配列をコードする外因性核酸配列の標的化組換えによって、あるいは、転写体のミススプライシングを引き起こす、スプライスアクセプター配列のイントロンへの標的化組換えによって達成することができる。

Ｂａｘおよび／またはＢａｋのＺＦＮ媒介不活化（ノックアウト）のための種々の適用がある。例えば、本明細書中に記載されたように生成されたＢａｘおよび／またはＢａｋが欠損した細胞株はアポトーシスに対して抵抗性であって、Ｂａｘおよび／またはＢａｋが欠乏していない細胞株よりも、培養において注目する外因性蛋白質を発現させた場合に、より長く増殖し、かつ健康なままでいる。従って、本明細書中に記載されたＢａｘ／Ｂａｋ欠損細胞株は、注目する１以上の蛋白質（例えば、抗体、抗原、治療用蛋白質）および／または組換えウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、アデノウイルスまたはアデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）の長期的な効率のよい生産に用いることができる。加えて、他のアポトーシス−関連遺伝子の破壊は、単独で、または組み合せて、アポトーシスを妨げるのに有効であることが判明するであろう。特に、アポトーシス−促進蛋白質（すなわち、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ等）のＢＨ３−ｏｎｌｙファミリーのメンバーは、遺伝子破壊および／またはノックアウトのための標的とすることができる。

加えて、本明細書中に記載されたＢａｘおよび／またはＢａｋ欠損細胞株は、ウイルス全体および／またはサブユニットのワクチンの生産で有用である。例えば、インフルエンザウイルスが感染した細胞株はアポトーシスの顕著な証拠を示すことが知られている。かくして、本発明のＢａｘおよび／またはＢａｋ欠損細胞株の使用は、インフルエンザワクチンのようなウイルスワクチンのより効率のよい長期的生産に利用することができる。インフルエンザ感染に対して感受性のない種からの細胞でのインフルエンザワクチンの生産は、例えば、ＭＤＣＫ細胞のようなイヌ細胞において特に望ましい。また、宿主細胞アポトーシスの結果、ワクチンが生産細胞の成分により汚染する可能性がもたらされることも知られている。そのような汚染の結果、ヒト向けの出荷および使用に必要な純度および品質を達成するための製品のロットが失敗し得る。Ｂａｘおよび／またはＢａｋ欠損細胞株を用いることによって得られたアポトーシスの予防を介して汚染を減少させると、収率および有効性双方の獲得に導き得る。

実施例１：ＢＡＸ−およびＢＡＫ−ＺＦＮの設計および構築
ジンクフィンガー蛋白質は、ＢＡＸおよびＢＡＫにおける標的部位を認識するように設計した。例示的な設計は表１および２に示される。

ＺＦＮの適切な対をコードする配列を含むプラスミドを、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５（７０４２）：６４６−６５１に実質的に記載されたように構築した。また、米国特許公開第２００８００１５１６４号および国際公開第２００７／１３９９８２号パンフレットも参照。

実施例２：遺伝子型分析
種々の細胞型におけるＢＡＫ−およびＢＡＸ−不活化クローンを生成させ、遺伝子レベルにて分析した。

Ａ．ＣＨＯ細胞
ＺＦＮ １１２０５および１０３５０をコードするプラスミドをＣＨＯ Ｋ１細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ Ｋ１細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％の適格なウシ胎仔血清（ＦＣＳ， Ｃｙｃｌｏｎｅ）を補足したＦ−１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で推奨されるように増殖させた。細胞は、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）プロテアーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてプラスチックウエアから解離させた。トランスフェクションでは、１００万のＣＨＯ Ｋ１細胞を、２μｇのジンク−フィンガーヌクレアーゼプラスミドおよび１００μＬのＡｍａｘａ溶液Ｔと混合した。プログラムＵ−２３を用いて、細胞をＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（商標）において細胞をトランスフェクトし、１．４ｍＬのＦ−１２加熱培地＋１０％ＦＣＳに回収した。

ゲノムＤＮＡを収穫し、オリゴＧＪＣ ３９Ｆ（５’−ｔｃａａｇａｇｇｔｔｔｃａｔｇｇｃｇａｇ−３’）（配列番号：２５）およびＧＪＣ ３８Ｒ（５’−ｔｔｃｔｃｔｃｔｃｔｔｇｔｇｃｔｔａｔｇｇ−３’）（配列番号：２６）を用いてＢＡＫ遺伝子座の一部をＰＣＲ増幅した。ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎからのＡｃｃｕｐｒｉｍｅ ＨｉＦｉポリメラーゼを用いるＰＣＲは以下の通りであった：９４℃における最初の３分の変性後に、ＰＣＲの３０サイクルを９４℃における３０秒の変性工程で行い、引き続いて、５８℃において３０秒のアニーリング工程を行い、引き続いて、６８℃において３０秒の延長工程を行った。３０サイクルの完了の後、反応液を６８℃にて７分間インキュベート、次いで、１０℃で無期限に保存した。

ＰＣＲ産物をゲル精製し、配列決定し、２つの対立遺伝子を回収した。２つの例示的クローンのＢＡＫ遺伝子型（欠失）の一部を図１に示す。双方のクローンにおいて、ＺＦＮは、野生型開始部位を含んだ欠失を導入した。対立遺伝子はＡおよびＢと命名される。

配列決定された双方のクローンについては、ＢＡＫの双方の対立遺伝子を修飾した。クローン８Ｈ−６はヘテロ接合性化合物であり（対立遺伝子Ｂよりも大きな欠失を有する対立遺伝子Ａ）、クローン８Ｄ−４はホモ接合性であった。図１参照。

Ｂ．ＭＤＣＫ細胞
（イヌＢＡＫ遺伝子中の標的部位を認識する）ＢＡＫについてはＺＦＮ １７６２２および１７６２３、および（イヌＢＡＸ遺伝子中の標的部位を認識する）ＢＡＸについてはＺＦＮ １７６５８および１７６５９を用いる以外は、ＣＨＯ細胞について前記したように、ＢＡＫ−およびＢＡＸ−標的化ＺＦＮをＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ Ｃａｎｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ）細胞においてもテストした。

例えば、米国特許公開第２００８００１５１６４号；第２００８０１３１９６２号および第２００８０１５９９９６号に記載されたように、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）によって、ＭＤＣＫ ＢＡＫ−およびＢＡＸ−ＺＦＮ処理細胞も調べた。ＺＦＮ−１７６２２／１７６２３およびＺＦＮ １７６２７／１７６２６で処理したＭＤＣＫ細胞は、各々、ＢＡＫ対立遺伝子において３．７％および１．１％破壊を示した（図２Ａ）。ＺＦＮ １７６５８および１７６５９で処理したＭＤＣK細胞はＢＡＸ対立遺伝子において８．０％破壊を示した（図２Ｂ）。

ゲノムＤＮＡに収穫し、オリゴＹＳ １３Ｆ（５’−ｃｔｃｃｔｔｔｃａｃａｇａｇａｔｇｃａｇ−３’）（配列番号：７０）およびＹＳ １４Ｒ（５’−ｃａｇｇａｇａｇａｃａｇａｇｔｇｇｔｃａ−３’）（配列番号：７１）を用いてＢＡＫ遺伝子座の一部をＰＣＲ増幅した。ゲノムＤＮＡを収穫し、オリゴＹＳ ２１Ｆ（５’−ａａａａａｇａｃｔｇｃａｇｔｇｇｃｇｃａ−３’）（配列番号：７２）およびＹＳ ２２Ｒ（５’−ｔｃａｃｃｃａｇａｇｇｔｃａａｔｇｇａｔ−３’）（配列番号：７３）を用いてＢＡＸ遺伝子座の一部をＰＣＲ増幅した。（野生型およびＢＡＫ−欠失クローン双方における）ＢＡＫおよびＢＡＸについてのＰＣＲ増幅産物をクローン化し、配列決定した。

図２Ｃに示すように、種々のＢＡＫ−特異的ＺＦＮ−処理クローンの分析は、ＺＦＮ−処理ＭＤＣＫクローンが一方または双方のＢＡＫ対立遺伝子において破壊されていることを示した。同様に、図２Ｄは、ＢＡＸ−特異的ＺＦＮで処理したＭＤＣＫ細胞のＰＣＲ分析を示し、ＢＡＫ単一ノックアウトが、一方の対立遺伝子での３０ｂｐの欠失、および他方の対立遺伝子での１ｂｐの挿入で得られたことを示す。ＢＡＸ／ＢＡＫ二重ノックアウトでは、ＢＡＫ対立遺伝子が、ＢＡＸ−特異的ＺＦＮを用いてＢａｋ−欠損クローンにおいて標的化された。図に示すように、いくつかのヘテロ接合性クローンが同定され、これは１つの野生型ＢＡＸ対立遺伝子、および１つの突然変異したＢＡＸ対立遺伝子を含有した。

実施例３：Ｂａｋ欠失クローンのＲＮＡ分析
実施例２に記載されたようなＢＡＫ−不活化ＣＨＯ細胞クローンからのＢＡＫの転写体も分析した。

製造業者の推奨に従い、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、野生型ＣＨＯ−ＫＩ細胞および双方のＢＡＫ欠失クローンからＲＮＡを精製した。２．５μｇの全ＲＮＡを逆転写反応で以下のように用いた：５００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）をＲＮＡ、および１μＬの１０ ｍＭ ｄＮＴＰミックスと混合した。水を２０μＬの最終容量になるように加えた。混合物を６５℃まで加熱し、氷上で冷却し、４μＬの５×第１ストランド緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．１Ｍ ＤＴＴを補充した。混合物を４２℃にて２分間インキュベートした。１μＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（登録商標）（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を反応液に加え、次いで、反応液を４２℃にて５０分間インキュベートした。次いで、逆転写反応を、７０℃での１５分間のインキュベーションによって停止した。ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎからのＡｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標） ＨｉＦｉポリメラーゼを用い、１μＬの得られたｃＤＮＡをＰＣＲ反応で以下のように用いた：９４℃における最初の３分の変性後に、２５サイクルのＰＣＲを、９４℃における３０秒の変性工程で行い、続いて、６０℃にて３０秒のアニーリング工程を行い、続いて、６８℃にて３０秒の延長工程を行った。３０サイクルの完了の後、反応液を６８℃にて７分間インキュベート、次いで、１０℃で、無期限に保存した。ＢＡＫのオリゴヌクレオチドはＧＪＣ ２４Ｆ（５’−ｃａｔｃｔｃａｃａｔｃｔｇｇａｃｃａｃａｇｃｃｇ−３’）（配列番号：２７）およびＧＪＣ ２５Ｒ（５’−ｃｔｇｇａａｃｔｃｔｇｔｇｔｃｇｔａｔｃｔｃｃｇｇ−３’）（配列番号：２８）であった。ＢＡＸについてのオリゴヌクレオチドはＧＪＣ １２Ｆ（５’−ｃｔｔｃｔｔｃｃｇｇｇｔｇｇｃａｇｃｔｇ−３’）（配列番号：２９）およびＧＪＣ ２３Ｒ（５’−ｃｃｃｇａａｇｔａｔｇａｇａｇｇａｇｇｃｃａｔｃ−３’）（配列番号：３０）であった。

図３に示すように、クローン８Ｈ６（合成異型接合体クローン）から形成された転写体は、このクローンがエクソン２をスキップすることを示す。加えて、予測されたように、ＢＡＫの欠失はＢＡＸのスプライシングに対して効果を有しなかった。

実施例４：ＢＡＫ／ＢＡＸ二重ノックアウト細胞株の生成および分析
ＢＡＫおよびＢＡＸの双方が不活化された細胞株も創製した。特に、ＢＡＸに向けられたジンクフィンガーヌクレアーゼを設計し、前記したように構築した。ＢＡＸをコードするプラスミドは、表１に示されるように、実施例２および３に記載されたＢａｋ−欠損ＣＨＯ細胞に設計する。

ＺＦＮ切断の部位において突然変異を検出するＢｓｌＩによるＢＡＸ ＰＣＲ産物の消化によって、細胞をＢＡＸ不活化についてテストした。各クローンからのほぼ２５，０００個の細胞を１００μＬのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）に溶解させ、得られた粗製溶解物の１μＬを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＡｃｃｕｐｒｉｎｅ（商標） ＨｉＦｉポリメラーゼを用いるＰＣＲ反応で以下のように用いた：９４℃における最初の３分の変性の後、３５サイクルのＰＣＲを９４℃における３０秒の変性工程で行い、続いて、６０℃における３０秒のアニーリング工程を行い、続いて、６８℃における３０秒の延長工程を行った。３０サイクルの完了の後、反応液を６８℃にて７分間インキュベート、次いで、１０℃で、無期限に保存した。ＢＡＸ破壊クローンをスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドはＧＪＣ ５２Ｆ（５’−ｃａｇａｇｇａａｔｇａａａｇｃａａａｇｇ−３’）（配列番号：３１）およびＧＪＣ １１４Ｒ（５’−ｔｇａａｃｃａｇｇｃｔｇｇｇａｇａｔｔｔ−３’）（配列番号：３２）であった。０．１μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡおよび０．１μＬの１０×緩衝液＃４（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）とともにＢｓｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の０．１μＬをＰＣＲ反応に加えた。消化を５５℃にて３時間進行させ、その後、消化産物を１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。

図４に示すように、ＢＡＫ−／−ＢＡＸ−トランスフェクトクローン７９のうち２１は、ＢＡＸの予測された破壊を含有した。

ＢＡＫ／ＢＡＸ二重ノックアウトクローンを、ＢａｘおよびＢａｋ蛋白質の発現についてもテストした。１００万のＢＡＸ／ＢＡＫ−／−細胞からの溶解物は、１００μＬ ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）＋プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ ｔａｂｌｅｔｓ， Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中への再懸濁、および氷上での１時間のインキュベーションによって調製した。溶解物を１４，０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心し、１０μＬの上清をウエスタンブロットで用いた。クローンからの蛋白質抽出物を抗−Ｂａｘ抗体（Ａｂｃａｍ）および抗−Ｂａｋ抗体（Ｓｉｇｍａ）で検索した。図５に示すように、ＢＡＸ／ＢＡＫ−／−二重ノックアウト細胞は、ＢａｘまたはＢａｋ蛋白質の全長型または切断型を発現しなかった。

実施例５：アポトーシスは、ＢＡＸ／ＢＡＫ−／−二重ノックアウト細胞株において妨げられる。
また、ＢＡＸ／ＢＡＫ−／−二重ノックアウト細胞株を、スタウロスポリン−誘導アポトーシスに対するそれらの抵抗性についてテストした。

簡単に述べれば、３つの異なるＢＡＸ／ＢＡＫ−／−−ノックアウト細胞株（＃４７、７１および９７）からの２５０００個の細胞、２５０００個のの野生型ＣＨＯ−ＫＩ細胞を、９６−ウェル皿中の、Ｆ−１２培地＋１０％ウシ胎仔血清に播いた。１２時間の増殖の後、細胞を３７℃にて１μＭスタウロスポリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓ−４４００）に６時間暴露した。カスパーゼ（アポトーシスの間のみ活性であって、ミトコンドリアからのチトクロームＣのＢａｋ−およびＢａｘ媒介放出によって活性化されるプロテアーゼ）の活性化を、製造業者に指示に従い、Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ Ｃａｓｐａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で測定した。データは、アッセイの開始から２．５時間後に記録した。細胞播種密度のわずかな変動について修正するために、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ（商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、カスパーゼ活性をＬＤＨ−Ａ酵素活性（細胞数の代わり）によって正規化した。

図６に示すように、アポトーシスはＢＡＸ／ＢＡＫ−／−細胞株において検出されなかった。

これらの結果は、遺伝子組換えヌクレアーゼを用いるアポトーシス−抵抗性ＢａｘおよびＢａｋ−欠損細胞株の迅速な生成を示す。切断の部位におけるＮＨＥＪの誤差−傾向プロセスによる不正なＤＮＡ修復の結果、機能的に有害な突然変異がもたらされる。ＮＨＥＪ−由来突然変異は、時々、慣用的な遺伝子破壊によって作成されたものに対して小さいが、ＢＡＫおよびＢＡＸの選択された臨界的領域にこれらの突然変異を標的化する遺伝子組換えヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の能力は、小さいイン−フレーム欠失でさえ不活化をもたらすであろうとことを確実とした。

さらに、ＣＨＯ細胞株の多くの異なるサブタイプが、しばしば、特注の遺伝子または表現型変化を伴って存在するが、本明細書中に記載されたＺＦＮを用いて、いずれかの細胞株またはサブタイプにおいてＢＡＸおよび／またはＢＡＫを迅速に破壊することができる。加えて、哺乳動物種の間で保存されたジンクフィンガー蛋白質結合部位を選択することができるが、ＺＦＮは、いずれの種に由来する細胞株においてもＢＡＸおよびＢＡＫを不活化するように設計することができる。

実施例６：組換え蛋白質の生産はＢＡＸ／ＢＡＫ−／−二重ノックアウト細胞株において増加する。
野生型ＣＨＯ−ＫＩ細胞およびＢＡＸ ＢＡＫ−／−クローン８Ｈ６−７１（図５参照）からの蛋白質生産をアッセイした。野生型およびノックアウト両細胞株を、ＩｇＧ重鎖および軽鎖遺伝子、およびピューロマイシン−抵抗性についての遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクトした。細胞を８μｇ／ｍＬピューロマイシンで選択し、ピューロマイシン抵抗性プールの細胞上清を２日間隔で２．５週間サンプリングした。細胞はこの実験においては栄養を与えず、栄養飢餓および毒性代謝産物蓄積が培養の増殖後期にアポトーシスを誘導することを可能とした。

ＩｇＧレベルは４ないし８日において双方の培養で同様であった。しかしながら、１２ないし１７日において、二重−ノックアウト培養におけるＩｇＧレベルは野生型ＣＨＯ細胞培養の２ないし５倍であった（図７）。

本明細書中で言及した全ての特許、特許出願および刊行物は、ここに、その全体を参照により組み込まれる。

開示は理解の明瞭性の目的で説明および例によって幾分詳細に提供してきたが、開示の精神または範囲を逸脱することなく実施することができるのは当業者に明らかであろう。従って、これまでの記載および実施例は限定的なものと解釈すべきではない。

Claims (16)

1. ＢａｋまたはＢａｘ遺伝子中の標的部位に特異的に結合する、遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインを含む蛋白質であって、該遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインは、Ｎ−末端からＣ−末端に、４つのジンクフィンガードメインを伴う蛋白質についてＦ１ないしＦ４の順番の、５つのジンクフィンガードメインを伴う蛋白質についてＦ１ないしＦ５の順番の、そして、６つのジンクフィンガードメインを伴う蛋白質についてＦ１ないしＦ６の順番の、４、５または６つのジンクフィンガー認識領域を含み、そしてさらに、該ジンクフィンガー認識領域は、以下に示される組み合せ：
   （ｉ） Ｆ１：ＲＳＤＨＬＴＴ（配列番号９）；
   Ｆ２：ＲＳＤＨＬＳＥ（配列番号１０）；
   Ｆ３：ＲＮＤＮＲＫＴ（配列番号１１）；
   Ｆ４：ＱＳＧＨＬＱＲ（配列番号１２）；および
   Ｆ５：ＱＳＧＨＬＳＲ（配列番号１３）；
   （ｉｉ） Ｆ１：ＲＳＤＳＬＳＡ（配列番号１４）；
   Ｆ２：ＤＲＳＳＲＴＫ（配列番号１５）；
   Ｆ３：ＲＳＤＤＬＴＲ（配列番号１６）；および
   Ｆ４：ＲＳＤＡＬＡＲ（配列番号１７）；
   （ｉｉｉ） Ｆ１：ＤＲＳＨＬＳＲ（配列番号３４）；
   Ｆ２：ＴＳＧＳＬＴＲ（配列番号３５）；
   Ｆ３：ＲＳＤＳＬＳＡ（配列番号１４）；
   Ｆ４：ＤＲＳＳＲＴＫ（配列番号１５）；
   Ｆ５：ＲＳＤＮＬＳＥ（配列番号３６）；および
   Ｆ６：ＨＳＮＡＲＫＴ（配列番号３７）；
   （ｉｖ） Ｆ１：ＲＳＤＮＬＳＶ（配列番号３９）；
   Ｆ２：ＤＲＳＮＬＴＲ（配列番号４０）；
   Ｆ３：ＲＳＤＴＬＳＥ（配列番号４１）；および
   Ｆ４：ＲＳＱＴＲＫＴ（配列番号４２）；
   （ｖ） Ｆ１：ＱＮＡＨＲＫＴ（配列番号５０）；
   Ｆ２：ＱＳＧＤＬＴＲ（配列番号５３）；
   Ｆ３：ＱＳＧＤＬＴＲ（配列番号５３）；
   Ｆ４：ＱＳＳＮＬＡＲ（配列番号５４）；および
   Ｆ５：ＴＳＳＮＲＫＴ（配列番号５５）；
   （ｖｉ） Ｆ１：ＲＳＤＮＬＡＲ（配列番号５７）；
   Ｆ２：ＱＳＧＤＬＴＲ（配列番号５３）；
   Ｆ３：ＤＮＲＱＬＩＴ（配列番号５８）；
   Ｆ４：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号８）；
   Ｆ５：ＲＳＤＴＬＳＲ（配列番号５９）；および
   Ｆ６：ＲＮＤＤＲＩＴ（配列番号６０）；
   （ｖｉｉ） Ｆ１：ＲＳＤＮＬＴＴ（配列番号６２）；
   Ｆ２：ＲＳＤＨＬＳＲ（配列番号６３）；
   Ｆ３：ＱＳＳＤＬＲＲ（配列番号６４）；
   Ｆ４：ＱＳＳＨＬＴＲ（配列番号３）；および
   Ｆ５：ＲＳＤＨＬＴＱ（配列番号６５）；
   （ｖｉｉｉ）Ｆ１：ＱＳＧＳＬＴＲ（配列番号６７）；
   Ｆ２：ＴＳＳＮＲＫＴ（配列番号５５）；
   Ｆ３：ＤＲＳＨＬＴＲ（配列番号６８）；
   Ｆ４：ＲＳＤＤＲＫＴ（配列番号６９）；
   Ｆ５：ＮＲＴＤＬＩＲ（配列番号７）；および
   Ｆ６：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号８）；
   （ｉｘ） Ｆ１：ＲＳＤＨＬＳＴ（配列番号１）；
   Ｆ２：ＤＲＳＨＬＡＲ（配列番号２）；
   Ｆ３：ＱＳＳＨＬＴＲ（配列番号３）；および
   Ｆ４：ＲＳＤＮＬＲＥ（配列番号４）；
   （ｘ） Ｆ１：ＲＳＡＮＬＳＶ（配列番号５）；
   Ｆ２：ＤＲＡＮＬＳＲ（配列番号６）；
   Ｆ３：ＮＲＴＤＬＩＲ（配列番号７）；および
   Ｆ４：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号８）；
   （ｘｉ） Ｆ１：ＤＲＳＤＬＳＲ（配列番号４５）；
   Ｆ２：ＮＲＴＤＬＩＲ（配列番号７）；
   Ｆ３：ＴＳＳＮＬＳＲ（配列番号８）；
   Ｆ４：ＲＳＤＴＬＳＱ（配列番号４６）；および
   Ｆ５：ＤＲＳＡＲＴＲ（配列番号４７）；ならびに
   （ｘｉｉ） Ｆ１：ＲＳＤＡＬＳＶ（配列番号４８）；
   Ｆ２：ＤＳＳＨＲＴＲ（配列番号４９）；
   Ｆ３：ＱＮＡＨＲＫＴ（配列番号５０）；
   Ｆ４：ＲＳＤＨＬＳＴ（配列番号１）；および
   Ｆ５：ＴＳＧＨＬＳＲ（配列番号５１）
   のいずれか１つから選択される、蛋白質。
2. 請求項１記載の遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメイン、および少なくとも１つの切断ドメインまたは少なくとも１つの切断ハーフ−ドメインを含む融合蛋白質。
3. 前記切断ハーフ−ドメインが野生型ＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインである請求項２記載の融合蛋白質。
4. 前記切断ハーフ−ドメインが遺伝子組換えＦｏｋＩ切断ハーフ−ドメインである請求項２記載の融合蛋白質。
5. 請求項１記載の遺伝子組換えジンクフィンガー蛋白質ＤＮＡ−結合ドメインをコードするポリヌクレオチド。
6. 請求項１記載の蛋白質を含む単離された細胞。
7. 請求項２に記載の融合蛋白質を用いた切断により、Ｂａｋおよび／またはＢａｘが部分的にまたは全面的に不活化されている細胞株であって、不活性化が、切断部位またはその近くにおいて、機能的に有害な突然変異を導入する、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復を介するものである、細胞株。
8. 細胞中の内因性細胞Ｂａｋおよび／またはＢａｘ遺伝子を不活化する方法であって：
   （ａ）請求項２に記載の第１の融合蛋白質をコードする第１の核酸を細胞に導入することを含み、これにより、前記第１の融合蛋白質が、Ｂａｋおよび／またはＢａｘ遺伝子の少なくとも１つに結合し、これを切断することを特徴とする方法。
9. さらに、請求項２に記載の第２の融合蛋白質をコードする核酸を導入することを含み、これにより、前記第１および第２の融合蛋白質が、Ｂａｋおよび／またはＢａｘ遺伝子の少なくとも１つに結合し、これを切断することを特徴とする、請求項８記載の方法。
10. 前記第１および第２の融合蛋白質が同一の核酸によってコードされる請求項９記載の方法。
11. 前記第１および第２の融合蛋白質が異なる核酸によってコードされる請求項９記載の方法。
12. 宿主中で注目する組換え蛋白質を生産する方法であって：
    （ａ）内因性Ｂａｘおよび／またはＢａｋ遺伝子を含む宿主細胞を供し；
    （ｂ）請求項８記載の方法によって、宿主細胞の内因性Ｂａｘおよび／またはＢａｋ遺伝子の一方または双方を不活化し；次いで、
    （ｃ）導入遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に導入するステップを含み、
    前記導入遺伝子は注目する蛋白質をコードする配列を含み、それにより、組換え蛋白質が生産される方法。
13. 前記注目する蛋白質が抗原を含む請求項１２記載の方法。
14. 前記抗原がインフルエンザ抗原を含む請求項１３記載の方法。
15. Ｂａｋおよび／またはＢａｘの少なくとも１つが部分的にまたは全面的に不活化された細胞株であって、ここに、前記細胞株は、
    （ａ）請求項８記載の方法に従ってＢａｋおよび／またはＢａｘの少なくとも１つを細胞において不活化し；そして、
    （ｂ）ＢａｋおよびＢａｘの少なくとも１つが部分的にまたは全面的に不活化された細胞株を生成させるのに適切な条件下で前記細胞を培養する、
    ことによって生産される細胞株。
16. 前記細胞がＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＷＩ３８細胞、Ｖ７９細胞、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＨａＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、およびｐｅｒＣ６細胞よりなる群から選択される哺乳動物細胞である請求項１５記載の細胞株。

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