BRPI0611167A2 - polipeptìdeos - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a polipeptídeos que tem a propriedade de ligação a uma dada pMHC Classe 1 caracterizado em que o dito polipeptideo tem o dito polipeptídeo tem um K<SYM> para a dita pMCH Classe 1 de menos do que ou igual a 1 <SYM>M e/ou tem "off rate" (k0ff) para a dita dada molécula de pMHC Classe 1 de 2S<SYM> ou mais lento E o dito polipeptídeo tem pelo menos 45% de identidade e/ou 55% de similaridade com SEQ ID NO: 7 E o dito polipeptícleo inibe a ligação de CD8 a dada pMHC em um grau maior do que o polipeptídeo SEO ID NO: 3. Tais polipeptídeos são úteis, tanto sozinhos como associados com um agente terapêutico, para a inibição de respostas de células T citotóxicas (CTL).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEOS".

A presente invenção refere-se a polipeptídeos que têm a propri-edade de ligação a uma dada pMHC Classe I CARACTERIZADO EM QUE odito polipeptídeo tem um Kd para a dita pMHC Classe I de menos do que ouigual a 1 μΜ e/ou tem "off-rate" (koff) para a dita molécula de pMHC Classe Ide 2 S"1 ou mais lento E o dito polipeptídeo tem pelo menos 45% de identi-dade e/ou 55% de similaridade com SEQ ID NO: 7 E o dito polipeptídeo inibea ligação de CD8 a dada pMHC em um grau maior do que o polipeptídeo daSEQ ID NO:3. Também são fornecidos complexos multivalentes dos ditospolipeptídeos, células que apresentam os ditos polipeptídeos, os ditos poli-peptídeos associados a agentes terapêuticos e métodos para uso dessespolipeptídeos.

Antecedentes da Invenção

Transcritos semelhantes à imunoglobulina (ILTs) também sãoconhecidos como receptores semelhantes à imunoglobulina de leucócito(LIRs), receptores semelhantes à imunoglobulina de monócito/macrófago(MIRs) e CD85. Essa família de imunorreceptores forma parte da superfamí-Iia de imunoglobulina. A identificação de moléculas de ILT foi publicada pri-meiramente em março de 1997 em um estudo (Samaridis etal., (1997) EurJImmunol 2Π\ 660-665) que detalhou a seqüência de LIR-1 (ILT-2), observousua similaridade com FCy2R bovino, receptores inibitórios de célula killerhumana (KlRs), FcaR humano e gp49 de camundongo. Esse estudo tam-bém observou que LIR-1, diferente de KIRs, é predominantemente expressaem monócitos e células linfóides B.

Polipeptídeos solúveis com as características de ligação a p-MHC de moléculas ILT e complexos multivalentes desses fornecem um meiode bloquear o sítio de ligação de CD8 sobre as moléculas de pMHC, por e-xemplo com o propósito de inibir a doença auto-imune mediada pela célula TCD8+. Entretanto, para esse propósito seria desejável que esses polipeptí-deos tivessem uma afinidade maior e/ou um "off-rate" mais lento para asmoléculas de pMHC alvo do que as moléculas de ILT nativas.Breve Descrição da Invenção

A presente invenção refere-se a polipeptídeos que tem a propri-edade de ligação a uma dada pMHC Classe I CARACTERIZADO EM QUE odito polipeptídeo tem um Kd para a dita pMHC Classe I de menos do que ouigual a 1 μΜ e/ou tem "off-rate" Ckoff) para a dita molécula de pMHC Classe Ide 2 S"1 ou mais lento E o dito polipeptídeo tem pelo menos 45% de identi-dade e/ou 55% de similaridade com SEQ ID NO: 7 e o dito polipeptídeo inibea ligação de CD8 a uma dada pMHC em um grau maior do que o polipeptí-deo da SEQ ID NO: 3. Também são fornecidos complexos multivalentes dosditos polipeptídeos, células que apresentam os ditos polipeptídeos, os ditospolipeptídeos associados a agentes terapêuticos e métodos para uso dessespolipeptídeos.

Descrição Detalhada da Invenção

Como observado acima, moléculas de ILT também são conheci-das como LIRs, MIRs e CD85. O termo ILT como usado aqui é entendidocomo abrangendo qualquer polipeptídeo dentro dessa família de imunorre-ceptores.

ILTs

A família ILT de imunorreceptores é expressa sobre a superfíciede células linfóides e mielóides. As moléculas de ILT partilham 63-84% dehomologia em suas regiões extracelulares e todas exceto a LIR-4 solúvelsão proteínas transmembrana tipo I. Todas as moléculas de ILT atualmenteidentificadas têm dois ou quatro domínios da superfamília de imunoglobuli-nas em suas regiões extracelulares. (Willcox et al., (2003) 4: (9) 913-919).

Moléculas de ILT individuais também podem ser expressas como inúmerasvariantes/isoformas distintas. (Colonna et al., (1997) J Exp Med 186: (11)1809-1 818) e (Cosman et al., (1997) Immunity 7: 273 -282).

Existem vários artigos científicos que detalham a estrutura e fun-ção de moléculas de ILT incluindo os seguintes: (Samaridis et ai, (1997) EurJ Immunol 27 660-665), (Cella, et ai, (1997) J Exp Med 185 (IO) 1743-1751),(Cosman etal, (1997) Immunity 7 273-282), (Borges et ai, (1997) J Immunol159 5192-5196), (Colonna et al., (1997) J Exp Med 186 (11) 1809-1818),(Colonna eíal., (1998) J, Immunol 160 3096-3100), (Cosman ef al., (1 999)Immunological Revs 168 177-1 85), (Chapman et al., (1 999) Immunity 11603-61 3), (Chapman et al., (2000) Immunity 12 727-736), (Willcox et al.,(2002) BMC Structural Biology 2 6), (Shiroshi et al., (2003) PNAS 100 (5)8856-8861) e (Willcox et al., (2003) 4 (9) 913-919).

W09848017 descreve as seqüências genéticas que codificam osmembros da família ILT e suas seqüências de aminoácidos deduzidas. Essepedido classificou as moléculas de LIR em três grupos. O primeiro grupo quecontem polipeptídeos com uma região transmembrana que inclui um resíduocarregado positivamente e uma cauda citoplasmática curta. O segundo gru-po que compreende polipeptídeos que tem uma região transmembrana nãopolar e uma cauda citoplasmática longa. E finalmente um terceiro grupo quecontem um polipeptídeo expresso como um polipeptídeo solúvel que nãotem região transmembrana ou cauda citoplasmática. Também foram descri-tos processos para a produção de polipeptídeos da família de LIR e anticor-pos antagonistas para membros da família LlR. Esse pedido discutiu o pos-sível uso de membros da família LIR para tratar doenças autoimunes e esta-dos de doença associados à função imune suprimida. Com relação a isso,foi observado que o uso de formas solúveis de um membro da família LIR évantajoso para certas aplicações. Essas vantagens incluíram a facilidade depurificar formas solúveis de ILTs/LIRs a partir de células hospedeiras recom-binantes, que elas são adequadas para administração intravenosa e seu usopotencial para bloquear a interação de membros da família LIR de superfíciecelular com seus Iigantes a fim de mediar uma função imune desejável. Apossível utilidade de fragmentos solúveis de LIR que retém uma atividadebiológica desejada, tal como ligação a Iigantes incluindo as moléculas deMHC Classe I também foi observada.

Outro estudo (Shiroishi et a1 (2003) PNAS 100 (15) 8856-8861)discutiu formas solúveis (truncadas) de moléculas de ILT-2 e ILT-4. Sua ha-bilidade de competir com CD8 solúvel pela ligação com moléculas de MHCem estudos Biacore foi observada e foi postulado que esse pode ser um dosmecanismos pelos quais ILT-2 modula a ativação de células T CD8+. Emrelação a ligação a pMHC esse estudo estabelece que "A maior afinidade deILT versus a ligação de CD8 sugere que ILTs podem bloquear efetivamentea ligação de CD8 na superfície celular". Esse estudo mostrou que ILT2 seliga ao domínio a3 de MHC Classe I e a estrutura cristalina de um fragmentode ILT2 que contem domínios 1 e 2 foi relatada.

Colonna et al., (1998) J: Immunol. 160 3096-3100) que se con-centrou sobre ILT-4, contém um resumo da distribuição tecidual e especifici-dade de ILTs 2-5. Dessas moléculas de ILT, ILT-2 e ILT-4 são observadasse ligando a moléculas de MHC Classe I. Esse estudo analisou a ligação deILT-4 solúvel a células transfectadas com várias MHCs Classe I. Esse estu-do concluiu que ILT-4 liga-se a HLAs-A, BeG, mas não a HLA-Cw3 ou HLA-Cw5

W003041650 descreve um método para tratar Artrite Reumatói-de (RA) usando moduladores da atividade de LIR-2 e/ou LIR-3/ LIR-7. Osmoduladores descritos incluem tanto os agonistas como os antagonistas daatividade de LIR. W02006033811 descreve o uso de polipeptídeos de ILT-3e fusões desses como agentes terapêuticos para a inibição da rejeição deenxerto.

A afinidade por vários análogos solúveis de moléculas de ILTselvagem por diferentes alvos de pMHC foi determinada. Por exemplo,(Chapman et al., (1999) Immunity 11 603-613) usou métodos baseados emBiacore para determinar que LIR-I (ILT-2) se ligou a uma gama de moléculasde HLA-A, HLA-B, HLA-C1 HLA-E e HLA-G. Os valores de K0 determinadospara essas interações variaram de 1 χ 10"4 M (para HLA-GI) a 2 χ 10"5 M (pa-ra HLA-Cw*0702). Esse estudo também observou que o K0 da interação en-tre ILT-2 tinha uma afinidade por UL18, um análogo viral de MHC Classe I,na faixa de nM.

Um estudo posterior (Chapman et al., (2000) Immunity 12 727-736) relatou a estrutura cristalina de um polipeptídeo de LIR-1 truncado (ILT-2) que compreende os domínios D1 e D2. LIR-1 era conhecido por se ligarao análogo viral de MHC Classe I UL18 com uma afinidade maior do que oLIR-2 similar. Os autores usaram a estrutura cristalina do polipeptídeo LIR-1truncado para identificar diferenças entre LIR-1 e LIR-2 que ocorreram emresíduos expostos a um solvente. Mutagênese direcionada ao sítio dessesdois peptídeos foi usada para confirmar quais resíduos estavam envolvidosna ligação de UL18. Isso foi realizado pela substituição de resíduos WT deLIR-1 nas posições de aminoácidos correspondentes de LIR-2. O estudoconcluiu que o resíduo 38Y e pelo menos um de 76Y, 80D ou 83R de LIR-1estavam envolvidos na ligação de UL18. Os autores estabeleceram que"Como a afinidade de LIR-1 por proteínas MHC Classe I é muito menor doque por UL18 nós fomos incapazes de derivar afinidades precisas para aligação de mutantes de LIR-ie LIR-2 para MHC Classe I".

As seqüências completas de aminoácidos e DNA de uma ILT-2humana selvagem são mostradas nas Figuras 1a (SEQ ID NO: 1) e 1b (SEQID NO: 2) respectivamente. A seqüência de DNA fornecida corresponde aeste dado número de acesso NM_006669 da base de dados de nucleotídeode NCBI.

Polipeptídeos semelhantes a ILTde alta afinidade

A presente invenção fornece polipeptídeos que tem a proprieda-de de ligação a uma dada pMHC Classe I CARACTERIZADO EM QUE odito polipeptídeo tem um K0 para a dita pMHC Classe I de menos do que ouigual a 1 μΜ e/ou "off-rate" (koff) para a dita molécula de pMHC Classe I de 2S1 ou mais lenta E o dito polipeptídeo tem pelo menos 45% de identidadee/ou 55% de similaridade com SEQ ID NO: 7 e o dito polipeptídeo inibe aligação de CD8 a dada pMHC em um grau maior do que o polipeptídeo deSEQ ID NO: 3.

Polipeptídeos que satisfazem a homologia acima e os critériosde ligação de pMHC Classe I podem ser considerados como moléculas se-melhantes a ILT de alta afinidade e podem ser referidos aqui como tais.

Como declarado acima, polipeptídeos de ILT de ocorrência natu-ral podem ter dois ou quatro domínios da superfamília de imunoglobulinasem suas regiões extracelulares. Os polipeptídeos semelhantes a ILT de altaafinidade da invenção podem ser expressos em formas que tem quatro, trêsou dois dos ditos domínios. As modalidades atualmente preferidas da inven-ção tem dois domínios da superfamília de imunoglobulina que correspondemaos dois domínios N-terminais de ILT-2 humano que contem uma ou maismutação(ões) que conferem alta afinidade para pMHC Classe I. Esses doisdomínios N-terminais são os domínios um e dois que usam a notação deCosman et ai, (1999) Immunol Revs 168: 177-185. Polipeptídeos semelhan-tes a ILT que tem esses dois domínios N-terminais geralmente têm uma se-qüência que corresponde aos aminoácidos 1-195 de SEQ ID NO: 3.

Preferivelmente1 o polipeptídeo é CARACTERIZADO EM QUE odito polipeptídeo tem pelo menos 60% de identidade e/ou 75% de similarida-de com SEQ ID NO: 7.

Preferivelmente, o polipeptídeo é CARACTERIZADO EM QUE odito polipeptídeo tem pelo menos 75% de identidade e/ou 85% de similarida-de com SEQ ID NO: 7.

Preferivelmente, o polipeptídeo é CARACTERIZADO EM QUE odito polipeptídeo tem pelo menos 90% de identidade e/ou 95% de similarida-de com SEQ ID NO: 7.

Identidade de seqüência como usado aqui significa aminoácidosidênticos em posições correspondentes nas duas seqüências que estãosendo comparadas. Similaridade nesse contexto inclui aminoácidos que sãoidênticos e aqueles que são similares (funcionalmente equivalentes). Porexemplo, uma única substituição de um aminoácido hidrofóbico presente emuma dada posição em um polipeptídeo por um aminoácido hidrofóbico dife-rente poderia resultar na formação de um polipeptídeo que seria consideradosimilar ao polipeptídeo original, mas não idêntico. Os parâmetros "similarida-de" e "identidade" como usados aqui para caracterizar os polipeptídeos dainvenção são determinados pelo uso do algoritmo FASTA como implemen-tado pelo conjunto de programas FASTA disponibilizado por William R. Pe-arson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottes-ville, Virginia. Os parâmetros usados para determinação daqueles parâme-tros através do pacote de programas FASTA são como os especificados a-qui no Exemplo 6.

Como será claro para aqueles versados na técnica, existe umasérie de fontes de comparações de proteína:proteína do FASTA que poderi-am ser usadas para essa análise. (Pearson et ai,(1988) PNAS 85 2444-2448) fornece detalhes adicionais do algoritmo FASTA. As atividades inibitó-rias relativas do polipeptídeo de SEQ ID NO: 3 e de qualquer dado supostopolipeptídeo da invenção podem ser determinadas por qualquer ensaio con-vencional a partir do qual a leitura é relacionada com a afinidade de ligaçãode CD8 para a dada pMHC. Em geral a leitura será um valor de IC50.0 poli-peptídeo de teste e aquele da SEQ ID NO: 3 serão avaliados em concentra-ções comparáveis e suas respectivas IC50 determinadas por referência àscurvas de inibição plotadas a partir dos resultados individuais. Um ensaioadequado é aquele que está descrito no Exemplo 5.

Preferivelmente, o polipeptídeo é CARACTERIZADO EM QUE odito polipeptídeo tem um K0 para a dada pMHC Classe I de menos do queou igual a 100 nM e/ou tem "off rate" (koft) para a dada pMHC Classe I de 0,1 S-1.

Como será conhecido por aqueles versados na técnica, existemvários meios pelos quais a dita afinidade e/ou "off rate" podem ser determi-nadas. Por exemplo, a dita afinidade (K0) e/ou "off rate" (koft) podem ser de-terminadas por Ressonância de Plasmon de Superfície. O Exemplo 4 aquicontido fornece um ensaio a base de Biacore adequado para a realização detais determinações.

Como comparação a interação de uma variante truncada solúvelda molécula ILT-2 selvagem (veja Figura 2a (SEQ ID NO: 3) para a seqüên-cia de aminoácidos desse polipeptídeo solúvel) e HLA-A*0201 carregadacom o peptídeo YLSGANLNL (SEQ ID NO: 13) derivado de antígeno carci-no-embriogênico (CEA), tem um K0 de 6 μΜ e "off rate" (koft) de 2,4 S-1 con-forme medidos pelo método baseado em Biacore do Exemplo 4. Essa molé-cula de ILT-2 solúvel é uma forma truncada de uma variante de isoforma 1de ILT-2 selvagem humano que contém apenas domínios extracelulares D1e D2. Os resíduos de aminoácidos que diferem entre essa molécula variantede ILT-2 e aquelas da isoforma 1 de ILT-2 estão destacados na Figura 1a.

Figura 2b (SEQ ID NO: 4) detalha a seqüência de DNA nativaque codifica esse polipeptídeo. A fim de melhorar a eficiência da expressãorecombinante e facilitar a clonagem desse polipeptídeo várias mutações fo-ram introduzidas no DNA que codifica esse polipeptídeo. Essas mutaçõesnão alteram a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo expresso. A se-qüência de DNA usada para a expressão recombinante é mostrada na Figu-ra 3 (SEQ ID NO: 5).

É fornecida uma modalidade da invenção em que o polipeptídeoé uma molécula de ILT humano mutada. Por exemplo, o DNA que codificaILT-2 humano ou fragmentos solúveis desse, pode ser usado como um mol-de no qual as várias mutações que causam grande afinidade e/ou "off rate"lenta para a interação entre os polipeptídeos semelhantes a ILT de alta afini-dade da invenção e o complexo de pMHC alvo, podem ser introduzidas. As-sim, a invenção inclui variantes de ILT-2 que são mutadas em relação a se-qüência nativa.

Como será claro para aqueles versados na técnica, a(s) muta-ção(ões) em tal seqüência de aminoácidos de ILT-2 humano podem ser umaou mais de substituição(ões), deleção(ões) ou inserção(ões). Essas muta-ções podem ser efetuadas usando qualquer método apropriado incluindo,mas não limitado àqueles baseados em reação em cadeia da polimerase(PCR), clonagem a base de enzima de restrição ou procedimentos de clona-gem independentes de ligação (LIC). Esses métodos estão detalhados emmuitos dos textos usuais de biologia molecular. Para mais detalhes com re-lação a mutagênese por reação em cadeia da polimerase (PCR) e clonagema base de enzima de restrição veja (Sambrook & Russell, (2001) MolecularCloning - A Laboratory Manual (3- Ed.) CSHL Press). Informação adicionalsobre procedimentos de LIC pode ser encontrada em (Rashtchian, (1995)Curr Opin Biotechnol 6 (1): 30-6).

Modalidades adicionais da invenção incluem polipeptídeos emque um ou mais dos aminoácidos que correspondem a 10W, 19Q, 20G, 21S,42K, 47W, 50R, 66I, 77Y, 78Y, 79G, 80S, 81 D, 82T, 83A, 84G, 85R, 87E,99A, 1011, 102K, 141E, 146L, 147N, 1591, 168S, 172W, 174R e 188L deSEQ ID NO: 3 é/são mutado(s). Por exemplo, polipeptídeos da invenção po-dem compreender uma ou mais das seguintes mutações: IOW-L, 19Q—M,19Q—L, 19Q—V, 20G—D, 20G—M, 20G—Q, 20G—F, 20G—S, 20G—E,20G—R, 21S-Q1 21S-R, 21S-A1 21S-S1 42K— R1 47W—Q, 50R—L166L—V, 77Y—V, 77Y—Μ, 77Y—I, 77Y—Q, 78Y—Q, 78Y—I, 78Y—G,79G—Q, 79G—Y, 79G—W, 79G—R, 79G—V, 80S—R, 80S—T, 80S—G181D+G, 81D—Q1 81 D—L, 81D—V, 82T—G, 82T—Ε, 83A—S, 83A—G,83A—R, 84G—L, 84G—Q, 84G—A, 85R—W, 87E—A, 99A—I, 99A—Y,1011—>L, 1011—K, 1011—Q1 101—V, 102K—Q1 102K—A, 102K— R1141 E—G, 141 E—D, 146L—D, 147N—S, 1591—E1 168S—G, 172W—R1174R—Wou 188L—D.

Por exemplo, polipeptídeos que compreendem pelo menos dois,três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez das mutações acima serãogeralmente adequados.

A numeração usada é a mesma daquela mostrada na Figura 2a(SEQ ID No: 3).

Uma modalidade fornece um polipeptídeo da invenção que com-preende mutações que correspondem aos aminoácidos 19Q—M e 21 S-Qusando a numeração da SEQ ID NO: 3.

Outra modalidade fornece um polipeptídeo da invenção quecompreende as mutações que correspondem a 19Q—M, 20G—D, 21S—Q,99A—V e 168S—G usando a numeração da SEQ ID NO: 3.

Outra modalidade fornece um polipeptídeo da invenção quecompreende as mutações que correspondem a 19Q—L, 20G—M e 21S-Qusando a numeração da SEQ ID NO: 3.

Outra modalidade fornece um polipeptídeo da invenção quecompreende as mutações que correspondem a 19Q—M, 20G—Q, 21S-R,42K—R, e 146L—S usando a numeração da SEQ ID NO: 3.

Outra modalidade fornece um polipeptídeo da invenção quecompreende as mutações que correspondem a 19Q—M, 20G—D, 21S-Q,83A—S, 84G—Q, 85R—W, 87E—A e 99A—V usando a numeração da SEQID NO: 3.

Uma modalidade adicional é fornecida por um polipeptídeo emque os aminoácidos que correspondem a um ou ambos de 135C ou 145Cusando a numeração da SEQ ID NO: 3 é/são mutado(s) para S.

Outra modalidade é fornecida por um polipeptídeo da invençãoque compreende aminoácidos que correspondem a pelo menos os aminoá-cidos de 1-195 da SEQ ID No: 3. Tais polipeptídeos são modalidades dedois domínios que compreendem domínios que correspondem aos dois do-mínios N-terminais da superfamília de imunoglobulina de ILT-2 humano.

Modalidades específicas adicionais da invenção são fornecidaspor polipeptídeos que consistem em ou incluem qualquer uma das SEQ IDNos: 6 a 9, ou 21 a 61. É claro que, embora essas modalidades preferidassejam expressas como consistindo em incluindo as SEQ ID Nos: 6 a 9, 16ou 21 a 61, aqueles versados na técnica observarão que inevitavelmentehaverá substituições, deleções e inserções de aminoácidos menos importan-tes que não afetam a identidade global e as propriedades da modalidade.

Tais variações menos importantes podem ser consideradas como variaçõesfenotipicamente silenciosas de tais polipeptídeos. Olhadas de outra maneira,tais variações resultam em um polipeptídeo que tem a mesma função que ode origem e que executa aquela função da mesma maneira.

Uma modalidade preferida da invenção é fornecida por um poli-peptídeo que consiste em ou inclui a SEQ ID No: 16.

Polipeptídeos de alta afinidade semelhantes a ILT com solubilidade aumentada

Os polipeptídeos da invenção podem ser usados como terapêu-ticos solúveis. Em tais casos, é desejável aumentar a solubilidade dessespolipeptídeos. A invenção abrange polipeptídeos que compreendem uma oumais mutações que aumentam a solubilidade de polipeptídeos em relação aum polipeptídeo correspondente que não tem as ditas mutações. Como seráentendido por aqueles versados na técnica, quando solubilidade aumentadade um polipeptídeo é procurada, é geralmente preferível mutar aminoácidosque são expostos a um solvente. Esses aminoácidos expostos a um solven-te podem ser identificados por referência a estrutura cristalina de ILT-2. (Ve-ja Chapman et ai, (2000) Immunity 12 727-736). A invenção abrange poli-peptídeos em que um ou mais aminoácido(s) exposto(s) a um solventeé(são) mutados. Por exemplo, polipeptídeos da invenção que compreendempelo menos uma mutação em que um aminoácido hidrofóbico exposto a umsolvente é substituído por um aminoácido carregado.

Preferivelmente, tais mutações que aumentam a solubilidadeestão dentro dos 6 aminoácidos C-terminais dos polipeptídeos da invenção.

Outra modalidade é fornecida por um polipeptídeo da invençãoem que os aminoácidos que correspondem a 196L e/ou 198L da SEQ IDNO: 3 estão mutados para 196D e 198D, respectivamente.

Uma modalidade adicional é fornecida por um polipeptídeo dainvenção que compreende mutações que correspondem a 19Q—>M,20G—>D, 21S—>Q, 83A—>S, 84G^Q, 85R^W, 87E-»A, 99A^V, 196L^D e198L—>D usando a numeração da SEQ ID NO: 3.

Outra modalidade é fornecida por um polipeptídeo da invençãoque consiste em ou inclui qualquer uma das SEQ ID Nos: 63 a 80.

Outra modalidade é fornecida por um polipeptídeo da invençãoque consiste em ou inclui SEQ ID Nos: 17 ou 62.Polipeptídeos de alta afinidade semelhantes a ILT "sinalizados"

Os polipeptídeos da invenção podem ser usados em formas mul-timéricas ou em associação com outras porções. Com relação a isso, é de-sejável produzir polipeptídeos da invenção que compreendem um meio deacoplar outras porções a eles.

Portanto, uma modalidade é fornecida por um polipeptídeo dainvenção que compreendem um "sinalizador" para facilitar o acoplamento deoutras porções. Esse sinzalizador pode estar na terminação C dos polipeptí-deos.

Como será conhecido por aqueles versados na técnica, existemvários sinalizadores que são adequados para esse propósito. Esses incluem,mas não são limitados a, resíduos de cisteína, peptídeos de hexaistidina,biotina e grupos quimicamente reativos. A presença de tais sinalizadorestambém pode facilitar a purificação dos polipeptídeos.Polipeptídeos de alta afinidade semelhantes a ILTPEGuiIadosEm uma modalidade particular, um polipeptídeo da invençãoestá associado a pelo menos uma cadeia(s) de polialquileno glicol. Essa as-sociação pode ser feita de várias maneiras conhecidas por aqueles versadosna técnica. Em uma modalidade preferida a(s) cadeia(s) de polialquilenoé/são ligada(s) covalentemente aos polipeptídeos. Em uma modalidade adi-cional, as cadeias de polietileno glicol do presente aspecto da invençãocompreendem pelo menos duas unidades de repetição de polietileno.Complexos Multivalentes de Alta Afinidade semelhantes a ILT

Um aspecto da invenção fornece um complexo multivalente quecompreende pelo menos dois polipeptídeos da invenção, o dito complexomultivalente tendo um K0 para uma dada pMHC Classe I de menos do queou igual a 1μΜ e/ou tem "off rate" (koff) para a dita pMHC Classe I de 2 S1 oumais lento.

Em uma modalidade desse aspecto, pelo menos dois polipeptí-deos da invenção são ligados através de porções Iigantes para formar com-plexos multivalentes.

Um aspecto é fornecido aqui, em que os polipeptídeos da inven-ção são ligados por por uma cadeia de polímero não peptídico ou uma se-qüência peptídica ligante. Preferivelmente, os complexos multivalentes sãosolúveis em água, então a porção ligante pode ser selecionada de acordo.Além disso, é preferível que a porção ligante seja capaz de se ligar a posi-ções definidas sobre os polipeptídeos, tal que a diversidade estrutural doscomplexos formados seja minimizada. Uma modalidade do presente aspectoé fornecida por um complexo multivalente da invenção em que a cadeia depolímero ou a seqüência peptídica ligante se estende entre resíduos de ami-noácidos de cada polipeptídeo que não estão localizados no domínio de li-gação de pMHC Classe I dos polipeptídeos.

Já que os complexos da invenção podem ser para uso em medi-camentos, as porções Iigantes devem ser escolhidas com a devida conside-ração quanto a sua adequabilidade farmacêutica, por exemplo sua imunoge-nicidade.

Exemplos de porções Iigantes que preenchem os critérios dese-jáveis acima são conhecidas na técnica, por exemplo na técnica de ligaçãode fragmentos de anticorpo.

Existem duas classes de Iigantes que são preferidos para uso naprodução de complexos multivalentes da presente invenção. Um complexomultivalente da invenção no qual os polipeptídeos são ligados por uma ca-deia de polialquileno glicol ou um Iigante peptídico derivado de um domíniode multimerização humano fornece certas modalidades da invenção.

Polímeros hidrofílicos adequados incluem, mas não são limita-dos a, polialquileno glicóis. Os polímeros dessa classe mais comumente u-sados são a base de polietileno glicol ou PEG1 cuja estrutura é mostradaabaixo.

HOCH2CH2O (CH2CH2O)n -CH2CH2OH

Em que η é maior do que dois.

Entretanto, outros são a base de outros polialquileno glicóis a-dequados, opcionalmente substituídos, incluindo polipropileno glicol e copo-límeros de etileno glicol e propileno glicol.

Tais polímeros podem ser usados para tratar ou conjugar agen-tes terapêuticos, particularmente terapêuticos de polipeptídeos ou proteínas,para se obter alterações benéficas do perfil fármacocinético (PK) do terapêu-tico, por exemplo depuração renal reduzida, meia vida plasmática melhora-da, imunogenicidade reduzida e solubilidade melhorada. Tais melhorias noperfil PK do conjugado PEG-terapêutico são tidas como resultando da molé-cula ou moléculas de PEG formando uma "concha" em torno do terapêuticoo que impede estericamente a reação com o sistema imune e reduz a de-gradação proteolítica (Casey et al, (2000) Tumor Targetting 4 235-244). Otamanho do polímero hidrofílico usado pode, em particular, ser selecionadocom base no uso terapêutico pretendido dos polipeptídeos semelhantes aILT de alta afinidade. Há vários artigos de revisão e livros que detalham ouso de PEG e moléculas similares em formulações farmacêuticas. Por e-xemplo, veja (Harris (1992) Polyethylene Glycol Chemistry - Biotechnical andBiomedical Applications, Plenum, Nova Iorque, NY.) ou (Harris & Zalipsky(1997) Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACSBooks, Washington, D.C).

O polímero usado pode ter uma conformação linear ou ramifica-da. Moléculas de PEG ramificadas, ou derivados dessas, podem ser induzi-das pela adição de porções ramificantes incluindo glicerol e oligômeros deglicerol, pentaeritritol, sorbitol e lisina.

Geralmente, o polímero terá um grupo ou grupos quimicamentereativos em sua estrutura, por exemplo em uma ou ambas as terminações,e/ou nas ramificações do esqueleto, para possibilitar que o polímero se liguenos sítios alvo no polipeptídeo semelhante a ILT de alta afinidade. Esse gru-po ou grupos quimicamente reativos podem estar acoplados diretamente aopolímero hidrofílico, ou pode haver um grupo/porção espaçadora entre o po-límero hidrofílico e o químico reativo como mostrado abaixo:

Químico reativo-Polímero hidrofílico-Químico reativoQuímico reativo-Espaçador-Polímero hidrofílico-Espaçador-Químico reativo

O espaçador usado na formação de construtos do tipo descritoacima pode ser qualquer porção orgânica que seja uma cadeia não reativa,quimicamente estável. Tais espaçadores incluem, mas não são limitados aosseguintes:

-(CH2)n- em que η = 2 a 5

-(CH2)3NHCO(CH2)2

Um complexo multivalente da invenção no qual um radical espa-çador de alquileno divalente está localizado entre a cadeia de polialquilenoglicol e seu ponto de acoplamento a molécula do polipeptídeo do complexofornece uma modalidade adicional do presente aspecto.

Um complexo multivalente da invenção no qual a cadeia de poli-alquileno glicol compreende pelo menos duas unidades de repetição polieti-Ieno glicol fornece uma modalidade adicional do presente aspecto.

Há vários fornecedores comerciais de polímeros hidrofílicos liga-dos, diretamente ou através de um espaçador, a químicos reativos que po-dem ter uso na presente invenção. Esses fornecedores incluem Nektar The-rapeutics (CA, USA), NOF Corporation (Japão), Sunbio (Coréia do Sul) eEnzon Pharmaceuticals (NJ, USA).Polímeros hidrofílicos disponíveis comercialmente ligados, dire-tamente ou através de um espaçador, aos químicos reativos que podem teruso na presente invenção incluem, mas não são limitados aos seguintes:

<table>table see original document page 16</column></row><table>Uma grande variedade de químicos de acoplamento pode serusada para acoplar moléculas de polímeros aos terapêuticos de proteína epeptídeo. A escolha do químico de acoplamento mais apropriado é ampla-mente dependente do sítio de acoplamento desejado. Por exemplo, os se-guintes químicos de acoplamento tem sido usados ligados a uma ou maisdas terminações de moléculas de PEG (Fonte: Nektar Molecular EngineeringCatalogue 2003):

N-maleimida

Vinil sulfona

Carbonato de benzotriazol

Propionato de succinimidila

Butanoato de succinimidila

Tio-éster

Acetalde idos

Acrilatos

Biotina

Aminas Primárias

Como estabelecido acima, polímeros que não são a base dePEG também fornecem Iigantes adequados para multimerizar os polipeptí-deos da presente invenção. Por exemplo, porções que contêm terminaçõesde maleimida ligadas por cadeias alifáticas tais como BMH e BMOE (Pierce,produtos N- 22330 e 22323) podem ser usadas.

Ligantes peptídicos são outra classe de Iigantes de complexosmultivalentes. Esses Iigantes são compreendidos de cadeias de aminoácidose funcionam para produzir Iigantes simples ou domínios de multimerizaçãosobre os quais os polipeptídeos da presente invenção podem ser acoplados.O sistema biotina/estreptavidina foi usado previamente para produzir tetrâ-meros de TCRs e moléculas de pMHC (veja WO 99/60119) para estudos deligação in vitro. Entretanto, a estreptavidina é um polipeptídeo derivado demicróbios e como tal não é idealmente adequado para uso em um terapêutico.

Complexos multivalentes da invenção nos quais os polipeptídeossão ligados por um Iigante peptídico derivado de um domínio de multimeri-zação humano fornecem uma modalidade do presente aspecto. Existem vá-rias proteínas humanas que contêm um domínio de multimerização que po-de ser usado na produção de complexos multivalentes de polipeptídeos se-melhantes a ILT de alta afinidade. Por exemplo, o domínio de tetramerizaçãode p53 foi utilizado para produzir tetrâmeros de fragmentos de anticorposcFv que exibiram persistência sérica aumentada e "off rate" significativa-mente reduzida em comparação com o fragmento scFv monomérico (Willudaetal. (2001) J. Biol, Chem. 276 (17) 14385-14392). A hemoglobina tambémtem um domínio de tetramerização que poderia ser potencialmente usadopara esse tipo de aplicação.

Em uma modalidade específica, os complexos multivalentes dainvenção podem ser dímeros ou tetrâmeros. Os exemplos 9 e 10 aqui conti-dos fornecem metodologias detalhadas para a produção de complexos se-melhantes a ILT de alta afinidade ligados a PEG diméricos ou tetraméricosda invenção, respectivamente. O exemplo 11 aqui contido fornece dadossobre a habilidade de tais complexos multivalentes inibirem a ativação decélula T citotóxica.

Um complexo multivalente da invenção que compreende pelomenos dois polipeptídeos da invenção, em que pelo menos um dos ditospolipeptídeos está associado a um agente terapêutico fornece uma modali-dade adicional desse aspecto.

Um aspecto adicional é fornecido por um polipeptídeo da inven-ção ou complexo multivalente desse em que o dito polipeptídeo ou complexomultivalente é solúvel.

Um aspecto adicional é fornecido por uma célula isolada ou umapartícula que apresenta pelo menos um polipeptídeo da invenção. Comoserá óbvio para aqueles versados na técnica, tais polipeptídeos requeremum meio de acoplamento à superfície das ditas células ou partículas. Há vá-rios meios de facilitar tal acoplamento. Por exemplo, particularmente no casode células, esse meio de acoplamento pode ser convenientemente fornecidopela produção de versões de "extensão completa" dos polipeptídeos esco-lhidos que incorporam pelo menos o domínio transmembrana de ILT-2 hu-mano. O domínio transmembrana de ILT-2 humano está sublinhado na Figu-ra 1a (SEQ ID NO: 1). Entretanto, esse não é o único meio de acoplar taispolipeptídeos à superfície das células. Por exemplo, proteínas de fusão quecompreendem um polipeptídeo da invenção ou fragmentos desse ligadosaos domínios transmembrana de outros polipeptídeos podem ser produzi-das. No caso de acoplar os polipeptídeos da invenção a partículas, isso po-de ser convenientemente obtido colocando os polipeptídeos da invenção quecompreendem um sinalizador C-terminal, tal como biotina, em contato compartículas revestidas com uma porção de ligação específica para o dito sina-lizador, tal como estreptavidina.

Uso Diagnóstico e Terapêutico

Em um aspecto, os polipeptídeos da invenção ou complexosmultivalentes desses podem ser rotulados com um composto de formaçãode imagem, por exemplo um rótulo que é adequado para fins diagnósticos.Tais polipeptídeos rotulados são úteis em um método para detectar molécu-las de pMHC alvo, cujo método compreende colocar a pMHC em contatocom um polipeptídeo da invenção ou complexo multivalente desse que seligue a pMHC; e detectar a dita ligação. Em complexos tetraméricos forma-dos, por exemplo, usando moléculas de polipeptídeo biotiniladas, estreptavi-dina fluorescente pode ser usada para fornecer um rótulo detectável. Taltetrâmero fluorescentemente rotulado é adequado para uso em análise deFACS, por exemplo, para detectar células que apresentam antígeno. Outramaneira na qual os peptídeos solúveis da presente invenção podem ser de-tectados é pelo uso de anticorpos, em particular anticorpos monoclonais.

Anticorpos ILT-específicos têm sido descritos na literatura. Porexemplo, IGH/75 é uma IgG ILT-2-específica que foi produzida no Basel Ins-titute for Immunology, Basel, Suíça (Riteau et ai, (2001) Int. Immunol. 13 (2)193).

Em um aspecto adicional, um polipeptídeo da presente invençãoou um complexo multivalente desse pode alternativamente ou adicionalmen-te estar associado a (por exemplo, ligado covalentemente ou de outra ma-neira) um agente terapêutico.

Em uma modalidade específica da invenção, o agente terapêuti-co é ligado covalentemente a terminação C do polipeptídeo.

Há vários agentes terapêuticos que poderiam estar associadosaos polipeptídeos da invenção. Por exemplo, o agente terapêutico pode seruma molécula imune efetora. Uma modalidade desse aspecto é fornecidaem que a molécula imune efetora é uma citocina. Como é conhecido por a-queles versados na técnica há várias citocinas que geralmente agem para"suprimir" respostas imunes. Polipeptídeos da invenção associados a taiscitocinas imunossupressoras formam modalidades preferidas da invenção.

Polipeptídeos da invenção associados a IL-4, IL-10 ou IL-13 ou uma varianteou fragmento fenotipicamente silencioso dessas citocinas fornecem modali-dades específicas da presente invenção.

Um complexo multivalente da invenção pode ter capacidade deligação aumentada para uma dada pMHC em comparação com um ILT não-multimérico selvagem ou o polipeptídeo de alta afinidade semelhante a ILTda invenção. Assim, os complexos multivalentes de acordo com a invençãosão particularmente úteis para rastrear ou atingir células que apresentamantígenos particulares in vitro ou in vivo e também são úteis como intermedi-ários para a produção de mais complexos multivalentes que tem tais usos.

Composições farmacêuticas que compreendem um polipeptídeoda invenção ou um complexo multivalente desse, ou uma pluralidade de cé-lulas que expressam tais polipeptídeos, junto com um veículo farmaceutica-mente aceitável, portanto, fornecem um aspecto adicional da invenção. Umamodalidade relacionada é fornecida pelo uso terapêutico de um polipeptídeoda invenção ou um complexo multivalente desse, ou uma pluralidade de cé-lulas que expressam tais polipeptídeos.

Composições farmacêuticas que compreendem um polipeptídeoda invenção ou um complexo multivalente desse associado a um agente te-rapêutico junto com um veículo farmaceuticamente aceitável fornecem por-tanto um aspecto adicional da invenção. Uma modalidade relacionada é for-necida pelo uso terapêutico de um polipeptídeo da invenção ou um comple-xo multivalente desse associado a um agente terapêutico.

Outro aspecto da invenção é fornecido pelo uso de um polipeptí-deo da invenção ou um complexo multivalente desse, ou um pluralidade decélulas ou partículas que expressam tais polipeptídeos, na produção de ummedicamento para tratamento de doença auto-imune, o dito medicamentosendo adaptado para administração parenteral. Vias de administração pa-renteral adequadas incluem as vias subcutânea, intradérmica ou intramuscu-lar.

Um aspecto adicional da invenção é fornecido pelo uso de umpolipeptídeo da invenção ou complexo multivalente desse associado a umagente terapêutico, na produção de um medicamento para tratamento dedoença auto-imune, o dito medicamento sendo adaptado para administraçãoparenteral. Vias de administração parenteral adequadas incluem as viassubcutânea, intradérmica ou intramuscular.

A invenção também fornece um método para liberar um agenteterapêutico a uma célula-alvo, cujo método compreende colocar as potenci-ais células alvo em contato com um polipeptídeo ou complexo multivalentede acordo com a invenção sob condições que permitem o acoplamento dopolipeptídeo ou complexo multivalente à célula-alvo, o dito polipeptídeo oucomplexo multivalente capaz de se ligar a uma dada molécula de pMHCClasse I e que tem o agente terapêutico associado a ele.

Um agente terapêutico poderia ser liberado tal que ele exerces-se seu efeito localmente, não apenas sobre a célula em que ele se ligou di-retamente. Assim, uma estratégia particular contempla moléculas "imunos-supressoras" ligadas a um polipeptídeo ou complexo multivalente de acordocom a invenção específicas para antígenos tumorais.

Polipeptídeos solúveis ou complexos multivalentes da invençãopodem ser ligados a uma enzima capaz de converter um pró-fármaco em umfármaco. Isso permite que o pró-fármaco seja convertido no fármaco apenasno sítio onde ele é necessário (isto é, direcionado pelo dito polipeptídeo oucomplexo multivalente).

É esperado que os polipeptídeos e complexos multivalentes aquidescritos possam ser usados em métodos para o diagnóstico e tratamentode doença auto-imune.

A invenção também fornece um método de tratamento de doen-ça auto-imune que compreende administrar a um indivíduo que sofre de taldoença auto-imune uma quantidade eficaz de um polipeptídeo da invençãoou complexo multivalente desse, ou uma pluralidade de células ou partículasque apresentam pelo menos um tal polipeptídeo. Em uma modalidade rela-cionada, a invenção fornece o uso de um polipeptídeo da invenção ou com-plexo multivalente desse, ou uma pluralidade de células ou partículas queapresentam pelo menos um tal polipeptídeo, na preparação de uma compo-sição para tratamento de doença auto-imune.

A invenção também fornece um método de tratamento de doen-ça auto-imune que compreende administrar a um indivíduo que sofre de taldoença auto-imune uma quantidade eficaz de um polipeptídeo da invençãoou complexo multivalente desse associado a um agente terapêutico. Emuma modalidade relacionada, a invenção fornece o uso de um polipeptídeoda invenção ou complexo multivalente desse, associado a um agente tera-pêutico, na preparação de uma composição para tratamento de doença au-to-imune.

Polipeptídeos terapêuticos ou de formação de imagem de acor-do com a invenção, serão geralmente fornecidos como parte de uma com-posição farmacêutica estéril que normalmente incluirá um veículo farmaceu-ticamente aceitável. Essa composição farmacêutica pode estar em qualquerforma adequada (dependendo do método desejado de administrá-la ao paci-ente). Ela pode ser fornecida em forma de dosagem unitária, geralmenteserá fornecida em um recipiente selado e pode ser fornecida como parte deum kit. Tal kit incluiria normalmente (embora não necessariamente) instru-ções de uso. Ele pode incluir uma pluralidade das ditas formas de dosagemunitária.

A composição farmacêutica pode ser adaptada para administra-ção por qualquer via apropriada, por exemplo, parenteral, transdérmica ouvia inalatória, preferivelmente uma via parenteral (incluindo subcutânea, in-tramuscular ou o mais preferivelmente intravenosa). Tais composições po-dem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica de farmácia,por exemplo pela mistura do ingrediente ativo com o(s) veículo(es) ou exci-piente(s) sob condições estéreis.

As dosagens das substâncias da presente invenção podem vari-ar dentro de limites amplos, dependendo da doença ou distúrbio a ser trata-do, da idade e da condição do indivíduo a ser tratado, etc. e em última análi-se o médico determinará as dosagens apropriadas a serem usadas.

Aspectos Adicionais

Um polipeptídeo ou complexo multivalente da presente invençãopode ser fornecido em forma substancialmente pura, ou como preparaçãopurificada ou isolada. Por exemplo, ela pode ser fornecida em uma formaque é substancialmente livre de outras proteínas.

Modalidades adicionais são fornecidas por um ácido nucléicoisolado que codifica os polipeptídeos da invenção, vetores que incorporamtal ácido nucléico e células que contem tais vetores. O ácido nucléico quecodifica o polipeptídeo da invenção pode ser um que tenha sido adaptadopara alto nível de expressão em uma célula hospedeira. Há várias empresasque oferecem tal otimização de ácido nucléico como um serviço, por exem-pio, GeneArt, Alemanha.

A invenção também fornece um método de identificar uma vari-ante de alta afinidade de uma dada molécula de ILT que tem a propriedadede se ligar a uma dada pMHC Classe I, CARACTERIZADO EM QUE o tipopolipeptídeo tem um Kd para a dita dada pMHC Classe I de menos do queou igual a 1 μΜ e/ou "off rate" (koft) para a dita dada molécula de pMHCClasse I de 2 S"1 ou mais lento E o dito polipeptídeo tem pelo menos 45% deidentidade e/ou 55% de similaridade com SEQ ID NO: 7 E o dito polipeptídeoinibe a ligação de CD8 a dada pMHC em um grau maior do que o polipeptí-deo SEQ ID NO: 3, o dito método compreendendo:

(a) A produção de uma biblioteca de moléculas ILT que compre-endem uma ou mais mutações na seqüência de aminoácidos em compara-ção às moléculas de ILT selvagens correspondentes; e(b) Colocar as ditas moléculas de ILT mutadas em contato com apMHC Classe I alvo sob condições adequadas para permitir a ligação damolécula de ILT mutada a pMHC Classe I alvo; e

(c) Medir o Kd e/ou koff e da interação; e

(d) Selecionar o(s) polipeptídeo(s) com as características de li-gação desejadas.

A apresentação em fago de polipeptídeos de ILT e/ou polipeptí-deos semelhantes a ILT fornece um método de gerar uma biblioteca de poli-peptídeos adequada para uso no método acima.

Um aspecto final é fornecido pelo método de produzir um poli-peptídeo da invenção que compreende:

(i) transformar uma célula hospedeira com um vetor que incorpo-ra o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo da invenção; e

(ii) cultivar as células transformadas sob condições adequadaspara expressão de um polipeptídeo da invenção; e

(iii) recuperar o polipeptídeo expresso.

Modalidades específicas do presente aspecto são fornecidas emque as células hospedeiras são células de E. coli ou células de levedura, porexemplo células de Pichia pastoris. Os exemplos 1 a 3 e 7 a 8 aqui contidosfornecem metodologias detalhadas para a produção de polipeptídeos da in-venção em células de E. colie Pichia pastoris respectivamente.

Características preferidas de cada aspecto da invenção são paracada um dos outros aspectos mutatis mutandis.Os documentos da técnicaanterior mencionados aqui estão incorporados em sua extensão mais com-pleta permitida por lei.

Exemplos

A invenção ainda é descrita nos seguintes exemplos, que nãolimitam o escopo da invenção de nenhuma maneira.

Referência é feita a seguir às figuras anexas nas quais:

Figura 1a fornece a seqüência de aminoácidos completa de umILT-2 humano selvagem (SEQ ID No: 1). Os aminoácidos destacados mos-tram resíduos desse polipeptídeo que diferem dos resíduos correspondentesda isoforma 1 de ILT-2 humano selvagem. Os aminoácidos do domíniotransmembrana estão sublinhados.

Figura 1b fornece a seqüência de DNA completa de um ILT-2humano tipo selvagem (SEQ ID No:2) que codifica a seqüência de aminoá-cidos da Figura 1a. A seqüência de DNA corresponde àquele acesso de Nu-cleotídeo do NCIMB NO: NM-006669.

Figuras 2a e 2b, respectivamente, fornecem a seqüência de a-minoácido e de DNA de uma forma solúvel de dois domínios das seqüênciasde ILT-2 selvagens fornecidas nas figuras 1a e 1b. Essas seqüências trun-cadas contêm/codificam apenas domínios extracelulares Dl e D2 de ILT-2.(SEQ ID No: 3 e SEQ ID No: 4, respectivamente).

Figura 3 fornece a seqüência de DNA completa inserida no vetora base de pGMT7 a fim de expressar a forma solúvel de dois domínios dopolipeptídeo de ILT-2 selvagem da Figura 2a. As seqüências de reconheci-mento de enzima de restrição Hindlll e Ndel estão sublinhadas.

Figuras 4a a 4d (SEQ ID Nos 6-9) fornecem as seqüências deaminoácido de polipeptídeos semelhantes a ILT de alta afinidade solúveis dedois domínios. Os resíduos que foram mutados em relação àqueles da Figu-ra 2a estão destacados.

Figuras 5a a 5d (SEQ ID Nos 10-13) fornecem as seqüências deDNA inseridas em um vetor derivado de pGMT7 a fim de expressar os poli-peptídeos semelhantes a ILT de alta afinidade solúveis de dois domíniosmostrados nas Figuras 4a a 4d respectivamente. Os códons que foram mu-tados em relação àqueles da Figura 3 estão destacados e as seqüências dereconhecimento de enzima de restrição Hindlll e Ndel estão sublinhados.

Figura 6 fornece a seqüência de DNA de um vetor derivado depGMT7 no qual as seqüências das Figuras 5a a 5d podem ser inseridas.

Figura 7 fornece o mapa do plasmídeo de um vetor derivado depGMT7 no qual as seqüências de DNA das Figuras 5a a 5d podem ser inse-ridas.

Figura 8a fornece a seqüência de aminoácidos de um polipeptí-deo semelhante a ILT de alta afinidade de dois domínios (c20) solúvel.Figura 8b fornece a seqüência de aminoácidos de um polipeptí-deo semelhante a ILT de alta afinidade de dois domínios (c50) solúvel.

Figura 8c fornece a seqüência de aminoácidos de um polipeptí-deo semelhante a ILT de alta afinidade de dois domínios (c50) solúvel quetem um resíduo de cisteína adicionado na terminação C desse.

Figura 9a fornece a seqüência de DNA que codifica um polipep-tídeo semelhante a ILT de alta afinidade de dois domínios (c20) solúvel quetem uma cisteína que codifica um códon adicionado à extremidade 5' desse.Essa seqüência de DNA foi otimizada para expressão em Pichia pastoris eincorpora os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição SnaBI e Notlque estão sublinhados.

Figura 9b fornece a seqüência de aminoácidos de um polipeptí-deo semelhante a ILT de alta afinidade de dois domínios (c20) solúvel quetem um resíduo de cisteína adicionado à terminação C desse codificado pelaseqüência de DNA da Figura 9a.

Figura 10 fornece a curva de resposta Biacore gerada para ainteração de um polipeptídeo semelhante a ILT de alta afinidade de dois do-mínios (c20) solúvel expresso em Pichia pastoris e MHC Classe I.

Figura 11 fornece a curva de resposta Biacore gerada para ainteração de um dímero de polipeptídeo semelhante a ILT de alta afinidadede dois domínios (c20) solúvel e Tax-HLA-A*0201.

Figura 12 fornece a curva de resposta Biacore gerada para ainteração de um tetrâmero de polipeptídeo semelhante a ILT de alta afinida-de de dois domínios (c20) solúvel e Tax-HLA-A*0201.

Figuras 13a - 13bh fornecem as seqüências de aminoácido depolipeptídeos semelhantes a ILT de alta afinidade de dois domínios adicio-nais.

Figura 14 fornece dados de ELISPOT mostrando a inibição daativação de CLT por monômeros e dímeros semelhantes a ILT de alta afini-dade (c50).

Figura 15 fornece dados de ELISPOT mostrando a inibição daativação de CLT por monômeros, dímeros e tetrâmeros semelhantes a ILTde alta afinidade (c50).

Exemplo 1 - Produção de uma molécula de ILT-2 selvagem solúvel quecompreende os domínios 1 e 2.

Figura 3 (SEQ ID NO: 5) fornece a seqüência de DNA usadapara expressar uma ILT-2 solúvel tipo selvagem que contém apenas os do-mínios Dl e D2. Essa seqüência de DNA foi sintetizada de novo por umaempresa de pesquisa contratada, GeneArt (Alemanha). Os sítios de reco-nhecimento de enzimas de restrição (Ndel e Hindlll) foram introduzidos nes-sa seqüência de DNA a fim de facilitar a ligação da seqüência de DNA emum plasmídeo de expressão a base de pGMT7, que contém o promotor T7para alto nível de expressão na cepa BL21-DE3(pLysS) de E. coli (Pan et ai,Biotechniques (2000) 29 (6): 1234-8).

Essa seqüência de DNA está ligada em um vetor pGMT7 corta-do com Ndel e Hindlll. (Veja a Figura 6 para a seqüência de DNA desse ve-tor e a Figura 7 para o mapa de plasmídeo desse vetor).

Sítios de reconhecimento de enzima de restrição conforme intro-duzidos no DNA que codifica o polipeptídeo de ILT-2 selvagemNdel- CATATGHindlll- AAGCTT

Ligação

O DNA de ILT-2 cortado e o vetor cortado são ligados usandoum kit de ligação rápida de DNA (Roche) seguindo as instruções do fabrican-te.

Os plasmídeos ligados são transformados em células competen-tes da cepa XL1-blue de E. coli e plaqueadas sobre placas de LB/ágar con-tendo 100 mg/ml de ampicilina. Após a incubação durante a noite a 37°C,colônias isoladas são selecionadas e cultivadas em 10 ml de LB contendo100 mg/ml de ampicilina durante a noite a 37°C com agitação. Os plasmí-deos clonados são purificados usando um kit Miniprep (Qiagen) e o inserto éseqüenciado usando um seqüenciador automático de DNA (Lark Technologies).

Figura 2a mostra a seqüência de aminoácidos do polipeptídeode ILT-2 selvagem solúvel produzido a partir da seqüência de DNA da Figura 2b.

Exemplo 2 - Produção de variantes de alta afinidade do polipeptídeo de ILT-2 selvagem solúvel

O polipeptídeo de ILT-2 tipo selvagem solúvel produzido confor-me descrito no Exemplo 1 pode ser usado como um molde a partir do qualsão produzidos os polipeptídeos da invenção que tem uma afinidade aumen-tada e/ou "off rate" mais lenta para moléculas de pMHC Classe I.

Como é conhecido por aqueles versados na técnica, as altera-ções de códon necessárias requeridas para produzir essas cadeias mutadaspodem ser introduzidas no DNA que codifica o polipeptídeo de ILT-2 selva-gem solúvel por mutagênese direcionada ao sítio (QuickChange™ Site Di-rected Mutagenesis Kit de Stratagene).

Resumidamente, isso é obtido pelo uso de iniciadores que incor-poram a(s) alteração(ões) de códon desejada(s) e os plasmídeos que con-têm o DNA que codifica o polipeptídeo solúvel de ILT-2 selvagem como ummolde para a mutagênese.

A mutagênese foi realizada usando as seguintes condições: 50ng de molde de plasmídeo, 1μΙ de dNTP 10 mM, 5 μΙ de tampão Pfu DNApolimerase 10 χ como suprido pelo fabricante, 25 pmols de iniciador de sen-tido direto, 25 pmol de iniciador de sentido reverso, 1μΙ de pfu DNA polime-rase em um volume total de 50 μΙ. Após uma etapa inicial de desnaturaçãode 2 min a 95°C, a reação foi submetida a 25 ciclos de desnaturação (95°C,10 seg.), anelamento (55°C, 10 seg) e alongamento (72°C, 8 min). O produtoresultante foi digerido com a enzima de restrição Dpnl para remover o plas-mídeo de molde e transformado na cepa XL1-blue de E. coli. A mutagênesefoi verificada por seqüenciamento.

As seqüências amino dos polipeptídeos semelhantes a ILT mu-tados que demonstraram alta afinidade para o complexo YLSGANLNL (SEQID NO: 15) -HLA-A*0201 estão listadas nas Figuras 4a a 4d (SEQ ID Nos: 6a 9) e Figuras 13a a 13bh (SEQ ID NOS: 21 a 80). Como é conhecido poraqueles versados na técnica na técnica, as alterações de códon necessáriasrequeridas para produzir esses polipeptídeos mutados podem ser introduzi-das no DNA que codifica o polipeptídeo de ILT-2 selvagem solúvel por mu-tagênese direcionada ao sítio (QuickChange® Site Directed Mutagenesis Kitde Stratagene).

Exemplo 3 - Expressão, redobramento e purificação de polipeptídeos solú-veis

O plasmídeo de expressão que contém os polipeptídeos de ILTconforme preparados nos Exemplos 1 ou 2 são transformados separada-mente na cepa de E. coli Rosetta DE3pLysS e colônias isoladas resistentesa ampicilina/cloranfenicol são cultivadas a 37°C em meio TYP (100 pg/ml deampicilina, 15pg/ml de cloranfenicol) por 7 horas antes da indução de ex-pressão de proteína com 0,5 mM de IPTG. As células são coletadas 15 ho-ras após a indução por centrifugação por 30 minutos a 4000 rpm em umBeckman J-6B. Os precipitados de célula são ressuspensos em um tampão,as células ressuspensas são sonicadas em pulsos de 1 min por um total decerca de 10 minutos em um sonicador Milsonix XL2020 usando uma sondapadronizada de 12 mm de diâmetro. Os precipitados de corpo de inclusãosão recuperados por centrifugação por 10 minutos a 4000 rpm em uma cen-trífuga Beckman J2-21. Três lavagens com detergente são então realizadaspara remover os restos celulares e componentes de membrana. A cada vezo precipitado de corpo de inclusão é homogeneizado um tampão Triton (Tris-HCI 50 mM, 0,5% de Triton-Xl 00, NaCI 200 mM, NaEDTA 10 mM, 0,1 %(p/v) de NaÁzida, DTT 2 mM, pH 8.0) antes de ser precipitado por centrifu-gação por 15 minutos a 4000 rpm em uma Beckman J2-21. Detergente e salsão então removidos por uma lavagem similar no seguinte tampão: Tris-HCI50 mM, NaEDTA 1 mM, 0,1% (p/v) de NaAzida, DTT 2 mM, pH 8.0. Final-mente, os corpos de inclusão são divididos em alíquotas de 60 mg e conge-lados a -70°C. O rendimento de proteína no corpo de inclusão é quantificadopor solubilização guanidina-HCI 6M e medido usando um espectrômetro UV.

Aproximadamente 60 mg de corpos de inclusão solubilizadoscom polipeptídeo de ILT em são descongelados dos estoques congelados ediluídos em 15 ml de uma solução de guanidina (cloridrato de guanidina 6M,Acetato de Sódio 10 mM, EDTA 10 mM), para assegurar a desnaturaçãocompleta da cadeia. A solução de guanidina contendo o polipeptídeo de ILTcompletamente reduzido e desnaturado é então injetada em 1 litro do se-guinte tampão de redobramento: Tris 100 mM, pH 8.5, L-Arginina 400 mM,EDTA 2 mM, Cisteamina reduzida 5 mM, 2-mercaptoetilamina 0,5 mM, uréia5M. O par redox (2-mercaptoetilamina e cisteamina) (em concentrações fi-nais de 6,6 M e 3,7 mM, respectivamente) é adicionado aproximadamente 5minutos antes da adição do polipeptídeo de ILT desnaturado. A solução édeixada por 30 minutos. O polipeptídeo de ILT redobrado foi dialisado emuma membrana Spectrapor 1 (Spectrum; Produto No. 132670) contra 10 Lde Tris 10 mM pH 8.1 a 5°C ± 3°C por 18-20 horas. Após esse tempo, otampão de diálise é trocado por Tris 10 mM novo, pH 8.1(10 L) e a diálise écontinuada a 5°C ± 3°C por outras 20-22 horas.

O polipeptídeo de ILT solúvel é separado dos produtos de de-gradação e impurezas pela aplicação do redobrado dialisado em uma colunade troca de ânion POROS 50HQ e eluição da proteína ligada com um gradi-ente de 0-500 mM de NaCI sobre 50 volumes de coluna usando um purifica-dor Akta (Pharmacia). As frações de pico são armazenadas a 4°C e analisa-das por SDS-PAGE corado com Coomassie antes de serem agrupadas econcentradas. Finalmente, o polipeptídeo de ILT solúvel é purificado e carac-terizado usando uma coluna de filtração em gel Superdex 200HR pré-equilibrada em tampão HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7.4, NaCI 150 mM, ED-TA 3,5 mM, 0,05% de nonidet p40). O pico que elui em um peso molecularrelativo de aproximadamente 27 kDa é agrupado e concentrado antes dacaracterização por análise de ressonância de plasmônio de superfície Biacore.

Exemplo 4 - Caracterização por ressonância de plasmônio de superfície Bi-acore da ligação de moléculas de ILTsolúveis a moléculas de pMHC

Um biossensor de ressonância de plasmônio de superfície (Bia-core 3000®) foi usado para analisar a ligação de moléculas de ILT solúveis apMHC Classe I. Isso foi facilitado pela produção de pMHC biotinilada solúvel(descrito abaixo) que foi imobilizada a uma superfície de ligação revestidacom estreptavidina de uma maneira semi-orientada, possibilitando o testeeficiente da ligação de uma molécula solúvel de ILT com até quatro pMHCdiferentes (imobilizadas em células de fluxo separadas) simultaneamente.Injeção de pMHC permite o nível preciso de moléculas de Classe I imobiliza-das serem manipuladas facilmente.

HLA-À*0201 classe I biotinilado solúvel carregado com um pep-tídeo YLSGANLNL (SEQ ID NO: 15) derivado de CEA foi redobrado in vitro apartir de corpos de inclusão expressos em bactéria contendo as proteínas desubunidade constituintes e peptídeo sintético, seguida pela purificação e bio-tinilação enzimática in vitro (0'Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). A cadeia pesada de MHC foi expressa com um sinalizador de biotinila-ção C-terminal que substitui os domínios transmembrana e citoplasmático daproteína em um construto apropriado. Os níveis de expressão de corpos deinclusão de -75 mg/litro de cultura bacteriana foram obtidos. A cadeia levede MHC ou p2-microglobulina também foi expressa como corpos de inclusãoem E.coli a partir de um construto apropriado, em um nível de -500 mg/litrode cultura bacteriana.

As células de E. coli foram Iisadas e os corpos de inclusão sãopurificados para aproximadamente 80% de pureza. A proteína dos corpos deinclusão foi desnaturada em guanidina-HCI 6 M, Tris 50 mM pH 8.1, NaCI100 mM, DTT IO mM, EDTA 10 mM, e foi redobrada em uma concentraçãode 30 mg/litro de cadeia pesada, 30 mg/litro de 32m em L-Arginina-HCI 0,4M, Tris 100 mM pH 8.1, cisteamina 3,7 mM, β-cisteamina 6,6 mM, 4 mg/mldo peptídeo necessário a ser carregado pela MHC, pela adição de um pulsoúnico de proteína desnaturada em tampão de dobramento a < 5°C. O redo-bramento foi deixado se completar a 4°C por pelo menos 1 hora.

O tampão foi trocado por diálise em 10 volumes de Tris 10 mMpH 8.1. Duas trocas de tampão foram necessárias para reduzir suficiente-mente a força iônica da solução. A solução de proteína foi então filtrada a-través de um filtro de acetato de celulose de 1,5 μιτι e aplicada em uma co-luna de troca de ânion POROS 50HQ (volume do leito de 8 ml). A proteínafoi eluída com um gradiente linear de 0-500 mM de NaCI. O complexo HLA-A2-peptídeo solúvel biotinilado foi eluído em aproximadamente 250 mM deNaCI, e as frações de pico foram coletadas, um coquetel de inibidores deprotease foi adicionado (CaIbiochem) e as frações foram resfriadas sobregelo.

pMHC de biotinilação sinalizadas foram trocadas de tampão emTris 10 mM pH 8.1, NaCI 5 mM, usando uma coluna de dessalinização rápi-da Pharmacia equilibrada no mesmo tampão. Imediatamente após eluição,as frações contendo proteínas foram resfriadas em gelo e um coquetel deinibidor de protease (CaIbiochem) foi adicionado. Reagentes de biotinilaçãoforam então adicionados: biotina 1 mM, ATP 5 mM (tamponado para pH 8),MgCl2 7,5 mM, e 5 pg/ml de enzima BirA (purificado de acordo com O1CaIIa-ghan et al. (1 999) Anal. Biochem. 266: 9-10 15). A mistura foi então deixadaincubar em temperatura ambiente durante a noite.

pMHC biotiniladas foram purificadas usando cromatografia defiltração em gel. Uma coluna Superdex 75 HR 10/30 de Pharmacia foi pré-equilibrada com PBS filtrado e 1 ml da mistura de reação de biotinilação foiaplicada e a coluna foi desenvolvida PBS a 0,5 ml/min. pMHC biotiniladaeluiu como um único pico a aproximadamente 15 ml. As frações contendoproteína foram agrupadas, resfriadas em gelo, e coquetel de inibidor de pro-tease foi adicionado. A concentração de proteína foi determinada usando umensaio de ligação de Coomassie (PerBio) e alíquotas de pMHC de biotinila-ção foram armazenadas a -20°C. Estreptavidina foi imobilizada por métodosde acoplamento de amina usuais.

Tais pMHC imobilizadas são capazes de ligar-se a receptores decélulas T solúveis e ao co-receptor CD8aa, assim como a moléculas de ILT,e essas interações podem ser usadas para garantir que as pMHC imobiliza-das sejam redobradas corretamente.

As interações entre uma molécula de ILT solúvel e YLSGANLNL(SEQ ID NO: 15) derivado de CEA-HLA-A*0201, cuja produção é descritaacima, foram analisadas em um biossensor de ressonância de plasmônio desuperfície (SPR) Biacore 3000™. SPR mede alterações no índice refrativoexpresso em unidades de resposta (RU) próximas a uma superfície do sen-sor dentro de uma pequena célula de fluxo, um princípio que pode ser usadopara detectar interações de Iigante e receptor e para analisar sua afinidade eparâmetros cinéticos. As células de fluxo de sonda foram preparadas pelaimobilização de complexos de pMHC nas células de fluxo através de ligaçãode sinalizador de biotina. O ensaio foi então realizado pela passagem de ILTsolúvel sobre as superfícies das diferentes células de fluxo em uma taxa defluxo constante, medindo-se a resposta de SPR ao fazê-lo.Medição da Constante de Ligação de Equilíbrio

Diluições seriadas de moléculas de ILT solúveis foram prepara-das e injetadas em uma taxa de fluxo constante de 5 μΙ min"1 por duas célu-las de fluxo diferentes; uma revestida com -500 RU do complexo -HLA-A*0201 específico, e a segunda foi deixada vazia como um controle. A res-posta foi normalizada para cada concentração usando a medição da célulade controle. A resposta dos dados normalizados foi plotada versus a concen-tração da amostra de ILT e ajustada para uma hipérbole a fim de calcular aconstante de ligação de equilíbrio, Kd (Price & Dwek, Principies and Pro-blems in Physical Chemistry for Biochemists (2§ Edição) 1979, ClarendonPress, Oxford).

Medição dos Parâmetros Cinéticos

Kd de ILTs solúveis de alta afinidade foi determinado medindo-se experimentalmente a constante da taxa de dissociação, kd, e a constanteda taxa de associação, ka. A constante de equilíbrio, Kd foi calculada comokd/ka.

Moléculas semelhantes a ILT de alta afinidade foram injetadaspor duas células de fluxo diferentes, uma revestida com -300 RU de com-plexo de YLSGANLNL (SEQ ID NO: 15) derivado de CEA-HLA-A*0201, e asegunda foi deixada vazia como um controle. A taxa de fluxo foi ajustada a50 μl/min. Tipicamente, 250 μΙ de polipeptídeo de ILT a -3 μΜ foram injeta-dos. Tampão foi então circulado até que a resposta retornou para o nívelbasal. Os parâmetros cinéticos foram calculados usando o programa Biaeva-luation. A fase de dissociação também foi ajustada para uma equação dedecaimento exponencial permitindo o calculo da meia vida.Resultados

A interação entre uma variante solúvel de ILT-2 tipo selvagem eo complexo YLSGANLNL derivado de CEA-HLA-A*0201 foi analisada usan-do os métodos acima e demonstrou um K0 de aproximadamente 6 μΜ. Asmoléculas semelhantes a ILT que têm as seqüências de aminoácido forneci-das nas Figuras 4a a 4d (SEQ ID Nos: 6 a 9), e nas Figuras 13a a13bh (SEQID NOS: 21 a 80) tem um KD de menos do que ou igual a 1 μΜ e de 2 S1 oumais lento.

Exemplo 5 - Análise de ressonância de plasmônio de superfície Biacore dainibição mediada porlTL solúvel da interação de pMHC/CD8

Um biossensor de ressonância de plasmônio de superfície (Bia-core 3000®) é usado para analisar a inibição mediada por ILT solúvel da inte-ração de pMHC/CD8. Isso é facilitado pela produção de complexos de p-MHC solúveis (descrito abaixo) e moléculas de CD8aa solúveis biotiniladas(também descritas abaixo). As moléculas de CD8aa solúveis biotiniladas sãoimobilizadas a uma superfície de ligação revestida com estreptavidina de"Biacore chip" de uma forma semi-orientada, permitindo o teste eficaz daligação de complexos de pMHC solúveis ao CD8aa solúvel imobilizado. Ainjeção de moléculas de CD8aa solúvel biotiniladas permite que o nível exa-to de moléculas de CD8aa imobilizadas seja facilmente manipulado.

pMHC HLA-A*0201 solúvel carregado com um peptídeo YLS-GANLNL (SEQ ID NO: 15) derivado de CEA são produzidos usando os mé-todos substancialmente conforme descrito em (Garboczi et. ai, (1992) PNASUSA 89 3429-3433). As moléculas de pMHC são redobradas in vitro a partirde corpos de inclusão expressos em E. coli contendo as proteínas de subu-nidades constituintes e peptídeo sintético e então purificadas. A cadeia levede MHC ou p2-microglobulina também é expressa como corpos de inclusãoem E. coli a partir de um construto apropriado, em um nível de ~ 500mg/litrode cultura bacteriana.

As células de E. coli são Iisadas e os corpos de inclusão sãopurificados e as proteínas super-expressas são redobradas e purificadasusando os métodos detalhados no Exemplo 4 exceto que as etapas de bioti-nilação são omitidas.

As moléculas de CD8 solúveis biotiniladas são produzidas con-forme descrito nos Exemplos 1 e 6 de EP1024822. Resumidamente, o CD8asolúvel contendo um sinalizador de biotinilação é expresso como corpos deinclusão em E. coli e então purificado e redobrado para produzir homodíme-ros de CD8aa contendo uma seqüência de sinalização que pode ser biotini-Iada enzimaticamente (Schatz, (1993) Biotechnology NY 11: 1138-43). Abiotinilação das moléculas de CD8a sinalizadas é então obtida usando a en-zima BirA (O1CaIIaghan1 etal. AnaIBiocIzern 266(1): 9-15 (1999)). Os rea-gentes de biotinilação são: biotina 1 mM, ATP 5 mM (tamponado para pH 8),MgCI2 7,5 mM e 5 Mg/ml de enzima BirA (purificada de acordo com O1CaIIa-ghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-1 5). A mistura é então deixada in-cubar em temperatura ambiente durante a noite.

O sCD8aa biotinilado é imobilizado sobre a superfície de umchip Biacore revestido com estreptavidina produzindo uma alteração no índi-ce refrativo de 1000 unidades de resposta. Tais moléculas de CD8aa imobi-lizadas são capazes de ligar-se a complexos de pMHC que podem ser inje-tados na fase solúvel.

A habilidade das moléculas de ILT inibirem a interação de p-MHC/CD8 em um biossensor de ressonância de plasmônio de superfície(SPR) Biacore 3000™ é analisada como segue:

SPR mede alterações no índice refrativo expresso em unidadesde resposta (RU) próximo de uma superfície do sensor dentro de uma pe-quena célula de fluxo, um princípio que pode ser usado para detectar intera-ções entre o Iigante e o receptor e para analisar sua afinidade e parâmetroscinéticos. Os chips são preparados pela imobilização das moléculas deCD8aa biotiniladas solúveis a chips revestidos com estreptavidina comodescrito acima. Diluições seriadas de moléculas de ILT selvagem ou seme-lhantes a ILT de alta afinidade são preparadas e injetadas em uma taxa defluxo constante de 5 pl min"1 por uma célula de fluxo revestida com 1000 RUde CD8aa biotinilado na presença de uma concentração adequada de YLS-GANLNL (SEQ ID NO: 15) -HLA-A*0201 solúvel. A inibição das respostas deSPR para a interação de CD8aa/pMHC produzem uma curva dose-respostaque é usada para calcular um valor de IC50 para o peptídeo que está sendotestado para essa interação.

Exemplo 6 - Comparação da identidade e similaridade de seqüência de polipeptídeo.

O algoritmo de comparação proteína-proteína usado para gerardados de identidade e similaridade para esse pedido está disponível atravésda seguinte página da Internet.

http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www/cgi/search_frm2.cgi

O programa "FASTA: proteína: proteína DNA: DNA" disponívelnessa página da internet foi usado para realizar essas comparações. Os se-guintes parâmetros (padrão) foram usados:

Ktup: Ktup =2

Matriz de pontuação: Blosum 50

Gap: -10

Ext: -2

A fim de fazer as comparações necessárias, a seqüência de a-minoácidos do fragmento de ILT-2 em código de uma letra conforme forneci-do na Figura 4b (SEQ ID NO: 7) é digitado na primeira seqüência (consulta)e a seqüência de aminoácido para comparação a isto é digitada como a se-gunda seqüência (biblioteca). O algoritmo pode então ser aplicado e fornece-rá o percentual de pontuações de identidade e similaridade para o par deseqüências comparadas.

Como será óbvio para aqueles versados na técnica há váriasfontes de comparações proteína: proteína do FASTA que poderiam ser usa-das para essa análise.

Exemplo 7 - Produção de vetores de Pichia pastoris para a expressão depolipeptídeo semelhante a ILT c20 solúvel de alta afinidade.

A figura 9a (SEQ ID NO: 19) fornece a seqüência de DNA usadapara expressar um polipeptídeo semelhante a ILT c20 de alta afinidade con-tendo apenas os domínios D1 e D2 em Pichia pastoris. Essa seqüência deDNA que foi otimizada para expressão em Pichia foi sintetizada de novo poruma companhia de pesquisa contratada, GeneArt (Alemanha). Um códonque codifica cisteína foi adicionado à extremidade 3' iniciador desse DNA afim de fornecer um "sinalizador" na terminação-C do polipeptídeo semelhan-te a ILT expresso para facilitar a multimerização se necessário. Sítios de re-conhecimento de enzima de restrição (SnaBI e Notl) foram introduzidos den-tro dessa seqüência de DNA a fim de facilitar a ligação da seqüência deDNA dentro de um plasmídeo de expressão pPIC9K (Invitrogen).

Sítios de reconhecimento de enzima de restrição conforme introduzidos noDNA que codifica o polipeptídeo semelhante a ILT c20 solúvel de alta afinidade:

SnaBI - tacgta

Not 1 - gcggccgc

Ligação

A seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo semelhante aILT de alta afinidade foi ligado em um vetor pPIC9K (Invitrogen) cortado comas enzimas de restrição SnaBI e Notl usando um kit de ligação de DNA rá-pido (Roche).

Amplificação de Plasmídeo

Os plasmídeos ligados são transformados em XL1 blue (Strata-gene, Country) competentes e plaqueados sobre placas de ágar/LB conten-do 100 mg/ml de canamicina. Após incubação durante a noite a 37°C, colô-nias isoladas são retiradas e cultivadas em 100 ml de LB contendo 100mg/ml de canamicina durante a noite a 37°C com agitação. Os plasmídeosclonados são purificados usando um kit Midiprep (Qiagen) e o inserto é se-qüenciado usando um seqüenciador automático de DNA (Lark Technologies).

Figura 9b (SEQ ID NO: 20) mostra a seqüência de aminoácidosdos polipeptídeos semelhantes a ILT (c20) de dois domínios de alta afinida-de codificados pela seqüência de DNA da Figura 9a (SEQ ID NO: 19).

Exemplo 8 - Expressão e purificação de polipeptídeos semelhantes a ILTsolúveis de alta afinidade em Pichia Pastoris

O plasmídeo de expressão de Pichia pastoris contendo o DNAque codifica o polipeptídeo semelhante a ILT de afinidade conforme prepa-rado no Exemplo 7 foi transformados na cepa de Pichia pastoris GS 115 (In-vitrogen, USA) como segue:

Células GS115 de Pichia pastoris foram tornadas competentesusando um Kit Pichia EasyComp (Invitrogen). Esse kit usa PEG1000 paratornar as células competentes quimicamente.

O vetor contendo o DNA do polipeptídeo semelhante a ILT foilinearizado usando Sal I e transformado na cepa GS115 conforme descritono manual da Invitrogen,

Os transformantes contendo o DNA que codifica o polipeptídeosemelhante a ILT de alta afinidade foram selecionados pelo crescimento decélulas em placas de ágar RDB (Invitrogen). O ágar RDB não tem histidina,o que garante que apenas células de levedura que tenham sido transforma-das com sucesso com o plasmídeo pPIC9K irão crescer. O plasmídeopPIC9K confere a habilidade de crescer sobre o ágar-histidina pelo forneci-mento de uma cópia do gene HIS4 que permite o crescimento sobre meio-His.

Colônias isoladas foram retiradas da placa de ágar e cultivadasa 30°C em meio BMGY (Invitrogen) durante a noite antes de induzir a ex-pressão de proteína. A expressão de proteína foi induzida pela rotação dascélulas (2000 χ g, 10 min) e ressupensão em 200 ml de meio de induçãoBMMY (Invitrogen). As células foram colhidas 6 dias após a indução por cen-trifugação por 30 minutos a 2000 χ g. o sobrenadante foi concentrado atra-vés de filtração de fluxo tangencial (ponto de corte de 10 kDa de Sartorius)para 10 ml e purificado usando SEC (S200HR GE Healthcare).

As frações de pico são armazenadas a 4°C e analisadas porSDS-PAGE corado com Coomassie antes de serem agrupadas e concentra-das. Finalmente, o polipeptídeo semelhante a ILT de alta afinidade solúvel épurificado e caracterizado usando uma coluna de filtração em gel Superdex200HR pré-equilibrada em tampão HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7.4, NaCI150 mM, EDTA 3,5 mM, 0,05% de nonidet p40). O pico que elui em um pesomolecular relativo de aproximadamente 28 kDa é agrupado e concentradoantes da caracterização por análise de ressonância de plasmônio de super-fície Biacore usando os métodos detalhados no Exemplo 4.

Resultados

O polipeptídeo semelhante a ILT c20 de alta afinidade expressoem Pichia pastoris tinha um K0 de aproximadamente 100 -150 nM para MHCClasse I conforme determinado pelo método baseado em Biacore do exem-plo 4 (veja figura 10 para a curva de Biacore gerada usando o polipeptídeosemelhante a ILT c20 de alta afinidade produzido em Pichia. Isso se compa-ra a um Kd de aproximadamente 25 - 85 nM determinado para o polipeptídeosemelhante a ILT c20de alta afinidade produzido em E. colicorrespondente.

Exemplo 9 - Dimerização de polipeptídeos semelhantes a ILT usando umIigante MaI-PEG-MaI de 3,4 kd.

Polipeptídeos semelhantes a ILT c50 solúveis de alta afinidadecontendo um resíduo de cisteína adicional na terminação C foram prepara-dos usando os métodos detalhados nos Exemplos 1 a 3 (veja a figura 8b(SEQ ID NO: 17) para a seqüência de aminoácidos desse polipeptídeo). Ospolipeptídeos semelhantes a ILT foram reticulados usando maleimida-PEGbifuncional não-ramificada (MAL-PEG-MAL, MW 3.4KD, NOF Corporation,Japão). Os grupos de maleimida na terminação desse Iigante conferem aoIigante especificidade de ligação a tiol livre. Antes da reticulação o polipeptí-deo semelhante a ILT foi pré-tratado com um agente redutor, DTT 0,1 mM(temperatura ambiente, durante a noite), a fim de liberar a cisteína livre nopolipeptídeo semelhante a ILT solúvel. Essa baixa concentração de agenteredutor foi usada para reduzir seletivamente o resíduo de cisteína c-terminalexposto. O polipeptídeo semelhante a ILT solúvel foi então re-purifiçado porcromatografia de filtração em gel (Superdex 75) em tampão PBS. O polipep-tídeo semelhante a ILT foi então reconcentrado usando um concentrador demembrana centrífuga de ponto de corte de 10 kDa (VivaScience, Satorius).

A reticulação foi obtida pela adição em etapas de MAL-PEG-MAL (10 mMem DMF) em uma razão molar de aproximadamente 2:1 (proteína para reti-culador) e subseqüentemente incubando-se por 2 horas em temperaturaambiente. O produto foi então purificado usando uma coluna de filtração emgel Superdex 75 HR10/30 pré-equilibrada em PBS. Três picos foram obser-vados após a reticulação; deles, um correspondeu com a posição dos poli-peptídeos semelhantes a ILT "monoméricos" intactos correspondendo a es-pécie de massa molecular mais elevada. O material nos picos foi analisadoainda por SDS-PAGE.

Amostras dos três picos foram pré-tratadas com amostra detampão SDS padronizado (BioRad) sem DTT (não-redutor) ou com DTT 15mM (redutor) e foram corridas em um SDS-PAGE de gradiente 4-20% e co-radas com corante azul de Coomassie. Sob condições não-redutoras, o ma-terial nos três picos apareceu como a espécie reticulada (ILT—PEG—ILT),uma espécie intermediária (ILT—PEG) e ILT-2 não modificado, respectivamente.

A habilidade desses dímeros de polipeptídeo semelhante a ILTc50 solúvel de alta afinidade se ligarem a pMHC Classe I foi confirmada u-sando o método baseado em Biacore detalhado no Exemplo 4. Os dímerossemelhantes a ILT c50 solúveis de alta afinidade demonstraram uma meia-vida para dissociação de aproximadamente 30-86 minutos. Por comparação,o KD determinado por Biacore do polipeptídeo monomérico de ILT-2 c50solúvel correspondente foi de aproximadamente 6 seg. Isso demonstra cla-ramente a afinidade melhorada obtida pela dimerização. A Figura 11 fornecea curva de Biacore para a interação do dímero de polipeptídeo semelhante aILT c50 de alta afinidade e Tax-HLA-A*0201. Essa curva de Biacore tambémtem a linha de regressão adicionada que foi usada para calcular a meia-vidapara dissociação para essa corrida em particular (86 minutos).

Exemplo 10 - Tetramerização de polipeptídeos de ILT-2.

Polipeptídeos semelhantes a ILT c50 solúveis de alta afinidadeque contem um resíduo de cisteína adicional na terminação C foram tetra-merizados usando maleimida-PEG tetramérico (4arm MAL-PEG, MW 20KD,Sheanwater Corporation). Os grupos de maleimida sobre as terminaçõesdesse Iigante conferem ao Iigante especificidade de ligação a tiol livre. Antesda reticulação, os polipeptídeos semelhantes a ILT c50 solúveis de alta afi-nidade foram pré-tratados com um agente redutor, DTT 0,1 mM (temperaturaambiente, durante a noite), a fim de liberar a cisteína livre nos polipeptídeosde ILT-2 solúveis. Essa baixa concentração de agente redutor foi usada parareduzir seletivamente o resíduo de cisteína C-terminal exposto. Os polipeptí-deos semelhantes a ILT c50 solúveis de alta afinidade foram então re-purificados por cromatografia de filtração em gel (Superdex 75) em tampãoPBS. O polipeptídeo semelhante a ILT c50 solúvel de alta afinidade foi entãoreconcentrado usando um concentrador de membrana centrífuga de pontode corte de 10 kDa (VivaScience, Satorius). A tetramerização foi obtida pelaadição em etapas do 4arm MAL-PEG (10 mM em DMF) em uma proporçãomolar de aproximadamente 4:1 (proteína para reticulador) e subseqüenteincubação por 2 horas em temperatura ambiente. O produto foi então purifi-cado usando uma coluna de filtração em gel Superdex 75 HR10/30 pré-equilibrada em PBS. As frações eluidas foram analisadas ainda por SDS-PAGE.

Amostras das frações foram pré-tratadas com tampão de amos-tra de SDS padrão (BioRad) sem DTT (não-redutor) ou com DTT 15 mM (re-dutor) e foram corridas em um PAGE de gradiente 4-20% e coradas comcorante azul de Coomassie. Os géis de SDS-PAGE demonstraram que aespécie de polipeptídeo semelhante a ILT c50 solúvel de alta afinidade te-tramérico constituiu aproximadamente 50% da presente proteína.

A habilidade desses tetrâmeros se ligarem a pMHC Classe I foiconfirmada usando o método baseado em Biacore detalhado no Exemplo 4.Os tetrâmeros semelhantes a ILT c50 solúveis se ligaram tão fortemente aTax-HLA*0201 que foi impossível determinar o K0 aparente ou meia vidapara a dissociação da interação. Por comparação, a meia-vida determinadapor Biacore para dissociação da interação dos polipeptídeos de ILT-2 c50solúveis diméricos e monoméricos foi de 30-86 minutos e aproximadamente6 segundos, respectivamente. Isso demonstra claramente a afinidade melho-rada obtida pela tetramerização. A Figura 12 fornece a curva Biacore para ainteração do tetrâmero de polipeptídeo semelhante a ILT c50 solúvel de altaafinidade e Tax-HLA*A0201.

Exemplo 11 - Ensaio ELISPOT para avaliação de inibição in vitro da ativa-ção de célula T citotóxica (CTL) por monômeros, dímeros e tetrâmeros se-melhantes a ILTc50 de alta afinidade

O método a seguir fornece um meio de avaliar a habilidade demonômeros e complexos multi-valentes de polipeptídeo semelhante a ILTc50 solúvel de alta afinidade inibirem a ativação de célula T mediada peloco-receptor de CD8.

Reagentes:

Meio de Ensaio: FCS 10% (inativado por calor, Gibco, cat# 10108-165),RPMI 1640 88% (Gibco, cat# 42401-018), glutamina 1% (Gibco, cat# 25030-024) e 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco, cat# 15070-063).

Tampão de Lavagem: PBS 0,01 M/0,05% de Tween 20 (1 sachê de soluçãosalina tamponada com Fosfato com Tween 20, pH 7.4 de Sigma, Cat. # P-3563 dissolvido em 1 litro de água destilada dá uma composição final dePBS 0,01 M, NaCI 0,138 M, KCI 0,0027 M, 0,05 % de Tween 20).

PBS (Gibco, cat# 10010-015).

Kit Diaclone EIiSpot (IDS). O kit EIiSpot contem todos os outros reagentesnecessários, isto é, anticorpos de captura e de detecção, leite em pó desna-tado, BSA, estreptavidina-fosfatase alcalina, solução de BCIP/NBT (PVDFEli-manchas para IFN-γ humano com placas de 20 χ 96 cavidades (IDS cat#DC-856.051.020, DC-856.000.000)).

O método a seguir é baseado nas instruções dos fabricantes,fornecidas com cada kit, mas contem algumas alterações.

Método

100 μΙ de anticorpo de captura foram diluídos em 10 ml de PBSestéril por placa. 100 μΙ de anticorpo de captura diluído foram aliquotadosem cada cavidade e deixados durante a noite a 4°C, ou por 2h a temperatu-ra ambiente. As placas foram então lavadas três vezes com 450 μΙ de tam-pão de lavagem, lavador de placa de 96 cavidades Ultrawash (Thermo LifeSciences), para remover o excesso de anticorpo de captura. 100 μΙ de leiteem pó desnatado a 2% foram então adicionados a cada cavidade (um frascode leite em pó desnatado conforme fornecido com o kit EIiSpot foi dissolvidoem 50 ml de PBS estéril). As placas foram então incubadas a temperaturaambiente por duas horas antes de serem lavadas mais três vezes com 450μΙ de tampão de lavagem, lavador de placa de 96 cavidades Ultrawash(Thermo Life Sciences).

Células alvo Mel 624 e Mel 526 foram removidas dos seus fras-cos de cultura de tecido usando tripsina, lavadas uma vez por centrifugação(280 χ g por 10 minutos) em meio de ensaio e ressuspensas a 1 χ 106/ml nomesmo meio. 50 μΙ dessa suspensão foram então adicionados à placa deensaio para dar um número total de células alvo de 50.000 células/cavidade.

Um clone de célula T MART-1 específico (KA/C5) (linhagem decélula efetora) foi coletado por centrifugação (280 s g por 10 min) e ressus-penso a 1 χ 104/ml em meio de ensaio para dar 500 células/cavidade quando50 μΙ foram adicionados à placa de ensaio.

Monômero, dímero e tetrâmero de polipeptídeo semelhante aILT c50 solúvel de alta afinidade foram diluídos em meio de ensaio em umaconcentração de 3x para dar um final de 1x quando 50 μΙ foram adicionadosà placa em um volume final de 150 μΙ. A faixa de concentração de monôme-ro de ILT-2 testado foi de 10 μΜ-0,03 μΜ. A faixa de concentração de díme-ro e tetrâmero de ILT-2 testada foi de 1 μΜ-0,03 μΜ.

Cavidades contendo o seguinte foram então preparados (o vo-lume de reação final em cada cavidade foi de 100 μΙ):

Amostras de Teste (adicionadas em ordem)50 μΙ de células alvo Mel 624 ou Mel 526

50 μΙ da concentração desejada de monômero, tetrâmero ou dímero seme-lhante a ILT.

50 μΙ de células efetoras do clone de célula T.

ControlesNegativos

50 μΙ de células alvo

50 μΙ da concentração mais alta de monômero, dímero ou tetrâmero seme-lhante a ILT

50 μΙ de meio de ensaioOU

50 μΙ de células efetoras50 μl da concentração mais alta de monômero, dímero ou tetrâmero seme-lhante a ILT

50 μl de meio de ensaio

Controles Positivos

50 μl de células alvo Mel 624 ou Mel 526

50 μl de células efetoras

50 μl de meio de ensaio

OU

Para mostrar a dependência de CD8

50 μl de células alvo Mel 624 ou Mel 526

50 μl de células efetoras

50 μl contendo 100 pg/ml de anticorpo anti-CD8 HB230

As placas foram então incubadas durante a noite a 37°C/ 5% deCO2. As placas foram então lavadas seis vezes com tampão de lavagemantes de retirar o excesso de tampão. 550 μΙ de água destilada foram entãoadicionados a cada frasco de anticorpo de detecção fornecido com o kit E-LISPOT para preparar a solução diluída. 100 μΙ da solução de anticorpo dedetecção diluída foram então diluídos em 10 ml de PBS/BSA 1% por placa e100 μl da solução de anticorpo de detecção diluída foram aliquotados emcada cavidade. As placas foram então incubadas a temperatura ambientepor 90 minutos.

Após esse tempo, as placas foram lavadas três vezes com tam-pão de lavagem (três vezes com 450 μΙ de tampão de lavagem, lavador deplaca de 96 cavidades Ultrawash (Thermo Life Sciences) e secas tampadas.10 μl de estreptavidina-fosfatase alcalina foram então diluídos com 10 ml dePBS/BSA 1% por placa e 100 μΙ da estreptavidina diluída foram adicionadosa cada cavidade e incubados a temperatura ambiente por 1 h. As placas fo-ram então lavadas novamente três vezes com 450 μΙ de tampão de lavageme secas tampadas.

100 μl da solução de BCIP/NBT fornecida foram então adiciona-dos a cada cavidade e as placas foram cobertas com folha laminada e dei-xadas desenvolver por 5-15 min. As placas foram checadas regularmentedurante esse período para observar formação de manchas a fim de decidirquando terminar a reação.

As placas foram então lavadas cuidadosamente em água corren-te e agitadas antes de serem desmontadas e deixadas secar sobre a banca-da.

Uma vez secas, as placas foram lidas usando um leitor de E-LISPOT (Autoimmune Diagnostistika1 Alemanha).

O número de "spots" que apareceram em cada cavidade é pro-porcional ao número de células T ativadas. Portanto, qualquer diminuição nonúmero de "spots" nos cavidades contendo o monômero, dímero ou tetrâme-ro de polipeptídeo semelhante a ILT c50 solúvel de alta afinidade indica ini-bição da ativação de CTL mediada por co-receptor de CD8.

Resultados

Como mostrado na Figura 14, o polipeptídeo de ILT-2 c50 dealta afinidade é eficaz em inibir a ativação de CTL tanto nas formas mono-mérica como dimérica. O dímero semelhante a ILT c50 de alta afinidade éconsideravelmente mais eficaz em inibir a ativação de CTL do que o monô-mero correspondente. O tetrâmero c50 semelhante a ILT de alta afinidade émais eficaz ainda (veja Figura 15). Os valores de IC5o calculados a partir dosdados mostrados na Figura 15 para a inibição de CTLs pelos polipeptídeosmonomérico, dimérico e tetramérico semelhantes a ILT foram 800 nM, 16,2nM e 0,7 nM respectivamente.LISTAGEM DE SEQÜENCIA

<110> Avidex Ltd

Jakobsen, Bent KMoysey, Ruth KLi, Yi<120> Polipeptídeos<130> 75/MG<140> PCT/GB2006/001860<141> 2006-05-19<150> GB0510627.3<151> 2005-05-25<160> 80

<170> Versão 3.3 PatentIn

<210> 1

<211> 650

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Thr Pro Ile Leu Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly1 5 10 15

Pro Arg Thr His Val Gln Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp

20 25 30

Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg

35 40 45

Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys

50 55 60

Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys65 70 75 80

Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr

85 90 95

Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp100 105 110Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser

115 120 125

Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln

130 135 140

Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly145 150 155 .160

Glu Asp Glu His Pro Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly

165 170 175

Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg

180 185 190

Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp

195 200 205

Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys

210 215 220

Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu225 230 235 240

Thr-Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val

245 250 255

Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln

260 265 270

Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser

275 280 285

Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly305 310 315 320

Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val

325 330 335

Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met

340 345 350

Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg355 360 365Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met

370 375 380

Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser385 390 395 400

Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu

405 410 415

Leu Vál Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly

420 425 430

Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly

435 440 445

Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly

450 455 460

Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe465 470 475 480

Leu Ile Leu Árg His Arg Arg Glri Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln

485 490 495

Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro

500 505 510

Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln

515 520 525

Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly

530 535 540

Val Glu Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val545 550 555 560

Thr Tyr Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser

565 570 575

Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln

580 585 590

Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala

595 600 605

Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg610 615 620Lys Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val

Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His

<210> 2

<211> 2984<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 2

gaggaggaac agaaaagaaa agaaaagaaa aagtgggaaa caaataatct aagaatgagg 60

agaaagcaag aagagtgacc cccttgtggg cactccattg gttttatggc gcctctactt 120

tctggagttt gtgtaaaaca aaaatattat ggtctttgtg cacatttaca tcaagctcag 180

cctgggcggc acagccagat gcgagatgcg tctctgctga tctgagtctg cctgcagcat 240

ggacctgggt cttccctgaa gcatctccag ggctggaggg acgactgcca tgcaccgagg 300

gctcatccat ccacagagca gggcagtggg aggagacgcc atgaccccca tcctcacggt 360

cctgatctgt ctcgggctga gtctgggccc ccggacccac gtgcaggcag ggcacctccc 420

caagcccacc ctctgggctg aaccaggctc tgtgatcacc caggggagtc ctgtgaccct 480

caggtgtcag gggggccagg agacccagga gtaccgtcta tatagagaaa agaaaacagc 540

accctggatt acacggatcc cacaggagct tgtgaagaag ggccagttcc ccatcccatc 600

catcacctgg gaacatgcag ggcggtatcg ctgttactat ggtagcgaca ctgcaggccg 660

ctcagagagc agtgaccccc tggagctggt ggtgacagga gcctacatca aacccaccct 720

ctcagcccag cccagccccg tggtgaactc aggagggaat gtaaccctcc agtgtgactc 780

acaggtggca tttgatggct tcattctgtg taaggaagga gaagatgaac acccacaatg 840

cctgaactcc cagccccatg cccgtgggtc gtcccgcgcc atcttctccg tgggccccgt 900

gagcccgagt cgcaggtggt ggtacaggtg ctatgcttat gactcgaact ctccctatga 960

gtggtctcta cccagtgatc tcctggagct cctggtccta ggtgtttcta agaagccatc 1020

actctcagtg cagccaggtc ctatcgtggc ccctgaggag accctgactc tgcagtgtgg 1080

ctctgatgct ggctacaaca gatttgttct gtataaggac ggggaacgtg acttccttca 1140

gctcgctggc gcacagcccc aggctgggct ctcccaggcc aacttcaccc tgggccctgt 1200

gagccgctcc tacgggggcc agtacagatg ctacggtgca cacaacctct cctccgagtg 1260

gtcggccccc agcgaccccc tggacatcct gatcgcagga cagttctatg acagagtctc 1320

cctctcggtg cagccgggcc ccacggtggc ctcaggagag aacgtgaccc tgctgtgtca 1380gtcacaggga tggatgcaaa ctttccttct gaccaaggag ggggcagctg atgacccatg 1440

gcgtctaaga tcaacgtaçc aatctcaaaa ataccaggct gaattcccca tgggtcctgt 1500

gacctcagcc catgcgggga cctacaggtg ctacggctca cagagctcca aaccctacct 1560

gctgactcac cccagtgacc ccctggagct cgtggtctca ggaccgtctg ggggccccag 1620

ctccccgaca acaggcccca cctccacatc tggccctgag gaccagcccc tcacccccac 1680

cgggtcggat ccccagagtg gtctgggaag gcacctgggg gttgtgatcg gcatcttggt 1740

ggccgtcatc ctactgctcc tcctcctcct cctcctcttc ctcatcctcc gacatcgacg 1800

tcagggcaaa cactggacat cgacccagag aaaggctgat ttccaacatc ctgcaggggc 1860

tgtggggcca gagcccacag acagaggcct gcagtggagg tccagcccag ctgccgatgc 1920

ccaggaagaa aacctctatg ctgccgtgaa gcacacacag cctgaggatg gggtggagat 1980

ggacactcgg agcccacacg atgaagaccc ccaggcagtg acgtatgccg aggtgaaaca 2040

ctccagacct aggagagaaa tggcctctcc tccttcccca ctgtctgggg aattcctgga 2100

cacaaaggac agacaggcgg aagaggacag gcagatggac actgaggctg ctgcatctga 2160

agccccccag gatgtgacct acgcccagct gcacagcttg acccttagac ggaaggcaac 2220

tgagcctcct ccatcccagg aagggccctc tccagctgtg cccagcatct acgccactct 2280

ggccatccac tagcccaggg ggggacgcag accccacact ccatggagtc tggaatgcat 2340

gggagctgcc cccccagtgg acaccattgg accccaccca gcctggatct accccaggag 2400

actctgggaa cttttagggg tcactcaatt ctgcagtata aataactaat gtctctacaa 2460

ttttgaaata aagcaacaga cttctcaata atcaatgaag tagctgagaa aactaagtca 2520

gaaagtgcat taaactgaat cacaatgtaa atattacaca tcaagcgatg aaactggaaa 2580

actacaagcc acgaatgaat gaattaggaa agaaaaaaag taggaaatga atgatcttgg 2640

ctttcctata agaaatttag ggcagggcac ggtggctcac gcctgtaatt ccagcacttt 2700

gggaggccga ggcgggcaga tcacgagttc aggagatcga gaccatcttg gccaacatgg 2760

tgaaaccctg tctctcctaa aaatacaaaa attagctgga tgtggtggca gtgcctgtaa 2820

tcccagctat ttgggaggct gaggcaggag aatcgcttga accagggagt cagaggtttc 2880

agtgagccaa gatcgcacca ctgctctcca gcctggcgac agagggagac tccatctcaa 2940

attaaaaaaa aaaaaaaaaa agaáagaaaa aaaaaaaaaa aaaa 2984<210> 3<211> 198<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 3Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu195

<210> 4

<211> 690

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

atggggcacc tccccaagcc caccctctgg gctgaaccag gctctgtgat cacccaggggagtcctgtga ccctcaggtg tcaggggggc caggagaccc aggagtaccg tctatataga 120

gaaaagaaaa cagcaccctg gattacacgg atcccacagg agcttgtgaa gaagggccag 180

ttccccatcc catccatcac ctgggaacat gcagggcggt atcgctgtta ctatggtagc 240

gacactgcag gccgctcaga gagcagtgac cccctggagc tggtggtgac aggagcctac 300

atcaaaccca ccctctcagc ccagcccagc cccgtggtga actcaggagg gaatgtaacc 360

ctccagtgtg actcacaggt ggcatttgat ggcttcattc tgtgtaagga aggagaagat 420

gaacacccac aatgcctgaa ctcccagccc catgcccgtg ggtcgtcccg cgccatcttc 480

tccgtgggcc ccgtgagccc gagtcgcagg tggtggtaca ggtgctatgc ttatgactcg 540

aactctccct atgagtggtc tctacccagt gatctcctgg agctcctggt cctagcggcc 600

gcaggtggcg gtactagtac tgttgaaagt tgtttagcaa aaccccatac agaaaattca 660

tttactaacg tctggaaaga cgacaaaact 690<210> 5<211> 615<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> DNA codificando duas truncagens de domínio de ILT-2 e restrição

60120180240300360420480540600615

sítios de reconhecimento de enzimas introduzido novetor de expressão da base de PGMT7<400> 5

tatacatatg ggtcatcttc caaaaccaac tctctgggct gaaccaggct ctgtgatcacccaggggagt cctgtgaccc tcaggtgtca ggggggccag gagacccagg agtaccgtctatatagagaa aagaaaacag caccctggat tacacggatc ccacaggagc ttgtgaagaa

gggccagttc cccatcccat ccatcacctg ggaacatgca gggcggtatc gctgttacta

tggtagcgac actgcaggcc gctcagagag cagtgacccc ctggagctgg tggtgacagg

agcctacatc aaacccaccc tctcagccca gcccagcccc gtggtgaact caggagggaa

tgtaaccctc cagtgtgact cacaggtggc atttgatggc ttcattctgt gtaaggaagg

agaagatgaa cacccacaat gcctgaactc ccagccccat gcccgtgggt cgtcccgcgc

catcttctcc gtgggccccg tgagcccgag ccgcaggtgg tggtacaggt gctatgctta

tgactcgaac tctccctatg agtggtctct acccagtgat ctcctggagc tcctggtcctataagcttga attcc<210> 6<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios imitados<400> 6

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Met Gly Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu195<210> 7<211> 198

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptideos<400> 7

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

1O Ile Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu195

<210> 8<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptideos<400> 8

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Leu Met Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr ArgIle Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glú Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu180 185 190Leu Glu Leu Leu Val Leu195

<210> 9<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptideos<400> 9

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Met Gln Arg Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Arg Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 .45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro He. Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Ser Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 10<211> 615<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> DNA codificando um polipeptídeo ILT-2 de dois domíniosmutados de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição

<400> 10

tatacatatg ggtcatcttc caaaaccaac tctctgggct gaaccaggct ctgtgatcac 60catggggcag cctgtgaccc tcaggtgtca ggggggccag gagacccagg agtaccgtct 120atatagagaa aagaaaacag caccctggat tacacggatc ccacaggagc ttgtgaagaa 180gggccagttc cccatcccat ccatcacctg ggaacatgca gggcggtatc gctgttacta 240tggtagcgac actgcaggcc gctcagagag cagtgacccc ctggagctgg tggtgacagg 300agcctacatc aaacccaccc tctcagccca gcccagcccc gtggtgaact caggagggaa 360tgtaaccctc cagtgtgact cacaggtggc atttgatggc ttcattctgt gtaaggaagg 42 0agaagatgaa càcccacaat gcctgaactc ccagccccat gcccgtgggt cgtcccgcgc 480catcttctcc gtgggccccg tgagcccgag tcgcaggtgg tggtacaggt gctatgctta 540tgactcgaac tctccctatg agtggtctct acccagtgat ctcctggagc tcctggtcct 600ataagcttga attcc 615

<210> 11<211> 615<212> DNA

<213> Seqüência Artificial.<220>

<223> DNA codificando um polipeptídeo ILT-2 de dois domínios

mutados de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição

<400> 11

tatacatatg ggtcatcttc caaaaccaac tctctgggct gaaccaggct ctgtgatcac 60

catggatcaa cctgtgaccc tcaggtgtca ggggggccag gagacccagg agtaccgtct 120180240300360420480540600615

mutados de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição<400> 12

tatacatatg ggtcatcttc caaaaccaac tctctgggct gaaccaggct ctgtgatcaccctgatgcaa cctgtgaccc tcaggtgtca ggggggccag gagacccagg agtaccgtctatatagagaa aagaaaacag caccctggat tacacggatc ccacaggagc ttgtgaagaagggccagttc cccatcccat ccatcacctg ggaacatgca gggcggtatc gctgttactatggtagcgac actgcaggcc gctcagagag cagtgacccc ctggagctgg tggtgacaggagcctacatc aaacccaccc tctcagccca gcccagcccc gtggtgaact caggagggaatgtaaccctc cagtgtgact cacaggtggc atttgatggc ttcattctgt gtaaggaaggagaagatgaa çacccacaat gcctgaactc ccagccccat gcccgtgggt cgtcccgcgccatcttctcc gtgggccccg tgagcccgag ccgcaggtgg tggtacaggt gctatgcttatgactcgaac tctccctatg agtggtctct acccagtgat ctcctggagc tcctggtcctataagcttga attcc<210> 13

<211> 615

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

atatagagaa aagaaaacag caccctggat tacacggatc ccacaggagc ttgtgaagaagggccagttc cccatcccat ccatcacctg ggaacatgca gggcggtatc gctgttactatggtagcgac actgcaggcc gctcagagag cagtgacccc ctggagctgg tggtgacaggagtctacatc aaacccaccc tctcagccca gcccagcccc gtggtgaact caggagggaatgtaaccctc cagtgtgact cacaggtggc atttgatggc ttcattctgt gtaaggaaggagaagatgaa cacccacaat gcctgaactc ccagccccat gcccgtgggt cgtcccgcgccatcttctcc gtgggccccg tgagcccggg tcgcaggtgg tggtacaggt gctatgcttatgactcgaac tctccctatg agtggtctct acccagtgat ctcctggagc tcctggtcctataagcttga attcc<210> 12

<211> 615·<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> DNA codificando um polipeptídeo ILT-2 de dois domínios

60120180240300360420480540600615<220>

<223> DNA codificando um polipeptideo ILT-2 de dois domínios

mutados de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição<400> 13

tatacatatg ggtcatcttc caaaaccaac tctctgggct gaaccaggct ctgtgatcac 60catgcagcgg cctgtgaccc tcaggtgtca ggggggccag gagacccagg agtaccgtct 120atatagagaa aggaaaacag caccctggat tacacggatc ccacaggagc ttgtgaagaa 180gggccagttc cccatcccat ccatcacctg ggaacatgca gggcggtatc gctgttacta 240tggtagcgac actgcaggcc gctcagagag cagtgacccc ctggagctgg tggtgacagg 300agcctacatc aaacccaccc tctcagccca gcccagcccc gtggtgaact caggagggaa 360tgtaaccctc cagtgtgact cacaggtggc atttgatggc ttcattctgt gtaaggaagg 420agaagatgaa cacccacaat gcctgagctc ccagccccat gcccgtgggt cgtcccgcgc 480catcttctcc gtgggccccg tgagcccgag tcgcaggtgg tggtacaggt gctatgctta 540tgactcgaac tctccctatg agtggtctct acccagtgat ctcctggagc tcctgg.tcct 600ataagcttga attcc 615

<210> 14<211> 3111<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> DNA codificando um vetor de expressão baseado em PGMT7<400> 14

gatctcgatc ccgcgaaatt aatacgactc actataggga gaccacaacg gtttccctct 60

agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gatãtacata tgggatccat ggtaagcttg 120aattccgatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct 180gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg 240aaaggaggaa ctatatccgg ataattcttg aagacgaaag ggcctcgtga tacgcctatt 300tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg 360aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 420catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatatttt gttaaaattc gcgttaaatt 480tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat cggcaaaatc ccttataaat 540caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag agtccactat 600taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggctacgtgaacc atcaccctaa tcaagtttttggaaccctaa agggagcccc cgatttagaggaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcggcgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgcgcacttttcg gggaaatgtg cgcggaacccatatgtatcc gctcatgaga caataaccctagagtatgag tattcaacat ttccgtgtcgttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatcgccccgaaga acgttttcca atgatgagcatatcccgtgt tgacgccggg caagagcaacacttggttga gtactcacca gtcacagaaaaattatgcag tgctgccata accatgagtgcgatcggagg accgaaggag ctaaccgcttgccttgatcg ttgggaaccg ^gagctgaatgcgatgcctgc agcaatggca acaacgttgctagcttcccg gcaacaatta.atagactggatgcgctcggc ccttccggct ggctggttta

ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggctctacacgac ggggagtcag gcaactatgggtgcctcact gattaagcat tggtaactgtttgatttaaa acttcatttt taatttaaaatcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt

agatcaaagg atcttcttga gatcctttttaaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgttcgaaggtaac tggcttcagc agagcgcagaagttaggcca ccacttcaag aactctgtagtgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgggcttggagcg aacgacctac accgaactgaccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca

gaaaaaccgt ctatcagggc gatggcccac 660

tggggtcgag gtgccgtaaa gcactaaatc 720

cttgacgggg aaagccggcg aacgtggcga 780

gcgctagggc gctggcaagt gtagcggtca 840

ttaatgcgcc gctacagggc gcgtcaggtg 900

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 960

gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 1020

cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 1080

tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 1140

tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 1200

cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 1260

tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 1320

agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 1380

ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 1440

ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 1500

aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 1560

gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 1620

tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 1680

ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1740

cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1800

atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1860

cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1920

ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1980

cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 2040

ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 2100

tgccggatca agagctacca actctttttc 2160

taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 2220

caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 2280

agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 2340

gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 2400

gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 2460

ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 2520gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 2580

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 2640

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 2700

acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 2760

gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 2820

cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2880

atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagt atacactccg 2940

ctatcgctac gtgactgggt catggctgcg ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg 3 000

ccctgacggg cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg 3060

agctgcatgt gtcagaggtt ttcaccgtca tcaccgaaac gcgcgaggca g 3111<210> 15<211> 9<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 15

Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu1 5

<210> 16<211> 198<212 > PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> XLT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 16

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 .15

Ile Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

30 35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro50 55 60Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ser Gln Trp Ser Ala Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 17<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 17

Met His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile1 5 10 15

Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr

20 25 30

Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr

35 40 45

Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser50 55 60

Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp65 70 75 80

Thr Ser Gln Trp Ser Ala Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr

85 90 95

Gly Val Tyr Xle Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val

100 105 110

Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe

115 120 125

Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys

130 135 140

Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser145 150 155 160

Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala

165 170 175

Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu

180 185 190

Glu Leu Asp Val Asp Gly

195<210> 18<211> 199<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 18

Met His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile1 5 10 15

Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr

20 25 30

Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr35 40 45Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser

50 55 60

Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp65 70 75 80

Thr Ser Gln Trp Ser Ala Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr

85 90 95

Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val

100 105 110

Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe

115 120 125

Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys

130 135 140

Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser145 150 155 160

Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala

165 170 175

Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu

180 185 190

Glu Leu Asp Val Asp Gly Cys

195<210> 19<211> 614<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> DNA codificando um polipeptídeo ILT-2 de dois domínios

mutado com um codom terminal cys e sítios de reconhecimento de enzmas de restrição<400> 19

tacgtaatgg gtcatcttcc aaaaccaact ctctgggctg aaccaggctc tgtgatcacc 60

atggatcagc ctgtgaccct caggtgtcag gggggccagg agacccagga gtaccgtcta 120tatagagaaa agaaaacagc accctggatt acacggatcc cacaggagct tgtgaagaag 180ggccagttcc ccatcccatc catcacctgg gaacatgcag ggcggtatcg ctgttactatggtagcgaca ctagtcaatg gtcggcgagc agtgaccccc tggagctggt ggtgacaggagtctacatca aacccaccct ctcagcccag cccagccccg tggtgaactc aggagggaatgtaaccctcc agtgtgactc acaggtggca tttgatggct tcattctgtg taaggaaggagaagatgaac acccacaatg cctgaactcc cagccccatg cccgtgggtc gtcccgcgccatcttctccg tgggccccgt gagcccgagt cgcaggtggt ggtacaggtg ctatgcttatgactcgaact ctccctatga gtggtctcta cccagtgatc tcctggagct cctggtcctatgttaagcgg ccgc<210> 20<211> 199<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> Polipeptideo ILT-2 de dois domínios mutados com um

resíduo de cys c-terminal.<400> 20Met Gly His1

Ile Thr Met

Thr Gln Glu35

Thr Arg Ile50

Ser Ile Thr65

Asp Thr Ser

Thr Gly Val

Val Asn Ser115

Leu Pro Lys Pro Thr Leu5

Asp Gln Pro Val Thr Leu20 25

Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu40

Pro Gln Glu Leu Val Lys55

Trp Glu His Ala Gly Arg70

Gln Trp Ser Ala Ser Ser85

Tyr Ile Lys Pro Thr Leu100 105

Gly Gly Asn Val Thr Leu120

Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val10 15

Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu30

Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile45

Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro60

Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser

75 80

Asp Pro Leu Glu Leu Val Val90 95

Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val110

Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala125Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu Cys

195<210> 21<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 21

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Leu Phe Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 22<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 22

Met Gly His Leu Pro Lys Pró Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val15 10 15

Ile Thr Leu Ser Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phé Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val100 105 110Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 23<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 23

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Gln Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Val Ile Gln Arg65 70 75 80

Gly Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 24<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> ILT-2 de<400> 24Met Gly His Leu1

Ile Thr Gln Gly20

Thr Gln Glu Tyr35

Thr Arg Ile Pro50

Ser Ile Thr Trp65

Gln Gly Gly Leu

dois domínios mutados polipeptídeos

Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val

5 10 15

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. 25 30

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Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

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- 180 185 190

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Leu Glu Leu Leu Val Leu

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Leu Glu Leu Leu Val Leu

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<213> Seqüência Artificial<220>

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Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 40<211> 198<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 40

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

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165 170 175

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180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 41<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptideos<400> 41

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115 120 125

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130 135 140

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Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

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180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 42<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 42

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala IlePhe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu195<210> 43<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 43

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu195<210> 44<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 44

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Val Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser GlU Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu180 185 190Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 45<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 45

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 50 15

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20 25 30

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35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Val Gly Trp Ala65 70 75 80

Val Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser. Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 46<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> XLT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<220>

<221> misc_feature<222> (170).. (170)

<223> Xaa pode estar ocorrendo naturalmente algum aminoácido<400> 46

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20 25 30

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50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ile Gly Arg Ser65 70 75 80

Gln Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln130 135 140Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Xaa Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 47<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 47

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35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

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Gln Glu Gly Ala Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

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180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 48<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 48

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

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35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

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Gln Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala115 120 125Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 49<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptideos<400> 49

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Gln Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Val Tyr Val Ala Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

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Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195 <210> 50<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 50

Met Gly His Leu Pro Lys Prò Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ile Tyr Lys Ala Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val100 105 110Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 51<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 51

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ile Tyr Gln Arg Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 52<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> ILT-2 de dois domínios inutados polipeptídeos<400> 52

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val85 90 95Thr Gly Ile Tyr Gln Ala Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg. Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175.

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 53<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios imitados polipeptídeos<400> 53

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

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100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 54<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 54

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5· 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ile Tyr Lys Gln Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg. Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Gly Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 55<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 55

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ile Tyr Gln Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 56<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 56

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro50 55 60Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val85 90 95

5 Thr Gly Ile Tyr Leu Ala Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln10 130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr165 170 175

15 Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu19557198PRT

Seqüência Artificial

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos25 <400> 57

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val15 10 15

Ile Thr Leu Gly Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu20 25 30

30 Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

<210>20 <2ii><212><213><220>50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ile Tyr Leu Ala Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser LeU Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 58<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 58

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile35 40 45Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ser Gln Trp Ser Ala Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ile Tyr Leu Ala Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

130 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 59<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<22 3> MGHL PK PTLWAE PGSVITMDQ PVTLRC QGGQ ETQ E YRL YREKKTAPWITRIPQ ELVKKGQF PIPSITWEHAGRYRCYYGSDTSQWSASSDPLELWTGIYLAPTLSAQPSPWNSGGNVTLQCDSQVAFDGFILCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVL

<400> 59

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15Ile Thr Leu Gly Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

Asp Thr Ser Gln Trp Ser Ala Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val

85 90 95

Thr Gly Ile Tyr Leu Ala Pro Thr Leu Ser Alá Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

Phe Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln

13 0 135 140

Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe145 150 155 160

Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr

165 170 175

Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu

180 185 190

Leu Glu Leu Leu Val Leu

195<210> 60<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 60

Met Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val1 5 10 15

Ile Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

35 40 45

Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

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195

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115 120 125

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<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 73

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<213> Seqüência Artificial<220>

Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala

170 175

Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu185 190

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptideos<400> 74

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20 25 30

Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Xle Thr

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Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser

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Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe

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Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys

130 135 140

Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser145 150 155 160

Val GÍy Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala

165 170 175

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Glu Leu Asp Val Asp Gly

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<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 75.

Met His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile1 5 10 15

Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr

20 25 30

Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr

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Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser

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Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Thr Gln65 70 75 80

Thr Ser Gln Trp Ser Ala Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr

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Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val

100 105 110

Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe

115 120 125

Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys130 135 140Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser145 150 155 160

Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala

165 170 175

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Glu Leu Asp Val Asp Gly

195<210> 76<211> 199<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 76

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Ile Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu

20 25 30

Thr Gln Gln Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile

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Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro

50 55 60

Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser65 70 75 80

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85 90 95

Thr Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val

100 105 110

Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala

115 120 125

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<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 77

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20 25 30

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50 55 60

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100 105 110

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

Glu Leu Asp Val Asp Gly

195<210> 78<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<22 0>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 78

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Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr

20 25 30

Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr

35 40 45

Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser

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100 105 110

Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe115 120 125

Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys

130 135 140

Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Glu Phe Ser145 150 155 160

Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala

165 170 175

Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu

180 185 190

Glu Leu Asp Val Asp Gly

195<210> 79<211> 198<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 79

Met His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Vai, Ile1 5 10 15

Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr

20 25 30

Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr

35 40 45

Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser

50 55 60

Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp65 70 75 80

Thr Ser Gln Trp Ser Ala Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr

85 90 95

Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val100 105 110Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe

115 120 125

Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys

130 135 140

Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser145 150 155 160

Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala

165 170 175

Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Asp Pro Ser Asp Leu Leu

180 185 190

Glu Leu Asp Val Asp Gly

195<210> 80

<211> 198

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ILT-2 de dois domínios mutados polipeptídeos<400> 80

Met His Leú Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ilé1 5 10 15

Thr Met Asp Gln Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr

20 25 30

Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Pro Trp Ile Thr

35 40 45

Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser

50 55 60

Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp65 70 75 80

Thr Ser Gln Trp Ser Ala Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr

85 90 95

Gly Val Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val100

Asn Ser Gly Gly Asn Val Thr Leu115 120

Asp Gly Phe Ile Leu Ser Lys Glu

130 135

Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg145 150

Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg165

Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu180

Glu Leu Asp Val Asp Gly195

105 110

Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe125

Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Ser140

Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser155 160

Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala

170 175

Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu185 190

Claims (60)

1. Polipeptídeo que tem a propriedade de ligação a uma dadapMHC Classe I caracterizado em que o dito polipeptídeo tem um K0 para adita pMCH Classe I de menos do que ou igual a 1 μΜ e/ou tem "off rate" (Kjff)para a dita dada molécula de pMHC Classe I de 2S"1 ou mais lento E o ditopolipeptídeo tem pelo menos 45% de identidade e/ou 55% de similaridadecom SEQ ID NO: 7 e o dito polipeptídeo inibe a ligação de CD8 a dada p-MHC em um grau maior do que o polipeptídeo SEQ ID NO: 3.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 que é uma mo·lécula de ILT humana mutada.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação ou a reivindicação 2, em que o dito Kd ou kotf é/são conforme medido(s) por ressonância deplasmon de superfície.

4. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, em que um ou mais dos aminoácidos que correspondem aos a-minoácidos 10W, 19Q, 20G, 21S1 42K, 47W, 50R, 66I, 77Y, 78Y, 79G, 80S, 8 ID, 82T, 83A, 84G, 85R, 87E, 99A, 1011,102K, 141E, 146L, 147N, 1591, 168S, 172W, 174R e 188L de SEQ ID NO: 3 é/são mutados.

5. Polipeptídeo de acordo com em qualquer uma das reivindica-ções anteriores, que compreende uma ou mais das seguintes mutações- 10W-+L, 19Q—»M, 19Q—»L, 19Q-+V, 20G-+D, 20G^M, 20G^Q, 20G-+F,- 20G—»S, 20G—>E, 20G—>R, 21S—>Q, 21 S-^R1 21S^A, 21S->S, 42K-^R,- 47W-+Q, 50R—»L, 66L->V, 77Y^V, 77Y^M, 77Y^I, 77Y-+Q, 78Y-^Q,- 78Y—►!, 78Y^G, 79G—>Q, 79G-+Y, 79G^W, 79G^R, 79G^V, 80S—R,- 80S—»T, 80S—>G, 81D^G, 81 D-^Q, 81D^L, 81D^V, 82T-+G, 82T-*E,- 83A^S, 83A—>-G, 83A^R, 84G^L, 84G^Q, 84G^A, 85R-+W, 87E-+A,- 99A—»l, 99A^Y, 101 I^L, 101 I^K, 1011—^Q5 101^V, 102K-+Q, 102K-+A,- 102K-+R, 141E^G, 141E^D, 146L^D, 147N->S, 159I^E, 168S^G,- 172W^R, 174R—ou 188L->D usando a numeração de SEQ ID NO: 3.

6. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, que compreende as mutações que correspondem a 19Q—>M e 21->Q usando a numeração de SEQ ID NO: 3.

7. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 5, que compreende as mutações que correspondem a 19Q—>M, 20G->D,-21S—99A->V e 168S^G usando a numeração de SEQ ID NO: 3.

8. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 5, que compreende as mutações que correspondem a 19Q—>L, 20G—>M,e 21S—>Q usando a numeração de SEQ ID NO: 3.

9. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 5, que compreende as mutações que correspondem a 19Q—>M, 20G->Q,-21S—>R, 42K—»R, e 146L^S usando a numeração de SEQ ID NO: 3.

10. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 5, que compreende as mutações que correspondem a 19Q—M,-20G—>D, 21S—>Q, 83A—>S, 84G-+Q, 85R^W, 87E^A e 99A^V usando anumeração de SEQjD NO: 3.

11. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções anteriores, em que os aminoácidos que correspondem a um ou ambosde 135C ou 145C usando a numeração de SEQ ID NO: 3 é/são mutado(s)para S.

12. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções anteriores que compreende aminoácidos que correspondem a pelomenos os aminoácidos 1-195 de SEQ ID NO: 3.

13. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções anteriores que consiste em ou inclui qualquer uma das SEQ ID Nos: 6a 9 ou 21 a 61.

14. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções anteriores que consiste em ou inclui SEQ ID No: 16.

15. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções anteriores que compreende uma ou mais mutação(ões) que aumen-ta(m) a solubilidade do polipeptídeo em relação a um polipeptídeo corres-pondente que não tem as ditas mutações.

16. Polipeptídeo de acordo com na reivindicação 15, em quepelo menos um aminoácido hidrofóbico exposto a solvente é substituído porum aminoácido carregado.

17. Polipeptídeo de acordo com na reivindicação 15 ou reivindi-cação 16, em que as ditas mutações estão dentro dos 6 aminoácidos C-terminais do polipeptídeo.

18. Polipeptídeo de acordo com em qualquer uma das reivindi-cações 15 a 17, em que os aminoácidos que correspondem a 196L e/ou 198L de SEQ ID NO: 3 são mutados para 196D e 198D respectivamente.

19. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 15 a 18, que compreende as mutações que correspondem a 19Q—>M, 20G—>D, 21S—»Q, 83A^S, 84G^Q, 85R^W, 87E^A, 99A^V, 196L^D e 198L—>D usando a numeração de SEQ ID NO: 3.

20. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 15 a 17 que consiste em ou inclui qualquer uma de SEQ ID Nos: 63 a 80.

21. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 14 a 19, que consiste em ou inclui SEQ ID Nos: 17 ou 62.

22. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções anteriores, que compreende um "sinalizador" na porção C-terminal domesmo.

23. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, em que odito sinalizador é um resíduo de cisteína.

24. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções anteriores, em que o polipeptídeo está associado a pelo menos umacadeia de polialquileno glicol.

25. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 24, em que a(s)cadeia(s) de polialquileno glicol é/são ligada(s) covalentemente ao polipeptí-deo.

26. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 24 ou reivindica-ção 25 em que a(s) cadeia(s) de polialquileno glicol compreende(m) pelomenos duas unidades de repetição de polialquileno glicol.

27. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções anteriores, associado a um agente terapêutico.

28. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 27, em que opolipeptídeo é ligado covalentemente a um agente terapêutico.

29. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 28, em que oagente terapêutico é ligado covalentemente à terminação C do polipeptídeo.

30. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 27 a 29, em que o agente terapêutico é uma molécula imune efetora.

31. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 30, em que amolécula imune efetora é uma citocina.

32. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 31, em que amolécula imune efetora é IL-4, IL-10 ou IL-13.

33. Complexo multivalente que compreende pelo menos doispolipeptídeos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 32, odito complexo multivalente tendo um Kd para uma dada pMHC Classe I demenos do que ou igual a 1 μΜ e/ou "off rate" (koff) para a dada pMHC ClasseI de 2S"1 ou mais lento.

34. Complexo multivalente de acordo com a reivindicação 33,em que os polipeptídeos são ligados por uma cadeia de polímero não-peptídica ou uma seqüência peptídica ligante.

35. Complexo multivalente de acordo com a reivindicação 33,em que a cadeia de polímero ou seqüência peptídica ligante se estende en-tre os resíduos de aminoácidos de cada polipeptídeo que não estão localiza-dos no domínio de ligação de pMHC Classe I dos polipeptídeos.

36. Complexo multivalente de acordo com a reivindicação 34 ou-35, no qual os polipeptídeos são ligados por uma cadeia de polialquilenoglicol ou um ligante peptídico derivado de um domínio de multimerizaçãohumano.

37. Complexo multivalente de acordo com na reivindicação 36,em que um radical espaçador de alquileno divalente está localizado entre acadeia de polialquileno glicol e seu ponto de ligação a um polipeptídeo docomplexo.

38. Complexo multivalente de acordo com na reivindicação 36ou reivindicação 37, em que a cadeia de polialquileno glicol compreende pe-lo menos duas unidades de repetição de polietileno glicol.

39. Complexo multivalente de acordo com em qualquer uma dasreivindicações 33 a 38 que é um dímero ou um tetrâmero.

40. Complexo multivalente que compreende pelo menos doispolipeptídeos de acordo coms qualquer uma das reivindicações 33 a 39 emque (i) pelo menos um do dito polipeptídeo está associado a um agente te-rapêutico de acordo com em qualquer uma das reivindicações 16 a 21.

41. Polipeptídeo ou complexo multivalente de acordo com qual-quer uma das reivindicações anteriores que é solúvel.

42. Ácido nucléico isolado que codifica um polipeptídeo confor-me reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 32.

43. Ácido nucléico isolado que codifica de acordo com a reivindi-cação 42 que foi adaptado para alto nível de expressão em uma célula hos-pedeira.

44. Vetor que incorpora um ácido nucléico de acordo com a rei-vindicação 42 ou 43.

45. Célula ou uma partícula isolada que apresenta pelo menosum polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

46. Composição farmacêutica que compreende um polipeptídeocomo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 26, ou um complexomultivalente conforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 33 a 39, ou uma pluralidade de células ou partículas conforme reivindicadas nareivindicação 45, junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

47. Uso de um polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 26, ou um complexo multivalente conforme reivindicadoem qualquer uma das reivindicações 33 a 39, ou uma pluralidade de célulasou partículas como reivindicado na reivindicação 45 na fabricação e um me-dicamento para o tratamento de doença autoimune, o dito medicamentosendo adaptado para administração parenteral.

48. Uso terapêutico de um polipeptídeo como definido em qual-quer uma das reivindicações 1 a 26, ou um ou um complexo multivalenteconforme reivindicado em qualquer uma das reivindicações 33 a 39, ou umapluralidade de células ou partículas conforme reivindicado na reivindicação- 45.

49. Composição farmacêutica que compreende um polipeptídeocomo definido em qualquer uma das reivindicações 27 a 32, ou um comple-xo multivalente conforme reivindicado na reivindicação 40, junto com um ve-ículo farmaceuticamente aceitável.

50. Uso de um polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 27 a 32, ou um complexo multivalente conforme reivindicadona reivindicação 40 na fabricação de um medicamento para o tratamento dedoença autoimune, o dito medicamento sendo adaptado para administraçãoparenteral.

51. Uso terapêutico de um polipeptídeo como definido em qual-quer uma das reivindicações 27 a 32, um complexo multivalente conformereivindicado na reivindicação 40.

52. Método de tratamento de doença autoimune que compreen-de administrar a um indivíduo que sofre de tal doença autoimune uma quan-tidade eficaz de um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivin-dicações 1 a 26, um complexo multivalente conforme reivindicado em qual-quer uma das reivindicações 33 a 39, ou uma pluralidade de células ou par-tículas conforme reivindicado na reivindicação 45.

53. Uso de um polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 26, ou um complexo multivalente conforme reivindicadonas reivindicações 33 a 39, ou uma pluralidade de células ou partículas con-forme reivindicado na reivindicação 45, no preparo de uma composição parao tratamento de doença autoimune.

54. Método de tratamento de doença autoimune que compreen-de administrar a um indivíduo que sofre de tal doença autoimune uma quan-tidade eficaz de um polipeptídeo como definido nas reivindicações 27 a 32ou um complexo multivalente conforme reivindicado na reivindicação 40.

55. O uso de um polipeptídeo de acordo com em qualquer umadas reivindicações 27 a 32, ou um complexo multivalente como definido nareivindicação 40, no preparo de uma composição para o tratamento de do-ença autoimune.

56. Método de identificar uma variante de alta afinidade de umadada molécula de ILT que tem a propriedade de ligação a uma dada pMHCClasse I CARACTERIZADO EM QUE o dito polipeptídeo tem um K0 para adita dada pMHC Classe I de menos do que ou igual a 1μΜ e/ou tem "off rate"(kotf) para a dita dada molécula de pMHC Classe I de 2S"1 ou mais lento Eque o dito polipeptídeo tem pelo menos 45% de identidade e/ou 55% de si-milaridade com SEQ ID NO: 7 e o dito polipeptídeo inibe a ligação de CD8 adada pMHC em um grau maior do que o polipeptídeo SEQ ID NO: 3, o ditométodo compreendendo:(i) A produção de uma biblioteca de moléculas de ILT que com-preendem uma ou mais mutações na seqüência de aminoácido em compa-ração com a molécula de ILT selvagem correspondente; e(ii) Colocar as ditas moléculas de ILT mutadas em contato comuma pMHC Classe I alvo sob condições adequadas para permitir a ligaçãoda molécula de ILT mutada a pMHC Classe I alvo; e(iii) Medir o Kd e/ou koft das interações; e(iv) Selecionar o(s) polipeptídeo(s) com as características deligação desejadas.

57. Método de produzir um polipeptídeo como definido em qual-quer uma das reivindicações 1 a 23 que compreende:(i) transformar uma célula hospedeira com um vetor de acordocom na reivindicação 43; e(ii) cultivar as células transformadas sob condições adequadaspara a expressão do polipeptídeo como definido em qualquer uma das rei-vindicações 1 a 23; e(iii) recuperar o polipeptídeo expresso.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, em que as célulashospedeiras são células de E. coli.

59. Método de acordo com a reivindicação 57, em que as célulashospedeiras são células de levedura.

60. Método de acordo com a reivindicação 57, em que as célulashospedeiras são células de Pichia pastoris.