ES2348674T3 - Miembros de la familia del receptor similar a ig leucociteno modificado (lir) con afinidad incrementada para mhc clase i y sus usos en la modulaciã“n de la activaciã“n de cã‰lula t. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que tiene la propiedad de unir a un pMHC Clase I dado CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido tiene un KD para el dicho pMHC Clase I dado de menos de o igual a 1 µM y/o tiene una constante de disociación (koff) para la dicha molécula pMHC Clase I dada de 2 S -1 o menos y dicho polipéptido tiene por lo menos a 45% de identidad y/o 55% de similitud con la SEQ ID NO: 7 y dicho polipéptido que inhibe al CD8 se une al pMHC dado a un mayor grado que el polipéptido SEQ ID NO: 3.

Description

La presente invención se relaciona con polipéptidos que tienen la propiedad de unirse a un pMHC Clase I dado CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido tiene un KD para dicho pMHC Clase I dado, de menos de o igual a 1 µM y/o tiene una constante de disociación (koff) para dicha molécula pMHC Clase I dada, de 2 S-1 o menos y dicho polipéptido tiene por lo menos un 45% de identidad y/o 55% de similitud con la SEQ ID NO: 7 y dicho polipéptido que inhibe CD8 une al pMHC dado a un mayor grado que el polipéptido SEQ ID NO: 3. También se proporcionan complejos multivalentes de dichos polipéptidos, células que presentan dichos polipéptidos, dichos polipéptidos asociados con agentes terapéuticos y métodos para utilizar estos polipéptidos.

Antecedente de la Invención

Los transcritos similares a inmunoglobulina (ILT) también se conocen como receptores similares a inmunoglobulina leucocito (LIR), receptores similares a inmunoglobulina monocito/macrófago (MIR) y CD85. Esta familia de inmunoreceptores forma parte de la superfamilia de inmunoglobulina. La identificación de las moléculas ILT se publica primero en marzo 1997 en un estudio (Samaridis et al., (1997) Eur J Immunol 27 660-665) que detalla la secuencia de LIR-1 (ILT2), que nota su similitud con el FCγ2R bovino, receptores inhibidores de linfocito citolítico (KIR), FcαR humano, y gp49 de ratón. Este estudio también nota que el LIR-1, como los KIR, se expresan predominantemente en células linfoides B y monocíticas.

Los polipéptidos solubles con las características de unión de pMHC de moléculas ILT y sus complejos multivalentes proporcionan un medio para bloquear el sitio de unión CD8 en moléculas pMHC, por ejemplo para el propósito de inhibir la enfermedad autoinmune mediada por célula T CD8+. Sin embargo, para aquel propósito sería deseable que estos polipéptidos tuvieran una mayor afinidad y/o una menor constante de disociación para las moléculas pMHC objetivo que para las moléculas ILT naturals.

Breve Descripción de la Invención

La presente invención se relaciona con polipéptidos que tienen la propiedad de unirse a un pMHC Clase I dado CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido tiene un KD para dicho pMHC Clase I dado de menos de o igual a 1 µM y/o tiene una constante de disociación (koff) para dicha molécula pMHC Clase I dada de 2 S-1 o menor y dicho polipéptido tiene por lo menos a 45% de identidad y/o 55% de similitud con la SEQ ID NO: 7 y dicho polipéptido que inhibe CD8 se une al pMHC dado a un mayor grado que el polipéptido de la SEQ ID NO: 3. También se proporcionan complejos multivalentes de dichos polipéptidos, células que presentan dichos polipéptidos, dichos polipéptidos asociados con agentes terapéuticos y métodos para utilizar estos polipéptidos.

Descripción Detallada de la Invención

Como se anotó anteriormente las moléculas ILT también se conocen como LIR, MIR y CD85. El término ILT como se utiliza aquí se entiende que abarca cualquier polipéptido dentro de esta familia de inmunoreceptores.

ILT

La familia ILT de inmunoreceptores se expresa en la superficie de células mieloides y linfoides. Las moléculas ILT comparten 63-84% de homología en sus regiones extracelulares y todas excepto los LIR-4 solubles son proteínas de transmembrana tipo I. Todas las moléculas ILT

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identificadas actualmente tienen dos a cuatro dominios de la superfamilia de inmunoglobulina en sus regiones extracelulares. (Willcox et al., (2003) 4 (9) 913-919) También se pueden expresar moléculas ILT individuales como un número de variantes/isoformas diferentes. (Colonna et al., (1997) J Exp Med 186 (11) 1809-1818) y (Cosman et al., (1997) Immunity 7 273-282)

Existe un número de papeles científicos que detallan la estructura y función de las moléculas ILT que incluyen los siguientes: (Samaridis et al., (1997) Eur J Inmunol 27 660-665), (Cella, et al., (1997) J Exp Med 185 (10) 1743-1751), (Cosman et al., (1997) Immunity 7 273-282), (Borges et al., (1997) J Inmunol 159 5192-5196), (Colonna et al., (1997) J Exp Med 186 (11) 1809-1818), (Colonna et al., (1998) J. Inmunol 160 3096-3100), (Cosman et al., (1999) Inmunological Revs 168 177-185), (Chapman et al., (1999) Immunity 11 603-613), (Chapman et al., (2000) Immunity 12 727-736), (Willcox et al., (2002) BMC Structural Biology 2 6), (Shiroshi et al., (2003) PNAS 100 (5) 88568861) y (Willcox et al., (2003) 4 (9) 913-919).

La WO9848017 describe las secuencias genéticas que codifican los miembros de la familia de ILT y sus secuencias de aminoácido deducidas. Esta solicitud clasifica las moléculas LIR en tres grupos. El primer grupo contiene polipéptidos con una región de transmembrana que incluye un residuo cargado positivamente y una cola citoplásmica corta. El segundo grupo comprende polipéptidos que tienen una región de transmembrana no polar y una cola citoplásmica larga, y finalmente un tercer grupo que contiene un polipéptido expresado como un polipéptido soluble que no tiene región de transmembrana o cola citoplásmica. También se describen procesos para producir polipéptidos de la familia LIR, y anticuerpos antagónicos para los miembros de la familia LIR. Esta solicitud discute el posible uso de miembros de la familia LIR para tratar enfermedades autoinmunes y estados de enfermedad asociados con función inmune suprimida. A este respecto, se observa que el uso de formas solubles de un miembro de la familia LIR es ventajoso para ciertas aplicaciones. Estas ventajas incluyen la facilidad de purificar formas solubles de ILT/LIR de células anfitrionas recombinantes, que son adecuadas para la administración intravenosa y su potencial uso para bloquear la interacción de los miembros de la familia LIR de superficie celular con sus ligandos con el fin de mediar una función inmune deseable. También se observa la utilidad posible de fragmentos LIR solubles que retienen la actividad biológica deseada, tal como la unión a ligandos que incluyen moléculas MHC clase I.

Otro estudio (Shiroishi et al (2003) PNAS 100 (15) 8856-8861) trata formas solubles (truncadas) de moléculas ILT-2 y ILT-4. Se observa su capacidad para competir con CD8 soluble para la unión a moléculas MHC en estudios Biacore y se considera que este puede ser uno de los mecanismos por los que el ILT-2 modula la activación de célula T CD8+. En relación con la unión de pMHC este estudio iindica "La alta afinidad de ILT versus la unión de CD8 lo que sugiere que los ILT pueden bloquear efectivamente la unión de CD8 a la superficie celular. Este estudio observa que el ILT2 se une al dominio α3 de MHC Clase I y que se ha reportado la estructura de cristal de un fragmento ILT2 que contiene los dominios 1 y 2.

(Colonna et al., (1998) J. Inmunol. 160 3096-3100) que se enfoca en ILT-4, contiene un resumen de la distribución del tejido y la especificidad de los ILT 2-5. De estas moléculas ILT, ILT-2 y ILT-4 se observa que se unen a moléculas MHC Clase I. Este estudio analiza la unión de ILT-4 soluble a células transfectadas con varios MHC Clase I. El estudio concluye que el ILT-4 se une a HLAs-A, B y G, pero no al HLA-Cw3 o HLA-Cw5.

La WO03041650 describe un método para tratar Artritis Reumatoide (RA) utilizando los moduladores de la actividad LIR-2 y/o LIR-3/ LIR-7. Los moduladores descritos incluyen agonistas y

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antagonistas de la actividad LIR. La WO2006033811 describe el uso de polipéptidos ILT-3 y sus fusiones como agentes terapéuticos para la inhibición del rechazo de injerto.

Se ha determinado la afinidad para varios análogos solubles de moléculas ILT tipo intacto para diferentes objetivos pMHC. Por ejemplo, (Chapman et al., (1999) Immunity 11 603-613) utilizado en métodos basados en Biacore para determinar que el LIR-1 (ILT-2) que se une a un rango de moléculas HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E y HLA-G. Los valores KD determinados para estas interacciones varía de 1 x 10-4 M (para HLA-G1) a 2 x 10-5 M (para HLA-Cw*0702). Este estudio también observa que el KD de la interacción entre el ILT-2 tiene una afinidad al UL18, un análogo vírico de MHC Clase I, en el rango de nM.

Un estudio adicional (Chapman et al., (2000) Immunity 12 727-736) reporta la estructura de cristal de un polipéptido LIR-1 truncado (ILT-2) que comprende los dominios D1 y D2. También se conoce que el LIR-1 se une al análogo MhC clase I vírico UL18 con afinidad mucho mayor que el LIR-2 similar. Los autores utilizan la estructura de cristal del polipéptido LIR-1 truncado para identificar las diferencias entre LIR-1 y LIR-2 que ocurren en un disolvente expuesto a los residuos. La mutagenia dirigida al sitio de estos dos péptidos se utiliza para confirmar que los residuos se involucran en la unión de UL18. Esto se lleva a cabo al sustituir los residuos WT de LIR-1 en las posiciones de aminoácido correspondientes de LIR-2. El estudio concluye que el residuo 38Y, y por lo menos uno de 76Y, 80D o 83R de LIR-1 se involucran en la unión de UL18. Los autores indican que "Debido a que la afinidad de LIR-1 para las proteínas MHC clase I es mucho menor que el UL18 somos incapaces de derivar afinidades exactas para la unión de los mutantes LIR-1 y LIR-2 para el MHC clase I."

Las secuencias de ADN y de aminoácido completas de un ILT-2 humano Tipo Intacto se muestran en las Figuras 1a (SEQ ID NO:1) y 1b (SEQ ID NO:2) respectivamente. La secuencia de ADN proporcionada corresponde a aquella que da el número de acceso NM_ 006669 en la base de datos de nucleótidos NCBI.

Polipéptidos Similares a ILT de Alta Afinidad

La presente invención proporciona polipéptidos que tienen la propiedad de unirse a un pMHC Clase I dado CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido tiene un KD para el dicho pMHC Clase I dado de menos de o igual a 1µM y/o tiene una constante de disociación (koff) para dicha molécula pMHC Clase I dada de 2 S-1 o menos y dicho polipéptido tiene por lo menos un 45% de identidad y/o 55% de similitud con SEQ ID NO: 7 y dicho polipéptido que inhibe el CD8 se une al pMHC dado a un mayor grado que el polipéptido de la SEQ ID NO: 3.

Los polipéptidos que cumplen la homología anterior y los criterios de unión de pMHC Clase I se pueden relacionar con respecto a moléculas como ILT de alta afinidad y se pueden relacionar aquí como tal.

Como se indicó anteriormente, los polipéptidos ILT de ocurrencia natural tienen dos a cuatro dominios de la superfamilia de inmunoglobulina en sus regiones extracelulares. Los polipéptidos como ILT de alta afinidad de la invención se pueden expresar en formas que tienen cuatro, tres o dos de dichos dominios. Las realizaciones actualmente preferidas de la invención tienen dos dominios de la superfamilia de inmunoglobulina que corresponden a los dos dominios de terminal N de ILT-2 humano que contienen una o más mutaciones que confieren alta afinidad al PMHC Clase I. Estos dominios de terminal N son dominios uno y dos que utilizan la notación de Cosman et al., (1999) Inmunol Revs 168: 177-185. Los polipéptidos como ILT tienen aquellos dos dominios de terminal N que tienen generalmente una secuencia que corresponde a los aminoácidos 1-195 de la SEQ ID NO: 3.

4 Preferiblemente, el polipéptido SE CARACTERIZA PORQUE dicho polipéptido tiene por lo menos a 60% de identidad y/o 75% de similitud con la SEQ ID NO: 7 Preferiblemente, el polipéptido SE CARACTERIZA PORQUE dicho polipéptido tiene por lo menos a 75% de identidad y/o 85% de similitud con la SEQ ID NO: 7. Preferiblemente, el polipéptido SE CARACTERIZA PORQUE dicho polipéptido tiene por lo menos a 90% de identidad y/o 95% de similitud con la SEQ ID NO: 7. La identidad de secuencia como se utiliza aquí significa aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes en las dos secuencias que se comparan. De forma similar este contexto incluye aminoácidos que son idénticos y aquellos que son similares (funcionalmente equivalentes). Por ejemplo una única sustitución de un aminoácido hidrófobo presente en una posición dada en un polipéptido con un aminoácido hidrófobo diferente que resultaría en la formación de un polipéptido que se considera similar al polipéptido similar pero no idéntico). Los parámetros "similitud" y "identidad" como se utiliza aquí que caracteriza polipéptidos de la invención se determinan mediante el uso del algoritmo FASTA cuando se implementa en el programa FASTA adecuado disponible de William R. Pearson, Department of Biological Chemistry, Box 440, Jordan Hall, Charlottesville, Virginia. La configuración utilizada para la determinación de aquellos parámetros por medio de los programas FASTA adecuados son como se especifica en el Ejemplo 6 aquí. Como será obvio para aquellos expertos en la técnica hay un número de fuentes de proteína FASTA: comparaciones de proteína que se pueden utilizar para este análisis. (Pearson et al., (1988) PNAS 85 2444-2448) proporcionan detalles adicionales del algoritmo FASTA. Las actividades inhibidoras relativas del polipéptido de la SEQ ID NO 3 y cualquier polipéptido putativo dado de la invención se pueden determinar mediante cualquier ensayo convencional para el que la lectura se relaciona con la afinidad de unión de CD8 para el pMHC dado. En general la lectura será un valor IC50. El polipéptido de prueba y aquel de la SEQ ID NO: 3 se evaluarán en concentraciones comparables y sus IC50 respectivos determinados por referencia a las curvas de inhibición graficadas de los resultados individuales. Un ensayo adecuado es aquel descrito en el Ejemplo 5. Preferiblemente, el polipéptido SE CARACTERIZA PORQUE dicho polipéptido tiene un KD para el dicho pMHC Clase I dado de menos de o igual a 100nM y/o tiene una constante de disociación (koff) para dicho pMHC Clase I dado de 0.1 S-1 . Como es bien conocido por aquellos expertos en la técnica existe un número de medios por los que se puede determinar dicha afinidad y/o constante de disociación. Por ejemplo, dicha afinidad (KD) y/o constante de disociación (koff) se puede determinar mediante Resonancia de Plasmón de Superficie. El Ejemplo 4 aquí proporciona un ensayo con base en Biacore adecuado para llevar a cabo tales determinaciones Para comparación la interacción de una variante truncada soluble de la molécula ILT-2 Tipo Intacto (ver Figura 2a (SEQ ID NO: 3) para la secuencia de aminoácido de este polipéptido soluble) y HLA-A*0201 cargado con el antígeno Carcinoembriónico (CEA) derivado del péptido YLSGANLNL (SEQ ID NO: 13) tiene un KD de 6 µM, y una constante de disociación (koff) de 2.4 S-1 según se mide mediante el método con base en Biacore del Ejemplo 4. Esta molécula soluble ILT-2 es una forma truncada de una variante de isoforma 1 del ILT-2 humano Tipo Intacto que contiene solo los dominios extracelulares D1 y D2. Los residuos de aminoácido que difieren entre esta molécula variante ILT-2 y aquella de la isoforma 1 del ILT-2 se bosquejan en la Figura 1a. La Figura 2b (SEQ ID NO: 4) detalla la secuencia de ADN natural que codifica este polipéptido. Con el fin de mejorar la eficiencia de la expresión recombinante y de facilitar la

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clonación de este polipéptido un número de mutaciones se introducen en el ADN que codifica este polipéptido. Estas mutaciones no alteran la secuencia de aminoácido del polipéptido expresado. La secuencia de ADN utilizada para la expresión recombinante se muestra en la Figura 3 (SEQ ID NO: 5)

Una realización de la invención se proporciona en donde el polipéptido es una molécula ILT humana mutada. Por ejemplo, el ADN que codifica ILT-2 humano, o sus fragmentos solubles, se puede utilizar como una plantilla cuyas varias mutaciones que origina alta afinidad y/o una constante de disociación lenta para la interacción entre los polipéptidos como ILT de alta afinidad de la invención y se puede introducir el complejo pMHC objetivo. Así la invención incluye variantes ILT-2 que se mutan con relación a la secuencia natural.

Como será obvio para aquellos expertos en la técnica las mutaciones en tal secuencia de aminoácido de ILT-2 puede ser una o más de sustituciones, eliminaciones, o inserciones. Se pueden llevar a cabo estas mutaciones utilizando cualquier método apropiado que incluye, pero no se limita a, aquellas con base en procedimientos de reacción de cadena de polimerasa (PCR), clonación con base en enzima de restricción, o clonación independiente de ligado (LIC). Estos métodos se detallan en muchos textos de biología molecular estándar. Para detalles adicionales con respecto a mutagenia de la reacción de cadena de polimerasa (PCR) y clonación con base en enzima de restricción ver (Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press) se puede encontrar información adicional en procedimientos LIC en (Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6 (1): 30-6)

Modalidades adicionales de la invención incluyen polipéptidos en donde uno o más de los aminoácidos que corresponden a 10W, 19Q, 20G, 215, 42K, 47W, 50R, 66I, 77Y, 78Y, 79G, 80S, 81D, 82T, 83A, 84G, 85R, 87E, 99A, 101I, 102K, 141E, 146L, 147N, 159I, 168S, 172W, 174R y 188L de la SEQ ID NO: 3 se muta/mutan. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención pueden comprender una o más de las siguientes mutaciones: 10W→L, 19Q→M, 19Q→L, 19Q→V, 20G→D, 20G→M, 20G→Q, 20G→F, 20G→S, 20G→E, 20G→R, 21S→Q, 21S→R, 21S→A, 21S→S, 42K→R, 47W→Q, 50R→L, 66L→V, 77Y→V, 77Y→M, 77Y→I, 77Y→Q, 78Y→Q, 78Y→I, 78Y→G, 79G→Q, 79G→Y, 79G→W, 79G→R, 79G→V, 80S→R, 80S→T, 80S→G, 81D→G, 81D→Q, 81D→L, 81D→V, 82T→G 82T→E, 83A→S, 83A→G, 83A→R, 84G→L, 84G→Q, 84G→A, 85R→W, 87E→A, 99A→I, 99A→Y, 101I→L, 101I→K, 101I→Q, 101→V, 102K→Q, 102K→A, 102K→R, 141E→G, 141E→D, 146L→D, 147N→S, 159I→E, 168S→G, 172W→R, 174R→W o 188L→D.

Por ejemplo, los polipéptidos que comprenden por lo menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez de las mutaciones anteriores será frecuentemente adecuado.

La numeración utilizada es la misma como aquella mostrada en la Figura 2a (SEQ ID No: 3).

Una realización proporciona un polipéptido de la invención que comprende mutaciones que corresponden a los aminoácidos 19Q→M y 21S→Q utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

Otra realización proporciona un polipéptido de la invención que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→M, 20G→D, 21S→Q, 99A→V y 168S→G utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

Otra realización proporciona un polipéptido de la invención que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→L, 20G→M, y21S→Q utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

Otra realización proporciona un polipéptido de la invención mutaciones que corresponden a 19Q→M, 20G→Q, 21S→R, 42K→R, y 146L→S utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

6 Otra realización proporciona un polipéptido de la invención que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→M, 20G→D, 21S→Q, 83A→S, 84G→Q, 85R→W, 87E→A y 99A→V utilizando el número de la SEQ ID NO: 3. Se proporciona una realización adicional mediante un polipéptido en donde los aminoácidos que corresponden a uno o ambos de 135C o 145C utilizando el número de la SEQ ID NO: 3. se mutan en S. Otra realización se proporciona mediante un polipéptido de la invención que comprende aminoácidos que corresponden a por lo menos aminoácidos 1-195 de la SEQ ID No: 3. Tales polipéptidos son realizaciones de dos dominios que comprenden dominios que corresponden a los dos dominios de la superfamilia de de inmunoglobulina de Terminal N del ILT-2 humano. Se proporcionan modalidades específicas adicionales de la invención mediante polipéptidos que consisten de o incluyen cualquiera de la SEQ ID Nos: 6 a 9, o 21 a 61. Por supuesto, aunque estas realizaciones preferidas se expresan cuando consisten de o incluyen la SEQ ID Nos: 6 a 9, 16, o 21 a 61 aquellos expertos en la técnica apreciarán que es inevitable que existan sustituciones, eliminaciones e inserciones de aminoácido menores que no afectan la identidad general y propiedades de la realización. Tales variaciones menores pueden ser con respecto a variaciones fenotípicamente inactivo de tales polipéptidos. Visto de otra forma, tales variaciones resultan en un polipéptido que tiene la misma función que el padre y alcanza esa función en la misma forma. Una realización preferida de la invención se proporciona mediante un polipéptido que consiste de o incluye la SEQ ID No: 16. Polipéptidos como ILT de Alta Afinidad con solubilidad mejorada Los polipéptidos de la invención se pueden utilizar como terapéuticos solubles. En tales casos es deseable incrementar la solubilidad de estos polipéptidos. La invención abarca polipéptidos que comprenden una o más mutaciones que incrementan la solubilidad del polipéptido con relación a una carencia de polipéptido correspondiente a dichas mutaciones. Como es bien sabido por aquellos expertos en la técnica cuando se incrementa la solubilidad de un polipéptido se busca generalmente y preferiblemente mutar aminoácidos que están expuestos a un disolvente. Este disolvente expuesto a los aminoácidos se puede identificar mediante referencia a la estructura de cristal de ILT-2. (Ver Chapman et al., (2000) Immunity 12 727-736) La invención abarca polipéptidos en donde se muta uno

o más aminoácidos expuestos al disolvente. Por ejemplo, los polipéptidos de la invención que comprenden por lo menos una mutación en donde un aminoácido hidrófobo expuesto al disolvente se sustituye por un aminoácido cargado.

Preferiblemente, tal solubilidad mejora mutaciones que están dentro de los 6 aminoácidos de Terminal C de los polipéptidos de la invención.

Otra realización se proporciona mediante un polipéptido de la invención en donde los aminoácidos que corresponden a 196L y/o 198L de la SEQ ID NO: 3 se mutan a 196D y 198D respectivamente.

Se proporciona una realización adicional mediante un polipéptido de la invención que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→M, 20G→D, 21S→Q, 83A→S, 84G→Q, 85R→W, 87E→A, 99A→V, 196L→D y 198L→D utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

Otra realización se proporciona mediante un polipéptido de la invención que consiste de o incluye cualquiera de la SEQ ID Nos: 63 a 80. Otra realización se proporciona mediante un polipéptido de la invención que consiste de o incluye la SEQ ID Nos: 17 o 62. Polipéptidos como ILT de Alta Afinidad "etiquetados"

7 Los polipéptidos de la invención se pueden utilizar en formas multiméricas o en asociación con otros grupos funcionales. A este respecto es deseable producir polipéptidos de la invención que comprendan un medio de adhesión de otros grupos funcionales del mismo. Por lo tanto, se proporciona una realización mediante un polipéptido de la invención que comprende una “etiqueta” para facilitar la adhesión a otros grupos funcionales. Esta etiqueta puede estar en el Terminal C de los polipéptidos. Como es bien sabido por aquellos expertos en la técnica existen muchas etiquetas que son adecuadas para este propósito. Estas incluyen, pero no se limitan a, residuos cisteína, péptidos hexahistidina, biotina y grupos químicamente reactivos. La presencia de tales etiquetas también puede facilitar la purificación de los polipéptidos. Polipéptidos como ILT de Alta Afinidad PEGilados En una realización particular un polipéptido de la invención se asocia con por lo menos una cadena polialquilenglicol. Esta asociación se puede originar en un número de formas conocidas por aquellos expertos en la técnica. En una realización preferida la cadena o cadenas de polialquileno se une/unen covalentemente a los polipéptidos. En una realización adicional las cadenas de polietilenglicol del presente aspecto de la invención comprenden por lo menos dos unidades de repetición de polietileno. Complejos como ILT de Alta Afinidad Multivalentes Un aspecto de la invención proporciona un complejo multivalente que comprende por lo menos dos polipéptidos de la invención, dicho complejo multivalente tiene un KD para un pMHC Clase I dado de menos de o igual a 1µM y/o tiene una constante de disociación (koff) para el dicho PMHC Clase I de 2 S-1 o menos. En una realización de este aspecto, por lo menos dos polipéptidos de la invención se ligan por vía de grupos funcionales para formar complejos multivalentes. Se proporciona un aspecto en donde los polipéptidos de la invención se ligan mediante una cadena de polímero no peptídica o una secuencia ligadora peptídica. Preferiblemente los complejos multivalentes son solubles en agua, el grupo funcional ligador se debe seleccionar de acuerdo con lo anterior. Adicionalmente, es preferible que el grupo funcional ligador deba ser capaz de adherir en posiciones definidas en los polipéptidos, de tal manera que se minimiza la diversidad estructural de los complejos formados. Una realización del presente aspecto se proporciona mediante un complejo multivalente de la invención en donde la cadena de polímero o secuencia ligadora peptídica se extiende entre los residuos de aminoácido de cada polipéptido que no se ubican en el dominio de unión pMHC Clase I de los polipéptidos. Ya que los complejos de la invención pueden ser para uso en la medicina, los grupos funcionales ligadores se deben seleccionar con respecto a su adecuabilidad farmacéutica, por ejemplo su inmunogenicidad. Ejemplos de grupos funcionales ligadores que cumplen completamente con los criterios deseables anteriores se conocen en la técnica, por ejemplo la técnica de fragmentos de anticuerpo ligadores. Existen dos clases de ligador que se prefieren para uso en la producción de complejos multivalentes de la presente invención. Un complejo multivalente de la invención en la que los polipéptidos se ligan mediante una cadena de polialquilenglicol o un ligador peptídico derivado de un dominio de multimerización humano proporciona ciertas realizaciones de la invención.

8 Los polímeros hidrófilos adecuados incluyen, pero no se limitan a, polialquilenoglicoles. Los polímeros más comúnmente utilizados de esta clase se basan en el polietilenglicol o PEG, cuya estructura se muestra adelante. HOCH2CH2O (CH2CH2O)n-CH2CH2OH En donde n es mayor de dos. Sin embargo, otros se basan en otros polialquilenoglicoles adecuados opcionalmente sustituidos que incluyen polipropilenglicol, y copolímeros de etilenglicol y propilenglicol. Se pueden utilizar tales polímeros para tratar o conjugar agentes terapéuticos, particularmente terapéuticos de polipéptido o proteína, para alcanzar cambios benéficos para el perfil farmacocinético (PK) del terapéutico, por ejemplo depuración renal reducida, vida útil de plasma mejorada, inmunogenicidad reducida, y solubilidad mejorada. Tales mejoras en al perfil PK del conjugado terapéutico PEG se considera que resultan de la molécula o moléculas PEG que forman una cubierta alrededor del terapéutico que oculta estéricamente la reacción con el sistema inmune y reduce la degradación proteolítica. (Casey et al, (2000) Tumor Targetting 4 235-244) El tamaño del polímero hidrófilo utilizado se puede seleccionar en particular en la base del uso terapéutico pretendido de los polipéptidos similares a ILT de alta afinidad. Existen numerosos papeles y libros de revisión que detallan el uso de PEG y moléculas similares en las formulaciones farmacéuticas. Por ejemplo, ver (Harris (1992) Polietilenglicol Chemistry -Biotechnical and Biomedical Applications, Plenum, New York, NY.) o (Harris & Zalipsky (1997) Chemistry and Biological Applications of Polietilenglicol ACS Books, Washington, D.C). El polímero utilizado puede tener una conformación lineal o ramificada. Las moléculas PEG ramificadas, o sus derivados, se pueden inducir mediante la adición de grupos funcionales ramificados que incluyen glicerol y oligómeros glicerol, pentaeritritol, sorbitol y lisina. Usualmente, el polímero tendrá un grupo o grupos químicamente reactivos en su estructura, por ejemplo en uno o ambos terminales, y/o en ramificaciones de la estructura, para permitir la unión del polímero a los sitios objetivo en el polipéptido similar a ILT de alta afinidad. Este grupo o grupos químicamente reactivos se puede adherir directamente al polímero hidrófilo, o puede haber un grupo/grupo funcional separador entre el polímero hidrófilo y la química reactiva como se muestra adelante: Química reactiva-Polímero hidrófilo-Química reactiva Química reactiva-Espaciador-Polímero hidrófilo-Espaciador-Química reactiva El espaciador utilizado en la formación de las construcciones del tipo destacado anteriormente puede ser cualquier grupo funcional orgánico que no es reactivo, de cadena químicamente estable. Tales espaciadores incluyen, pero no se limitan a los siguientes: -(CH2)n-en donde n = 2 a 5 -(CH2)3NHCO(CH2)2 Un complejo multivalente de la invención en el que un radical separador de alquileno divalente se ubica entre la cadena polialquilenglicol y su punto de unión a una molécula de polipéptido del complejo proporciona una realización adicional del presente aspecto. Un complejo multivalente de la invención en el que la cadena polialquilenglicol comprende por lo menos dos unidades de repetición de polietilenglicol proporciona una realización adicional del presente aspecto. Existe un número de proveedores comerciales de polímeros hidrófilos ligados, directamente o por medio de un espaciador, para químicas reactivas que pueden ser de uso en la presente invención.

9 Estos proveedores incluyen Nektar Therapeutics (CA, USA), NOF Corporation (Japón), Sunbio (Sur de corea) y Enzon Pharmaceuticals (NJ, EEUU). Los polímeros hidrófilos comercialmente disponibles ligados, directamente o por medio de un espaciador, para químicas reactivas que pueden ser de uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, lo siguiente:

imagen1

Se puede utilizar una amplia variedad de químicas acoplantes para acoplar las moléculas de polímero a la proteína y los péptidos terapéuticos. La elección de la química acoplante más apropiada se largamente dependiente del sitio de acoplamiento deseado. Por ejemplo, se han utilizado las

10 siguientes químicas de acoplamiento unido a una o más de las moléculas PEG de terminal (Source:

Nektar Molecular Engineering Catalogue 2003): N-maleimida Vinil sulfona Carbonato de benzotriazol

15 Proprionato de Succinimidilo butanoato Succinimidilo Tio-éster Acetaldehídos Acrilatos

20 Biotina Aminas primarias

10 Como se indicó anteriormente los polímeros con base en no PEG también proporcionan ligadores adecuados para la multimerización de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, se pueden utilizar grupos funcionales que contienen el terminal maleimida ligado mediante cadenas alifáticas tal como BMH y BMOE (Pierce, products Nos. 22330 y 22323). Los ligadores peptídicos son otra clase de ligadores de complejo multivalente. Estos ligadores se comprenden de cadenas de aminoácidos, y funcionan para producir ligadores simples o dominios de multimerización en los que los polipéptidos de la presente invención se pueden adherir. El sistema de biotina/estreptavidina se ha utilizado previamente para producir tetrámeros de las moléculas TCR y pMHC (ver WO 99/60119) para estudios de unión in-vitro. Sin embargo, la estreptavidina es un polipéptido derivado microbialmente y como tal no es idealmente adecuado para uso en un terapéutico. Los complejos multivalentes de la invención en los que los polipéptidos se ligan mediante un ligador peptídico derivado de un dominio de multimerización humano proporcionan una realización del presente aspecto. Existe un número de proteínas humanas que contienen un dominio de multimerización que se puede utilizar en la producción de complejos de polipéptido similares a ILT de alta afinidad multivalente. Por ejemplo, el dominio de tetramerización de p53 se ha utilizado para producir tetrámeros de fragmentos de anticuerpo scFv que exhiben persistencia de suero incrementado y reduce significativamente la constante de disociación comparado con el fragmento scFv monomérico. (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem. 276 (17) 14385-14392). La Hemoglobina también tiene un dominio de tetramerización que se puede utilizar potencialmente para este tipo de aplicación. En una realización específica los complejos multivalentes de la invención pueden ser dímeros

o tetrámeros. Los Ejemplos 9 y 10 aquí proporcionan metodologías detalladas para la producción de complejos similares a ILT de alta afinidad ligados a PEG dimérico y tetramérico de la invención respectivamente. El Ejemplo 11 proporciona aquí datos en la capacidad de tales complejos multivalentes para inhibir la activación de célula T citotóxica.

Un complejo multivalente de la invención que comprende por lo menos dos polipéptidos de la invención, en donde por lo menos uno de dicho polipéptido se asocia con un agente terapéutico proporciona una realización adicional de este aspecto.

Un aspecto adicional se proporciona mediante un polipéptido de la invención o complejo multivalente del mismo en donde dicho polipéptido o complejo multivalente es soluble.

Un aspecto adicional se proporciona mediante una célula aislada o una partícula que presenta por lo menos un polipéptido de la invención. Como será obvio para aquellos expertos en la técnica tales polipéptidos requieren un medio de adhesión a la superficie de dichas células o partículas. Existe un número de medios para facilitar tal adhesión. Por ejemplo, particularmente en el caso de células, este medio de adhesión se puede proporcionar convenientemente al producir versiones de "longitud completa" de los polipéptidos seleccionados que incorporan por lo menos el dominio de transmembrana de ILT-2 humano. El dominio de transmembrana de ILT-2 humano se destaca en la Figura 1a (SEQ ID NO: 1). Sin embargo, no existen solo medios de adhesión de tales polipéptidos a la superficie de las células. Por ejemplo, se pueden producir proteínas de fusión que comprenden un polipéptido de la invención o sus fragmentos ligados a los dominios de transmembrana de otros polipéptidos. En el caso de adhesión de los polipéptidos de la invención a partículas esto se puede alcanzar convenientemente al poner en contacto polipéptidos de la invención que comprenden una etiqueta de terminal C, tal como biotina, con partículas recubiertas con un grupo funcional de unión específico para dicha etiqueta, tal como estreptavidina.

Uso Terapéutico y Diagnóstico

11 En un aspecto los polipéptidos de la invención o sus complejos multivalentes se pueden marcar con un compuesto de formación de imagen, por ejemplo una etiqueta que es adecuada para propósitos de diagnóstico. Tales polipéptidos etiquetados son útiles en un método para detectar moléculas pMHC objetivo cuyo método comprende poner en contacto el pMHC con un polipéptido de la invención o un complejo multivalente del mismo que une al pMHC; y detectar dicha unión. En complejos tetraméricos formados por ejemplo, utilizando moléculas de polipéptido biotiniladas, la estreptavidina fluorescente se puede utilizar para proporcionar una etiqueta detectable. Tal un tetrámero marcado fluorescentemente es adecuado para uso en el análisis FACS, por ejemplo para detectar el antígeno que está presente en las células. Otra forma en la que los péptidos solubles de la presente invención se pueden detectar es mediante el uso de anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos específicos ILT se han descrito en la literatura. Por ejemplo, el IGH/75 es un IgG específico de ILT-2 que se produce en the Basel Institute for Inmunology, Basilea, Suiza. (Riteau et al., (2001) Int. Inmunol. 13 (2) 193). En un aspecto adicional un polipéptido de la presente invención o un complejo multivalente del mismo se puede asociar alternativamente o adicionalmente con (por ejemplo unir covalentemente

o de otra forma a) un agente terapéutico. En una realización específica de la invención el agente terapéutico se liga covalentemente al terminal C del polipéptido.

Existe un número de agentes terapéuticos que se pueden asociar con los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser una molécula efectora inmune. Una realización específica de este aspecto se proporciona en donde la molécula efectora inmune es una citoquina. Como es sabido por aquellos expertos en la técnica existe un número de citoquinas que actúan generalmente para "suprimir" las respuestas inmunes. Los polipéptidos de la invención asociados con tales citoquinas inmunosupresoras forman realizaciones preferidas de la invención. Los polipéptidos de la invención asociados con IL-4, IL-10 o IL-13 o una variante fenotípicamente inactiva o fragmento de estas citoquinas proporcionan realizaciones específicas de la presente invención.

Un complejo multivalente de la invención puede tener unión mejorada que da capacidad de un pMHC dado comparado con un ILT tipo intacto no multimérico o el polipéptido similar a ILT de alta afinidad correspondiente de la invención. Así, los complejos multivalentes de acuerdo con la invención son particularmente útiles para rastrear o objetivar células que presentan antígenos particulares in vitro o in vivo, y también son útiles como intermedios para la producción de complejos multivalentes adicionales que tienen tales usos.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido de la invención, o un complejo multivalente del mismo, o una pluralidad de células que expresan tales polipéptidos, junto con un portador farmacéuticamente aceptable proporcionan por lo tanto un aspecto adicional de la invención. Se proporciona una realización relacionada con el uso terapéutico de un polipéptido de la invención, o un complejo multivalente del mismo, o una pluralidad de células que expresan tales polipéptidos.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden un polipéptido de la invención o un complejo multivalente del mismo asociado con un agente terapéutico junto con un portador farmacéuticamente aceptable proporcionan por lo tanto un aspecto adicional de la invención. se proporciona una realización relacionada con el uso terapéutico de un polipéptido de la invención o un complejo multivalente del mismo asociado con un agente terapéutico.

12 Otro aspecto de la invención se proporciona mediante el uso de un polipéptido de la invención, o un complejo multivalente del mismo, o una pluralidad de células o partículas que expresan tales polipéptidos, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad autoinmune, dicho medicamento se adapta para administración parenteral. Las rutas parenterales adecuadas de administración incluyen rutas subcutáneas, intradérmicas o intramusculares. Un aspecto adicional de la invención se proporciona mediante el uso de un polipéptido de la invención o un complejo multivalente del mismo asociado con un agente terapéutico, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad autoinmune, dicho medicamento se adapta para administración parenteral. Las rutas parenterales adecuadas de administración incluyen rutas subcutáneas, intradérmicas o intramusculares. La invención también proporciona un método para suministrar un agente terapéutico a una célula objetivo, cuyo método comprende poner en contacto células objetivo potenciales con un polipéptido o complejo multivalente de acuerdo con la invención bajo condiciones que permiten la adhesión del polipéptido o complejo multivalente a la célula objetivo, dicho polipéptido o complejo multivalente es capaz de unirse a una molécula pMHC Clase I dada y tiene el agente terapéutico asociado a este. Se puede suministrar un agente terapéutico de tal manera que este ejercerá su efecto localmente, no solo en la célula que se una directamente. Así, una estrategia particular prevé moléculas "inmunosupresoras" ligadas a un polipéptido o complejo multivalente de acuerdo con la invención específicos para antígenos de tumor. Los polipéptidos solubles o complejos multivalentes de la invención se pueden ligar a una enzima capaz de convertir un profármaco en un fármaco. Esto permite que el profármaco sea convertido en fármaco solo en el sitio donde este se requiere (es decir objetivado por el dicho polipéptido o complejo multivalente). Se espera que los polipéptidos y complejos multivalentes descritos aquí se pueden utilizar en los métodos para el diagnóstico y tratamiento de la enfermedad autoinmune. La invención también proporciona un método de tratamiento de enfermedad autoinmune que comprende administrar a un sujeto que sufre de tal enfermedad autoinmune una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención o complejo multivalente del mismo, o una pluralidad de células o partículas que presentan por lo menos un tal polipéptido. En una realización relacionada la invención se proporciona para el uso de un polipéptido de la invención o complejo multivalente del mismo, o una pluralidad de células o partículas que presentan por lo menos un tal polipéptido, en la preparación de una composición para el tratamiento de la enfermedad autoinmune. La invención también proporciona un método de tratamiento de enfermedad autoinmune que comprende administrar a un sujeto que sufre de tal enfermedad autoinmune una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención o un complejo multivalente del mismo asociado con un agente terapéutico. En una realización relacionada la invención se proporciona para el uso de un polipéptido de la invención o un complejo multivalente del mismo, asociado con un agente terapéutico, en la preparación de una composición para el tratamiento de la enfermedad autoinmune. Los polipéptidos de formación de imagen o terapéuticos de acuerdo con la invención usualmente se suministrarán como parte de una composición farmacéutica estéril que incluirá normalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica puede estar en cualquier forma adecuada, (dependiendo del método deseado para administrarlo a un paciente). Este se puede proporcionar en una forma de dosificación unitaria, se proporcionará generalmente en un contenedor sellado y se puede proporcionar como parte de un equipo. Tal un equipo incluiría

13

normalmente (aunque no necesariamente) instrucciones para uso. Este puede incluir una pluralidad de dichas formas de dosificación unitarias.

La composición farmacéutica se puede adaptar para administración mediante cualquier ruta apropiada, por ejemplo parenteral, transdérmica o mediante inhalación, preferiblemente una ruta parenteral (que incluye subcutánea, intramuscular, o, más preferiblemente intravenosa). Tales composiciones se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica de la farmacia, por ejemplo al mezclar el ingrediente activo con los portadores o excipientes bajo condiciones estériles.

Las dosificaciones de las sustancias de la presente invención pueden variar entre límites amplios, dependiendo de la enfermedad o trastorno a ser tratado, la edad y condición del individuo a ser tratado, etc. y un médico determinará ultimadamente las dosificaciones a ser utilizadas.

Aspectos Adicionales

Un polipéptido o complejo multivalente de la presente invención se puede proporcionar en forma sustancialmente pura, o como una preparación purificada o aislada. Por ejemplo, se puede proporcionar en una forma que es sustancialmente libre de otras proteínas.

Se proporcionan realizaciones adicionales mediante un ácido nucleico aislado que codifica los polipéptidos de la invención, los vectores que incorporan dicho ácido nucleico y células contienen dichos vectores. El ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención puede ser uno que se ha adaptado para expresión en alto nivel en una célula anfitriona. Existe un número de compañías que ofrecen tal optimización de ácido nucleico como un servicio, por ejemplo GeneArt, Alemania.

La invención también proporciona un método para identificar una variante de alta afinidad de una molécula ILT dada que tiene la propiedad de unir a un pMHC Clase I dado CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido tiene un KD para el dicho pMHC Clase I dado de menos de o igual a 1 µM y/o tiene una constante de disociación (koff) para dicha molécula pMHC Clase I dada de 2 S-1 o menos y dicho polipéptido tiene por lo menos a 45% de identidad y/o 55% de similitud con la SEQ ID NO: 7 y dicho polipéptido inhibe CD8 une al pMHC dado a un grado mayor que el polipéptido de la SEQ ID NO: 3 dicho método comprende:

(a)

La producción de una colección de moléculas ILT que comprende en una o más mutaciones en la secuencia de aminoácido comparado con la molécula ILT Tipo Intacto correspondiente; y

(b)

Poner en contacto dichas moléculas ILT mutadas con el pMHC Clase I objetivo bajo condiciones adecuadas para permitir la unión de la molécula ILT mutada al pMHC Clase I objetivo; y

(c) Medir el KD y/o koff de la interacción; y

(d) Seleccionar los polipéptidos con las características de unión deseadas. La exhibición de fago de los polipéptidos ILT y/o polipéptidos similares a ILT proporciona un método para generar una colección de polipéptidos adecuada para uso en el método anterior.

Un aspecto final se proporciona mediante un método para producir un polipéptido de la invención que comprende:

(i)

transformar una célula anfitriona con un vector que incorpora el ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención; y

(ii)

cultivar las células transformadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de un polipéptido de la invención; y

(iii) recuperar el polipéptido expresado. Se proporcionan realizaciones específicas del presente aspecto en donde las células anfitrionas son células E.coli o células de levadura,

14 por ejemplo células Pichia pastonis. Ejemplos 1 a 3, y 7 a 8 proporcionan aquí metodologías detalladas para la producción de polipéptidos de la invención en células E. coli y células Pichia pastoris respectivamente. Las características preferidas de cada aspecto de la invención son para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis. Los documentos de la técnica anterior se incorporan aquí a un grado más completo permitido por la ley. Ejemplos La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención en ninguna forma. Se hace referencia adelante en los dibujos acompañantes en los que: La Figura 1a proporciona la secuencia de aminoácido completa de un ILT-2 humano tipo intacto. (SEQ ID No: 1). Los aminoácidos bosquejados muestran residuos de este polipéptido que difiere de los residuos correspondientes de la isoforma 1 de ILT-2 humano Tipo Intacto. Se destacan los aminoácidos del dominio de transmembrana. La Figura 1b proporciona la secuencia de ADN completa de un ILT-2 humano tipo intacto (SEQ ID No: 2) que codifica la secuencia de aminoácido de la Figura 1a. La secuencia de ADN corresponde a aquella dada por el No de acceso de Nucleótido NCIMB: NM_ 006669. Las Figuras 2a y 2b proporcionan respectivamente la secuencia de aminoácido y ADN de una forma de dos dominios solubles de las secuencias ILT-2 tipo intacto proporcionadas en las figuras 1a y 1b. Estas secuencias truncadas contienen/codifican para solo dominios extracelulares D1 y D2 de ILT-2. (SEQ ID No: 3 y SEQ ID NO: 4 respectivamente) La Figura 3 proporciona la secuencia de ADN completa insertada en el vector con base en pGMT7 con el fin de expresar la forma de dos dominios solubles del polipéptido ILT-2 tipo intacto de la Figura 2a. Se destacan las secuencias de reconocimiento de restricción de enzima HindIII y NdeI. Las Figuras 4a a 4d (SEQ ID Nos 6-9) proprocionan la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos similares a ILT de alta afinidad de dos dominios solubles. Los residuos que se han mutado con relación a aquellos de la Figura 2a se bosquejan. Las Figuras 5a a 5d (SEQ ID Nos 10-13) proporcionan las secuencias de ADN insertadas en un vector derivado de pGMT7 con el fin de expresar los polipéptidos similares a ILT de alta afinidad de dos dominios solubles mostrados en las Figuras 4a a 4d respectivamente. Los codones que se han mutado con relación a aquellos de la Figura 3 se bosquejan, y se destacan las secuencias de reconocimiento de restricción de enzima HindIII y NdeI. La Figura 6 proporciona la secuencia de ADN de un vector derivado de pGMT7 en el que se pueden insertar las secuencias de ADN de las Figuras 5a a 5d . La Figura 7 proporciona el mapa de plásmido de un vector derivado de pGMT7 en el que se pueden insertar las secuencias de ADN de las Figuras 5a a 5d . La Figura 8a proporciona la secuencia de aminoácido de un polipéptido similar a ILT de alta afinidad (c20) de dos dominios solubles. La Figura 8b proporciona la secuencia de aminoácido de un polipéptido similar a ILT de alta afinidad de dos dominios soluble (c50).

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La Figura 8c proporciona la secuencia de aminoácido de un polipéptido similar a ILT de alta afinidad de dos dominios solubles (c50) que tiene un residuo cisteína agregado a su terminal C.

La Figura 9a proporciona la secuencia de ADN que codifica un polipéptido similar a ILT de alta afinidad de dos dominios solubles (c20) que tiene una cisteína que codifica el codón agregado a su extremo 5’. Esta secuencia de ADN se ha optimizado para la expresión en sitios de reconocimiento de restricción de enzima Pichia Pastoris e incorpora SnaBI y NotI que se destacan.

La Figura 9b proporciona la secuencia de aminoácido de un polipéptido similar a ILT de alta afinidad de dos dominios solubles (c20) que tiene un residuo cisteína agregado a su terminal C codificado por la secuencia de ADN de la Figura 9a.

La Figura 10 proporciona la curva de respuesta Biacore generada por la interacción de un polipéptido similar a ILT de alta afinidad que expresa dos dominios solubles Pichia Pastoris (c20) y MHC Clase I.

La Figura 11 proporciona la curva de respuesta Biacore generada por la interacción de un dímero de polipéptido similar a ILT de alta afinidad de dos dominios solubles (c20) y Tax-HLA-A*0201.

La Figura 12 proporciona la curva de respuesta Biacore generada por la interacción de un tetrámero de polipéptido similar a ILT de alta afinidad de dos dominios solubles (c20) y Tax-HLA-A*0201.

Las Figuras 13a -13bh proporcionan la secuencia de aminoácidos de polipéptidos similares a ILT de alta afinidad de dos dominios adicionales. La Figura 14 proporciona datos ELISPOT que muestran la inhibición de la activación CTL mediante monómeros y dímeros similares a ILT de alta afinidad (c50).

La Figura 15 proporciona datos ELISPOT que muestran la inhibición de la activación CTL mediante monómeros, dímeros y tetrámeros similares a ILT de alta afinidad (c50). Ejemplo 1-Producción de una molécula ILT-2 tipo intacto soluble que comprende los

dominios 1 y 2.

La Figura 3 (SEQ ID NO: 5) proporciona la secuencia de ADN utilizada para expresar un ILT-2 tipo intacto soluble que contiene solo los dominios D1 y D2. Esta secuencia de ADN se sintetiza de -novo por una empresa de investigación por contrato, GeneArt (Alemania). Los sitios de reconocimiento de restricción de enzima (NdeI y HindIII) se han introducido en esta secuencia de ADN con el fin de facilitar el ligado de la secuencia de ADN en un plásmido de expresión compuesto base en pGMT7, que contiene el promotor T7 para expresión en alto nivel en la cepa E.coli BL21DE3(pLysS) (Pan et al., Biotechniques (2000) 29 (6): 1234-8).

Esta secuencia de ADN se liga en un vector pGMT7 cortado con NdeI y HindIII. (Ver l Figura 6 para la secuencia de ADN de este vector y la Figura 7 para el mapa de plásmido de este vector).

Sitios de reconocimiento de restricción de enzima cuando se introduce en el ADN que

codifica el polipéptido ILT-2 tipo intacto soluble NdeI -CATATG HindIII -AAGCTT Ligación

16 El corte de ADN ILT-2 y el corte del vector se ligan utilizando un equipo de ligación de ADN rápido (Roche) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se transforman plásmidos ligados en células XL1-azul de la cepa competente E.coli y se colocan en placas en placas de LB/agar que contienen 100mg/ml de ampicilina. Luego de incubación durante la noche a 37°C, se agregan colonias sencillas y se hacen crecer en 10 ml de LB que contiene 100mg/ml de ampicilina durante la noche a 37°C con agitación. Los plásmidos clonados se purifican utilizando un equipo Miniprep (Qiagen) y el inserto se secuencia utilizando un secuenciador de ADN automático (Lark Technologies). La Figura 2a muestra la secuencia de aminoácido para el polipéptido ILT-2 tipo intacto soluble producido de la secuencia de ADN de la Figura 2b. Ejemplo 2-Producción de variantes de alta afinidad del polipéptido ILT-2 tipo intacto soluble El polipéptido ILT-2 tipo intacto soluble producido como se describe en el Ejemplo 1 puede utilizar una plantilla para la cual se producen los polipéptidos de la invención que tienen una afinidad incrementada y/o constante de disociación menor para moléculas pMHC Clase I. Como lo muestran aquellos expertos en la técnica, los cambios de codón necesarios requeridos para producir estas cadenas mutadas se pueden introducir en el ADN que codifica el polipéptido ILT-2 tipo intacto soluble mediante mutegenia dirigida a sitio. (Quick-Change™ Site-Directed Mutagenesis Kit de Stratagene) En resumen, esto se logra al utilizar cebadores que incorporan los cambios de codón deseados y los plásmidos que contienen ADN que codifica el polipéptido ILT-2 tipo intacto soluble como una plantilla para la mutagenia. Se lleva a cabo la mutagenia utilizando las siguientes condiciones: 50ng de plantilla de plásmido, 1µl de 10mM dNTP, 5 µl de 10x Pfu de amortiguador de polimerasa de ADN como se suministra por el fabricante, 25 pmol del cebador fwd, 25 pmol del cebador rev, 1 µl de polimerasa de ADN pfu en volumen total de 50 µl. Después de una etapa de desnaturalización inicial de 2 mins a 95C, la reacción se somete a 25 ciclos de desnaturalización (95C, 10 segs), hibridación (55C 10 segs), y elongación (72C, 8 mins). El producto resultante se digiere con la enzima de restricción DpnI para remover el plásmido de plantilla y se transforma en la cepa E. coli XL1-azul. La mutagenia se verifica mediante secuenciamiento. Las secuencias amino de los polipéptidos similares a ILT mutados que demuestran alta afinidad para el complejo YLSGANLNL (SEQ ID NO: 15) -HLA-A*0201 se listan en las Figuras 4a a 4d (SEQ ID Nos: 6 to 9), y Figuras 13a a 13bh (SEQ ID NOs: 21 a 80). Como se conoce por aquellos expertos en la técnica los cambios de codón necesarios que se requieren para producir los polipéptidos mutados se pueden introducir en el ADN que codifica el polipéptido ILT-2 tipo intacto soluble mediante mutagenia dirigida a sitio. (QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit de Stratagene) Ejemplo 3 -Expresión, desdoblamiento y purificación de los polipéptidos solubles El plásmido de expresión que contiene los polipéptidos ILT como se prepara en los Ejemplos 1 o 2 se transforman separadamente en la cepa E.coli rosetta DE3pLysS, y colonias resistentes a ampicilina única/cloramfenicol se hacen crecer en 37°C en medio TYP (ampicilina 100µg/ml, cloramfenicol 15µg/ml) durante 7 horas antes de inducir la expresión de proteína con 0.5mM de IPTG. Se cosechan células 15 horas post-inducción mediante centrifugación durante 30 minutos a 4000rpm en un Beckman J-6B. Se resuspenden glóbulos de célula en un amortiguador, las células

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resuspendidas se sonican en 1 minuto bursts para un total de alrededor de 10 minutos en un sonicador Milsonix XL2020 utilizando una sonda de diámetro 12 mm estándar. Se recuperan glóbulos del cuerpo de inclusión mediante centrifugación durante 10 minutos a 4000rpm en una centrifuga Beckman J2-21. Luego se llevan a cabo tres lavados con detergente para remover cell debris y los componentes de membrana. Cada vez el glóbulo de cuerpo de inclusión se homogeniza en un amortiguador Triton (50mM Tris-HCI, 0.5% Triton-X100, 200mM NaCI, 10mM NaEDTA, 0.1 % (p/v) NaAzida, 2mM DTT, pH 8.0) antes de ser convertido en glóbulo mediante centrifugación durante 15 minutos a 4000rpm en un Beckman J2-21. Luego se remueve el detergente y la sal mediante un lavado similar en el siguiente amortiguador: 50mM Tris-HCl, 1mM NaEDTA, 0.1% (p/v) NaAzida, 2mM DTT, pH 8.0. Finalmente, los cuerpos de inclusión se dividen en alícuotas de 60mg y se congelan a -70°C. Se cuantifica la producción de proteína de cuerpo de inclusión al solubilizar con 6M de guanidina-HCl y se mide utilizando un espectrómetro UV.

Aproximadamente 60mg del polipéptido ILT solubiliza los cuerpos de inclusión que se descongelan de soluciones madre congeladas y se diluye en 15ml de una solución guanidina (6 M de clorhidrato de guanidina, 10mM de Acetato de Sodio, 10mM EDTA), para asegurar la desnaturalización de cadena completa. La solución de guanidina que contiene el polipéptido ILT desnaturalizado y completamente reducido luego se inyecta en 1 litro del siguiente amortiguador redoblado: 100mM Tris pH 8.5, 400mM L-Arginina, 2mM EDTA, 5mM de Cistaeimina reducida, 0.5mM 2-mercaptoetilamina, 5M urea. Se agregan acoples redox (2-mercaptoetilamina y cistamina (en concentraciones finales de 6.6mM y 3.7mM, respectivamente) aproximadamente 5 minutos antes de la adición del polipéptido ILT desnaturalizado. La solución se deja durante 30 minutos. El polipéptido ILT redoblado se dializa en membrana Spectrapor 1 (Espectro; Product No. 132670) contra 10 L 10 mM Tris pH 8.1 a 5°C ± 3°C durante 18-20 horas. Después de este tiempo, el amortiguador de diálisis se cambia a 10 mM de Tris fresco pH 8.1 (10 L) y se continúa la diálisis a 5°C ± 3°C durante otras 20-22 horas.

Se separa el polipéptido ILT soluble de los productos de degradación y las impurezas al cargar el dializado replegado en una columna de intercambio de anión de POROS 50HQ y eluyendo la proteína vinculada con un gradiente de 0-500mM NaCI sobre 50 volúmenes de columna utilizando un purificador Akta (Pharmacia). Las fracciones pico se almacenan a 4°C y se analizan mediante SDSPAGE de teñido Coomassie antes de agrupar y concentrar. Finalmente, el polipéptido ILT soluble se purifica y se caracteriza utilizando una columna de filtración de gel Superdex 200HR pre-equilibrada en amortiguador HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.5 mM EDTA, 0.05% nonidet p40). El pico eluido en un peso molecular relativo de aproximadamente 27 kDa se agrupa y se concentra antes de caracterización mediante análisis de Resonancia de Plasmón de Superficie Biacore.

Ejemplo 4 – Caracterización de Resonancia de Plasmón de Superficie Biacore de la unión de moléculas ILT solubles a moléculas pMHC

Un biosensor de Resonancia de Plasmón de Superficie (Biacore 3000™) se utiliza para analizar la unión de moléculas ILT solubles a pMHC Clase I. Esto se facilita al producir pMHC biotinilado soluble (descrito adelante) que se inmovilizan con una superficie de unión cubierta de estreptavidina en una forma semiorientada, que permite la prueba eficiente de la unión de una molécula soluble ILT de hasta cuatro diferentes pMHC (inmovilizado en células de flujo separadas) simultáneamente. La inyección del pMHC permite que el nivel preciso de moléculas clase I inmovilizadas sean manipuladas fácilmente.

EL HLA-A*0201 clase I biotinilado soluble cargado con un péptido YLSGANLNL derivado de CEA (SEQ ID NO: 15) se repliegan in vitro de cuerpos de inclusión expresados bacterianamente

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que contienen las proteínas de subunidad constituyente y péptido sintético, seguido por purificación y biotinilación enzimática in vitro (O’Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). Se expresa la cadena pesada MHC con una etiqueta de biotinilación de terminal C que reemplaza los dominios de transmembrana y citoplásmicos de la proteína en una construcción apropiada. Se obtienen niveles de expresión del cuerpo de inclusión del cultivo bacteriano de ~ 75 mg/litro. La cadena liviana MHC o microbulina β2 también se expresa como cuerpos de inclusión en E.coli de una construcción apropiada, en un nivel de cultivo bacteriano de ~ 500 mg/litro.

Las células E. coli se lisan y se purifican los cuerpos de inclusión en aproximadamente 80% de pureza. La proteína de los cuerpos de inclusión se desnatura en 6 M de guanidina-HCl, 50 mM Tris pH 8.1, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 10 mM EDTA, y se repleigan en una concentración de cadena pesada de 30 mg/litro, 30 mg/litro de β2m en 0.4 M L-Arginina-HCl, 100 mM Tris pH 8.1, 3.7 mM cistamina, 6.6 mM β-cisteamina, 4 mg/ml del péptido requerido para ser cargado en el MHC, mediante la adición de un pulso único de proteína desnaturalizada en amortiguador replegado a < 5°C. Al replegado se le permite alcanzar la terminación a 4°C durante por lo menos 1 hora.

El amortiguador se intercambia mediante diálisis en 10 volúmenes de 10 mM Tris pH 8.1. Son necesarios dos cambios del amortiguador para reducir la resistencia iónica de la solución suficientemente. La solución de proteína luego se filtra a través de un filtro de acetato de celulosa de 1.5µm y se carga en una columna de intercambio de anión POROS 50HQ (volumen de lecho de 8 ml). Se eluye la proteína con un gradiente lineal de 0-500 mM de NaCl. El complejo de péptido HLA-A2 biotinilado soluble se eluye en aproximadamente 250 mM NaCl, y se recolectan fracciones pico, se agrega un cóctel de inhibidores proteasa (Calbiochem) y las fracciones se congelan en hielo.

El pMHC etiquetado de biotinilación se intercambian en amortiguador en 10 mM Tris pH 8.1, 5 mM NaCl utilizando una columna de destilación rápida de Pharmacia equilibrada en el mismo amortiguador. Inmediatamente luego de elución, las fracciones que contienen la proteína se congelan en hielo y se agrega cóctel inhibidor de proteasa (Calbiochem). Luego se agregan reactivos de biotinilación: 1 mM biotina, 5 mM ATP (amortiguado a pH 8), 7.5 mM MgCl2, y enzima de 5 µg/ml BirA (purificada de acuerdo con O’Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 9-15). A la mezcla luego se le permite incubar a temperatura ambiente durante la noche.

Los pMHC biotinilados se purifican utilizando cromatografía de filtración de gel. Se preequilibra una columna Pharmacia Superdex 75 HR 10/30 con PBS filtrado y 1 ml de la mezcla de reacción de biotinilación se carga y la columna se desarrolla con PBS a 0.5 ml/min. El pMHC biotinilado se eluye como un único pico en aproximadamente 15 ml. Se agrupan las fracciones que contienen proteína, se enfrían en hielo, y se agrega cóctel de inhibidor de proteasa. Se determina la concentración de proteína utilizando un ensayo de unión Coomassie (PerBio) y alícuotas de pMHC biotinilado se almacenan congelados a -20°C. Se inmoviliza la estreptavidina mediante métodos de acoplamiento de amina estándar.

Tales pMHC inmovilizados son capaces de unir los receptores de célula T solubles y el coreceptor CD8αα, así como también moléculas ILT, y se pueden utilizar estas interacciones para asegurar que el pMHC inmovilizado se repliegan correctamente.

Las interacciones entre una molécula soluble ILT y YLSGANLNL derivado de CEA (SEQ ID NO: 15)-HLA-A*0201, la producción la cual se describió anteriormente, se analizan en un biosensor de Resonancia de Plasmón de Superficie Biacore 3000™ (SPR). Los cambios en las medidas de SPR en el índice refractivo se expresa en unidades de respuesta (RU) cerca a una superficie de sensor dentro de una célula de flujo pequeño, un principio que se puede utilizar para detectar interacciones de ligando de receptor y para analizar su afinidad y parámetros cinéticos. Se

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preparan células de sonda de flujo al inmovilizar los complejos pMHC en células de flujo por medio de la unión de etiqueta biotina. El ensayo luego se desarrolla al pasar ILT soluble sobre las superficies de las diferentes células de flujo en una velocidad de flujo constante, medir la respuesta SPR al hacerlo.

Para medir la constante de unión de equilibrio

Se preparan diluciones seriales de moléculas ILT solubles y se inyectan en velocidad de flujo constante de 5 µl min-1 sobre dos células de flujo diferentes; una recubierta con ~ 500 RU del complejo -HLA-A*0201 específico, la segunda célula se deja el blanco como un control. Se normaliza la respuesta para cada concentración utilizando la medición de la célula de control. Se grafica la respuesta de datos normalizada versus la concentración de la muestra ILT y se fija a una hipérbola con el fin de calcular la constante de unión de equilibrio, KD. (Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2da Edición) 1979, Clarendon Press, Oxford).

Para medir Parámetros Cinéticos

Para los ILT solubles de alta afinidad se determina el KD al medir experimentalmente la constante de índice de disociación, kd, y la constante de índice de asociación, ka. La constante de equilibro KD se calcula como kd/ka.

Se inyectan moléculas similares a ILT de alta afinidad sobre dos células diferentes una recubierta con ~ 300 RU de complejo YLSGANLNL derivado de CEA (SEQ ID NO: 15)-HLAA*0201, el segundo se deja en blanco como un control. Se establece la velocidad de flujo a 50 µl/min. Típicamente se inyecta 250 µl del polipéptido ILT a -3 µM. El amortiguador luego fluye hasta que la respuesta ha regresado a valores iniciales. Se calculan parámetros cinéticos utilizando el software Biaevaluation. La fase de disociación también se fija en una única ecuación de decaimiento exponencial que permite calcular la vida útil.

Resultados

La interacción entre una variante soluble de ILT-2 tipo intacto y el complejo YLSGANLNLHLA-A*0201 derivado de CEA se analiza utilizando los métodos anteriores y se demuestra un KD de aproximadamente 6 CEA M. Las moléculas similares a ILT que tienen las secuencias de aminoácido proporcionadas en las Figuras 4a a 4d (SEQ ID Nos: 6 a 9), y Figuras 13a a 13bh (SEQ ID NOs: 21 a 80) tienen un KD de menos de o igual a 1 CEA M y/o de 2 S-1 o menos.

Ejemplo 5 – Análisis de Resonancia de Plasmón de Superficie Biacore de inhibición mediada por ILT soluble de la interacción pMHC/CD8

Un biosensor de Resonancia de Plasmón de Superficie (Biacore 3000™) se utiliza para analizar la inhibición mediada por ILT soluble de la interacción pMHC/CD8. Esto se facilita al producir complejos solubles pMHC (descritos adelante) y moléculas CD8αα solubles biotiniladas (también descritas adelante). Las moléculas CD8αα biotiniladas solubles se inmovilizan con una superficie de unión cubierta con estreptavidina "trozos Biacore" en una forma semiorientada, que permite la prueba eficiente de la unión de complejos solubles pMHC para el CD8αα soluble inmovilizado. La inyección de las moléculas CD8αα solubles biotiniladas permite el nivel preciso de moléculas CD8 inmovilizadas que se manipulan fácilmente.

El pMHC HLA-A*0201 soluble cargado con un péptido YLSGANLNL derivado con CEA (SEQ ID NO: 15) se produce utilizando los métodos como se describe sustancialmente en (Garboczi et. al., (1992) PNAS USA 89 3429-3433). Las moléculas solubles pMHC se replegan in vitro de los cuerpos de inclusión que expresan E. coli que contienen las proteínas de subunidad constituyentes y el péptido sintético y luego se purifica. La cadena liviana MHC o la microglobulina β2 también se

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expresa como cuerpos de inclusión en E.coli de una construcción apropiada, en un nivel de cultivo bacteriano de ~ 500 mg/litro.

Se lisan células E. coli y se purifican los cuerpos de inclusión, y las proteínas sobreexpresadas se replegan y se purifican utilizando los métodos detallados en el Ejemplo 4 excepto que se omiten las etapas de biotinilación.

Las moléculas CD8 solubles biotiniladas se producen como se describe en los Ejemplos 1 y 6 de la EP1024822. En resumen, el CD8α soluble que contiene una etiqueta de biotinilación de terminal C se expresa como cuerpos de inclusión en E.coli y luego se purifica y se repliegan para producir homodímeros CD8αα que contiene una secuencia de etiqueta que se puede biotinilar enzimáticamente. (Schatz, (1993) Biotechnology N Y 11: 1138-43). La biotinilación de las moléculas CD8α etiquetas luego se alcanza utilizando la enzima BirA (O’Callaghan, et al. Anal Biochem 266(1): 9-15 (1999) Los reactivos de biotinilación son: 1 mM biotina, 5 mM ATP (amortiguado a pH 8), 7.5 mM MgCl2, y 5 µg/ml de enzima BirA (purificada de acuerdo con O’Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem. 266: 915). A la mezcla luego se le permite incubar a temperatura ambiente durante la noche.

El sCD8αα biotinilado se inmoviliza en la superficie de un chip cubierto con estreptavidina Biacore que produce un cambio en el índice refractivo de 1000 unidades de respuesta. Tales moléculas CD8αα inmovilizadas son capaces de unir los complejos solubles pMHC que se pueden inyectar en la fase soluble.

La capacidad de las moléculas ILT para inhibir la interacción pMHC/CD8 en un biosensor de resonancia de plasmón de superficie Biacore 3000™ (SPR) se analiza como sigue:

Los cambios en las mediciones SPR en el índice refractivo expresado en unidades de respuesta (RU) cerca a la superficie sensora dentro de una célula de flujo pequeña, un principio que se puede utilizar para detectar las interacciones de ligando de receptor y para analizar su afinidad y parámetros cinéticos. The trozos se preparan al inmovilizar las moléculas CD8αα biotiniladas solubles con trozos cubiertos con estreptavidina como se describió anteriormente. Se preparan diluciones seriales del ILT tipo intacto o moléculas similares a ILT de alta afinidad y se inyectan en velocidad de flujo constante de 5 µl min-1 sobre una célula de flujo cubierta con 1000 RU de CD8αα biotinilado en la presencia de una concentración adecuada de YLSGANLNL soluble (SEQ ID NO: 15) -HLA-A*0201. La inhibición de las respuestas SPR para la interacción CD8αα/pMHC produce una curva de respuesta de dosis que se utiliza para calcular un valor IC50 para el polipéptido que se ha evaluado para esta interacción. Ejemplo 6 – Comparación de identidad y similitud de secuencia de polipéptido El algoritmo de comparación de proteína-proteína utilizado para generar identidad y datos de

similitud para esta aplicación está disponible por medio del siguiente sitio web: http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www/cgi/search_frm2.cgi La "FASTA: proteína: ADN de proteína: ADN" programa disponible en el sitio web se

utiliza para llevar a cabo estas comparaciones. Se utilizan las siguientes configuraciones

(predeterminadas): Ktup: Ktup=2 Matriz de clasificación: Blosum 50 Gap: -10 Ext: -2

Con el fin de correr las comparaciones requeridas el fragmento soluble ILT-2 de la secuencia de aminoácido en el código de única letra como se proporciona en la Figura 4b (SEQ ID NO: 7) se

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ingresa como la primera secuencia (consulta) y la secuencia de aminoácido para su comparación se ingresa como la segunda secuencia (colección). El algoritmo luego se puede correr y proporcionará el porcentaje de identidad y las clasificaciones de similitud para el par de las secuencias comparadas.

Como será obvio para aquellos expertos en la técnica existe un número de fuentes de proteína FASTA: comparaciones de proteína que se pueden utilizar para este análisis.

Ejemplo 7 -Producción de vectores Pichia pastoris para la expresión del polipéptido similar a c20 ILT de alta afinidad soluble

La Figura 9a (SEQ ID NO: 19) proporciona la secuencia de ADN utilizada para expresar un polipéptido similar a ILT de alta afinidad c20 soluble que contiene solo dominios D1 y D2 en Pichia pastoris. Esta secuencia de ADN que se optimiza para la expresión Pichia se sintetiza de-novo mediante una compañía de investigación por contrato, GeneArt (Alemania). Se agrega un codón que codifica la cisteína el extremo 3’ de este ADN con el fin de proporcionar una “etiqueta” en el Terminal C del polipéptido similar a ILT expresado para facilitar la multimerización si se requiere. Se introducen sitios de reconocimiento de restricción de enzima (SnaBI y NotI) en su secuencia de ADN con el fin de facilitar la ligación de la secuencia de ADN en un plásmido de expresión pPIC9K. (Invitrogen)

Los sitios de reconocimiento de restricción de enzima como se introduce en el ADN que codifica el polipéptido similar a c20 ILT de alta afinidad soluble:

SnaBI -tacgta

NotI -gcggccgc

Ligación

El polipéptido similar a ILT de alta afinidad que codifica la secuencia de ADM se liga en un vector pPIC9K (Invitrogen) corta con las enzimas de restricción SnaBI y NotI utilizando un equipo de ligación de ADN rápido (Roche).

Amplificación de Plásmido

Se transforman plásmidos ligados en azul competente XL1, (Stratagene, Country) y se colocan en placas en placas LB/agar que contienen 100mg/ml de canamicina. Luego de incubación durante la noche a 37°C, se agrega colonias sencillas y se hacen crecer en 100 ml de LB que contiene 100mg/ml de canamicina durante la noche a 37°C con agitación. Se purifican plásmidos clonados utilizando un equipo Midiprep (Qiagen) y el inserto se secuencia utilizando un secuenciador de ADN automático (Lark Technologies).

La Figura 9b (SEQ ID NO: 20) muestra la secuencia de aminoácido del polipéptido similar a ILT de alta afinidad de dos dominios (c20) codificado por la secuencia de ADN de la Figura 9a (SEQ ID NO: 19).

Ejemplo 8 -Expresión y purificación de polipéptidos similares a ILT alta afinidad solubles en Pichia pastoris

El plásmido de expresión Pichia pastoris que contiene la afinidad del ADN que codifica el polipéptido similar a ILT como se prepara en el Ejemplo 7 se transforman en la cepa Pichia pastoris GS 115 (Invitrogen, USA) como sigue;

Se hacen células GS 115 Pichia competentes utilizando un equipo Pichia EasyComp (Invitrogen). Este equipo utiliza PEG1000 para hacer las células químicamente competentes.

El ADN del polipéptido similar a ILT que contiene el vector se lineariza utilizando Sal I y se transforma en la cepa GS 115 como se describe en el manual Invitrogen.

Los transformantes que contienen el polipéptido similar a ILT de alta afinidad que codifica el ADN se seleccionan al hacer crecer células en placas agar RDB (Invitrogen). El agar RDB carece de

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histidina, asegurando que solo crecerán las células de levadura que se han transformado exitosamente con el plásmido pPIC9K. El plásmido pPIC9K imparte la capacidad de hacer crecer en histidina-agar al proporcionar una copia del gen HIS4 que permite el crecimiento en medio His.

Las colonias sencillas se recogen de la placa de agar y se hacen crecer 30°C en medio BMGY (Invitrogen) durante la noche antes de inducir la expresión de la proteína. Se induce la expresión de la proteína al centrifugar las células (2000xg, 10 min) y se resuspende en 200ml de medio de inducción BMMY (Invitrogen). Se cosechan células 6 días post-inducción mediante centrifugación durante 30 minutos a 2000x g. Se concentra el sobrenadante mediante filtración de flujo tangencial (corte Sartorious 10 kDa) a 10 ml y se purifica utilizando SEC (S200HR GE Healthcare)

Se almacenan fracciones pico a 4°C y se analizan mediante teñido Coomassie SDS-PAGE antes de ser agrupados y se concentran. Finalmente, el polipéptido similar a ILT de alta afinidad soluble se purifica y se caracteriza utilizando la columna de filtración de gel Superdex 200HR preequilibrada en amortiguador HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.5 mM EDTA, 0.05% nonidet p40). El pico eluido en peso molecular relativo de aproximadamente 27 kDa se agrupa y se concentra antes de caracterización mediante análisis de Resonancia de Plasmón de Superficie Biacore utilizando los métodos detallados en el Ejemplo 4.

Resultados

El polipéptido similar a ILT c20 de alta afinidad expresado en Pichia pastoris tiene un KD de aproximadamente 100 -150 nM para MHC clase I cuando se determina por el método con base en Biacore del Ejemplo 4. (Ver la Figura 10 para la curva Biacore generada utilizando el polipéptido similar a ILT c20 de alta afinidad que produce Pichia. Esto compara a un KD de aproximadamente 25 85nM determinado para el polipéptido similar a ILT c20 de alta afinidad producido por E.coli correspondiente.

Ejemplo 9 – Dimerización de polipéptidos similares a ILT utilizando un ligador 3.4kdMalPEG-Mal.

Los polipéptidos similares a ILT de alta afinidad solubles c50 que contienen el residuo cisteína adicional en el terminal C se preparan utilizando los métodos detallados en los Ejemplos 1 a

3.

(Ver la Figura 8b (SEQ ID NO: 17) para la secuencia de aminoácido de este polipéptido) Los polipéptidos similares a ILT se reticulan utilizando maleimida-PEG bifuncional no ramificado (MALPEG-MAL, MW 3.4KD, NOF Corporation, Japón). Los grupos maleimida en el Terminal de este ligador confieren especificidad de unión libre de tiol para el ligador. Antes de reticular el polipéptido similar a ILT se pretrata con un agente de reducción, 0.1mM DTT (temperatura ambiente, durante la noche), con el fin de liberar la cisteína libre en el polipéptido similar a ILT soluble. Esta concentración baja de agente de reducción se utiliza para reducir selectivamente el residuo cisteína de Terminal C expuesto. El polipéptido similar a ILT soluble luego se vuelve a purificar mediante cromatografía de filtración de gel (Superdex 75) en amortiguador PBS. El polipéptido similar a ILT luego se vuelve a concentrar utilizando un concentrador de membrana centrífugo de corte de 10kDa (VivaScience, Satorius). Se logra reticular mediante la adición en forma de etapas de MAL-PEGMAL (10mM en DMF) en una relación molar de aproximadamente 2:1 (proteína para reticular) y se incuba posteriormente durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto luego se purifica utilizando la columna de filtración de gel Superdex 75 HR10/30 pre-equilibrada en PBS. Se observan tres picos después de reticulación; del cual uno corresponde con la posición de polipéptidos similares a ILT intactos "monoméricos" que corresponde a especies de masa molecular mayor. El material en los pocito se analiza adicionalmente mediante SDS-PAGE.

23 Las muestras de los tres picos se pretratan con amortiguador de muestra SDS estándar (BioRad) sin DTT (sin reducción) o con 15mM de DTT (reducción), y se hacen correr en un gradiente 4-20% de PAGE y se tiñen con la cepa azul Coomassie. Bajo condiciones sin reducción, el material en los tres picos aparece como la especie reticulada (ILT-PEG-ILT), una especie intermedia (ILT--PEG) y el ILT-2 no modificado respectivamente. La capacidad de los dímeros de polipéptido similar a ILT c50 de alta afinidad soluble para unir el PMHC Clase I se confirma utilizando el método con base en Biacore se detalla en el Ejemplo

4.

Los dímeros similares a ILT c50 de alta afinidad solubles demuestran un tiempo para la disociación de aproximadamente 30-86 minutos. Mediante comparación, el Biacore determina el KD del polipéptido monomérico ILT-2 c50 soluble correspondiente es aproximadamente 6 segs. Esta claridad demuestra la afinidad mejorada obtenida mediante dimerización. La Figura 11 proporciona la curva Biacore para la interacción del dímero de polipéptido similar a ILT c50 de alta afinidad soluble y TaxHLA-A*0201. Esta curva Biacore también tiene la línea de regresión agregada que se utiliza para calcular el tiempo medio para la disociación de corrida particular. (86 minutos)

Ejemplo 10 – Tetramerización de polipéptidos ILT-2.

Los polipéptidos similares a ILT c50 de alta afindad solubles que contienen un residuo cisteína adicional en el terminal C se tetramerizan utilizando una maleimida-PEG tetramérica (4arm MAL-PEG, MW 20KD, Shearwater Corporation). Los grupos maleimida en el terminal de este ligador confieren la especificidad de unión tiol libre para el ligador. Antes de reticular los polipéptidos similares a ILT c50 de alta afinidad solubles se pretratan con un agente de reducción, 0.1mM DTT (temperatura ambiente, durante la noche), con el fin de liberar la cisteína libre en los polipéptidos solubles ILT-2. Esta baja concentración de agente de reducción se utiliza para reducir selectivamente el residuo de cisteína expuesto al terminal C. Los polipéptidos similares a ILT c50 de alta afinidad solubles luego se vuelven a purificar mediante cromatografía de filtración de (Superdex 75) en amortiguador PBS. Los polipéptidos similares a ILT c50 de alta afinidad solubles luego se vuelven a concentrar utilizando un concentrador de membrana centrífuga de corte 10kDa (VivaScience, Satorius). Se logra la tetramerización mediante la adición en forma de etapa del MAL-PEG de 4 brazos (10mM en DMF) en una relación molar de aproximadamente 4:1 (proteína reticulada) e incubación posterior durante 2 horas a temperatura ambiente. El producto luego se purifica utilizando la columna de filtración de gel Superdex 75 HR10/30 preequilibrada en PBS. Las fracciones eluidas se analizan adicionalmente mediante SDS-PAGE.

Las muestras de las fracciones se pretratan con amortiguador de muestra SDS estándar (BioRad) sin DTT (sin reducción) o con 15mM DTT (reducción), y se hacen correr en un gradiente 420% de PAGE y se tiñen con la cepa azul Coomassie. Los geles SDS PAGE demuestran que las especies de polipéptido similar a ILT c50 de alta afinidad solubles tetraméricos se hacen aproximadamente 50% de la proteína presente.

La capacidad de estos tetrámeros para unir el PMHC Clase I se confirma utilizando el método con base en Biacore detallado en el Ejemplo 4. Los tetrámeros similares a ILT c50 solubles se vinculan fuertemente a Tax-HLA*0201 que es imposible para determinar el KD evidente o el tiempo medio para disociación para la interacción. Mediante comparación, el Biacore determina el tiempo medio para disociación para la interacción de los polipéptidos monoméricos y diméricos ILT-2 c50 solubles correspondientes son 30 -86 minutos y aproximadamente 6 segundos respectivamente. Esta claridad demuestra la afinidad mejorada obtenida mediante tetramerización. La Figura 12 proporciona la curva Biacore para la interacción del tetrámero de polipéptido similar a ILT c50 de alta afinidad soluble y Tax-HLA*A0201.

24 Ejemplo 11 – Ensayo ELISPOT para evaluar la inhibición in-vitro de la activación de célula T citotóxica (CTL) mediante monómeros, dímeros o tetrámeros similares a ILT c50 de alta afinidad El siguiente método proporciona un medio para evaluar la capacidad los monómeros de polipéptido similares a ILT c50 de alta afinidad solubles y complejos multivalentes de inhibir la activación de célula T mediada por el co-receptor CD8. Reactivos: Medio de ensayo: 10% FCS (inactivado por calor, Gibco, cat# 10108-165), 88% RPMI 1640 (Gibco, cat# 42401-018), 1% glutamina (Gibco, cat# 25030-024) y 1% penicilina/estreptomicina (Gibco, cat# 15070-063). Amortiguador de lavado: 0.01 M PBS/0.05% Tween 20 (1 bolsita de solución salina amortiguada con fosfato con Tween 20, pH7.4 de Sigma, Cat. # P-3563 disuelto en 1 litro de agua destilada que da la composición final 0.01 M PBS, 0.138 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.05 % Tween 20). PBS (Gibco, cat#10010-015). El equipo Diaclone EliSpot (IDS) el equipo EliSpot contiene todos los otros reactivos es decir anticuerpos de captura y detección, polvo de leche descremada, BSA, estreptavidina-fosfatasa alcalina, solución BCIP/NBT (IFN-γ humano PVDF Eli-spot 20 x 96 pozos con placas (IDS cat# DC856.051.020, DC-856.000.000. El siguiente método se basa en las instrucciones del fabricante suministradas con cada equipo pero contiene algunas alteraciones. Método Se diluye el anticuerpo de captura de 100 µl en 10 ml de PBS estéril por placa. Se forman alícuotas del anticuerpo de captura diluido en 100 µl en cada pozo y se dejan durante la noche a 4°C, o durante 2 hr a temperatura ambiente. Las placas luego se lavan tres veces con 450 µl de amortiguador de lavado, el lavador de placa de 96 pozos de ultralavado, (Thermo Life Sciences) para remover el exceso de anticuerpo de captura. Luego se agrega 100 µl de 2% de leche descremada a cada pozo. (Un frasco de polvo de leche descremada cuando se suministra con el equipo EliSpot se disuelve en 50 ml de PBS estéril). Las placas luego se incuban a temperatura ambiente durante dos horas antes de lavado cuando se lava tres veces adicionales con 450µl de amortiguador de lavado, lavador de placa de 96 pozos de Ultralavado, (Thermo Life Sciences). Se desunen células objetivo Mel 624 y Mel 526 de sus frascos de cultivo de tejido utilizando tripsina, se lavan una vez mediante centrifugación (280 x g durante 10 minutos) en medio de ensayo y se resuspenden a 1x106/ml en el mismo medio. Luego se agrega 50ul de esta suspensión a la placa de ensayo para dar un número de células objetivo total de 50,000 células/pozo. Se cosecha un clon de célula T específico MART-1 (KA/C5) (estirpe celular efectora) mediante centrifugación (280 x g durante 10 min) y se resuspende a 1x104/ml en medio de ensayo para dar 500 células/pozo cuando se agrega 50µl a la placa de ensayo. Se diluyen el monómero, dímero y tetrámero de polipéptido similar a ILT c50 de alta afinidad soluble en medio de ensayo en una concentración de 3x para dar un 1x final cuando se agrega 50ul a la placa en un volumen final de 150µl. el rango de concentración del monómero ILT-2 es 10µM-0.03µM. El rango de concentración del dímero y tetrámero ILT-2 probado es 1µM-0.003µM. Luego se preparan pozos que contienen lo siguiente, (el volumen de reacción final en cada pozo es 100µl): Muestras de prueba (agregadas en orden)

50 µl de células objetivo Mel 624 o Mel 526

25 50ul de la concentración deseada del monómero, tetrámero o dímero similar a ILT. 50ul de células efectoras de clon de célula T. Controles Negativos

50 µl de células objetivo 50ul de la concentración mayor del monómero, dímero o tetrámero similar a ILT 50 µl de medio de ensayo o 50µl de células efectoras 50µl de la concentración mayor del monómero, dímero o tetrámero similar a ILT 50µl de medio de ensayo Controles Positivos

50 µl de células objetivo Mel 624 o Mel 526 50 µl de células efectoras 50 µl de medio de ensayo o Para mostrar dependencia CD8

50µl de células objetivo Mel 624 o Mel 526

50 µl de células efectoras

50µl que contiene 100µg/ml HB230 de anticuerpo anti-CD8

Las placas luego se incuban durante la noche 37°C/5% de CO2. A continuación se lavan las placas seis veces con amortiguador de lavado antes de retirar el exceso de amortiguador. Luego se agrega 550 µl de agua destilada a cada frasco de detección suministrado con el equipo ELISPOT para preparar una solución diluida. Luego se diluye adicionalmente 100 µl de la solución de anticuerpo de detección diluida en 10 ml de PBS/1% BSA por placa y 100 µl de la solución de anticuerpo de detección diluido se forman alícuotas en cada pozo. Las placas luego se incuban a temperatura ambiente durante 90 minutos.

Después de este tiempo las placas se lavan tres veces con amortiguador de lavado (tres veces con 450 µl de amortiguador de lavado, lavador de placa de 96 pozos de Ultralavado (Thermo Life Sciences) y se le da golpe seco. Luego se diluye 10 µl de estreptavidina-fosfatasa alcalina con 10 ml con PBS/1% BSA por placa y 100 µl de la estreptavidina diluida se agrega a cada pozo y se incuba a temperatura ambiente durante 1 hr. Las placas luego se lavan de nuevo tres veces con 450 µl de amortiguador de lavado y se le da golpe seco.

Se agrega 100 µl de la solución suministrada BCIP/NBT a cada pozo y las placas se cubren con láminas y se dejan desarrollar durante 5 -15 min. Las placas se revisan regularmente durante este periodo para la formación de manchas con el fin de decidir cuándo termina la reacción.

Las placas luego se lavan vigorosamente en agua de grifo y se agitan antes de tomar parte y dejar de secar en el banco.

Una vez se leen las placas utilizando un lector ELISPOT (Autoimmune Diagnotistika, Alemania).

El número de manchas que aparecen en cada pozo es proporcional al número de células T activadas. Por lo tanto, cualquier reducción en el número de manchas en los pozos que contienen el

26 monómero, dímero o tetrámero de polipéptido similar a ILT c50 de alta afinidad soluble indica la inhibición de la activación CTL mediada por el co-receptor CD8. Resultados Como se muestra en la Figura 14 el polipéptido ILT-2 c50 de alta afinidad es efectivo en 5 inhibir la activación de CTL en las formas monoméricas y diméricas. El dímero similar a ILT c50 de alta afinidad es considerablemente más efectivo para inhibir la activación de CTL que el monómero correspondiente. El tetrámero similar a ILT c50 de alta afinidad es todavía más efectivo. (Ver Figura 15). Los valores IC50 calculados de los datos mostrados en la Figura 15 para la inhibición de los CTL mediante los polipéptidos similares a ILT monoméricos, diméricos y tetraméricos son 800 nM, 16.2 10 nM y 0.7 nM respectivamente.

Claims (59)

1. 27 REIVINDICACIONES

   1.

   Un polipéptido que tiene la propiedad de unir a un pMHC Clase I dado CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido tiene un KD para el dicho pMHC Clase I dado de menos de o igual a 1 µM y/o tiene una constante de disociación (koff) para la dicha molécula pMHC Clase I dada de 2 S-1 o menos y dicho polipéptido tiene por lo menos a 45% de identidad y/o 55% de similitud con la SEQ ID NO: 7 y dicho polipéptido que inhibe al CD8 se une al pMHC dado a un mayor grado que el polipéptido SEQ ID NO: 3.

2. 2.

   Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 que es una molécula ILT humana mutada.

3. 3.

   Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 o reivindicación 2 en donde el dicho KD y/o koff es/son según se mide mediante Resonancia de Plasmón de Superficie.

4. 4.

   Un polipéptido como se reivindica en cualquier reivindicación precedente en donde uno

   o más de los aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 10W, 19Q, 20G, 21S, 42K, 47W, 50R, 66I, 77Y, 78Y, 79G, 80S, 81D, 82T, 83A, 84G, 85R, 87E, 99A,101I, 102K, 141 E, 146L, 147N, 159I, 168S, 172W, 174R y 188L de la SEQ ID NO: 3 se muta/se mutan.

5. 5.

   Un polipéptido como se reivindica en cualquier reivindicación precedente que comprende una o más de las siguientes mutaciones 10W→L, 19Q→M, 19Q→L, 19Q→V, 20G→D, 20G→M, 20G→Q, 20G→F, 20G→S, 20G→E, 20G→R, 21S→Q, 21S→R, 21S→A, 21S→S, 42K→R, 47W→Q, 50R→L, 66L→V, 77Y→V, 77Y→M, 77Y→I, 77Y→Q, 78Y→Q, 78Y→1, 78Y→G, 79G→Q, 79G→Y, 79G→W, 79G→R, 79G→V, 80S→R, 80S→T, 80S→G, 81D→G, 81D→Q, 81D→L, 81D→V, 82T→G, 82T→E, 83A→S, 83A→G, 83A→R, 84G→L, 84G→Q, 84G→A, 85R→W, 87E→A, 99A→I, 99A→Y, 1011→L, 1011→K, 1011→Q, 1011→V, 102K→Q, 102K→A, 102K→R, 141E→G, 141E→D, 146L→D, 147N→S, 159I→E, 168S→G, 172W→R, 174R→W o 188L→D utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

6. 6.

   Un polipéptido como se reivindica en cualquier reivindicación precedente que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→M y 21S→Q utilizando el número de la SEQ ID NO: 3

7. 7.

   Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→M, 20G→D, 21S→Q, 99A→Vy 168S→G utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

8. 8.

   Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→L, 20G→M, y21S→Q utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

9. 9.

   Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→M, 20G→Q, 21S→R, 42K→R, y 146L→S utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

10. 10.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→M, 20G→D, 21S→Q, 83A→S, 84G→Q, 85R→W, 87E→A y 99A→V utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

11. 11.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en donde los aminoácidos que corresponden a uno o ambos de 135C o 145C utilizando el número de la SEQ ID NO: 3. se muta/se mutan a S.

12. 12.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende aminoácidos que corresponden a por lo menos aminoácidos 1-195 de la SEQ ID NO: 3.

13. 13.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquier reivindicación precedente que consiste de o incluye cualquiera de la SEQ ID NOs: 6 a 9 o 21 a 61.

14. 14.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquier reivindicación precedente que consiste de o incluye SEQ ID NO: 16.

15. 15.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquier reivindicación precedente que comprende una o más mutaciones que incrementa la solubilidad del polipéptido con relación a una carencia de polipéptido correspondiente de dichas mutaciones.

16. 16.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 15 en donde por lo menos un disolvente expuesto al aminoácido hidrófobo se sustituye por un aminoácido cargado.

17. 17.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 15 o reivindicación 16 en donde dichas mutaciones están dentro de los 6 aminoácidos del polipéptido de terminal C.

18. 18.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 en donde los aminoácidos que corresponden a 196L y/o 198L de la SEQ ID NO: 3 se mutan a 196D y 198D respectivamente.

19. 19.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 que comprende mutaciones que corresponden a 19Q→M, 20G→D, 21S→Q, 83A→S, 84G→Q, 85R→W, 87E→A, 99A→V, 196L→D y 198L→D utilizando el número de la SEQ ID NO: 3.

20. 20.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 que consiste de o incluye cualquiera de la SEQ ID NOs: 63 a 80.

21. 21.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19 que consiste de o incluye SEQ ID Nos: 17 o 62.

22. 22.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquier reivindicación precedente que comprende una “etiqueta” en su terminal C.

23. 23.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 22, en donde dicha etiqueta es un residuo cisteína.

24. 24.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquier reivindicación precedente en donde el polipéptido se asocia con por lo menos una cadena polialquilenglicol.

25. 25.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 24 en donde la cadena o cadenas polialquilenglicol se une/unen covalentemente al polipéptido.

26. 26.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 24 o reivindicación 25 en donde la cadena o cadenas polialquilenglicol comprenden por lo menos dos unidades de repetición de polietilenglicol.

27. 27.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquier reivindicación precedente asociada con un agente terapéutico.

28. 28.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 27 en donde el polipéptido se liga covalentemente a un agente terapéutico.

29. 29.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 28 en donde el agente terapéutico se liga covalentemente al terminal C del polipéptido.

30. 30.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29 en donde el agente terapéutico es una molécula efectora inmune.

31. 31.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 30 en donde la molécula efectora inmune es una citoquina.

32. 32.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 31 en donde la molécula efectora inmune es IL-4, IL-10 o IL-13.

33. 33.

    Un complejo multivalente que comprende por lo menos dos polipéptidos como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32, dicho complejo multivalente tiene un KD para un pMHC Clase I dado de menos de o igual a 1 µM y/o una constante de disociación (koff) para el dicho pMHC Clase I dado de 2 S-1 o menos.

34. 34.

    Un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 33 en donde los polipéptidos se liga mediante una cadena de polímero no peptídica o una secuencia ligadora peptídica.

35. 35.

    Un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 33 en donde la cadena de polímero o secuencia ligadora peptídica se extiende entre los residuos de aminoácido de cada polipéptido que no se ubican en el dominio de unión pMHC Clase I de los polipéptidos.

36. 36.

    Un complejo multivalente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 34 o 35 en la que los polipéptidos se ligan mediante una cadena de polialquilenglicol o un ligador peptídico derivado de un dominio de multimerización humano.

37. 37.

    Un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 36 en donde un radical separador de alquileno divalente se ubica entre la cadena polialquilenglicol y su punto de unión a un polipéptido del complejo.

38. 38.

    Un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 36 o reivindicación 37 en donde la cadena polialquilenglicol comprende por lo menos dos unidades de repetición de polietilenglicol.

39. 39.

    Un complejo multivalente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 33 a 38 que es un dímero o tetrámero.

40. 40.

    Un complejo multivalente que comprende por lo menos dos polipéptidos como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39 en donde (i) por lo menos uno de dichos polipéptidos se asocia con un agente terapéutico como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21.

41. 41.

    Un polipéptido o complejo multivalente como se reivindica en cualquier reivindicación precedente que es soluble.

42. 42.

    Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32.

43. 43.

    Un ácido nucleico aislado que codifica como se reivindica en la reivindicación 42 que se ha adaptado para expresión en alto nivel en una célula anfitriona.

44. 44.

    Un vector que incorpora un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 42 o reivindicación 43.

45. 45.

    Una célula aislada o una partícula que presenta por lo menos un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

46. 46.

    Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, o un complejo multivalente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39, o una pluralidad de células o partículas como se reivindica en la reivindicación 45, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

47. 47.

    El uso de un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, o un complejo multivalente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39, o una pluralidad de células o partículas como se reivindica en la reivindicación 45 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, preferiblemente dicho medicamento se adapta para administración parenteral.

48. 48.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, o un complejo multivalente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39,

    28 29 30

    o una pluralidad de células o partículas como se reivindica en la reivindicación 45 para uso en un método terapéutico.

49. 49.

    Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, o un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 40, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

50. 50.

    El uso de un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, o un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 40 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, preferiblemente dicho medicamento se adapta para administración parenteral.

51. 51.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, o un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 40 para uso en un método terapéutico.

52. 52.

    Un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, o un complejo multivalente como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39,

    o una pluralidad de células o partículas como se reivindica en la reivindicación 45 para uso en un método de tratamiento de enfermedad autoinmune que comprende administrar a un sujeto que sufre de tal enfermedad autoinmune una cantidad efectiva del polipéptido, o complejo multivalente, o la pluralidad de células o partículas.

53. 53.

    El uso de un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, o un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 33 a 39, o una pluralidad de células o partículas como se reivindica en la reivindicación 45, en la preparación de una composición para el tratamiento de enfermedad autoinmune.

54. 54.

    Un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 27 a 32 o un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 40 para uso en un método de tratamiento de enfermedad autoinmune que comprende administrar a un sujeto que sufre de tal enfermedad autoinmune una cantidad efectiva del polipéptido o complejo multivalente.

55. 55.

    El uso de un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 27 a 32, o un complejo multivalente como se reivindica en la reivindicación 40, en la preparación de una composición para el tratamiento de enfermedad autoinmune.

56. 56.

    Un método para identificar una variante de alta afinidad de una molécula ILT dad que tiene la propiedad de unir a un pMHC Clase I dado CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido tiene un KD para el dicho pMHC Clase I dado de menos de o igual a 1µM y/o tiene una constante de disociación (koff) para la dicha molécula pMHC Clase I dada de 2 S-1 o más lento y dicho polipéptido tiene por lo menos a 45% de identidad y/o 55% de similitud con SEQ ID NO: 7 y dicho polipéptido inhibe CD8 une al pMHC dado a un grado mayor que el polipéptido SEQ ID NO: 3 dicho método comprende:

    31

    (i)

    La producción de una colección de moléculas ILT que comprende una o más mutaciones en la secuencia de aminoácido comparado con la molécula ILT Tipo Intacto correspondiente; y

    (ii)

    Poner en contacto dichas moléculas ILT mutadas con el pMHC Clase I objetivo bajo

    5 condiciones adecuadas para permitir la unión de la molécula ILT mutada al pMHC Clase I objetivo; y

    (iii) Medir el KD y/o koff de las interacciones; y

    (iv) Seleccionar los polipéptidos con las características de unión deseadas.
57. 57. Un método para producir un polipéptido como se reivindica en cualquiera de las 10 reivindicaciones 1 a 23 que comprende:

    (i)

    transformar una célula anfitriona con un vector como se reivindica en la reivindicación 43; y

    (ii)

    cultivar las células transformadas bajo condiciones adecuadas para la expresión del

    polipéptido como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23; y 15 (iii) recuperar el polipéptido expresado.

58. 58.

    Un método como se reivindica en la reivindicación 57 en donde las células anfitrionas son células E. coli.

59. 59.

    Un método como se reivindica en la reivindicación 57 en donde las células anfitrionas son células de levadura.

    20 60. Un método como se reivindica en la reivindicación 57 en donde las células anfitrionas son células Pichia pastoris.

    32