CN101268100A - 对I类MHC亲和力提高的修饰的白细胞Ig样受体家族（LIR'S）及其在调节T细胞活性中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供对某给定的I类pMHC具有结合特性的多肽，其特征在于，所述多肽对所述给定的I类pMHC的KD小于或等于1μM和/或对所述给定的I类pMHC分子的解离速率(koff)为2S－1或更慢，所述多肽与SEQ ID NO：7有至少45％相同性和/或55％相似性并且所述多肽对CD8与该给定pMHC结合的抑制程度高于多肽SEQ ID NO：3。这种多肽可单独或与治疗剂相连用于抑制细胞毒性T细胞(CTL)反应。

Description

对I类MHC亲和力提高的修饰的白细胞Ig样受体家族（LIR'S）及其在调节T细胞活性中的用途
本发明涉及对某给定的I类pMHC具有结合特性的多肽，其特征在于，所述多肽对所述给定的I类pMHC的KD小于或等于1μM和/或对所述给定的I类pMHC分子的解离速率(off-rate，koff)为2S-1或更慢，所述多肽与SEQ ID NO：7有至少45％相同性和/或55％相似性并且所述多肽对CD8与该给定pMHC结合的抑制程度高于多肽SEQ ID NO：3。也提供了所述多肽的多价复合物，呈递所述多肽的细胞，与治疗剂结合的所述多肽和使用这些多肽的方法。
发明背景
免疫球蛋白样转录物(ILT)也称为白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)、单核细胞/巨噬细胞免疫球蛋白样受体(MIR)和CD85。该免疫受体家族构成了免疫球蛋白超家族的一部分。1997年3月，一项研究(Samaridis等，(1997)Eur J Immunol 27660-665)首次公开了鉴定到ILT分子，该研究详述了LIR-1(ILT-2)的序列并注意到这些分子与牛FCγ2R、人杀伤细胞抑制受体(KIR)、人FcαR和小鼠gp49相似。该项研究也注意到与KIR不同，LIR-1主要表达在单核细胞和B淋巴细胞上。
具有ILT分子的pMHC结合特征的可溶性多肽及其多价复合物为阻断pMHC分子上的CD8结合位点提供了方法，例如对于抑制CD8+T细胞介导的自身免疫疾病的目的。然而，对于该目的，如果与天然ILT分子相比，这些多肽对靶pMHC分子的亲和力较高和/或解离速率较慢是理想的。
发明概述
本发明涉及对某给定的I类pMHC具有结合特性的多肽，其特征在于，所述多肽对所述给定的I类pMHC的KD小于或等于1μM和/或对所述给定的I类pMHC分子的解离速率(koff)为2S-1或更慢，所述多肽与SEQ ID NO：7有至少45％相同性和/或55％相似性，并且所述多肽对CD8与该给定pMHC结合的抑制程度高于多肽SEQ ID NO：3。也提供了所述多肽的多价复合物，呈递所述多肽的细胞，与治疗剂结合的所述多肽和使用这些多肽的方法。
发明详述
如上所述，ILT分子也称为LIR、MIR和CD85。本文所用的术语ILT应理解为包括该免疫受体家族内的任何多肽。
ILT
免疫受体的ILT家族表达在淋巴细胞和髓细胞表面。ILT分子在它们的胞外区域具有63-84％的同源性，除了可溶性LIR-4之外的所有ILT分子均是I型跨膜蛋白。目前鉴定的所有ILT分子在它们的胞外区中具有两个或四个免疫球蛋白超家族结构域。(Willcox等，(2003)4(9)913-919)。各ILT分子也可表达为许多不同的变体/同种型。(Colonna等，(1997)J Exp Med 186(11)1809-1818)和(Cosman等，(1997)Immunity 7 273-282)。
有许多科学论文详细描述了ILT分子的结构和功能，包括以下文献：(Samaridis等，(1997)Eur J Immunol 27 660-665)，(Cella等，(1997)J Exp Med 185(10)1743-1751)，(Cosman等，(1997)Immunity 7 273-282)，(Borges等，(1997)J Immunol 159 5192-5196)，(Colonna等，(1997)J Exp Med 186(11)1809-1818)，(Colonna等，(1998)J.Immunol 160 3096-3100)，(Cosman等，(1999)Immunological Revs 168 177-185)，(Chapman等，(1999)Immunity 11 603-613)，(Chapman等，(2000)Immunity 12 727-736)，(Willcox等，(2002)BMC StructuralBiology 2 6)，(Shiroshi等，(2003)PNAS 100(5)8856-8861)和(Willcox等，(2003)4(9)913-919)。
WO9848017披露了编码ILT家族诸成员和它们推测的氨基酸序列的遗传序列。此申请将LIR分子分为三组。第一组包括具有跨膜区和短胞质尾的多肽，该跨膜区含有带正电的残基。第二组包括具有非极性跨膜区和长胞质尾的多肽。最后，第三组包括的多肽表达为不具有跨膜区或胞质尾的可溶性多肽。也披露了制备LIR家族的多肽，LIR家族诸成员的拮抗性抗体的方法。此申请讨论了可能利用LIR家族成员治疗自身免疫疾病和免疫功能受抑制相关的疾病状态。就此而言，提到了可溶形式的LIR家族成员对于某些应用有利。这些优点包括易于纯化来自重组宿主细胞的可溶形式ILT/LIR，它们适用于静脉内给予，它们有可能用于阻断细胞表面LIR家族成员与其配体相互作用而介导所需的免疫功能。也提到了保留所需生物学活性，例如结合配体(包括I类MHC分子)的可溶性LIR片段的可能应用。
另一项研究(Shiroishi等(2003)PNAS 100(15)8856-8861)讨论了可溶(截短)形式的ILT-2和ILT-4分子。提到了它们在Biacore研究中与可溶性CD8竞争与MHC分子结合的能力，估计这可能是ILT-2调节CD8+T细胞激活的机制之一。对于pMHC结合，此项研究指出“ILT比CD8结合的亲和力高提示ILT可有效阻断CD8在细胞表面的结合”。此项研究指出ILT2与I类MHC的α3结构域结合并报道了含有结构域1和2的ILT2片段的晶体结构。
集中在ILT-4上的(Colonna等，(1998)J.Immunol.160 3096-3100)总结了ILT 2-5的组织分布和特异性。在这些ILT分子中，注意到ILT-2和ILT-4与I类MHC分子结合。此项研究分析了可溶性ILT-4与各种I类MHC所转染细胞的结合。此项研究的结论是ILT-4能与HLA-A、B和G结合，但不与HLA-Cw3或HLA-Cw5结合。
WO03041650披露了使用LIR-2和/或LIR-3/LIR-7活性调节剂治疗类风湿性关节炎(RA)的方法。所披露的调节剂包括LIR活性的激动剂和拮抗剂。WO2006033811披露了ILT-3多肽及其融合体作为抑制移植物排斥的治疗剂的应用。
已确定了针对不同pMHC靶标的野生型ILT分子的各种可溶性类似物。例如，(Chapman等，(1999)Immunity 11603-613)采用基于Biacore的方法来确定与各种HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E和HLA-G分子结合的LIR-1(ILT-2)。测定的这些相互作用的KD值范围是1×10-4M(对于HLA-G1)-2×10-5M(对于HLA-Cw*0702)。此项研究也提到ILT-2对UL18(一种I类MHC的病毒类似物)有亲和力，二者之间相互作用的KD以nM计。
另一项研究(Chapman等，(2000)Immunity 12 727-736)报道了含有D1和D2结构域的截短的LIR-1(ILT-2)多肽的晶体结构。已知LIR-1与UL18病毒I类MHC类似物结合的亲和力高于相似的LIR-2。作者使用截短的LIR-1多肽的晶体结构来鉴定LIR-1和LIR-2之间存在于溶剂接触残基中的差异。采用定点诱变该两种多肽来证实哪几个残基参与UL18结合。将LIR-1的野生型残基换入LIR-2中相应的氨基酸位置进行定点诱变。此项研究的结论是LIR-1的残基38Y、以及76Y、80D或83R中的至少一种参与UL18结合。作者指出“由于LIR-1对I类MHC蛋白的亲和力远低于对UL18的，我们未能获得LIR-1和LIR-2突变体与I类MHC结合的精确亲和力”。
图1a(SEQ ID NO：1)和1b(SEQ ID NO：2)分别显示了野生型人ILT-2的全部氨基酸和DNA序列。所提供的DNA序列对应于NCBI核苷酸数据库中给定的登录号NM_006669。
高亲和力ILT-样多肽
本发明提供对某给定的I类pMHC具有结合特性的多肽，其特征在于，所述多肽对所述给定的I类pMHC的KD小于或等于1μM和/或对所述给定的I类pMHC分子的解离速率(koff)为2S-1或更慢，所述多肽与SEQ ID NO：7有至少45％相同性和/或55％相似性，并且所述多肽对CD8与该给定pMHC结合的抑制程度高于多肽SEQ ID NO：3。
符合以上同源性和I类pMHC-结合标准的多肽可视作高亲和力ILT-样分子，同样是本文所述及的。
如上所述，天然存在的ILT多肽在其胞外区中具有两个或四个免疫球蛋白超家族结构域。本发明的高亲和力ILT-样多肽可表达为具有4个、3个或2个所述结构域的形式。目前优选的本发明实施方式具有对应于人ILT-2的两个N-末端结构域的两个免疫球蛋白超家族结构域，其含有一个或多个突变从而赋予对I类pMHC的高亲和力。这些N-末端结构域是利用Cosman等((1999)Immunol Revs 168：177-185)的标志的结构域一和二。具有所述两个N-末端结构域的ILT-样多肽通常具有对应于SEQ ID NO：3所示氨基酸1-195的序列。
优选该多肽的特征在于所述多肽与SEQ ID NO：7具有至少60％相同性和/或75％相似性。
优选该多肽的特征在于所述多肽与SEQ ID NO：7具有至少75％相同性和/或85％相似性。
优选该多肽的特征在于所述多肽与SEQ ID NO：7具有至少90％相同性和/或95％相似性。
本文所用的序列相同性表示所比较的两条序列中相应位置的氨基酸相同。本文中相似性包括相同及相似(功能上等价)的氨基酸。例如，用不同的疏水性氨基酸一次取代多肽中给定位置的一个疏水性氨基酸所形成的多肽可视作与原始多肽相似但不相同。采用FASTA算法测定本文用于表征本发明多肽的参数“相似性”和“相同性”，所述算法用获自William R.Pearson(Department of BiologicalChemistry(生物化学系)，Box 440，Jordan Hall，Charlottesville，弗吉尼亚州)的FASTA程序组执行。采用FASTA程序组测定那些参数所用的设置如本文实施例6所述。
本领域技术人员明白该项分析可使用许多来源的FASTA蛋白：蛋白比较。(Pearson等，(1988)PNAS 85 2444-2448)提供了FASTA算法的其它细节。可通过任何常规试验测定SEQ ID NO：3所示多肽和本发明任何给定的推定多肽的相对抑制活性，这些试验的读出值(read-out)与CD8对给定pMHC的结合亲和力有关。读出值通常是IC50值。评估浓度相当的测试多肽和SEQ ID NO：3的多肽，通过参考以各结果绘制的抑制曲线测定它们各自的IC50。实施例5描述了合适的试验。
多肽的特征优选在于，所述多肽对所述给定的I类pMHC的KD小于或等于100nM和/或对所述给定的I类pMHC的解离速率(koff)为O.1S-1。
本领域技术人员已知可采用许多方法测定所述亲和力和/或解离速率。例如，可通过表面等离振子共振测定所述亲和力(KD)和/或解离速率(koff)。本文的实施例4提供了适合于进行这种测定的基于Biacore的试验。
比较而言，通过实施例4所述基于Biacore的方法检测到野生型ILT-2分子的可溶性截短变体(该可溶性多肽的氨基酸序列参见图2a(SEQ ID NO：3))和加载有癌胚抗原(CEA)-衍生YLSGANLNL(SEQ ID NO：13)肽的HLA-A*0201之间相互作用的KD为6μM，解离速率(koff)为2.4S-1。该可溶性ILT-2分子是野生型人ILT-2同种型1的变体的截短形式，其只含有胞外结构域D1和D2。图1a中加亮显示了该ILT-2变体分子与ILT-2同种型1的那些变体分子之间不同的氨基酸残基。
图2b(SEQ ID NO：4)详述了编码该多肽的天然DNA序列。为提高重组表达的效率并促进该多肽的克隆，将许多突变引入编码该多肽的DNA中。这些突变未改变所表达多肽的氨基酸序列。图3(SEQ ID NO：5)显示了用于重组表达的DNA序列。
本发明的一个实施方式提供的多肽是突变的人ILT分子。例如，编码人ILT-2或其可溶性片段的DNA可用作模板，在该模板中可引入各种突变从而导致本发明高亲和力ILT-样多肽与靶pMHC复合物之间相互作用的亲和力高和/或解离速率慢。因此，本发明包括与天然序列相比发生突变的ILT-2变体。
本领域技术人员应明白这种人ILT-2氨基酸序列中的一个或多个突变可以是一个或多个取代、缺失或插入。可采用合适的方法进行这些突变，所述方法包括但不限于：基于聚合酶链式反应(PCR)、基于限制性内切酶的克隆或不依赖于连接的克隆(LIC)方法的那些方法。许多标准的分子生物学教材详述了这些方法。聚合酶链式反应(PCR)诱变和基于限制性内切酶的克隆的其它细节可参见(Sambrook和Russell，(2001)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(《分子克隆-实验室手册》)，(第三版)CSHL Press)。LIC方法的其它信息见(Rashtchian，(1995)Curr Opin Biotechnol 6(1)：30-6)。
本发明其它实施方式包括其中对应于SEQ ID NO：3的10W、19Q、20G、21S、42K、47W、50R、66I、77Y、78Y、79G、80S、81D、82T、83A、84G、85R、87E、99A，101I、102K、141E、146L、147N、159I、168S、172W、174R和188L的一个或多个氨基酸发生突变的多肽。例如，本发明多肽可含有以下一个或多个突变：10W→L、19Q→M、19Q→L、19Q→V、20G→D、20G→M、20G→Q、20G→F、20G→S、20G→E、20G→R、21S→Q、21S→R、21S→A、21S→S、42K→R、47W→Q、50R→L、66L→V、77Y→V、77Y→M、77Y→I、77Y→Q、78Y→Q、78Y→I、78Y→G、79G→Q、79G→Y、79G→W、79G→R、79G→V、80S→R、80S→T、80S→G、81D→G、81D→Q、81D→L、81D→V、82T→G、82T→E、83A→S、83A→G、83A→R、84G→L、84G→Q、84G→A、85R→W、87E→A、99A→I、99A→Y、101I→L、101I→K、101I→Q、101→V、102K→Q、102K→A、102K→R、141E→G、141E→D、146L→D、147N→S、159I→E、168S→G、172W→R、174R→W或188L→D。例如，含有至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个上述突变的多肽通常合适。
所用的编号方法与图2a(SEQ ID NO：3)所示相同。
采用SEQ ID NO：3的编号方法，一个实施方式提供的本发明多肽含有对应于氨基酸19Q→M和21S→Q的突变。
采用SEQ ID NO：3的编号方法，一个实施方式提供的本发明多肽含有对应于19Q→M、20G→D、21S→Q、99A→V和168S→G的突变。
采用SEQ ID NO：3的编号方法，另一个实施方式提供的本发明多肽含有对应于19Q→L、20G→M和21S→Q的突变。
采用SEQ ID NO：3的编号方法，另一个实施方式提供的本发明多肽含有对应于19Q→M、20G→Q、21S→R、42K→R和146L→S的突变。
采用SEQ ID NO：3的编号方法，另一个实施方式提供的本发明多肽含有对应于19Q→M、20G→D、21S→Q、83A→S、84G→Q、85R→W、87E→A和99A→V的突变。
采用SEQ ID NO：3的编号方法，另一个实施方式提供的多肽中对应于135C或145C中一个或二者的氨基酸突变为S。
另一实施方式提供的本发明多肽所含的氨基酸至少对应于SEQ ID NO：3的氨基酸1-195。这种多肽是二结构域的实施方式，其所含的结构域对应于人ILT-2的两个N-末端免疫球蛋白超家族结构域。
本发明的其它具体实施方式提供的多肽由SEQ ID NO：6-9或21-61中任一条构成或包含其中任一条。当然，虽然这些优选的多肽可表达为由SEQ ID NO：6-9、16或21-61构成或包含它们，但本领域技术人员应知道有少量不影响该实施方式(多肽)的总体身份和特性的氨基酸取代、缺失和插入是不可避免的。这种少量突变可视作这种多肽的表型沉默突变。从另一方面看，这种突变得到的多肽具有与亲代相同的功能并能以相同方式起作用。
本发明的优选实施方式提供的多肽由SEQ ID No：16构成或包含SEQ ID No：16。
溶解性增强的高亲和力ILT-样多肽
本发明多肽可用作可溶性治疗剂。在这种情况中，增强这些多肽的溶解性是理想的。本发明包括含有一个或多个突变的多肽，与缺乏这些突变的相应多肽相比，这些突变增强了多肽的溶解性。本领域技术人员知道，要增强多肽的溶解性一般宜使与溶剂接触的氨基酸突变。参考ILT-2的晶体结构可鉴定这些与溶剂接触的氨基酸。(参见Chapman等，(2000)Immunity 12 727-736)。本发明包括一个或多个与溶剂接触的氨基酸发生突变的多肽。例如，含有至少一个突变的本发明多肽中用带电荷的氨基酸取代了与溶剂接触的疏水性氨基酸。
这种溶解性增强的突变优选位于本发明多肽C-末端的6个氨基酸内。
另一实施方式提供的本发明多肽中对应于SEQ ID NO：3的196L和/或198L的氨基酸分别突变为196D和198D。
采用SEQ ID NO：3的编号方法，另一实施方式提供的本发明多肽含有对应于19Q→M、20G→D、21S→Q、83A→S、84G→Q、85R→W、87E→A、99A→V、196L→D和198L→D的突变。
另一实施方式提供的本发明多肽由SEQ ID No：63-80中任一条构成或包含其中任一条。
另一实施方式提供的本发明多肽由SEQ ID No：17或62构成或包含SEQ IDNo：17或62。
“有标签”的高亲和力ILT-样多肽
本发明多肽可以多聚形式使用或与其它部分结合使用。就这点而言，所制备的本发明多肽含有在其上连接其它部分的“装置(means)”是理想的。
因此，一个实施方式提供的本发明多肽含有“标签”以促进连接其它部分。该标签可以在这些多肽的C-末端上。
本领域技术人员应知道有许多标签适用于该目的。这些标签包括但不限于：半胱氨酸残基、六组氨酸肽、生物素和化学反应活性基团。存在这些标签也可促进该多肽的纯化。
PEG化的高亲和力ILT-样多肽
在一具体实施方式中，本发明多肽与至少一条聚亚烷基二醇链连接。可采用本领域技术人员已知的许多方法实现这种连接。在一优选的实施方式中，一条或多条聚亚烷基链与这些多肽连接。在另一实施方式中，本发明该方面的聚乙二醇链含有至少两个聚乙烯重复单位。
多价高亲和力ILT-样复合物
本发明一方面提供含有至少两个本发明多肽的多价复合物，所述多价复合物对所述给定的I类pMHC的KD小于或等于1μM和/或对所述给定的I类pMHC的解离速率(koff)为2S-1或更慢。
在该方面的一个实施方式中，至少两个本发明多肽经接头部分相连形成多价复合物。
一方面提供的本发明多肽通过非肽聚合物链或肽接头序列相连。这些多价复合物优选为水溶性的，所以应相应选择接头部分。此外，接头部分优选能与这些多肽上确定的位置相连，从而尽可能减少所形成复合物的结构多样性。该方面的一个实施方式提供的本发明多价复合物中聚合物链或肽接头序列在各多肽中不位于该多肽的I类pMHC结合结构域中的氨基酸残基之间延伸。
由于本发明复合物可用作药物，接头部分应该适当考虑它们的药学适用性，例如它们的免疫原性来选择。
本领域已知满足以上所需标准的接头部分的例子，例如连接抗体片段的技术。
两类接头优选用于产生本发明的多价复合物。其中的多肽通过聚亚烷基二醇链或衍生自人多聚化结构域的肽接头相连的本发明多价复合物提供了本发明的某些实施方式。
合适的亲水性聚合物包括但不限于聚亚烷基二醇。此类中最常用的聚合物以聚乙二醇或PEG为基础，其结构如下式所示。
HOCH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH
其中n大于2。
然而，其它聚合物可以基于其它合适的、任选取代的聚亚烷基二醇，包括聚丙二醇，以及乙二醇与丙二醇的共聚物。
这种聚合物可用于处理或偶联治疗剂，特别是多肽或蛋白质治疗剂来实现有益地改变该治疗剂的药代动力学(PK)分布，例如降低肾廓清率、延长血浆半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。据信，一个或多个PEG分子在治疗剂周围形成的“外壳”能在立体上阻碍治疗剂与免疫系统反应并降低其蛋白水解降解，从而改善PEG-治疗剂偶联物的PK分布。(Casey等，(2000)，Tumor Targetting，4 235-244)。所用亲水性聚合物的分子大小可根据高亲和力ILT-样多肽预定的治疗应用来具体选择。已有许多综述文章和书籍详细描述了PEG和类似分子在药物制剂中的应用。例如，参见Harris，(1992)，Polyethylene Glycol Chemistry-Biotechnical and Biomedical Applications(《聚乙二醇化学-生物技术和生物医药应用》)，Plenum，纽约，纽约州或Harris和Zalipsky，(1 997)，Chemistry andBiological Applications of Polyethylene Glycol ACS Books(《聚乙二醇化学和生物学应用ACS手册》)，华盛顿，哥伦比亚特区。
所用的聚合物可具有线形或分支构型。可通过加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和赖氨酸来诱生分支PEG分子或其衍生物。
该聚合物一般在其结构中，例如在其一端或两端，和/或骨架的支链处具有一个或多个化学反应活性基团从而使该聚合物能与高亲和力ILT-样多肽中的靶位点相连。如下所示，所述一种或多种化学反应活性基团可与亲水性聚合物直接相连，或者在亲水性聚合物和反应活性化学(基团)之间可以具有间隔基团/部分：
反应活性化学(基团)-亲水性聚合物-反应活性化学(基团)
反应活性化学(基团)-间隔物-亲水性聚合物-间隔物-反应活性化学(基团)
用于形成以上概述的该类型构建物的间隔物可以是无反应活性、化学稳定的、链状的任何有机部分。这种间隔物包括但不限于以下基团：
-(CH2)n-，其中n＝2到5
-(CH2)3NHCO(CH2)2
其中二价亚烷基间隔基团位于聚亚烷基二醇链和其与该复合物的多肽分子连接点之间的本发明多价复合物是本方面的另一种实施方式。
其中聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位的本发明多价复合物是本方面的另一实施方式。
本发明可用的直接或经间隔物与反应活性化学物质相连的亲水性聚合物有许多商业供应商。这些供应商包括Nektar Therapeutics(加利福尼亚州，美国)、NOF Corporation(日本)、Sunbio(韩国)和Enzon Pharmaceuticals(新泽西州，美国)。
本发明可用的直接或经间隔物与反应活性化学物质相连的可购得的亲水性聚合物包括但不限于以下聚合物：
PEG接头描述 PEG来源  目录号
ILT-样单体连接物
5K线形(马来酰亚胺) Nektar  2D2MOHO1
20K线形(马来酰亚胺) Nektar  2D2MOPO1
20K线形(马来酰亚胺) NOF Corporation  SUNBrightME-200MA
20K支链(马来酰亚胺) NOF Corporation  SUNBrightGL2-200MA
30K线形(马来酰亚胺) NOF Corporation  SUNBrightME-300MA
40K支链PEG(马来酰亚胺) Nektar  2D3XOTO1
5K-NP线形(用于Lys连接) NOF Corporation  SUNBrightMENP-50H
10K-NP线形(用于Lys连接) NOF Corporation  SUNBrightMENP-10T
20K-NP线形(用于Lys连接) NOF Corporation  SUNBrightMENP-20T
ILT-样二聚体接头
3.4K线形(马来酰亚胺) Nektar  2D2DOFO2
5K分叉的(马来酰亚胺) Nektar  2D2DOHOF
10K线形(用正吡啶基ds-接头取代马来酰亚胺) Sunbio
20K分叉的(马来酰亚胺) Nektar  2D2DOPOF
20K线形(马来酰亚胺) NOF Corporation
40K分叉的(马来酰亚胺) Nektar  2D3XOTOF
高级别ILT-样多聚体
15K，3臂，Mal3(用于三聚体) Nektar  OJOONO3
20K，4臂，Mal4(用于四聚体) Nektar  OJOOPO4
40K，8臂，Mal8(用于八聚体) Nektar  OJOOTO8
可利用各种偶联化学(物质)将聚合物分子偶联于蛋白质和肽治疗剂。选择最合适的偶联化学(物质)在很大程度上取决于所需的偶联部位。例如，以下偶联化学(物质)已用于连接PEG分子(来源：Nektar Molecular EngineeringCatalogue 2003 Nektar(分子工程目录2003))的一个或多个末端：
N-马来酰亚胺
乙烯基砜
苯并三唑碳酸酯
琥珀酰亚胺丙酸酯(Succinimidyl proprionate)
琥珀酰亚胺丁酸酯(Succinimidyl butanoate)
硫代酯
乙醛
丙烯酸酯
生物素
伯胺
如上所述，非PEG基聚合物也可为本发明多肽的多聚化提供合适的接头。例如，可以利用含有通过脂肪链相连的马来酰亚胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，产品号22330和22323)。
肽接头是另一类多价复合物接头。这些接头由氨基酸链组成，其作用为产生可使本发明多肽连接于其上的简单接头或多聚化结构域。现有技术采用生物素/链霉亲和素系统来产生体外结合研究用的TCR和pMHC分子的四聚体(参见WO 99/60119)。然而，链霉亲和素是微生物来源的多肽，因此用于治疗剂中并不理想。
其中的多肽通过衍生自人多聚化结构域的肽接头连接的本发明多价复合物提供了本方面的另一种实施方式。可用许多含多聚化结构域的人蛋白质产生多价高亲和力ILT-样多肽复合物。例如，p53的四聚化结构域已用于产生scFv抗体片段的四聚体，与单体scFV片段相比，该四聚体显示血清持久性延长和解离速率明显降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白也具有四聚化结构域，可能用于该类应用。
在一具体实施方式中，本发明多价复合物可以是二聚体或四聚体。本文的实施例9和10分别提供了制备本发明二聚和四聚PEG-连接的高亲和力ILT-样复合物的详细方法。本文的实施例11提供了这种多价复合物抑制细胞毒性T细胞激活能力的数据。
含有至少两个本发明多肽的本发明多价复合物提供了本方面的另一种实施方式，其中至少一个所述多肽与治疗剂相连。
另一方面提供了本发明多肽或其多价复合物，其中所述多肽或多价复合物是可溶性的。
另一方面提供了呈递至少一种本发明多肽的分离的细胞或颗粒。本领域技术人员应该知道，这种多肽需要某种“装置”以连接于所述细胞或颗粒的表面。促进这种连接的“装置”有许多种。例如，特别是在细胞的情况中，通过制备掺有人ILT-2的至少一个跨膜结构域的所选多肽的“全长”形式不难提供该连接“装置”。图1a中以下划线标出了人ILT-2的跨膜结构域(SEQ ID NO：1)。然而，这不是将这种多肽连接于细胞表面的唯一“装置”。例如，可制备含有与其它多肽的跨膜结构域相连的本发明多肽或其片段的融合蛋白。在连接本发明多肽与颗粒的情况中，不难通过连接含有C-末端标签(例如生物素)的本发明多肽与包衣有对所述标签特异的结合部分(例如链霉亲和素)的颗粒得以实现。
诊断和治疗应用
一方面，可用成像化合物(例如适用于诊断目的的标记)标记本发明多肽或其多价复合物。这种标记的多肽可用于检测靶pMHC分子的方法，该方法包括将pMHC与本发明多肽或其多价复合物接触从而结合该pMHC；和检测所述结合。在用例如生物素化的多肽分子形成的四聚复合物中，可用荧光链霉亲和素提供可检测标记。这种荧光标记的四聚体可适用于FACS分析来例如检测抗原呈递细胞。检测本发明可溶性肽的另一种方式是利用抗体，特别是单克隆抗体。
参考文献中已描述了ILT-特异性抗体。例如，IGH/75是巴塞尔免疫学研究院(Basel Institute for Immunology，巴塞尔，瑞士)制备的ILT-2特异性IgG。(Riteau等，(2001)Int.Immunol.13(2)193)。
在另一方面，本发明多肽或其多价复合物或可与治疗剂结合，或额外地与治疗剂结合(例如，共价或以其它方式相连)。
在本发明一具体实施方式中，治疗剂可以共价连接于多肽的C末端。
可与本发明多肽结合的治疗剂有许多。例如，治疗剂可以是免疫效应分子。此方面的具体实施方式提供的免疫效应分子是细胞因子。本领域技术人员已知许多通常用于“抑制”免疫应答的细胞因子。与这种免疫抑制细胞因子结合的本发明多肽构成本发明的优选实施方式。与IL-4、IL-10或IL-13或这些细胞因子的表型沉默变体或片段结合的本发明多肽提供了本发明的具体实施方式。
与未多聚化的野生型ILT或相应的本发明高亲和力ILT-样多肽相比，本发明多价复合物对给定pMHC的结合能力增强。因此，本发明多价复合物对于在体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞特别有用，也可用作制备具有这种用途的其它多价复合物的中间体。
因此，含有本发明多肽或其多价复合物或表达这种多肽的多个细胞连同药学上可接受的载体的药物组合物提供了本发明的另一方面。本发明多肽或其多价复合物或表达这种多肽的多个细胞的治疗性应用提供了相关的实施方式。
含有与治疗剂结合的本发明多肽或其多价复合物连同药学上可接受的载体的药物组合物提供了本发明的另一方面。与治疗剂结合的本发明多肽或其多价复合物的治疗性应用提供了相关的实施方式。
本发明另一方面是本发明多肽或其多价复合物或表达这种多肽的多个细胞或颗粒在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用，所述药物适应于胃肠外给药。合适的胃肠外给药途径包括皮下、皮内或肌肉内途径。
本发明另一方面是与治疗剂结合的本发明多肽或其多价复合物在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用，所述药物适应于胃肠外给药。合适的胃肠外给药途径包括皮下、皮内或肌肉内途径。
本发明也提供将治疗剂递送给靶细胞的方法，该方法包括在允许本发明多肽或多价复合物与潜在的靶细胞结合的条件下，使靶细胞与该多肽或多价复合物接触，所述多肽或多价复合物能与给定的I类pMHC分子结合并连接有治疗剂。
治疗剂的递送应使之能在局部，而非只对与之直接相连的细胞施加其效力。因此，一种具体的方案设想将“免疫抑制剂”分子与对肿瘤抗原特异的本发明多肽或多价复合物相连。
可将本发明的可溶性多肽或多价复合物与能将药物前体转化成药物的酶连接。这样能将药物前体只在需要其之处(即，所述多肽或多价复合物所靶向之处)转化成药物。
预计本文披露的多肽和多价复合物可用于自身免疫疾病的诊断和治疗方法。
本发明也提供了治疗自身免疫疾病的方法，包括给予患这种自身免疫疾病的对象有效量的本发明多肽或其多价复合物，或呈递至少一种所述多肽的多个细胞或颗粒。在一相关的实施方式中，本发明提供本发明多肽或其多价复合物，或呈递至少一种所述多肽的多个细胞或颗粒在制备治疗自身免疫疾病的组合物中的应用。
本发明也提供了治疗自身免疫疾病的方法，包括给予患这种自身免疫疾病的对象有效量的与治疗剂结合的本发明多肽或其多价复合物。在一相关的实施方式中，本发明提供与治疗剂结合的本发明多肽或其多价复合物在制备治疗自身免疫疾病的组合物中的应用。
本发明的治疗或成像多肽通常以无菌药物组合物的部分提供，该组合物通常包含药学上可接受的载体。该药物组合物可以是任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。可以单位剂型提供，通常装在密封的容器中提供，也可作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒通常(虽然不是必须)装有使用说明书。试剂盒可装有多个所述单位剂型。
可改进药物组合物以适应于通过任何合适的途径给予，例如胃肠外、透皮或通过吸入，优选胃肠外(包括皮下、肌肉内或最优选静脉内)途径。可通过药学领域已知的任何方法制备这种组合物，例如通过在无菌条件下混合活性成分与一种或多种载体或赋形剂。
本发明物种的剂量可依据待治疗的疾病或病症，待治疗个体的年龄和状况等而在宽广界限内变动，医师将最终确定所使用的合适剂量。
其它方面
本发明多肽或多价复合物可以基本上纯的形式，或作为纯化或分离的制品提供。例如，其可以基本上不含其它蛋白质的形式提供。
编码本发明多肽的分离的核酸、插入所述核酸的载体和含有所述载体的细胞提供了其它实施方式。编码本发明多肽的核酸可以是经改进适于在宿主细胞中高水平表达的核酸。提供这种核酸优化服务的公司有许多，例如德国的GeneArt。
本发明也提供鉴定对给定I类pMHC具有结合特性的给定ILT分子高亲和力变体的方法，其特征在于所述多肽对所述给定的I类pMHC的KD小于或等于1μM和/或对所述给定的I类pMHC分子的解离速率(koff)为2S-1或更慢，所述多肽与SEQ ID NO：7有至少45％相同性和/或55％相似性，并且所述多肽对CD8与该给定pMHC结合的抑制程度高于多肽SEQ ID NO：3，所述方法包括：
(a)制备ILT分子文库，与相应的野生型ILT分子相比，所述ILT分子在氨基酸序列中含有一个或多个突变；和
(b)在适合突变ILT分子与I类pMHC靶标结合的条件下，使所述突变的ILT分子与I类pMHC靶标接触；和
(c)检测相互作用的KD和/或koff；和
(d)选择具有所需结合特征的一种或多种多肽。
ILT多肽和/或ILT-样多肽的噬菌体展示提供了制备适用于上述方法的多肽文库的一种方法。
制备本发明多肽的方法是最后一方面，包括：
(i)用掺有编码本发明多肽的核酸的载体转化宿主细胞；和
(ii)在适合表达本发明多肽的条件下培养所述转化细胞；和
(iii)回收所表达的多肽。
提供了该方面的具体实施方式，其中宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞或酵母菌细胞，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。本文的实施例1-3和7-8分别提供了在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母细胞中制备本发明多肽的详细方法。
本发明各方面的优选特征与已作了必要修正的其它各方面一样。本文述及的现有技术文件按照法律所允许的最大程度纳入。
实施例
以下实施例进一步描述了本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。
下文参考了附图，其中：
图1a提供了野生型人ILT-2的全长氨基酸序列(SEQ ID No：1)。突出表示的氨基酸显示该多肽残基不同于野生型人ILT-2同种型1的相应残基。下划线标出了跨膜结构域的氨基酸。
图1b提供了编码图1a所示氨基酸序列的野生型人ILT-2的全长DNA序列(SEQ ID No：2)。该DNA序列对应于所给出的NCIMB核苷酸登录号为NM_006669的序列。
图2a和2b分别提供了图1a和1b所示野生型ILT-2序列的可溶性二结构域形式的氨基酸和DNA序列。这些截短的序列只含有/编码ILT-2的胞外结构域D1和D2。(分别是SEQ ID No：3和SEQ ID NO：4)
图3提供了插入基于pGMT7的载体以表达图2a所示野生型ILT-2多肽的可溶性二结构域形式的全长DNA序列。下划线标出了HindIII和NdeI限制性内切酶识别序列。
图4a-4d(SEQ ID No：6-9)提供了可溶性二结构域高亲和力ILT-样多肽的氨基酸序列。突出表示的残基相对于图2a已发生突变。
图5a-5d(SEQ ID NO：10-13)分别提供了插入pGMT7衍生的载体以表达图4a-4d所示可溶性二结构域高亲和力ILT-样多肽的DNA序列。突出表示的密码子相对于图3a已发生突变，下划线标出了HindIII和NdeI限制性内切酶识别序列。
图6提供了可插入图5a-5d所示DNA序列的pGMT衍生载体的DNA序列。
图7提供了可插入图5a-5d所示DNA序列的pGMT衍生载体的质粒图谱。
图8a提供了可溶性二结构域(c20)高亲和力ILT-样多肽的氨基酸序列。
图8b提供了可溶性二结构域(c50)高亲和力ILT-样多肽的氨基酸序列。
图8c提供了在其C-末端添加了半胱氨酸残基的可溶性二结构域(c50)高亲和力ILT-样多肽的氨基酸序列。
图9a提供了在其5’端添加了半胱氨酸编码密码子的可溶性二结构域(c20)高亲和力ILT-样多肽的DNA序列。该DNA序列已为在巴斯德毕赤酵母中表达作了优化，并掺入了用下划线标出的SnaBI和NotI限制性内切酶识别位点。
图9b提供了图9a所示DNA序列编码的在其C-末端添加了半胱氨酸残基的可溶性二结构域(c20)高亲和力ILT-样多肽的氨基酸序列。
图10提供了为巴斯德毕赤酵母表达的可溶性二结构域(c20)高亲和力ILT-样多肽与I类MHC相互作用制作的Biacore应答曲线。
图11提供了为可溶性二结构域(c20)高亲和力ILT-样多肽二聚体与Tax-HLA-A*0201相互作用制作的Biacore应答曲线。
图12提供了为可溶性二构域(c20)高亲和力ILT-样多肽四聚体与Tax-HLA-A*0201相互作用制作的Biacore应答曲线。
图13a-13bh提供了其它二结构域高亲和力ILT-样多肽的氨基酸序列。
图14提供了显示高亲和力(c50)ILT-样单体和二聚体抑制CTL激活的ELISPOT数据。
图15提供了显示高亲和力(c50)ILT-样单体、二聚体和四聚体抑制CTL激活的ELISPOT数据。
实施例1-制备含有结构域1和2的可溶性野生型ILT-2分子
图3(SEQ ID NO：5)提供了用于表达只含有结构域D1和D2的可溶性野生型ILT-2的DNA序列。可由多个承包研究公司(contract research company)从头合成这些DNA序列，例如GeneArt(德国)。该DNA序列中引入了限制性内切酶识别位点(NdeI和HindIII)，从而促进这些DNA序列连接入基于pGMT7的表达质粒，该质粒含有用于在大肠杆菌菌株BL21-DE3(pLysS)中高水平表达的T7启动子(Pan等，Biotechniques(2000)29(6)：1234-8)。
该DNA序列连接入用NdeI和HindIII切割的pGMT7载体(该载体的DNA序列见图6，该载体的质粒图谱见图7)。
导入编码可溶性野生型ILT-2多肽的DNA的限制性内切酶识别位点
NdeI-CATATG
HindIII-AAGCTT
连接
采用快速DNA连接试剂盒(rapid DNA ligation kit，Roche)，根据厂商的使用说明书连接切割的ILT-2 DNA和切割的载体。
将连接的质粒转化入感受态大肠杆菌菌株XL1-蓝细胞，将其接种于含有100mg/ml氨苄西林的LB/琼脂平板上。37℃培育过夜后，挑选单菌落，37℃在10ml含有100mg/ml氨苄西林的LB中摇动生长过夜。采用Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化克隆的质粒，采用自动化DNA测序仪(Lark Technologies)测序插入的片段。
图2a显示了由图2b所示DNA序列产生的可溶性野生型ILT-2多肽的氨基酸序列。
实施例2-制备可溶性野生型ILT-2多肽的高亲和力变体
可将如实施例1所述产生的可溶性野生型ILT-2多肽用作模板，由该模板可产生对I类pMHC分子的亲和力提高和/或解离速率降低的本发明多肽。
本领域技术人员已知可通过定点诱变将产生这些突变链所需的必需密码子变化导入编码该可溶性野生型ILT-2多肽的DNA中(QuickChangeTM，Stratagene的定点诱变试剂盒)。
简言之，通过使用掺入所需的一个或多个密码子变化的引物以及将含有编码可溶性野生型ILT-2多肽的DNA的质粒作为诱变模板来实现：
采用以下条件进行诱变：50ng质粒模板、1μl的10mM dNTP、由厂商提供的5μl 10×Pfu DNA聚合酶缓冲液、25pmol正向引物、25pmol反向引物、1μl pfuDNA聚合酶，总体积50μl。95℃进行2分钟的初始变性步骤，然后进行25轮如下反应：变性(95℃，10秒)、退火(55℃，10秒)和延伸(72℃，8分钟)。用DpnI限制性内切酶消化所得产物以去除模板质粒，并转化入大肠杆菌菌株XL1-蓝。测序验证诱变。
图4a-4d(SEQ ID No：6-9)和图13a-13bh(SEQ ID NO：21-80)列出了对YLSGANLNL(SEQ ID NO：15)-HLA-A*0201复合物显示有高亲和力的突变ILT-样多肽的氨基序列。本领域技术人员已知可通过定点诱变将产生这些突变多肽所需的必需密码子变化导入编码该可溶性野生型ILT-2多肽的DNA中(QuickChangeTM，Stratagene的定点诱变试剂盒)。
实施例3-可溶性多肽的表达、重折叠和纯化
将实施例1或2中制备的含有ILT多肽(基因)的表达质粒分别转化入大肠杆菌菌株rosetta DE3pLysS，37℃在TYP培养基(含100μg/ml氨苄西林、15μg/ml氯霉素)中培养具有氨苄西林/氯霉素抗性的单菌落7小时，然后用0.5mMIPTG诱导蛋白质表达。诱导15小时后用Beckman J-6B以4000rpm离心30分钟收集细胞。将细胞沉淀物重悬在缓冲液中，在Milsonix XL2020超声波仪中用标准的12mm直径探头对重悬的细胞进行1分钟的超声破碎，总共超声约10分钟。用Beckman J2-21离心机以4000rpm离心10分钟回收包涵体沉淀物。然后用去污剂洗涤三次以去除细胞碎片和膜组分。每次用Triton缓冲液(50mM Tris-HCl、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0)均浆包涵体沉淀物，然后用Beckman J2-21离心机以4000rpm离心15分钟使其沉淀。然后用如下缓冲液进行类似洗涤去除去污剂和盐：50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH8.0。最后，将包涵体分成60mg的等分，-70℃冷冻。用6M盐酸胍溶解，用紫外分光光度计定量测定包涵体蛋白产率。
从冷冻储备物融化约60mg其中溶有ILT多肽的包涵体，用15ml胍溶液(6M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA)稀释以确保链完全变性。然后将含有完全还原并变性的ILT多肽的胍溶液注入1升以下重折叠缓冲液中：100mM Tris pH 8.5、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原性胱亚胺(Cystaeimine)、0.5mM 2-巯基乙胺、5M尿素。加入氧化还原对(2-巯基乙胺和胱胺(其终浓度分别为6.6mM和3.7mM))，约5分钟后加入变性的ILT多肽。将溶液静置30分钟。5℃±3℃，在Spectrapor 1膜(Spectrum；产品编号：132670)中用10L 10mM Tris pH 8.1透析重折叠的ILT多肽18-20个小时。然后将透析缓冲液换为新鲜的10mM Tris pH 8.1(10L)，继续在5℃±3℃下再透析20-22小时。
将透析的重折叠蛋白加载到POROS 50HQ阴离子交换柱上，然后用Akta纯化仪(Pharmacia)以50倍以上柱体积的0-500mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白质来分离可溶性ILT多肽与降解产物和杂质。将峰组分储存于4℃，采用考马斯染色的SDS-PAGE进行分析，然后合并和浓缩。最后，采用在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％乙基苯基聚乙二醇p40(nonidet p40))中预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱纯化和表征可溶性ILT多肽。合并、浓缩在相对分子量约为27kDa洗脱的峰，然后用Biacore表面等离振子共振分析来表征。
实施例4-Biacore表面等离振子共振表征可溶性ILT对pMHC的结合
用表面等离振子共振生物传感器(Biacore 3000TM)来分析可溶性ILT分子与I类pMHC的结合。制备以半定向方式固定于链霉亲和素包被的结合表面的可溶性生物素化pMHC(如下所述)有助于该分析并可同时有效测试可溶性ILT分子与多达4种不同pMHC(固定于不同流动小室)的结合。注射pMHC易于操控固定的I类分子的精确水平。
由含有组成型亚单位蛋白和合成肽的细菌表达包涵体体外重折叠加载有CEA衍生的YLSGANLNL(SEQ ID NO：15)肽的可溶性生物素化I类HLA-A*0201，然后纯化并在体外进行酶生物素化(O’Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266：9-15)。所表达的MHC重链具有C末端生物素化标签，其在适合的构建物中替代了该蛋白质的跨膜区和胞质结构域。获得的包涵体表达水平约为75mg/升细菌培养液。还在大肠杆菌中将合适构建体的MHC轻链或β2-微球蛋白表达为包涵体，其水平约为500mg/升细菌培养液。
裂解大肠杆菌细胞，将包涵体纯化到约80％的纯度。包涵体的蛋白质在6M盐酸胍、50mM Tris pH 8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA中变性，在低于5℃将变性的蛋白一次脉冲加入重折叠缓冲液，以30mg/升重链、30mg/升β2m的浓度在0.4M L-精氨酸-HCl、100mM Tris pH 8.1、3.7mM胱胺、6.6mM β-巯基乙胺、MHC负载所需的4mg/ml肽中重折叠。重折叠在4℃时进行至少1小时方能完成。
用10倍体积的10mM Tris pH 8.1进行透析来更换缓冲液。需更换缓冲液2次以充分降低溶液的离子强度。然后用1.5μm的醋酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液，加载到POROS 50HQ阴离子交换柱上(8ml的床体积)。用线性0-500mMNaCl梯度洗脱蛋白质。以约250mM NaCl洗脱可溶性生物素化的HLA-A2-肽复合物，收集峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)，然后在冰上冷藏这些组分。
采用以10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl平衡的Pharmacia快速脱盐柱，将生物素化标记的pMHC的缓冲液更换为10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl。洗脱后立即将含蛋白质的诸组分置于冰上冷藏，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化试剂：1mM生物素、5mM ATP(缓冲至pH 8)、7.5mM MgCl2和5μg/ml BirA酶(根据O’Callaghan 等(1999)Anal.Biochem.266：9-15进行纯化)。然后室温培育该混合物过夜。
采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pMHC。用经过滤的PBS预平衡Pharmacia Superdex 75HR 10/30柱，然后加载1ml生物素化反应混合物，用PBS以0.5ml/分钟展开柱。生物素化的pMHC在约15ml时以单峰洗脱。合并含蛋白质的诸组分，在冰上冷藏，然后加入蛋白酶抑制剂混合物。采用考马斯结合分析法(PerBio)测定蛋白质浓度，将生物素化pMHC的等份试样冷冻于-20℃。采用标准胺偶联法固定链霉亲和素。
该固定化的pMHC与可溶性T-细胞受体和共同受体(coreceptor)CD8αα以及ILT分子均能结合，可利用这些相互作用确保固定的pMHC正确重折叠。
在Biacore 3000TM表面等离振子共振(SPR)生物传感器上分析含可溶性ILT分子与CEA衍生YLSGANLNL(SEQ ID NO：15)-HLA-A*0201(其产生如上所述)之间的相互作用。在一流动小室中，SPR检测到传感器表面附近以响应单元(RU)表示的折光率发生变化，该原理可用于检测受体配体相互作用和分析它们的亲和力以及动力学参数。通过生物素标签结合将pMHC复合物固定在流动小室中制成检测流动小室。然后使可溶性ILT以恒定的流速通过不同流动小室的表面，检测该情况下的SPR响应以进行测试。
检测平衡结合常数
制备了可溶性ILT分子的连续稀释液，以5μl/分钟的恒定流速注入两个不同的流动小室；一个流动小室用约500RU的特异性-HLA-A*0201复合物包被，第二个小室用作空白对照。利用对照小室的测定值标准化对各浓度的响应。以标准化数据响应对ILT样品的浓度作图，拟合成双曲线(hyperbola)以计算平衡结合常数，KD。(Price & Dwek，Principles and Problems in Physical Chemistry forBiochemists (《生物化学家的物理化学原理和问题》)，第二版，1979，ClarendonPress，牛津)。
检测动力学参数
通过试验检测解离速率常数Kd和结合速率常数Ka来测定高亲和力可溶性ILT的KD。平衡常数KD计算为kd/ka。
将高亲和力ILT-样分子注射流过两个不同小室，一个用约300RU的CEA衍生的YLSGANLNL(SEQ ID NO：15)-HLA-A*0201复合物包被，另一个用作空白对照。流速设置为50μl/分钟。通常以约3μM的浓度注入250μl的ILT多肽。然后使缓冲液流过直到响应回复到基线。用Biaevaluation软件计算动力学参数。也将解离相拟合为单指数衰变方程式从而能计算半衰期。
结果
采用上述方法分析野生型ILT-2的可溶性变体和CEA衍生的YLSGANLNL-HLA-A*0201复合物之间的相互作用，显示KD约为6μM。具有图4a-4d(SEQ ID No：6-9)和图13a-13bh(SEQ ID NO：21-80)所示氨基酸序列的ILT-样分子的KD为小于或等于1μM和/或2S-1或更慢。
实施例5-可溶性ILT-介导pMHC/CD8相互作用抑制的Biacore表面等离振子共振分析
用表面等离振子共振(surface plasmon resonance)生物传感器(Biacore3000TM)分析可溶性ILT介导pMHC/CD8相互作用的抑制。制备可溶性pMHC(如下所述)和生物素化的可溶性CD8αα(也如下所述)有助于该分析。以半定向方式将该生物素化的可溶性CD8αα分子固定于链霉亲和素包被的结合表面“Biacore芯片”，从而能有效测试可溶性pMHC复合物与固定的可溶性CD8αα的结合。注射生物素化的可溶性CD8αα分子能易于对固定的CD8分子进行精确水平的操作。
采用基本上如(Garboczi等，(1992)PNAS USA 893429-3433)所述的方法制备加载有CEA衍生的YLSGANLNL(SEQ ID NO：15)肽的可溶性HLA-A*0201pMHC。体外重折叠来自含有组成型亚单位蛋白和合成肽的细菌表达包涵体中的可溶性pMHC分子，然后纯化。还在大肠杆菌中将合适构建体的MHC轻链或β2-微球蛋白表达为包涵体，其水平约为500mg/升细菌培养液。
裂解大肠杆菌细胞，纯化包涵体，除省去生物素化步骤之外采用实施例4所详述的方法重折叠和纯化过度表达的蛋白质。
如EP1024822的实施例1和6所述制备生物素化的可溶性CD8分子。简言之，含有C-末端生物素化标签的可溶性CD8α在大肠杆菌中表达为包涵体，然后纯化和重折叠以产生能通过酶法生物素化的含标签序列的CD8αα同二聚体。(Schatz，(1993)Biotechnology N Y 11：1138-43)。然后利用BirA酶生物素化标记的CD8α分子(O’Callaghan等，Anal Biochem 266(1)：9-15(1999)。生物素化试剂为：1mM生物素、5mM ATP(缓冲至pH 8)、7.5mM MgCl2和5μg/ml BirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)Anal.Biochem.266：9-15纯化)。室温培育混合物过夜。
将生物素化的sCD8αα固定在Biacore链霉亲和素包被的芯片表面，导致折光率改变1000响应单位。这种固定的CD8αα能与可注射入可溶相中的可溶性pMHC复合物结合。
如下所示分析ILT分子抑制Biacore 3000TM表面等离振子共振(SPR)生物传感器上pMHC/CD8相互作用的能力：
SPR检测流动小室内接近传感器表面以响应单位(RU)表示的折光率变化，该原理可用于检测受体配体相互作用和分析它们的亲和力以及动力学参数。通过将可溶性生物素化的CD8αα分子固定到上述链霉亲和素包被的芯片上来制备芯片。制备野生型ILT或高亲和力ILT-样分子的连续稀释液，在有合适浓度的可溶性YLSGANLNL(SEQ ID NO：15)-HLA-A*0201存在下，以5μl/分钟的恒定流速注射流过包被有1000RU生物素化CD8αα的流动小室。抑制CD8αα/pMHC相互作用的SPR应答产生了剂量应答曲线，利用该曲线计算所测试的该多肽对此相互作用的IC50值。
实施例6-多肽序列相同性和相似性的比较
对于该项应用，可通过以下网址获得产生相同性和相似性数据的蛋白质-蛋白质比较算法：
http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www/cgi/search_frm2.cgi
利用该网址上得到的“FASTA：蛋白质：蛋白质DNA：DNA”程序进行这些比较。使用以下(默认)设置：
Ktup：        Ktup＝2
评分矩阵：    Blosum 50
Gap：         -10
Ext：         -2
为进行所需的比较，将图4b中以单字母密码子表示的可溶性ILT-2片段氨基酸序列(SEQ ID NO：7)作为第一(查询)序列输入，将与之比较的氨基酸序列作为第二(文库)序列输入。然后，可执行该算法，得到所比较序列对的相同性和相似性百分比。
本领域技术人员明白，可用于此分析的FASTA蛋白质：蛋白质比较有许多来源。
实施例7-制备用于表达可溶性高亲和力c20ILT-样多肽的巴斯德毕赤酵母载体
图9a(SEQ ID NO：19)提供了用于在巴斯德毕赤酵母中表达只含有结构域D1和D2的可溶性c20高亲和力ILT-样多肽的DNA序列。可由承包研究公司，例如GeneArt(德国)从头合成为毕赤酵母表达而优化的该DNA序列。将编码半胱氨酸的密码子加入该DNA的3’引物端以在表达的ILT-样多肽的C-末端上提供“标签”，从而促进多聚化(如果需要的话)。将限制性内切酶识别位点(SnaBI和NotI)引入该DNA序列以促进该DNA序列连接入pPIC9K表达质粒。(Invitrogen)
导入编码可溶性高亲和力c20ILT样多肽的DNA的限制性内切酶识别位点
SnaBI  -tacgta
NotI   -gcggccgc
连接
采用快速DNA连接试剂盒(Roche)，将编码高亲和力ILT-样多肽的DNA序列连接入用SnaBI和NotI限制性内切酶切割的pPIC9K载体(Invitrogen)。
质粒扩增
将连接的质粒转化入感受态XL1-蓝(Stratagene，Country)，将其接种于含有100mg/ml卡那霉素的LB/琼脂平板上。37℃培育过夜后，挑选单菌落，37℃在100ml含有100mg/ml卡那霉素的LB中摇动生长过夜。利用Midiprep试剂盒(Qiagen)纯化克隆的质粒，利用自动化DNA测序仪(Lark Technologies)测序插入的片段。
图9b(SEQ ID NO：20)显示了由图9a所示DNA序列(SEQ ID NO：19)编码的二结构域高亲和力ILT-样(c20)多肽的氨基酸序列。
实施例8-在巴斯德毕赤酵母中表达和纯化可溶性高亲和力ILT-样多肽
如下所述，将如实施例7中所述制备的含有亲和力ILT-样多肽的编码DNA的巴斯德毕赤酵母表达质粒转化入巴斯德毕赤酵母菌株GS115(Invitrogen，美国)：
利用Pichia EasyComp Kit(Invitrogen)将GS115巴斯德毕赤酵母细胞制成感受态。该试剂盒利用PEG1000将这些细胞制备成化学感受态。
利用Sal I使含有LIT-样多肽DNA的载体线性化，按照Invitrogen手册所述转化入GS115菌株。
用RDB琼脂平板(Invitrogen)培养细胞来选择含有高亲和力ILT-样多肽的编码DNA的转化体。RDB琼脂不含组氨酸，从而确保只有成功转化了pPIC9K质粒的酵母细胞能生长。pPIC9K质粒通过提供能使其在His-培养基上生长的一拷贝HIS4基因赋予在组氨酸-琼脂上生长的能力。
从琼脂平板上挑出单菌落，30℃用BMGY培养基(Invitrogen)培养过夜，然后诱导蛋白质表达。通过离心(spinning)细胞(2000×g，10分钟)并重悬在200mlBMMY诱导培养基(Invitrogen)中来诱导蛋白质表达。诱导后6天，以2000×g离心30分钟收集细胞。采用切向流过滤(tangential flow filtration)(Sartorious10kDa截断值)将上清液浓缩至10ml，利用SEC(S200HR GE Healthcare)纯化。
将诸峰组分储存于4℃，采用考马斯染色的SDS-PAGE进行分析，然后合并和浓缩。最后，采用在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％乙基苯基聚乙二醇p40)中预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱纯化和表征可溶性高亲和力ILT样多肽。合并、浓缩在相对分子量约为27kDa洗脱的峰，然后用实施例4所详述的方法通过Biacore表面等离振子共振分析来表征。
结果
通过实施例4基于Biacore的方法测定到巴斯德毕赤酵母表达的高亲和力c20ILT-样多肽对I类MHC的KD约为100-150nM。利用毕赤酵母产生的高亲和力c20ILT-样多肽得到的Biacore曲线见图10。该结果与大肠杆菌产生的相应高亲和力c20ILT-样多肽测定的约为25-85nM的KD可比。
实施例9-利用3.4kdMal-PEG-Mal接头二聚化ILT-样多肽
采用实施例1-3所详述的方法制备在C-末端含有额外的半胱氨酸残基的可溶性c50高亲和力ILT-样多肽。(该多肽的氨基酸序列见图8b(SEQ ID NO：17))。利用不分叉的双功能马来酰亚胺-PEG(MAL-PEG-MAL，分子量3.4KD，NOFCorporation，日本)交联ILT-样多肽。该接头末端上的马来酰亚胺基团赋予该接头游离巯基结合特异性。在交联前，先用还原剂0.1mM DTT预处理(室温，过夜)ILT-样多肽再交联，从而释放该可溶性ILT-样多肽上的游离半胱氨酸。利用低浓度的该还原剂选择性还原该暴露的C-末端半胱氨酸残基。然后用PBS缓冲液通过凝胶过滤层析(Superdex 75)再次纯化该可溶性ILT-样多肽。然后用10kDa截断值的离心薄膜浓缩仪(centrifugal membrane concentrator)(VivaS cience，Satorius)再次浓缩该ILT-样多肽。以约2∶1(蛋白质比交联剂)的摩尔比分步加入MAL-PEG-MAL(10mM，DMF配制)，然后室温培育两小时来实现交联。然后利用以PBS预平衡的Superdex 75HR10/30凝胶过滤柱纯化产物。交联后观察到3个峰，其中一个峰符合完整的“单体”ILT-样多肽的位置，(其它)的符合较高分子量的物质。通过SDS-PAGE进一步分析诸峰中的物质。
用不含DTT(非还原性)或含15mM DTT(还原性)的标准SDS样品缓冲液(BioRad)预处理三个峰的样品，进行梯度4-20％PAGE(电泳)，用考马斯蓝染色。在非还原性条件下，三个峰中的物质分别显示为交联(ILT--PEG-ILT)物质、中间物质(ILT--PEG)和未修饰的ILT-2。
采用实施例4详述的基于Biacore的方法验证这些可溶性高亲和力c50ILT-样多肽二聚体与I类pMHC结合的能力。该可溶性高亲和力c50ILT-样二聚体显示的解离半衰期约为30-86分钟。通过比较，Biacore方法测定相应的可溶性c50ILT-2单体多肽的KD约为6秒。这清楚地证明二聚化提高了亲和力。图11提供了可溶性高亲和力c50ILT-样多肽二聚体与Tax-HLA-A*0201相互作用的Biacore曲线。该Biacore曲线也加有用于计算该特定运行的解离半衰期的回归线。(86分钟)
实施例10-ILT-2多肽的四聚化
利用四聚马来酰亚胺-PEG(4臂MAL-PEG，分子量20KD，ShearwaterCorporation)四聚化在C-末端含有额外半胱氨酸残基的可溶性高亲和力c50ILT-样多肽。该接头末端上的马来酰亚胺基团赋予该接头游离巯基结合特异性。交联前，先用还原剂0.1mM DTT预处理(室温，过夜)可溶性高亲和力c50ILT-样多肽，从而释放该可溶性ILT-2多肽上的游离半胱氨酸。利用低浓度的该还原剂选择性还原暴露的C-末端半胱氨酸残基。然后用PBS缓冲液通过凝胶过滤层析(Superdex 75)再次纯化该可溶性高亲和力c50 ILT-样多肽。然后用10kDa截断值的离心薄膜浓缩仪(VivaScience，Satorius)再次浓缩该可溶性高亲和力c50 ILT-样多肽。以约4∶1(蛋白质比交联剂)的摩尔比分步加入四臂MAL-PEG-(10mM，DMF配制)，然后室温培育两小时分钟来实现四聚化。然后利用以PBS预平衡的Superdex 75 HR10/30凝胶过滤柱纯化产物。通过SDS-PAGE进一步分析洗脱的诸组分。
用不含DTT(非还原性)或含15mM DTT(还原性)的标准SDS样品缓冲液(BioRad)预处理这些组分的样品，进行梯度4-20％PAGE(电泳)，用考马斯蓝染色。SDS PAGE凝胶(电泳)显示四聚可溶性高亲和力c50 ILT-样多肽物质约占存在的蛋白质的50％。
采用实施例4详述的基于Biacore的方法验证这些四聚体与I类pMHC结合的能力。这些可溶性c50ILT-样四聚体与Tax-HLA*0201的结合非常紧密，以致于不能测定该相互作用的解离表观KD或半衰期。通过比较，Biacore方法测定相应的可溶性c50ILT-2二聚体和单体多肽的相互作用解离半衰期分别是30-86分钟和约为6秒。这清楚地证明四聚化提高了亲和力。图12提供了可溶性高亲和力c50 ILT-样多肽四聚体与Tax-HLA*A0201相互作用的Biacore曲线。
实施例11-评估高亲和力c50 ILT-样单体、二聚体和四聚体体外抑制细胞毒性T细胞(CTL)激活的ELISPOT试验
以下方法提供了评估可溶性高亲和力c50ILT-样多肽单体和多价复合物抑制CD8共同受体介导的T细胞激活的手段。
试剂：
试验培养基：10％FCS(热灭活的，Gibco，目录号10108-165)，88％RPMI1640(Gibco，目录号42401-018)，1％谷氨酰胺(Gibco，目录号25030-024)和1％青霉素/链霉素(Gibco，目录号15070-063)。
洗涤缓冲液：0.01M PBS/0.05％吐温20(将Sigma，目录号P-3563的1袋含吐温20的磷酸缓冲盐水，pH7.4溶解于1升蒸馏水得到最终的组合物0.01MPBS、0.138M NaCl、0.0027M KCl、0.05％吐温20)。
PBS(Gibco，目录号10010-015)。
Diaclone EliSpot试剂盒(IDS)EliSpot试剂盒装有需要的所有其它试剂，即捕捉和检测抗体，脱脂奶粉、BSA、链霉亲和素-碱性磷酸、BCIP/NBT溶液(人IFN-γPVDF Eli-spot 20×96孔与平板(IDS目录号DC-856.051.020，DC-856.000.000)。
以下方法基于随各试剂盒提供的厂商使用说明书，但有少许改进。
方法
每平板用10ml无菌PBS稀释100μl捕捉抗体。将100μl稀释的捕捉抗体等份加入各孔，4℃静置过夜，或室温静置2小时。然后用450μl洗涤缓冲液，Ultrawash 96-孔板清洗器(Thermo Life Sciences)洗涤各平板三次以除去过量的捕捉抗体。然后将100μl 2％脱脂奶加入各孔。(将随EliSpot试剂盒提供的一小瓶脱脂奶粉溶解于50ml无菌PBS)。然后，室温培育各平板2小时，再用450μl洗涤缓冲液，Ultrawash 96-孔板清洗器(Thermo Life Sciences)洗涤各平板三次。
使用胰蛋白酶使Mel 624和Mel 526靶细胞脱离它们的组织培养瓶，在试验培养液中离心(280×g，10分钟)洗涤一次，以1×106/ml重悬在同样的培养液中。然后将50μl该混悬液加入试验平板得到的靶细胞总数为50,000个细胞/孔。
离心(280×g，10分钟)收集MART-1特异性T细胞克隆(KA/C5)(效应细胞系)，以1×104/ml重悬在试验培养液中，当将50μl加入试验平板时得到500个细胞/孔。
用试验培养液将可溶性高亲和力c50ILT-样多肽单体、二聚体和四聚体稀释成3×浓度，当将50μl以150μl的终体积加入平板时得到1×终浓度。测试的ILT-2单体的浓度范围是10μM-0.03μM。测试的ILT-2二聚体和四聚体的浓度范围是1μM-0.003μM。
然后制备含有以下各物质的孔，(各孔中最终反应体积是100μl)：
测试样品(顺序加入)：
50μl Mel 624或Mel 526靶细胞
50μl所需浓度的ILT-样单体、四聚体或二聚体。
50μl T细胞克隆效应细胞。
阴性对照
50μl靶细胞
50μl最高浓度的ILT-样单体、二聚体或四聚体
50μl试验培养液
或
50μl效应细胞
50μl最高浓度的ILT-样单体、二聚体或四聚体
50μl试验培养液
阳性对照
50μl Mel 624或Mel 526靶细胞
50μl效应细胞
50μl试验培养液
或
为显示CD8依赖性
50μl Mel 624或Mel 526靶细胞
50μl效应细胞
含有100μg/ml HB230抗CD8抗体的50μl(溶液)
37℃/5％CO2培育各平板。然后用洗涤缓冲液洗涤各平板六次，再轻拍出多余的缓冲液。然后向随ELISPOT试剂盒提供的各检测抗体小瓶中加入550μl蒸馏水以制备稀释溶液。然后每平板再用10ml PBS/1％BSA稀释100μl稀释的检测抗体溶液，将100μl稀释的检测抗体溶液等份加入各孔。室温培育各平板90分钟。
然后用洗涤缓冲液洗涤各板三次(用450μl洗涤缓冲液，Ultrawash 96-孔平板清洗器(Thermo Life Sciences)洗涤三次)，拍干。每板再用10ml PBS/1％BSA稀释10μl链霉亲和素-碱性磷酸酶，向各孔加入100μl稀释的链霉亲和素，室温培育1小时。然后用450μl洗涤缓冲液再洗涤各板三次，拍干。
将100μl提供BCIP/NBT的溶液加入各孔，用箔片覆盖各板，静置显影5-15分钟。在此期间常规检测各板上斑点形成来确定何时终止反应。
然后用自来水彻底洗涤各板，分析(take apart)前摇晃，静置于工作台上干燥。
一旦干燥，用ELISPOT读数计(Autoimmune Diagnotistika，德国)对各板读数。
各孔中显示的斑点数目与激活的T细胞数目成正比。因此，含有可溶性高亲和力c50ILT-样多肽单体、二聚体或四聚体的孔中斑点数目的任何减少表明CD8共同受体介导的CTL激活受抑制。
结果
如图14所示，单体和二聚体形式的高亲和力c50ILT-2多肽能有效抑制CTL激活。高亲和力c50ILT-样二聚体抑制CTL激活远比相应的单体有效。高亲和力c50ILT-样四聚体甚至更有效。(参见图15)。从图15所示数据计算的单体、二聚体和四聚体ILT-样多肽抑制CTL的IC50值分别是800nM、16.2nM和0.7nM。

Claims (60)

1. 一种对给定的I类pMHC具有结合特性的多肽，其特征在于，所述多肽对所述给定的I类pMHC的KD小于或等于1μM和/或对所述给定的I类pMHC的解离速率(koff)为2S-1或更慢，所述多肽与SEQ ID NO：7有至少45％相同性和/或55％相似性，并且所述多肽对CD8与该给定pMHC结合的抑制程度高于多肽SEQ ID NO：3。
2. 如权利要求1所述的多肽，其特征在于，其是一种突变的人ILT分子。
3. 如权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，采用表面等离振子共振检测所述KD和/或koff。
4. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，对应于SEQ ID NO：3的氨基酸10W、19Q、20G、21S、42K、47W、50R、66I、77Y、78Y、79G、80S、81D、82T、83A、84G、85R、87E、99A、101I、102K、141E、146L、147N、159I、168S、172W、174R和188L的一个或多个氨基酸发生突变。
5. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，采用SEQ ID NO：3的编号方法，所述多肽含有以下一个或多个突变：10W→L、19Q→M、19Q→L、19Q→V、20G→D、20G→M、20G→Q、20G→F、20G→S、20G→E、20G→R、21S→Q、21S→R、21S→A、21S→S、42K→R、47W→Q、50R→L、66L→V、77Y→V、77Y→M、77Y→I、77Y→Q、78Y→Q、78Y→I、78Y→G、79G→Q、79G→Y、79G→W、79G→R、79G→V、80S→R、80S→T、80S→G、81D→G、81D→Q、81D→L、81D→V、82T→G、82T→E、83A→S、83A→G、83A→R、84G→L、84G→Q、84G→A、85R→W、87E→A、99A→I、99A→Y、101I→L、101I→K、101I→Q、101→V、102K→Q、102K→A、102K→R、141E→G、141E→D、146L→D、147N→S、159I→E、168S→G、172W→R、174R→W或188L→D。
6. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，采用SEQ ID NO：3的编号方法，所述多肽含有对应于19Q→M和21S→Q的突变。
7. 如权利要求1-5中任一项所述的多肽，其特征在于，采用SEQ ID NO：3的编号方法，所述多肽含有对应于19Q→M、20G→D、21S→Q、99A→V和168S→G的突变。
8. 如权利要求1-5中任一项所述的多肽，其特征在于，采用SEQ ID NO：3的编号方法，所述多肽含有对应于19Q→L、20G→M和21S→Q的突变。
9. 如权利要求1-5中任一项所述的多肽，其特征在于，采用SEQ ID NO：3的编号方法，所述多肽含有对应于19Q→M、20G→Q、21S→R、42K→R和146L→S的突变。
10. 如权利要求1-5中任一项所述的多肽，其特征在于，采用SEQ ID NO：3的编号方法，所述多肽含有对应于19Q→M、20G→D、21S→Q、83A→S、84G→Q、85R→W、87E→A和99A→V的突变。
11. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，采用SEQ ID NO：3的编号方法，其中对应于135C或145C中一个或二者的氨基酸突变为S。
12. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，其所含的氨基酸至少对应于SEQ ID NO：3的氨基酸1-195。
13. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽由SEQ IDNO：6-9或21-61中任一条构成或包含其中任一条。
14. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽由SEQ IDNo：16构成或包含SEQ ID No：16。
15. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有一个或多个突变，与缺乏所述突变的相应多肽相比，这些突变增强该多肽的溶解性。
16. 如权利要求15所述的多肽，其特征在于，其中至少一个与溶剂接触的疏水性氨基酸被带电荷的氨基酸取代。
17. 如权利要求15或16所述的多肽，其特征在于，所述突变位于该多肽C-末端6个氨基酸内。
18. 如权利要求15-17中任一项所述的多肽，其特征在于，对应于SEQ IDNO：3的196L和/或198L的氨基酸分别突变为196D和198D。
19. 如权利要求15-18中任一项所述的多肽，其特征在于，采用SEQ ID NO：3的编号方法，所述多肽含有对应于19Q→M、20G→D、21S→Q、83A→S、84G→Q、85R→W、87E→A、99A→V、196L→D和198L→D的突变。
20. 如权利要求15-17中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽由SEQID No：63-80中任一条构成或包含其中任一条。
21. 如权利要求14-19中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽由SEQID No：17或62构成，或包含SEQ ID No：17或62。
22. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，在所述多肽的C-末端上含有“标签”。
23. 如权利要求22所述的多肽，其特征在于，所述标签是半胱氨酸残基。
24. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽与至少一条聚亚烷基二醇链连接。
25. 如权利要求24所述的多肽，其特征在于，所述一条或多条聚亚烷基二醇链与所述多肽连接。
26. 如权利要求24或25所述的多肽，其特征在于，所述一条或多条聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位。
27. 如以上权利要求中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多肽与治疗剂相连。
28. 如权利要求27所述的多肽，其特征在于，所述多肽与治疗剂共价连接。
29. 如权利要求28所述的多肽，其特征在于，所述治疗剂与所述多肽的C-末端共价连接。
30. 如权利要求27-29中任一项所述的多肽，其特征在于，所述治疗剂是免疫效应分子。
31. 如权利要求30所述的多肽，其特征在于，所述免疫效应分子是细胞因子。
32. 如权利要求31所述的多肽，其特征在于，所述免疫效应分子是IL-4、IL-10或IL-13。
33. 一种含有至少两个如权利要求1-32中任一项所述多肽的多价复合物，所述多价复合物对给定的I类pMHC的KD小于或等于1μM和/或对所述给定的I类pMHC的解离速率(koff)为2S-1或更慢。
34. 如权利要求33所述的多价复合物，其特征在于，所述多肽通过非肽聚合物链或肽接头序列相连。
35. 如权利要求33所述的多价复合物，其特征在于，聚合物链或肽接头序列在各多肽中不位于该多肽的I类pMHC结合结构域中的氨基酸残基之间延伸。
36. 如权利要求34或35所述的多价复合物，其特征在于，所述多肽通过聚亚烷基二醇链或衍生自人多聚化结构域的肽接头相连。
37. 如权利要求36所述的多价复合物，其特征在于，在所述聚亚烷基二醇链及其与所述复合物的多肽的连接点之间具有二价亚烷基间隔基团。
38. 如权利要求36或37所述的多价复合物，其特征在于，所述聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位。
39. 如权利要求33-38中任一项所述的多价复合物，其特征在于，其是二聚体或四聚体。
40. 一种含有至少两个如权利要求33-39中任一项所述多肽的多价复合物，其中(i)至少一条所述多肽与如权利要求16-21中任一项所述的治疗剂相连。
41. 如以上权利要求中任一项所述的多肽或多价复合物，其特征在于，其是可溶的。
42. 一种编码如权利要求1-32中任一项所述多肽的分离的核酸。
43. 如权利要求42所述分离的编码核酸，其特征在于，其适应于在宿主细胞中高水平表达。
44. 一种掺有如权利要求42或43所述核酸的载体。
45. 一种呈递至少一条如权利要求1-21中任一项所述多肽的分离的细胞或颗粒。
46. 一种药物组合物，其含有如权利要求1-26中任一项所述多肽，或如权利要求33-39中任一项所述多价复合物，或如权利要求45所述多个细胞或颗粒，连同药学上可接受的载体。
47. 如权利要求1-26中任一项所述的多肽，或如权利要求33-39中任一项所述的多价复合物，或如权利要求45所述的多个细胞或颗粒在制备治疗自身免疫疾病的药物中的用途，所述药物适于胃肠外给药。
48. 如权利要求1-26中任一项所述的多肽，或如权利要求33-39中任一项所述的多价复合物，或如权利要求45所述的多个细胞或颗粒的治疗性用途。
49. 一种药物组合物，其含有如权利要求27-32中任一项所述多肽，或如权利要求40所述多价复合物，连同药学上可接受的载体。
50. 如权利要求27-32中任一项所述的多肽，或如权利要求40所述的多价复合物在制备治疗自身免疫疾病的药物中的用途，所述药物适于胃肠外给药。
51. 如权利要求27-32中任一项所述的多肽，或如权利要求40所述的多价复合物的治疗性用途。
52. 一种治疗自身免疫疾病的方法，包括给予患有这种自身免疫疾病的对象有效量的如权利要求1-26中任一项所述多肽、或如权利要求33-39中任一项所述多价复合物、或如权利要求45所述多个细胞或颗粒。
53. 如权利要求1-26中任一项所述多肽、或如权利要求33-39中任一项所述多价复合物、或如权利要求45所述多个细胞或颗粒在制备用于治疗自身免疫疾病的组合物中的用途。
54. 一种治疗自身免疫疾病的方法，包括给予患有这种自身免疫疾病的对象有效量的如权利要求27-32中任一项所述多肽或如权利要求40所述多价复合物。
55. 如权利要求27-32中任一项所述多肽或如权利要求40所述多价复合物在制备用于治疗自身免疫疾病的组合物中的用途。
56. 一种鉴定对给定的I类pMHC具有结合特性的给定ILT分子高亲和力变体的方法，其特征在于，所述多肽对所述给定的I类pMHC的KD小于或等于1μM和/或对所述给定的I类pMHC分子的解离速率(koff)为2S-1或更慢，所述多肽与SEQ ID NO：7有至少45％相同性和/或55％相似性，并且所述多肽对CD8与该给定pMHC结合的抑制程度高于多肽SEQ ID NO：3，所述方法包括：
(i)制备ILT分子文库，与相应的野生型ILT分子相比，所述ILT分子在氨基酸序列中含有一个或多个突变；和
(ii)在适合突变的ILT分子与I类pMHC靶标结合的条件下，使所述突变的ILT分子与I类pMHC靶标接触；和
(iii)检测相互作用的KD和/或koff；和
(iv)选择具有所需结合特征的一种或多种多肽。
57. 一种制备如权利要求1-23中任一项所述多肽的方法，包括：
(i)用如权利要求43所述的载体转化宿主细胞；和
(ii)在适合表达如权利要求1-23中任一项所述多肽的条件下，培养所述转化细胞；和
(iii)回收所表达的多肽。
58. 如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌细胞。
59. 如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是酵母细胞。
60. 如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞是巴斯德毕赤酵母细胞。
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