CN101155829A - 高亲和力hiv t细胞受体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了对SLYNTVATL－HLA－A*0201复合物的亲和力(K_D)小于或等于1μM和/或解离速率(k_off)为1×10^－3S^－1或更慢的TCR，前提是当所述TCR由细胞递呈并包含SEQ ID NO：1和2时，所述细胞不是天然T细胞。此类TCR可单独使用或与治疗剂联用，以靶向于递呈该复合物的HIV感染细胞。

Description

高亲和力HIV T细胞受体

本发明涉及对HIV Gag多肽衍生的SLYNTVATL-HLA-A*0201具有结合特性的T细胞受体(TCR)。该TCR包含至少一个TCR α链可变区和/或至少一个TCR β链可变区，其对于所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的K_D小于或等于1μM和/或对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的解离速率(k_off)为1×10^-3S^-1或更慢。

发明背景

人免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的致病因子。该病毒是属于慢病毒群(group)中的一种被膜逆转录病毒。SLYNTVATL(SEQ IDNO：16)肽衍生自Gag基因的g17基因产物，Gag基因是构成人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的九个基因中的一个。该肽由HLA-A*0201负载，并呈递到HIV感染细胞的表面。因此，SLYNTVATL-HLA-A2*0201复合物提供了一种TCR可靶向的HIV标记，例如为将细胞毒剂或免疫刺激剂递送到感染细胞的目的。然而，对于该目的，如果TCR对肽-HLA复合物具有高亲和力和/或慢的解离速率将是有利的。

发明概述

本发明首次提供了对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的亲和力(K_D)小于或等于1μM和/或解离速率(k_off)为1×10^-3S^-1或更慢的TCR，前提是当所述TCR由细胞递呈且包含SEQ ID NO：1和2时，所述细胞不是天然T细胞。此类TCR不论单用或是与治疗剂一起使用对于靶向递呈该复合物的HIV感染细胞都是很有利的。

发明详述

本发明提供了一种T细胞受体(TCR)，其对SLYNTVATL-HLA-A*0201具有结合特性，并包含至少一个TCR α链可变区和/或至少一个TCR β链可变区，它的特征在于所述TCR对于所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的K_D小于或等于1μM和/或对于SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的解离速率(k_off)为1×10^-3S^-1或更慢，前提是当所述TCR由细胞递呈且包含SEQ ID NO：1和2时，该细胞不是天然T细胞。

可采用任何已知的方法测定K_D和/或(k_off)。一种优选的方法是实施例4中的表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，Biacore)方法。

为了比较，通过实施例4的基于Biacore方法测定亲本HIV gag TCR(TCRα链见SEQ ID NO：9，TCR β链见SEQ ID NO：10)的二硫键连接的可溶性变体与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物相互作用的K_D约为85nM，解离速率(koff)为2.21×10^-2S-1，半衰期为0.17分钟。

SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的特异性亲本HIV Gag TCR具有以下的V_α链和V_β链基因用途：

α链-TRAV 12.2

β链-TRBV 5.6

可将亲本HIV Gag TCR用作模板来产生本发明的其它TCR，所述其它TCR对于所述TCR与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物之间的相互作用的高亲和力高和/或解离速率慢。因此，相对于亲本HIV Gag TCR α链可变区(参见图1a和SEQ ID No：1)和/或β链可变区(参见图1b和SEQ ID NO：2)，本发明的TCR在其至少一个互补决定区(CDR)和/或可变区框架区发生突变。本发明也考虑了本发明TCR可变区中的其它超变区(例如超变4(HV4)区)可在高亲和力突变TCR中发生突变。

噬菌体展示为产生TCR变体文库提供了一种手段。(Li等，(2005)NatureBiotech 23(3)：349-354)和WO 2004/04404详述了适于噬菌体展示和随后的TCR变体文库筛选的方法，所述TCR变体各含有非天然链间二硫键。

天然TCR以异二聚化的αβ或γδ形式存在。然而，现已显示由单条TCR TCRα或TCR β链组成的重组TCR可结合肽MHC分子。

在一个实施方式中，本发明的TCR包括α链可变区和TCR β链的可变区。

TCR α链序列和/或TCR β链序列中的突变可为一个或多个取代、缺失或插入，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。可用任何合适的方法来实现这些突变，这些方法包括但不限于：基于聚合链式反应(PCR)方法、基于限制性内切酶的克隆方法、或不依赖于连接反应的克隆(LIC)方法。这些方法在许多标准分子生物学教材中有所详述。关于聚合酶链式反应(PCR)诱变法和基于限制性内切酶的克隆法更为详尽的描述可参见(Sambrook&Russell，(2001)Molecular Cloning-A Laboratory Manual(3^rdEd.)《分子克隆实验室指南》第三版，CSHL Press)。关于LIC法的进一步描述可见于(Rashtchian，(1995)Curr OpinBiotechnol 6(1)：30-6)。

应注意到包含相似Vα和Vβ基因应用并由此氨基酸序列与HIV Gag相似的任何αβTCR可用来制作便利的模板TCR。然后可能将产生本发明突变的高亲和力TCR所需的改变引入编码模板αβTCR的一个或两个可变区的DNA中。本领域技术人员显然知道可通过许多方法，例如定点诱变引入所需的突变。

与图1a和SEQ ID No：1的亲本HIV Gag TCRα链可变区序列中这些位置的氨基酸相比，本发明TCR包含那些在对应于以下所列的一个或多个TCRα链可变区的氨基酸发生突变的TCR。

除非另有相反陈述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或M)残基。本领域技术人员可知该残基在重组蛋白产生过程中可以除去。本领域技术人员也显然知道，可将其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5个或更多个残基，而基本不影响该TCR的pMHC结合性能，本发明包括所有这些不重要的变体。

本文所用的术语“可变区”应理解为包括给定TCR的不包含在由TCR α链的TRAC基因或TCR β链的TRBC1或TRBC2基因所编码的恒定区内的所有氨基酸(序列)。(《T细胞受体手册》(T cell receptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN 0-12-441352-8)。

本文所用的术语“可变域”应理解为包括给定TCR的由TCR α链的TRAC基因或TCR β链的TRBV基因所编码的所有氨基酸(序列)。(《T细胞受体手册》(Tcell receptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN0-12-441352-8)。

本领域技术人员可知，在本文定义的可变区和恒定区之间交界处由密码子所编码的氨基酸中发生变异可导致TCR库(repertoire)的部分多样性。例如，存在于亲本HIV Gag TCR序列中该交界处的密码子(突变)导致本文可变区序列的C-末端存在组氨酸(H)残基。该组氨酸取代了图8a所示，TRAC基因编码的N-末端天冬酰胺(N)残基。

本发明的实施方式中包括含有对应于以下一个或多个α链可变区氨基酸发生突变的突变性TCR：95T、96N、97S、98G和100A，例如以下氨基酸：

95S或G

96A

97H

98D

100S

以上的编号与图1a和SEQ ID No：1中所示的编号一致。

本发明的实施方案也包括对应于以下所列的一个或多个TCR β链可变区氨基酸相对于图1b和SEQ ID No：2的天然HIV Gag TCR β链可变区中这些位置的氨基酸发生突变的TCR。所指示的可能发生突变的氨基酸是：51Y、52E、53E和54E，例如：

51V或A

52R或L

53G

54V

以上的编号与图1b和SEQ ID No：2中所示的编号一致。

本发明的其它优选实施方式是含有图6所示突变的α链可变区氨基酸序列之一的TCR。(SEQ ID No：11到13)。这种TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分。

本发明的其它优选实施方式是含有图7所示突变的β链可变区氨基酸序列之一的TCR。(SEQ ID No：14和15)。这种TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分。

天然TCR存在异源二聚体αβ或γδ形式。然而，目前已显示由αα或ββ同源二聚体构成的重组TCR能与肽MHC分子结合。因此，本发明的一个实施方式是TCR αα或TCR ββ同源二聚体。

本发明的其它优选实施方式是含有下列α链可变区氨基酸序列和β链可变区氨基酸序列组合的本发明的TCR，这类TCR的表型沉默变体也构成本发明的一部分：

α链可变区序列，SEQ ID NO：	β链可变区序列，SEQ ID NO：
		1	2

1	14
		1	15
11	2
		12	2
13	2
		12	15
13	15
		12	14
13	14

在另一优选实施方案中，含有以上详述的可变区组合的本发明TCR还含有图8a所示α链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO：19)以及图8b和8c所示β链氨基酸恒定区序列之一(SEQ ID NO：20和21)或其表型沉默变体。

本文所用的术语“表型沉默变体”应理解为指对所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的K_D小于或等于1μM和/或具有1×10^-3S^-1或更慢的解离速率(k_off)的那些TCR。例如，本领域技术人员已知可能产生与以上详述的那些TCR相比，在其恒定和/或可变区中掺入了较小变化但不改变与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物相互作用的亲和力和/或解离速率的TCR。本发明范围包括这类不重要的变体。其中含有一个或多个保守取代的那些TCR也构成本发明的一部分。

就广义而言，本发明TCR可以如WO 04/033685和WO 03/020763所述为单链TCR(scTCR)或二聚体TCR(dTCR)形式。

合适的scTCR形式包括：由对应于TCR α链可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCR β链可变区序列并与对应于TCR β链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成的第二区段，和连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列。

或者，所述第一区段可由对应于TCR β链可变区氨基酸序列构成，所述第二区段可由对应于TCR α链可变区序列并与对应于TCR α链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成。

以上scTCR在第一和第二链之间还含有二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物，其中该接头序列的长度和该二硫键的位置应使第一和第二区段的可变区序列的相互取向基本上如天然αβT细胞受体中的那样。

更具体地说，所述第一区段可由对应于TCR α链可变区序列并与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成，第二区段可由对应于TCR β链可变区序列并与对应于TCR β链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成，和在第一和第二链之间可以存在天然αβT细胞受体中没有等价物的二硫键。

在以上scTCR形式中，接头序列可连接第一区段C末端和第二区段N末端，其可如式-PGGG-(SGGGG)_n-P-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是丝氨酸。

-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQ ID NO：17)

-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQ ID NO：18)

本发明TCR的合适dTCR形式包括：第一多肽，其中对应于TCR α链可变区的序列的一条序列与对应于TCR α链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合；第二多肽，其中对应于TCR β链可变区序列的一条序列与对应于TCR β链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合；该第一和第二多肽通过在天然αβT细胞受体中没有等价物的二硫键相连。

所述第一多肽可含有与对应于TCR α链恒定区胞外序列的序列的的N末端相融合的TCR α链可变区序列，而第二多肽中对应于TCR β链可变区序列的一条序列与对应于TCR β链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合，该第一和第二多肽通过取代TRAC*01外显子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等价物的外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基之间的二硫键相连。(“TRAC”等在本文根据《T细胞受体手册》(T cell receptor Factsbook)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科学出版社，ISBN 0-12-441352-8命名)。

本发明TCR的dTCR或scTCR形式可具有对应于人αβTCR胞外恒定区和可变区序列的氨基酸序列，在天然TCR中没有等价物的二硫键可连接所述恒定区序列的氨基酸残基。所述二硫键存在于与在天然TCR中其β碳原子距离小于0.6nm的氨基酸残基相对应的半胱氨酸残基之间，例如在取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01或其非人等价物的外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基之间。就TCR α链而言，可引入半胱氨酸形成二硫键的其它位点是TRAC*01外显子1中的以下残基，就TCR β链而言，是TRBC1*01或TRBC2*01外显子1中的以下残基：

TCRα链	TCRβ链	天然β碳的距离(nm)
			Thr 45Tyr 10Thr 45Ser 15	Ser 77Ser 17Asp 59Glu 15	0.5330.3590.5600.59

除了以上提及的非天然二硫键以外，本发明TCR的dTCR或scTCR形式可在对应于天然TCR中通过二硫键连接的残基的残基之间含有二硫键。

本发明TCR的dTCR或scTCR形式优选不含有对应于天然TCR的跨膜或胞质序列的序列。

本发明的TCR与SLYNTVATL-HLA-A2*0201牢固结合。当用HLA-A*0201负载时，这些TCR还可与HIV Gag衍生的SLYNTVATL天然变体相结合，其结合程度虽然发生改变但仍然有用。已从AIDS患者中分离的SLYNTVATL变体包括下述变体(Sewell等，(1997)Eur J Immunol.27：2323-2329)：

SLFNTVATL

SLFNTVAVL

SLSNTVATL

SSFNTVATL

SLLNTVATL

SLYNTIATL

SLYNTIAVL

SLFNTIATL

SLFNTIAVL

SLFNFVATL

突变的氨基酸用下划线表示。

PEG化的TCR单体

在一个具体的实施方式中，本发明的TCR与至少一条聚亚烷基二醇链结合。本领域技术人员已知有许多方法可产生这种结合。在一优选的实施方式中，一条或多条聚亚烷基二醇链与TCR共价相连。在另一实施方式中，本发明该方面的聚乙二醇链含有至少两个聚乙烯重复单位。

多价TCR复合物

本发明一方面提供含有至少两个本发明TCR的多价TCR复合物。在该方面的一个实施方式中，至少两个TCR分子经接头部分相连形成多价复合物。这些复合物优选为水溶性的，所以应照此(标准)选择接头部分。此外，接头部分优选能与TCR分子上确定的位置相连，从而尽可能降低所形成复合物的结构多样性。该方面的一个实施方式所提供的本发明TCR复合物中聚合物链或肽接头序列延伸于各TCR中不位于该TCR可变区序列中的氨基酸残基之间。

由于本发明复合物可用作药物，接头部分应该适当考虑它们的药学适用性，例如它们的免疫原性来选择。

本领域已知符合以上所需标准的接头部分的例子，例如连接抗体片段的技术。

两类接头优选用于产生本发明的多价TCR分子。其中的TCR通过聚亚烷基二醇链相连的本发明TCR复合物提供了该方面的一个实施方式。

第一类是亲水性聚合物，例如聚亚烷基二醇。此类中最常用的是聚乙二醇或PEG，其结构如下式所示。

HOCH₂CH₂O(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂OH

其中n大于2。然而其它聚合物可以基于其它合适的、任选取代的聚亚烷基二醇，包括聚丙二醇，和乙二醇与丙二醇的共聚物。

这种聚合物可用于处理或偶联治疗剂，特别是多肽或蛋白质治疗剂来有益地改变该疗剂的PK分布，例如降低肾廓清率、提高血浆半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。据信，一个或多个PEG分子在治疗剂周围形成的“外壳”能在立体上阻碍治疗剂与免疫系统反应并降低其蛋白酶降解，从而改善PEG-治疗剂偶联物的PK分布。(Casey等，(2000)，Tumor Targetting，4235-244)。所用亲水性聚合物的分子大小可根据TCR复合物预定的治疗应用来具体选择。已有许多综述文章和书籍详细描述了PEG和类似分子在药物制剂中的应用。例如，参见Harris，(1992)，《聚乙二醇化学-生物技术和生物医药应用》(PolyethyleneGlycol Chemistry-Biotechnical and Biomedical Applications)，Plenum，纽约，纽约州或Harris和Zalipsky，(1997)，《聚乙二醇化学和生物学应用ACS手册》(Chemistry and Biological Applications of Polyethylene Glycol ACS Books)，华盛顿，哥伦比亚特区。

所用的聚合物可具有线形或分支构型。可通过加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和赖氨酸来诱生分支PEG分子或其衍生物。

该聚合物一般在其结构中，例如在其一端或两端，和/或骨架的支链处具有化学反应活性基团而使该聚合物能与PCR中的靶位点相连。如下所示，这种化学反应活性基团可与亲水性聚合物直接相连，或者在亲水性聚合物或反应活性化学(基团)之间可以具有间隔基团/部分：

反应活性化学(基团)-亲水性聚合物-反应活性化学(基团)

反应活性化学(基团)-间隔基团-亲水性聚合物-间隔基团-反应活性化学(基团)

用于形成以上概述的该类型构建物的间隔基团可以是无反应活性、化学稳定的、链状的任何有机部分。这种间隔基团包括但不限于以下基团：

-(CH₂)_n-，其中n＝2到5

-(CH₂)₃NHCO(CH₂)₂

其中二价亚烷基间隔基团位于聚亚烷基二醇链和其与该复合物的TCR连接点之间的本发明TCR复合物是该方面的另一种实施方式。

其中聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位的本发明TCR复合物是该方面的另一实施方式。

本发明可用的直接或经间隔基团与反应活性化学物质相连的亲水性聚合物有许多商业供应商。这些供应商包括Nektar Therapeutics(加利福尼亚州，美国)、NOF Corporation(日本)、Sunbio(韩国)和Enzon Pharmaceuticals(新泽西州，美国)。

本发明可用的直接或经间隔基团与反应活性化学物质相连的亲水性聚合物包括但不限于以下聚合物：

PEG接头描述	PEG来源	目录号
			TCR单体连接
5K线形(马来酰亚胺)	Nektar	2D2MOHO1
			20K线形(马来酰亚胺)	Nektar	2D2MOPO1
20K线形(马来酰亚胺)	NOF Corporation	SUNBrightME-200MA
			20K支链(马来酰亚胺)	NOF Corporation	SUNBrightGL2-200MA
30K线形(马来酰亚胺)	NOF Corporation	SUNBrightME-300MA

40K支链PEG(马来酰亚胺)	Nektar	2D3XOTO1
			5K-NP线形(用于Lys连接)	NOF Corporation	SUNBrightMENP-50H
10K-NP线形(用于Lys连接)	NOF Corporation	SUNBrightMENP-10T
			20K-NP线形(用于Lys连接)	NOF Corporation	SUNBrightMENP-20T
TCR二聚体接头
			3.4K线形(马来酰亚胺)	Nektar	2D2DOFO2
5K分叉的(马来酰亚胺)	Nektar	2D2DOHOF
			10K线形(用正吡啶基ds-接头取代马来酰亚胺)	Sunbio
20K分叉的(马来酰亚胺)	Nektar	2D2DOPOF
			20K线形(马来酰亚胺)	NOF Corporation
40K分叉的(马来酰亚胺)	Nektar	2D3XOTOF
			高级别TCR多聚体
15K，3臂，Mal3(用于三聚体)	Nektar	OJOONO3
			20K，4臂，Mal4(用于四聚体)	Nektar	OJOOPO4
40K，8臂，Mal8(用于八聚体)	Nektar	OJOOTO8

可利用各种偶联化学(物质)将聚合物分子偶联于蛋白质和肽治疗剂。选择最合适的偶联化学(物质)在很大程度上取决于所需的偶联部位。例如，以下偶联化学(物质)已用于连接PEG分子(来源：Nektar分子工程目录2003(NektarMolecular Engineering Catalogue 2003))的一个或多个末端：

N-马来酰亚胺

乙烯基砜

苯并三唑碳酸酯

琥珀酰亚胺丙酸酯(Succinimidyl proprionate)

琥珀酰亚胺丁酸酯(Succinimidyl butanoate)

硫代酯

乙醛

丙烯酸酯

生物素

伯胺

如上所述，非PEG基聚合物也可为本发明TCR的多聚化提供合适的接头。例如，可以利用含有通过脂肪链相连的马来酰亚胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，产品号22330和22323)。

肽接头是另一类TCR接头。这些接头由氨基酸链组成，其作用为在可连接的TCR分子上产生简单接头或多聚化结构域。曾采用生物素/链霉亲和素系统来产生体外结合研究用的TCR四聚体(参见WO/99/60119)。然而，链霉亲和素是微生物来源的多肽，因此用于治疗剂中并不理想。

其中的TCR通过源自人多聚化结构域的肽接头连接的本发明TCR复合物提供了该方面的另一种实施方式。

有许多含多聚化结构域的人蛋白质可用于产生多价TCR复合物。例如，p53四聚化结构域，其已用于产生scFv抗体片段四聚体，该四聚体与单体scFV片段相比，显示血清持久性增加和解离速率明显降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白的四聚化结构域也可能用于该类应用。

含有至少两个TCR的本发明多价TCR复合物提供了该方面的最后一种实施方式，该复合物中所述TCR的至少一个与治疗剂结合。

在一方面，本发明TCR(或其多价复合物)或者还可或额外还可在其α或β链的C-末端或N-末端包含反应活性半胱氨酸。

诊断和治疗应用

一方面，本发明TCR可以与治疗剂或可检测部分结合。例如，所述治疗剂或可检测部分可与TCR共价相连。

在本发明的一个实施方式中，所述治疗剂或可检测部分与一条或两条TCR链的C-末端共价相连。

一方面，可利用可检测部分，例如适用于诊断目的的标记物来标记本发明TCR的scTCR或一条或两条dTCR链。这种标记的TCR可用于检测SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的方法，该方法包括使TCR配体与该TCR配体的特异性TCR(或多聚高亲和力TCR复合物)接触；和检测与该TCR配体的结合情况。在例如利用生物素化的异源二聚体形成的四聚体TCR复合物中，可利用荧光链霉亲和素来提供可检测标记。这种荧光标记的TCR四聚体适用于FACS分析，例如检测携带这些高亲和力TCR的特异性SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的抗原呈递细胞。

可检测本发明可溶性TCR的另一种方法是利用TCR特异性抗体，特别是单克隆抗体。有许多商业可购得的抗-TCR抗体，例如αF1和βF1可分别识别α和β链的恒定区。

在其它方面，本发明TCR(或其多价复合物)或者还可或额外还可与治疗剂结合(例如，以共价或其它方式相连)，所述治疗剂可以是，例如用于杀伤细胞的毒性部分，或免疫效应分子，如白介素或细胞因子。与非多聚野生型或本发明的T细胞受体异源二聚体相比，本发明的多价TCR复合物对TCR配体的结合能力提高。因此，本发明的多价TCR复合物特别可用于在体外或体内追踪或靶向呈递SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的细胞，也可用作中间体来产生具有这种用途的其它多价TCR复合物。因此，这些TCR或多价TCR复合物可以在体内应用的药学上可接受的制剂中提供。

本发明也提供将治疗剂递送至靶细胞的方法，该方法包括在允许潜在的靶细胞与本发明TCR或多价TCR复合物结合的条件下使二者接触，所述TCR或多价TCR复合物对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物具有特异性并结合有治疗剂。

具体地说，本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可用于将治疗剂递送至呈递具体抗原的细胞。这可用于许多情况，特别是针对HIV感染的细胞。治疗剂的递送应可在局部起作用而非只对与其结合的细胞起作用。因此，一种具体方案设想可采用与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物特异性的本发明TCR或多价TCR复合物相连的细胞毒性或免疫刺激分子。

为此应用，可利用许多治疗剂，例如放射性化合物，酶(例如，穿孔素)或化疗药物(例如，顺铂)。为保证在所需部位发挥毒性作用，可将毒素包裹在与链霉亲和素相连的脂质体内从而使该化合物缓慢释放。这防止了毒素在体内转运期间遭受破坏并且保证了TCR与相关的抗原呈递细胞结合后毒素具有最大作用。

其它合适的治疗剂包括：

·小分子细胞毒性药物，即分子量小于700道尔顿，能杀伤哺乳动物细胞的化合物。这种化合物也可包含具有细胞毒性作用的毒性金属。此外，应该理解这些小分子细胞毒性药物也包括药物前体，即能在生理条件下分解或转变从而释放细胞毒性药物的化合物。这种药物的例子包括顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、刺胞霉素、多西他赛、鬼臼亚乙苷、吉西他滨、异环磷酰胺、依利替康、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；

·肽细胞毒素，即能杀伤哺乳动物细胞的蛋白质或其片段。包括但不限于：蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；

·放射性核素，即一些元素的不稳定同位素，其在衰减同时发射一种或多种α或β粒子，或γ射线。包括但不限于：碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；也可利用螯合剂来促进这些放射性核素与高亲和力TCR或其多聚体结合；

·前药，包括但不限于：抗体定向的酶前药；

·免疫刺激剂，即能激活免疫应答的部分。包括但不限于：细胞因子，例如IL-2和IFN；超抗原和其变体；TCR-HLA融合物和趋化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段；补体激活剂；异种蛋白结构域；同种蛋白结构域；病毒/细菌蛋白结构域；病毒/细菌肽和抗T细胞决定簇抗体(例如，抗-CD3或抗-CD28)或抗体类似物，例如Nanobodies^TM和Affybodies^TM。

本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可与能将前药转化为药物的酶相连接。这就使前药仅在需要药物的位点得以转化为药物(即通过sTCR靶向)

期望本文所揭示的高亲和力SLYNTVATL(SEQ ID NO：16)-HLA-A*0201特异性TCR可用于诊断和治疗AIDS的方法中。

出于治疗目的，使治疗剂定位在HIV感染的(CD4⁺)细胞邻近处将增强毒剂或免疫刺激剂的效果。出于疫苗递送的目的，疫苗抗原可定位于抗原递呈细胞的附近，从而增强抗原的效力。该方法还可用于成像目的。

一个实施方式是包含本发明TCR的膜制剂。可用细胞制备所述膜制剂，或者所述膜制剂可包含合成的膜。

另一实施方式是具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞。例如，所述细胞可为T细胞。

本发明的其它实施方式是包含以下成分的药物组合物：

本发明的TCR或多价TCR复合物(任选地与治疗剂结合)，或包含本发明TCR的膜制剂，或多个具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞，同时还含有药学上可接受的载体。

本发明还提供了治疗AIDS的方法，所述方法包括：给予罹患AIDS的对象有效量的本发明的TCR或多价TCR复合物，或包含本发明TCR的膜制剂，或多个具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞。在相关的实施方式中，本发明提供了本发明TCR或多价TCR复合物、包含本发明TCR的膜制剂、或多个具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞在制备治疗AIDS的组合物中的用途。本发明的这些用途和方法的其它具体实施方式是将本发明的TCR或多价TCR复合物、或包含本发明TCR的膜制剂以与治疗剂结合的方式给药。在其它优选的实施方式中，所述具有包含本发明TCR编码核酸的表达载体的细胞是CD8⁺T细胞。

本发明的治疗性或成像TCR将通常作为一般包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分应用。该药物组合物可为任何适合的形式(取决于将其给予患者所需的方法)。可以单位剂型提供，(所述单位剂型)通常装在密封容器中提供，并可作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒通常(虽然并不是必须)装有使用说明书。其可装有多种所述的单位剂型。

不希望受限于理论，期望本发明的TCR可提供能递送治疗剂(例如免疫刺激剂和/或针对HIV感染的(CD4⁺)细胞的细胞毒剂)的有效靶向剂。具体而言，期望将本发明TCR与免疫刺激剂和/或细胞毒剂一起给药，并联用常规的抗逆转录病毒药物疗法和/或IL-2治疗将能靶向HIV感染细胞。

以下是在美国获准使用的抗逆转录病毒药物的列表：

Agenerase(安泼那韦)-蛋白酶抑制剂

可比韦-叠氮胸苷(300mg)与拉米夫定(150mg)并用

Crixivan(印地那韦(indinavir))-蛋白酶抑制剂

拉米夫定(3-硫胞苷/lamivudine)-腺苷类似物，逆转录酶抑制剂

Epzicom(联用两种核苷逆转录酶抑制剂(在同一药丸中的NRTI；600mg Ziagen(阿巴卡韦)和300mg拉米夫定(3TC))

Emtriva[恩曲他滨(FTC)]

沙奎那韦软凝胶剂(沙奎那韦)-蛋白酶抑制剂

Fuzeon(恩夫韦地(enfuvirtide))-融合抑制剂

唑西他宾(ddc/扎西他宾)-核苷类似物逆转录酶抑制剂

Invirase(沙奎那韦)-蛋白酶抑制剂

Kaletra(洛匹那韦)-蛋白酶抑制剂

Lexiva(福沙那韦)-蛋白酶抑制剂，批准于10/20/03

诺韦(利托那韦)-蛋白酶抑制剂

Rescriptor(地拉夫定)-非核苷类似物逆转录酶抑制剂

叠氮胸苷，AZT(齐多夫定)-核苷类似物逆转录酶抑制剂

Reyataz(阿扎奈韦(atazanavir)；BMS-232632)-蛋白酶抑制剂

Sustiva(依法韦仑)-非核苷类似物逆转录酶抑制剂

Trizivir (于同一片剂中的3种非核苷；阿巴卡韦+叠氮胸苷+叠氮胸苷

Truvada (恩曲他滨+替诺福韦DF)

惠妥滋(ddl/地达诺新)核苷类似物逆转录酶抑制剂

惠妥滋EC；(ddl/地达诺新)核苷类似物逆转录酶抑制剂；

奈非那韦(那非那韦)-蛋白酶抑制剂

Viramune(奈韦拉平)-非核苷类似物逆转录酶抑制剂

Viread(奈韦拉平；延胡索酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate))核苷酸逆转录酶抑制剂(阿糖腺苷类)

泽瑞特(d4t/司他夫定)-核苷类似物逆转录酶抑制剂

Ziagen(司他夫定)-核苷类似物逆转录酶抑制剂

所述药物组合物可适于用任何合适的途径给药，例如胃肠道外、透皮或通过吸入给药，优选经胃肠道外途径(包括皮下、肌内或最优选静脉内给药)。该组合物可用药剂领域中已知的任何方法制备，例如在无菌条件下混合活性成分与载体或赋形剂。

本发明物质的剂量可根据待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和状况等而有较大不同，医师最终可确定所使用的合适剂量。

其它方面

本发明的scTCR或dTCR(优选由对应于人序列的恒定区或可变区序列构成)可以以基本纯的形式、或作为纯化或分离的制剂提供。例如，可以基本上不含其它蛋白质的形式提供。

也可改变本发明TCR的一种或多种编码核酸的序列，从而使得在宿主细胞中获得的表达水平最优化。宿主细胞可为任何适宜的原核细胞或真核细胞。例如，所述宿主细胞可为大肠杆菌(E.coli)细胞或人T细胞。对这些遗传序列所作出的改变是沉默的，即它们不会改变所编码的氨基酸序列。有很多提供此类表达最优化服务的公司，包括德国的GeneArt。

本发明也提供与SLYNTVATL-HLA-A*0201具有结合特性的高亲和力TCR的制备方法。所述TCR的特征在于(i)含有至少一个TCR α链可变区和/或至少一个TCR β链可变区，和(ii)对所述SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的K_D小于或等于1μM和/或对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物的解离速率(k_off)为1×10^-3S^-1或更慢，该方法包括：

(a)制备含有亲本HIV Gag TCR的α和β链可变区的TCR，其中α和β链可变区的一个或两个在权利要求7和8所鉴定的一个或多个氨基酸中含有突变；

(b)在适合于TCR和SLYNTVATL-HLA-A*0201结合的条件下使所述突变的TCR与SLYNTVATL-HLA-A*0201接触；

和测定该相互作用的K_D和/或k_off。

本发明各方面的优选特征与已作了必要修正的其它各方面的一样。本文提及的现有技术文件按照法律所允许的最大程度纳入。

实施例

以下实施例进一步描述了本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。

下文参考了附图，其中：

图Ia和Ib分别详细描述了亲本HIV Gag TCR的α链可变区氨基酸序列和β链可变区氨基酸序列。

图2a和2b分别显示了可溶形式亲本HIV Gag TCR α链和β链的DNA序列。

图3a和3b分别显示了从图2a和2b的DNA序列产生的HIV Gag TCR α和β链胞外氨基酸序列。

图4a和4b分别显示了可溶形式HIV Gag TCRα和β链的DNA序列经突变而能编码额外的半胱氨酸残基从而形成非天然的二硫键。阴影表示突变的密码子。下划线表示限制性内切酶识别位点。

图5a和5b分别显示了从图4a和4b的DNA序列产生的HIV Gag TCR α和β链胞外氨基酸序列。阴影表示各链中引入的半胱氨酸。

图6详细描述了高亲和力HIV Gag TCR变体的α链可变区氨基酸序列。

图7详细描述了高亲和力HIV Gag TCR变体的β链可变区氨基酸序列。

图8a详细描述了TRA可溶部分的氨基酸序列。

图8b详细描述了TRBC1可溶部分的氨基酸序列。

图8c详细描述了TRBC2可溶部分的氨基酸序列。

图9详细描述了pEX954质粒的DNA序列。

图10详细描述了pEX821质粒的DNA序列。

图11详细描述了通过肽接头连接于野生型人IL-2的亲本可溶性HIV GagTCR变体的β链氨基酸序列。接头的氨基酸和IL-2用斜体表示。

图12提供了可溶性二硫键连接的亲本HIV Gag TCR与SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物相互作用的Biacore响应曲线。

图13提供了pEX954质粒的质粒作图。

图14提供了pEX821质粒的质粒作图。

图15a提供了为在人T细胞中表达而优化的亲本HIV Gag TCR α链的全长DNA序列。

图15b提供了为在人T细胞中表达而优化的亲本HIV Gag TCR 13链的全长DNA序列。

图16a提供了亲本HIV Gag TCR α链的全长氨基酸序列。

图16b提供了为在人T细胞中表达而优化的亲本HIV Gag TCRβ链的全长氨基酸序列。

图17a提供了未转导的对照CD8⁺T细胞的FACS分析数据。

图17b提供了说明亲本HIV Gag TCR表达在转导CD8⁺T细胞表面上的FACS分析数据。

图18a和18b分别提供了可溶性二硫键连接的高亲和力cllc6HIV Gag TCR的α和β链的氨基酸序列。

图19显示了在受HIV感染的To细胞存在下，通过IFN-γ和TNF-α的产量测定的可溶性二硫键连接的高亲和力c1 Ic6 HIV Gag TCR对SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性0X84单克隆T细胞株活化的抑制能力。

图20显示了在SLYNTVATL肽脉冲的未受HIV感染的To细胞存在下，通过IFN-γ和TNF-α的产量测定的可溶性二硫键连接的高亲和力c1 Ic6 HIV GagTCR对SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性0X84单克隆T细胞株活化的抑制能力。

图21显示了可溶性二硫键连接的高亲和力c1 Ic6 HIV Gag TCR染色SLYNTVATL肽脉冲的T2细胞的能力。

实施例1-包含亲本HIV Gag TCR可变区的可溶性二硫键连接的TCR的产生

图4a和4b提供了对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物具有特异性的亲本TCR的可溶性二硫键连接αβ链的DNA序列。可由多个承包研究公司(contractresearch company)从头合成这些DNA序列，例如GeneArt(德国)。可在这些DNA序列中加入限制性内切酶识别位点，从而使得这些DNA序列易于连接入基于pGMT7的表达质粒，该质粒含有用于在大肠杆菌BL21-DE3(pLysS)中高水平表达的T7启动子(Pan等，Biotechniques(2000)29(6)：1234-8)。

该TCR α链序列包含导入的ClaI和SalH限制性内切酶识别位点，并且该序列被连接入用ClaI和XhoI切割的pEX954(参见图9和13)。

该TCR β链序列包含导入的AseI和AgeI限制性内切酶识别位点，并且该序列被连接入用NdeI/AgeI切割的pEX821(参见图l0和14)。

导入编码TCR链的DNA的限制性内切酶识别位点

ClaI-ATCGAT

SalH-GTCGAC

AseI-ATTAAT

AgeI-ACCGGT

连接

采用快速DNA连接试剂盒(rapid DNA ligation kit，Roche)，根据厂商说明书连接切割的TCR α、β链DNA和切割的载体。

将连接的质粒转化入感受态的大肠杆菌菌株XL1-蓝细胞，并将其接种于含有100mg/ml氨苄西林的LB/琼脂平板上。于37℃孵育过夜后，挑选单菌落，使其在10ml含有100mg/ml氨苄西林的LB中于37℃摇动生长过夜。采用Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化克隆的质粒，并采用自动化DNA测序仪(LarkTechnologies)对插入片段进行测序。

图5a和5b分别显示了可溶性二硫键连接的亲本HIV gag TCR α和β链胞外氨基酸序列，该氨基酸序列是由图4a和4b的DNA序列产生的。

实施例2-可溶性二硫键连接的HIV Gag TCR高亲和力变体的产生

可将如实施例1所述产生的可溶性二硫键连接的天然HIV Gag TCR用作模板，由该模板可产生对SLYNTVATL(SEQ ID NO：16)-HLA-A*0201复合物的亲和力提高的本发明TCR。

噬菌体展示是可为鉴别高亲和力变体而制备HIV Gag TCR变体库的一种方法。例如，可对Li等(2005)Nature Biotech 23(3)：349-354)描述的TCR噬菌体展示和筛选方法进行调整并将其用于HIV Gag TCR。

图6和7分别列出了与适当的TCR链结合时对SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物显示出高亲和力的突变TCR α和β链氨基序列(分别为SEQ ID No：11-13和14-15)。本领域技术人员已知可通过定点突变将产生这些突变链所需的必需密码子变化导入编码这些链的DNA中(QuickChange^TM，Stratagene的定点突变试剂盒)。

简而言之，通过使用掺入所需的一个或多个密码子变化的引物以及作为诱变模板的含相关TCR链DNA的质粒来实现：

采用以下条件进行诱变：50ng质粒模板、1μl的10mM dNTP、由厂商提供的5μl的10×Pfu DNA聚合酶缓冲液、25pmol的正向引物、25pmol的反向引物、1μl的pfu DNA聚合酶，总体积为50μl。在95℃进行2分钟的初始变性之后，进行25个循环的如下反应：变性(95℃，10秒)、退火(55℃，10秒)和延伸(72℃，8分钟)。用DpnI限制性内切酶消化所得产物以去除模板质粒，并转化入大肠杆菌菌株XL1-蓝。通过测序验证诱变。

实施例3-可溶性TCR的表达、重折叠和纯化

将实施例1或2中制备的分别含有突变α链和β链的表达质粒分别转化入大肠杆菌菌株BL21pLysS，并于37℃下在TYP培养基(含100μg/ml氨苄西林)中培养具有氨苄西林抗性的单菌落直至OD₆₀₀为0.4，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导后3小时用Beckman J-6B以4000rpm离心30分钟收集细胞。将细胞沉淀物重悬在含有50mM Tris-HCI、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、10mM DTT pH 8.0的缓冲液中。在过夜的冻融步骤之后，在Milsonix XL2020超声波仪中用标准的12mm直径探头对重悬的细胞进行1分钟的超声破碎，总共超声约10分钟。用Beckman J2-21离心机以13000rpm离心30分钟回收包涵体沉淀物。然后用去污剂洗涤三次以去除细胞碎片和膜组分。每次将包涵体沉淀物在Triton缓冲液中均浆(50mM Tris-HCl、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0)，然后用Beckman J2-21离心机以13000rpm离心15分钟使其沉淀。然后在如下缓冲液中进行类似洗涤去除去污剂和盐：50mM Tris-HCl、1mMNaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0。最后，将包涵体分成30mg的等分，并于-70℃冷冻。用6M盐酸胍溶解并通过Bradford染料结合测试(PerBio)定量测定包涵体蛋白产率。

融化冷冻储备物中溶有约30mg的TCR β链和60mg的TCR α链的包涵体，然后混合样品，用15m胍溶液(6M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA)稀释该混合物以确保链完全变性。然后将含有完全还原并变性的TCR链的胍溶液注入到l升如下的重折叠缓冲液中：100mM Tris pH 8.5、400mM L-精氨酸、2mMEDTA、5mM还原性谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、5M尿素、0.2mM PMSF。加入氧化还原对(2-巯乙胺和六甲烯胺(其终浓度分别为6.6mM和3.7mM)，约5分钟后加入变性的TCR链。将溶液静置5小时±15分钟。5℃±3℃，在Spectrapor1膜(Spectrum；产品编号：132670)中用10L 10mM Tris pH 8.1透析重折叠的TCR 18-20个小时。然后将透析缓冲液换为新鲜的10mM Tris pH 8.1(10L)，继续在5℃±3℃下再透析20-22小时。

从降解产物中分离sTCR，将透析的重折叠蛋白加载到POROS 50HQ阴离子交换柱上，然后采用Akta纯化仪(Pharmacia)以50倍以上柱体积的0-500mMNaCl梯度溶液洗脱结合的蛋白质来纯化。将峰部分储存于4℃，采用考马斯染色的SDS-PAGE进行分析，然后合并和浓缩。最后，采用在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％乙基苯基聚乙二醇p40(nonidet p40))预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱纯化和表征sTCR。收集并浓缩在相对分子量约为50kDa洗脱的峰，然后用BIAcore表面等离子共振分析法表征。

实施例4-Biacore表面等离子共振表征结合于特异性pMHC的sTCR

采用表面等离子共振生物传感器(Biacore 3000^TM)来分析sTCR与其肽-MHC配体的结合。产生以半定向形式固定于抗生物素蛋白链菌素包被的结合表面的一种pMHC复合物(如下所述)有助于该分析并可同时有效测试可溶性T-细胞受体与多达4种不同pMHC(固定于不同流动小室)的结合。手工注射HLA复合物易于操控固定的I类分子的精确水平。

体外重新折叠含有组成性亚单位蛋白和合成肽的细菌表达的内涵体的生物素化I类HLA-A*0201分子，然后纯化并在体外进行酶生物素化(O’Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266：9-15)。所表达的HLA-A*0201-重链具有C末端生物素化标签，其在适合的构建物中替代了该蛋白质的跨膜区和胞质结构域。获得的内涵体表达水平约75mg/升细菌培养物。还从适合的构建体在大肠杆菌中表达了MHC轻链或β2-微球蛋白，其水平约为500mg/升细菌培养物。

裂解大肠杆菌细胞，将内涵体纯化到约80％的纯度。在6M盐酸胍、50mMTris pH 8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA中使内涵体的蛋白质变性，通过在低于5℃将变性蛋白一次脉冲加入重折叠缓冲液，以30mg/升重链、30mg/升β2m的浓度在0.4M L-精氨酸-HCl、100mM Tris pH 8.1、3.7mM六甲烯胺、6.6mM β-巯乙胺，负载于HLA-A*0201分子所需的4mg/mlSLYNTVATL肽中重折叠。重折叠在4℃时进行至少1小时方能完成。

用10倍体积的10mM Tris pH 8.1进行透析来更换缓冲液。需更换缓冲液2次以充分降低溶液的离子强度。然后用1.5μm的醋酸纤维素滤膜过滤蛋白质溶液，并加载到POROS 50HQ阴离子交换柱上(8ml的床体积)。用线性0-500mMNaCl梯度洗脱蛋白质。以约250mM NaCl洗脱HLA-A*0201-肽复合物，收集峰组分，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)，然后在冰上冷藏该部分。

采用以10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl平衡的Pharmacia快速脱盐柱，将生物素化标记的pMHC分子的缓冲液更换为10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl。洗脱后立即将含蛋白质的组分置于冰上冷藏，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)。然后加入生物素试剂：1mM生物素、5mM ATP(缓冲至pH 8)、7.5mM MgCl₂和5μg/ml BirA酶(根据O’Callaghan 等(1999)Ahal.Biochem.266：9-15进行纯化)。然后将该混合物在室温下孵育过夜。

采用凝胶过滤层析来纯化生物素化的pHLA-A*0201分子。用经过滤的PBS预平衡Pharmacia Superdex 75HR 10/30柱，然后加载1ml生物素化反应混合物，用PBS以0.5ml/分钟洗脱柱。生物素化的pHLA-A*0201分子在约15ml时以单峰洗脱。合并含蛋白质的组分，在冰上冷藏，然后加入蛋白酶抑制剂混合物。采用考马斯结合分析法(PerBio)测定蛋白质浓度，将生物素化pHLA-A*0201分子的等份试样冷冻于-20℃。采用标准胺偶联法固定抗生物素蛋白链菌素。

该固定化的复合物与T-细胞受体和共同受体CD8αα均能结合，这些受体都可注入可溶相。即便是在低浓度下(至少40μg/ml)也获得了TCR的特异性结合，这就暗示了TCR相对稳定。如果采用溶解的或固定相的sTCR，所观察到的sTCR的pMHC结合特性在质量和数量上类似。这是可溶性物质的部分活性的一种重要控制方法，也提示生物素化的pMHC复合物与非生物素化复合物具有相同的生物学活性。

在Biacore 3000^TM表面等离子共振(SPR)生物传感器上分析含新的链间键的HIV Gag sTCR与其配体/MHC复合物或无关HLA-肽组合物之间的相互作用(其产生如上所述)。在一流动小室中，SPR检测到传感器表面附近以响应单元(RU)表示的折光率发生变化，该原理可用于检测受体配体相互作用和分析它们的亲和力以及动力学参数。所述探针流动小室如下制备：通过交联到β2m上的生物素与已化学交联到流动小室的活性表面上的抗生物素蛋白链菌素之间的结合，将各HLA-肽复合物固定在不同的流动小室中。然后使sTCR以恒定的流速通过不同流动小室的表面，并测定该情况下的SPR响应以进行测试。

平衡结合常数的测定

制备了亲本或突变HIV Gag sTCR的连续稀释液，以5μl/分钟的恒定流速注入两个不同的流动小室；一个流动小室用约1000RU的特异性SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物包被，另一个用约1000RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。采用对照小室的测定值对各浓度的响应进行标准化。以标准化数据响应对TCR样品的浓度作图，拟合成双曲线(hyperbola)以计算平衡结合常数，K_D。(Price&Dwek，Principles and Problems in Physical Chemistryfor Biochemists(2^nd Edition)，《生物化学的物理化学中的原理和问题》第二版，1979，Clarendon Press，牛津)。

动力学参数的测定

通过试验测定解离速率常数Kd和结合速率常数Ka来确定高亲和力TCR的K_D。平衡常数K_D计算为kd/ka。

将TCR注射流过两个不同小室，一个用约300RU的特异性HLA-A2-nyeso肽复合物包被，另一个用约300RU的非特异性HLA-A2-肽复合物包被。流速设置为50μl/分钟。通常以约3μM的浓度注入250μl的TCR。然后使缓冲液流过直到响应回复到基线。采用Biaevaluation软件计算动力学参数。也将解离相拟合为单指数衰变方程式以计算半衰期。

结果

采用上述方法分析可溶性二硫键连接的天然HIV Gag TCR(由SEQ IDNO：9和10分别详述的α和βTCR链组成)和SLYNTVATL-HLA-A*0201复合物之间的相互作用，显示K_D为85nM，解离速率(k_off)为2.21×10^-2S^-1。(Biacore响应曲线可参见图12)

下表所述TCR具有的K_D小于或等于1μM和/或k_off为1×10^-3S^-1或更慢。

α链可变区序列，SEQ ID NO：	β链可变区序列，SEQ ID NO：
		1	2
1	14
		1	15
11	2
		12	2
13	2
		12	15
13	15
		12	14
13	14

实施例5-可溶性高亲和力HIV Gag TCR-野生型人IL-2融合蛋白的产生

可利用大致上如实施例1-3中所述方法产生可溶性高亲和力HIV GagTCR-野生型(WT)人IL-2融合蛋白。简言之，将编码所需接头和WT人IL-2的DNA加到可溶性二硫键连接的亲本HIV Gag TCRβ链3′端，即直接在TAA(“终止”)密码子的前部。图11提供了融合蛋白的氨基酸序列，该融合蛋白包含通过接头序列融合到WT人IL-2的二硫键连接的亲本HIV Gag TCR β链(SEQ IDNO：24)。该融合蛋白的接头和IL-2部分用斜体表示。然后可将编码该构建物的DNA连接入pEX821。然后可采用基本上如实施例3所述的方法，使该β链融合蛋白与图5a详述的可溶性二硫键连接的亲本HIV Gag α链TCR链相结合，从而表达可溶性亲本HIV Gag TCR-IL-2融合蛋白。

实施例6-亲本HIV Gag TCR在T细胞表面上的重组表达

合成了编码亲本HIV Gag TCR链的信号序列、胞外区、跨膜区和胞内区的DNA构建物(GeneArt，德国)。这些TCR α链和TCR β链DNA序列(分别示于图15a和15b)与亲本HIV Gag TCR DNA序列不同，从而增强了所编码的TCR链在人T细胞中的表达水平，并同时保留了天然氨基酸序列。图16a和16b提供了分别由图15a和15b所示DNA序列编码的全长氨基酸序列。

然后将TCR α链和TCR β链DNA序列一起插入慢病毒(Lentiviral)表达载体。该载体包含：作为单个开放读框的编码亲本HIV Gag TCR α链和β链和隔开TCR链的框内口蹄疫病毒(FMDV)2A分裂因子(cleaviage factor)氨基酸序列(LLNFDLLKLAGDVESNPG(SEQ ID NO：31))的DNA序列。(de Felipe等，GenetVaccines Ther(2004)2(1)：13)。在mRNA翻译时，产生了在C末端具有2A肽序列的TCR α链，而TCR β链则作为单独的多肽产生。

用上述慢病毒载体转导T细胞。简言之，用抗CD3/抗CD28珠刺激原始(primary)T细胞24小时。然后将表达TCR基因的慢病毒浓缩上清液与经刺激的T细胞一起孵育以进行病毒转导。然后去除抗CD3/抗CD28珠，培养转导的T细胞直到它们达到200-300fL的“静体积”(resting volumn)。

利用HLA-A*0201-SLYNTVALT PE三聚体和抗CD8单克隆抗体FITC共染色，通过FACS分析证实亲本HIV Gag TCR递呈到转导细胞表面上。

结果

图17b提供了FACS分析数据，该数据显示亲本HIV Gag TCR成功地表达在转导的CD8⁺T细胞表面。图17a提供了利用对照的未转导T细胞产生的FACS分析数据。

实施例7-可溶性高亲和力HIV Gag TCR对CTL活化的抑制

进行了以下测试以证实可溶性高亲和力c11c6 HIV Gag TCR能抑制SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性单克隆T细胞株的活化。

HIV感染细胞存在下OX84 SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性单克隆T细胞株活化的抑制作用

本试验中采用的可溶性c11c6高亲和力HIV Gag TCR包含分别如图6c(SEQ ID NO：13)和图7b(SEQ ID NO：15)所示的TCR α链可变区和TCR β链可变区。该可溶性TCR的TCR α和β链全长序列分别示于图18a(SEQ ID NO：29)和图18b(SEQ ID NO：30)中。

将IFN-γ和TNF-α的产生用作CTL活化的显示。

试剂

R1O分析培养基：10％FCS(经热灭活，Gibco，目录号10108-165)、88％RPMI 1640(Gibco，目录号42401-018)、1％谷胺酰胺(Gibco，目录号25030-024)和1％青霉素/链霉素(Gibco，目录号15070-063)。

肽：(获自各种来源)最初溶于DMSO(Sigma，目录号D2650)，浓度为4mg/ml，冻存。

BD^TM细胞计数珠芯片试剂盒(BD^TM Cytometric Bead Array Kit)，人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(Human Th1/Th2 cytokine Kit II，BD Biosciences，圣迭戈，美国)包含了该测试所需的所有试剂。

T细胞活化测试

洗涤慢性HIV感染的To靶细胞(HXB2和HIV3B HIV试验株)，并重悬于R1O培养基中。作为对照，加入未感染的To靶细胞和1nM的SLYNTVATL肽，于37℃、5％CO₂中(培育)30分钟。

试样：

96孔U型底培养板中每孔含有R1O培养基配制的25,000个HIV感染的To靶细胞。

每孔中含有R1O培养基配制的2×10^-7M高亲和力c11c6 HIV Gag TCR或亲本HIV Gag TCR。

每孔中含有R1O培养基配制的5000 OX84单克隆效应T细胞株。

对照：

上述替代的无关可溶性TCR(HLA-A*0201-Tax特异性和HLA-A*0201-NY-ESO特异性TCR)或高亲和力HIV Gag TCR。

然后将板在37℃、5％CO₂中孵育4小时。去除培养上清液，采用如下方法测定IFN-γ和TNF-α存在的水平。

IFN-γ和TNF-α测试

根据厂商说明书制备(a)IFNγ捕获抗体和(b)抗TNFα捕获抗体包被的BD^TM细胞计数珠。

然后制备含有以下添加物的多个分析管：

50μlBD测试稀释液配制的混合抗IFNγ和抗TNFαBD^TM细胞计数珠50μlPE检测试剂

方法如下：

从T细胞活化测试孔中取出50μl培养上清液(试样)

或

通过连续稀释储备标准液制备各浓度范围的50μl混合IFNγ和TNFα标准液(定标标准物)

然后避光孵育试管3小时，再用1ml BD洗涤缓冲液洗涤，离心。最后，将这些珠重悬于300μl洗涤缓冲液中，通过流式细胞术根据厂商的说明书测定IFNγ和TNFα存在的水平。

以SLYNTVATL肽脉冲的未感染To细胞存在下，SLYNTVATL-HLA-A*0201特异性OX84多克隆T细胞系的抑制

采用上述CTL活化测试所用的相同试剂和方法，除了：

在各T细胞活化测试中使用2000OX84多克隆效应T细胞。

用10^-10-10^-8M SLYNTVATL肽脉冲的未感染To类淋巴母细胞用作靶T细胞。

结果

通过IFN-γ和TNF-α产量测得，在HIV感染的To细胞存在下，可溶性高亲和力c11c6 HIV Gag TCR强烈抑制了SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性OX84多克隆T细胞株活化(参见图19)。

通过IFN-γ和TNF-α产量测得，在SLYNTVATL脉冲的未感染To细胞存在下，可溶性高亲和力c11c6HIV Gag TCR强烈抑制了SLYNTVATL-HLA-A*0201反应性OX84多克隆T细胞株的活化(参见图20)。

实施例8-通过荧光显微镜用高亲和力c11c6 HIV Gag TCR定量测定肽脉冲的T2细胞上的细胞表面SLYNTVATL-HLA-A*0201抗原

通过单分子荧光显微镜用可溶性高亲和力c11c6 HIV Gag TCR测定肽脉冲的T2类淋巴母细胞上SLYNTVATL-HLA-A*0201抗原的数量(基于假设：一个荧光信号与一个标记TCR结合其位于靶细胞表面的同源pMHC配体有关)。采用生物素化TCR靶向表达抗原的癌细胞，然后用抗生物素蛋白链菌素R-藻红蛋白(PE)偶联物来标记与细胞结合的TCR有助于该项测定。然后用三维荧光显微镜使单个PE分子成像。

37℃用一定浓度范围(10^-5-10^-10M)的HIV Gag-衍生的SLYNTVATL肽或无关肽(SLLMWITQC)脉冲T2类淋巴母细胞90分钟。脉冲后，用500μl PBS洗涤细胞2次。室温下，将细胞孵育于200μl的TCR溶液中(100nM高亲和力c11c6HIV Gag TCR，用含0.5％BSA白蛋白的PBS配制)30分钟。去除TCR溶液，用500μl PBS洗涤细胞3次。室温下，在200μl抗生物素蛋白链菌素-PE溶液中(5μg ml^-1含0.5％BSA的PBS配制的抗生物素蛋白链菌素-PE中)避光孵育细胞20分钟。去除抗生物素蛋白链菌素-PE溶液，用500μl PBS洗涤细胞3次。去除洗涤介质，将细胞保存在400μl R1O中，在用荧光显微镜成像前不加入酚红。

荧光显微法

采用Axiovert 200M(Zeiss)显微镜以63×油镜(Zeiss)进行荧光显微法。用将装有300W氙弧灯(Sutter)的λLS光源照明，通过在光路中放入0.3和0.6中密度滤片将光强减低到优化水平。采用TRITC/DiI滤波器组(Chroma)来分离激发和发射光谱。通过z-叠层(z-stack)采集(21个平面，1μm间隔)使细胞三维成像。采用如(Irvine等，Nature 419：p845-9和Purbhoo等，Nature Immunology 5：p524-30)所述的Metamorph软件(Universal Imaging)进行图像采集和分析。

结果

如图21所示，上述方法成功地使与肽脉冲的T2细胞表面上的SLYNTVATL-HLA-A*0201抗原结合的高亲和力c11c6 HIV Gag TCR成像。这些结果显示采用高亲和力c6c11 HIV Gag TCR对SLYNTVATL肽脉冲的细胞上表位进行计数的阈值约为10^-9M肽。

Claims (55)

1.一种T细胞受体(TCR)，其对于SLYNTVATL-HLA-A^*0201具有结合特性，且包含至少一个TCRα链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区，其特征在于，所述TCR对所述SLYNTVATL-HLA-A^*0201复合物的K_D小于或等于1μM和/或对SLYNTVATL-HLA-A^*0201复合物的解离速率(k_off)为1×10^-3S^-1或更慢，前提是当所述TCR由细胞递呈并包含SEQ ID NO：1和2时，该细胞不是天然T细胞。

2.如权利要求1所述的TCR，其包含α链可变区和TCRβ链可变区。

3.如权利要求1所述的TCR，其为αα或ββ同二聚体。

4.如前述任一权利要求所述的T细胞受体(TCR)，其特征在于，所述K_D和/或k_off用表面等离子共振法测定。

5.如前述任一权利要求所述的TCR，其相对于亲本HIV Gag TCRα链可变区(SEQ ID No：1)和/或β链可变区(SEQ ID NO：2)在至少一个互补决定区中存在突变。

6.如前述任一权利要求所述的TCR，其相对于亲本HIV Gag TCRα链可变区(SEQ ID No：1)和/或β链可变区(SEQ ID NO：2)在其至少一个可变区框架区中存在突变。

7.如前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，采用SEQ ID NO：1所示编号，α链可变区氨基酸95T₅、96N、97S、98G和100A中的一个或多个发生突变。

8.如前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，采用SEQ ID NO：2所示编号，β链可变区氨基酸51Y、52E、53E和54E中的一个或多个发生突变。

9.如权利要求1-6中任一项所述的TCR，采用SEQ ID NO：1所示编号，其包含α链可变区氨基酸95S、95G、96A、97H、98D或100S中的一个或多个。

10.如权利要求1-6或9中任一项所述的TCR，采用SEQ ID NO：2所示编号，其包含β链可变区氨基酸51V、51A、52R、52L、53G或54V中的一个或多个。

11.如权利要求1-6中任一项所述的TCR，其包含SEQ ID NO：11-13所示α链可变区氨基酸序列之一，任选包含一个或多个表型沉默取代。

12.如权利要求1-6或11中任一项所述的TCR，其包含SEQ ID NO：14-15所示β链可变区氨基酸序列之一，任选包含一个或多个表型沉默取代。

13.如权利要求2所述的TCR，其包含下表所示的α和β链可变区对，任选地包含一个或多个表型沉默取代：

  α链可变区序列，SEQ ID NO：   β链可变区序列，SEQ ID NO：   1   2   1   14   1   15   11   2   12   2   13   2   12   15   13   15   12   14   13   14

                                                                          。

14.如前述任一权利要求所述的TCR，其还包括SEQ ID NO：19所示的α链恒定区氨基酸序列和/或SEQ ID NO：20和21所示的β链氨基酸恒定区序列之一，任选地包含一个或多个表型沉默取代。

15.如前述任一权利要求所述的TCR，其为二聚T细胞受体(dTCR)或单链T细胞受体(scTCR)。

16.如权利要求4-15中任一项所述的TCR，其为包含如下区段的scTCR：

第一区段，其由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成；

第二区段，其由对应于TCRβ链可变区序列并融合于对应于TCRβ链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端的氨基酸序列构成；和

接头序列，该序列连接第一区段的C末端和第二区段的N末端。

17.如权利要求4-15中任一项所述的TCR，其为包含如下区段的scTCR：

第一区段，其由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成；

第二区段，其由对应于TCRα链可变区序列并融合于对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列N末端的氨基酸序列构成；和

接头序列，该序列连接第一区段的C末端和第二区段的N末端。

18.如权利要求16或17所述的TCR，其还包含位于第一和第二链之间的二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物，且其中所述接头序列的长度和所述二硫键的位置使得第一和第二区段的可变区序列相互取向基本上与天然αβT细胞受体相同。

19.如权利要求16-18中任一项所述的scTCR，其特征在于，在结合部分中，所示接头序列连接第一区段的C末端和第二区段的N末端。

20.如权利要求16-19中任一项所述的scTCR，其特征在于，在结合部分中，所述接头序列具有结构式-PGGG-(SGGGG)₅-P-(SEQ ID NO：17)或-PGGG-(SGGGG)₆-P-(SEQ ID NO：18)，其中P为脯氨酸，G为甘氨酸，S为丝氨酸。

21.如权利要求1、2或4-15中任一项所述的TCR，其是包含如下区段的dTCR：

第一多肽，其中对应于TCRα链可变区序列的序列融合于对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端；和

第二多肽，其中对应于TCRβ链可变区序列的序列融合于对应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列的N末端，

所述第一和第二多肽通过二硫键连接，该二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物。

22.如权利要求21所述的TCR，其特征在于，所述二硫键连接所述恒定区序列的氨基酸残基，该二硫键在天然TCR中没有等价物。

23.如权利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫键位于半胱氨酸残基之间，所述半胱氨酸对应于天然TCR中β碳原子距离小于0.6nm的氨基酸残基。

24.如权利要求22所述的TCR，其特征在于，所述二硫键位于半胱氨酸残基之间，所述半胱氨酸残基取代TRAC^*01外显子1的Thr 48和TRBC1^*01或TRBC2^*01或其非人等价物的外显子1的Ser 57。

25.如权利要求15-24中任一项所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR结合部分包括二硫键，所述二硫键位于对应于在天然TCR中由二硫键连接的那些残基的残基之间。

26.如权利要求14-23中任一项所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR结合部分不含对应于天然TCR跨膜或胞质序列的序列。

27.如前述任一权利要求所述的TCR，其特征在于，所述TCR与至少一条聚亚烷基二醇链相连。

28.如权利要求27所述的TCR，其特征在于，所述一条或多条聚亚烷基二醇链与TCR共价连接。

29.如权利要求27或28所述的TCR，其特征在于，所述一条或多条聚亚烷基二醇链包含至少两个聚乙二醇重复单元。

30.如前述任一权利要求所述的TCR，其还包括位于其α或β链C末端或N末端的反应活性半胱氨酸。

31.如前述任一权利要求所述的TCR，其与治疗剂或可检测部分连接。

32.如权利要求31所述的TCR，其特征在于，所述TCR与所述治疗剂或可检测部分共价连接。

33.如权利要求31所述的TCR，其特征在于，所述治疗剂或可检测部分与一条或两条TCR链的C末端共价连接。

34.如权利要求31-33中任一项所述的TCR，其与治疗剂连接，所述治疗剂为免疫效应分子。

35.如权利要求34所述的TCR，其特征在于，所述免疫效应分子是细胞因子。

36.如权利要求34所述的TCR，其特征在于，所述免疫效应分子是IL-2或其功能性变体或片段。

37.如权利要求31-33中任一项所述的TCR，其特征在于，所述治疗剂是细胞毒剂。

38.如权利要求31-33中任一项所述的TCR，其特征在于，所述治疗剂是放射性核素。

39.一种多价TCR复合物，其包含前述任一权利要求中所述的至少两个TCR。

40.一种多价TCR复合物，其包含通过非肽聚合物链或肽接头序列连接的前述任一权利要求中所述的至少两个TCR。

41.如权利要求40所述的TCR复合物，其特征在于，所述聚合物链或肽接头序列在各TCR的氨基酸残基之间延伸，所述氨基酸残基不位于TCR可变区序列中。

42.如权利要求40或41所述的TCR复合物，其特征在于，所述TCR通过聚亚烷基二醇链或衍生自人多聚化结构域的肽接头连接。

43.如权利要求42所述的TCR复合物，其特征在于，二价亚烷基间隔基团位于所述聚亚烷基二醇链和其与所述复合物的TCR的连接点之间。

44.如权利要求40或41所述的TCR复合物，其特征在于，所述聚亚烷基二醇链包括至少两个聚乙二醇重复单元。

45.一种多价TCR复合物，其包含如权利要求1-30中任一项所述的TCR中的至少两个TCR，其中(i)所述TCR中的至少一个与权利要求31-38中任一项所述的治疗剂连接。

46.一种膜制剂，其包含权利要求1-26中任一项所述的TCR。

47.一种包含表达载体的细胞，该表达载体包含权利要求1-26中任一项所述的TCR的编码核酸。

48.一种药物组合物，其包含权利要求1-45中任一项所述的TCR或多价TCR复合物、或权利要求46所述的膜制剂、或多个权利要求47中所述的细胞，以及药学上可接受的载体。

49.一种治疗AIDS的方法，所述方法包括给予罹患AIDS的对象有效量的权利要求1-45中任一项所述的TCR或多价TCR复合物、或权利要求46所述的膜制剂、或多个递呈权利要求1-30中任一项所述的TCR中的多个TCR的T细胞。

50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，以与治疗剂结合的形式给予TCR或多价TCR复合物、或包含TCR的膜制剂。

51.如权利要求49所述的方法，其特征在于，给予多个递呈多个TCR的T细胞，且所述T细胞是CD8⁺T细胞。

52.权利要求1-45中任一项所述的TCR或多价TCR复合物、或权利要求46所述的膜制剂、或多个权利要求47中所述的细胞在制备治疗AIDS的组合物中的用途。

53.如权利要求52所述的用途，其特征在于，以与治疗剂结合的方式给予TCR或多价TCR复合物、或含有TCR的膜制剂。

54.如权利要求52所述的用途，其特征在于，给予多个递呈多个TCR的T细胞，且所述T细胞是CD8⁺T细胞。

55.一种产生对SLYNTVATL-HLA-A^*0201具有结合特性的高亲和力TCR的方法，其特征在于，所述TCR(i)包含至少一个TCRα链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区，和(ii)其对所述SLYNTVATL-HLA-A^*0201复合物的K_D小于1μM和/或对所述SLYNTVATL-HLA-A^*0201复合物的解离速率(k_off)小于1×10^-3，所述方法包括：

(a)产生包含HIV Gag TCR的α和β链可变区的TCR，其中α和β链可变区中的一条或两条在权利要求7和8中所限定的一个或多个氨基酸中含有突变；

(b)在适于使所述突变的TCR与SLYNTVATL-HLA-A^*0201结合的条件下，使所述TCR与SLYNTVATL-HLA-A^*0201接触；和

测定该相互作用的K_D和/或k_off。

Images