CN101389652B - 特异性结合vygfvracl-hla-a24的t细胞受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供具有特异性结合VYGFVRACL-HLA-A24肽-MHC特性的T细胞受体(TCR)。这种TCR可单用或与治疗剂联用来靶向呈递该复合物的癌细胞。

Description

特异性结合VYGFVRACL-HLA-A24的T细胞受体
本发明涉及具有特异性结合VYGFVRACL-HLA-A24特性的分离的T细胞受体(TCR)。 
发明背景 
VYGFVRACL肽衍生自端粒酶蛋白的催化亚单位。(参见Meyerson等，(1997)Cell 90：785-795和Nakamura等，(1997)Science 277：955-9)。这些研究描述了从数据库序列中几乎同时发现了端粒酶催化亚单位的DNA和推导的氨基酸序列。两项研究均注意到端粒酶催化亚单位活性与人癌症有关。这些癌细胞的I类HLA分子呈递该蛋白质的肽中包括VYGFVRACL。该肽由HLA-A24呈递(Arai等，(2001)Blood97(9)：2903-2907，和Tajima等，Int.J.Cancer(2004)110：403-412)。因此，VYGFVRACL-HLA-A24复合物提供了本发明TCR可靶向的一种癌症标记，例如将细胞毒性药物递送至癌细胞。 
发明简述 
本发明首次利用了具有特异性结合VYGFVRACL-HLA-A24特性的分离的T维胞受体(TCR)。这种TCR可单用或与治疗剂联用来靶向呈递该复合物的癌细胞。 
发明详述 
本发明提供具有特异性结合VYGFVRACL-HLA-A24特性的分离的TCR。VYGFVRACL(SEQ ID NO：1)肽优选由HLA-A*2402呈递。 
具有特异性结合VYGFVRACL-HLA-A24特性的TCR在本文称为VYG-A24TCR。“亲本”VYG-A24 TCR定义为含有如图1a所示α链可变区(SEQ ID NO：2)和如图1b所示β链可变区(SEQ ID NO：3)的那些TCR。例如，二硫键连接的可溶性形式的亲本VYG-A24 TCR由如图5a所示TCR α链(SEQ ID NO：15)和如图5b所示TCRβ链(SEQ ID NO：16)构成。 
本发明的一个实施方式提供了具有特异性结合VYGFVRACL-HLA-A24特性的非天然TCR。即，本发明的这种TCR由自然界中未发现的序列构成。 
另一实施方式提供的本发明TCR的特征在于所述TCR对所述VYGFVRACL-HLA-A*02402复合物的KD为5μM或更低。本文的实施例4提供了适用于测定可溶性TCR与pMHC分子之间相互作用的KD的Biacore方法的细节。 
另一方面提供了本发明的分离TCR，其含有如图10b(SEQ ID NO 20)和/或图3b(SEQ ID No：12)所示的互补决定区(CDR)。在相应的附图中这些TCR链的CDR以下划线标出。 
VYGFVRACL-HLA-A24复合物的特异性亲本VYG-A24 TCR使用以下Vα链和Vβ链： 
α链：TRAV22 
β链：TRBV 6.5 
VYG-A24 TCR可用作制备本发明其它TCR的模板。因此，与亲本VYG-A24TCR α链可变区(参见图1a和SEQ ID No：2)和/或β链可变区(参见图1b和SEQ IINO：3)相比，本发明的一个实施方式包括在至少一个互补决定区(CDR)和/或其可变区框架区中含有突变的TCR。在一相关的实施方式中，本发明也包括相对于VYG-A24 TCR α链可变区(参见图10a和SEQ ID No：19)和在至少一个互补决定区(CDR)和/或其可变区框架区中含有突变的TCR。 
也考虑可突变本发明TCR可变区中的其它超变区，例如超变4(HV4)区，从而产生能保留了特异性结合VYGFVRACL-HLA-A24特性的高亲和力突变型TCR。 
噬菌体展示提供了一种制备TCR变体文库的方法。(Li等，(2005)NatureBiotech 23(3)：349-354)和WO 2004/04404详述了适用于噬菌体展示和随后筛选各含有非天然链间二硫键的TCR变体文库的方法。 
天然TCR存在异质二聚体αβ或γδ形式。然而，以前的报道显示一条TCR α链或TCR β链构成的重组TCR能与肽MHC分子结合。此外，以前的报道显示αα或ββ同质二聚体构成的重组TCR能与肽MHC分子结合。因此，本发明的其它实施方式提供了TCRαα或TCR ββ同质二聚体。 
在一个实施方式中，本发明TCR包含α链可变区和TCR β链可变区。 
除非有相反表述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或 M)残基。本领域技术人员可知该残基在重组蛋白的产生过程中可以除去。本领域技术人员显然还知道，可将其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5或更多个残基，而基本上不影响该TCR结合pMHC的性能，本发明包括所有这些变化细微的变体。 
本文所用的术语“分离的TCR”表示自然界中发现的以外形式的TCR，例如可溶性TCR或非天然转染了编码所述TCR遗传物质的细胞上的TCR。 
本文所用的术语“可变区”应理解为包括某给定TCR中包含的除TCR α链的TRAC基因或TCR β链的TRBC1或TRBC2(基因)所编码的恒定区以外的所有氨基酸。(T cell receptor Factsbook(《T细胞受体手册》)，(2001)，LeFranc和LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8)。 
优选实施方式提供的本发明TCR含有： 
图1a(SEQ ID NO：2)所示α链可变区和图1b(SEQ ID NO：3)所示β链可变区或其表型沉默变体。例如，含有SEQ ID NO：15(图5a)和SEQ ID NO：16(图5b)所示氨基酸序列的TCR。该TCR α链是已知的ILAKFLHWL-HLA-A*0201复合物特异性TCR的α链。该TCR α链的DNA和氨基酸序列首次公布于WO 2005/116075中。 
其它优选的实施方式提供的本发明TCR含有： 
图10a(SEQ ID NO：19)所示α链可变区和图1b(SEQ ID NO：3)所示的β链可变区或其表型沉默变体。例如，含有SEQ ID NO：20(图10b)和SEQ ID NO：16(图5b)所示氨基酸序列的TCR。 
在一相关实施方式中，本发明的这种TCR还可包含图6a所示截短的α链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO：4)和图6b和6c所示截短的β链恒定区序列之一(SEQ IDNO：5和6)或其表型沉默变体。 
本文所用的术语“表型沉默变体”应理解为指保留了与由HLA-A24呈递的端粒酶衍生VYGFVRACL肽结合特性的那些TCR。例如，本领域技术人员已知可能产生在其恒定区和/或可变区中掺入了微小变化但不改变与VYGFVRACL-HLA-A24复合物相互作用亲和力和/或解离速率的TCR。本发明范围包括这类变化细微的变体。其中含有一个或多个保守取代的那些TCR也构成本发明的一部分。 
就广义而言，本发明TCR可以分别是WO 04/033685和WO 03/020763所述的 单链TCR(scTCR)形式或二聚体TCR(dTCR)形式。 
合适的scTCR形式包括：由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于TCR β链可变区序列并与对应于TCR β链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成的第二区段，和连接该第一区段C末端与该第二区段N末端的接头序列。 
或者，所述第一区段可由对应于TCR β链可变区的氨基酸序列构成，所述第二区段可由对应于TCR α链可变区序列并与对应于TCRα链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成。 
以上scTCR在第一和第二链之间还含有二硫键，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有等价物，其中该接头序列的长度和该二硫键的位置应使第一和第二区段的可变区序列的相互取向基本上与天然αβT细胞受体中的相同。 
更具体地说，第一区段可由对应于TCRα链可变区序列并与对应于TCR α链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成，第二区段可由对应于TCR β链可变区序列并与对应于TCR β链恒定区胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列构成，和在第一和第二链之间可以存在天然αβ T细胞受体中没有等价物的二硫键。 
在以上scTCR形式中，接头基团可连接第一区段C末端和第二区段N末端，其可如式-PGGG-(SGGGG)n-P-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是丝氨酸： 
-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQ ID NO：7) 
-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQ ID NO：8) 
本发明TCR的合适dTCR形式含有第一多肽，其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合；和第二多肽，其中对应于TCR β链可变区序列的序列与对应于TCR β链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合，该第一和第二多肽通过在天然αβ T细胞受体中没有等价物的二硫键相连。 
所述第一多肽可含有与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合的TCRα链可变区序列，而第二多肽中的序列对应于TCRβ链可变区序列并与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合，该第一和第二多肽通过 取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57的半胱氨酸残基之间的二硫键或其非人等价键相连。(“TRAC”等在本文中根据T cell receptor Factsbook(《T细胞受体手册》)，(2001)，LeFranc和LeFranc，Academic Press，ISBN 0-12-441352-8命名)。 
本发明TCR的dTCR或scTCR形式可具有对应于人αβ TCR胞外恒定和可变区序列的氨基酸序列，和在天然TCR中没有等价物的二硫键可连接所述恒定区序列的氨基酸残基。与天然TCR中其β碳原子距离小于0.6nm的氨基酸残基相对应的半胱氨酸残基之间存在二硫键，例如在取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基之间或其非人等同残基之间。就TCRα链而言，可引入半胱氨酸形成二硫键的其它位点是TRAC*01外显子1中的以下残基，就TCRβ链而言，是TRBC1*01或TRBC2*01外显子1中的以下残基： 
     TCRα链     TCRβ链   天然β碳距离  (nm)
    Thr45    Tyr10    Thr45    Ser15     Ser77    Ser17    Asp59    Glu15   0.533  0.359  0.560  0.59
除了以上提及的非天然二硫键以外，本发明TCR的dTCR或scTCR形式可在对应于天然TCR中通过二硫键连接的那些残基的残基之间含有二硫键。 
本发明TCR优选不含有对应于跨膜序列的序列。 
本发明TCR优选不含有对应于天然TCR胞质序列的序列。 
本发明TCR的dTCR或scTCR形式可含有第一多肽，其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合，和 
第多肽，其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区胞外序列的序列的N末端相融合， 
该第一和第二多肽通过取代TRAC*01外显子1的Thr 48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser 57的半胱氨酸残基之间的二硫键或其非人等价键相连。 
目前优选的一个本发明实施方式提供含有SEQ ID NO：15所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：16所示β链氨基酸序列的TCR。目前优选的另一个本发明实施方 式提供含有SEQ ID NO：20所示α链氨基酸序列和SEQ ID NO：16所示β链氨基酸序列的TCR。 
也提供了编码本发明TCR的一种或多种核酸。提供的所述一种或多种核酸可以是经改造适合在原核或真核宿主细胞中表达的形式。合适的宿主细胞包括但不限于：细菌、酵母菌、哺乳动物或昆虫细胞。例如，宿主细胞可以是人T细胞或人造血干细胞。 
使这种经改造的一种或多种核酸是经突变而反映为其中引入了宿主细胞偏爱的密码子。引入的突变是不影响所编码的一种或多种多肽氨基酸序列的沉默突变。GeneArt(Regensburg，德国)提供合适的核酸优化服务(GeneOptimizerTM)。GeneArt拥有的WO 2004/059556进一步提供了该优化方法的细节。 
目前优选的本发明其它实施方式提供了由全长TCRα链DNA序列和全长TCRβ链DNA序列构成的核酸。与上述核酸互补的核酸或相应的RNA序列也构成本发明的部分。此外，本领域技术人员明显知道编码本发明TCR的所述一种或多种核酸也可含有非编码(内含子)序列。 
本领域技术人员明显知道这种全长TCR链DNA序列编码以下序列： 
前导序列和胞外、跨膜和胞质TCR序列。 
PEG化的TCR单体 
在个具体实施方式中，本发明TCR与至少一条聚亚烷基二醇链结合。本领域技术人员已知有许多方法可产生这种结合。在一优选实施方式中，一条或多条所述聚亚烷基二醇链与TCR共价相连。在另一实施方式中，本发明该方面的聚乙二醇链含有至少两个聚乙烯重复单位。 
多价TCR复合物 
本发明一方面提供含有至少两个本发明TCR的多价TCR复合物。在该方面的一个实施方式中，至少两个TCR分子经接头部分相连形成多价复合物。这些复合物优选为水溶性的，所以应照此选择接头部分。此外，接头部分优选能与TCR分子上确定的位置相连，从而尽可能降低所形成复合物的结构多样性。该方面的一个实施方式所提供的本发明TCR复合物中聚合物链或肽接头序列延伸于各TCR中不位于该TCR可变区序列中的氨基酸残基之间。 
由于本发明复合物可用作药物，接头部分的选择应适当考虑它们的药学适用 性，例如它们的免疫原性。 
本领域已知能满足以上所需标准的接头部分的例子，例如连接抗体片段的技术。 
两类接头优选用于产生本发明的多价TCR分子。这些接头是非肽聚合物链或肽接头序列。其中的TCR通过聚亚烷基二醇链相连的本发明TCR复合物提供了该方面的一个实施方式。 
第一类是亲水性聚合物，例如聚亚烷基二醇。此类中最常用的是聚乙二醇或PEG，其结构如下式所示。 
HOCH2CH2O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH 
其中n大于2。然而，其它聚合物可以是基于其它合适的、任选取代的聚亚烷基二醇，包括聚丙二醇，和乙二醇与丙二醇的共聚物。 
这种聚合物可用于处理或偶联治疗剂，特别是多肽或蛋白质疗剂来有益地改变该治疗剂的PK分布，例如降低肾廓清率、提高血浆半衰期、降低免疫原性和提高溶解性。据信，一个或多个PEG分子围绕疗剂周围形成的“外壳”能在立体上阻碍此疗剂与免疫系统反应并降低蛋白酶降解，从而改善PEG-疗剂偶联物的PK分布。(Casey等，(2000)，Tumor Targetting，4 235-244)。所用亲水性聚合物的大小可根据TCR复合物预定的治疗应用来具体选择。因此，例如当要该产品离开循环(系统)渗入组织时，如用于治疗肿瘤时，宜使用5 KDa级的低分子量聚合物。已有许多综述文章和书籍详细描述了PEG和类似分子在药物制剂中的应用。例如，参见Harris，(1992)，Polyethylene Glycol Chemistry-Biotechnical and BiomedicalApplications(《聚乙二醇化学-生物技术和生物医药应用》)，Plenum，纽约，纽约州或Harris和Zalipsky，(1997)，Chemistry and Biological Applications of PolyethyleneGlycol ACS Books(《聚乙二醇化学和生物学应用ACS手册》)，华盛顿，哥伦比亚特区。 
所用的聚合物可具有线形或分支构型。可通过加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和赖氨酸来诱生分支PEG分子或其衍生物。 
该聚合物一般在其结构中，例如在其一端或两端，和/或骨架的支链处具有化学反应活性基团，从而使该聚合物能与TCR中的靶位点相连。如下所示，这种化学反应活性基团可与亲水性聚合物直接相连，或者在亲水性聚合物和反应活性化学(基团)之间可以具有间隔基团/部分： 
反应活性化学(基团)-亲水性聚合物-反应活性化学(基团) 
反应活性化学(基团)-间隔基团-亲水性聚合物-间隔基团-反应活性化学(基团) 
用于形成以上所概述类型的构建物的间隔基团可以是无反应活性、化学稳定的、链状的任何有机部分。这种间隔基团包括但不限于以下基团： 
-(CH2)n-，其中n＝2到5 
-(CH2)3NHCO(CH2)2
其中二价亚烷基间隔基团位于聚亚烷基二醇链和其与该复合物的TCR连接点之间的本发明TCR复合物是该方面的另一种实施方式。 
其中聚亚烷基二醇链含有至少两个聚乙二醇重复单位的本发明TCR复合物是该方面的另一实施方式。 
本发明可用的直接或经间隔基团与反应活性化学(基团)相连的亲水性聚合物有许多商业供应商。这些供应商包括Nektar Therapeutics(加利福尼亚州，美国)、NOF Corporation(日本)、Sunbio(韩国)和Enzon Pharmaceuticals(新泽西州，美国)。 
本发明所用直接或经间隔基团与反应活性化学(基团)相连的可商品化购得的亲水性聚合物包括但不限于以下聚合物： 
PEG接头描述 PEG来源  目录号
TCR单体连接    
5K线形(马来酰亚胺) Nektar  2D2MOHO1
20K线形(马来酰亚胺) Nektar  2D2MOPO1
20K线形(马来酰亚胺) NOF Corporation  SUNBright  ME-200MA
20K支链(马来酰亚胺) NOF Corporation  SUNBright  GL2-200MA
30K线形(马来酰亚胺) NOF Corporation  SUNBright  ME-300MA
40K支链PEG(马来酰亚胺) Nektar  2D3XOTO1
5K-NP线形(用于Lys连接) NOF Corporation  SUNBright  MENP-50H
10K-NP线形(用于Lys连接) NOF Corporation  SUNBright  MENP-10T
20K-NP线形(用于Lys连接) NOF Corporation  SUNBright  MENP-20T
TCR二聚体接头    
3.4K线形(马来酰亚胺) Nektar  2D2DOFO2
5K分叉的(马来酰亚胺) Nektar  2D2DOHOF
[0076] 
 10K线形(用正吡啶基ds-接头 取代马来酰亚胺) Sunbio  
 20K分叉的(马来酰亚胺) Nektar  2D2DOPOF
 20K线形(马来酰亚胺) NOF Corporation  
 40K分叉的(马来酰亚胺) Nektar  2D3XOTOF
 高级TCR多聚体    
 15K，3臂，Mal3(用于三聚体) Nektar  OJOONO3
 20K，4臂，Mal4(用于四聚体) Nektar  OJOOPO4
 40K，8臂，Mal8(用于八聚体) Nektar  OJOOTO8
可利用各种偶联化学(基团)将聚合物分子偶联于蛋白质和肽疗剂。选择最合适的偶联化学(基团)在很大程度上取决于所需的偶联部位。例如，以下偶联化学(基团)已用于连接PEG分子(来源：Nektar分子工程目录2003(Nektar Molecular EngineeringCatalogue 2003))的一个或多个末端： 
N-马来酰亚胺 
乙烯基砜 
苯并三唑碳酸酯 
琥珀酰亚胺丙酸酯(Succinimidyl proprionate) 
琥珀酰亚胺丁酸酯(Succinimidyl butanoate) 
硫代酯 
乙醛 
丙烯酸酯 
生物素 
伯胺 
如上所述，非PEG聚合物也可为本发明TCR的多聚化提供合适的接头。例如，可用含有通过脂肪链相连的马来酰亚胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce，产品号22330和22323)。 
肽接头是另一类TCR接头。这些接头由氨基酸链组成，其作用是在要连接的TCR分子上产生简单的接头或多聚化结构域。曾采用生物素/链霉亲和素系统来产生体外结合研究用的TCR四聚体(参见WO/99/60119)。然而，链霉亲和素是微生物来源的多肽，因此用于疗剂中并不理想。 
其中的TCR通过源自人多聚化结构域的肽接头连接的本发明TCR复合物提 供了该方面的另一种实施方式。 
有许多含多聚化结构域的人蛋白质可用于产生多价TCR复合物。例如，p53四聚化结构域已用于产生scFv抗体片段四聚体，该四聚体与单体scFV片段相比，显示血清存留期增加和解离速率明显降低。(Willuda等，(2001)J.Biol.Chem.276(17)14385-14392)。血红蛋白的四聚化结构域也可能用于该类应用。 
含有至少两个TCR的本发明多价TCR复合物提供了该方面的最后一个实施方式，其中至少一个所述TCR与治疗剂结合。 
一方面，本发明TCR(或其多价复合物)或者还可在其α或β链的C-末端或N-末端包含反应活性半胱氨酸。 
诊断和治疗应用 
一方面，本发明TCR可以与治疗剂或可检测部分结合。例如，所述治疗剂或可检测部分可与TCR共价相连。 
在本发明的一个实施方式中，所述治疗剂或可检测部分与一条或两条TCR链的C-末端共价相连。 
一方面，可用可检测部分，例如适用于诊断目的的标记物来标记本发明TCR的scTCR或一条或两条dTCR链。这种标记的TCR可用于检测VYGFVRACL-HLA-A*0201复合物的方法中，该方法包括使TCR配体与该TCR配体的特异性TCR(或多聚高亲合力TCR复合物)接触；和检测与该TCR配体的结合情况。在例如利用生物素化的异质二聚体形成的四聚体TCR复合物中，可利用荧光链霉亲和素提供可检测标记。这种荧光标记的TCR四聚体适用于FACS分析，例如检测携带这些TCR的特异性VYGFVRACL-HLA-A*0201复合物的抗原呈递细胞。 
可检测本发明可溶性TCR的另一种方法是利用TCR特异性抗体(例如，抗-CD3抗体)，特别是单克隆抗体。有许多可商品化购得的抗-T细胞抗体，例如αFl和βFl可分别识别α和β链的恒定区。 
在其它方面，本发明TCR(或其多价复合物)或者还可与治疗剂结合(例如，共价或其它方式相连)，所述治疗剂可以是，例如用于杀伤细胞的毒性部分，或免疫效应分子，如白介素或细胞因子。与非多聚野生型或本发明的T细胞受体异质二聚体相比，本发明多价TCR复合物对TCR配体的结合能力提高。因此，本发明多 价TCR复合物特别可用于在体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也可用作中间体来产生具有这种用途的其它多价TCR复合物。因此，这些TCR或多价TCR复合物可以体内应用的药学上可接受的制剂提供。 
本发明也提供将治疗剂递送至靶细胞的方法，该方法包括在允许潜在的靶细胞与本发明TCR或多价TCR复合物结合的条件下使二者接触，所述TCR或多价TCR复合物对VYGFVRACL-HLA-A24复合物具有特异性并结合有治疗剂。 
具体地说，本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可用于将治疗剂递送至呈递特定抗原的细胞部位。这可用于许多情况，特别是对付肿瘤。递送的治疗剂应可在局部施加其作用而不只对与其结合的细胞起作用。因此，一种具体方案设想可将抗肿瘤分子与肿瘤抗原特异性的本发明TCR或多价TCR复合物相连。 
为此应用，可利用许多治疗剂，例如放射性化合物，酶(例如，穿孔素)或化疗药物(例如，顺铂)。为保证只在所需部位发挥毒性作用，可将毒素包裹在与链霉亲和素相连的脂质体内从而缓慢释放该化合物。这防止了毒素在体内转运期间的破坏作用并且保证了TCR与相关的抗原呈递细胞结合后毒素具有最大作用。 
其它合适的治疗剂包括： 
·小分子细胞毒性药物，即分子量小于700道尔顿，能杀伤哺乳动物细胞的化合物。这种化合物也可包含具有细胞毒性作用的毒性金属。此外，应该理解这些小分子细胞毒性药物也包括药物前体，即能在生理条件下分解或转变从而释放细胞毒性药物的化合物。这种药物的例子包括顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、刺胞霉素、多西他赛、鬼臼亚乙苷、吉西他滨、异环磷酰胺、依利替康、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodium photofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素； 
·肽类细胞毒素，即能杀伤哺乳动物细胞的蛋白质或其片段。包括但不限于：蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A及其变体(例如PE38)、DNA酶和RNA酶； 
·放射性核素，即一些元素的不稳定同位素，其衰减时发射一种或多种α或β粒子，或γ射线。包括但不限于：碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；也可利用螯合剂来促进这些放射性核素与TCR或其多聚体结合； 
·药物前体，包括但不限于：抗体定向的酶药物前体； 
·免疫刺激剂，即能激活免疫应答的部分。包括但不限于：细胞因子，例如IL-2和IFN；超抗原及其突变体；pHLA复合物和趋化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段；补体激活剂；异种蛋白结构域；同种蛋白结构域；病毒/细菌蛋白结构域；病毒/细菌肽和抗T细胞决定簇抗体(例如，抗-CD3或抗-CD28)。 
功能性抗体片段和变体 
适用于本文所述组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括但不限于以下。 
抗体片段 
本领域技术人员已知可能产生基本上保留了亲代抗体相同结合特性的某给定抗体的片段。下文提供了这种片段的细节： 
微型抗体(minibody)-这些构建物由具有截短的Fc部分的抗体组成。同样，它们保留了其所衍生自抗体的完整结合结构域。 
Fab片段-这些(构建物)包含与免疫球蛋白重链的一部分共价相连的一条免疫球蛋白轻链。因此，Fab片段包含一个抗原结合位点。Fab片段定义为用木瓜蛋白酶处理IgG而释放的那部分。这种片段一般可用重组DNA技术生产。(Reeves等，(2000)，Lecture Notes on Immunology(《免疫学讲稿》)，(第四版)，Blackwell Science出版)。 
F(ab’)2片段-这些(构建物)同时包含一种抗体的抗原结合位点和绞链区。F(ab’)2 片段定义为用胃蛋白酶处理IgG而释放的那部分。这种片段一般可用重组DNA技术生产。(Reeves等，(2000)，Lecture Notes on Immunology(《免疫学讲稿》)，(第四版)，Blackwell Science出版)。 
Fv片段-这些(构建物)包含与免疫球蛋白轻(链)可变区共价相连的免疫球蛋白重(链)可变区。已作出了许多Fv设计。这些(构建物)包括通过引入二硫键来增强两结构域之间缔合的dsFv。或者，可利用肽接头将两个结构域结合到一起成为一条多肽来形成scFv。还产生了含有免疫球蛋白重链或轻链的可变区，与相应的免疫球蛋白重链或轻链的可变或恒定区相结合的Fv构建物。Fv也可多聚化形成双抗体或三抗体(Maynard等，(2000)，Annu Rev Biomed Eng，2 339-376)。 
NanobodiesTM-由Ablynx(比利时)投入市场的这些构建物包含衍生自骆驼 (camelid)(例如，骆驼或美洲驼)抗体的一个合成的免疫球蛋白重(链)可变区。 
结构域抗体-由Domantis(比利时)投入市场的这些构建物包含亲和力成熟的一个免疫球蛋白重(链)可变区或免疫球蛋白轻(链)可变区。 
抗体变体和类似物 
本发明抗体的明确功能特性是它们能特异性结合靶配体。本领域技术人员已知可能将这种结合特性工程改造加入到许多其它蛋白质中。适用于本发明组合物和方法的抗体变体和类似物的例子包括但不限于以下。 
基于蛋白质支架的结合多肽-该结合构建物家族包括含天然结合环的蛋白质的突变类似物。例子包括由Affibody(瑞典)投入市场的Affibodies，其是基于衍生自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蛋白A的一个IgG结合结构域的三螺旋基序。另一例子是由EvoGenix(澳大利亚)投入市场的Evibodies，其是基于在CTLA-4胞外结构域中移植了类似于抗体结合环的结构域。最后一个例子是由RegeneronPharmaceuticals (US)投入市场的Cytokine Traps，其将细胞因子受体结构域移植入抗体支架中。(Nygren等，(2000)Current Opinion in Structural biology，7 463-469)是利用支架来工程改造蛋白质中新结合位点的综述。该综述提及以下蛋白质作为支架来源：CP1锌指(结构)、淀粉酶抑制肽(Tendamistat)、Z结构域(蛋白A同类物)、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1和细胞色素b562。其它蛋白质支架研究报道采用纤连蛋白、绿色荧光蛋白(GFP)和锚蛋白重复(单位)。 
本领域技术人员已知可以产生能与某给定蛋白配体不同部分结合的抗体或其片段，变体或类似物。例如，可产生针对形成该复合物(CD3)的任一多肽链(即，γ、δ、ε、ξ和η CD3链)的抗-CD3抗体。能与ε CD3链结合的抗体是本发明组合物和方法所用的优选抗-CD3抗体。 
本发明的可溶性TCR或多价TCR复合物可与能将药物前体转化为药物的酶相连。这可使药物前体只在所需部位转变为药物(即，通过sTCR靶向)。 
预计本文披露的VYGFVRACL(SEQ ID NO：1)-HLA-A24特异性TCR可用于癌症的诊断和治疗方法。 
对于癌症治疗，将毒素或免疫刺激剂定位在肿瘤或转移(性肿瘤)附近可提高其效力。对于疫苗递送，将疫苗抗原定位在抗原呈递细胞附近可提高该抗原的效力。该方法也可应用于成像目的。 
一个实施方式提供了呈递本发明TCR的细胞。另一相关实施方式提供了经转染而能呈递本发明TCR的细胞。呈递或经转染而能呈递本发明TCR的细胞优选人T细胞或人造血干细胞。呈递本发明TCR的细胞可通过过继疗法(adoptive therapymethods)用于治疗癌症。这些方法提供了在患者体内将细胞，例如T细胞导向靶细胞群的手段，所述方法包括给予癌症对象多个呈递本发明TCR的细胞，所述TCR对靶细胞群上的VYGFVRACL-HLA-A24配体具有特异性。 
本发明的其它实施方式提供了含有以下组分的药物组合物： 
本发明的TCR或多价TCR复合物(任选与治疗剂结合)，或多个呈递至少一种本发明TCR的细胞，或编码本发明TCR的一种或多种核酸及药学上可接受的载体。 
本发明也提供一种癌症治疗方法，包括给予患这种癌症的对象有效量的本发明TCR或多价TCR复合物(任选与治疗剂结合)，或能呈递至少一种本发明TCR的多个细胞，或编码本发明TCR的一种或多种核酸。在一相关实施方式中，本发明提供本发明的TCR或多价TCR复合物(任选与治疗剂结合)，或能呈递至少一种本发明TCR的多个细胞，或编码本发明TCR的一种或多种核酸在制备治疗癌症组合物中的应用。 
本发明的治疗性或成像TCR一般可作为通常含有药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该药物组合物可采用任何合适的形式(取决于给予患者的所需方法)。该药物组合物可以单位剂型提供，一般装在密封容器中或作为试剂盒的一部分提供。这种试剂盒通常(虽然不一定)装有使用说明书。该试剂盒可装有多个所述单位剂型。 
该药物组合物适于用任何合适的途径给药，例如胃肠外、透皮或通过吸入给药，优选经胃肠外途径(包括皮下、肌肉内或最优选静脉内给药)。可用药学领域中已知的任何方法制备该组合物，例如在无菌条件下混合活性成分与载体或赋形剂。 
本发明物质的剂量可根据待治疗的疾病或病症、待治疗个体的年龄和状况等而在较大范围内变动，医师可最终确定所用的合适剂量。 
其它力面 
本发明的scTCR或dTCR(优选由对应于人序列的恒定区或可变区序列构成)可以是基本纯形式、或作为纯化或分离的制品提供。例如，可以基本上不含其它蛋白质的形式提供。 
可通过以下方法鉴定具有特异性结合VYGFVRACL-HLA-A*2402特性的高亲合力TCR，该TCR(i)含有至少一个TCRα链可变区和/或至少一个TCRβ链可变区和(ii)对所述VYGFVRACL-HLA-A*2402复合物的KD小于或等于1μM： 
(a)制备各含有亲本VYG-A24 TCR的α和β链可变区的多个TCR，其中α和β链可变区的一个或两个含有突变； 
(b)在适合于TCR与VYGFVRACL-HLA-A*2402结合的条件下使所述突变的TCR与VYGFVRACL-HLA-A*2402接触；和 
(c)测定该相互作用的KD，选出具有所需KD的TCR。 
本发明各方面的优选特征与已作了必要修正的其它各方面的一样。本文提及的现有技术文件按照法律所允许的最大程度纳入。 
实施例
以下实施例进一步描述了本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。 
下文参考了附图，其中： 
图1a和1b分别提供了亲本VYG-A24 TCR的α链可变区氨基酸序列和β链可变区氨基酸序列。 
图2a和2b分别提供了可溶形式的亲本VYG-A24 TCR α链和β链的DNA序列。下划线标出了Ndel和HindIII限制性内切酶识别位点。 
图3a和3b分别提供了从图2a和2b所示DNA序列产生的可溶形式亲本VYG-A24TCRα和β链的氨基酸序列。下划线标出了这些可溶性TCR链中的CDR序列。 
图4a和4b分别提供了可溶形式的亲本VYG-A24 TCRα链和β链的DNA序列，其经突变而包含了额外的半胱氨酸残基从而形成非天然二硫键。阴影表示引入各链的半胱氨酸密码子。下划线标出了Ndel和HindIII限制性内切酶识别位点。 
图5a和5b分别显示了从图4a和4b的DNA序列产生的可溶形式的亲本VYG-A24 TCRα和β链的氨基酸序列。阴影表示引入各链的半胱氨酸。 
图6a提供了截短形式TRAC的氨基酸序列。 
图6b提供了截短形式TRBC1的氨基酸序列。 
图6c提供了截短形式TRBC2的氨基酸序列。 
图7a提供述了pGMT7质粒的质粒图谱。 
图7b提供述了pGMT7质粒的DNA序列。 
图8详细描述了二硫键连接形式的可溶性亲本VYG-A24 TCR的β链氨基酸序列，其采用了经肽接头与野生型人IL-2融合的TRBC2编码的恒定区。接头和IL-2序列以斜体字表示。 
图9提供了二硫键连接形式的可溶性亲本VYG-A24 TCR与HLA-VYGFVRACL-HLA-A*2402相互作用产生的Biacore响应曲线。 
图10a提供了(c8)VYG-A24 TCRα链可变区的氨基酸序列。 
图1 0b提供了掺入了非天然半胱氨酸的可溶形式(c8)VYG-A24 TCR的α链氨基酸序列。引入的半胱氨酸加亮表示，该TCR链的CDR内的氨基酸以下划线标出。 
实施例1-制备包含亲本VYG-A24可变区的二硫键连接的可性TCR 
图4a和4b提供了对VYGFVRACL-HLA-A*2402复合物具有特异性的二硫键连接形式的可溶性亲本VYG-A24 TCR的α和β链DNA序列。通过以下实施例6所述的方法从噬菌体文库中鉴定β链序列。α链是已知[LAKFLHWL-HLA-A*0201复合物特异性TCR的α链。该α链的DNA序列和氨基酸序列在WO2005/116075中首次披露。可由多个承包研究公司(contractresearch company)，例如GeneArt(德国)从头合成这些DNA序列。还可在这些DNA序列中加入限制性内切酶识别位点，从而使得这些DNA序列易于连接入pGMT7表达质粒，该质粒含有能在大肠杆菌BL21-DE3(pLysS)中高水平表达的T7启动子(Pan等，Biotechniques(2000)29(6)：1234-8)。 
将用NdeI和HindIII切割的编码各TCR链的DNA序列连接入也用NdeI和HindIII切割的不同pGMT7载体(pGMT7的质粒图谱见图7a，该载体的DNA序列见图7b(SEQ ID NO：17))。 
在编码可溶性亲本VYG-A24 TCR链的DNA中导入限制性内切酶识别位点 
NdeI-CATATG 
HindIII-AAGCTT 
连接 
将连接的质粒转化入感受态大肠杆菌菌株XL1-蓝细胞，接种于含100mg/ml氨苄西林的LB/琼脂平板。37℃培育过夜后，挑取单菌落，用含100mg/ml 氨苄西林的10ml LB于37C摇动培养过夜。用Miniprep试剂盒(Qiagen)纯化克隆的质粒，用自动化DNA测序仪(Lark Technologies)测序插入的片段。 
图5a和5b分别显示了由图4a和4b所示DNA序列产生的二硫键连接的可溶性亲本VYG-A24 TCRα和β链胞外氨基酸序列。 
实施例2-制备二硫键连接的可溶性VYG-A24 TCR的高亲和力变体 
可将如实施例1所述制备的二硫键连接的可溶性亲本VYG-A24 TCR用作模板，从该模板制备对VYGFVRACL(SEQ ID NO：43)-HLA-A*0201复合物的亲和力提高的本发明TCR。 
本领域技术人员已知可通过定点诱变将制备这些突变链所需的必需密码子变化导入编码这些链的DNA中(QuickChangeTM，Stratagene的定点诱变试剂盒)。 
简言之，可通过用能掺入所需一个或多个密码子变化的引物以及含相关亲本VYG-A24 TCR链DNA的pGMT7质粒作为诱变模板来实现： 
采用以下条件进行诱变：50 ng质粒模板、1μl的10mM dNTP、由厂商提供的5μl的10×Pfu DNA聚合酶缓冲液、25pmol的正向引物、25pmol的反向引物、1μl的pfu DNA聚合酶，总体积为50μl。95C进行2分钟的初始变性后，进行25轮如下反应：变性(95℃，10秒)、退火(55℃，10秒)和延伸(72℃，8分钟)。用DpnI限制性内切酶消化所得产物以去除模板质粒，并转化入大肠杆菌XL1-蓝菌株中。采用测序验证诱变。 
实施例3-可溶性TCR的表达、重折叠和纯化 
将实施例1制备的含有亲本VYG-A24 TCRα链和亲本VYG-A24 TCRβ链的pGMT7表达质粒分别转化入大肠杆菌菌株BL21pLysS，37℃用TYP培养基(含100μg/ml氨苄西林)培养具有氨苄西林抗性的单菌落至OD600为0.4，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达。诱导后3小时用Beckman J-6B以4000rpm离心30分钟收集细胞。将细胞沉淀物重悬在含有50mM Tris-HCl、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、10mM DTT，pH 8.0的缓冲液中。冻融过夜后，在Milsonix XL2020超声波仪中用标准的12mm直径探头超声破碎重悬的细胞1分钟，总共超声约10分钟。用Beckman J2-21离心机以13000rpm 离心30分钟回收包涵体沉淀物。然后用洗涤剂洗涤三次以去除细胞碎片和膜组分。每次用Triton缓冲液(50mM Tris-HCl、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH8.0)匀浆包涵体沉淀物，然后用Beckman J2-21以13000rpm离心15分钟使其沉淀。然后用如下缓冲液进行类似洗涤以去除洗涤剂和盐：50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH 8.0。最后，将包涵体分成30mg等分，-70℃冷冻。用6 M盐酸胍溶解并通过Bradford染料结合测试(PerBio)定量测定包涵体蛋白产量。 
融化含有约30mg TCRβ链和60mg TCRα链的包涵体的冷冻储备物，然后混合样品，用15ml胍溶液(6M盐酸胍、10mM醋酸钠、10mM EDTA)稀释该混合物以确保链完全变性。然后将含有完全还原并变性的TCR链的胍溶液注入1升以下重折叠缓冲液中：100mM Tris pH 8.5、400mM L-精氨酸、2mMEDTA、5mM还原谷胱甘肽、0.5mM氧化谷胱甘肽、5M尿素、0.2mM PMSF。加入氧化还原对(2-巯乙胺和胱胺(其终浓度分别为6.6mM和3.7mM)，约5分钟后加入变性的TCR链。溶液静置5小时±15分钟。5℃±3℃，在Spectrapor 1膜(Spectrum；产品编号：132670)中用10L 10mM Tris pH 8.1透析重折叠的TCR18-20小时。然后将透析缓冲液换为新鲜的10mM Tris pH 8.1(10L)，在5℃±3℃下再透析20-22小时。 
将透析的重折叠物加样于POROS 50HQ阴离子交换柱上，用Akta纯化仪(Pharmacia)以50倍以上柱体积的0-500mM NaCl梯度液洗脱结合的蛋白质从而将sTCR与降解产物和杂质分开。将诸峰组分保存于4℃，用考马斯染色SDS-PAGE分析，然后合并与浓缩。最后，用HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，3.5mM EDTA，0.05％乙基苯基聚乙二醇(nonidet p40))预平衡的Superdex 200HR凝胶过滤柱纯化和表征sTCR。合并与浓缩相对分子量约50kDa的洗脱峰后通过Biacore表面等离振子共振分析来表征。 
实施例4-Biacore表面等离子共振表征结合于特异性pMHC的sTCR 
用表面等离振子共振生物传感器(Biacore 3000TM)分析亲本VYG-A24 TCR与VYGFVRACL-HLA-A*2402的结合情况。制备以半定向方式固定在链霉亲和素包被结合表面上的单种VYGFVRACL-HLA-A*2402复合物(描述于下文)有助 于该项分析，从而能同时有效测试可溶性T-细胞受体与多达4种不同pMHC(固定在不同的流动小室上)的结合情况。手动注入HLA复合物易于操控固定的I类分子的精确水平。 
体外重折叠含有亚单位蛋白组分和合成肽的细菌表达的包涵体中生物素化I类HLA-A*2402分子，然后纯化并在体外进行酶促生物素化(O’Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266：9-15)。所表达的HLA-A*2402-重链的C末端具有生物素化标签，其以合适的结构替代了该蛋白质的跨膜区和胞质结构域。获得的包涵体表达水平约75mg/升细菌培养物。还在大肠杆菌中从合适构建物表达了作为包涵体的MHC轻链或β2-微球蛋白，其水平约为500mg/升细菌培养物。 
裂解大肠杆菌细胞，纯化包涵体至约80％纯度。用6M盐酸胍、50mM TrispH 8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA使包涵体蛋白质变性，通过在低于5℃将变性蛋白一次脉冲加入重折叠缓冲液：0.4M L-精氨酸-HCl、100mM Tris pH 8.1、3.7mM胱胺、6.6mM β-半胱胺，负载于HLA-A*0201分子所需的4mg/ml SLYNTVATL肽，重折叠成30mg/升重链、30mg/升β2m的浓度。重折叠在4℃进行至少1小时方能完成。 
用10倍体积的10mM Tris pH 8.1透析更换缓冲液。为充分降低溶液的离子强度，缓冲液需更换两次。然后将蛋白质溶液通过1.5μm乙酸纤维素滤膜过滤，加样于POROS 50HQ阴离子交换柱上(床体积8ml)。用0-500mM NaCl线性梯度液洗脱蛋白。HLA-A*0201-肽复合物大约在250mM NaCl处洗脱，收集诸峰细分，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)，各组分冷藏于冰上。 
用以相同缓冲液平衡的Pharmacia快速脱盐柱将含生物素化标记的pMHC分子的缓冲液更换为10mM Tris pH 8.1、5mM NaCl。洗脱后立即将含有蛋白质的组分冷藏于冰上，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化试剂：1mM生物素、5mM ATP(缓冲至pH 8)、7.5mM MgCl2和5μg/mlBirA酶(按照O’Callaghan等，(1999)，Anal.Biochem.266：9-15纯化)。然后室温培育混合物过夜。 
采用凝胶过滤层析纯化生物素化的pHLA-A*2402分子。用已过滤的PBS预平衡Pharmacia Superdex 75 HR 10/30柱，加载1ml生物素化反应混合物， 用PBS以0.5ml/分钟过柱。生物素化pHLA-A*0201分子在约15ml时作为单峰洗脱。合并含有蛋白质的组分，在冰上冷藏，加入蛋白酶抑制剂混合物。采用考马斯结合试验(PerBio)测定蛋白质浓度，将生物素化VYGFVRACL-HLA-A*2402分子等份试样冷冻保存在-20℃。采用标准的胺基偶联方法(amine coupling method)固定链霉亲和素。 
这种固定的复合物能结合T-细胞受体和辅助受体CD8αα，可将二者注射入溶液相。即使在低浓度(至少40μg/ml)也能获得TCR的特异性结合，提示该TCR较稳定。如果采用溶液相或固定相的sTCR，观察到sTCR的pMHC结合特性在质量和数量上相似。这对控制可溶性(TCR)部分活性至关重要，也提示生物素化的pMHC复合物与非生物素化的复合物生物活性相同。 
在Biacore 3000TM表面等离振子共振(SPR)生物传感器上分析含有新的链间键的可溶性亲本VYG-A24 TCR与其同源pMHC或无关的pMHC混合物(制备方法如上所述)之间的相互作用。在一流动小室中，SPR检测到传感器表面附近以响应单位(RU)表示的折光率发生变化，该原理可用于检测受体配体相互作用和分析它们的亲和力以及动力学参数。所述探针流动小室如下制备：通过交联到β2m上的生物素与已化学交联到流动小室的活化表面上的链霉亲和素之间的结合，将各HLA-肽复合物固定在不同的流动小室中。然后使sTCR以恒定流速通过不同流动小室的表面，并测定该情况下的SPR响应以进行测试。 
检测平衡结合常数 
制备亲本VYG-A24 TCR的一系列稀释液，以5μl/分钟的恒定流速注入两个不同的流动小室；一个流动小室用约1000RU的特异性VYGFVRACL-HLA-A*2402复合物包被，第二个用约1000RU的非特异性HLA-A24-肽复合物包被。用对照小室的测定值对各浓度的响应进行标准化。制作标准化数据响应与TCR样品浓度相关图，拟合成双曲线(hyperbola)以计算平衡结合常数，KD。(Price&Dwek，Principles and Problems in Physical Chemistryfor Biochemists(2nd Edition)，《生物化学家的物理化学原理和问题》第二版，1979，Clarendon Press，牛津)。 
检测动力学参数 
通过试验检测解离速率常数Kd和结合速率常数Ka来确定高亲和力TCR 的KD。平衡常数KD计算为kd/ka。注射TCR流过两个不同小室，一个用约300RU的特异性HLA-A*2402-VYGFVRACL复合物包被，第二个用约300 RU的非特异性肽-HLA复合物包被。流速设置为50μl/分钟。通常注入约3μM浓度的250μl TCR。然后使缓冲液流过直到响应回复到基线。用Biaevaluation软件计算动力学参数。也将解离相拟合为单指数衰变方程式从而能计算半衰期。 
结果 
采用上述方法分析二硫键连接的可溶性亲本VYG-A24 TCR(由SEQ ID NO：15和16分别详述的二硫键连接的可溶性α和βTCR链组成)与VYGFVRACL-HLA-A*2402复合物之间的相互作用，显示KD为4μM。(Biacore响应曲线见图9)。 
实施例5-制备可溶性VYG-A24 TCR-野生型人lL-2融合蛋白 
可用基本上如实施例1-3中所述的方法制备可溶性VYG-A24 TCR-野生型(WT)人IL-2融合蛋白。简言之，将编码所需接头和WT人IL-2的DNA加到二硫键连接的可溶性VYG-A24 TCRβ链DNA序列的3′端。图8提供了融合蛋白的氨基酸序列，该融合蛋白包含通过接头序列(SEQ ID NO：18)融合到WT人IL-2的二硫键连接的亲本VYG-A24 TCRβ链。该融合蛋白的接头和IL-2部分用斜体表示，TCRβ中引入的半胱氨酸残基以阴影表示。然后可将编码该构建物的DNA连接入pGMT7。然后可采用基本上如实施例3所述的方法，使该β链融合蛋白与图5a详述的二硫键连接的可溶性亲本VYG-A24 TCRα链(SEQID NO：15)相结合，从而表达此可溶性亲本VYG-A24 TCR-IL-2融合蛋白。 
实施例6-从A6 TCR起源的噬菌体展示文库分离与HLA-A24-VYGFVRA CL结合的TCR 
采用WO 2004/044004所述的方法制备噬菌体展示的TCR文库。简言之，该文库基于对HLA-A2-LLFGYPVYV具有特异性的二硫键连接的可溶性A6 TCR。利用能在所展示的A6 TCR的CDR3区域中引入突变的诱变引物产生A6 TCR文库的多样性。为展示A6 TCR文库，将噬菌粒载体构建为能表达含有异质二聚体A6TCR(含有非天然链间二硫键)与gIII噬菌体包衣蛋白的融合蛋白。利用含有噬菌粒的大肠杆菌XL-1-蓝细胞表达此噬菌体展示的TCR，所述噬菌粒能编码与噬菌体 gIII蛋白融合的可溶性A6TCRα链和A6TCRβ链。采用噬菌体ELISA方法检测噬菌体颗粒上是否存在展示的能结合VYGFVRACL-HLA-A*2402的功能性TCR。然后利用编码噬菌体展示的经ELISA选择的TCR的DNA构建二硫键连接的可溶性TCR。然后采用本文实施例4所述的Biacore方法评估这些可溶性TCR与HLA-A24-VYGFVRACL的结合情况。利用从该文库分离得到的TCRβ链(SEQ ID NO：16)构建二硫键连接的可溶性亲代VYG-A24TCR，该β链与能结合ILAKFLHWL-HLA-A*0201的“野生型”TCRα链(SEQ ID NO：15)的二硫键连接的可溶性类似物结合。也从该文库分离得到图10b所示的TCRα链(SEQID NO：20)，其与图5b所示的TCRβ链(SEQ ID NO 16)一起展示为对VYGFVRACL-HLA-A*2402复合物具有特异性的αβTCR。 

Claims (60)

1.一种分离的T细胞受体(TCR)，其具有特异性结合VYGFVRACL-HLA-A24的特性，其特征在于，所述TCR的α链可变区是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：19，所述TCR的β链可变区是SEQ ID NO：3。
2.如权利要求1所述的T细胞受体(TCR)，其具有特异性结合VYGFVRACL-HLA-A*2402的特性。
3.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有α链SEQ ID NO：15和β链SEQ ID NO：16。
4.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有α链SEQ ID NO：20和β链SEQ ID NO：16。
5.如权利要求1所述的TCR，其特征在于，所述TCR与治疗剂或可检测部分相连。
6.如权利要求5所述的TCR，其特征在于，所述TCR与治疗剂或可检测部分共价连接。
7.一种多价TCR复合物，其含有至少两个如权利要求1所述的TCR。
8.一种多价TCR复合物，其含有至少两个如权利要求2所述的TCR。
9.一种多价TCR复合物，其含有至少两个如权利要求3所述的TCR。
10.一种多价TCR复合物，其含有至少两个如权利要求4所述的TCR。
11.一种多价TCR复合物，其含有至少两个如权利要求5所述的TCR。
12.一种多价TCR复合物，其含有至少两个如权利要求6所述的TCR。
13.一种细胞，其呈递如权利要求1所述的TCR。
14.一种细胞，其呈递如权利要求2所述的TCR。
15.一种细胞，其呈递如权利要求3所述的TCR。
16.一种细胞，其呈递如权利要求4所述的TCR。
17.一种细胞，其呈递如权利要求5所述的TCR。
18.一种细胞，其呈递如权利要求6所述的TCR。
19.一种细胞，其经转染以呈递如权利要求1所述的TCR。
20.一种细胞，其经转染以呈递如权利要求2所述的TCR。
21.一种细胞，其经转染以呈递如权利要求3所述的TCR。
22.一种细胞，其经转染以呈递如权利要求4所述的TCR。
23.一种细胞，其经转染以呈递如权利要求5所述的TCR。
24.一种细胞，其经转染以呈递如权利要求6所述的TCR。
25.如权利要求13所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
26.如权利要求14所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
27.如权利要求15所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
28.如权利要求16所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
29.如权利要求17所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
30.如权利要求18所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
31.如权利要求19所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
32.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
33.如权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
34.如权利要求22所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
35.如权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
36.如权利要求24所述的细胞，其特征在于，所述细胞是人T细胞或人造血干细胞。
37.一种或多种核酸，其编码如权利要求1所述的TCR。
38.一种或多种核酸，其编码如权利要求2所述的TCR。
39.一种或多种核酸，其编码如权利要求3所述的TCR。
40.一种或多种核酸，其编码如权利要求4所述的TCR。
41.一种或多种核酸，其编码如权利要求5所述的TCR。
42.一种或多种核酸，其编码如权利要求6所述的TCR。
43.一种药物组合物，其含有如权利要求1所述的TCR以及药学上可接受的载体。
44.一种药物组合物，其含有如权利要求2所述的TCR以及药学上可接受的载体。
45.一种药物组合物，其含有如权利要求3所述的TCR以及药学上可接受的载体。
46.一种药物组合物，其含有如权利要求4所述的TCR以及药学上可接受的载体。
47.一种药物组合物，其含有如权利要求5所述的TCR以及药学上可接受的载体。
48.一种药物组合物，其含有如权利要求6所述的TCR以及药学上可接受的载体。
49.一种药物组合物，其含有如权利要求25所述的细胞以及药学上可接受的载体。
50.一种药物组合物，其含有如权利要求26所述的细胞以及药学上可接受的载体。
51.一种药物组合物，其含有如权利要求27所述的细胞以及药学上可接受的载体。
52.一种药物组合物，其含有如权利要求28所述的细胞以及药学上可接受的载体。
53.一种药物组合物，其含有如权利要求29所述的细胞以及药学上可接受的载体。
54.一种药物组合物，其含有如权利要求30所述的细胞以及药学上可接受的载体。
55.一种药物组合物，其含有如权利要求31所述的细胞以及药学上可接受的载体。
56.一种药物组合物，其含有如权利要求32所述的细胞以及药学上可接受的载体。
57.一种药物组合物，其含有如权利要求33所述的细胞以及药学上可接受的载体。
58.一种药物组合物，其含有如权利要求34所述的细胞以及药学上可接受的载体。
59.一种药物组合物，其含有如权利要求35所述的细胞以及药学上可接受的载体。
60.一种药物组合物，其含有如权利要求36所述的细胞以及药学上可接受的载体。
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