KR20220031614A - 자동화된 t세포 배양 - Google Patents

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KR20220031614A
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파스칼 보센느
키엔 쿠-두옹
코하나 레우바
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
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Abstract

T세포 부피 축소 처리의 자동화된 방법이 제공된다. 상기 방법은 T세포를 하나 이상의 활성화 시약과 자동으로 접촉시켜 T세포를 활성화하는 단계; T세포를 재조합 바이러스 벡터와 자동으로 접촉시켜 T세포를 형질도입하는 단계; T세포를 자동으로 접종하는 단계; T세포를 자동으로 확장하는 단계; 선택적으로, T세포를 자동으로 디비딩(debeading)하는 단계; 및 T세포를 자동으로 수확하는 단계를 포함한다. 또한 T세포 부피 축소 처리의 자동화된 방법을 위한 시스템이 제공된다.

Description

자동화된 T세포 배양
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2019년 6월 7일자로 출원된 미국 특허 가출원 62/858,736호에 의거한 우선권 주장 출원으로, 이는 그 전체가 본원에 참고로 혼입된다.
서열 목록의 참조 혼입
본 출원은 2020년 5월 27일에 생성되고 18킬로바이트를 포함하는 컴퓨터 판독 가능한 형태로 제출된 서열 목록을 참조로 혼입한다.
본 개시는 일반적으로 세포 배양 분야에 관한 것이다. 특히, 본 개시는 소규모 자동화 배양, 및 T세포와 같은 포유동물 세포의 유전적 변형을 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
질병 및 상태를 치료하기 위해 다양한 세포 치료 방법이 이용 가능하다. 세포 치료 방법 중에는 키메라 항원 수용체와 같은 재조합 수용체로 유전적으로 조작된 T세포와 같은 면역 세포를 포함하는 방법이 있다. 다양한 조건 및 유전자 조작된 T세포를 시험하는 보다 효율적인 방법을 제공하는 것을 포함하여 이러한 세포 요법을 제조 및/또는 조작하기 위한 개선된 방법이 필요하다.
다양한 조건 및 유전자 조작된 T 세포를 테스트하는 보다 효율적인 방법을 제공하는 것을 포함하여 이러한 세포 요법을 제조 및/또는 조작하기 위한 개선된 방법을 제공한다.
본 개시의 한 측면은 T세포 부피 축소 제조의 자동화된 방법으로서, 이 방법은 한 명 이상의 공여자로부터 얻은 입력 T세포 세트를 하나 이상의 활성화 시약과 접촉시켜 활성화된 T세포 세트를 생성함으로써 입력 T세포 세트를 활성화하는 단계; 활성화된 T세포의 바이러스 감염을 촉진하는 조건 하에 활성화된 T세포를 재조합 바이러스 벡터와 접촉시켜 상기 활성화된 T세포 세트를 형질도입하는 단계로서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 이종 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 단계; 활성화된 T세포 세트를 접종 및/또는 부화(incubation) 배지로부터 상기 형질도입된 T세포 세트를 회수하고 형질도입된 T세포 세트를 확장 배지로 옮겨서 형질도입된 T세포 세트를 확장시키는 접종 및/또는 배양 배지로 활성화된 T세포 세트를 옮김으로써 상기 형질도입된 T세포 세트를 접종 및/또는 배양하는 단계; 확장 배지로부터 형질도입된 T세포 세트를 회수하는 단계; 및 형질도입된 T세포 세트를 동결보존하여 형질도입된 T세포 세트를 수확하여 수확된 형질도입된 T세포 세트를 생성하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 랩웨어 및 하나 이상의 활성화 시약으로 작업대를 설정하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 실시예에서, 하나 이상의 단계가 자동으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 한 명 이상의 공여자로부터 얻은 입력 T세포 세트를 하나 이상의 활성화 시약과 자동으로 접촉시키고, 활성화된 T세포를 재조합 바이러스 벡터와 자동으로 접촉시키고, 활성화된 T세포 세트를 접종 및/또는 배양으로 자동 전달 배지, 접종 배지로부터 형질도입된 T세포 세트를 자동으로 회수하고 형질도입된 T세포 세트를 확장 배지로 옮기고, 확장 배지로부터 형질도입된 T세포 세트를 자동으로 회수하고 및/또는 형질도입된 T세포 세트를 자동으로 동결보존하는 단계가 자동으로 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 개시내용은 T세포 부피 축소 제조의 자동화된 방법에 관한 것으로, 이 방법은, 활성화된 T세포 세트를 생성하기 위해 한 명 이상의 공여자로부터 얻은 입력 T세포 세트를 하나 이상의 활성화 시약과 자동으로 접촉시킴으로써 입력 T세포 세트를 활성화하는 단계; 활성화된 T세포의 바이러스 감염을 촉진하는 조건 하에 활성화된 T세포를 재조합 바이러스 벡터와 접촉시켜 상기 활성화된 T세포 세트를 형질도입하는 단계로서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 이종 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 단계; 활성화된 T세포 세트를 접종 및/또는 배양 배지에 자동으로 옮겨 형질도입된 T세포 세트를 접종 및/또는 배양하는 단계 접종 배지로부터 형질도입된 T세포 세트를 자동으로 회수하여 형질도입된 T세포 세트를 확장 및 형질도입된 T세포 세트를 확장 배지로 전달하는 단계; 확장 배지로부터 형질도입된 T세포 세트를 자동으로 회수하는 단계; 및 형질도입된 T세포 세트를 자동으로 동결 보존하여 집합 형질도입 T세포를 수확하여 수확된 형질도입 T세포 세트를 생성하는 단계를 포함한다.
임의의 다른 실시예와 조합될 수 있는 방법의 다양한 실시예에서, 형질도입은 생존 세포 계수를 위해 활성화된 T세포 세트의 샘플을 수득하는 단계; 회전 접종(spinoculation)을 위한 활성화된 T세포 세트를 준비하는 단계; 활성화된 T세포 세트를 재조합 바이러스 벡터와 접촉시키고 활성화된 T세포 세트에 원심력을 가함으로써 활성화된 T세포 세트를 회전 접종하는 단계; 및 형질도입 후 포유동물 세포 인큐베이터에서 활성화된 T세포 세트를 배양 및/또는 접종하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 단계 중 임의의 하나 이상, 예를 들어, 생존 세포 계수를 위해 활성화된 T세포 세트의 샘플을 자동으로 얻는 단계; 회전 접종을 위해 활성화된 T세포 세트를 자동으로 준비하는 단계; 활성화된 T세포 세트를 재조합 바이러스 벡터와 접촉시키고 활성화된 T세포 세트에 원심력을 가함으로써 활성화된 T세포 세트를 자동으로 회전 접종하는 단계; 및 형질도입 후 포유동물 세포 인큐베이터에서 활성화된 T세포 세트를 자동으로 배양 및/또는 접종하는 단계가 자동으로 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 활성화된 T세포 세트의 형질도입을 위한 시약 및 실험기구로 작업대를 설정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 접종하는 단계는 생존 세포 계수를 위해 형질도입한 후 활성화된 T세포 세트의 샘플을 수득하는 단계; 및 활성화된 T세포 세트를 확장 플레이트에 자동으로 옮기고 활성화된 T세포 세트를 포함하는 확장 플레이트를 포유동물 세포 인큐베이터에 배치함으로써 활성화된 T세포 세트를 접종하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 단계 중 임의의 하나 이상이 자동으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 생존 세포 계수를 위해 형질도입한 후 활성화된 T세포 세트의 샘플을 자동으로 얻는 단계가 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 활성화된 T세포 세트를 접종하기 위한 실험기구 및 시약으로 작업대를 설정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 확장은 생존 세포 계수를 위해 형질도입된 T세포 세트의 샘플을 수득하는 단계; 및 모의 관류/세포 배양 배지 교환을 수행한다. 일부 실시예에서, 상기 단계 중 임의의 하나 이상이 자동으로 수행될 수 있다. 예를 들어 모의 관류/세포 배양 배지 교환을 자동으로 수행할 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 형질도입된 T세포 세트를 확장하기 위한 시약 및 실험기구로 작업대를 설정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 탈염은 생존 세포 계수를 위한 탈염 단계 이전에 샘플을 수득하는 단계; 자기장을 적용하여 형질도입된 T세포 세트를 디비딩(debeading)하는 단계; 및 선택적으로, 생존 세포 계수를 위한 탈염 단계 후에 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 단계 중 임의의 하나 이상이 자동으로 수행될 수 있다. 예를 들면: 생존 세포 계수를 위한 디비딩 단계 이전에 샘플을 자동으로 얻는 단계; 자기장을 적용하여 형질도입된 T세포 세트를 자동으로 디비딩하는 단계; 및 선택적으로, 생존 세포 카운팅을 위한 디비딩 단계 후에 샘플을 자동으로 얻는 단계가 수행될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 디비딩을 위한 실험기구 및 시약으로 작업대를 설정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 수확은 형질도입된 T세포 세트를 동결보존 배지를 구비한 동결 바이알에 배치하는 단계; 및 액체 질소 탱크에 동결 바이알을 배치하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 형질도입된 T세포를 동결보존하기 위한 실험기구 및 시약으로 작업대를 설정하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 상기 T세포는 CD4+ T세포를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 상기 T세포는 CD8+ T세포를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 상기 T세포는 CD4+ T세포 및 CD8+ T세포를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 이종 재조합 단백질은 재조합 수용체를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 재조합 수용체는 질병, 장애 또는 상태의 세포 또는 조직과 연관되거나, 특이적이거나, 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 질병, 장애 또는 상태는 전염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암이다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 표적 항원은 종양 항원이다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 재조합 수용체는 기능적 비-T세포 수용체(TCR) 항원 수용체 또는 TCR 또는 이의 항원 결합 단편이거나 이를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, T세포는 한 명 이상의 공여자로부터 얻은 1차 T세포를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 한 명 이상의 공여자는 인간 대상체이다.
개시된 방법과 관련하여, 활성화된 T세포의 바이러스 감염을 촉진하는 조건 하에 활성화된 T세포를 재조합 바이러스 벡터와 접촉시킴으로써 활성화된 T세포 세트를 형질도입하는 것을 참조한다. 그러나, 개시된 방법은 이종 재조합 단백질을 코딩하는 핵산의 비-바이러스 혼입 방법을 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 활성화된 T세포 세트로의 핵산 혼입을 위한 비바이러스 방법론의 예는 전기천공, 시약 기반 형질감염, 세포 압축 또는 압착을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 핵산의 비-바이러스 혼입은 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고, 예를 들어 자동 전기천공, 자동 시약 기반 형질감염, 자동 세포 압축, 자동 압착 등에 의해 자동으로 수행될 수 있는 것으로 고려된다.
따라서, 다양한 실시예에서, 본원에 개시된 바와 같은 T세포 부피 축소 처리를 위한 자동화된 방법은: 한 명 이상의 공여자(예를 들어, 한 명 이상의 인간 공여자)로부터 수득된 입력 T세포 세트를 하나 이상의 활성화 시약과 자동으로 접촉시킴으로써 입력 T세포 세트를 활성화하여 한 세트의 활성화된 T세포를 생성하는 단계; 재조합 폴리뉴클레오티드의 활성화된 T세포 세트 내로의 혼입을 촉진하는 조건 하에 활성화된 T세포 세트를 재조합 폴리뉴클레오티드와 접촉시켜 변형된 T세포 세트를 생성하도록 활성화된 T세포 세트를 변형시키는 단계로서, 여기서 재조합 폴리뉴클레오티드는 이종 재조합 단백질을 코딩하는 핵산; 확장 배지에서 변형된 T세포 세트를 확장하는 단계; 확장 배지로부터 변형된 T세포 세트를 회수하는 단계; 및 변형된 T세포의 수확된 세트를 생성하기 위해 변형된 T세포 세트를 자동으로 동결보존함으로써 변형된 T세포 세트를 수확하는 단계를 포함한다. 재조합 폴리뉴클레오티드의 활성화된 T세포 세트 내로의 혼입을 촉진하는 조건 하에 활성화된 T세포 세트를 재조합 폴리뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 변형된 T세포 세트를 생성하도록 활성화된 T세포 세트를 변형시키는 단계로서, 여기서 상기 재조합체 폴리뉴클레오티드는 이종 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 단계; 확장 배지에서 변형된 T세포 세트를 확장하는 단계; 확장 배지에서 변형된 T세포 세트를 회수하는 단계; 및 변형 T세포 세트를 자동으로 동결보존하여 변형 T세포 세트를 수확하여 변형 T세포 세트를 생성하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 활성화된 T세포 세트를 생성하기 위해 활성화된 T세포 세트를 변형시키는 단계는 형질도입, 전기천공, 시약 기반 형질감염, 세포 압축 또는 압착 중 적어도 하나를 통해 재조합 폴리뉴클레오티드를 혼입하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 다양한 실시예에서, 입력 T세포 세트 활성화, 활성화된 T세포 세트 수정, 변형 T세포 세트 확장, 변형 T세포 세트 복구 및 변형 T세포 세트 수확 중 하나 이상이 운영자 개입 없이 자동으로 수행된다.
예를 들어, 방법의 일부 실시예에서, 상기 방법은 형질도입, 전기천공, 시약-기반 형질감염, 세포 압축 또는 압착을 위한 하나 이상의 실험기구 및/또는 시약으로 작업대를 설정하여 재조합체를 혼입하는 단계를 추가로 포함한다. 폴리뉴클레오티드를 활성화된 T세포 세트에 넣는다. 작업 테이블의 설정은 일부 예에서 자동으로, 또는 적어도 부분적으로 자동으로 수행될 수 있다.
상기 방법의 일부 예에서, 상기 방법은 변형된 T세포 세트를 접종 및/또는 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 변형된 T세포 세트는 자동으로 접종 및/또는 배양 배지로 옮겨질 수 있다. 상기 방법은 변형된 T세포 세트를 확장 배지에 자동으로 전달함으로써 변형된 T세포 세트를 확장하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 방법은 접종 및/또는 확장 절차를 위한 작업대를 설정하는 것을 포함할 수 있다. 접종 및/또는 확장 절차를 위한 작업대를 설정하는 것은 일부 예에서 자동으로, 또는 적어도 부분적으로 자동으로 수행될 수 있다.
상기 방법의 일부 예에서, 상기 방법은 디비딩(debeading) 단계를 포함한다. 상기 디비딩 단계는 생존 세포 계수를 위한 디비딩 단계 이전에 샘플을 얻는 것을 포함할 수 있으며, 세포 계수에 기초하여 비드가 끌리거나 반응하는 경우 자기장의 적용에 의해 변형된 T세포 세트에서 디비딩할 수 있다. 일부 예에서, 샘플은 생존 세포 계수 절차를 위한 디비딩 후에 얻어진다. 샘플링 및/또는 디비딩 단계는 일부 예에서 자동으로 또는 적어도 부분적으로 자동으로 수행될 수 있다. 일부 예에서 작업 테이블은 디비딩 및/또는 세포 카운팅/샘플링 단계를 위해 설정되고, 작업 테이블 설정은 예에서 자동으로 또는 적어도 부분적으로 자동으로 수행된다.
상기 방법의 일부 예에서, 상기 방법은 변형된 T세포 세트를 회수 및/또는 수확하기 위한 실험기구 및/또는 시약으로 작업대를 설정하는 것을 포함한다. 변형된 T세포 세트를 회수 및/또는 수확하기 위한 작업대의 설정은 일부 예에서 자동으로, 또는 적어도 부분적으로 자동으로 수행될 수 있다. 일부 예에서, 변형된 T세포 세트를 수확하는 것은 변형된 T세포 세트를 동결보존 배지를 구비한 동결 바이알에 넣는 것을 포함한다. 일부 예에서, 변형된 T세포 세트를 수확하는 단계는 일부 예에서 액체 질소 탱크에 동결 바이알을 배치하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 방법의 일부 예에서, 입력 T세포 세트에는 CD4+ T세포가 포함된다.
상기 방법의 일부 예에서, 입력 T세포 세트에는 CD8+ T세포가 포함된다.
일부 예에서, 상기 T세포는 CD4+ T세포 및 CD8+ T세포를 포함한다.
상기 방법의 일부 예에서, 상기 이종 재조합 단백질은 재조합 수용체를 포함한다. 일 예로서, 상기 재조합 수용체는 연관된 질병, 장애 또는 상태의 세포 또는 조직과 연관되고/되거나 이에 특이적이고/거나 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다. 예를 들어, 질병, 장애 또는 상태는 감염성 질병 또는 장애, 자가면역 질병, 염증성 질병, 종양 또는 암 중 하나 이상일 수 있다. 예시들에서, 표적 항원은 종양 항원이다. 일부 예에서, 상기 재조합 수용체는 기능적 비-T세포 항원 수용체, 또는 T세포 수용체의 항원-결합 단편이다. 일부 예에서, 상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
본 개시의 다른 측면은 T세포 부피 축소(scale down) 제조를 위한 다중 자동화 시스템이다. 상기 시스템은 일부 실시예에서 자동화 액체 취급 시스템, 및 자동화 액체 취급 시스템과 통신하는 제어 시스템을 포함하며, 이 제어 시스템은 T세포 세트를 활성화하는 단계; 상기 T세포 세트를 예를 들어 형질도입함으로써 변형하는 단계; 상기 T세포 세트를 디비딩하는 단계; T세포 세트를 접종하는 단계; 상기 T세포 세트를 확장하는 단계; 및 상기 T세포 세트를 수확하는 단계의 단위 프로세스를 수행하도록 자동화 액체 취급 시스템을 제어하도록 프로그래밍된 하나 이상의 프로세서를 포함한다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 자동화 액체 취급 시스템은 액체를 독립적인 다중채널 피펫 형식으로 전달하도록 구성된 가요성 채널 액체 조작 모듈을 포함하되, 각 피펫은 독립적으로 작동하도록 구성된다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 가요성 채널 액체 조작 모듈은 액체 등급의 결정을 기반으로 약 0.5-5000 μL 사이의 유체 부피를 정확하게 조작하도록 구성된다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 가요성 채널 액체 조작 모듈은 멸균 배양을 제공하기 위해 일회용 팁을 사용하도록 구성된다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 가요성 채널 액체 조작 모듈은 액체 변위 가요성 채널 아암이다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 자동화 액체 취급 시스템은 액체를 다중채널 피펫 형식으로 전달하도록 구성된 정적 다중채널 액체 조작 모듈로 구성된다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 정적 다중채널 액체 조작 모듈은 다중채널 아암이다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 자동화 액체 취급 시스템은 호환 가능 가능한 그리퍼 구성이 있는 용기 조작 모듈을 포함한다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 호환 가능 가능한 그리퍼 구성은 실험실 산물의 수평 접근 및 운송을 위해 구성된 편심 핑거; 실험실 산물에 수직으로 접근할 수 있도록 구성된 중심 핑거; 및 튜브형 실험기구의 운송을 위해 구성된 튜브 핑거를 포함한다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 용기 조작 모듈은 긴 z축 로봇 그리퍼 아암이다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 자동화 액체 취급 시스템은 활성화, 형질도입, 접종, 확장, 디비딩 및 수확 단위 작업을 위해 독립적으로 구성 가능한 작업대를 포함한다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 자동화 액체 취급 시스템은 온도 제어 로봇 원심 분리기를 포함한다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 자동화 액체 취급 시스템은 둥근 실험기구를 잡고 쥐도록 구성된 바이알 그리퍼 모듈을 포함한다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 자동화 액체 취급 시스템은 생존 가능한 세포 수 측정을 수행하도록 구성된 자동화된 세포 계수 모듈을 포함한다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 자동화 액체 취급 시스템은 저온 바이알을 유지하도록 구성된 휴대용 저온 냉각 챔버/캡 홀더를 포함한다.
상기 시스템의 다양한 실시예에서, 상기 자동화 액체 취급 시스템은 멸균 환경을 제공한다.
일부 실시예에서, 상기 시스템은 포유동물 세포 인큐베이터를 추가로 포함한다.
상기 시스템은 본 명세서에 개시된 임의의 방법을 수행하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
다양한 조건 및 유전자 조작된 T 세포를 테스트하는 보다 효율적인 방법을 제공하는 것을 포함하여 이러한 세포 요법을 제조 및/또는 조작하기 위한 개선된 방법을 제공한다.
실시예는 첨부 도면 및 첨부된 청구범위와 함께 다음의 상세한 설명에 의해 용이하게 이해될 것이다. 실시예는 첨부 도면의 도면에서 제한이 아니라 예로서 도시된다.
도 1은 본원에 개시된 실시예에 따른 자동화된 다중 포유동물 세포 배양 시스템의 개략 블록도이다.
도 2는 액체 변위 가요성 채널 아암(FCA)의 개략도이다.
도 3은 다중채널 아암(MCA)의 개략도이다.
도 4a는 96채널 어댑터의 상부면의 디지털 이미지이다.
도 4b는 도 4a에 도시된 96채널 어댑터의 바닥면의 디지털 이미지이다.
도 5는 로봇 그리퍼 아암 롱(RGA)의 개략도이다.
도 6은 도 5에 도시된 로봇 그리퍼 아암 롱(RGA)에 대한 편심 핑거의 개략도이다.
도 7은 도 5에 도시된 로봇 그리퍼 아암 롱(RGA)에 대한 중심 핑거의 개략도이다.
도 8은 도 5에 도시된 로봇 그리퍼 아암 롱(RGA)용 튜브 핑거의 개략도이다.
도 9는 도 2에 도시된 FCA에 대한 주사기 구성의 디지털 이미지이다
도 10은 7mm 마이크로플레이트 네스트 세그먼트 및 7mm 네스트의 개략도이다.
도 11은 100mL 시약통의 개략도이다.
도 12는 50mL 원뿔형 튜브 러너의 개략도이다.
도 13은 6개소 호텔(105)의 개략도이다.
도 14는 로봇 원심분리기의 개략도이다.
도 15는 명명된 구성요소의 구성을 도시하는 작업대(60)의 개략도이다.
도 16은 도 2, 도3, 및 도5에 각각 도시된 FCA, MCA, 및 RGA의 구성을 도시하는 액체 취급 시스템의 개략도이다.
도 17은 특정 실시예에 따른 T세포 배양의 자동화된 방법에 대한 작업 흐름의 개략도이다.
다음의 상세한 설명은 본질적으로 단지 예시적인 것이며 주제의 실시예 또는 이러한 실시예의 적용 및 사용을 제한하도록 의도되지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "예시적인"이라는 단어는 "예시, 사례 또는 예시로 제공되는"을 의미한다. 본 명세서에서 예시적인 것으로 설명된 임의의 구현은 반드시 다른 구현보다 바람직하거나 유리한 것으로 해석되어서는 안 된다. 또한, 선행 기술 분야, 배경, 요약 또는 다음의 상세한 설명에 제시된 어떠한 명시적 또는 묵시적 이론에 얽매이려는 의도도 없다.
본 명세서는 "하나의 실시예" 또는 "일 실시예"에 대한 참조를 포함한다. "하나의 실시예에서" 또는 "일 실시예에서"라는 문구의 출현은 반드시 동일한 실시예를 지칭하는 것은 아니다. 특정 특징, 구조 또는 특성은 본 개시내용과 일치하는 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
용어. 다음 단락은 본 개시내용(첨부된 청구범위 포함)에서 발견되는 용어에 대한 예시적인 설명 및/또는 맥락을 제공한다.
"포함하는(Comprising)" - 이 용어는 개방형이다. 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 이 용어는 추가 구조 또는 단계를 금지하지 않는다."
"구성된(Configured To)" - 다양한 단위 또는 구성요소는 태스크 또는 태스크를 수행하도록 "구성된" 것으로 설명되거나 청구될 수 있다. 이러한 맥락에서, "구성된"은 단위/구성요소가 작동 중에 해당 작업 또는 작업을 수행하는 구조를 포함한다는 것을 표시함으로써 구조를 암시하는 데 사용된다. 이와 같이 단위/구성요소는 지정된 단위/구성요소가 현재 작동하지 않는 경우에도(예: 켜져 있지 않음/활성화되지 않음) 작업을 수행하도록 구성되었다고 말할 수 있다. 장치/회로/구성 요소가 하나 이상의 작업을 수행하도록 "구성"되어 있다고 언급하는 것은 해당 단위/구성 요소에 대하여 35 U.S.C. §112 제6단락이 인용되지 않도록 분명하게 의도된 것이다.
"제1," "제2," 등 - 본 명세서에 사용된 바와 같이, 이러한 용어는 앞에 오는 명사에 대한 레이블로 사용되며 임의의 유형의 순서(예: 공간, 시간, 논리 등)를 의미하지 않는다.
"결합된(Coupled)" - 다음 설명은 함께 "결합"되는 요소 또는 노드 또는 기능을 나타낸다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, "결합된"은 하나의 요소/노드/피처가 다른 요소/노드/피처에 직접 또는 간접적으로 연결(또는 직접 또는 간접적으로 통신)하는 것을 의미하며 반드시 기계적으로 연결되는 것은 아니다.
또한, 특정 용어는 참조의 목적으로만 하기 설명에서 사용될 수 있으며, 따라서 제한하려는 의도가 아니다. 예를 들어, "위", "아래", "위", "아래", "앞" 및 "뒤"와 같은 용어는 참조되는 도면의 방향을 나타낸다. "전면", "후면", "후면", "측면", "외부", "내측", "좌측" 및 "우측"과 같은 용어는 논의 중인 구성 요소를 설명하는 텍스트 및 관련 도면을 참조하여 명확해지는 것으로 일관되지만 임의적인 참조 프레임 내에서 구성 요소 부분의 방향 및/또는 위치를 설명하거나 구성 요소 간의 상대적 방향 및/또는 위치를 설명한다. 이러한 용어에는 위에서 구체적으로 언급된 단어, 그 파생어 및 유사한 의미의 단어가 포함될 수 있다.
다음 설명에서, 본 개시내용의 실시예의 완전한 이해를 제공하기 위해 특정 동작과 같은 다수의 특정 세부사항이 설명된다. 본 개시내용의 실시예가 이러한 특정 세부사항 없이 실시될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 다른 예들에서, 잘 알려진 기술들은 본 개시의 실시예들을 불필요하게 모호하게 하지 않기 위해 상세하게 설명하지는 않는다. 여기에 사용된 섹션 제목은 구성적 목적만을 위한 것이며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도입
세포 요법에 사용하기 위해 유전자 조작된 T세포, 예컨대 CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포를 생산하는 것은 다수의 변수를 포함하는 다단계 과정이다. 예를 들어, 유전적으로 조작된 T세포를 생산하기 위해, 세포는 자극 조건 하에 배양되고, 형질도입을 통해 세포에 재조합 폴리펩티드가 도입되고, 증식 및/또는 확장을 촉진하는 조건 하에 세포가 배양된다. 이러한 각 프로세스는 테스트 조건과 사용자/운영자 모두에서 다양할 수 있다. 또한 현재 T세포 부피 축소 테스트는 자원이 있는 운영자의 수와 운영자가 주어진 시간에 수행할 수 있는 최대 조건 수에 의해 제한될 수 있다. 테스트는 또한 작업자 취급 및 부정확한 피펫팅으로 인해 변동성과 불일치에 노출될 수 있다. 이러한 가변성은 결과의 불일치로 이어질 수 있다. 사용자/운영자 입력과 관련된 불일치를 줄이고 발달 처리량을 높이려면 자동화된 부피 축소 T세포 배양 플랫폼이 필요하다. 자동화된 부피 축소 플랫폼은 표준화된 T세포 배양 플랫폼을 제공하고 부피 축소 실험의 일관성을 개선한다. 이 플랫폼은 원자재 검증과 같은 일상적인 테스트나 미디어 개발과 같은 복잡한 작업에 유용하다. 추가 방법을 작성하여 배지 및 배양 보충 화면 및 대규모 실험 설계(DoE) 실험 설계와 같은 작업을 수행할 수 있다. 상기 요구를 충족시키기 위해, 본 발명자들은 유전자 조작된 치료 T세포의 개발을 용이하게 하기 위해 자동화된 벤치탑 세포 배양 시스템 및 이 시스템을 사용하는 방법을 개발하였다.
예시적인 시스템
도 1을 참조하면, 자동화된 T세포 부피 축소 모델 시스템으로 지칭될 수 있는 자동화된 세포 배양 시스템(10)이 본원에 개시되어 있다. 상기 시스템(10)은 컴퓨터 구현 제어 시스템과 같은 제어 시스템(20) 및 자동화된 액체 취급 시스템(30)을 포함한다. 도시된 바와 같이, 상기 제어 시스템(20) 및 액체 취급 시스템(30)은 네트워크(42)에 의해 연결된다. 시스템은 또한 선택적인 포유동물 세포 인큐베이터(35)를 포함할 수 있다. 네트워크(42)는 근거리 통신망(LAN) 또는 광역 통신망(WAN)을 포함하는 임의의 네트워크일 수 있거나, 외부 컴퓨팅 장치에 대한 연결이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 인터넷 서비스 제공자를 사용하는 인터넷을 통해, 또는 무선 네트워크를 통해, 또는 직접적인 연결, 예를 들어 시스템(10)의 통합 구성요소로서 연결될 수 있다. 상기 제어 시스템(20)은 자동 액체 취급 시스템(30)의 다양한 모듈을 제어한다. 특정 실시예에서, 자동화된 액체 취급 시스템(30)은 예를 들어, 무균 세포 배양 작업을 위한 무균 환경을 포함하고, 필터 및/또는 오염을 방지하기 위한 긍정적 환기를 갖는 하우징, 예를 들어 후드 또는 캐비넷에 포함될 수 있다. 상기 액체 취급 시스템(30)은 T세포, 예를 들어 CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포와 같은 관심 포유동물 세포를 포함할 수 있는 액체, 액체 및 액체를 포함하는 용기의 조작을 위한 다중 모듈로 구성된다.
실시예들에서, 상기 액체 취급 시스템(30)은 액체 변위 가요성 채널 아암(예를 들어, 도 2 참조)과 같은 가요성 채널 액체 조작 모듈(40)을 포함한다. 실시예들에서, 가요성 채널 액체 조작 모듈(40)은 포유동물 세포를 함유하는 액체와 같은 액체를 하나의 용기에서 다른 용기, 예를 들어 편평하거나 둥근 바닥 플레이트, 원추형 튜브와 같은 튜브 등으로 이송하도록 구성된다. 각 피펫팅 채널이 독립적으로 작동할 수 있고 따라서 모듈 40이 다른 부피의 액체를 동시에 전달할 수 있기 때문에 이 아암을 "가요성(유연한)"이라고 한다. 실시예들에서, 상기 가요성 액체 조작 모듈(40)은 T세포(예: CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포)와 같은 포유동물 세포를 포함하는 액체의 다른 샘플과 같은 샘플을 별도로 조작하는 다중 개별 피펫팅 채널이 있다는 점에서 멀티플렉스이다. 특정 실시예들에서, 채널 또는 채널의 하위 집합은 독립적으로 작동할 수 있다. 예를 들어, 상기 제어 시스템(20)은 채널 또는 채널의 서브세트를 독립적으로 작동하도록 프로그래밍될 수 있다. 실시예들에서, 각 피펫팅 채널은 독립적으로 작동하고 가요성 액체 조작 모듈(40)은 다른 부피의 액체를 동시에 전달할 수 있다. 실시예들에서, 가요성 액체 조작 모듈(40)은 약 2 내지 196개 이상의 채널을 갖는다. 실시예들에서, 가요성 액체 조작 모듈(40)은 액체 이동을 위해 액체 변위 기술을 사용한다. 실시예들에서, 액체 전달은 희석기 주사기 피스톤에 의해 생성된 압력 차이에 의해 수행된다. 예를 들어, 피스톤을 아래로 움직이면 음압 차이가 발생하여 피펫 끝단에서 액체를 흡입할 수 있으며, 피스톤을 위로 움직이면 양압 차이가 생성되어 피펫 끝에서 액체를 분배할 수 있다. 특정 실시예들에서, 피펫의 팁(액체와 접촉하는 피펫의 부분)은 멸균 배양을 제공하기 위해 일회용 팁(DiTi)을 사용한다. 다른 실시예에서, 팁은 고정되지만 예를 들어 UV 광, 또는 다른 화학적 또는 방사선 처리로 멸균된다. DiTi 구성은 약 0.5mL와 약 5mL 사이, 예를 들어 약 1.25mL와 약 5mL 사이, 예를 들어 1.25mL 주사기 및 5mL 주사기의 사용을 가능하게 한다. 실시예들에서, 개별 피펫 채널은 약 0.5-5000 μL 사이의 유체 부피를 정확하게 조작할 수 있다(이하의 액체 등급 결정 부문 참조). DiTi 유형은 T세포 배양과 관련하여 아래에 설명된 것과 같이 세포 배양 방법 내에서 직접 교환될 수도 있다. 특정 실시예에서, 상기 액체 취급 시스템(30)은 액체 변위 가요성 채널 아암(FCA)을 사용한다(예를 들어, 도 2 참조). 도 1에 도시된 구현에서. 2 액체 FCA는 액체 이동을 위해 액체 치환 기술을 활용하는 8개의 피펫팅 채널 시스템이다. 표준 FCA 주사기 구성에는 최대 1mL의 액체를 전송할 수 있는 8 x 1.25mL 주사기가 포함된다. 세포 배양 배지에 대한 대용량 이동에 대한 요구 사항 때문에 시스템의 주사기 구성은 5mL 주사기를 허용하도록 개발되었다(도 9 참조). 도 9를 참조하면, 5mL 주사기는 나머지 6개의 1.25mL 주사기에 대한 입체 장애를 제한하기 위해 위치 1 및 8에 배치되었다. 또한 연속 1.25mL 주사기를 사용하면 방법 스크립팅을 축소하는 데 매우 유용하다. 전반적으로 1.25/5mL 주사기 구성은 대용량 전송을 가능하게 하지만 분석법 스크립팅 및 개발을 위한 유연성을 제공하다.
실시예들에서, 상기 액체 취급 시스템(30)은 선택적으로 가요성 채널 액체 조작 모듈(40) 외에 다중 채널 아암(MCA)(도 3 참조)과 같은 정적 다중 채널 액체 조작 모듈(45)을 포함한다. 정적 다중 채널 액체 조작 모듈(45)은 다른 부피의 액체를 동시에 차등적으로 전달할 수 없다는 점에서 "정적(static)”이다. 정적 다중 채널 액체 조작 모듈(45)은 액체의 양이 채널 전체에서 동일할 때 사용할 수 있다. 일반적으로, 정적 다중채널 액체 조작 모듈(45)은 96 또는 384 채널 형식과 같은 다중웰 형식으로 액체를 전달하는 데 사용된다. 실시예들에서, 정적 다중 채널 액체 조작 모듈(45)은 각 실린더 내의 압력 차이에 따라 흡인 및 분배 단계를 수행하는 384개의 플런저가 있는 공기 치환 시스템이다. 그러나, 가요성 채널 액체 조작 모듈(40)과 달리, 정적 다중 채널 액체 조작 모듈(45) 플런저는 동시에 이동하므로 다른 부피의 액체를 동시에 차등적으로 전달할 수 없다. 정적 다채널 액체 조작 모듈(45)은 여러 어댑터 유형과 호환될 수 있다. 상기 시스템의 특정 예에서, 96 채널 어댑터는 정적 다중 채널 액체 조작 모듈(45)과 함께 사용된다(도 4A 및 4B 참조). 특정 실시예에서, 피펫의 팁(액체와 접촉하는 피펫의 부분)은 멸균 배양을 제공하기 위해 일회용 팁(DiTi)을 사용한다. 다른 실시예에서, 팁은 고정되지만 예를 들어 UV 광, 또는 다른 화학적 또는 방사선 처리로 멸균된다. 예를 들어, 시스템(10) 구성에 따라 DiTi 팁이 픽업되고 액체가 모든 96개의 DiTi와 함께, 12개의 DiTi의 처음 2개 행 또는 DiTi의 처음 4개 열과 함께 전송된다. 실시예들에서, 96 채널 어댑터는 DiTis(고정 팁과 반대)를 사용하며 0.5μL 내지 125μL 등과 같이 0.2μL 내지 250μL의 액체를 다중 전송할 수 있다.
실시예들에서, 상기 액체 취급 시스템(30)은 긴 z-축 로봇 그리퍼 아암(RGA)과 같은 용기 조작 모듈(50)을 포함할 수 있다(도 5 참조). 용기 조작 모듈(50)은 활동에 따라 용기의 상이한 형상 및 크기를 조작하기 위해 상이한 그리퍼 구성 또는 헤드와 함께 장착될 수 있다. 특정 실시예들에서, 상기 용기 조작 모듈(50)은 예를 들어 위에서 설명된 바와 같은 멸균 세포 배양 작업을 위해 멸균 환경에서 사용된다. 특정 실시예들에서, 상이한 그리퍼 구성 또는 헤드는 예를 들어 제어 시스템(20)의 제어 하에 시스템(10)에 의해 자동으로 변경될 수 있다. 그리퍼 구성에 기초하여, 용기 조작 모듈(50)은 작업대(60)와 그 하부 전체에 걸쳐 실험실 산물 영역의 수송을 허용한다. 실험 기구는 마이크로플레이트, 딥웰 플레이트, 원추형 튜브, DiTi 상자 등을 포함할 수 있다. 상기 용기 조작 모듈(50)은 보관 위치 및 장치로 및 그로부터 실험실웨어의 운송을 위해 사용될 수도 있다. 특정 실시예들에서, 긴 z축 로봇 그리퍼 아암(RGA)과 같이 용기 조작 모듈(50)은 x, y 및 z 방향으로 용기를 이동한다. 도 5에 도시된 바와 같이, 용기 조작 모듈(50)의 그리퍼 핑거는 360° 회전(R)할 수도 있을 뿐 아니라 개폐(G)도 가능하다.
특정 구성에서, 상기 용기 조작 모듈(50)은 편심 핑거(52)를 사용한다(예를 들어, 도 6 참조). 편심 핑거(52)는 실험실 산물 의 수평 접근 및 운송을 허용한다. 편심 핑거(52)는 표준 세포 배양(예: 6웰 및 24웰 플레이트) 및 샘플링 플레이트(예: 1.0mL 딥 웰 플레이트, 96 플랫/라운드 플레이트)의 운반을 가능하게 한다. 편심 핑거(52)는 호텔(105) 액세스 및 로딩(아래에서 논의됨)을 추가적으로 허용한다.
특정 구성에서, 상기 용기 조작 모듈(50)은 중심 핑거(54)를 사용한다(예를 들어, 도 7 참조). 중심 핑거(54)는 랩웨어에 수직으로 접근할 수 있고 수평 접근이 제한된 사이트에 접근하는 데 사용된다. 중심 핑거(54)는 모든 딥웰 세포 배양 플레이트(원심분리기 및 확장 플레이트) 및 작업대(60) 이하 주변의 원심분리기 구성요소의 운송을 허용한다.
특정 구성에서, 상기 용기 조작 모듈(50)은 튜브 핑거(56)를 사용한다(도 8 참조). 튜브 핑거(56)는 튜브형 실험기구의 운송에 사용된다. 튜브 핑거(56)는 또한 동결 바이알(활성화 및 수확 단위 작업 참조) 및 50mL 원뿔형 튜브(활성화 단위 작업 참조)의 캡핑 및 디캡핑에 사용될 수 있다.
다시 도 1을 참조하면, 위에서 논의된 모듈에 더하여, 액체 취급 시스템(30)은 아래 방법에 설명된 현재 부피 축소 응용을 가능하게 하도록 구성된 구성요소를 갖는 작업대(60)를 포함한다. 이러한 응용 프로그램에는 T세포에 대한 활성화, 형질도입, 접종, 확장, 디비딩(debeading) 및 수확 단위 작업이 포함된다. 데크 세그먼트(85), 네스트 유형(도 10 참조), 통 러너, 튜브 러너, 호텔(105), 맞춤형 랩웨어 및 통합 장치는 서로 다른 단위 작업 간에 상당한 작업대(60) 수정 없이 각 단위 작업의 최대 처리를 가능하게 하도록 구성된다. 작업대(60) 단위 운영 방식의 레이아웃은 네스트 사이트와 호텔(105)을 사용하여 실험 기구의 사용량을 최대화함으로써 각 단위 작업에서 수행되는 조건의 수를 최대화함으로써 시스템(10)의 다중화 능력을 크게 향상시킨다.
실시예들에서, 데크 세그먼트(85)는 기구 사용자의 구성에 따라 작업대(60) 상에 위치될 수 있는 데크 구성요소이다(예를 들어, 도 10 참조). 데크는 실험기구를 보관하는 데 사용되는 85개의 네스트를 분할한다. 실시예들에서, 작업대(60)는 25x7mm 네스트로 장식되어 있어 마이크로플레이트와 딥웰 플레이트를 모두 사용할 수 있다.
실시예들에서, 액체 취급 시스템(30)은 320mL 시약통 러너와 같은 통 러너(90)를 포함한다. 320mL 시약통 러너는 3개의 320mL 시약통을 수용하는 2개소 그리드 세그먼트이다. 320mL 통은 최대 256mL의 액체를 담을 수 있으며 세포 배양 배지와 같은 대용량 시약을 담기 위해 선택할 수 있다.
실시예들에서, 상기 액체 취급 시스템(30)은 100mL 시약통(도 11 참조)과 같은 시약통(95)를 포함한다. 100mL 시약통에는 100mL 시약통 3개가 있다. 100mL는 최대 80mL의 액체를 담을 수 있으며 동결보존 배지 및 세포 생존율 측정 시약, 예를 들어 Guava Viacount 시약과 같은 대용량 시약을 담기 위해 선택되었다.
실시예들에서, 액체 취급 시스템(30)은 50mL 원뿔형 튜브 러너(도 12 참조)와 같은 원뿔형 튜브 러너(100)를 포함한다. 일 예에서, 50mL 원뿔형 튜브 러너는 10 x 50mL 원뿔형 튜브를 보유하는 2-자리 그리드 세그먼트이다. 자동화된 부피 축소 방법 내에서 50mL 원뿔형 튜브는 대용량 세포 혼합물, 즉 활성화 단위 작업에 사용되며, 이로써 세포는 신선한 세포 배양 배지로 세척되고 원심분리된다.
실시예들에서, 액체 취급 시스템(30)은 호텔(105)을 포함한다(도 13 참조). 호텔(105)은 판형 실험기구의 보관에 활용된다. 실시예들에서, 호텔(105)은 2 내지 10개의 자리를 갖는다. 다중 호텔(105)은 자리의 수를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이를 통해 작업대(60) 공간을 최대화할 수 있다. 실험실 산물은 사용할 때까지 호텔(105)에 보관할 수 있으며 필요할 때 용기 조작 모듈(50) 편심 핑거(52)를 통해 작업대(60)로 옮길 수 있다. 특정 실시예들에서, 6개소 호텔(105)이 다양한 실험 기구 세트를 보유할 수 있는 능력으로 인해 선택되었다. 자동화된 부피 축소 프로세스 내에서 하나 이상의 24-평면 웰 플레이트, 6-웰 플레이트, 96-딥웰 플레이트, 96-평면 마이크로플레이트, 96-라운드 마이크로플레이트, 6mm 덮개, 9mm 플레이트 덮개, 금속 확장 덮개 등, 단위 작업을 위해 6개소 호텔(105) 내에 저장될 수 있다. 본 개시의 범위를 벗어나지 않으면서 추가 또는 대안적인 실험기구가 호텔(105) 내에 저장될 수 있음을 이해할 수 있다.
실시예들에서, 액체 취급 시스템(30)은 로봇 원심분리기(65)를 포함한다(예를 들어, 도 14 참조). 특정 실시예들에서, 로봇 원심분리기(65)는 온도 제어된다. 특정 실시예에서, 로봇 원심분리기(65)는 예를 들어 회전자 위치를 감지하고 제어하기 위해 제어 시스템(20)으로 컴퓨터로 제어되어, 예를 들어 튜브 및/또는 플레이트가 로봇 원심분리기(65)에 쉽게 조작, 배치 및/또는 제거될 수 있도록 한다. 특정 실시예들에서, 로봇 원심분리기(65)는 유연성을 제공하기 위해 하나 이상의 용기를 삽입하기 위한 약 2개 내지 약 8개의 자리를 갖는다. 특정 실시예들에서, 로봇 원심분리기(65)는 컴퓨터 제어 로터 위치 지정으로 온도가 제어되는 4-자리 로봇 원심분리기이다. 특정 실시예들에서, 로봇 원심분리기(65)는 데크 아래 기능(예: 수직 대 수평 접근)이 있다. 이하에서 개시되는 자동화된 T세포 배양 방법에서, 긴 z-축 로봇 그리퍼 아암(RGA)과 같은 용기 조작 모듈(50)은 중심 핑거(54)에 의해 실험기구를 픽업한 다음, 실험실 기구를 로봇 원심분리기(65)에 탑 로딩 자동화 도어를 통하여 수직으로 옮긴다. 로봇 원심분리기(65)의 작동을 포함하는 이러한 조작은 예를 들어 사용자 입력, 또는 로봇 원심분리기(65) 및 용기 조작 모듈(50)을 작동하기 위한 명령이 포함된 기존 프로그램 파일에 기초하여 제어 시스템(20)에 의해 제어될 수 있다.
실시예들에서, 상기 액체 취급 시스템(30)은 바이알 그리퍼 모듈(70)을 포함한다. 실시예들에서, 바이알 그리퍼 모듈 70은 원추형 튜브와 같은 튜브의 캡핑 및 디캡핑을 가능하게 하는 공압 장치이다. 여기에는 표준 15mL 및 50mL 튜브 크기가 포함될 수 있다. 원추형 튜브 캡핑/디캐핑은 아래에 설명된 방법과 같은 튜브 원심분리 단계에서 수행된다. 튜브 핑거(56)를 사용하여 용기 조작 모듈(50)은 원뿔형 튜브를 바이알 그리퍼 모듈(70)로 옮기고, 압력 변화에 따라 바이알 그리퍼 모듈(70)은 튜브를 파지한다. 그런 다음 용기 조작 모듈(50)은 튜브의 캡을 집어서 원추형 튜브 위에 놓고 튜브를 덮는다. 마지막으로, 용기 조작 모듈(50)은 로봇 원심분리기(65)에서 원심분리를 위한 원심분리기 튜브 어댑터로 튜브를 전달한다. 원심분리 후, 튜브는 캡핑을 위해 바이알 그리퍼 모듈(70)로 다시 반환된다. 아래 방법에서 바이알 그리퍼 모듈 70은 활성화 장치 프로세스의 튜브 원심분리 단계에 사용된다. 바이알 그리퍼 모듈(70)의 작동을 포함하는 이러한 조작은 예를 들어 사용자 입력에 기초하여 제어 시스템(20)에 의해, 또는 바이알 그리퍼 모듈(70) 및 로봇 원심분리기(65) 및 용기 조작 모듈 (50)를 작동하기 위한 지침이 있는 기존 프로그램 파일에 의해 제어될 수 있다.
실시예들에서, 액체 취급 시스템(30)은 예를 들어 수동 세포 생존율 판단을 제거하기 위해 세포 계수 모듈(75)을 선택적으로 포함한다. 특정 실시예들에서, 용기 조작 모듈(50)은 계수 플레이트를 세포 계수 모듈(75)에 직접 전달한다. 특정 실시예들에서, 세포 계수 모듈(75)은 생존 세포 계수(VCC) 측정값을 제어 시스템(20)으로 전송한다. 자동화된 VCC 측정은 작업자 상호 작용 없이 방법의 직접 전파를 허용한다.
실시예들에서, 액체 취급 시스템(30)은 휴대용 동결 냉각 챔버/캡 홀더(80)를 포함한다. 실시예들에서, 동결 바이알 냉각 챔버는 2mL 동결 바이알용 12-자리 홀더이다. 실시예에서 동결 냉각 챔버/캡 홀더(80)는 용기 조작 모듈(50) 튜브 핑거(56)로 캡핑 및 디캡핑 기능을 허용하도록 나사산이 있다. 동결 냉각 챔버/캡 홀더(80)는 사용 전에 냉동고에 배치될 수 있고 동결 바이알을 상기 방법의 기간동안 소스 온도로 유지시킨다. 동결 냉각 챔버/캡 홀더(80)는 유지 또는 일시 정지 단계 동안 온도 제어 원심분리기로의 가능한 운송을 허용하도록 휴대용일 수 있다. 캡 홀더는 맞춤형 장치일 수 있으며 캡핑 및 디캡핑 단계를 위해 2mL 동결 캡을 보관하는 데 사용할 수 있다.
실시예들에서, 액체 취급 시스템(30)은 50mL 튜브 원심분리기 어댑터(110)와 같은 휴대용 튜브 원심분리기 어댑터(110)를 포함한다. 50mL 튜브 원심분리기 어댑터(110)는 50mL 튜브의 원심분리를 가능하게 하는 맞춤형 원심분리기 버킷이다. 이 어댑터는 튜브 조작이 필요한 단계의 튜브 홀더로도 사용된다. 50mL 튜브 원심분리기 어댑터(110)는 용기 조작 모듈(50)을 사용하여 원심분리기 안팎으로 쉽게 운반할 수 있도록 휴대용으로 제작되었다. 작업대(60)에서 맞춤형 원심분리기 어댑터 네스트에 배치된다.
실시예들에서, 액체 취급 시스템(30)은 50mL 튜브 캡 홀더와 같은 튜브 캡 홀더(115)를 포함한다. 50mL 튜브 캡 홀더는 캡핑 및 디캡핑 단계를 위해 50mL 튜브 캡을 보관하는 데 사용되는 맞춤형 장치이다.
개시된 시스템 및 맞춤형 담체의 구현은 완전 자동화된 T세포 배양 플랫폼을 가능하게 한다. 이 플랫폼의 구현은 보다 일관된 실험을 가능하게 하여 실험에 도입된 운영자 기반 변동성을 줄인다. 인간 작업자와 비교하여 이 플랫폼은 수행된 실험의 수와 실험당 필요한 시간을 개선한다.
도시된 바와 같은 제어 시스템(20)은 하나 이상의 컴퓨팅 장치를 포함할 수 있다. 실시예들에서, 컴퓨팅 장치는 하나 이상의 프로세서 및 하나 이상의 통신 모듈과 같은 다수의 구성요소를 포함한다. 다양한 실시예에서, 하나 이상의 프로세서는 각각 하나 이상의 프로세서 코어를 포함한다. 다양한 실시예에서, 적어도 하나의 통신 모듈은 하나 이상의 프로세서에 물리적으로 및/또는 전기적으로 연결된다. 추가 구현에서, 통신 모듈은 하나 이상의 프로세서의 일부이다. 다양한 실시예에서, 컴퓨팅 디바이스는 인쇄 회로 기판(PCB)을 포함한다. 이들 실시예의 경우, 하나 이상의 프로세서 및 통신 모듈이 그 위에 배치된다. 응용 프로그램에 따라 컴퓨팅 장치는 PCB에 물리적으로 전기적으로 연결되거나 연결되지 않을 수 있는 다른 구성 요소를 포함한다. 이러한 다른 구성 요소에는 메모리 컨트롤러, 휘발성 메모리(예: 동적 랜덤 액세스 메모리(DRAM)(도시되지 않음)), 비휘발성 메모리(예: ROM), 플래시 메모리, I/O 포트, 디지털 신호 프로세서, 암호화 프로세서, 그래픽 프로세서, 하나 이상의 안테나, 디스플레이(예: 터치 스크린 디스플레이), 디스플레이 컨트롤러(예: 터치 스크린 디스플레이 컨트롤러), 배터리, 오디오 코덱, 비디오 코덱 및 대용량 저장 장치(예: 하드 디스크 드라이브, 솔리드 스테이트 드라이브, 컴팩트 디스크(CD), 디지털 다목적 디스크(DVD)) 등이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 프로세서는 하나 이상의 링크(예를 들어, 인터커넥트, 버스 등)를 통해 시스템 메모리에 작동 가능하게 연결된다. 실시예들에서, 시스템 메모리는 하나 이상의 프로세서가 프로그램 및 운영 체제를 작동하고 실행하는 데 사용하는 정보를 저장할 수 있다. 다른 실시예에서, 시스템 메모리는 동적 랜덤 액세스 메모리(DRAM)의 형태와 같은 임의의 사용 가능한 유형의 판독 및 기록 가능한 메모리이다. 실시예들에서, 컴퓨팅 디바이스는 컴퓨팅 디바이스 및/또는 주변 컴포넌트 또는 하나 이상의 사용자 인터페이스 또는 주변 컴포넌트 인터페이스를 통해 컴퓨팅 디바이스와 연관된 디바이스와의 사용자 상호작용을 가능하게 하기 위해 다양한 입력 및 출력/피드백 디바이스를 포함하거나 이와 연관되어 있다. 실시예들에서, 사용자 인터페이스는 물리적 키보드 또는 키패드, 터치패드, 디스플레이 장치(터치스크린 또는 비터치스크린), 스피커, 마이크, 이미지 센서, 햅틱 피드백 장치 및/또는 하나 이상의 액츄에이터 등을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 컴퓨팅 장치는 제거 가능한 스마트 칩 또는 보안 디지털("SD") 카드 내에 존재할 수 있거나 치과용 ex의 고정 칩 내에 내장될 수 있는 메모리 요소(미도시)를 포함할 수 있다. 특정 예시적인 실시예에서, 가입자 식별 구성요소("SIM") 카드가 사용될 수 있다. 다양한 실시예에서, 메모리 요소는 장치에 상주하는 소프트웨어 애플리케이션을 허용할 수 있다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 프로세서, 플래시 메모리, 및/또는 저장 장치는 하나 이상의 프로세서에 의한 프로그래밍 명령의 실행에 응답하여 컴퓨팅 장치가 본 개시내용의 실시형태에 따라, 본 명세서에 개시된 방법의 모든 또는 선택된 측면을 실행한다.
실시예들에서, 통신 모듈은 액체 조작 시스템(30) 및/또는 그 다양한 모듈과 같은 컴퓨팅 장치로 및 컴퓨팅 장치로부터 데이터를 전송하기 위한 유선 및/또는 무선 통신을 가능하게 한다. 다양한 실시예에서, 컴퓨팅 디바이스는 또한 송신기 및 수신기(또는 선택적으로 트랜시버)를 통해 및/또는 통신 포트를 사용하는 유선 연결을 통해 컴퓨팅 디바이스를 하나 이상의 네트워크 연결된 컴퓨팅 디바이스에 연결하도록 구성된 네트워크 인터페이스를 포함한다. 실시예들에서, 네트워크 인터페이스와 송신기/수신기 및/또는 통신 포트는 집합적으로 "통신 모듈"이라고 한다. 실시예들에서, 무선 송신기/수신기 및/또는 송수신기는 하나 이상의 무선 통신 표준에 따라 동작하도록 구성될 수 있다. "무선"이라는 용어와 그 파생어는 비고체 매질을 통해 변조된 전자기 복사를 사용하여 데이터를 전달할 수 있는 회로, 장치, 시스템, 방법, 기술, 통신 채널 등을 설명하는 데 사용될 수 있다. 이 용어는 연관된 장치가 어떤 와이어도 포함하지 않는다는 것을 의미하지 않지만 일부 실시예에서는 그렇지 않을 수 있다. 실시예들에서, 컴퓨팅 장치는 데이터를 송수신하기 위한 무선 통신 모듈, 예를 들어 통신 네트워크와 같은 네트워크로부터 데이터를 송수신하기 위한 무선 통신 모듈을 포함한다. 실시예들에서, 컴퓨팅 장치는 예를 들어 Bluetooth 및/또는 BLE 프로토콜, WiFi 프로토콜, IrDA(Infrared Data Association) 프로토콜, ANT 및/또는 ANT+ 프로토콜, LTE ProSe 표준 등을 사용하여 직접 무선 연결을 통해 하나 이상의 장치와 직접 연결된다. 실시예들에서, 통신 포트는 직렬 통신 프로토콜(예: USB(Universal Serial Bus), FireWire, 직렬 디지털 인터페이스(SDI) 및/또는 기타 유사한 직렬), 병렬 통신 프로토콜(예: IEEE 1284, CAMAC(Computer Automated Measurement And Control) 및/또는 기타 유사한 병렬 통신 프로토콜) 및/또는 네트워크 통신 프로토콜(예: 이더넷, 토큰 링, Fiber Distributed 데이터 인터페이스(FDDI) 및/또는 기타 유사한 네트워크 통신 프로토콜)과 같은 하나 이상의 알려진 유선 통신 프로토콜에 따라 작동하도록 구성된다.
실시예들에서, 컴퓨팅 장치는 하나 이상의 애플리케이션을 실행, 실행 또는 작동하도록 구성된다. 실시예들에서, 응용 프로그램에는 기본 응용 프로그램, 웹 응용 프로그램 및 하이브리드 응용 프로그램이 포함된다. 실시예들에서, 기본 애플리케이션은 플랫폼 또는 운영 체제(OS)에 따라 다르거나 특정하지 않다. 실시예들에서, 네이티브 애플리케이션은 플랫폼별 개발 도구, 프로그래밍 언어 등을 사용하여 특정 플랫폼용으로 개발된다. 이러한 플랫폼별 개발 도구 및/또는 프로그래밍 언어는 플랫폼 공급업체에서 제공한다. 실시예들에서, 네이티브 애플리케이션은 제조 중에 컴퓨팅 장치에 사전 설치되거나 네트워크를 통해 애플리케이션 서버에 의해 컴퓨팅 장치에 제공된다. 웹 애플리케이션은 서비스 제공자로부터 웹 애플리케이션을 요청하는 것에 대한 응답으로 컴퓨팅 장치의 웹 브라우저에 로드되는 애플리케이션이다. 실시예들에서, 웹 애플리케이션은 리소스 가용성, 디스플레이 크기, 터치 스크린 입력 등과 같은 다양한 컴퓨팅 장치 매개변수를 고려하여 컴퓨팅 장치에서 실행되도록 설계되거나 맞춤화된 웹사이트이다. 이러한 방식으로 웹 애플리케이션은 웹 브라우저 내의 기본 애플리케이션과 유사한 경험을 제공할 수 있다. 웹 애플리케이션은 PHP, Node.js, ASP.NET 및/또는 HTML을 렌더링하는 기타 유사한 기술과 같은 서버 측 개발 도구 및/또는 프로그래밍 언어로 개발된 서버 측 애플리케이션일 수 있다. 하이브리드 애플리케이션은 기본 애플리케이션과 웹 애플리케이션 간의 하이브리드일 수 있다. 하이브리드 애플리케이션은 독립 실행형, 스켈레톤 또는 애플리케이션 용기 내에서 웹사이트를 로딩할 수 있는 기타 유사한 애플리케이션 용기일 수 있다. 하이브리드 애플리케이션은 HTML5, CSS, JavaScript 등과 같은 웹사이트 개발 도구 및/또는 프로그래밍 언어를 사용하여 작성할 수 있다. 실시예들에서, 하이브리드 애플리케이션은 컴퓨팅 장치의 웹 브라우저를 사용하지 않고 컴퓨팅 장치의 브라우저 엔진을 사용하여 웹 사이트의 서비스를 로컬로 렌더링한다. 일부 실시예에서, 하이브리드 애플리케이션은 또한 가속도계, 카메라, 로컬 스토리지 등과 같은 웹 애플리케이션에서 액세스할 수 없는 컴퓨팅 장치 기능에 액세스한다.
하나 이상의 컴퓨터 사용 가능 매체 또는 컴퓨터 판독 가능 매체(들)의 임의의 조합이 본 명세서에 개시된 실시예와 함께 사용될 수 있다. 컴퓨터 사용 가능 또는 컴퓨터 판독 가능 매체는 예를 들어 전자, 자기, 광학, 전자기, 적외선, 또는 반도체 시스템, 장치, 장치 또는 전파 매체일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 컴퓨터 판독 가능 매체의 보다 구체적인 예(완전하지 않은 목록)는 하나 이상의 전선을 갖는 전기 연결, 휴대용 컴퓨터 디스켓, 하드 디스크, RAM(Random Access Memory), 판독 전용 메모리(ROM), 소거 가능하고 프로그램 가능한 읽기 전용 메모리(EPROM 또는 플래시 메모리), 광섬유, 휴대용 컴팩트 디스크 읽기 전용 메모리(CD-ROM), 광학 저장 장치, 다음을 지원하는 전송 매체 인터넷이나 인트라넷 또는 자기 저장 장치를 포함한다. 컴퓨터 사용 가능 또는 컴퓨터 판독 가능 매체는, 예를 들어 종이 또는 기타 매체의 광학 스캐닝을 통해 프로그램을 전자적으로 캡처한 다음 컴파일하고, 해석되거나 필요한 경우 적절한 방식으로 처리되어 컴퓨터 메모리에 저장할 수 있기 때문에, 프로그램이 인쇄되는 종이 또는 다른 적절한 매체일 수도 있다. 이 문서의 맥락에서, 컴퓨터 사용 가능 또는 컴퓨터 판독 가능 매체는 명령 실행 시스템, 장치 또는 장치에 의해 또는 이와 관련하여 사용하기 위해 프로그램을 포함, 저장, 통신, 전파 또는 전송할 수 있는 임의의 매체일 수 있다. 컴퓨터 사용 가능 매체는 기저대역에서 또는 반송파의 일부로서 컴퓨터 사용 가능 프로그램 코드와 함께 전파된 데이터 신호를 포함할 수 있다. 컴퓨터에서 사용할 수 있는 프로그램 코드는 무선, 유선, 광섬유 케이블, RF 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 적절한 매체를 사용하여 전송할 수 있다.
본 개시내용의 동작을 수행하기 위한 컴퓨터 프로그램 코드는 자바, 스몰토크, C++ 등과 같은 객체 지향 프로그래밍 언어, 및 "C" 프로그래밍 언어 또는 유사한 프로그래밍 언어 또는 제어 시스템(20) 고유의 프로그래밍 언어 등과 같은 이러한 종래의 절차적 프로그래밍 언어를 포함하는 하나 이상의 프로그래밍 언어의 임의의 조합으로 작성될 수 있다. 프로그램 코드는 사용자의 컴퓨팅 장치에서 부분적으로 사용자의 컴퓨팅 장치에서 독립형 소프트웨어 패키지로 부분적으로 사용자의 컴퓨팅 장치에서 부분적으로 원격 컴퓨터에서 부분적으로 또는 원격 컴퓨터 또는 서버에서 완전히 실행할 수 있다. 후자의 시나리오에서 원격 컴퓨터는 LAN(Local Area Network) 또는 WAN(Wide Area Network)을 포함한 모든 유형의 네트워크를 통해 사용자의 컴퓨팅 장치에 연결되거나 외부 컴퓨팅장치(예: 인터넷 서비스 공급자를 사용하여 인터넷을 통해) 또는 위에서 설명한 것과 같은 무선 네트워크에 연결될 수 있다.
또한, 예시적인 실시예는 하드웨어, 소프트웨어, 펌웨어, 미들웨어, 마이크로코드, 하드웨어 기술 언어, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 구현될 수 있다. 소프트웨어, 펌웨어, 미들웨어 또는 마이크로코드로 구현되는 경우, 필요한 작업을 수행하기 위한 프로그램 코드 또는 코드 세그먼트는 기계 또는 컴퓨터 판독 가능 매체에 저장될 수 있다. 코드 세그먼트는 프로시저, 기능, 서브프로그램, 프로그램, 루틴, 서브루틴, 모듈, 프로그램 코드, 소프트웨어 패키지, 클래스 또는 명령, 데이터 구조, 프로그램 명령문 등을 나타낼 수 있다.
다양한 실시예에서, 제조 물품은 본 명세서에 개시된 하나 이상의 방법을 구현하기 위해 사용될 수 있다. 제조 물품은 컴퓨터 판독가능 비일시적 저장 매체 및 저장 매체를 포함할 수 있다. 저장 매체는 본 개시의 실시예들에 따라, 장치로 하여금 본 명세서에 개시된 방법들의 일부 또는 모든 양상들을 실행하게 하도록 구성된 프로그래밍 명령들을 포함할 수 있다.
저장 매체는 플래시 메모리, 광 디스크 또는 자기 디스크를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 광범위한 영구 저장 매체를 나타낼 수 있다. 특히, 프로그래밍 명령어는 장치에 의한 실행에 응답하여 장치가 본 명세서에 설명된 다양한 동작을 수행할 수 있게 할 수 있다. 예를 들어, 저장 매체는 본 개시의 실시예들에 따라, 장치로 하여금 여기에서 방법의 일부 또는 모든 양태들을 실행하게 하도록 구성된 프로그래밍 명령들을 포함할 수 있다.
예시적인 공정
위에서 설명한 시스템을 사용하여 아래에서 설명하는 방법을 수행할 수 있지만, 여기에서 설명하는 방법 및 장치에 사용할 수 있는 시스템을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 17을 참조하면, 개시된 방법(200)은 T세포에 대한 활성화 단위 동작(210), 형질도입 단위 동작(220), 접종 단위 동작(230), 확장 단위 동작(240), 디비딩 단위 작업(250), 및 확장 단위 작업(260)을 독립적으로 포함하는 6개의 단위를 포함한다. 본 명세서에 개시된 방법의 작업 실시예는 액체 취급 시스템(예: 고도로 수정된 Tecan Fluent 780 시스템)에서 구현되었다. 개시된 방법의 작업 실시예는 위에서 논의된 바와 같이 FCA, MCA, 및 RGA를 사용하여 수행되었다(도 16 참조). 이러한 아암(arms)은 각각 액체 및 실험용기 이송을 허용한다. 활성화 단위 작업(210), 형질도입 단위 작업(220), 접종 단위 작업(230), 확장 단위 작업(240), 디비딩 단위 작업(250) 및 수확 단위 작업(260)이 여러 실험 설정에 대해 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포가 포유동물 세포 인큐베이터에 있는 시간은 다른 세포가 시스템(10)의 나머지 구성요소에 의해 조작되는 시간과 엇갈리거나 인터리브될 수 있다.
샘플
본원에 제공된 방법 및 시스템은 T세포, 예를 들어 CD4+ 및/또는 CD8+ T세포와 특히 관련이 있는 대상체로부터 분리된 세포와 같은 포유동물 세포와 함께 사용된다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 특정 질병이나 상태가 있거나 세포 치료가 시행될 대상과 같은 개체로부터 얻거나 파생된 것과 같은 생물학적 샘플에서 분리된 세포 또는 이의 조성물을 사용한다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 건강한 공여자와 같은 대상체로부터 얻거나 유래된 것과 같은 생물학적 샘플로부터 분리된 세포 또는 그의 조성물을 사용한다. 일부 측면에서, 대상체는 세포가 분리, 처리 및/또는 조작되는 입양 세포 요법과 같은 특정 치료적 개입을 필요로 하는 환자인 대상체와 같은 인간이다. 따라서, 일부 실시예에서 세포는 1차 세포, 예를 들어 1차 인간 세포이다. 샘플에는 조직, 체액 및 피험자로부터 직접 채취한 기타 샘플이 포함된다. 생물학적 샘플은 생물학적 공급원에서 직접 얻은 샘플 또는 처리된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀과 같은 체액, 이로부터 파생된 처리된 샘플을 포함한 조직 및 기관 시료가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 예를 들어 시험 절차 또는 방법론의 검증의 일부로서 세포주와 같은 비일차(non-primary) 세포와 함께 사용된다.
실시예들에서, 샘플은 혈액 또는 혈액에서 추출한 시료이거나 성분채집 또는 백혈구 성분채집 산물에서 추출한 것이다. 예시적인 샘플은 전혈, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검, 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 기관 및/또는 이들로부터 유래된 세포를 포함한다. 샘플에는 세포 요법(예: 입양 세포 요법)의 맥락에서 자가 및 동종 출처의 샘플이 포함된다. 일부 예에서, 세포는 성분채집 또는 백혈구 성분채집과 같은 피험자의 순환 혈액에서 얻는다. 일부 측면에서 샘플은 T세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 적혈구 및/또는 혈소판을 포함하는 백혈구를 함유하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 함유한다. 특정 실시예들에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에서 사용하기 위한 세포는 CD4+ T세포가 풍부한 T세포이다. 특정 실시예들에서, 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에 사용하기 위한 세포는 CD8+ T세포가 풍부한 T세포이다. 일부 실시예에서, 농축된 CD4+ T세포 및 농축된 CD8+ T세포의 2개의 개별 조성물은 개별적으로 본원에 개시된 다양한 시스템 및 방법에 적용된다. 일부 실시예에서, 단일 조성물은 농축된 CD4+ 및 CD8+ T세포, 예를 들어 개별적으로 농축되고 별도의 조성물로부터 조합된 세포의 조성이다. CD4+ T세포 및/또는 CD8+ T세포를 농축하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
활성화 단위 작업
활성화 단위 작업(210)은 작업 테이블 설정으로 시작하고, 도 1의 시스템(10)을 참조하면, 제어 시스템(20)은 예를 들어 DiTi, 시약 통, 세포 배양 배지, 세포 계수 시약 등을 사용하여 작업대(60)를 설정하도록 사용자/운영자를 촉구한다. 제어 시스템(20)은 T세포 공여자의 수, 활성화제의 수 및 실행되는 조건의 수와 같은 실험 매개변수를 입력하도록 사용자를 추가로 촉구한다. 다른 분석 매개변수는 사용자가 설정할 수 있다. 사용자는 실시간으로 또는 예를 들어 도 17에 도시된 바와 같은 방법(200)의 시스템(10)을 시작하기 전에 사용자에 의해 설정된 스크립트의 일부로서 이러한 매개변수를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 실행할 조건의 수를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 원하는 샘플링 부피를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 상기 방법의 말미에 샘플링을 수행할지 여부를 입력하라는 메시지를 받는다. 사용자가 '예'를 선택하면 총 세포 물질 및 AAA/유세포 분석 샘플링 부피를 지정하라는 지시 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 여러 공여자가 선택된 경우 사용자는 CD4 및 CD8 공여자 수와 방법에 필요한 동결 바이알의 총 수를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 웰당 분배할 활성화 시약 용량도 포함하라는 메시지가 표시된다. 본 명세서에서 "활성화 시약"은 하나 이상의 작용제를 의미한다.
실험 입력이 제어 시스템(20)에 의해 수신되면, 제어 시스템은 선택된 매개변수에 필요한 작업대(60) 구성 및 랩웨어를 결정한다. 일부 실시예에서, 본 단위 공정 및 다른 단위 공정에서, 실험기구는 예를 들어 제어 시스템(20)의 지시에 따라 예를 들어 용기 조작 모듈(50)을 사용하여 자동 액체 취급 시스템(30)에 자동으로 배치된다. 다른 실시예에서, 랩웨어의 일부 또는 전부는 예를 들어 제어 시스템(20)에 의해 프롬프트된 대로 한 명 이상의 사용자에 의해 작업대(60)에 배치된다. 특정 실시예들에서, 50mL의 원뿔형 튜브(또는 다른 관련 튜브 유형/부피)의 수는 입력된 공여자의 수에 따라 작업대(60)에 배치된다. 실시예들에서, 원추형 튜브는 원심분리기 튜브 어댑터에 배치된다. 실시예들에서, 사용자는 제어 시스템에 의해 입력된 공여자의 수에 따라 작업대(60)에 50mL 원뿔형 튜브를 배치하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 튜브 핑거(56)를 갖는 RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 50mL 원뿔형 튜브를 바이알 그리퍼 모듈(70)로 옮기고 캡을 제거한다. 튜브 캡을 원뿔형 튜브 캡 홀더에 놓고 원심분리 후 튜브를 원심분리기 튜브 어댑터로 반환한다.
특정 실시예들에서, 작업대(60)에는 입력된 조건의 수에 따라 n개의 셀룰러 재료 플레이트가 배치된다. 샘플링 플레이트는 96-웰 플레이트, 96-웰 저부착 플레이트(세포 계수) 및 96-라운드 바닥 플레이트(AAA/유세포 분석기)를 포함할 수 있다. 특정 실시예들에서, 사용자에게 입력된 조건의 수를 기반으로 샘플링 및 "n"개의 셀룰러 재료 플레이트를 사용하여 작업대(60)를 설정하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 편심 핑거(52)를 사용하는 RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 모든 세포 물질 및 샘플링 플레이트를 호텔(105)에 배치한다.
작업대 설정이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 세척이 시작된다. CD4+ 및 CD8+ 샘플 모두에 대한 공여자당 동결 바이알의 수가 선택될 수 있다. 실시예들에서, 동결 바이알의 수는 제어 시스템(20)에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시예들에서, 사용자에게 CD4+ 및 CD8+ 샘플 모두에 대해 공여자당 동결 바이알 수를 선택하라는 메시지가 표시된다. CD4+ 및 CD8+ 수, 작업 테이블 설정에서 필요한 동결 바이알 수, CD4+ 및 CD8+ 샘플 모두에 대한 공여자당 동결 바이알 개수의 입력을 사용하여, FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)은 동결 바이알의 내용물을 50mL 원뿔형 튜브로 옮긴다. 실시예들에서, 가요성 액체 조작 모듈(40)은 균형 세포 배양 배지를 분배하여 각 50mL 원추형 튜브에 대해 선택된 부피에 도달한다. 실시예들에서, 용기 조작 모듈(50)은 튜브 핑거(56)를 사용하여 50mL 원뿔형 튜브를 바이알 그리퍼 모듈(70)로 옮기고 각 튜브를 다시 덮는다. 실시예들에서, 용기 조작 모듈(50)은 튜브 핑거(56)를 사용하여 50mL 원추형 튜브를 원심분리기 튜브 어댑터로 다시 옮긴다. 실시예들에서, 용기 조작 모듈(50)은 튜브 핑거(56)를 중심 핑거(54)로 교체하고, 튜브가 있는 원심분리기 튜브 어댑터를 원심분리를 위해 로봇 원심분리기(65) 내로 수직으로 운반한다.
원심분리 후, 원심분리기 어댑터는 원추형 튜브와 함께 작업대(60)로 반환된다. 실시예들에서, 용기 조작 모듈(50)은 중심 핑거(52)를 튜브 핑거(56)로 교체하고 튜브를 바이알 그리퍼 모듈(70)로 옮기고 캡을 해제한다. 실시예들에서, 그런 다음 FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)은 각각의 원추형 튜브에 대한 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 제거한다. 실시예들에서는, 그 다음에 선택한 VCC와 추가된 동결 바이알(cryovial)의 수를 기반으로 각 튜브를 재현탁한다.
세척이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 샘플링이 시작된다. 각 50mL 원뿔형 튜브를 혼합한 다음, 튜브당 총 샘플 부피를 흡인하고 96-딥웰 플레이트에 분배한다. 그런 다음 분배된 샘플링 부피를 혼합하고 저부착 세포 계수 플레이트에 분취한다. 그런 다음 입력된 조건의 수에 따라 세포 계수 시약이 저부착 세포 계수 플레이트에 분배된다. 특정 실시예들에서, 샘플링 플레이트의 세포 수는 세포 계수 모듈(75)에 의해 자동으로 판독된다. 다른 실시예에서, 샘플링 플레이트는 사용자가 접근할 수 있도록 작업대(60)의 전면으로 가져온 다음 수동 세포 계수를 위해 사용자가 작업대(60)에서 치운다. 세포 농도 측정은 세포 계수 모듈(75)로부터 자동으로 또는 사용자에 의해 수동으로 입력되는 것과 같이 시스템 제어기(20)에 의해 얻어진다. 현재 VCC를 기반으로 목표 VCC에 도달하는 데 필요한 세포 부피가 계산된다.
샘플링이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 활성화가 시작된다. 활성화 시약은 예를 들어 자동으로 작업대(60)에 추가된다. 특정 실시예들에서, 사용자에게 활성화 시약을 작업대(60)에 추가하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 편심 핑거(52)를 사용하여 "n"개의 웰 플레이트(예: 6웰, 12웰, 24웰 플레이트 및/또는 48웰 플레이트 등)를 조건 번호에 따라 호텔 (105)에서 작업대 (60)로 올려 놓는다. 웰이 있는 플레이트는 둥근 바닥 플레이트, 평평한 바닥 플레이트 등이 될 수 있다. 6웰 플레이트의 경우 6개 조건마다 1개의 플레이트가 필요하다. 실시예들에서, 그런 다음 입력된 조건의 수에 따라 활성화 시약이 플레이트의 각 웰에 분배된다. 실시예들에서, 가요성 액체 조작 모듈(40)은 그 다음 각 튜브를 혼합하여 진행한다. 그 다음, 가요성 액체 조작 모듈(40)은 사용자 입력에 따라 총 유핵 세포 수(TNC)에 도달하기 위해 필요한 세포 부피를 분배한다. 가요성 액체 조작 모듈(40)은 원하는 VCC에 도달하기 위해 조건별로 균형 세포 배양 배지를 플레이트의 각 웰에 분배함으로써 이어진다.
활성화가 완료되면 선택적으로 제어 시스템(20)에 의해 샘플링이 시작된다. 샘플링이 필요한 경우 각 샘플 웰을 혼합한 다음 샘플당 총 샘플 부피를 흡인하고 96-딥웰 플레이트에 분배한다. 그런 다음 분배된 샘플링 부피를 혼합하고 세포 계수 및 AAA/유세포 분석 플레이트에 분취한다. 특정 실시예들에서, 샘플링 플레이트에 대한 세포 카운트는 세포 카운팅 모듈(75)에 의해 자동으로 판독된다. 다른 실시예에서, 샘플링 플레이트는 사용자가 접근할 수 있도록 작업대(60)의 전면으로 가져온 다음 수동 셀 카운팅을 위하여 사용자가 작업대(60)에서 치운다. 세포 농도 측정은 세포 계수 모듈(75)로부터 자동으로 또는 사용자에 의해 수동으로 입력되는 것과 같이 시스템 제어기(20)에 의해 얻어진다. 실시예들에서, 플레이트는 자동으로 다시 닫힌다. 실시예들에서, 플레이트는 자동으로 인큐베이터로 옮겨진다. 실시예들에서, 나머지 실험기구는 작업대에서 자동으로 치워진다. 실시예들에서, 사용자에게 플레이트를 인큐베이터에 넣으라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 작업대에서 남아 있는 모든 실험 기구를 치우라는 메시지가 사용자에게 표시된다.
샘플링이 완료되지 않으면 제어 시스템(20)에 의해 샘플링이 시작되지 않는다. 실시예들에서, 플레이트는 자동으로 다시 닫힌다. 실시예들에서, 플레이트는 자동으로 인큐베이터로 옮겨진다. 실시예들에서, 남아 있는 모든 실험 기구는 작업대에서 자동으로 치워진다. 실시예들에서, 인큐베이터에 플레이트를 놓으라는 메시지가 사용자에게 표시된다. 실시예들에서, 작업 테이블에서 남아 있는 모든 실험 기구를 치우라는 메시지가 사용자에게 표시된다.
일부 실시예에서, 제공된 방법 및 시스템은 예를 들어 활성화 단위 작업(220) 동안 추가된 하나 이상의 시약과 함께 활성화 조건 하에서 세포를 부화하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 실시예에서, 활성화 조건은 세포, 예를 들어 CD4+ T세포 또는 CD8+ T세포에서 신호를 활성화 또는 자극하고/하거나 활성화 또는 자극할 수 있는 조건을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성화 조건은 활성화 시약, 예를 들어 활성화 또는 자극하고/하거나 세포에서 신호를 활성화하거나 자극할 수 있는 시약과 함께 및/또는 존재하에 세포를 배양(culturing), 양성(cultivating), 부화, 활성화, 증식하는 단계 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시예에서, 활성화 조건 하에서의 부화는, 항원 노출을 모방하고/하거나 재조합 항원 수용체의 도입과 같은 형질도입을 위해 세포를 프라이밍하기 위하여, 활성화 조건, 예를 들어 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하도록 설계된 조건의 존재 하에 부화에 의한 것을 포함하여, 배양(culture), 양성(cultivation), 자극, 활성화, 증식을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 활성화 조건은 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온, 및/또는 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화하도록 설계된 기타 작용제 등과 같은 자극 인자 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 활성화 조건은 세포를 활성화 시약과 함께 부화, 배양, 및/또는 양성하는 것을 포함한다. 특정 실시예들에서, 활성화 시약은 비드를 함유하거나 포함한다. 특정 실시예들에서, 활성화 조건 하에서 부화, 배양 및/또는 양성의 시작 및/또는 개시는 세포가 활성화 시약과 접촉 및/또는 부화될 때 발생한다. 특정 실시예에서, 세포는 세포를 형질도입하기 전, 그 동안 및/또는 이후에, 예를 들어 형질도입 또는 형질감염에 의해 세포에 재조합 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것과 같이 활성화 시약과 함께 부화된다.
일부 실시예에서, 농축된 T세포의 조성물은 활성화 시약 및/또는 비드 대 세포의 비율로 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1로 부화된다. 특정 실시예에서, 활성화 시약 및/또는 비드 대 세포의 비율은 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1 범위에 있다. 특정 실시예에서, 활성화 시약 대 세포의 비율은 약 1:1 또는 1:1이다.
특정 실시예에서, 활성화 시약은 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 실시예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T세포에 의해 발현되고/되거나 T세포에 내인성인 수용체에 결합하고/하거나 이에 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-나선 다발 패밀리의 구성원이거나 이를 포함한다. 일부 실시예에서, 사이토카인의 4-알파-나선 번들 패밀리의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL- 9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 집락 자극 인자(G- CSF) 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-7이거나 IL-7을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-2이거나 IL-2를 포함한다.
특정 실시예에서, 활성화 시약은 IL-2, 예를 들어 재조합 IL-2를 포함한다. 이론에 구속되기를 바라지 않지만, 특정 실시예는 일부 피험자로부터 얻은 CD4+ T세포가 IL-2를 예를 들어 세포 치료에 사용하기에 적합한 조작된(engineered) 세포 조성물을 생성하는 과정 전반에 걸쳐 성장, 분열 및 확장을 허용하는 양으로 생산하지 않거나 충분히 생산하지 않는다는 것을 고려한다. 일부 실시예에서, 재조합 IL-2의 존재 하에 활성화 조건 하에 농축된 CD4+ T세포의 조성물을 부화하는 것은 부화 단계 시와 프로세스 전반에 걸쳐 조성물의 CD4+ T세포가 계속해서 생존, 성장, 확장 및/또는 활성화될 가능성 또는 가능성을 증가시킨다.
특정 실시예들에서, 상기 하나 이상의 사이토카인의 양 또는 농도는 국제 단위(IU)로 측정 및/또는 정량화된다. 국제 단위는 비타민, 호르몬, 사이토카인, 백신, 혈액 제품 및 유사한 생물학적 활성 물질을 정량화하는 데 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, IU는 특정 중량 및 강도(예: WHO 1st International Standard for Human IL-2, 86/504)의 국제 참조 표준과 비교하여 생물학적 작용제의 효능을 측정하는 단위이거나 이를 포함한다. 국제 단위는 국제 공동 연구 노력에서 발표되고 파생된 생물학적 활성 단위를 보고하는 유일하게 인정되고 표준화된 방법이다. 특정 실시예들에서, 조성물, 샘플 또는 사이토카인 공급원에 대한 IU는 유사한 WHO 표준 제품과 제품 비교 테스트를 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 인간 재조합 IL-2, IL-7 또는 IL-15의 조성물, 샘플 또는 공급원의 IU/mL는 각기 WHO 표준 IL-2 제품(NIBSC 코드: 86/500), WHO 표준 IL-17 제품(NIBSC 코드: 90/530) 및 WHO 표준 IL-15 제품(NIBSC 코드: 95/554)과 비교된다.
일부 실시예에서, IU/mL 단위의 생물학적 활성도는 (ED50 in ng/ml) 1 x106에 상응한다. 특정 실시예에서, 재조합 인간 IL-2 또는 IL-15의 ED50(이가 투여되는 집단의 50%에서 양적 효과를 생성하는 유효 용량 중앙값)은 CTLL-2(C57BL/6 마우스에서 유래된 세포독성 T세포) 세포로 세포를 증식 (XTT, 또는 테트라졸륨 수산화물, 절단)하는 것의 최대 자극의 절반에 필요한 농도에 상응한다. 특정 실시예들에서, 재조합 인간 IL-7의 ED50은 PHA(phytohaemagglutinin P) 활성화 인간 말초 혈액 림프구의 증식을 위한 최대 자극의 절반에 필요한 농도에 상응한다. IL-2에 대한 IU의 분석 및 계산에 관한 세부사항은 Wadhwa 등, Journal of Immunological Methods(2013), 379(1-2): 1-7; 및 Gearing 및 Thorpe, Journal of Immunological Methods (1988), 114(1-2): 3-9에서 논의되었고, IL-15에 대한 IU의 분석 및 계산과 관련된 세부사항은 Soman 등 Journal of Immunological Methods (2009) 348(1-2): 83-94에서 논의되었고, 전체가 참조로 여기에 통합되었다.
일부 실시예에서, 세포는 사이토카인, 예를 들어 재조합 인간 사이토카인과 함께 1 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 10 IU/ml 내지 50 IU/ml, 50 IU/ml 내지 100 IU/ml, 100 IU/ml 내지 200 IU/ml, 100 IU/ml 내지 500 IU/ml, 250 IU/ml 내지 500 IU/ml, 또는 500 IU/ml 내지 1,000 IU/ml의 농도에서 부화된다.
일부 실시예에서, 세포는 IL-2(예를 들어, 재조합 인간 IL-2)와 함께 1 IU/ml 내지 200 IU/ml, 10 IU/ml 내지 100 IU/ml, 50 IU/ml 내지 150 IU/ml, 80 IU/ml 내지 120 IU/ml, 60 IU/ml 내지 90 IU/ml, 또는 70 IU/ml 내지 90 IU/ml의 농도에서 부화된다. 특정 실시예에서, 농축 T세포의 조성물은 약, 또는 50 IU/ml, 55 IU/ml, 60 IU/ml, 65 IU/ml, 70 IU/ml, 75 IU/ml, 80 IU/ml, 85 IU/ml, 90 IU/ml, 95 IU/ml, 100 IU/ml, 110 IU/ml, 120 IU/ml, 130 IU/ml, 140 IU/ml 또는 150 IU/ml의 농도에서 재조합 IL-2와 함께 배양된다.
일부 실시예에서, 세포는 재조합 IL-7(예: 인간 재조합 IL-7)과 함께 100 IU/ml 내지 2,000 IU/ml, 500 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 100 IU/ml 내지 500 IU/ml, 500 IU/ml 내지 750 IU/ml, 750 IU/ml 내지 1,000 IU/ml, 또는 550 IU/ml 내지 650 IU/ml의 농도에서 부화된다. 특정 실시예에서, 세포는 IL-7과 함께 약, 또는 50 IU/ml, 100 IU/ml, 150 IU/ml, 200 IU/ml, 250 IU/ml, 300 IU/ml, 350 IU/ml, 400 IU/ml, 450 IU/ml, 500 IU/ml, 550 IU/ml, 600 IU/ml, 650 IU/ml, 700 IU/ml, 750 IU/ml, 800 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml, 750 IU/ml, 또는 1,000 IU/ml의 농도에서 부화된다.
일부 실시예에서, 세포는 재조합 IL-15(예: 인간 재조합 IL-15)와 함께 0.1 IU/ml 내지 100 IU/ml, 1 IU/ml 내지 50 IU/ml, 5 IU/ml 내지 25 IU/ml, 25 IU/ml 내지 50 IU/ml, 5 IU/ml 내지 15 IU/ml, 또는 10 IU/ml 내지 00 IU/ml의 농도에서 부화된다. 특정 실시예에서, 세포는 IL-15와 함께 약, 또는 1 IU/ml, 2 IU/ml, 3 IU/ml, 4 IU/ml, 5 IU/ml, 6 IU/ml, 7 IU/ml, 8 IU/ml, 9 IU/ml, 10 IU/ml, 11 IU/ml, 12 IU/ml, 13 IU/ml, 14 IU/ml, 15 IU/ml, 20 IU/ml, 25 IU/ml, 30 IU/ml, 40 IU/ml, 또는 50 IU/ml 의 농도에서 부화된다.
일부 실시예에서, 상기 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15는 재조합형이다. 특정 실시예들에서, 상기 IL-2, IL-7, 및/또는 IL-15는 인간이다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15이거나 이를 포함한다.
특정 실시예에서, 세포는 하나 이상의 항산화제가 있는 상태에서 활성화 시약과 함께 부화된다. 일부 실시예에서, 항산화제는, 토코페롤, 토코트리에놀, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 델타-토코페롤, 알파-토코트리에놀, 베타-토코트리에놀, 알파-토코페롤퀴논, Trolox(6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산), 부틸화 히드록시아니솔(BHA), 부틸화 히드록시톨루엔(BHT), 플라보노이드, 이소플라본, 리코펜, 베타-카로틴, 셀레늄 , 유비퀴논, 루에틴, S-아데노실메티오닌, 글루타티온, 타우린, N-아세틸 시스테인(NAC), 구연산, L-카르니틴, BHT, 모노티오글리세롤, 아스코르브산, 프로필 갈레이트, 메티오닌, 시스테인, 호모시스테인, 시스테인, 호모시스테인, 글루타민 시스타티오닌 및/또는 글리신-글리신-히스티딘을 포함하는 하나 이상의 항산화제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 산화방지제는 황 함유 산화제이거나 이를 포함한다. 특정 실시예들에서, 황 함유 항산화제는 티올 함유 항산화제 및/또는 하나 이상의 황 부분(예를 들어, 고리 구조 내)을 나타내는 항산화제를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 황 함유 항산화제는 예를 들어 N-아세틸시스테인(NAC) 및 2,3-다이머캅토프로판올(DMP), L-2-옥소-4-티아졸리딘카르복실레이트(OTC) 및 리포산을 포함할 수 있다. 특정 실시예에서, 산화 방지제를 함유한 황은 글루타티온 전구체이다. 일부 실시예에서, 상기 글루타티온 전구체는 세포 내에서 하나 이상의 단계에서 유도된 글루타티온으로 변형될 수 있는 분자이다. 특정 실시예에서, 상기 글루타티온 전구체는 N-아세틸 시스테인(NAC), L-2-옥소티아졸리딘-4-카복실산(프로시스테인), 리포산, S-알릴 시스테인, 또는 메틸메티오닌 설포늄 클로라이드를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시예에서, 활성화 조건 하에 세포를 부화하는 것은 하나 이상의 항산화제의 존재 하에 세포를 부화하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 세포는 하나 이상의 항산화제가 있는 경우 활성화 시약으로 자극된다. 일부 실시예에서, 세포는 1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 10 ng/ml 내지 1㎍/ml, 100 ng/ml 내지 10 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 내지 1 mg/ml, 100 ㎍/ml 내지 1 mg/ml, 1 500 ㎍/ml 내지 2 mg/ml, 500 ㎍/ml 내지 5 mg/ml, 1 mg/ml 내지 10 mg/ml, 또는 1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 상기 하나 이상의 항산화제 존재 하에 부화된다. 일부 실시예에서, 세포는 (약) 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400 mg/ml, 500 mg/ml의 상기 하나 이상의 항산화제 존재 하에 부화된다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 항산화제는 황 함유 항산화제이거나 이를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 항산화제는 글루타티온 전구체이거나 이를 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 항산화제는 N-아세틸 시스테인(NAC)이거나 이를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성화 조건 하에 세포를 부화하는 것은 NAC의 존재 하에 세포를 부화하는 것을 포함한다. 특정 실시예에서, 세포는 NAC의 존재 하에 활성화 시약으로 자극된다. 일부 실시예에서, 세포는 1 ng/ml 내지 100 ng/ml, 10 ng/ml 내지 1 ㎍/ml, 100 ng/ml 내지 10 ㎍/ml, 1 ㎍/ml 내지 100 ㎍/ml, 10 ㎍/ml 내지 1 mg/ml, 100 ㎍/ml 내지 1 mg/ml, 1 500 ㎍/ml 내지 2 mg/ml, 500 ㎍/ml 내지 5 mg/ml, 1 mg/ml 내지 10 mg/ml, 또는 1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 NAC 존재 하에 부화된다. 일부 실시예에서, 세포는 (약) 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml, 100 ㎍/ml, 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 400 mg/ml, 500 mg/ml의 NAC 존재 하에 부화된다.
일부 실시예에서, 자극 및/또는 활성화를 위한 조건은 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 용해성 수용체 및 세포를 활성화하도록 설계된 기타 작용제와 같은 자극 인자 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 부화(예를 들어, 활성화제 사용함)의 총 기간은 약 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 및 24시간, 예컨대 적어도 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 72시간일 수 있다. 일부 실시예에서, 추가 부화는 약 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간의 포괄한 (inclusive) 시간 동안이다.
일부 실시예에서, 세포는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 재조합 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입하기 위한 단계 전 및/또는 동안, 예를 들어 형질도입 및/또는 형질전환에 의하여 활성화 조건 하에서 배양, 양성 및/또는 부화된다. 특정 실시예에서, 세포는 활성화 조건 하에서, 형질도입 단위 작업에 앞서, 30분 내지 2 시간, 1시간 내지 8 시간, 1시간 내지 6 시간, 6 시간 내지 12 시간, 12 시간 내지 18 시간, 16 시간 내지 24 시간, 12 시간 내지 36 시간, 24 시간 내지 48 시간, 24 시간 내지 72 시간, 42 시간 내지 54 시간, 60 시간 내지 120 시간, 96 시간 내지 120 시간, 90 시간 내지 110 시간, 1일 내지 7일, 3일 내지 8일, 1일 내지 3일, 4일 내지 6일, 또는 4 일 내지 5일 동안 배양, 양성 및/또는 부화된다.
특정 실시예들에서, 세포는 형질도입 단위 작업 전 및/또는 동안 활성화 시약과 함께 및/또는 존재하에 부화된다. 특정 실시예에서, 세포는 12시간 내지 36시간, 24시간 내지 48시간, 24시간 내지 72시간, 42시간 내지 54시간, 60시간 내지 120시간, 96시간 내지 120시간, 90시간 내지 2일 및 7일, 3일 내지 8일, 1일 내지 8일, 4일 내지 6 일, 또는 4일 내지 5일 동안 활성화 시약과 함께 및/또는 그 존재 하에 부화된다. 특정 실시예에서, 세포는 형질도입 단위 작업 전 및/또는 동안 활성화 조건 하에서 10일, 9일, 8일, 7일, 6일 또는 5일, 4일 미만 동안, 또는 168시간, 162시간, 156시간, 144시간, 138시간, 132시간, 120시간, 114시간, 108시간, 102시간, 또는 96시간 미만 동안 세포를 배양, 양성 및/또는 부화한다. 특정 실시예에서, 세포는 (약) 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 활성화 시약과 함께 및/또는 존재 하에 부화된다.
일부 실시예에서, 활성화 조건 하에 세포를 배양하는 것은 세포를 활성화 시약과 함께 부화하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 활성화 시약은 상자성체(paramagnetic) 비드와 같은 비드를 함유하거나 포함하고 세포는 1:1 비율과 같이 3:1 미만(비드:세포)의 비율로 활성화 시약과 함께 부화된다. 특정 실시예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 항산화제의 존재 하에 자극/활성화 시약과 함께 부화된다. 일부 실시예에서, 농축 CD4+ T세포의 조성물은 재조합 IL-2, IL-7, IL-15 및 NAC의 존재 하에 1:1(비드:세포)의 비율로 활성화 시약과 함께 부화된다. 특정 실시예들에서, 농축된 CD8+ T세포의 조성은 재조합 IL-2, IL-15 및 NAC의 존재 하에 1:1(비드:세포)의 비율로 자극 시약과 함께 부화된다. 일부 실시예에서, 활성화 시약은 (예: 활성화 시약이 세포에 첨가되거나 접촉된 시점부터) 배양 시작 또는 개시로부터 (약) 6일, 5일 또는 4일 이내에 제거 및/또는 세포로부터 분리된다.
일부 실시예에서, 활성화 조건 하에 농축된 세포의 조성물을 부화하는 것은 농축된 세포의 조성물을 T세포를 활성화 및/또는 확장할 수 있는 활성화 시약과 부화 및/또는 접촉시키는 것을 포함하거나 포함한다. 일부 실시예에서, 활성화 시약은 세포에서 하나 이상의 신호를 활성화 및/또는 활성화할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 신호는 수용체에 의해 매개된다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 신호는 신호 전달의 변화 및/또는 2차 메신저, 예를 들어 cAMP 및/또는 세포내 칼슘의 수준 또는 양, 양의 변화, 세포 국소화, 형태, 하나 이상의 세포 단백질의 인산화, 유비퀴틴화 및/또는 절단, 및/또는 세포 활성의 변화, 예를 들어 전사, 번역, 단백질 분해, 세포 형태, 활성화 상태 및/또는 세포 분열이거나 이와 연관된다. 특정 실시예에서, 활성화 시약은 T세포 수용체(TCR) 복합체의 하나 이상의 성분 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인의 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인을 활성화 및/또는 활성화할 수 있다.
특정 실시예들에서, 활성화 시약은 세포, 예를 들어 T세포를 활성화 및/또는 확장할 수 있는 하나 이상의 작용제, 예를 들어 생체분자에 접합되거나 연결된 입자, 예를 들어 비드를 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 작용제가 비드에 바인딩된다. 일부 실시예에서, 비드는 생체 적합성, 즉 생물학적 사용에 적합한 물질로 구성된다. 일부 실시예에서, 비드는 배양된 세포, 예를 들어 배양된 T세포에 무독성이다. 일부 실시예에서, 비드는 작용제와 세포 사이의 상호작용을 허용하는 방식으로 작용제를 부착할 수 있는 임의의 입자일 수 있다.
일부 실시예에서, 활성화 시약은 비드, 예를 들어 비드의 표면에 결합되거나 달리 부착되는 세포(예: T세포)를 활성화 및/또는 확장할 수 있는 하나 이상의 작용제를 포함한다. 특정 실시예들에서, 비드는 비세포 입자이다. 특정 실시예에서, 비드는 콜로이드 입자, 미소구체, 나노입자, 자성 비드 등을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 비드는 아가로즈 비드이다. 특정 실시예들에서, 상기 비드는 세파로스 비드이다.
특정 실시예에서, 활성화 시약은 단분산인 비드를 포함한다. 특정 실시예들에서, 단분산인 비드는 직경 표준 편차가 서로 5% 미만인 크기 분산을 포함한다.
일부 실시예에서, 비드에는 비드 표면에 결합, 접합 또는 연결(직접 또는 간접적으로)되는 작용제와 같은 하나 이상의 작용제가 포함된다. 일부 실시예에서, 본원에서 고려되는 작용제는 RNA, DNA, 단백질(예: 효소), 항원, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 항체 단편, 탄수화물, 지질 렉틴, 또는 원하는 표적에 대한 친화성을 갖는 임의의 다른 생체분자를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시예에서, 원하는 표적은 T세포 수용체 및/또는 T세포 수용체의 성분이다. 특정 실시예들에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 실시예에서, 원하는 표적은 T세포 공동자극 분자, 예를 들어 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS이다. 상기 하나 이상의 작용제는 당업계에 공지되고 이용가능한 다양한 방법에 의해 비드에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 부착은 공유, 비공유, 정전기 또는 소수성일 수 있고, 예를 들어 화학적 수단, 기계적 수단, 또는 효소적 수단을 포함하는 다양한 부착 수단에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시예에서, 생체분자(예: 비오틴화된 항-CD3 항체)는 비드에 직접 부착되는 다른 생체분자(예: 항-비오틴 항체)를 통해 비드에 간접적으로 부착될 수 있다.
일부 실시예에서, 활성화 시약은 비드와 세포 표면의 거대분자와 직접 상호작용하는 하나 이상의 작용제를 포함한다. 특정 실시예에서, 비드(예: 상자성 비드)는 세포 상의 하나 이상의 거대분자(예: 하나 이상의 세포 표면 단백질)에 특이적인 하나 이상의 작용제(예: 항체)를 통해 세포와 상호작용한다. 특정 실시예들에서, 비드(예: 상자성 비드)는 1차 항체(예: 항-비오틴 항체) 또는 기타 생체분자와 같은 본원에 기재된 1차 작용제로 표지된 다음, 2차 항체(예: 예를 들어, 비오틴화된 항-CD3 항체) 또는 다른 제2 생체분자(예를 들어, 스트렙타비딘)가 첨가되고, 이에 의해 이차 항체 또는 다른 제2 생체분자는 이러한 일차 항체 또는 입자 상의 다른 생체분자에 특이적으로 결합한다.
일부 실시예에서, 활성화 시약은 비드(예: 상자성 비드)에 부착되고 세포(예: T세포)상에서 다음 거대분자들 중의 하나 이상에 특이적으로 바인딩된다: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54(ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L(CD70), 4-1BB(CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-감마R, TNF-알파R, IL-4R, IL-10R, CD18/CD11a(LFA-1), CD62L(L-셀렉틴), CD29/CD49d(VLA-4), 노치 리간드(예: Delta-like 1/4, Jagged 1/2 등), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7 및 CXCR3 또는 이들 거대분자 또는 이들의 단편에 대한 상응하는 리간드를 포함하는 이들의 단편 등. 일부 실시예에서, 비드에 부착된 작용제(예: 항체)는 세포(예: T세포)의 다음 거대분자 중 하나 이상에 특이적으로 결합한다: CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO.
일부 실시예에서, 비드에 부착된 하나 이상의 작용제는 항체이다. 상기 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체(면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체, 디아바디 및 단일 사슬 분자 뿐만 아니라 항체 단편(예: Fab, F(ab')2 및 Fv)를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 활성화 시약은 항체 단편(항원 결합 단편 포함), 예를 들어 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab')2 단편이다. IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 불변 영역을 포함하는 임의의 아이소타입의 불변 영역이 본원에서 고려되는 항체에 사용될 수 있고 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종 (예를 들어, 뮤린 종)으로부터 수득될 수 있음이 이해될 것이다. 일부 실시예에서, 작용제는 T세포 수용체의 하나 이상의 구성요소에 결합하고/하거나 이를 인식하는 항체이다. 특정 실시예에서, 작용제는 항-CD3 항체이다. 특정 실시예들에서, 작용제는 에 결합하고/하거나 공동 수용체를 인식하는 항체이다. 일부 실시예에서, 활성화 시약은 항-CD28 항체를 포함한다.
일부 실시예에서, 비드는 직경이 약 0.001 ㎛ 초과, 약 0.01 ㎛ 초과, 약 0.1 ㎛ 초과, 약 1.0 ㎛ 초과, 약 10 ㎛ 초과, 약 50 ㎛ 초과, 약 100 ㎛ 초과 또는 약 1000 ㎛ 초과 및 약 1500 ㎛ 이하이다. 일부 실시예에서, 비드는 약 1.0 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 약 1.0 ㎛ 내지 약 150 ㎛, 약 1.0 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 1.0 ㎛ 내지 약 10 ㎛, 약 1.0 ㎛ 내지 약 5.0 ㎛, 약 1.0 ㎛ 내지 약 5.0 ㎛, 2.0 ㎛ 내지 약 5.0 ㎛, 또는 약 3.0 ㎛ 내지 약 5.0 ㎛의 직경을 갖는다. 일부 실시예에서, 비드의 직경은 약 3 ㎛ 내지 약 5 ㎛이다. 일부 실시예에서, 비드는 적어도 약 0.001 ㎛, 0.01 ㎛, 0.1 ㎛, 0.5 ㎛, 1.0 ㎛, 1.5 ㎛, 2.0 ㎛, 2.5 ㎛, 3.0 ㎛, 3.5 ㎛, 4.0 ㎛, 4.5 ㎛, 5.0 ㎛, 5.5 ㎛, 6.0 ㎛, 6.5 ㎛, 7.0 ㎛, 7.5 ㎛, 8.0 ㎛, 8.5 ㎛, 9.0 ㎛, 9.5 ㎛, 10 ㎛, 12 ㎛, 14 ㎛, 16 ㎛, 18 ㎛ 또는 20 ㎛ 의 직경을 갖는다. 특정 실시예들에서, 비드의 직경은 (약) 4.5 ㎛이다. 특정 실시예들에서, 비드의 직경은 (약) 2.8 ㎛ 이다.
일부 실시예에서, 비드의 밀도는 0.001 g/cm3 초과, 0.01 g/cm3 초과, 0.05 g/cm3 초과, 0.1 g/cm3 초과, 0.5 g/cm3 초과, 0.6 g/cm3 초과, 0.7 g/cm3 초과, 0.8 g/cm3 초과, 0.9 g/cm3 초과, 1 g/cm3 초과, 1.1 g/cm3 초과, 1.2 g/cm3 초과, 1.3 g/cm3 초과, 1.4 g/cm3 초과, 1.5 g/cm3 초과, 2 g/cm3 초과, 3 g/cm3 초과, 4 g/cm3 초과, 또는 5g/cm3 초과이다. 일부 실시예에서, 비드는 약 0.001 g/cm3 내지 약 100 g/cm3, 약 0.01 g/cm3 내지 약 50 g/cm3, 약 0.1 g/cm3 and 약 10 g/cm3, 약 0.1 g/cm3 내지 약 5 g/cm3, 약 0.5 g/cm3 내지 약 1 g/cm3, 약 0.5 g/cm3 내지 약 1.5 g/cm3, 약 1 g/cm3 내지 약 1.5 g/cm3, 약 1 g/cm3 내지 약 2 g/cm3, 또는 약 1 g/cm3 내지 약 5 g/cm3 의 밀도를 갖는다. 일부 실시예에서, 비드는 약 0.5 g/cm3, 약 0.5 g/cm3, 약 0.6 g/cm3, 약 0.7 g/cm3, 약 0.8 g/cm3, 약 0.9 g/cm3, 약 1.0 g/cm3, 약 1.1 g/cm3, 약 1.2 g/cm3, 약 1.3 g/cm3, 약 1.4 g/cm3, 약 1.5 g/cm3, 약 1.6 g/cm3, 약 1.7 g/cm3, 약 1.8 g/cm3, 약 1.9 g/cm3, 또는 약 2.0 g/cm3 의 밀도를 갖는다. 특정 실시예들에서, 비드는 약 1.6 g/cm3의 밀도를 갖는다. 특정 실시예에서, 비드 또는 입자는 약 1.5 g/cm3 의 밀도를 갖는다. 특정 실시예들에서, 입자는 약 1.3 g/cm3 의 밀도를 갖는다. 특정 실시예들에서, 복수의 비드는 균일한 밀도를 갖는다. 특정 실시예에서, 균일한 밀도는 평균 비드 밀도의 10% 미만, 5% 미만 또는 1% 미만의 밀도 표준 편차를 포함한다. 일부 실시예에서, 비드는 입자 1g당 약 0.001 m2 (m2/g) 내지 약 1,000 m2/g, 약 0.010 m2/g 내지 약 100 m2/g, 약 0.1 m2/g 내지 약 10 m2/g, 약 0.1 m2/g 내지 약 1 m2/g, 약 1 m2/g 내지 약 10 m2/g, 약 10 m2/g 내지 약 100 m2/g, 약 0.5 m2/g 내지 약 20 m2/g, 약 0.5 m2/g 내지 약 5 m2/g, 또는 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g의 표면적을 갖는다. 일부 실시예에서, 입자 또는 비드는 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g의 표면적을 갖는다.
일부 실시예에서, 비드는 작용제에 결합, 연결 또는 접합될 수 있는 비드 표면 또는 근처에 적어도 하나의 물질을 포함한다. 일부 실시예에서, 비드는 표면 기능화, 즉 결합 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 공유 결합을 형성할 수 있는 기능기를 포함한다. 특정 실시예에서, 비드는 표면에 노출된 카르복실, 아미노, 히드록실, 토실, 에폭시, 및/또는 클로로메틸 기를 포함한다. 특정 실시예에서, 비드는 표면에 노출된 아가로스 및/또는 세파로스를 포함한다. 특정 실시예들에서, 비드 표면은 결합 분자를 결합하거나 부착할 수 있는 부착된 활성화 시약을 포함한다. 특정 실시예에서, 생체분자는 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 비드는 표면에 노출된 단백질 A, 단백질 G 또는 비오틴으로 구성된다.
일부 실시예에서, 비드는 자기장 내에서 또는 자기장에 반응하거나 반응한다. 일부 실시예에서, 비드는 자성 비드이다. 일부 실시예에서, 자성 비드는 상자성이다. 특정 실시예들에서, 자성 비드는 초상자성이다. 특정 실시예들에서, 비드는 자기장에 노출되지 않는 한 어떠한 자기적 특성도 나타내지 않는다.
특정 실시예에서, 비드는 자기 코어, 상자성 코어 또는 초상자성 코어를 포함한다. 일부 실시예에서, 자기 코어는 금속을 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 금속은 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄, 망간, 탄탈륨, 아연, 지르코늄 또는 이들의 임의의 조합일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시예에서, 자기 코어는 금속 산화물(예를 들어, 산화철), 페라이트(예를 들어, 망간 페라이트, 코발트 페라이트, 니켈 페라이트 등), 적철광 및 금속 합금(예를 들어, CoTaZn)을 포함한다. 일부 실시예에서, 자기 코어는 페라이트, 금속, 금속 합금, 산화철 또는 이산화 크롬 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 자기 코어는 원소 철 또는 그 화합물을 포함한다. 일부 실시예에서, 자기 코어는 자철광(Fe3O4), 마그헤마이트(γFe2O3), 또는 그레이자이트(Fe3S4) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 내부 코어는 산화철(예: Fe3O4)을 포함한다.
특정 실시예들에서, 비드는 표면 기능화된 코트 또는 코팅으로 덮인 자기, 상자성 및/또는 초상자성 코어를 포함한다. 일부 실시예에서, 코트는 중합체, 다당류, 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 아가로스, 세파로스 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 물질을 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(락트산-코-글리콜산), 폴리글루타르알데히드, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 또는 폴리비닐 알코올일 수 있다. 특정 실시예에서, 외부 코트 또는 코팅은 폴리스티렌을 포함한다. 특정 실시예에서, 외부 코팅은 표면 기능화된다.
일부 실시예에서, 활성화 시약은 금속 산화물 코어(예: 산화철 코어) 및 코트를 포함하는 비드를 포함하고, 여기서 금속 산화물 코어는 하나 이상의 다당류(예: 덱스트란)를 포함하고, 코트는 적어도 하나의 다당류(예: 아미노 덱스트란), 적어도 하나의 중합체(예: 폴리우레탄) 및 실리카을 포함한다. 일부 실시예에서, 금속 산화물 코어는 콜로이드성 산화철 코어이다. 특정 실시예들에서, 상기 하나 이상의 작용제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성화 시약은 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 실시예에서, 활성화 시약은 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 실시예에서, 비드의 직경은 약 3㎛ 내지 약 10㎛ 이다. 일부 실시예에서, 비드의 직경은 약 3㎛ 에서 약 5㎛ 이다. 특정 실시예들에서, 비드의 직경은 약 3.5㎛이다.
일부 실시예에서, 활성화 시약은 금속 산화물 코어(예를 들어, 산화철 내부 코어) 및 코트(예를 들어, 보호 코트)를 포함하는 비드에 부착된 하나 이상의 작용제를 포함하고, 여기서 코트는 폴리스티렌을 포함한다. 특정 실시예들에서, 비드는 상자성(예: 초상자성) 철 코어, 예를 들어 자철광(Fe3O4) 및/또는 마그헤마이트(γFe2O3)를 포함하는 코어 및 폴리스티렌 코트 또는 코팅을 포함하는 단분산, 상자성(예: 초상자성) 비드이다. 일부 실시예에서, 비드는 비다공성이다. 일부 실시예에서, 비드는 하나 이상의 작용제가 부착된 기능화된 표면을 포함한다. 특정 실시예들에서, 상기 하나 이상의 작용제는 표면에서 비드에 공유 결합된다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 작용제는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체, 및 표지된 항-CD3 또는 항-CD28 항체와 같은 표지된 항체(예: 비오티닐화 항체)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 단편을 포함한다. 특정 실시예들에서, 비드는 밀도가 약 1.5 g/cm3 이고 표면적이 약 1 m2/g 내지 약 4 m2/g이다. 특정 실시예들에서, 비드는 직경이 약 4.5 ㎛ 이고 밀도가 약 1.5 g/cm3인 단분산 초상자성 비드이다. 일부 실시예에서, 비드는 평균 직경이 약 2.8 ㎛ 이고 밀도가 약 1.3 g/cm3인 단분산 초상자성 비드이다.
일부 실시예에서, 세포는 (약) 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1, 또는 0.2:1의 비드 대 세포비로 활성화 시약과 함께 배양된다. 특정 실시예에서, 비드 대 세포 비는 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8:1, 1.1:1 내지 0.9:1에 있다. 특정 실시예에서, 활성화 시약 대 세포 비는 약 1:1 또는 1:1이다.
특정 실시예에서, 자극 시약은 TCR 복합체의 세포내 신호전달 도메인을 활성화할 수 있는 하나 이상의 작용제(들)(예: 리간드)에 접합, 연결 또는 부착된 올리고머 시약(예: 스트렙타비딘 뮤테인 시약)을 포함한다. 실시예에서, 상기 하나 이상의 작용제는 특정 결합 부위(예: 결합 부위 Z)에서 올리고머 시약에 결합할 수 있는 부착된 결합 도메인 또는 결합 파트너(예: 결합 파트너 C)를 갖는다. 일부 실시예에서, 복수의 작용제는 올리고머 시약에 가역적으로 결합된다. 다양한 실시예에서, 올리고머 시약은, 특정 실시예들에서, 결합 도메인(예를 들어, 결합 파트너 C)에서 복수의 작용제에 가역적으로 결합되는 복수의 특정 결합 부위를 갖는다. 일부 실시예에서, 결합된 작용제의 양은 경쟁 시약, 예를 들어 특정 결합 부위(예: 결합 부위 Z)에도 결합할 수 있는 시약의 존재 하에 감소되거나 감소된다.
일부 실시예에서, 자극 시약은 적어도 하나의 작용제(예를 들어, T세포와 같은 세포에서 신호를 생성할 수 있는 작용제)가 올리고머 시약과 회합(예를 들어, 가역적으로 연관)되는 가역적 시스템이거나 이를 포함한다. 일부 실시예에서, 시약은 작용제에 결합(예: 가역적으로 결합)할 수 있는 다수의 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 상기 시약은 T세포와 같은 세포에서 신호를 생성할 수 있는 하나 이상의 부착된 작용제를 갖는 올리고머 입자 시약이다. 일부 실시예에서, 작용제는 분자의 에피토프 또는 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 부위(예: 결합 부위 B)를 함유하고, 또한 시약의 하나 이상의 결합 부위(예: 결합 부위 Z)에 특이적으로 결합하는 결합 파트너(본원에서 결합 파트너 C로도 지칭됨)를 함유한다. 일부 실시예에서, 결합 파트너 C와 하나 이상의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 비공유 상호작용이다. 일부 경우에, 결합 파트너 C와 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용은 공유 상호작용이다. 일부 실시예에서, 결합 파트너 C와 적어도 하나의 결합 부위 Z 사이의 결합 상호작용, 예컨대 비공유 상호작용은 가역적이다.
이러한 가역적 시스템에서 올리고머 시약으로 사용될 수 있는 물질이 알려져 있다. 예를 들어 미국 특허 5,168,049; 5,506,121; 6,103,493; 7,776,562; 7,981,632; 8,298,782; 8,735,540; 9,023,604; 및 국제 공개 PCT 출원 WO2013/124474호 및 WO2014/076277호 참조. 가역적 상호작용을 형성할 수 있는 시약 및 결합 파트너, 뿐만 아니라 이러한 결합을 역전시킬 수 있는 물질(예: 경쟁 시약)의 비제한적 예가 아래에 설명되어 있다.
일부 실시예에서, 올리고머 시약은 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘, 아비딘 뮤테인 또는 유사체(예: 뉴트라비딘) 또는 이들의 혼합물의 올리고머이며, 여기서 이러한 올리고머 시약은 작용제 (예: 결합 파트너 C)의 과 가역적으로 결합하기 위한 하나 이상의 결합 부위를 함유한다. 일부 실시예에서, 작용제의 결합 도메인은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체, 또는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는 기타 분자일 수 있다.
특정 실시예들에서, 하나 이상의 작용제(예를 들어, T세포와 같은 세포에서 신호를 생성할 수 있는 작용제)는, 예를 들어 올리고머 시약에 존재하는 다수의 특정 결합 부위(예를 들어, 결합 부위 Z)를 통하여, 올리고머 시약에 가역적으로 결합하는 등과 같이 올리고머 시약과 연관된다. 일부의 경우에, 이는 작용제에 의해 결합되거나 작용제에 의해 인식되는 세포 표면 분자(최소 2개의 카피)를 갖는 표적 세포가 작용제와 접촉하는 경우에 결합력 효과가 일어날 수 있도록 작용제가 서로 밀접하게 배열되도록 한다.
일부 실시예에서, 올리고머 시약은 스트렙타비딘 올리고머, 스트렙타비딘 뮤테인 올리고머, 스트렙타비딘 유사체 올리고머, 아비딘 올리고머, 아비딘 뮤테인 또는 아비딘 유사체(예: 뉴트라비딘) 또는 이들의 혼합물로 구성된 올리고머이다. 특정 실시예에서, 올리고머 시약은 작용제의 결합 도메인(예: 결합 파트너 C)에 결합할 수 있는 특정 결합 부위를 포함한다. 일부 실시예에서, 결합 도메인은 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체, 또는 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체, 아비딘 또는 아비딘 뮤테인 또는 유사체에 특이적으로 결합할 수 있는 스트렙타비딘-결합 펩티드 또는 기타 분자일 수 있다.
일부 실시예에서, 스트렙타비딘은 야생형 스트렙타비딘, 스트렙타비딘 뮤테인 또는 스트렙타비딘-유사 폴리펩티드와 같은 유사체일 수 있다. 유사하게, 아비딘은 일부 측면에서 야생형 아비딘 또는 돌연변이단백질 또는 아비딘의 유사체, 예를 들어 뉴트라비딘, 전형적으로 보다 중성인 등전점(pI)을 나타내고 천연 아비딘에 대한 대안으로서 이용가능한 변형된 아르기닌을 갖는 탈당화된 아비딘을 포함한다. 일반적으로, 탈당화된 중성 형태의 아비딘은 예를 들어, Sigma Aldrich(St. Louis, MO)를 통해 입수 가능한 "Extravidin" 또는 Thermo Scientific(Waltham, MA) 또는 Invitrogen(Carlsbad, CA)에서 입수 가능한 "NeutrAvidin"과 같은 상업적으로 입수 가능한 형태를 포함한다.
일부 실시예에서, 시약은 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 또는 유사체이다. 일부 실시예에서, 야생형 스트렙타비딘(wt-streptavidin)은 Argarana et al, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882에 개시된 아미노산 서열 (서열번호: 1)를 갖는다. 일반적으로, 스트렙타비딘은 4개의 동일한 서브단위의 4량체로 자연적으로 발생한다. 즉, 이는 각각의 서브단위가 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대한 단일 결합 부위를 포함하는 호모-사량체이다. 스트렙타비딘 서브단위의 예시적인 서열은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산의 서열이지만, 이러한 서열은 또한 다른 스트렙토마이세스 종으로부터의 상동체에 존재하는 서열을 포함할 수 있다. 특히, 스트렙타비딘의 각 서브단위는 약 10-14 M 정도의 해리 상수(Kd)로 비오틴에 대한 강한 결합 친화도를 나타낼 수 있다. 일부의 경우에는 스트렙타비딘이 4개의 결합 부위 중 하나만 기능하는 1가 사량체 (Howarth 등 (2006) Nat. Methods, 3:267-73; Zhang 등 (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun., 463:1059-63)), 4개의 결합 부위 중 2개가 기능하는 2가 사량체 (Fairhead 등 (2013) J. Mol. Biol., 426:199-214)이거나, 단량체 또는 이량체 형태로 존재할 수 있다 (Wu 등 (2005) J. Biol. Chem., 280:23225-31; Lim 등 (2010) Biochemistry, 50:8682-91).
일부 실시예에서, 스트렙타비딘은 야생형 또는 비변형된 스트렙타비딘, 예를 들어 비오틴, 비오틴 유도체 또는 유사체 또는 비오틴 모방체에 대한 결합 부위를 함유하는 적어도 하나의 기능적 소단위를 포함하는, 예를 들어, 일반적으로 서열번호 1에 기재된 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터의 야생형 스트렙타비딘의 적어도 하나의 기능적 서브단위 또는 그의 기능적 활성 단편을 함유하는, 스트렙토마이세스 종 또는 이의 기능적 활성 단편에서의 스트렙타비딘과 같은 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 스트렙타비딘은 N- 및/또는 C-말단에서 단축된 야생형 스트렙타비딘의 단편을 포함할 수 있다. 이러한 최소 스트렙타비딘은 서열 번호 1의 아미노산 위치 10 내지 16의 영역에서 N-말단으로 시작하고 서열 번호: 1의 아미노산 위치 133 내지 142의 영역에서 C-말단으로 끝나는 임의의 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 스트렙타비딘의 기능적 활성 단편은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열을 함유한다. 일부 실시예에서, 스트렙타비딘, 예컨대 서열번호 2에 제시된 것은 서열번호 1에 제시된 Ala13에 상응하는 위치에서 N-말단 메티오닌을 추가로 함유할 수 있다. 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인에서 잔기의 위치에 대한 언급은 서열번호: 1에서 잔기의 번호를 참조한다.
스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 예는 예를 들어 WO 86/02077, DE 19641876 A1, US 6,022,951, WO 98/40396 또는 WO 96/24606에 언급되어 있다. 스트렙타비딘 뮤테인의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호 5,168,049; 5,506,121; 6,022,951; 6,156,493; 6,165,750; 6,103,493; 또는 6,368,813; 또는 국제 공개 PCT 출원번호 WO2014/076277를 참조.
일부 실시예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 비변형 또는 야생형 스트렙타비딘의 일부가 아닌 아미노산을 포함할 수 있거나 야생형 또는 비변형 스트렙타비딘의 일부만 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 서열번호: 1 또는 그의 기능적 활성 단편, 예를 들어 서열번호: 2에 제시된 야생형 스트렙타비딘 서브단위와 비교하여 비변형 또는 야생형 스트렙타비딘의 서브단위와 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환(대체)을 가질 수 있는 적어도 하나의 서브단위를 포함한다.
일부 실시예에서, 결합 도메인에 대한 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인의 해리 상수(Kd)와 같은 결합 친화도는 1 x 10-4 M, 5 x 10-4 M, 1 x 10-5 M, 5x 10-5 M, 1 x 10-6 M, 5 x 10-6 M 또는 1 x 10-7 M 미만이나, 일반적으로 1 x 10-13 M, 1 x 10-12 M 또는 1 x 10-11 M 보다는 크다. 예를 들어, 미국 특허 제5,506,121호에 개시된 바와 같은 펩티드 서열 (Strep-tags)은 비오틴 모방체로서 작용할 수 있고 스트렙타비딘에 대한 결합 친화도(예를 들어, 대략 10-4 내지 10-5 M의 Kd 를 가짐)를 나타낼 수 있다. 일부 경우에, 결합 친화도는 스트렙타비딘 분자 내에서 돌연변이를 만들어서 더 개선시킬 수 있다. 예를 들어 미국 특허 6,103,493 또는 국제 공개 PCT 출원 WO2014/076277 참조. 일부 실시예에서, 결합 친화도는 본 명세서에 기술된 것과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인과 같은 시약은 펩티드 리간드 결합 파트너에 대한 결합 친화성을 나타내며, 이 펩티드 리간드 결합 파트너는 작용제(예: 수용체-결합제 또는 선택제)에 존재하는 결합 파트너 C일 수 있다. 일부 실시예에서, 펩티드 서열은 일반식 His-Pro-Xaa를 갖는 서열을 함유하고, 여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌이며, 예를 들어 서열 번호: 3에 기재된 서열을 함유한다. 일부 실시예에서, 펩티드 서열은 서열번호: 4에 제시된 일반식, 또는 서열번호: 5에 제시된 것과 같은 일반식을 갖는다. 일 예에서, 펩티드 서열은 Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(또한 Strep-tag®로 칭하고, 서열 번호: 6에 기재됨)이다. 일 예에서, 펩티드 서열은 Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(Strep-tag® II로도 칭하고, 서열번호: 7에 기재됨)이다. 일부 실시예에서, 펩티드 리간드는 2개 이상의 스트렙타비딘-결합 모듈의 순차적인 배열을 포함하고, 여기서 2개의 모듈 사이의 거리는 0개 이상 50개 이하의 아미노산이고, 여기서 하나의 결합 모듈은 3 내지 8개의 아미노산을 갖고, 서열 His-Pro-Xaa, 여기서 Xaa는 글루타민, 아스파라긴 또는 메티오닌이고, 다른 결합 모듈은 서열번호: 4에 제시된 것과 같은 동일하거나 상이한 스트렙타비딘 펩티드 리간드를 갖는다 (예를 들어, 국제공개 PCT 출원 WO02/077018호; 미국특허 7,981,632호 참조). 일부 실시예에서, 펩티드 리간드는 서열번호: 8 또는 9 중 어느 하나에 기재된 화학식을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 펩티드 리간드는 서열 번호: 10-12, 13-14 중 어느 하나에 제시된 아미노산의 서열을 갖는다. 대부분의 경우, 이러한 모든 스트렙타비딘 결합 펩티드는 동일한 결합 부위, 즉 스트렙타비딘의 비오틴 결합 부위에 결합한다. 이러한 스트렙타비딘 결합 펩티드 중 하나 이상이 결합 파트너 C로 사용되는 경우, 예를 들어 C1 및 C2, 결합 파트너 C를 통해 하나 이상의 작용제에 결합된 다량체화 시약 및/또는 올리고머 입자 시약은 전형적으로 하나 이상의 스트렙타비딘 뮤테인으로 구성된다.
일부 실시예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 미국 특허 제6,103,493호에 기술되어 있다. 일부 실시예에서스트렙타비딘 뮤테인은 서열번호: 1에 제시된 것과 같은 야생형 스트렙타비딘의 아미노산 서열에 기초하여 아미노산 위치 44 내지 53의 영역 내에 적어도 하나의 돌연변이를 함유한다. 일부 실시예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 하나 이상의 잔기 44, 45, 46 및/또는 47에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 야생형 스트렙타비딘의 위치 44에 있는 Glu를 소수성 지방족 아미노산(예: Val, Ala, Ile 또는 Leu), 위치 45에 있는 임의의 아미노산, 위치 46의 소수성 지방족 아미노산과 같은 지방족 아미노산으로의 대체 및/또는 위치 47의 Val의 예를 들어 일반적으로 Arg와 같은 Arg 또는 Lys와 같은 염기성 아미노산으로의 대체를 포함한다. 일부 실시예에서, Ala는 위치 46에 있고/있거나 Arg는 위치 47에 있고/또는 Val 또는 Ile는 위치 44에 있다. 일부 실시예에서, 스트렙타비딘 돌연변이체는 서열번호 15 또는 서열번호 16 또는 17(스트렙타비딘 돌연변이체 1, SAM1로도 알려짐)에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인에 제시된 바와 같은 잔기 Val44-Thr45-Ala46-Arg47을 함유한다. 일부 실시예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 서열 번호: 18, 19, 또는 20(SAM2로도 알려짐)에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 예시적인 스트렙타비딘 뮤테인에 제시된 것과 같은 잔기 Ile44-Gly45-Ala46-Arg47을 함유한다. 일부 경우에, 이러한 스트렙타비딘 뮤테인은 예를 들어 미국 특허 6,103,493에 기재되어 있으며 상표명 Strep-Tactin®으로 상업적으로 입수 가능하다. 일부 실시예에서, 뮤테인 스트렙타비딘은 서열번호: 21 또는 서열번호: 22에 기재된 아미노산 서열을 함유한다.특정 실시예에서, 분자는 스트렙타비딘의 사량체 또는 서열 번호: 2, 16, 19, 21, 23, 17 또는 20 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 스트렙타비딘 뮤테인이며, 사량체로서, 단량체당 1개의 N-말단 아민 및 4개의 라이신을 포함하여, 20개의 1차 아민를 포함하는 분자이다.
일부 실시예에서, 스트렙타비딘 뮤테인은 펩티드 리간드(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly, Strep-tag® 라고도 하고, 서열번호: 6으로 기재됨)에 대해 3.7 x 10-5 M 이하 및/또는 펩티드 리간드(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (Strep-tag® II라고도 하고, 서열 번호: 7으로 기재됨)에 대해 7.1 x 10-5 M 이하, 및/또는 7.0 x 10-5 M, 5.0 x 10-5 M, 1.0 x 10-5 M, 5.0 x 10-6 M, 1.0 x 10-6 M, 5.0 x 10-7 M, 또는 1.0 x 10-7 M 이나, 일반적으로 서열번호: 7, 8, 9, 13, 14, 10-12, 5, 6, 3, 4 중 어느 하나에 기재된 임의의 펩티드 리간드에 대해 1 x 10-13 M, 1 x 10-12 M 또는 1 x 10-11 M 초과하는 해리 상수(Kd)를 특징으로 하는 결합 친화도를 나타낸다.
일부 실시예에서, 그 결과로 생성된 스트렙타비딘 뮤테인은 펩티드 리간드(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly; Strep-tag®라고도 하고, 서열 번호 6에 기재됨) 및/또는 펩티드 리간드(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)에 대해 2.7 x 104 M-1 이상이고/이거나 펩티드 리간드(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys; Strep-tag® II,라고도 하고, 서열번호: 7에 기재됨)에 대해 1.4 x 104 M-1 이상이고/이거나 서열번호: 7, 8, 9, 13, 14, 10-12, 5, 6, 3, 4 중 어느 하나에 기재된 임의의 펩티드 리간드에 대해 1.43 x 104 M-1, 1.67 x 104 M-1, 2 x 104 M-1, 3.33 x 104 M-1, 5 x 104 M-1, 1 x 105 M-1, 1.11 x 105 M-1, 1.25 x 105 M-1, 1.43 x 105 M-1, 1.67 x 105 M-1, 2 x 105 M-1, 3.33 x 105 M-1, 5 x 105 M-1, 1 x 106 M-1, 1.11 x 106 M-1, 1.25 x 106 M-1, 1.43 x 106 M-1, 1.67 x 106 M-1, 2 x 106 M-1, 3.33 x 106 M-1, 5 x 106 M-1, 1 x 107 M-1 를 초과하나, 일반적으로 1 x 1013 M-1, 1 x 1012 M-1 또는 1 x 1011 M-1 미만인 결합 상수(Ka)를 특징으로 하는 결합 친화력을 나타낸다.
특정 실시예에서, 본원에서는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체로 구성되고/되거나 이를 함유하는 올리고머 입자 시약이 제공된다. 특정 실시예들에서, 본원에서 제공되는 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 작용제, 예를 들어, 자극제 및/또는 선택제에 가역적으로 결합하거나 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 실시예에서, 올리고머 입자는 70 nm 내지 125 nm(포함)의 반경(예를 들어, 평균 반경)을 갖고; a molecular weight of between 1 x 107 g/mol 내지 1 x 109 g/mol(포함)의 분자량; 및/또는 1,000 내지 5,000 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체(포함)를 갖는다. 일부 실시예에서, 올리고머 입자 시약은 세포 표면에서 분자(예: 수용체)에 결합하는 약제와 같은 하나 이상의 약제에 결합(예: 가역적으로 결합)된다. 특정 실시예들에서, 하나 이상의 작용제는 본 명세서에 기재된 작용제들이다. 일부 실시예에서, 상기 작용제는 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 결합 파트너, 예를 들어 Strep-tag® II 등의 스트렙타비딘 결합 펩티드를 함유하는 항체 또는 이의 항원 단편이다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 작용제는 예를 들어, Strep-tag® II 등의 스트렙타비딘 결합 펩티드과 같은 결합 파트너를 함유하는 항-CD3 및/또는 항 CD28 Fab이다.
일부 실시예에서, 본원에서는 복수의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체로 구성되고/되거나 이를 함유하는 올리고머 입자 시약이 제공된다. 특정 실시예들에서, 본원에서 제공되는 올리고머 입자 시약은 하나 이상의 작용제(예를 들어, 자극제 및/또는 선택제)에 가역적으로 결합하거나 가역적으로 결합할 수 있는 복수의 결합 부위를 함유한다. 일부 실시예에서, 올리고머 입자는 80 nm 내지 120 nm(포함)의 반경(예를 들어, 평균 반경); 7.5 x 106 g/mol 내지 2 x 108 g/mol (포함)의 분자량; 및/또는 500 내지 10,000(포함) 양의 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 뮤테인 사량체를 가진다. 일부 실시예에서, 올리고머 입자 시약은 예를 들어 수용체, 세포 표면 등의 분자에 결합하는 작용제와 같은 하나 이상의 작용제에 결합(예를 들어, 가역적으로 결합됨)된다. 특정 실시예들에서, 하나 이상의 작용제는 본 명세서에 기재된 작용제이다. 일부 실시예에서, 상기 작용제는 항-CD3 및/또는 항-CD28 Fab, 예컨대 결합 파트너를 함유하는 Fab(예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II)이다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 작용제는 결합 파트너(예를 들어, 스트렙타비딘 결합 펩티드, 예를 들어 Strep-tag® II)를 함유하는 항-CD3 및/또는 항 CD28 Fab이다.
일부 실시예에서, 세포는 106 개 세포당 약 또는 적어도 0.01 ㎍, 0.02 ㎍, 0.03 ㎍, 0.04 ㎍, 0.05 ㎍, 0.1 ㎍, 0.2 ㎍, 0.3 ㎍, 0.4 ㎍, 0.5 ㎍, 0.75 ㎍, 1 ㎍, 2 ㎍, 3 ㎍, 4 ㎍, 5 ㎍, 6 ㎍, 7 ㎍, 8 ㎍, 9 ㎍, 또는 10 ㎍의 올리고머 자극 시약의 존재 하에서 자극된다. 일부 실시예에서, 세포는 106 개 세포당 (약) 4 ㎍의 존재 하에 자극된다. 특정 실시예에서, 세포는 106 개 세포당 (약) 0.8 ㎍ 의 존재 하에서 자극된다. 특정 측면에서, 4 ㎍ 의 올리고머 자극 시약은 3 ㎍ 의 올리고머 입자와 1㎍의 부착제(예를 들어, 0.5㎍의 항-CD3 Fab 및 0.5㎍의 항-CD28 Fab)이거나 이를 포함한다.
형질도입/형질전환 단위 작업
이하 서술된 형질도입/형질전환 방법은 세포가 6-웰 플레이트로 활성화될 때 48개의 총 조건으로 시스템을 실행하도록 구성된다. 그러나 이는 병렬로 처리될 최대 192개 조건에 대한 T세포 활성화와 같이 다른 시스템 및/또는 시스템 구성 요소로 확장하거나 축소할 수 있다. 이 단위 작업을 통해 사용자는 순방향 처리 또는 활성화된 물질 선호의 표적 총핵세포(TNC) 처리를 입력할 수 있다. 사용자는 또한 형질도입 웰 복제의 수를 입력한다. reps=1의 경우 4x 플레이트마다 하나의 24웰 원심분리 플레이트가 필요하다. reps=2의 경우 1x 플레이트에는 1x 24웰 원심분리기가 필요하다. 여기에서 원하는 양을 24웰 플랫 바닥 플레이트 또는 24웰 피라미드 또는 둥근 바닥 깊은 웰 플레이트에 옮긴다. 형질도입 후, 세포는 사용자의 선호도에 따라 다음날 접종을 위해 24-웰 플레이트에서 배양되거나 접종을 위해 24-딥웰 확장 플레이트로 옮겨질 수 있다. 여기에서 논의는 바이러스 형질도입 접근법에 중점을 두고 있지만, 활성화된 T세포 내로 재조합 DNA를 도입하기 위한 다른 방법이 본 개시내용에 포함된다는 것이 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이 고려된다. 예를 들어, 하나 이상의 전기천공법, 시약 기반 형질감염, 세포 압축 또는 압착은 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않으면서 활성화된 T세포 내로 재조합 DNA를 통합하기 위해 의존할 수 있다.
도 17을 참조하면, 활성화 단위 작업(210)이 종료되면, 제어 시스템은 형질도입/형질전환 단위 작업(220)을 개시한다. 형질도입 단위 작업(220)은 작업대 설정으로 시작된다. 실시예들에서, 사용자는 DiTi, 시약 통, 세포 배양 배지, 세포 계수 시약 등으로 작업대(60)을 설정하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 균형 24-웰 평평한 바닥 및 24-딥웰 플레이트를 작업대(60)에 배치하라는 메시지가 표시된다. 24-웰 평평한 바닥 플레이트는 T세포 회전 접종에 사용된다. 24-딥웰 플레이트는 세포 원심분리에 사용된다. 실시예들에서, 사용자에게 변환 모드를 입력하라는 메시지가 표시된다. 변환 TNC 또는 정방향 처리를 설정한다. 실시예들에서, 사용자에게 형질도입 후 모드(접종 또는 형질도입 후 배양)를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 조건 번호, 바이러스 벡터 부피, 형질도입 복제 수, 회전 접종(spinoculation) 부피, 배양/접종 부피를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 총 샘플링 및 분석 샘플(예: 아미노산 분석(AAA)/유세포 분석) 부피를 입력하라는 메시지가 표시된다. 사용자는 실시간으로 또는 예를 들어 도 17에 도시된 바와 같은 방법(200)의 시스템(10)을 시작하기 전에 사용자에 의해 설정된 스크립트의 일부로서 이러한 매개변수를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 입력된 조건의 수에 따라 "n"개의 24웰 평평한 바닥 플레이트로 작업대 (60)을 설정하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 입력된 조건의 수를 기반으로 샘플링 및 "n" 플레이트 수로 작업대(60)를 설정하라는 메시지가 표시된다. 샘플링 플레이트에는 96-딥웰 플레이트, 96-웰 저부착 플레이트(세포 계수) 및 96-웰 둥근 바닥 플레이트(AAA/유세포 분석)가 포함된다.
작업대(60) 설정이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 샘플링이 시작된다. 플레이트를 열고, 각 샘플 웰이 혼합되고, 샘플당 총 샘플링 부피가 흡인되어 96-딥웰 플레이트에 분배된다. 플레이트는 다시 닫힌다. 그런 다음 분배된 샘플링 부피를 혼합하고 세포 계수 및 AAA/유세포 분석 플레이트에 분취한다. 세포 계수 시약은 입력된 조건의 수에 따라 저부착 세포 계수 플레이트에 분배된다. 특정 실시예들에서, 샘플링 플레이트에 대한 세포 수는 세포 계수 모듈(75)에 의해 자동으로 판독된다. 다른 실시예에서, 샘플링 플레이트는 사용자가 접근할 수 있도록 작업대(60)의 전면으로 가져온 다음 수동 세포 계수를 위해 사용자가 작업대(60)에서 치운다. 세포 농도 측정은 세포 계수 모듈(75)로부터 자동으로 또는 사용자에 의해 수동으로 입력되는 것과 같이 시스템 제어기(20)에 의해 얻어진다.
샘플링이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 접종 준비가 시작된다. 사용자는 바이러스 벡터를 25mL 통에 넣으라는 메시지가 표시된다. 사용자 입력에 따라 사용자는 입력된 조건의 수에 따라 작업대(60)에 "n"개의 24-딥웰 원심분리기 플레이트를 배치하도록 선택적으로 메시지가 표시된다. 용기 조작 모듈(50)은 원심분리기 플레이트와 플레이트 모두 열고 나서, 형질도입 TNC 또는 전체 샘플에 도달하는 데 필요한 세포 수를 흡인하고 이를 원심분리기 플레이트에 분배한다. 용기 조작 모듈(50)은 편심 핑거(52)로 원심분리기 플레이트를 덮은 다음 핑거 교환 시스템(FES)을 사용하여 핑거를 중심 핑거(54)로 교체한다. 그런 다음, RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 원심분리기 플레이트 및 그 균형 플레이트(홀수의 24-딥웰 원심분리기 플레이트만 있음)를 로봇 원심분리기(65) 내로 수직으로 운반한다. 원심분리 후, 원심분리기 플레이트는 작업대(60)로 반환된다. RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 원심분리기 플레이트를 열고 나서 FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)로 조건당 상청액을 흡인한다. 흡인은 세포 펠릿이 방해받지 않도록 잘 오프셋된 느린 속도로 수행된다. 상층액 흡인은 각 웰에 접종량 입력이 남을 때까지 진행된다. 일부 실시예에서, 접종 단계는 원래 용기에서 수행되며 세포 전달 단계가 없을 수 있다. 이 경우 진행하기 전에 원하는 세포 농도를 얻기 위해 원래 용기에서 부피 감소가 발생한다.
접종 준비가 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 회전 접종 모듈이 시작된다. 편심 핑거(52)가 있는 RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 호텔(105)로부터 24-웰 평평한 바닥 플레이트를 획득하고 이를 배치한다. 작업대(60)에는 조건번호 입력에 필요한 플레이트 수에 따라 중첩된다. 가요성 액체 조작 모듈(40)은 24개의 딥웰 원심분리판의 각 웰의 혼합을 진행한다. 그런 다음 웰 내용물을 흡인하고 24웰 평평한 바닥 플레이트에 분배한다. 미리 결정된 수의 세포가 24-웰 평평한 바닥 회전 접종 플레이트에 분배되면, 바이러스 벡터는 입력된 부피에 따라 웰당 분배된다. 편심 핑거(52)가 있는 RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 24웰 평평한 바닥 플레이트를 덮고 FES를 사용하여 편심 핑거를 중심 핑거로 대체한다. 그 다음, 용기 조작 모듈(50)은 24-웰 평평한 바닥 플레이트 및 이의 균형 플레이트(홀수의 24-웰 평평한 바닥 플레이트만 있음)를 회전 접종을 위해 로봇 원심분리기(65) 내로 수직으로 운반한다.
일단 회전 접종이 완료되면, 형질도입 후 사용자 입력에 따라 부화가 이어지는 경우, 형질도입 후 세포 부화는 제어 시스템(20)에 의해 시작된다. 원심분리 후, 24웰 평평한 바닥 플레이트는 작업대(60)로 반환된다. 용기 조작 모듈(50)은 24웰 평평한 바닥 플레이트를 열고 나서 FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)이 각각에 새로운 배지를 분배한다. 부화 부피에 도달할 수 있는 조건이다. FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)은 그 다음 조건의 수에 따라 플레이트 웰을 혼합한다. 편심 핑거(52)를 사용하는 RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 작업대(60)의 모든 24웰 평평한 바닥 플레이트를 덮는다. 실시예들에서, 플레이트는 접종을 위해 자동으로 포유류 세포 배양기로 옮겨진다. 실시예들에서, 남아 있는 모든 실험 기구는 작업대에서 자동으로 치워진다. 실시예들에서, 사용자는 접종을 위해 인큐베이터에 플레이트를 넣으라는 메시지가 표시된다. 실시예에서 사용자는 작업대에서 남아 있는 모든 실험기구를 치우라는 메시지가 표시된다. 그런 다음 사용자는 작업대(60)에서 남아 있는 모든 실험기구를 치우라는 메시지가 표시된다.
형질도입 후 세포 접종이 사용자 입력에 따라 선택되면, 원심분리 후, 24-웰 평평한 바닥 플레이트는 작업대(60)로 반환된다. 그런 다음 사용자는 작업대(60) 위에 24-딥웰 확장 플레이트를 놓으라는 메시지가 표시된다. 편심 핑거(52)를 사용하는 RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 확장 플레이트의 덮개를 제거한다. 가요성 액체 조작 모듈(40)은 입력된 부피에 따라 조건별로 균형 세포 배양 배지를 24-딥웰 확장 플레이트의 각 웰에 분배한다. FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)은 24-웰 평평한 바닥 플레이트로 돌아가서 플레이트 웰을 조건의 수에 따라 혼합한 다음 웰당 세포 배양 내용물을 흡인하고 24-딥웰 확장 플레이트에 분배한다. 편심 핑거(52)를 사용하는 용기 조작 모듈(50)은 작업대(60)의 모든 24-딥웰 확장 플레이트를 덮는다. 실시예들에서, 플레이트는 접종을 위해 자동으로 포유류 세포 배양기로 옮겨진다. 실시예들에서, 남아 있는 모든 실험 기구는 작업대에서 자동으로 치워진다. 실시예들에서, 접종을 위해 인큐베이터에 플레이트를 넣으라는 메시지가 사용자에게 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 작업대(60)에서 남아 있는 모든 실험기구를 치우라는 메시지가 표시된다.
실시예들에서, 본원에 제공된 방법은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 재조합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드의 형질도입 또는 형질감염에 사용된다. 특정 실시예에서, 재조합 단백질은 재조합 수용체이다.
하나 이상의 재조합 단백질(예: CAR 또는 TCR)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(예: 재조합 폴리뉴클레오티드)의 도입을 위한 다양한 방법이 공지되어 있으며 제공된 시스템, 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 비-바이러스 벡터 또는 트랜스포존, 예를 들어 잠자는 숲속의 미녀 (Sleeping Beauty) 트랜스포존 시스템을 통한 것을 포함하여 폴리펩티드 또는 수용체를 코딩하는 핵산의 전달을 위한 방법을 포함한다. 유전자 전달 방법은 형질도입, 전기천공 또는 세포 내로 유전자 전달을 초래하는 기타 방법, 또는 본원에 기재된 임의의 전달 방법을 포함할 수 있다. 재조합 생성물을 암호화하는 핵산의 전달을 위한 다른 접근법 및 벡터는 예를 들어 WO2014055668 및 미국 특허 번호 7,446,190에 기술된 것들이며, 이들 각각은 참고로 본 명세서에 포함된다.
일부 실시예에서, 재조합 핵산은 전기천공을 통해 T세포로 전달된다(예를 들어, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo 등 (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437 참조). 일부 실시예에서, 재조합 핵산은 전위를 통해 T세포로 전달된다(예를 들어, Manuri 등(2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma 등(2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74, 및 Huang 등(2009) Methods Mol Biol 506: 115-126 참조). 면역 세포에 유전 물질을 도입하고 발현시키는 다른 방법들에는 인산칼슘 형질감염(예: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기술됨), 원형질체 융합, 양이온성 리포솜-매개 형질감염; 텅스텐 입자 촉진 미세 입자 충격(Johnston, Nature, 346: 776-777(1990)); 디에틸아미노에틸(DEAE)-덱스트란/DNA 형질감염(Gulick, Curr Protoc Cell Biol., Chapter 20: Unit 20.4(2003)) 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공동 침전(Brash 등, Mol. Cell Biol., 7: 2031- 2034 (1987), 그 각각은 그 전체가 참고로 여기에 포함됨)이 있다.
또 다른 실시예에서, 면역 세포에서 유전 물질의 도입 및 발현은 세포 전달 비히클(예: 양이온성 리포솜) 또는 유도체화된(예: 항체 접합된) 폴리리신 접합체, 그라미시딘 S, 및/또는 인공 바이러스 외피를 통해 이루어진다. 이러한 비히클은 플라스미드, 벡터 또는 바이러스 DNA에 통합된 핵산을 전달할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 관심 유전자를 포함하는 핵산 분자는 가용성 분자 복합체의 형태로 원하는 세포(들)로 전달될 수 있다. 복합체는 원하는 세포(들)(예를 들어, T세포)의 표면 분자에 결합하는 핵산 결합제 및 세포 특이적 결합제로 구성된 담체에 방출가능하게 결합된 핵산을 함유할 수 있으며, 이후에 세포에 의해 내부화될 수 있는 크기이다. 이러한 착물은 U.S. Pat. 미국 특허 제5,166,320호에 기술되어 있으며, 이는 그 전체가 참고로 여기에 포함된다.
세포에서 재조합 수용체와 같은 재조합 단백질을 코딩하는 핵산 분자의 형질도입은 다수의 공지된 벡터 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 벡터에는 렌티바이러스 및 감마레트로바이러스 시스템을 비롯한 바이러스 및 비바이러스 시스템과 PiggyBac 또는 잠자는 숲속의 미녀 기반 유전자 전달 시스템과 같은 트랜스포존 기반 시스템이 포함된다. 예시적인 방법은 바이러스(예를 들어, 무엇보다도 레트로바이러스 또는 렌티바이러스), 형질도입, 트랜스포존을 통한 수용체를 코딩하는 핵산의 전달을 위한 방법을 포함한다.
일부 실시예에서, 핵산은 전기천공, 입자 총, 시약 기반 형질감염(예: 인산칼슘 형질감염), 세포 압축 또는 압착과 같은 물리적 전달 방법을 통해 도입된다.
일부 실시예에서, 세포, 바이러스 입자 및 시약을 함유하는 조성물의 회전 접종(예: 원심 접종)은 일반적으로 비교적 낮은 힘이나 속도로, 예를 들어 챔버 또는 공동의 내부 또는 외부 벽에서 측정된 바, 예를 들어 (약) 100g 내지 3200g (예를 들어, 약 또는 적어도 100g, 200g, 300g, 400g, 500g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3200g)의 세포를 펠렛화하는 데 사용되는 속도보다 낮은 속도로 회전할 수 있다. "상대 원심력" 또는 RCF라는 용어는 일반적으로, 회전축과 비교시 공간의 특정 지점에서 지구의 중력에 대하여, 물체 또는 물질(예: 세포, 샘플 또는 펠렛 및/또는 회전하는 챔버 또는 기타 용기의 한 지점)에 가해지는 유효력으로 이해된다. 그 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경(회전 축과 RCF가 측정되는 물체, 물질 또는 입자로부터의 거리)을 고려하여 잘 알려진 공식을 사용하여 결정할 수 있다. 일부 실시예에서, 세포, 예를 들어 CD4+ T세포 또는 CD8+ T세포의 자극된 조성물로부터의 세포와 바이러스와의 접촉, 부화 및/또는 조작의 적어도 일부는 약 100g 내지 3200g, 1000g 내지 2000g, 1000g 내지 3200g, 500g 내지 1000g, 400g 내지 1200g, 600g 내지 800g, 600g 내지 700g, 또는 500g 내지 700g의 회전으로 수행된다.
특정 실시예들에서, 조작, 형질도입 및/또는 형질감염의 적어도 일부는 회전, 예를 들어 회전 접종 및/또는 원심분리와 함께 수행된다. 일부 실시예에서, 회전은 약 또는 적어도 5분, 10분, 15분, 30분, 60분, 90분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 적어도 7일 동안 수행된다.
일부 실시예에서, 유전자 전달은 예를 들어 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정된 바와 같이 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 결합하는 것과 같이 먼저 세포를 활성화하고 나서 활성화된 세포의 형질도입 및 임상 적용에 충분한 수로 배양물의 확장함으로써 달성된다. 특정 실시예들에서, 유전자 전달은 먼저 활성화 단위 절차와 같은 활성화 조건에서 세포를 배양하여 수행된다.
일부 실시예에서, 형질도입 또는 형질감염을 위한 방법은 조성물의 하나 이상의 세포를 재조합 단백질, 예를 들어, 재조합 수용체를 코딩하는 핵산 분자와 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 실시예에서, 접촉은 회전 접종(예: 원심 접종)과 같은 원심 분리로 수행할 수 있다. 이러한 방법에는 국제 공개 번호 WO2016/073602에 기재된 것과 같은 방법이 포함된다.
특정 실시예들에서, 세포는 폴리양이온(polycations)과 같은 형질도입 보조제의 존재하에 형질도입된다. 특정 실시예들에서, 하나 이상의 형질도입 보조제의 존재는 형질도입의 효율을 증가시킨다. 특정 실시예에서, 폴리양이온의 존재 하에 조작된 세포의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%는 재조합 폴리뉴클레오티드를 함유하거나 발현한다. 일부 실시예에서, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% , 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1-배, 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 10-배, 적어도 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 적어도 100배의 조성물 세포가 형질도입 보조제의 존재 없이 세포를 조작하는 대안 및/또는 예시적인 방법과 비교하여 다중양이온의 존재 하에 재조합 형질도입 보조제를 함유하거나 발현하도록 조작된다.
일부 실시예에서, 세포가 100 ㎍/ml 미만, 90 ㎍/ml 미만, 80 ㎍/ml 미만, 75 ㎍/ml 미만, 70 ㎍/ml 미만, 60 ㎍/ml 미만, 50 ㎍/ml 미만, 40 ㎍/ml 미만, 30 ㎍/ml 미만, 25 ㎍/ml 미만, 20 ㎍/ml 미만, 또는 10 ㎍/ml 미만의 보조제의 존재 하에 형질감염 및/또는 형질도입된다. 특정 실시예들에서, 제공된 방법과 함께 사용하기에 적합한 아주반트는 폴리양이온, 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 유래 단편 또는 변이체, 및 레트로넥틴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 실시예에서, 폴리양이온은 양전하를 띠고 있다. 특정 실시예들에서, 폴리양이온은 세포와 벡터(예: 바이러스 또는 비바이러스 벡터) 사이의 반발력을 감소시키고 세포 표면에 대한 벡터의 접촉 및/또는 결합을 매개한다. 일부 실시예에서, 폴리양이온은 폴리브렌, DEAE-덱스트란, 프로타민 설페이트, 폴리-L-리신 또는 양이온성 리포솜이다.
일부 실시예에서, 세포는 위의 활성화 단위 절차에 설명된 것과 같은 활성화 시약의 존재 하에 있다.
일부 실시예에서, 세포 조작에는 벡터(예: 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터)와의 배양, 접촉 또는 배양이 포함된다. 특정 실시예에서, 조작은 벡터와 함께 세포를 배양, 접촉 및/또는 부화하는 것을 포함하며, 이는 약 또는 적어도 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 18시간, 24시간, 30시간, 36시간, 40시간, 48시간, 54시간, 60시간, 72시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일, 또는 7일 이상 동안 수행된다. 특정 실시예에서, 조작은 (약) 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 동안 또는 (약) 2일, 3일, 4 일 또는 5일 동안 벡터와 함께 세포를 배양, 접촉 및/또는 부화하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 조작 단계는 (약) 24시간, 36시간, 48시간, 60시간 또는 72시간 동안 수행된다. 특정 실시예에서, 조작은 (약) 2일 동안 수행된다.
일부 실시예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 또는 렌티바이러스, 비바이러스 벡터 또는 트랜스포존(예: 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템), 원숭이 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 감마-레트로바이러스 벡터, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV), 골수증식성 육종 바이러스(MPSV), 뮤린 배아줄기세포 바이러스(MESV), 뮤린 줄기세포 바이러스(MSCV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터 , 또는 비장 초점 형성 바이러스(SFFV)에서 유래된 벡터를 포함한다.
일부 실시예에서, 바이러스 벡터 또는 비바이러스 DNA는 이종 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 실시예에서, 이종 재조합 분자는 재조합 수용체(예: 항원 수용체), SB-트랜스포존(예: 유전자 침묵화 (gene silencing)용), 캡시드-봉입형 트랜스포존, 상동 이중 가닥 핵산(예: 게놈 재조합용) 또는 리포터 유전자(예: GFP와 같은 형광 단백질 또는 루시퍼라제와 같은 기타 리포터)이거나 이를 포함한다.
일부 실시예에서, 재조합 핵산은 예를 들어 유인원 바이러스 40(SV40), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV)에서 유래된 벡터와 같은 재조합 감염성 바이러스 입자를 사용하여 세포로 전달된다. 일부 실시예에서, 재조합 핵산은 감마-레트로바이러스 벡터와 같은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 T세포로 전달된다(예를 들어, Koste 등 (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens 등 (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino 등 (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park 등, Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조).
일부 실시예에서, 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(LTR)(예: Moloney murine leukemia virus(MoMLV), myeloproliferative sarcoma virus(MPSV), 쥐 배아 줄기 세포 바이러스(MESV), 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV), 비장 초점 형성 바이러스(SFFV) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)를 가진다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐의 레트로바이러스에서 파생된다. 일부 실시예에서, 레트로바이러스에는 모든 조류 또는 포유류 세포 공급원에서 유래된 바이러스가 포함된다. 레트로바이러스는 일반적으로 양쪽성이며, 이는 인간을 포함한 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 한 실시예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 gag, pol 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기술되어 있다(예: 미국 특허5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa 등 (1991) Virology 180:849-852; Burns 등 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).
렌티바이러스 형질도입 방법이 알려져 있다. 예시적인 방법은 예를 들어 Wang 등 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper 등 (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen 등 (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; and Cavalieri 등 (2003) Blood. 102(2): 497-505에 기술되어 있다.
일부 실시예에서, 바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스 게놈 기반 벡터에서 파생된 것과 같은 레트로바이러스 게놈 기반 벡터에서 파생된 게놈을 포함한다. 제공된 바이러스 벡터의 일부 측면에서, CAR과 같은 항원 수용체와 같은 재조합 수용체를 코딩하는 이종성 핵산은 벡터 게놈의 5' LTR과 3' LTR 서열 사이에 포함 및/또는 위치한다.
일부 실시예에서, 바이러스 벡터 게놈은 HIV-1 게놈 또는 SIV 게놈과 같은 렌티바이러스 게놈이다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 독성 유전자를 다중 약독화하여 생성되었다. 예를 들어, env, vif, vpu 및 nef 유전자는 삭제되어 벡터를 치료 목적으로 더 안전하게 만들 수 있다. 렌티바이러스 벡터가 알려져 있다. Naldini 등, (1996 and 1998); Zufferey 등, (1997); Dull 등, 1998, U.S. Pat. Nos. 6,013,516; and 5,994,136) 참조. 일부 실시예에서, 이러한 바이러스 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며 외래 핵산의 도입, 선택 및 숙주 세포로의 핵산 전달을 위한 필수 서열을 전달하도록 구성된다. 알려진 렌티바이러스는 American Type 컬처 컬렉션("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209)과 같은 기탁소 또는 컬렉션에서 쉽게 얻을 수 있거나 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 알려진 소스에서 분리할 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 비제한적인 예는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1), HIV-2, 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 T-림프영양 바이러스 1(HTLV-1), HTLV-2 또는 말 감염 빈혈 바이러스 (E1AV))과 같은 렌티바이러스에서 유래된 것을 포함한다. 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자를 다중 약독화하여 생성되었다. 예를 들어, env, vif, vpr, vpu 및 nef 유전자가 삭제되어 벡터를 치료 목적으로 더 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있다. Naldini 등, (1996 and 1998); Zufferey 등, (1997); Dull 등, 1998, 미국 특허 6,013,516; 및 5,994,136) 참조. 일부 실시예에서, 이러한 바이러스 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 외래 핵산을 통합하고, 선택하고, 핵산을 숙주 세포로 전달하기 위한 필수 서열을 운반하도록 구성된다. 알려진 렌티바이러스는 American Type Culture Collection("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209)과 같은 기탁소 또는 전시회에서 쉽게 얻을 수 있거나 일반적으로 사용 가능한 기술을 사용하여 알려진 소스에서 분리할 수 있다.
일부 실시예에서, 바이러스 게놈 벡터는 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스의 5' 및 3' LITR의 서열을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 바이러스 게놈 작제물은 렌티바이러스의 5' 및 3' LTR로부터의 서열을 함유할 수 있고, 특히 렌티바이러스의 5' LTR와 렌티바이러스의 불활성화 또는 자가 불활성화3' LTR로부터의 R 및 U5 서열을 함유할 수 있다. LTR 서열은 모든 종의 임의의 렌티바이러스의 LTR 서열일 수 있다. 예를 들어, HIV, SIV, FIV 또는 BIV의 LTR 서열일 수 있다. 일반적으로 LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
일부 실시예에서, HIV 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 핵산에는 추가적인 전사 단위가 없다. 벡터 게놈은 비활성화되거나 자체적으로 비활성화되는 3' LTR을 포함할 수 있다(Zufferey 등 J Virol 72: 9873, 1998; Miyoshi 등, J Virol 72:8150, 1998). 예를 들어, 바이러스 벡터 RNA를 생성하는 데 사용되는 핵산의 3' LTR의 U3 영역에서 결실을 사용하여 자가-불활성화(SIN) 벡터를 생성할 수 있다. 이러한 결실은 역전사 동안 proviral DNA의 5' LTR로 옮겨질 수 있다. 자가 불활성화 벡터는 일반적으로 벡터 통합 동안 5' LTR로 복사되는 3' 긴 말단 반복부(LTR)로부터 인핸서 및 프로모터 서열의 결실을 갖는다. 일부 실시예에서, LTR의 전사 활성을 없애기 위하여, TATA 상자의 제거를 포함하여, 충분한 순서를 제거될 수 있다. 이는 형질도입된 세포에서 전장 벡터 RNA의 생산을 방지할 수 있다. 일부 측면에서, 3' LTR의 U3 요소는 인핸서 서열, TATA 상자, Sp1 및 NF-카파 B 사이트의 결실을 포함한다. 자가 비활성화 3' LTR의 결과로 엔트리 및 역전사 후에 생성되는 프로바이러스는 비활성화된 5' LTR을 포함한다. 이는 벡터 게놈의 동원 위험과 LTR이 근처의 세포 프로모터에 미치는 영향을 줄임으로써 안전성을 향상시킬 수 있다. 자가-불활성화 3' LTR은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 이는 벡터 역가 또는 벡터의 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 특성에 영향을 미치지 않는다.
선택적으로, 렌티바이러스 5' LTR의 U3 서열은 이종 프로모터 서열과 같은 바이러스 작제물의 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 이는 포장 세포주에서 회수된 바이러스의 역가를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열도 포함될 수 있다. 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 어떠한 인핸서/프로모터 조합도 사용할 수 있다.일 예에서, CMV 인핸서/프로모터 서열이 사용된다(미국 특허 5,385,839 및 5,168,062).
특정 실시예들에서, 삽입 돌연변이 유발의 위험은 렌티바이러스 벡터 게놈과 같은 레트로바이러스 벡터 게놈을 통합 결함으로 구성함으로써 최소화될 수 있다. 비통합 벡터 게놈을 생성하기 위해 다양한 접근 방식을 추구할 수 있다. 일부 실시예에서, 돌연변이(들)는 pol 유전자의 인테그라제 효소 성분으로 조작되어 불활성 인테그라제가 있는 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 실시예에서, 벡터 게놈 자체는 예를 들어, 하나 또는 두 개의 부착 부위를 돌연변이 또는 결실시키거나, 결실 또는 변형을 통해 3' LTR-근위 폴리퓨린관(PPT)을 비기능화함으로써 통합을 방지하도록 변형될 수 있다. 일부 실시예에서, 비유전적 접근이 가능하다. 여기에는 하나 이상의 인테그라제의 기능을 억제하는 약리학적 작용제가 포함된다.
접근 방식은 상호 배타적이지 않다. 즉, 한 번에 둘 이상을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인테그라제와 부착 사이트가 모두 작동하지 않거나, 인테그라제와 PPT 사이트가 작동하지 않거나, 부착 사이트와 PPT 사이트가 작동하지 않거나, 이들 모두가 비기능적일 수 있다. 이러한 방법과 바이러스 벡터 게놈은 알려져 있고 이용 가능하다 (Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman 등 J Virol 69:2729, 1995; Brown 등 J Virol 73:9011 (1999); WO 2009/076524; McWilliams 등, J Virol 77:11150, 2003; Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996 참조).
일부 실시예에서, 벡터는 원핵 숙주 세포와 같은 숙주 세포에서 증식을 위한 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 바이러스 벡터의 핵산은 세균 세포와 같은 원핵 세포에서 증식을 위한 하나 이상의 복제 기점을 포함한다. 일부 실시예에서, 원핵생물 복제 기원을 포함하는 벡터는 또한 발현이 약물 내성과 같은 검출 가능하거나 선택 가능한 마커를 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터 게놈은 일반적으로 패키징 또는 생산자 세포주로 형질감염될 수 있는 플라스미드 형태로 구성된다. 다양한 공지된 방법을 사용하여 게놈에 바이러스 벡터 게놈의 RNA 사본이 포함된 레트로바이러스 입자를 생성할 수 있다. 일부 실시예에서, 적어도 두 가지 구성 요소가 바이러스 기반 유전자 전달 시스템을 만드는 데 관련된다. 첫 번째는 구조 단백질과 바이러스 벡터 입자를 생성하는 데 필요한 효소를 포함하는 포장 플라스미드이고 두 번째는 바이러스 벡터, 즉 전달될 유전 물질 자체이다. 바이오안전 보호수단은 이러한 구성요소 중 하나 또는 둘 모두의 설계에 도입될 수 있다.
일부 실시예에서, 포장 플라스미드는 HIV- 1과 같은 모든 레트로바이러스, 외피(envelop) 단백질 이외의 단백질을 포함할 수 있다 (Naldini 등, 1998). 다른 실시예에서, 바이러스 벡터는 독성, 예를 들어, vpr, vif, vpu 및 nef, 및/또는 HIV의 1차 전사활성화제인 Tat와 관련된 것과 같은 추가적인 바이러스 유전자가 결여될 수 있다. 일부 실시예에서, HIV 기반 렌티바이러스 벡터와 같은 렌티바이러스 벡터는 부모 바이러스의 3 가지 유전자인 gag, pol 및 rev로 구성되며, 재조합을 통해 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 줄이거나 제거한다.
일부 실시예에서, 바이러스 입자는 형질도입될 세포의 총 수(IU/세포)당 바이러스 벡터 입자 또는 이의 감염 단위(IU)의 특정 비율의 사본으로 제공된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 바이러스 입자는 세포 1개당 바이러스 벡터 입자의 약 또는 적어도 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 또는 60 IU에서 접촉하는 동안 존재한다.
일부 실시예에서, 바이러스 벡터 입자의 역가는 (약) 1 x 106 IU/mL 내지 1 x 108 IU/mL, 예컨대 (약) 5 x 106 IU/mL 내지 5 x 107 IU/mL, 예컨대 적어도 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL, 또는 5 x107 IU/mL 이다.
일부 실시예에서, 형질도입은 일반적으로 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 이하와 같이 100 미만의 감염 다중도(MOI)에서 달성될 수 있다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 세포를 바이러스 입자와 접촉시키거나 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 접촉시키는 것은 30분 내지 72시간 동안, 예컨대 적어도 30분 내지 48시간, 30분 내지 24시간 또는 1시간 내지 24시간 동안, 예컨대 적어도 또는 약 적어도 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간 이상이다.
특정 실시예들에서, 입력 세포는 바이러스 DNA에 의해 암호화되는 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 결합 분자를 포함하는 입자로 처리, 배양 또는 접촉된다.
일부 실시예에서, 바이러스 벡터 입자와 세포의 부화는 바이러스 벡터 입자로 형질도입된 세포를 포함하는 출력 조성물을 가져오거나 생성한다.
접종 단위 작업
형질도입 단위 작업(220)이 완료되면, 제어 시스템은 접종 단위 작업(230)을 시작한다. 이하에 설명되는 접종 방법은 형질도입 방법 내에서 사용된 복제 웰의 수를 기준으로 한 번에 72개의 조건으로 시스템을 실행하도록 구성된다. 그러나, 이는 다른 시스템 및/또는 시스템 구성 요소로 확장되거나 축소될 수 있다. 예를 들어 방법 내에서 복제 수 1을 사용하여 192개 조건을 처리할 수 있다. 여기에서 형질도입된 세포는 확장을 위해 포유동물 세포 딥웰 플레이트로 옮겨지고 사용자는 정방향 처리 또는 표적 접종 TNC에 대한 기본 설정을 입력하라는 메시지가 표시된다.
접종 단위 작업(230)은 작업대 설정으로 시작된다. 실시예들에서, 사용자는 DiTi, 시약 통, 세포 배양 배지, 세포 계수 시약으로 작업대 60을 설정하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 접종 모드를 입력하라는 메시지-원하는 TNC를 기반으로 하는 정방향 처리 또는 대상 접종-표시된다. 실시예들에서, 사용자는 조건 번호, 복제 수(형질 도입 방법 기반), 배양 부피(형질 도입 접종 부피 기반)을 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 총 샘플링 및 AAA/유세포 분석 부피를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 실시간으로 또는 예를 들어 도 17에 도시된 바와 같이 방법(200)의 시스템(10)의 개시 전에 사용자에 의해 설정된 스크립트의 일부로서 이러한 매개변수를 입력하도록 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 입력된 조건의 수에 따라 샘플링 및 접종 플레이트가 있는 작업대(60)를 설정하라는 메시지가 표시된다. 샘플링 플레이트에는 96-딥웰 플레이트, 96-웰 저부착 플레이트(세포 계수) 및 96-웰 둥근 바닥 플레이트(AAA/유세포 분석)가 포함된다.
작업대(60) 설정이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 샘플링이 시작된다. 플레이트가 열린다. 복제 수가 2인 경우, 가요성 액체 조작 모듈(40)은 복제 웰을 단일 웰로 결합하도록 진행한다. 결합된 각 샘플 웰을 혼합한 다음 샘플당 총 샘플링 부피를 흡인하여 96-딥웰 플레이트에 분배한다. 플레이트를 다시 닫는다. 그런 다음 분배된 샘플링 부피를 혼합하고 세포 계수 및 분석 샘플 플레이트(예: AAA/유세포 분석 플레이트)에 분취한다. 실시예들에서, 세포 계수 시약은 입력된 조건의 수에 따라 저부착 세포 계수 플레이트에 분배된다. 특정 실시예들에서, 샘플링 플레이트에 대한 세포 수는 세포 계수 모듈(75)에 의해 자동으로 판독된다. 다른 실시예에서, 샘플링 플레이트는 사용자가 접근할 수 있도록 작업대(60)의 전면으로 가져온 다음 수동 세포 계수를 위해 사용자에 의해 작업대(60)에서 치워진다. 세포 농도 측정은 세포 계수 모듈(75)로부터 자동으로 또는 사용자에 의해 수동으로 입력되는 것과 같이 시스템 제어기(20)에 의해 얻어진다.
샘플링이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 접종이 시작된다. 표적 접종이 선택되면 사용자는 측정된 VCC, 원하는 접종 TNC 및 VCC를 입력하라는 메시지가 표시된다. 현재 VCC를 기반으로 목표 TNC에 도달하는 데 필요한 세포 부피와 원하는 접종 VCC에 도달하는 데 필요한 균형 배지 부피가 계산된다. 정방향 처리를 선택하면 측정된 VCC 값을 입력하라는 메시지가 표시되지 않고 직접 접종을 진행할 수 있다. 사용자 입력에 따라 사용자는 입력된 조건의 수에 따라 "n" 개의 24-딥웰 확장 플레이트를 배치하라는 메시지가 표시된다. 용기 조작 모듈(50)은 확장 플레이트와 확장 플레이트 모두를 열고, 사용자 입력에 따라 접종 TNC에 도달하기 위해 필요한 확장된 세포 재료 또는 전체 확장 플레이트 내용물을 분배한다. 가요성 액체 조작 모듈(40)은 3mL의 최종 접종 부피에 도달하도록 조건별로 균형 세포 배양 배지를 24-딥웰 확장 플레이트의 각 웰에 분배한다. 편심 핑거(52)를 사용하는 용기 조작 모듈(50)은 작업대(60)의 모든 24-딥웰 확장 플레이트를 덮는다. 실시예들에서, 플레이트는 접종을 위해 자동으로 포유류 세포 배양기로 옮긴다. 실시예들에서, 남아 있는 모든 실험 기구는 작업대에서 자동으로 치운다. 실시예들에서, 사용자에게 접종을 위해 인큐베이터에 플레이트를 넣으라는 메시지가 표시된다. 실시예에서 사용자는 작업대에서 남아 있는 모든 실험기구를 치우라는 메시지가 표시된다. 그런 다음 사용자는 작업대(60)에서 남아 있는 모든 실험기구를 치우라는 메시지가 표시된다.
확장 단위 작업
도 17을 참조하면, 접종 단위 작업(230)이 종료되면, 제어 시스템은 확장 단위 작업(240)을 개시한다. 실시예들에서, 접종 단위 작업(230) 및 확장 단위 작업(240)은 수행되는 부피 축소 프로세스에 기초하여 예를 들어 약 1일 내지 약 3일 사이의 부화 기간으로 분리된다. 확장 단위 작업(240)은 작업대를 설정하는 것으로 시작된다. 실시예들에서, 사용자는 DiTi, 시약 통, 세포 배양 배지, 세포 계수 시약을 사용하여 작업대(60)을 설정하라는 메시지가 표시된다. 사용자에게 균형 24-딥웰 확장 플레이트를 작업대(60)에 놓으라는 메시지가 표시된다. 균형 24-딥웰 확장 플레이트는 세포 원심분리에 사용된다. 실시예들에서, 사용자에게 조건 번호와 확장 부피를 입력하라는 메시지가 표시된다. 사용자는 총 샘플링 및 AAA/유세포 분석 부피를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 입력된 조건의 수를 기반으로 샘플링 및 "n" 수의 24-딥웰 확장 플레이트를 사용하여 작업대 (60)을 설정하라는 메시지가 표시된다. 샘플링 플레이트에는 96-딥웰 플레이트, 96-웰 저부착 플레이트(세포 계수) 및 96-웰 둥근 바닥 플레이트(AAA/유세포 분석)가 포함된다. 일부 예에서, 하나 이상의 전술한 단계는 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 자동으로 수행될 수 있다.
작업대(60) 설정이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 샘플링이 시작된다. 확장 플레이트를 열고 나서 샘플당 총 샘플 부피를 흡인하여 96-딥웰 플레이트에 분배한다. 확장 플레이트는 용기 조작 모듈(50)을 사용하여 다시 닫는다. 그런 다음 분배된 샘플링 부피를 혼합하고 세포 계수 및 AAA/유세포 분석 플레이트에 분취한다. 세포 계수 시약은 입력된 조건의 수에 따라 저부착 세포 계수 플레이트에 분배된다. 특정 실시예들에서, 샘플링 플레이트에 대한 세포 수는 세포 계수 모듈(75)에 의해 자동으로 판독된다. 다른 실시예에서, 샘플링 플레이트는 사용자가 접근할 수 있도록 작업대(60)의 전면으로 가져온 다음 수동 세포 계수를 위해 사용자가 작업대(60)에서 치운다. 세포 농도 측정은 세포 계수 모듈(75)로부터 자동으로 또는 사용자에 의해 수동으로 입력되는 것과 같이 시스템 제어기(20)에 의해 얻어진다. 현재 확장 방법은 조건당 측정된 VCC를 사용하여 방법이 세포 계수와 독립적으로 진행되도록(예: 시스템이 셀 카운트와 무관하게 프로세스를 전달할 수 있음) 허용한다.
샘플링이 완료되면 모의 관류/세포 배양 배지 교환이 제어 시스템(20)에 의해 시작된다. 용기 조작 모듈(50)은 중심 핑거(54)를 사용하여 확장 플레이트와 그 균형 플레이트(홀수개의 24-딥웰 원심분리기 플레이트만 있음)를 로봇 원심분리기(65) 내로 수직으로 운반한다. 원심분리 후, 용기 조작 모듈(50)은 24-딥웰 원심분리기 플레이트를 다시 작업대(60)로 반환한다. FES를 사용하여 용기 조작 모듈(50)은 중심 핑거(54)를 편심 핑거(52)로 교체하고 확장판의 덮개를 연다. FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)은 그 다음 아래의 세포 펠릿을 제거하지 않고 확장 부피 세포 배양 상청액의 일부를 제거할 수 있다. 이는 입력된 조건의 수에 따라 웰당 수행된다. FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)은 입력으로서 최종 확장 부피에 도달하기 위해 조건당 24-딥웰 확장 플레이트의 각 웰에 신선한 세포 배양 배지를 분배한다. 편심 핑거(52)를 사용하는 용기 조작 모듈(50)은 작업대(60)의 모든 24-딥웰 확장 플레이트를 덮는다. 실시예들에서, 플레이트는 자동으로 포유류 세포 인큐베이터로 옮겨진다. 실시예들에서, 남아 있는 모든 실험 기구는 작업대에서 자동으로 치워진다. 실시예들에서, 사용자에게 인큐베이터에 플레이트를 올려놓으라는 메시지가 표시된다. 실시예에서 사용자는 작업대에서 남아 있는 모든 실험기구를 치우라는 메시지가 표시된다. 그런 다음 사용자는 작업대(60)에서 남아 있는 모든 실험기구를 치우라는 메시지가 표시된다.
이하에서 설명되는 확장 방법은 한 번에 최대 192개의 조건으로 시스템을 실행하도록 구성된다. 이 방법은 샘플링 및 모의 관류 단계를 수행한다. 특정 실시예들에서, 모의 관류는 확장 플레이트의 원심분리에 의해 실행된 후 매체 교환이 뒤따른다. 특정 실시예들에서, 세포 통과 전략은 조건 웰당 VCC를 기반으로 정의된다.
일부 실시예에서, 세포는 증식 및/또는 확장을 촉진하는 조건에서 배양된다. 일부 실시예에서, 이러한 조건은 개체군에서 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하도록 설계될 수 있다. 특정 실시예에서, 활성화 조건은 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예를 들어 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예를 들어 사이토카인, 케모카인, 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포의 성장, 분열 및/또는 확장을 촉진하도록 설계된 기타 작용제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 배양은 일반적으로 인간 T 림프구와 같은 1차 면역 세포의 성장에 적합한 온도, 예를 들어 적어도 약 섭씨 25도, 일반적으로 적어도 약 30도 및 일반적으로 섭씨 또는 약 섭씨 37도를 포함하는 조건하에서 수행된다. 일부 실시예에서, 농축 T세포의 조성물은 25~38℃, 예를 들어 30~37℃, 예를 들어 약 37℃ ± 2℃의 온도에서 배양된다. 일부 실시예에서, 부화는 배양, 예를 들어 양성 또는 확장이 원하는 밀도 또는 역치 밀도, 세포 수 또는 투여량에 이를 때까지 일정 기간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 부화는 (약) 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일 또는 그 이상 동안 약 또는 그 이상이다.
일부 실시예에서, 활성화 시약은 배양 전에 세포에서 제거 및/또는 분리된다. 일부 실시예에서, 활성화 시약은 활성화 단위 절차에 설명된 활성화 시약이다. 일부 실시예에서, 활성화 시약은 배양 후 또는 배양 중에 세포에서 제거 및/또는 분리된다.
특정 실시예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 배양된다. 특정 실시예들에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 실시예들에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 T세포에 의해 발현되고/되거나 T세포에 내인성인 수용체에 결합 및/또는 결합할 수 있다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-나선 번들 패밀리의 구성원이거나 이를 포함한다. 일부 실시예에서, 사이토카인의 4-알파 나선 번들 패밀리의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 일부 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-15이거나 이를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-7 이거나 이를 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 재조합 IL-2 이거나 이를 포함한다.
일부 실시예에서, 배양은 세포가 역치 양, 밀도 및/또는 확장을 달성하는 데 필요한 시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 배양은 (약) 6 시간, 12 시간, 18 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 60 시간, 72 시간, 2 일, 3 일 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 1 주, 2 주, 3 주, 또는 4 주 또는 그 미만 동안 수행한다.
디비딩 단위 작업
도 17을 참조하면, 확장 단위 작업(240)이 종료되면 제어 시스템은 디비딩 단위 작업(250)을 시작한다. 디비딩 단위 작업(250)은 작업대 설정으로 시작된다. 실시예들에서, 사용자에게 DiTi, 시약 통, 세포 배양 배지, 세포 계수 시약을 구비한 작업대(60)를 설정하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 스커트형 자석을 작업대(60)에 놓으라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 조건 번호와 확장 부피를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 총 샘플링 및 AAA/유동 세포 계측법 부피와 같은 분석 샘플 부피를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 디비딩 후 두 번째 샘플링 단계를 원하는지 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자는 입력된 조건의 수를 기반으로 샘플링 및 "n" 수의 24-딥웰 확장 플레이트를 사용하여 작업대(60)을 설정하라는 메시지가 표시된다. 샘플링 플레이트에는 96-딥웰 플레이트, 96-웰 저부착 플레이트(세포 계수) 및 96-웰 둥근 바닥 플레이트(분석 샘플 플레이트, 예: AAA/유세포 분석 샘플 플레이트)가 포함된다. 일부 예에서, 하나 이상의 전술한 단계는 본 개시내용의 범위를 벗어나지 않고 자동으로 수행될 수 있다.
일단 작업대(60) 설정 모듈이 완료되면, 샘플링은 제어 시스템(20)에 의해 시작된다. 확장 플레이트를 열고 나서 샘플당 총 샘플 부피를 흡인하여 96-딥웰 플레이트에 분배한다. 확장 플레이트를 다시 닫는다. 그런 다음 분배된 샘플링 부피를 혼합하고 세포 계수 및 AAA/유세포 분석 플레이트에 분취한다. 세포 계수 시약은 입력된 조건의 수에 따라 저부착 세포 계수 플레이트에 분배된다. 특정 실시예들에서, 샘플링 플레이트에 대한 세포 수는 세포 계수 모듈(75)에 의해 자동으로 판독된다. 다른 실시예에서, 샘플링 플레이트는 사용자가 접근할 수 있도록 작업대(60)의 전면으로 가져온 다음 수동 세포 계수를 위해 사용자에 의해 작업대(60)에서 치워진다. 세포 농도 측정은 세포 계수 모듈(75)로부터 자동으로 또는 사용자에 의해 수동으로 입력되는 것과 같이 시스템 제어기(20)에 의해 얻어진다. 디비딩 방법은 조건당 측정된 VCC를 FIO로 사용하므로 상기 방법은 세포 수와 무관하게 진행할 수 있다.
샘플링이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 디비딩이 시작된다. 실시예들에서, 사용자는 입력된 조건의 수에 기초하여 작업대(60)에 "n"개의 새로운 24-딥웰 확장 플레이트를 배치하라는 메시지가 표시된다. 편심 핑거(52)를 사용하여 용기 조작 모듈(50)은 원래 및 새로운 24-딥웰 확장 플레이트를 열게 된다. FES를 사용하여 용기 조작 모듈(50)은 중심을 위한 편심 핑거(52)를 교체하고 원래의 확장 플레이트를 스커트형 자석에 배치한다. 상기 방법은 디비딩이 발생할 수 있도록 5분 동안 일시 중지한다. 그런 다음 가요성 액체 조작 모듈(40)은 디비딩 산물을 흡인하고 이를 새로운 24-딥웰 확장 플레이트에 분배한다. 흡인은 아래의 비드 펠릿을 방해하지 않도록 x 오프셋으로 발생한다. 편심 핑거(52)를 사용하는 RGA와 같은 용기 조작 모듈(50)은 모든 24-딥웰 확장 플레이트에 의존한다.
디비딩이 완료되면 제어 시스템(20)에 의해 두 번째 샘플링이 시작된다. 그런 다음 사용자는 작업대(60)에서 모든 실험기구를 치우고 수확 또는 접종을 준비하라는 메시지가 표시된다.
디비딩 단위 작업(250)은 접종 전의 처리 T세포와 수확 전의 T세포 모두에 적용할 수 있다. 여기에서 24-딥웰 확장 플레이트는 데크에 배치되고, 샘플링되고, 계수되고, 온-데크 자석에 배치되고 24-딥웰 확장 플레이트로 옮겨진다. 디비딩은 상기 방법의 실행에 필요한 작업대(60)의 차이로 인해 수확 또는 접종에서 독립형 방법이다. 이 방법은 2단계의 샘플링을 허용한다. 한 단계는 디비딩 이전에, 나머지 단계는 디비딩 직후에 행해진다. 두 번째 샘플링 단계는 두 가지 용도로 사용된다. 첫 번째는 디비딩 세포 수율의 사용자 결정을 허용하는 것이고, 다른 하나는 수확 방법 처리를 알리는 데 사용되는 디비딩 후 업데이트된 세포 측정값을 제공하는 것이다.
수확 단위 작업
디비딩 단위 작업(250)이 완료되면, 제어 시스템은 수확 단위 작업(260)을 시작한다.
수확 단위 작업(260) 은 작업 테이블 설정으로 시작된다. 실시예들에서, 사용자에게 DiTi, 시약통 및 동결보존 매체를 사용하여 작업대(60)를 설정하라는 메시지가 표시된다. 일부 실시예에서, 작업대는 또한 설명된 방법에 사용하기 전에 시약을 냉각시키는 냉각 장치(61)를 포함한다. 냉각 장치(61)는 열전 냉각기, 냉매에 의존하는 냉각기, 절연 겔 또는 기타 절연 재료에 의존하는 냉각기, 그 중에서도 액체 질소, 드라이아이스 및/또는 물 얼음 중 하나 이상과 함께 사용하기 위한 냉각기일 수 있다. 실시예들에서, 균형 24-딥웰 확장플레이트를 작업대(60)에 놓으라는 메시지가 사용자에게 표시된다. 균형24-딥웰 확장 플레이트는 세포 원심분리에 사용된다. 실시예들에서, 사용자에게 조건 번호, 확장 배양 부피 및 디비딩 샘플링 부피를 입력하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 사용자에게 VCC와 조건당 동결 보존할 바이알 수를 수확 엑셀 워크북에 입력하라는 메시지가 표시된다. 현재 VCC와 원하는 VCC 및 동결 바이알 당 TNC를 기반으로 필요한 디비딩 산물 부피 및 동결보존매체가 계산된다. 조건당 바이알 번호는 분석 테스트를 위한 복제 바이알 역할을 한다. 실시예들에서, 사용자에게 입력에 따라 캡이 없는 동결 바이알의 세트 수를 추가하여 작업대(60)를 설정하라는 메시지가 표시된다. 실시예들에서, 그런 다음 사용자에게 디비딩 산물 플레이트를 작업대(60) 위에 올려놓으라는 메시지가 표시된다.
작업대(60) 설정이 완료되면 세포 샘플의 동결보존이 제어 시스템 (20)에 의해 시작된다. 중심 핑거(54)가 있는 용기 조작 모듈(50)은 팽창 플레이트와 그 균형 플레이트를 로봇 원심 분리기(65) 내로 수직으로 운반한다. 원심분리 후, 디비딩 산물 플레이트는 작업대(60)로 반환된다. 용기 조작 모듈(50)은 디비딩 산물 플레이트의 뚜껑을 열고, 조건 웰당 상청액의 FCA 흡인과 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)이 따른다. 흡인은 세포 펠릿이 방해받지 않도록 잘 오프셋된 감소된 속도로 수행된다. 가요성 액체 조작 모듈(40)은 입력으로서 원하는 동결보존 VCC에 도달하는 데 필요한 균형 동결매체 부피를 분배한다. FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)은 입력된 조건의 수에 따라 디비딩 산물 플레이트의 각 웰에 가변 부피의 동결보존 매체를 분배함으로써 뒤따른다. FCA와 같은 가요성 액체 조작 모듈(40)은 동결보존 배지와 펠렛화된 세포의 완전한 혼합을 보장하기 위해 2회의 혼합 사이클을 수행한다. 그런 다음 가요성 액체 조작 모듈(40)은 원하는 VCC 입력을 충족하는 데 필요한 동결 바이알당 원하는 TNC를 흡인한다. 각 조건에 대해 세포는 조건당 할당된 동결 바이알의 수를 기반으로 동결 바이알에 분배된다. 튜브 핑거(56)를 사용하는 용기 조작 모듈(50)은 입력으로서 요구되는 총 동결 바이알에 기초하여 각각의 동결 바이알을 덮는다. 실시예들에서, 그런 다음 사용자에게 동결 바이알을 세포 동결 용기 또는 제어 속도 냉동기(CRF)에 넣으라는 메시지가 표시된다. 편심 핑거(52)가 구비된 용기 조작 모듈(50)은 디비딩 산물 플레이트를 지지하고 사용자에게 작업대(60)에서 모든 실험기구를 치우라는 메시지가 표시된다.
설명된 수확 방법은 현재 최대 24개의 세포 배양 조건을 처리하고 한 번에 최대 96개의 바이알을 동결 보존할 수 있다. 디비딩 방법 중 측정된 VCC를 기반으로 사용자는 원하는 세포 밀도로 동결 보존된 세포를 사용할 수 있다.
재조합 단백질
구현예에서, 본원에 개시된 방법 및 시스템은 T세포와 같은 세포, 예를 들어 재조합 단백질, 예를 들어 재조합 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 T세포 수용체(TCR))를 함유하거나 발현하는, 또는 함유하거나 발현하도록 조작된 CD4+ 및/또는 CD8+ T세포를 생산하기 위하여 사용된다. 특정 실시예들에서, 본원에서 제공된 방법은 재조합 단백질을 발현하거나 함유하도록 조작된 세포, 또는 세포를 함유하고/하거나 농축된 세포 개체군 또는 조성물을 생산 및/또는 생산 가능하다.
세포는 일반적으로 기능적 비-TCR 항원 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체(CAR))를 포함하는 항원 수용체, 및 트랜스제닉 T세포 수용체(TCR)와 같은 다른 항원 결합 수용체와 같은 재조합 수용체를 발현한다. 상기 수용체 중에는 다른 키메라 수용체들도 있다.
키메라 항원 수용체
제공된 방법 및 용도의 일부 실시예에서, 키메라 항원 수용체와 같은 키메라 수용체는 원하는 항원(예를 들어, 종양 항원)에 대한 특이성을 제공하는 리간드 결합 도메인(예: 항체 또는 항체 단편)을 세포내 신호전달 도메인과 결합시키는 하나 이상의 도메인을 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 1차 활성화 신호를 제공하는 T세포 활성화 도메인과 같은 활성화 세포내 도메인 부분이다. 일부 실시예에서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능을 촉진하기 위해 공동자극 신호전달 도메인을 포함하거나 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 면역 세포로 유전적으로 조작된 키메라 수용체는 T세포 활성을 조절할 수 있고, 어떤 경우에는 T세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있어 입양 세포 치료 방법에 사용하기 위한 것과 같이 생체 내에서 수명, 생존 및/또는 지속성이 개선된 유전적으로 조작된 세포를 생성할 수 있다.
CAR을 비롯한 예시적인 항원 수용체 및 이러한 수용체를 조작하고 세포 내로 도입하는 방법은 예를 들어, 국제 특허 출원 공개 번호 WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개번호 US2002131960, US2013287748, US20130149337, 미국 특허 번호 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 및 8,479,118, 그리고 유럽특허 출원 EP2537416에 기재된 것들 및/또는 Sadelain 등, Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila 등 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle 등, Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu 등, Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에 기재된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 항원 수용체는 미국특허 7,446,190 및 국제 특허 출원 공개 WO/2014055668 A1에 기술된 것을 포함한다. 상기 CAR의 예시는 WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 7,446,190 및 8,389,282, Kochenderfer 등, 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang 등 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; and Brentjens 등, Sci Transl Med. 2013 5(177) 등과 같은 상기 언급된 간행물 중 어느 하나에 개시된 바와 같은 CAR을 포함한다. WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 7,446,190 및 8,389,282도 참조 가능하다.
CAR과 같은 키메라 수용체는 일반적으로 항체 분자의 일부, 일반적으로 항체(예를 들어, scFv 항체 단편)의 가변 중쇄(VH) 영역 및/또는 가변 경쇄(VL) 영역과 같은 세포외 항원 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 폴리펩티드이다. 일부 실시예에서, 그것은 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 실시예에서, 항원은 정상 또는 비표적화된 세포 또는 조직과 비교하여 질병 또는 상태의 세포, 예를 들어 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 실시예에서, 항원은 정상 세포 상에서 발현되고/거나 조작된 세포 상에서 발현된다.
일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 임의의 것과 같은 B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이다.
일부 실시예에서, 상기 키메라 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편 및 세포내 신호전달 도메인을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다.
일부 실시예에서, 재조합 수용체(예: CAR)의 항체 부분은 힌지 영역(예: IgG4 힌지 영역) 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc와 같은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부 영역을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 부분은 항원 인식 구성요소(예: scFv)와 막횡단 도메인 사이의 스페이서 영역 역할을 한다. 스페이서는 스페이서가 없는 경우와 비교하여 항원 결합 후 세포의 증가된 반응성을 제공하는 길이일 수 있다. 예시적인 스페이서는 Hudecek 등 (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, 국제 특허출원 공개번호 WO2014031687, 미국 특허 8,822,647 또는 미국 특허 출원 공개번호 US2014/0271635에 기술된 것들을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
일부 실시예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1과 같은 인간 IgG의 것이다.
일부 실시예에서, 항원 수용체는 세포외 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 세포외 도메인과 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 항원 인식 도메인(예: 세포외 도메인)은 일반적으로 CAR의 경우 TCR 복합체와 같은 항원 수용체 복합체를 통해 활성화를 모방하는 신호전달 성분과 같은 하나 이상의 세포내 신호전달 성분 및/또는 신호에 다른 세포 표면 수용체를 통해 연결된다. 일부 실시예에서, 키메라 수용체는 세포외 도메인(예: scFv)과 세포내 신호전달 도메인 사이에 연결되거나 융합된 막횡단 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 실시예에서, 항원 결합 성분(예: 항체)은 하나 이상의 막횡단 및 세포내 신호전달 도메인에 연결된다.
일 실시예에서, 수용체, 예를 들어 CAR 내의 도메인 중 하나와 자연적으로 회합된 막횡단 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막횡단 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막횡단 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 실시예에서 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서 도메인은 임의의 막 결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래된다. 막횡단 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로부터 유래된(즉, 적어도 막횡단 영역(들)을 포함하는) 것들을 포함한다. 대안적으로, 일부 실시예에서 막횡단 도메인은 합성이다. 일부 측면에서, 합성 막횡단 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서는, 합성 막횡단 도메인의 각 말단에서 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중항이 발견된다. 일부 실시예에서, 연결은 링커, 스페이서 및/또는 막횡단 도메인(들)에 의한 것이다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 포함한다.
일부 실시예에서, 세포외 도메인 및 막횡단 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시예에서, 세포외 도메인 및 막횡단은 본원에 기재된 것과 같은 스페이서에 의해 연결된다. 일부 실시예에서, 수용체는 CD28 세포외 부분과 같이 막횡단 도메인이 유래된 분자의 세포외 부분을 함유한다.
세포내 신호전달 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동자극 수용체와 조합된 이러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 공동자극 수용체 단독을 통한 신호를 모방하거나 근사하는 것이 있다. 일부 실시예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예를 들어 2 내지 10개 아미노산 길이의 링커, 예를 들어 글리신 및 세린을 함유하는 링커, 예를 들어 글리신-세린 이중선이 존재하고 막횡단 도메인과 CAR의 세포질 신호전달 도메인 사이에 연결을 형성한다.
T세포 활성화는 일부 측면에서 2가지 부류의 세포질 신호전달 서열: TCR(1차 세포질 신호전달 서열)을 통해 항원-의존성 1차 활성화를 개시하는 것들, 및 항원-독립적 방식으로 작용하여 2차 또는 공동 자극 신호(2차 세포질 신호 전달 서열)를 제공하는 것들에 의해 매개되는 것으로 기술된다. 일부 측면에서, 상기 CAR 은 이러한 신호전달 성분 중 하나 또는 둘 다를 포함한다.
수용체(예를 들어, CAR)는 일반적으로 적어도 하나의 세포내 신호전달 성분 또는 성분들을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호전달 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 알려진 신호 모티프를 포함할 수 있다. 1차 세포질 신호전달 서열을 함유하는 ITAM의 예는 CD3 제타 사슬, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타 및 CD3 입실론으로부터 유래된 것을 포함한다. 일부 실시예에서, CAR의 세포질 신호전달 분자(들)는 세포질 신호전달 도메인, 이의 부분 또는 CD3 제타에서 유래된 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 수용체는 T-세포 활성화 및 세포독성을 매개하는 TCR CD3 사슬(예: CD3 제타 사슬)과 같은 TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호전달 모듈에 연결된다. 일부 실시예에서, 세포 신호전달 모듈은 CD3 막횡단 도메인, CD3 세포내 신호전달 도메인, 및/또는 기타 CD3 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용체(예를 들어, CAR)는 Fc 수용체, CD8, CD4, CD25 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체는 CD3-제타(CD3-) 또는 Fc 수용체와 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메라 분자를 포함한다.
일부 실시예에서, CAR 또는 다른 키메라 수용체의 결찰 시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인은 면역 세포(예를 들어, CAR를 발현하도록 조작된 T세포)의 정상 작동체(effector) 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화한다. 예를 들어, 일부 맥락에서, CAR은 사이토카인 또는 기타 인자의 분비와 같은 세포용해 활성 또는 T-헬퍼 활성과 같은 T세포의 기능을 유도한다. 일부 실시예에서, 항원 수용체 성분 또는 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 잘린 부분은 예를 들어 작동체 기능 신호를 변환하는 경우 온전한 면역자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 실시예에서, 세포내 신호전달 도메인 또는 도메인들은 T세포 수용체(TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 일부 측면에서는 또한 자연적 맥락에서 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 이러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동-수용체의 서열을 포함한다.
자연적인 TCR의 맥락에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호전달 뿐만 아니라 공동자극 신호를 필요로 한다. 따라서, 일부 실시예에서, 완전한 활성화를 촉진하기 위해 2차 또는 공동 자극 신호를 생성하기 위한 구성 요소도 CAR에 포함된다. 다른 실시예에서, CAR은 공동자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가 CAR은 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공동자극 신호를 생성하기 위한 구성요소를 제공한다.
일부 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 T세포 공동자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 실시예에서, 상기 CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은 공동자극 수용체의 신호전달 도메인 및/또는 막횡단 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR에는 활성화 및 공동자극 구성요소가 모두 포함된다. 일부 실시예에서, 키메라 항원 수용체는 T세포 공동자극 분자로부터 유래된 세포내 도메인 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어 막횡단 도메인과 세포내 신호전달 도메인 사이를 함유한다. 일부 측면에서, T세포 공동자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
일부 실시예에서, 활성화 도메인은 하나의 CAR 내에 포함되는 반면, 공동자극 성분은 다른 항원을 인식하는 또 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 실시예에서, 상기 에는 활성화 또는 자극 CAR, 공동자극 CAR이 포함되며 둘 다 동일한 세포에서 발현된다(WO2014/055668 참조). 일부 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 공동자극 CAR을 포함한다. 일부 실시예에서, 세포는 억제성 CAR(iCAR, Fedorov 등, Sci. Transl. Medicine, 5(215)(December, 2013) 참조), 예를 들어 질병 또는 질병-표적화 CAR을 통해 전달되는 활성화 신호가 억제성 CAR이 그의 리간드에 결합함으로써(예를 들어, 표적을 벗어난 효과를 감소시키기 위해) 감소되거나 억제되는 상태와 관련되거나 이에 대해 특이적인 항원 이외의 항원을 인식하는 CAR 를 더 포함한다.
특정 실시예들에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD28 막관통 및 CD3(예를 들어, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 세포내 신호전달 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된 키메라 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공동-자극 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, CAR은 세포질 부분에서 하나 이상(예를 들어, 둘 이상), 공동자극 도메인 및 활성화 도메인(예를 들어, 1차 활성화 도메인)을 포함한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분을 포함한다.
일부 실시예에서, 항원 수용체는 마커 및/또는 CAR을 발현하는 세포를 추가로 포함하거나 다른 항원 수용체는 수용체를 발현하기 위한 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하는 데 사용될 수 있는 대리 마커, 예컨대 세포 표면 마커를 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 마커는 CD34의 전부 또는 일부(예: 절단된 형태), NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체, 예컨대 이러한 세포 표면 수용체(예: tEGFR)의 절단된 버전을 포함한다. 일부 실시예에서, 마커를 코딩하는 핵산은 절단 가능한 링커 서열, 예를 들어, T2A와 같은 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 마커와 선택적으로 링커 서열은 공개된 특허 출원 WO2014031687에 개시된 바와 같은 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 마커는 T2A 절단 가능한 링커 서열과 같은 링커 서열에 선택적으로 연결된 절단된 EGFR(tEGFR)일 수 있다.
일부 실시예에서, 마커는 T세포에서 자연적으로 발견되지 않거나 T세포의 표면 또는 이의 일부에서 자연적으로 발견되지 않는 분자(예: 세포 표면 단백질)이다.
일부 실시예에서, 분자는 비자기 분자(예: 비자기 단백질), 즉 세포가 입양으로 전달될 숙주의 면역계에 의해 "자기"로 인식되지 않는 분자이다.
일부 실시예에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않거나 유전 공학, 예를 들어 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 마커로 사용되는 것 외에 다른 효과를 생성하지 않는다. 다른 구체예에서, 마커는 세포의 반응을 향상 및/또는 약화시키기 위한 공동자극 또는 면역 체크포인트 분자와 같이 생체내에서 입양 전달 및 리간드와 마주치게 될 세포에 대한 리간드와 같은 일부 원하는 효과를 달리 발휘하는 치료 분자 또는 분자일 수 있다.
일부 경우에, CAR은 1세대, 2세대 및/또는 3세대 CAR로 지칭된다. 일부 측면에서, 1세대 CAR은 항원 결합 시 CD3-사슬 유도 신호만을 제공하는 CAR이고; 일부 측면에서, 2세대 CAR은 CD28 또는 CD137과 같은 공동자극 수용체의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 것과 같은 신호 및 공동자극 신호를 제공하는 CAR이고; 일부 측면에서, 3세대 CAR은 서로 다른 공동자극 수용체의 다중 공동자극 도메인을 포함하는 CAR이다.
예를 들어, 일부 실시예에서, CAR은 항체, 예를 들어 항체 단편, CD28의 막횡단 부분 또는 그의 기능적 변이체이거나 이를 포함하는 막횡단 도메인, 및 CD28의 신호전달 부분 또는 그의 기능적 변이체 및 CD3 제타 또는 이의 기능적 변이체를 함유한다. 일부 실시예에서, CAR은 항체(예를 들어, 항체 단편), CD28의 경막 부분 또는 그의 기능적 변이체이거나 이를 포함하는 막횡단 도메인, 및 4-1BB의 신호전달 부분 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 세포내 신호전달 도메인 및 CD3 제타의 신호전달 부분 또는 이의 기능적 변이체를 함유한다. 이러한 일부 실시예에서, 수용체는 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 힌지)와 같은 인간 Ig 분자와 같은 Ig 분자의 일부를 함유하는 스페이서, 예를 들어 힌지 전용 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 실시예에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 막횡단 도메인은 인간 CD28(예를 들어, 수탁 번호 P01747.1) 또는 그의 변이체의 막횡단 도메인이거나 이를 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합 수용체(예를 들어, CAR)의 세포내 신호전달 성분(들)은 인간 CD28의 세포내 공동자극 신호전달 도메인 또는 그의 기능적 변이체 또는 부분, 예를 들어 천연 CD28 단백질의 위치 186-187에서 LL에서 GG로의 치환을 갖는 도메인을 함유한다. 일부 실시예에서, 세포내 도메인은 4-1BB의 세포내 공동자극 신호전달 도메인(수탁 번호 Q07011.1) 또는 이의 기능적 변이체 또는 일부를 포함한다.
일부 실시예에서, 재조합 수용체(예: CAR)의 세포내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 자극 신호전달 도메인 또는 그의 기능적 변이체, 예를 들어 인간 CD3(수탁 번호: P20963.2)의 이소형(isoform)3의 112 AA 세포질 도메인 또는 미국 특허 제7,446,190호 또는 미국 특허 제8,911,993호에 기재된 바와 같은 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 힌지 전용 스페이서와 같은 IgG4 또는 IgG1의 힌지와 같은 IgG의 힌지 영역만을 포함한다. 다른 실시예에서, 스페이서는 임의로 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예를 들어, IgG4 유래 힌지)이거나 이를 함유한다. 일부 실시예에서, 스페이서는 CH2 및 CH3 도메인에 연결된 Ig 힌지(예: IgG4 힌지)이다. 일부 실시예에서, 스페이서는 CH3 도메인에만 연결된 Ig 힌지(예: IgG4 힌지)이다. 일부 실시예에서, 스페이서는 글리신-세린이 풍부한 서열 또는 공지된 가요성 링커와 같은 다른 가요성 링커이거나 이를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시예에서, CAR은 항체, 예를 들어 scFv를 포함하는 항체 단편, 스페이서, 예를 들어 면역글로불린 분자의 일부를 함유하는 스페이서, 예를 들어 힌지 영역 및/또는 중쇄 분자의 하나 이상의 불변 영역, 예를 들어 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28 유래 막횡단 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 막횡단 도메인, CD28 유래 세포내 신호전달 도메인, 및 CD3 제타 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, CAR은 항체 또는 단편, 예컨대 scFv, 스페이서, 예컨대 Ig-힌지 함유 스페이서, CD28 유래 막횡단 도메인, 4-1BB 유래 세포내 신호전달 도메인, 및 CD3 제타 유래 신호전달 도메인과 같은 스페이서를 포함한다 .
일부 실시예에서, 이러한 CAR 작제물을 인코딩하는 핵산 분자는 T2A 리보솜 스킵 요소 및/또는 tEGFR 서열을 인코딩하는 서열(예를 들어, CAR를 인코딩하는 서열의 다운스트림)을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 항원 수용체(예: CAR)를 발현하는 T세포는 또한 비-면역원성 선택 에피토프로서 절단된 EGFR(EGFRt)을 발현하도록 생성될 수 있다(예를 들어, T2A 리보솜 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt를 코딩하는 작제물의 도입에 의해 동일한 구조에서 두 개의 단백질을 발현), 그런 다음 이러한 세포를 감지하는 마커로 사용할 수 있다 (예를 들어, 미국특허 8,802,374 참조). 어떤 경우에는 T2A와 같은 펩티드가 리보솜이 2A 요소의 C-말단에서 펩티드 결합 합성을 건너뛰게(리보솜 건너뛰기)하여 2A 서열의 끝과 다음 펩티드 사이의 분리를 초래할 수 있다 (예를 들어, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) 및 deFelipe 등. Traffic 5:616- 626 (2004) 참조). 많은 2A 요소가 알려져 있다. 본원에 개시된 방법 및 핵산에 사용될 수 있는 2A 서열의 예는 구제역 바이러스, 말 비염 A 바이러스, 테사 아시그나 바이러스, 및 미국 특허공개 제20070116690호에 기재된 돼지 테스코바이러스-1로부터의 2A 서열을 제한 없이 포함한다.
대상체에 투여된 세포에 의해 발현되는 CAR과 같은 재조합 수용체는 일반적으로 치료되는 질환 또는 상태 또는 이의 세포에서 발현되거나, 이와 연관되고/되거나 이에 대해 특이적인 분자를 인식하거나 특이적으로 결합한다. 분자, 예를 들어 항원에 대한 특이적 결합 시, 수용체는 일반적으로 ITAM-형질도입된 신호와 같은 면역자극 신호를 세포로 전달하여 질병 또는 상태를 표적으로 하는 면역 반응을 촉진한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 세포는 질병 또는 상태의 세포 또는 조직에 의해 발현되거나 질병 또는 상태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다.
TCR
일부 실시예에서, T세포와 같은 조작된 세포는 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원과 같은 표적 폴리펩티드의 펩티드 에피토프 또는 T세포 에피토프를 인식하는 T세포 수용체(TCR) 또는 이의 항원 결합 부분을 발현하도록 제공된다.
일부 실시예에서, "T세포 수용체" 또는 "TCR"은 CD3 사슬 분자와의 복합체의 일부로 발현되는 하나 이상의 가변 α 및 β 사슬을 포함하는 분자이다. 소수의 T세포는 가변 γ 및 δ 사슬에 의해 형성된 대체 수용체를 발현한다. 이러한 사슬 내에는 TCR이 결합할 MHC 분자에 결합된 항원을 결정하는 상보적 결정 영역(CDR)이 있다. TCR은 항원을 인식할 때 그들이 상주하는 T세포를 활성화시켜 과다한 면역 반응을 유발한다. 일반적으로 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만 이를 발현하는 T세포는 별개의 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면이나 용해성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로 TCR은 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 역할을 하는 T세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "TCR"은 전체 TCR 뿐만 아니라 항원 결합 부분 또는 이의 항원 결합 단편을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 실시예에서, TCR은 형태 또는 형태의 TCR을 포함하여 온전하거나 완전한 길이의 TCR이다. 일부 실시예에서, TCR은 전장 TCR보다 작지만 MHC 분자에 결합된 특정 펩티드, 예를 들어 MHC-펩티드 복합체에 결합하는 항원-결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원 결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있지만, 전체 TCR이 바인딩하는 MHC-펩티드 복합체와 같은 펩티드 에피토프에는 결합할 수 있다. 일부 경우에, 항원 결합 부분은 특정 MHC-펩티드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한 TCR의 가변 사슬 및 가변 사슬과 같은 TCR의 가변 도메인을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩티드, MHC 및/또는 MHC-펩티드 복합체의 인식과 관련된 상보성 결정 영역을 포함한다.
일부 실시예에서, TCR의 가변 도메인은 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 주요 기여자인 초가변 루프 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시예에서, TCR의 CDR 또는 이들의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원 결합 부위의 전부 또는 실질적으로 전부를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내의 다양한 CDR은 일반적으로 프레임워크 영역(FR)에 의해 분리되며, 이는 일반적으로 CDR에 비해 TCR 분자 간의 가변성이 덜 나타난다 (예: Jores 등, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia 등, EMBO J. 7:3745, 1988 참조; Lefranc 등, Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003또한 참조). 일부 실시예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식 및/또는 펩티드-MHC 복합체의 처리된 펩티드 부분과의 상호작용을 위해 주어진 TCR 가변 영역에 대한 3개의 CDR 중에서 가장 중요하다. 일부 맥락에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원성 펩티드의 N-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서 베타 사슬의 CDR1은 펩티드의 C-말단 부분과 상호작용할 수 있다. 일부 맥락에서, CDR2는 MHC-펩티드 복합체의 MHC 부분과의 상호작용 또는 인식을 담당하는 1차 CDR에 가장 강력하게 기여하거나 1차 CDR이다. 일부 실시예에서, -사슬의 가변 영역은 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 결합(superantigen binding)에 관여하는 추가의 초가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 포함할 수 있다 (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 실시예에서, TCR은 또한 불변 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 짧은 세포질 꼬리를 포함할 수 있다(예: Janeway 등, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997 참조). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역 및 C-말단 말단에 짧은 세포질 꼬리를 가질 수 있다. 일부 실시예에서, TCR은 신호 전달 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 관련이 있다.
일부 실시예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인(들)을 포함한다. 예를 들어, 주어진 TCR 사슬(예: 알파 사슬 또는 베타 사슬)의 세포외 부분은 가변 도메인 (예: Vα or V
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; typically amino acids 1 to 116 based on Kabat numbering Kabat 등, "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) 및 세포막에 인접한 불변 도메인(예: 알파 및/또는 베타 사슬 불변 도메인 또는 C, 전형적으로 카바트(Kabat) 넘버링 또는 사슬 불변 도메인에 기초한 사슬의 위치 117 내지 259 또는 C, 전형적으로 카바트에 기초한 사슬의 위치 117 내지 295.)과 같은 두 개의 면역글로불린 유사 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 2개의 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개의 막-근위 불변 도메인 및 2개의 막-원위 가변 도메인을 함유하며, 이 가변 도메인은 각각 CDR을 함유한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하여 TCR의 두 사슬을 연결하는 짧은 연결 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, TCR은 각각의 불변 도메인에 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있으므로 TCR은 불변 도메인에 2개의 이황화 결합을 포함한다.
일부 실시예에서, TCR 사슬은 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시예에서, 막횡단 도메인은 양전하를 띠고 있다. 어떤 경우에는 TCR 사슬에 세포질 꼬리가 있다. 어떤 경우에는 그 구조로 인해 TCR이 CD3 및 이의 소단위와 같은 다른 분자와 결합할 수 있다. 예를 들어, 막관통 영역이 있는 불변 도메인을 포함하는 TCR은 단백질을 세포막에 고정시키고 CD3 신호전달 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 연관시킬 수 있다. CD3 신호전달 소단위의 세포내 꼬리 (예: CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ε 사슬) TCR 복합체의 신호전달 능력에 관여하는 하나 이상의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 포함한다.
일부 실시예에서, TCR은 2개의 사슬의 이종이량체일 수 있고/있거나 단일 사슬 TCR 작제물일 수 있다. 일부 실시예에서, TCR은 예를 들어 이황화 결합 또는 이황화 결합에 의해 연결된 두 개의 개별 사슬을 포함하는 이종이량체이다.
일부 실시예에서, TCR은 실질적으로 전장의 코딩 서열을 쉽게 이용할 수 있는 가변(V) 사슬의 서열과 같은 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있다. 세포 공급원으로부터 V 사슬 서열을 포함하는 전장 TCR 서열을 얻는 방법은 잘 알려져 있다. 일부 실시예에서, TCR을 코딩하는 핵산은 주어진 세포 또는 세포 내에서 또는 세포로부터 분리된 TCR-코딩 핵산의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 공개적으로 이용 가능한 TCR DNA 서열의 합성과 같은 다양한 소스로부터 얻을 수 있다.
일부 실시예에서, TCR은 T세포(예: 세포독성 T세포), T-세포 하이브리도마 또는 기타 공개적으로 이용 가능한 공급원과 같은 세포와 같은 생물학적 공급원으로부터 수득된다. 일부 실시예에서, T-세포는 생체 내에서 분리된 세포에서 얻을 수 있다. 일부 실시예에서, TCR은 흉선으로 선택된 TCR이다. 일부 실시예에서, TCR은 네오에피토프 제한 TCR이다. 일부 실시예에서, T-세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 실시예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분 또는 이의 항원 결합 단편은 TCR의 서열에 대한 지식으로부터 합성적으로 생성될 수 있다.
일부 실시예에서, TCR은 표적 폴리펩티드 항원, 또는 이의 표적 T세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 선별하는 것으로부터 확인되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 기타 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여 대상체로부터 분리된 T세포로부터 V 사슬의 레퍼토리를 증폭하여 생성할 수 있다. 어떤 경우에는 T세포가 종양 침윤 림프구(TIL)에서 증폭될 수 있다. 일부 실시예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ T세포에서 생성할 수 있다. 일부 실시예에서, TCR은 건강한 대상의 정상, 즉 정상 TCR 라이브러리의 T세포 소스로부터 증폭될 수 있다. 일부 실시예에서, TCR은 질병에 걸린 대상의 T세포 공급원, 즉 질병에 걸린 TCR 라이브러리로부터 증폭될 수 있다. 일부 실시예에서, 축퇴 프라이머(degenerate primers)는 인간으로부터 얻은 T세포와 같은 샘플에서 RT-PCR과 같이 V 사슬 서열의 유전자 레퍼토리를 증폭하는 데 사용된다. 일부 실시예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 산물이 복제되거나 링커에 의해 분리되도록 조립된 naive V 사슬 라이브러리에서 조립할 수 있다. 대상 및 세포의 출처에 따라 라이브러리는 HLA 대립유전자 특이적일 수 있다. 대안적으로, 일부 실시예에서, TCR 라이브러리는 모체 또는 스캐폴드 TCR 분자의 돌연변이유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면에서, TCR은 돌연변이 유발, 예를 들어 α 또는 β 사슬과 같은 유도 진화에 적용된다. 일부 측면에서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기가 변경된다. 일부 실시예에서, 선택된 TCR은 친화성 성숙에 의해 수정될 수 있다. 일부 실시예에서, 항원-특이적 T세포는, 예를 들어 펩티드에 대한 세포독성 T 림프구(CTL) 활성을 평가하기 위한 선별에 의해 선택될 수 있다. 일부 측면에서, TCR(예를 들어, 항원-특이적 T세포 상에 존재)은 예를 들어 결합 활성(예를 들어, 항원에 대한 특정 친화도 또는 결합력)에 의해 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 변형되거나 조작된 것이다. 일부 실시예에서, 유도 진화 방법은 특정 MHC-펩티드 복합체에 대한 더 높은 친화도와 같이 변경된 특성을 갖는 TCR을 생성하는 데 사용된다. 일부 실시예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이를 포함하지만 이에 국한되지 않는 디스플레이 방법(Holler 등 (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler 등 (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), phage display (Li 등 (2005) Nat Biotechnol, 23, 349- 54), 또는 T cell display (Chervin 등 (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)에 의해 달성된다. 일부 실시예에서, 디스플레이 접근 방식에는 알려진 부모 또는 참조 TCR을 조작하거나 수정하는 것이 포함된다. 예를 들어, 일부 경우에, 야생형 TCR은 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이된 돌연변이화된 TCR을 생성하기 위한 주형으로 사용될 수 있고, 원하는 표적 항원에 대한 더 높은 친화도와 같은 원하는 변경된 특성을 갖는 돌연변이체가 선택된다.
일부 실시예에서, 관심 TCR을 생성하거나 생성하는데 사용하기 위한 표적 폴리펩티드의 펩티드는 공지되어 있거나 쉽게 식별될 수 있다. 일부 실시예에서, TCR 또는 항원 결합 부분을 생성하는데 사용하기에 적합한 펩티드는 하기에 기술된 표적 폴리펩티드와 같은 관심 표적 폴리펩티드에 HLA-제한 모티프의 존재를 기반으로 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 사용 가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 펩티드를 식별한다. 일부 실시예에서, MHC 등급 I 결합 부위를 예측하기 위해 이러한 모델에는 ProPred1 (Singh and Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237, 및 SYFPEITHI (Schuler 등 (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참조) 이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 일부 실시예에서, MHC-제한 에피토프는 HLA-A0201이며, 이는 모든 백인의 약 39-46%에서 발현되므로 TCR 또는 기타 MHC-펩티드 결합 분자를 제조하는 데 사용하기 위한 MHC 항원의 적절한 선택을 나타낸다.
HLA-A0201-결합 모티프 및 컴퓨터 예측 모델을 사용하는 프로테아좀 및 면역-프로테아좀에 대한 절단 부위는 알려져 있다. MHC 등급 I 결합 부위를 예측하기 위해 이러한 모델에는 ProPred1(Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236- 1237 2001에 자세히 설명되어 있음), 및 SYFPEITHI(Schuler 등, SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007 참조) 이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
일부 실시예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은 하나 이상의 특성이 변경된 재조합으로 생성된 천연 단백질 또는 이의 돌연변이된 형태일 수 있다. 일부 실시예에서, TCR은 인간, 마우스, 래트 또는 기타 포유동물과 같은 다양한 동물 종 중 하나에서 유래할 수 있다. TCR은 세포에 결합되거나 가용성 형태일 수 있다. 일부 실시예에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포 표면에 발현되는 세포 결합 형태이다.
일부 실시예에서, TCR은 전체 길이 TCR이다. 일부 실시예에서, TCR은 항원 결합 부분이다. 일부 실시예에서, TCR은 이량체 TCR(dTCR)이다. 일부 실시예에서, TCR은 단일 사슬 TCR(sc-TCR)이다. 일부 실시예에서, dTCR 또는 scTCR은 WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186 에 설명된 구조를 갖는다.
일부 실시예에서, TCR은 막횡단 서열에 해당하는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, TCR은 세포질 서열에 해당하는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, TCR은 CD3와 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함한 모든 TCR은 T세포 표면에 활성 TCR을 생성하는 신호전달 도메인에 연결될 수 있다. 일부 실시예에서, TCR은 세포 표면에 발현된다.
일부 실시예에서, dTCR은 TCR 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩티드, 및 TCR 사슬 가변 영역에 상응하는 서열이 존재하는 제2 폴리펩티드를 함유한다 서열은 N 말단에 TCR 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열에 융합되고, 제1 및 제2 폴리펩티드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 실시예에서, 결합은 천연 이량체 TCR에 존재하는 천연 사슬간 이황화 결합에 해당할 수 있다. 일부 실시예에서, 사슬간 이황화 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 하나 이상의 시스테인이 dTCR 폴리펩타이드 쌍의 불변 영역 세포외 서열 내로 통합될 수 있다. 어떤 경우에는 천연 및 비천연 이황화 결합이 모두 바람직할 수 있다. 일부 실시예에서, TCR은 막에 고정하는 막횡단 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, dTCR은 가변 도메인, 불변 도메인 및 불변 도메인의 C-말단에 부착된 제1 이량체화 모티프를 포함하는 TCR 사슬, 및 불변 도메인의 C-말단을 포함하되, wherein 제1 및 제2 이량체화 모티프는 쉽게 상호작용하여 제1 이량체화 모티프의 아미노산과 TCR 사슬과 TCR 사슬을 함께 연결하는 제2 이량체화 모티프의 아미노산 사이에 공유 결합을 형성한다.
일부 실시예에서, TCR은 scTCR이다. 일반적으로 scTCR은 알려진 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 예를 들어, Soo Hoo, W. F. 등, PNAS (USA) 89, 4759 (1992); W
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lfing, and Pl
Figure pct00003
ckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); International published PCT Nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 Schlueter, C. J. 등, J. Mol. Biol. 256, 859 (1996) 참조. 일부 실시예에서, scTCR은 TCR 사슬의 결합을 촉진하기 위해 도입된 비천연 이황화 사슬간 결합을 포함한다(예: 국제 공개 PCT 번호 WO 03/020763 참조).일부 실시예에서, scTCR은 C-말단에 융합된 이종 류신 지퍼가 사슬 결합을 촉진하는 비-이황화물 연결 절단된 TCR이다 (예: 국제 공개 PCT 번호 WO99/60120 참조). 일부 실시예에서, scTCR은 펩티드 링커를 통해 TCR 가변 도메인에 공유 연결된 TCR 가변 도메인을 포함한다 (예: 국제 공개 PCT 번호 WO99/18129) 참조).
일부 실시예에서, scTCR은 TCR 사슬 가변 영역에 해당하는 아미노산 서열로 구성된 제1 세그먼트, TCR 사슬 불변 도메인 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제2 세그먼트, 및 제1 세그먼트의 C 말단을 제2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, scTCR은 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 세그먼트, 및 서열 사슬 세포외 불변 및 막횡단의 N 말단에 융합된 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 세그먼트, 및 선택적으로, 제1 세그먼트의 C 말단을 제2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, scTCR은 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제1 세그먼트, 및 서열 사슬 세포외 불변의 N 말단에 융합된 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 세그먼트, 및 막횡단 서열, 및 선택적으로, 제1 세그먼트의 C 말단을 제2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, 제1 및 제2 TCR 세그먼트를 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩티드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 링커 서열은 예를 들어 화학식 -P-AA-P-를 가지며, 여기서 P는 프롤린이고 AA는 아미노산이 글리신 및 세린인 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 세그먼트는 그 가변 영역 서열이 이러한 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서 일부 경우에 링커는 제1 세그먼트의 C 말단과 제2 세그먼트의 N 말단 사이의 거리에 걸쳐 있거나 그 반대의 거리에 걸쳐 있기에 충분한 길이를 갖지만 scTCR의 표적 리간드로의 결합을 차단하거나 감소시키기에는 너무 길지 않다. 일부 실시예에서, 링커는 약 10 내지 45개의 아미노산, 예를 들어 10 내지 30개의 아미노산 또는 26 내지 41개의 아미노산 잔기, 예를 들어 29, 30, 31 또는 32개의 아미노산을 함유할 수 있다.
일부 실시예에서, scTCR은 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결하는 공유 이황화 결합을 포함한다. 일부 실시예에서, 천연 TCR의 사슬간 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 하나 이상의 시스테인은 scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 세그먼트의 불변 영역 세포외 서열 내로 혼입될 수 있다. 어떤 경우에는 천연 및 비천연 이황화 결합이 모두 바람직할 수 있다.
도입된 사슬간 이황화 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 실시양태에서, 천연 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 실시예에서, 천연 사슬간 이황화 결합을 형성하는 천연 시스테인 중 하나 이상이 세린 또는 알라닌과 같은 다른 잔기로 치환된다. 일부 실시예에서, 도입된 이황화 결합은 제1 및 제2 세그먼트의 비-시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다.
TCR의 예시적인 비천연 이황화 결합은 공개된 국제 PCT 번호 WO2006/000830에 기재되어 있다.
일부 실시예에서, TCR 또는 이의 항원 결합 단편은 (약) 10-5 내지 10-12 M 및 그 안의 모든 개별 값 및 범위의 표적 항원에 대한 평형 결합 상수와 친화도를 나타낸다. 일부 실시예에서, 표적 항원은 MHC-펩티드 복합체 또는 리간드이다.
일부 실시예에서, TCR 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 또는 핵산은 PCR, 클로닝 또는 기타 적절한 수단에 의해 증폭될 수 있고 적절한 발현 벡터 또는 벡터들 내로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 플라스미드 및 바이러스와 같이 증식 및 확장 또는 발현 또는 둘 모두를 위해 설계된 것을 포함한다.
일부 실시예에서, 벡터는 pUC 시리즈(Fermentas Life Sciences), pBluescript 시리즈(Stratagene, LaJolla, Calif.), pET 시리즈(Novagen, Madison, Wis.), pGEX 시리즈(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 또는 pEX 시리즈(Clontech, Palo Alto, Calif.)의 벡터일 수 있다. 경우에 따라 G10, GT11, ZapII(Stratagene), EMBL4 및 NM1149와 같은 박테리오파지 벡터도 사용할 수 있다. 일부 실시예에서, 식물 발현 벡터가 사용될 수 있으며 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)를 포함한다. 일부 실시예에서, 동물 발현 벡터에는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)가 포함된다. 일부 실시예에서, 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터가 사용된다.
일부 실시예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 실시예에서, 벡터는 벡터가 도입될 숙주 유형(예: 박테리아, 균류, 식물 또는 동물)에 특이적이고 벡터가 DNA 기반인지 RNA 기반인지를 고려하여 적절하게 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은, 숙주(예: 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물)의 유형에 특정한 조절 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 벡터는 TCR 또는 항원-결합 부분(또는 다른 MHC-펩티드 결합 분자)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기 세포 바이러스의 장기 반복부에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 다른 알려진 프로모터도 고려된다.
일부 실시예에서, TCR을 인코딩하는 벡터를 생성하기 위해, α 및 β 사슬(예를 들어)은 관심 TCR을 발현하는 T세포 클론으로부터 분리된 전체 cDNA로부터 PCR 증폭되고 발현 벡터로 클로닝된다. 일부 실시예에서, 상기 α 및 β 사슬(예를 들어)은 동일한 벡터에 복제된다. 일부 실시예에서, 상기 α 및 β 사슬 은 다른 벡터로 복제된다. 일부 실시예에서, 생성된 사슬은 레트로바이러스(예: 렌티바이러스, 벡터)에 통합된다.
액체 등급 결정
액체 등급은 액체를 피펫팅하는 데 필요한 매개변수 모음이다. 액체 전달과 관련된 개시된 시스템(10)에는 두 세트의 매개변수가 있다. 이들은 피펫팅 매개변수 및 교정 매개변수이다. 피펫팅 매개변수는 정확도보다 정밀도와 더 관련이 있으며 흡인 및 디스펜싱 속도, 에어 갭 또는 디스펜싱 중 액체 접촉과 같은 요소를 포함한다. 보정 매개변수는 정밀도보다 정확도와 더 관련이 있으며 특정 액체 등급에 대한 보정 곡선의 기울기와 오프셋을 정의한다. 모든 새로운 액체 등급에 대해 두 매개변수 세트를 모두 최적화하는 대신 정밀한 피펫팅을 위한 최적의 매개변수가 있는 기본 등급을 식별하기 위해 선별된 사전 정의된 액체 등급이 결정된 다음 교정 설정이 조정되어 피펫팅 정확도가 향상된다.
피펫팅 및 보정 매개변수의 값은 액체의 물리적 특성에 따라 다르다. 이는 액체 유형 및 피펫 모드(즉, 단일 및 다중 피펫, 자유 및 습식 접촉 분배 등)별로 정의된다. 하나의 액체 등급은 FCA 및 MCA 384 모두에 대한 전체 부피 범위를 포함한다. 각 액체 등급 내에서 하위 등급이 생성되었다. 하위 등급은 아암 및 팁 유형을 기반으로 정의된다. 피펫팅 및 보정 매개변수가 정의된 것은 이러한 하위 등급 내에 있었다.
액체 등급을 개발하는 데 중량 측정 방식이 사용되었다. Mettler Toledo의 계량 모듈(0.01mg 분해능)이 온-데크 저울로 사용되었다. 이 저울은 자동화된 영점 조정 및 측정 명령을 허용하도록 제어 시스템(20)과 통합되었다. 액체 등급 선별, 최적화 및 확인은 각 단계에 대해 독립적인 방법으로 자동화된 방식으로 수행되었다.
액체 등급은 수동 피펫팅 단계를 자동화된 프로세스로 변환하여 피펫팅 자동화를 가능하게 한다. 일반적으로 피펫팅은 부피, 온도, 밀도 및 점도와 같은 여러 보정 매개변수와 에어갭, 지연 및 피펫팅 속도와 같은 여러 피펫팅 매개변수의 영향을 받는다. DMSO(세포 동결 보존에 사용되는 액체)와 같이 점성이 높은 액체는 일반적으로 높은 정밀도로 수행할 수 있는 물과 같이 점성이 낮은 액체에 비해 더 빠른 속도와 더 짧은 지연으로 피펫팅의 정확도와 정밀도를 개선하기 위해 느린 피펫팅 속도와 지연이 필요한 경우가 많다. 여러 솔루션의 부정확한 피펫팅은 결과 분석에 영향을 미치는 전체 프로세스에 복합적인 영향을 미칠 수 있다. 자동화된 부피 축소 모델 방법 내에서 모든 흡입 및 분배 액체 전달 단계에는 개발된 액체 등급이 필요하다. 이 액체 등급은 특정 액체가 각 팁 유형으로 흡입/분배되는 방식과 방법 실행 중 오류에 응답하는 방식을 정의한다. 액체 등급은 측정된 정확도와 정밀도를 기반으로 주어진 액체에 대한 각 피펫 팁 유형에 대한 적절한 작업 부피 범위를 알리는 데에도 사용된다.
액체 등급 성분 및 매개변수
액체 등급을 개발하는 데 사용되는 4가지 주요 구성 요소가 있다. 여기에는 쉬운 제어, 감지 및 위치 지정, 공식 및 마이크로스크립트 명령이 포함된다.
용이한 제어
용이한 제어 구성요소는 흡인 및 분배에 대한 중요한 매개변수를 쉽게 제어할 수 있는 그래픽 편집기이다. 간편한 제어 내에서 부피와 같은 매개변수를 조정하여 잠재적인 에어갭, 지연 및 피펫 팁 유형으로 특정 부피를 피펫팅하는 데 필요할 수 있는 속도를 시각화할 수 있다.
검출 및 위치 지정
검출 및 포지셔닝 구성요소를 통해 사용자는 용량성 액체 레벨 검출(cLLD), 추적 옵션, 오류 처리 및 흡인 및 분배를 위한 후퇴 속성에 대한 매개변수를 설정할 수 있다. cLLD는 액체 핸들러가 실험 기구에 있는 액체의 존재와 높이를 감지하는 수단이다. 접지된 작업대(60) 및 전도성 피펫팅 팁을 사용하여 액체 핸들러는 공기/액체 인터페이스의 용량 변화에 반응한다. 모든 자동화된 부피 축소 모델 애플리케이션에 대해 cLLD가 켜져 있다. cLLD는 Zstart 에서 시작하여Zmax 까지 진행된다. Ztravel 은 데크에서 피펫 팁이 자유롭게 움직일 때 실험 기구 근처에 올 수 있는 최소 거리를 나타낸다. Zstart는 흡인 단계가 시작되는 동안 액체 레벨에 대한 실험기구 내부의 거리이다. Zstart 는 랩웨어 정의에 의해서 정의된다. Zmax는 피펫 팁이 랩웨어 바닥에 충돌하지 않도록 설정되며 랩웨어 정의에 의해서도 정의된다. 액체 등급별로 cLLD를 선택하면 측정된 감도 그룹과 팁 침수 깊이가 입력된다.
액체가 흡입될 때 cLLD 및 추적이 켜져 있으면 피펫 팁이 액체에 들어가고 설정된 잠김 깊이로 진행한다. 그런 다음 액체가 흡입될 때 침수 깊이를 유지하기 위해 액체 흡입 속도로 아래쪽으로 이동한다. 자동화된 부피 축소 모델 방법 내의 모든 열망 단계에 대해 추적이 켜져 있다. 후퇴 속성 및 감독을 통해 시스템은 액체에서 피펫 팁의 출구를 모니터링하고 팁 후퇴 중에 오류가 발생한 경우 사용자에게 알린다. 오류 처리 섹션은 액체 처리기가 실험 중에 발생한 오류에 어떻게 응답하는지 정의한다. 이것은 액체 등급에 따라 결정된다. 일반적으로 "사용자 프롬프트"는 유동 등급별로 선택되어 사용자가 방법 실행 중에 오류 메시지를 볼 수 있고 직접 응답할 수 있다.
공식
공식은 액체 취급 매개변수를 함수로 입력하는 방법을 제공한다. 이러한 공식은 흡입 및 분주 모두에 대해 편집할 수 있으며 고정 값 또는 피펫팅 부피 종속 공식을 사용할 수 있다. 액체의 다른 부피는 액체 등급에 특정한 피펫팅의 정확도를 위해 다른 오프셋을 갖는다. 이러한 오프셋은 액체 등급 개발 중에 조정된다.
마이크로스크립트
마이크로스크립트는 흡인, 분배 및 혼합 동안 기본 동작 시퀀스이다. 흡인 스크립트에서 부피(정확도 조정의 오프셋 포함), 가속 및 감속에 대해 몇 가지 변수가 설정된다. 3방향 체크 밸브를 피펫 팁 위치로 돌려 액체를 흡입할 수 있다. 초기 선행 에어갭이 흡입된 다음 액체가 변수 섹션에 설정된 사이클 수로 미리 습윤된다. 소프트웨어는 cLLD가 켜져 있는지 꺼져 있는지 확인하여 흡인 모드를 결정한다. cLLD를 사용하거나 사용하지 않고 액체를 흡인한 후 후행 에어갭이 흡인된다. 액체를 분배하는 동안 스크립트는 부피에 대한 변수를 설정한다(정확도 조정의 오프셋 포함). 소프트웨어는 다중 피펫팅이 켜져 있는지 또는 꺼져 있는지 확인한다. 그런 다음 3방향 체크 밸브를 다시 피펫 팁 위치로 이동하여 액체가 분배되도록 한다. 소프트웨어는 cLLD가 켜져 있는지 꺼져 있는지 다시 한 번 확인한다. 그런 다음 적절한 설정(다중 피펫 사용 여부와 cLLD 사용 여부)으로 액체를 분배한다. 지연이 설정된 경우 피펫 팁은 실험실에서 후퇴하기 전에 설정된 시간 동안 기다린다. 그런 다음 설정된 z 위치로 이동한다. 후행 에어갭이 설정된 경우 피펫 팁을 이동하기 전에 공기를 흡인한다.
세포 배양 시험 액체
세포 배양 액체
배지
기초 배지
완료
세포액
세포+배지
세포+CryoStor/PlasmaLyte/HSA
Cryostor/PlasmaLyte/HSA
아암 형태
FCA
MCA384
FCA 하위 등급
5000μL DiTi
1000μL DiTi
200 μL DiTi
50μL DiTi
10μL DiTi
MCA 하위 등급
50μL DiTi
150μL DiTi
접촉 분배
자유
접촉
단일
다중
혼합
배지
세포+배지
세포+ CryoStor/PlasmaLyte/HAS
방법론
각 테스트 액체에 대해 액체 등급 워크북을 생성하였다.
Densito 30PX를 사용하여 테스트 액체의 밀도를 측정하고 액체 등급 워크북의 "액체 세부 정보" 탭 내에 기록하였다. 모든 추가 30PX 액체 세부 정보는 "액체 세부 정보" 탭에 보고되었다.
cLLD 감도 그룹(낮음, 중간, 높음)은 감도 감지 명령을 사용하여 각 테스트 액체에 대해 검증되었다. 민감도 그룹은 액체 등급 워크북의 "액체 세부 정보" 탭에 기록되었다.
이상적으로, 무료/1회 분배 기본 액체 등급은 모든 테스트 액체에 대해 식별되어야 한다. 이 기본 액체 등급은 다중 분배 및 MCA 액체 등급 모두에 대한 기본값으로도 사용되었다. 그런 다음 모든 기본 액체 등급을 최적화하여 피펫팅 정확도를 개선하였다. 자유/단일 분주 기본 액체 등급이 다중 분주 및 MCA 액체 등급에 대해 낮은 정밀도를 산출한 경우, 피펫팅 매개변수는 테스트 액체에 대해 최적화되었다.
가요성 채널 아암 액체 등급
자유 단일 분배
액체 등급 선별
신규 세포 배양액
모든 신규 액체는 5개의 확립된 액체 등급에 대해 선별하였다. 기본 액체 등급을 결정하기 위한 선별 부피로 500μL가 사용되었다. 디스펜스 부피의 최소, 최대, 평균, 정확도 및 정밀도는 테스트된 각 액체 등급 유형별로 계산되었다. 기본 등급은 정밀도(%CV)와 정확도(%DEV)가 가장 높은 등급으로 결정되었다. 고점도 액체의 경우, 액체는 확립된 접촉 액체 등급에 대해 추가로 선별되어야 한다. 접촉 형태가 사용된 경우 별도의 접촉 액체 등급이 생성되었다. 모든 액체 등급이 낮은 정확도와 정밀도를 나타내면 피펫팅 매개변수가 조정되었다. 부피 측정은 8개의 FCA 채널 모두에서 달성되었지만 모든 통계는 1.25mL 주사기만으로 계산되었다. 증발을 방지하기 위해 피펫팅 주기당 하나의 피펫 팁이 사용되었다. 비점성 액체에 대한 액체 등급 선별은 자유 및 단일 분배 모드에서 수행되었다.
"알려진" 세포 배양액
이전에 확립된 액체 등급과 유사한 물리적 특성을 나타내는 액체는 선별 단계를 건너뛸 수 있고 확립된 액체 등급을 기본(시작) 액체 등급, 즉, 미디어 제형 으로 채택할 수 있다.
액체 등급 최적화
테스트 액체에 대한 기본 액체 등급을 최적화하기 위해, 액체 등급 선별 단계에서 얻은 기본 액체 등급의 복제본이 생성되었다. DiTi 하위 등급당 6개의 테스트 부피를 평가하여 높은 정밀도와 정확도로 최적화된 테스트 액체 등급을 생성하였다.
10-1000μL DiTi 테스트 부피 FCA 1-4
액체 등급 최적화는 표 1에 나타낸 바와 같이 5개의 액체 하위 등급(FCA 1-5)으로 실행되었다. 각 하위 등급 내에서 6개의 부피를 테스트하여 파이펫팅 정확도를 평가하였다. 액체 하위 등급 및 테스트 부피는 액체 등급 워크북의 "테스트 부피" 탭에 보고되었다. 각 테스트 부피에는 채널당 1개의 복제가 있는 8개의 복제가 있다. 각 채널에서 분배된 측정 양은 "Opt FCA" 탭에 보고되었다. 부피 측정은 8개의 FCA 채널 모두에서 달성되었지만 모든 통계는 1.25mL 주사기만으로 계산되었다. 분주된 부피의 최소, 최대, 평균, 정확도(%DEV) 및 정밀도(%CV)는 테스트 부피당 계산되었다. %DEV 및 %CV가 허용 기준 내에 있으면 확인 실행이 시작되었다. 허용 기준보다 높으면 추가적인 반복이 수행되었다. 증발을 방지하기 위해 피펫팅 주기당 하나의 피펫 팁이 사용되었다.
5000μL DiTi 테스트 부피 FCA 5
각 테스트 부피에는 채널당 3개의 복제가 있는 6개의 복제가 있었다. 각 채널에서 분배된 측정된 부피는 "Opt FCA 5" 탭에 보고되었다. 분주된 부피의 최소, 최대, 평균, 정확도(%DEV) 및 정밀도(%CV)는 테스트 부피당 계산되었다. %DEV 및 %CV가 허용 기준 내에 있는 경우 확인 실행을 시작할 수 있다. 허용 기준보다 높으면 추가적인 반복이 수행되었다.
가요성 채널 아암: 단일 분주
DiTi 하위등급 하위등급 테스트 부피 (μL)
10μL DiTi FCA 1 0.25 1 2.5 5 7.5 10
50μL DiTi FCA 2 0.5 1 2 10 20 50
200μL DiTi FCA 3 2 5 10 50 100 200
1000μL DiTi FCA 4 5 10 50 100 500 1000
5000μL DiTi FCA 5 300 500 100 1500 2500 4700
확인 실행
실험 및 데이터 패키지는 액체 등급 최적화 단계와 동일하게 유지되었지만 각 부피는 최종 정확도 조정으로 3회 테스트되었다. 최종 평균, CV 및 %DEV는 1.25mL(3x6 1.25mL 주사기) 및 5mL(9x2 5mL 주사기) 주사기 모두에 대한 18회 측정값에서 계산되었다. %CV 및 %DEV가 허용 기준 내에 있으면 액체 등급이 완료된 것이다.
다중 분주
액체 등급 최적화
다중 분배 액체 등급의 경우, 선별 단계를 건너뛰고 최적화가 직접 진행되었다(좋은 정밀도가 유지되는 경우). 각 테스트 다중 분배 액체 등급은 테스트 액체에 대해 이미 최적화된 기본 다중 분배 액체 등급의 복제본으로 생성되었다(즉, 기본 액체 등급의 "다중" 버전). 표 2와 같이 각 다중 분배 액체 등급(FCA 3-5M)에 대해 3개의 액체 하위 등급이 구축되었다. 단일 분배 액체 등급과 달리 다중 분배 액체 등급에는 하나의 채널만 사용되었다.
각 하위 등급에 대해 피펫팅 정확도를 평가하기 위해 6개의 부피를 테스트하였다. 액체 하위 등급 및 테스트 부피는 표 2 및 액체 등급 워크북의 "테스트 부피" 탭에 보고되었다. 각 테스트 부피에는 8개의 복제가 있었고 8개의 복제는 1개의 채널로 수행되었다. 각 분배에서 분배된 측정된 부피는 "Opt FCA M" 탭에 보고되었다. 분주된 부피의 최소, 최대, 평균, 정확도(%DEV) 및 정밀도(%CV)는 테스트 부피당 계산되었다. %DEV 및 %CV가 허용 기준 내에 있는 경우 확인 실행을 시작할 수 있다. 허용 기준보다 높으면 추가 반복을 수행할 수 있다.
가요성 채널 아암: 다중-분주
DiTi 하위등급 하위등급 테스트 부피
200μL DiTi FCA 3 1 5 10 20 35 50
1000μL DiTi FCA 4 10 25 50 100 200 400
5000μL DiTi FCA 5 50 100 200 500 1000 2000
확인 실행
실험 및 데이터 패키지는 액체 등급 최적화 단계와 동일하게 유지되었지만, 각 부피는 최종 정확도 조정으로 3회 테스트되었다. 최종 평균, CV 및 %DEV는 1.25mL 및 5mL 주사기 모두에 대한 24회 측정값에서 계산되었다. CV 및 DEV가 허용 기준 내에 있으면 액체 등급이 완료된 것이다.
추가 장비
중량 측정 액체 등급 개발을 위한 예시적인 장비
항목 제조사 모델 번호 부품 번호
저울 Mettler Toledo Weigh Module WXSS205S/15 111210023
밀도계 Mettler Toledo Densito 30PX 51324450
그리드 세그먼트, 6개소 그리드 Tecan 　N/A 30042701
탑재 플레이트 Tecan 　N/A 30042796
서열
Figure pct00004
Figure pct00005
특정 실시예가 위에서 설명되었지만, 이러한 실시예는 특정 특징과 관련하여 단일 실시예만이 설명된 경우에도 본 개시의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 본 개시내용에 제공된 특징의 예는 달리 언급되지 않는 한 제한적이기보다는 예시적인 것으로 의도된다. 상기 설명은 본 개시내용의 이점을 갖는 당업자에게 명백할 그러한 대안, 수정 및 균등물을 포함하도록 의도된다.
본 개시 내용의 범위는 여기에서 언급된 문제 중 일부 또는 전부를 완화하는지 여부에 관계없이 여기에 개시된 임의의 특징 또는 특징들의 조합(명시적으로 또는 묵시적으로), 또는 그 일반화를 포함한다. 따라서, 본 출원(또는 우선권을 주장하는 출원)이 이러한 특징의 조합에 대해 속행되는 동안 새로운 청구항이 형성될 수 있다. 특히, 첨부된 청구항을 참조하여 종속 청구항의 특징은 독립 청구항의 특징과 결합될 수 있고 각각의 독립 청구항의 특징은 첨부된 청구항에 열거된 특정 조합뿐 아니라 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> JUNO THERAPEUTICS INC Aifuwa, Ivie Beauchense, Pascal Dhuu-Duong, Kien Leuba, Kohana <120> Automated T Cell Culture <130> 132777-255015-P001-PCT <150> 62/858,736 <151> 2019-06-07 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 159 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <400> 1 Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr 20 25 30 Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly 35 40 45 Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr 85 90 95 Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser 100 105 110 Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp 115 120 125 Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys 130 135 140 Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly 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Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val 100 105 110 Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 17 <211> 127 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <221> MUTAGEN <222> (32)..(35) <400> 17 Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val 20 25 30 Thr Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45 Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60 Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125 <210> 18 <211> 159 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <220> <221> MUTAGEN <222> (44)..(47) <400> 18 Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly 1 5 10 15 Ile Thr 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Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly 35 40 45 Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro 50 55 60 Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys 65 70 75 80 Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr 85 90 95 Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser 100 105 110 Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val Gly His Asp 115 120 125 Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 130 135 <210> 23 <211> 127 <212> PRT <213> Streptomyces avidinii <400> 23 Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu 20 25 30 Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr 35 40 45 Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr 50 55 60 Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80 Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp 85 90 95 Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu 100 105 110 Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser 115 120 125

Claims (60)

  1. T세포 부피 축소 처리를 위한 자동화된 방법으로서, 상기 방법은,
    활성화된 T세포 세트를 생성하기 위해 한 명 이상의 공여자로부터 얻은 입력 T세포 세트를 하나 이상의 활성화 시약과 자동으로 접촉시킴으로써 입력 T세포 세트를 활성화하는 단계;
    상기 활성화된 T세포 세트의 바이러스 감염을 촉진하는 조건 하에 상기 활성화된 T세포 세트를 재조합 바이러스 벡터와 자동으로 접촉시켜 상기 활성화된 T세포 세트를 형질도입하는 단계로서, 상기 재조합 바이러스 벡터는 이종 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하여 형질도입된 T세포 세트를 생성시키고;
    상기 형질도입된 T세포 세트를 확장하는 단계;
    확장 배지로부터 상기 형질도입된 T세포 세트를 자동으로 회수하는 단계; 및
    수확된 형질도입된 T세포 세트를 생성하기 위해 상기 형질도입된 T세포 세트를 자동으로 동결보존함으로써 형질도입된 T세포 세트를 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에서,
    상기 활성화된 T세포 세트를 접종 배지 내로 자동 전달함으로써 활성화된 T세포 세트를 접종하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에서,
    상기 활성화 단계는
    상기 입력 T세포 세트를 자동으로 세척하는 단계;
    선택적으로, 생존 세포 계수를 위해 상기 세척된 입력 T세포 세트의 시험 샘플을 자동으로 얻는 단계;
    상기 세척된 입력 T세포 세트를 하나 이상의 활성화 시약과 자동으로 접촉시키는 단계; 및
    선택적으로, 생존 세포 계수를 위한 하나 이상의 활성화 시약과 접촉한 후 상기 활성화된 T세포 세트의 시험 샘플을 자동으로 얻는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서,
    상기 형질도입 단계는
    선택적으로, 생존 세포 계수를 위해 상기 활성화된 T세포 세트의 시험 샘플을 자동으로 얻는 단계;
    회전 접종을 위해 상기 활성화된 T세포 세트를 자동으로 준비하는 단계;
    상기 활성화된 T세포 세트를 상기 재조합 바이러스 벡터와 접촉시키고 상기 활성화된 T세포 세트에 원심력을 가함으로써 상기 활성화된 T세포 세트를 자동으로 회전 접종하는 단계; 및
    선택적으로, 형질도입 후 포유동물 세포 인큐베이터에서 상기 활성화된 T세포 세트를 부화(incubate)하거나 접종하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서,
    상기 접종 단계는
    선택적으로, 생존 세포 계수를 위해 형질도입한 후 상기 활성화된 T세포 세트의 시험 샘플을 자동으로 얻는 단계; 및
    상기 활성화된 T세포 세트를 확장 플레이트에 자동으로 옮기고 상기 활성화된 T세포 세트를 포함하는 확장 플레이트를 포유동물 세포 인큐베이터에 배치함으로써 상기 활성화된 T세포 세트를 접종하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서,
    상기 확장 단계는
    생존 세포 계수를 위해 상기 형질도입된 T세포 세트의 시험 샘플을 얻는 단계; 및
    자동으로 모의 관류/세포 배양 배지 교환을 수행하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서,
    디비딩(debeading) 단계를 더 포함하고,
    상기 디비딩 단계는 자기장을 적용하여 상기 형질도입된 T세포 세트 및/또는 상기 활성화된 T세포 세트를 자동으로 디비딩하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에서,
    상기 수확하는 단계는
    상기 형질도입된 T세포 세트를 동결보존 배지를 구비한 동결 바이알에 배치하는 단계; 및
    액체 질소 탱크에 상기 동결 바이알을 배치하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서,
    상기 T세포는 CD4+ T세포를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서,
    상기 T세포는 CD8+ T세포를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서,
    상기 T세포는 CD4+ T세포 및 CD8+ T세포를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서,
    상기 이종 재조합 단백질은 재조합 수용체를 포함하는 것인 방법.
  13. 제12항에서,
    상기 재조합 수용체는 질병, 장애 또는 상태의 세포 또는 조직과 연관되거나, 특이적 및/또는 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
  14. 제13항에서,
    상기 질병, 장애 또는 상태는 전염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암인 것인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에서,
    상기 표적 항원은 종양 항원인 것인 방법.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에서,
    상기 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 그의 항원 결합 단편이거나 이를 포함하는 것인 방법.
  17. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에서,
    상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에서,
    상기 재조합 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에서,
    상기 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에서,
    상기 T세포는 한 명 이상의 공여자로부터 얻은 1차 T세포를 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에서,
    상기 한 명 이상의 공여자는 인간 대상체인 것인 방법.
  22. T세포 부피 축소 처리를 위한 자동화 방법으로서, 상기 방법은
    활성화된 T세포 세트를 생성하기 위해 한 명 이상의 공여자로부터 얻은 입력 T세포 세트를 하나 이상의 활성화 시약과 자동으로 접촉시킴으로써 입력 T세포 세트를 활성화하는 단계;
    재조합 폴리뉴클레오티드의 상기 활성화된 T세포 내로의 혼입을 촉진하는 조건 하에 상기 활성화된 T세포를 재조합 폴리뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 상기 활성화된 T세포 세트를 변형시키는 단계로서, 상기 재조합 폴리뉴클레오티드는 이종 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하여 변형된 T세포 세트를 생성하고;
    상기 변형된 T세포 세트를 확장하는 단계;
    확장 배지로부터 상기 변형된 T세포 세트를 회수하는 단계; 및
    상기 변형된 T세포의 수확된 세트를 생성하기 위해 상기 변형된 T세포 세트를 자동으로 동결보존함으로써 상기 변형된 T세포 세트를 수확하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제22항에서,
    상기 변형 단계는 형질도입, 전기천공, 시약 기반 형질감염, 세포 압축, 또는 압착을 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에서,
    상기 방법의 하나 이상의 단계는 자동으로 및/또는 작업자의 개입 없이 수행되는 것인 방법.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에서,
    상기 활성화된 T세포 세트를 접종 배지에 자동으로 전달함으로써 상기 활성화된 T세포 세트를 접종하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  26. 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에서,
    상기 활성화 단계는
    상기 입력 T세포 세트를 자동으로 세척하는 단계;
    선택적으로, 생존 세포 계수를 위해 상기 세척된 입력 T세포 세트의 시험 샘플을 자동으로 얻는 단계;
    상기 세척된 입력 T세포 세트를 하나 이상의 활성화 시약과 자동으로 접촉시키는 단계; 및
    선택적으로, 생존 세포 계수를 위한 하나 이상의 활성화 시약과 접촉한 후 상기 활성화된 T세포 세트의 시험 샘플을 자동으로 얻는 단계를 포함하는 것인 방법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에서,
    상기 형질도입 단계는
    선택적으로, 생존 세포 계수를 위해 상기 활성화된 T세포 세트의 시험 샘플을 자동으로 얻는 단계;
    회전 접종을 위해 상기 활성화된 T세포 세트를 자동으로 준비하는 단계;
    상기 활성화된 T세포 세트를 재조합 바이러스 벡터와 접촉시키고 상기 활성화된 T세포 세트에 원심력을 가함으로써 상기 활성화된 T세포 세트를 자동으로 회전 접종(spinoculation)하는 단계; 및
    선택적으로, 형질도입 후 포유동물 세포 인큐베이터에서 상기 활성화된 T세포 세트를 부화하거나 접종하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에서,
    상기 접종 단계는
    선택적으로, 생존 세포 계수를 위해 형질도입한 후 상기 활성화된 T세포 세트의 시험 샘플을 자동으로 얻는 단계; 및
    상기 활성화된 T세포 세트를 확장 플레이트에 자동으로 옮기고 상기 활성화된 T세포 세트를 포함하는 확장 플레이트를 포유동물 세포 인큐베이터에 배치함으로써 상기 활성화된 T세포 세트를 접종하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  29. 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항에서,
    상기 확장 단계는
    생존 세포 계수를 위해 상기 변형된 T세포 세트의 시험 샘플을 얻는 단계; 및
    자동으로 모의 관류/세포 배양 배지 교환을 수행하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에서,
    디비딩 단계를 더 포함하고,
    상기 디비딩 단계는 자기장을 적용하여 상기 변형된 T세포 세트 및/또는 상기 활성화된 T세포 세트를 자동으로 디비딩하는 것인 방법.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에서,
    상기 수확하는 단계는
    상기 변형된 T세포 세트를 동결보존 배지를 구비한 동결 바이알에 배치하는 단계; 및
    액체 질소 탱크에 상기 동결 바이알을 배치하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에서,
    상기 T세포는 CD4+ T세포를 포함하는 것인 방법.
  33. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에서,
    상기 T세포는 CD8+ T세포를 포함하는 것인 방법.
  34. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에서,
    상기 T세포는 CD4+ T세포 및 CD8+ T세포를 포함하는 것인 방법.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에서,
    상기 이종 재조합 단백질은 재조합 수용체를 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에서,
    상기 재조합 수용체는 질병, 장애 또는 상태의 세포 또는 조직과 연관되거나, 특이적 및/또는 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있는 것인 방법.
  37. 제36항에서,
    상기 질병, 장애 또는 상태는 전염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 종양 또는 암인 것인 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에서,
    상기 표적 항원은 종양 항원인 것인 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에서,
    상기 재조합 수용체는 기능적 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 그의 항원 결합 단편이거나 이를 포함하는 것인 방법.
  40. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에서,
    상기 재조합 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 것인 방법.
  41. 제22항 내지 제40항 중 어느 한 항에서,
    상기 T세포는 한 명 이상의 공여자로부터 얻은 1차 T세포를 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에서,
    상기 한 명 이상의 공여자는 인간 대상체인 것인 방법.
  43. T세포 형질도입을 위한 다중 자동화 시스템으로서,
    자동화 액체 취급 시스템; 및
    상기 자동화 액체 취급 시스템과 통신하는 제어 시스템으로서, 상기 제어 시스템은 하기 단위 프로세스를 수행하기 위해 상기 자동화 액체 취급 시스템을 제어하도록 프로그래밍된 하나 이상의 프로세서를 포함하는 것인 시스템:
    T세포 세트를 활성화하는 단계;
    상기 T세포 세트를 변형하는 단계;
    상기 T세포 세트를 디비딩하는 단계;
    상기 T세포 세트를 접종하는 단계;
    상기 T세포 세트를 확장하는 단계; 및
    상기 T세포 세트를 수확하는 단계.
  44. 제43항에서,
    상기 자동화 액체 취급 시스템은 독립적인 다중채널 피펫 형식으로 액체를 전달하도록 구성된 가요성 채널 액체 조작 모듈을 포함하고,
    여기서 각 피펫은 독립적으로 작동하도록 구성되는 것인 시스템.
  45. 제44항에서,
    상기 가요성 채널 액체 조작 모듈은 액체 등급의 결정을 기반으로 약 0.5-5000 μL 사이의 유체 부피를 정확하게 조작하도록 구성되는 것인 시스템.
  46. 제44항 또는 제45항에서,
    상기 가요성 채널 액체 조작 모듈은 멸균 배양을 제공하기 위해 일회용 팁을 사용하도록 구성되는 것인 시스템.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에서,
    상기 가요성 채널 액체 조작 모듈은 액체 변위 가요성 채널 아암인 것인 시스템.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에서,
    상기 자동화 액체 취급 시스템은 다중채널 피펫 형식으로 액체를 전달하도록 구성된 정적 다중채널 액체 조작 모듈을 포함하는 것인 시스템.
  49. 제48항에서,
    상기 정적 다중채널 액체 조작 모듈은 액체 변위 가요성 채널 아암 또는 다중채널 아암인 것인 시스템.
  50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에서,
    상기 자동화 액체 취급 시스템은 호환 가능한 그리퍼 구성이 있는 용기 조작 모듈을 포함하는 것인 시스템.
  51. 제50항에서,
    상기 호환 가능한 그리퍼 구성은 실험실 산물의 수평 접근 및 운송을 위해 구성된 편심 핑거; 실험실 산물에 수직 접근을 위해 구성된 중심 핑거; 및 튜브형 실험기구의 운송을 위해 구성된 튜브 핑거를 포함하는 것인 시스템.
  52. 제50항 또는 제51항에서,
    상기 용기 조작 모듈은 긴 z축 로봇 그리퍼 아암인 것인 시스템.
  53. 제43항 내지 제52항 중 어느 한 항에서,
    상기 자동화 액체 취급 시스템은 활성화, 변형, 접종, 확장, 디비딩 및 수확 단위 작업을 위해 독립적으로 구성 가능한 작업대를 포함하는 것인 시스템.
  54. 제43항 내지 제53항 중 어느 한 항에서,
    상기 자동화 액체 취급 시스템은 온도 제어 로봇 원심분리기를 포함하는 것인 시스템.
  55. 제43항 내지 제54항 중 어느 한 항에서,
    상기 자동화 액체 취급 시스템은 둥근 실험기구를 잡고 쥐도록 구성된 바이알 그리퍼 모듈을 포함하는 것인 시스템.
  56. 제43항 내지 제55항 중 어느 한 항에서,
    상기 자동화 액체 취급 시스템은 생존 가능한 세포 수 측정을 수행하도록 구성된 자동화된 세포 계수 모듈을 포함하는 것인 시스템.
  57. 제43항 내지 제56항 중 어느 한 항에서,
    상기 자동화 액체 취급 시스템은 저온 바이알을 유지하도록 구성된 휴대용 저온 냉각 챔버/캡 홀더를 포함하는 것인 시스템.
  58. 제43항 내지 제57항 중 어느 한 항에서,
    상기 자동화 액체 취급 시스템은 멸균 환경을 제공하는 것인 시스템.
  59. 제43항 내지 제58항 중 어느 한 항에서,
    포유동물 세포 인큐베이터를 더 포함하는 것인 시스템.
  60. 제43항 내지 제59항 중 어느 한 항에서,
    상기 제어 시스템은
    재조합 폴리뉴클레오티드의 상기 T세포 세트 내로의 혼입을 촉진하는 조건 하에 상기 T세포 세트를 재조합 폴리뉴클레오티드와 접촉시킴으로써 상기 T세포 세트를 변형시키기 위해 상기 자동화 액체 취급 시스템을 제어하도록 추가로 프로그래밍되고; 및
    상기 T세포 세트를 변형시키는 것은 상기 재조합 폴리뉴클레오티드를 상기 T세포 세트에 혼입시키기 위한 형질도입, 형질감염, 세포 압축, 또는 세포 압착 작업 중 하나를 포함하는 것인 시스템.
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