JP2022535380A - 自動化ｔ細胞培養 - Google Patents

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Abstract

Ｔ細胞をスケールダウン加工する自動化方法であって、Ｔ細胞を、１つ又は複数の活性化試薬と自動的に接触させることにより、Ｔ細胞を活性化させるステップ；Ｔ細胞を、組換えウイルスベクターと自動的に接触させることにより、Ｔ細胞へと形質導入するステップ；Ｔ細胞を自動的に接種するステップ；Ｔ細胞を自動的に拡大するステップ；任意選択で、Ｔ細胞を、自動的にビーズ分離ステップ；及びＴ細胞を自動的に採取するステップを含む自動化方法が提供される。Ｔ細胞をスケールダウン加工する自動化方法のためのシステムが提供される。【選択図】なし

Description

[0003]本開示は、一般に、細胞培養の分野に関する。特に、本開示は、Ｔ細胞などの哺乳動物細胞の、小スケールの自動化培養、及び遺伝子改変のためのシステム及び方法に関する。
[0004]疾患及び状態を処置するために、多様な細胞療法が利用可能である。細胞療法の中には、キメラ抗原受容体などの組換え受容体で遺伝子操作されたＴ細胞などの免疫細胞を伴う方法がある。多様な状態について検査するための、より効率的な方法、及び遺伝子操作Ｔ細胞をもたらすことを含む、このような細胞療法を行うための細胞を製造及び／又は操作するための、改善された方法が必要とされている。
[0005]本開示の一態様は、Ｔ細胞の自動化スケールダウン製造方法であって、１例又は複数例のドナーから得られたＴ細胞のインプットセットを１つ又は複数の活性化試薬と接触させることにより、Ｔ細胞のインプットセットを活性化させて、活性化Ｔ細胞セットを作出するステップ；活性化Ｔ細胞へのウイルス感染を促進する条件下で、活性化Ｔ細胞を、異種組換えタンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターと接触させることにより、活性化Ｔ細胞セットへと形質導入するステップ；活性化Ｔ細胞セットを、接種培地及び／又はインキュベーション培地へと自動的に移すことにより、形質導入Ｔ細胞セットを接種する、及び／又はこれをインキュベートするステップ；形質導入Ｔ細胞セットを、接種培地及び／又はインキュベーション培地から回収し、形質導入Ｔ細胞セットを、拡大培地へと移すことにより、形質導入Ｔ細胞セットを拡大するステップ；形質導入Ｔ細胞セットを、拡大培地から回収するステップ；並びに形質導入Ｔ細胞セットを凍結保存することにより、形質導入Ｔ細胞セットを採取して、採取された形質導入Ｔ細胞セットを作出するステップを含む自動化スケールダウン製造方法である。
[0006]一部の実施形態では、方法は、ワークテーブルを、実験機器、及び１つ又は複数の活性化試薬と共に設置することをさらに含む。
[0007]上記の実施形態のうちのいずれかでは、１つ又は複数のステップは、自動的に実施されうる。例えば、１例又は複数例のドナーから得られた、Ｔ細胞のインプットセットを、１つ又は複数の活性化試薬と自動的に接触させること、活性化Ｔ細胞を、組換えウイルスベクターと自動的に接触させること、活性化Ｔ細胞セットを、接種培地及び／又はインキュベーション培地へと自動的に移すこと、形質導入Ｔ細胞セットを、接種培地から自動的に回収し、形質導入Ｔ細胞セットを、拡大培地へと移すこと、形質導入Ｔ細胞セットを、拡大培地から自動的に回収すること、及び／又は形質導入Ｔ細胞セットを自動的に凍結保存することである。一部の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の自動化スケールダウン製造方法であって、１例又は複数例のドナーから得られた、Ｔ細胞のインプットセットを、１つ又は複数の活性化試薬と自動的に接触させることにより、Ｔ細胞のインプットセットを活性化させて、活性化Ｔ細胞セットを作出するステップ；活性化Ｔ細胞へのウイルス感染を促進する条件下で、活性化Ｔ細胞を、異種組換えタンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターと自動的に接触させることにより、活性化Ｔ細胞セットへと形質導入するステップ；活性化Ｔ細胞セットを、接種培地及び／又はインキュベーション培地へと自動的に移すことにより、形質導入Ｔ細胞セットを接種する、及び／又はこれをインキュベートするステップ；形質導入Ｔ細胞セットを、接種培地から自動的に回収し、形質導入Ｔ細胞セットを、拡大培地へと移すことにより、形質導入Ｔ細胞セットを拡大するステップ；形質導入Ｔ細胞セットを、拡大培地から自動的に回収するステップ；並びに形質導入Ｔ細胞セットを凍結保存することにより、形質導入Ｔ細胞セットを採取して、採取された形質導入Ｔ細胞セットを作出するステップを含む自動化スケールダウン製造方法に関する。
[0008]他の任意の実施形態と組み合わされうる、方法についての多様な実施形態では、形質導入するステップは、生細胞をカウントするために、活性化Ｔ細胞セットの試料を得ること；スピノキュレーションのために、活性化Ｔ細胞セットを調製すること；活性化Ｔ細胞セットを、組換えウイルスベクターと接触させ、遠心力を、活性化Ｔ細胞セットへと加えることにより、活性化Ｔ細胞セットにスピノキュレートすること；並びに形質導入した後で、哺乳動物細胞用インキュベーターにおいて、活性化Ｔ細胞セットをインキュベート及び／又は接種することを含む。一部の実施形態では、上記のステップのうちのいずれか１つ又は複数は、自動的に実施されうる。例えば、１つ又は複数のステップは、生細胞をカウントするために、活性化Ｔ細胞セットの試料を自動的に得ること；スピノキュレーションのために、活性化Ｔ細胞セットを自動的に調製すること；活性化Ｔ細胞セットを、組換えウイルスベクターと接触させ、遠心力を、活性化Ｔ細胞セットへと加えることにより、活性化Ｔ細胞セットに自動的にスピノキュレートすること；並びに形質導入した後で、哺乳動物細胞用インキュベーターにおいて、活性化Ｔ細胞セットを自動的にインキュベート及び／又は自動的に接種して実施されうる。
[0009]一部の実施形態では、方法は、ワークテーブルを、活性化Ｔ細胞セットへの形質導入のための実験機器及び試薬と共に設置するステップをさらに含む。
[0010]方法についての多様な実施形態では、接種するステップは、生細胞をカウントするために、形質導入した後で、活性化Ｔ細胞セットの試料を得ること；及び活性化Ｔ細胞セットを、拡大プレートへと自動的に移し、活性化Ｔ細胞セットを含有する拡大プレートを、哺乳動物細胞用インキュベーターに入れることにより、活性化Ｔ細胞セットを接種することを含む。一部の実施形態では、上記のステップのうちのいずれか１つ又は複数は、自動的に実施されうる。例えば、１つ又は複数のステップは、生細胞をカウントするために、形質導入した後で、活性化Ｔ細胞セットの試料を自動的に得て実施されうる。
[0011]一部の実施形態では、方法は、ワークテーブルを、活性化Ｔ細胞セットを接種するための実験機器及び試薬と共に設置するステップをさらに含む。
[0012]方法についての多様な実施形態では、拡大するステップは、生細胞をカウントするために、形質導入Ｔ細胞セットの試料を得ること；及びｍｏｃｋ灌流／細胞培養培地交換を実施することをさらに含む。一部の実施形態では、上記のステップのうちのいずれか１つ又は複数は、自動的に実施されうる。例えば、１つ又は複数のステップは、ｍｏｃｋ灌流／細胞培養培地交換を自動的に実施して実施されうる。
[0013]一部の実施形態では、方法は、ワークテーブルを、形質導入Ｔ細胞セットを拡大するための実験機器及び試薬と共に設置するステップをさらに含む。
[0014]方法についての多様な実施形態では、ビーズ分離ステップは、生細胞をカウントするために、ビーズにより分離する前に、試料を得ること；磁界を加えることにより、形質導入Ｔ細胞セットを、ビーズにより分離すること；及び、任意選択で、生細胞をカウントするために、ビーズにより分離した後で、試料を得ることを含む。一部の実施形態では、上記のステップのうちのいずれか１つ又は複数は、自動的に実施されうる。例えば、１つ又は複数のステップは、生細胞をカウントするために、ビーズにより分離する前に、試料を自動的に得ること；磁界を加えることにより、形質導入Ｔ細胞セットを、自動的にビーズにより分離すること；及び、任意選択で、生細胞をカウントするために、ビーズにより分離した後で、試料を自動的に得て実施されうる。
[0015]一部の実施形態では、方法は、ワークテーブルを、ビーズにより分離するための実験機器及び試薬と共に設置するステップをさらに含む。
[0016]方法についての多様な実施形態では、採取するステップは、形質導入Ｔ細胞セットを、凍結保存培地と共に、クライオバイアルに入れること；及びクライオバイアルを、液体窒素タンクに入れることを含む。
[0017]一部の実施形態では、方法は、ワークテーブルを、形質導入Ｔ細胞を凍結保存するための実験機器及び試薬と共に設置するステップをさらに含む。
[0018]方法についての多様な実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。
[0019]方法についての多様な実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。
[0020]方法についての多様な実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。
[0021]方法についての多様な実施形態では、異種組換えタンパク質は、組換え受容体を含む。
[0022]方法についての多様な実施形態では、組換え受容体は、疾患、障害、又は状態の細又は組織と関連する、これに特異的である、及び／又はこれにおいて発現される、標的抗原に結合することが可能である。
[0023]方法についての多様な実施形態では、疾患、障害、又は状態は、感染性疾患若しくは感染性障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、又は腫瘍若しくはがんである。
[0024]方法についての多様な実施形態では、標的抗原は、腫瘍抗原である。
[0025]方法についての多様な実施形態では、組換え受容体は、機能的な非Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）抗原受容体若しくはＴＣＲ、又はこれらの抗原結合性断片であるか、又はこれを含む。
[0026]方法についての多様な実施形態では、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
[0027]方法についての多様な実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであるか、又はこれを含む。
[0028]方法についての多様な実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター又はガンマレトロウイルスベクターである。
[0029]方法についての多様な実施形態では、Ｔ細胞は、１例又は複数例のドナーから得られた初代Ｔ細胞を含む。
[0030]方法についての多様な実施形態では、１例又は複数例のドナーは、ヒト対象である。
[0031]開示される方法に関して、活性化Ｔ細胞へのウイルス感染を促進する条件下で、活性化Ｔ細胞を、組換えウイルスベクターと接触させることにより活性化Ｔ細胞セットへと形質導入するステップに対する言及がなされる。しかし、開示される方法が、異種組換えタンパク質をコードする核酸を組み込む非ウイルス法を含みうることが想定される。核酸を、活性化Ｔ細胞セットへと組み込むための非ウイルス法の例は、電気穿孔、試薬ベースのトランスフェクション、細胞圧縮、又は細胞圧搾を含みうるがこれらに限定されない。核酸の非ウイルス的組込みは、例えば、本開示の範囲から逸脱しない限りにおいて、自動式電気穿孔、試薬ベースの自動式トランスフェクション、自動式細胞圧縮、自動式細胞圧搾などにより、自動的に実施されうることが想定される。
[0032]したがって、多様な実施形態では、本明細書で開示される、Ｔ細胞をスケールダウン加工するための自動化方法は、１例又は複数例のドナー（１例又は複数例のヒトドナーなど）から得られた、Ｔ細胞のインプットセットを、１つ又は複数の活性化試薬と自動的に接触させることにより、Ｔ細胞のインプットセットを活性化させて、活性化Ｔ細胞セットを作出するステップ；異種組換えタンパク質をコードする核酸を含む組換えポリヌクレオチドの、活性化Ｔ細胞セットへの組込みを促進する条件下で、活性化Ｔ細胞セットを、組換えポリヌクレオチドと接触させることにより、活性化Ｔ細胞セットを改変して、改変Ｔ細胞セットを作出するステップ；拡大培地において、改変Ｔ細胞セットを拡大するステップ；改変Ｔ細胞セットを、拡大培地から回収するステップ；及び改変Ｔ細胞セットを自動的に凍結保存することにより、改変Ｔ細胞セットを採取して、採取された改変Ｔ細胞セットを作出するステップを含む。
[0033]方法についての多様な実施形態では、活性化Ｔ細胞セットを改変して、活性化Ｔ細胞セットを作出するステップは、形質導入、電気穿孔、試薬ベースのトランスフェクション、細胞圧縮、又は細胞圧搾のうちの少なくとも１つを介して、組換えポリヌクレオチドを組み込むことをさらに含む。
[0034]方法についての多様な実施形態では、Ｔ細胞のインプットセットを活性化させるステップ、活性化Ｔ細胞セットを改変するステップ、改変Ｔ細胞セットを拡大するステップ、改変Ｔ細胞セットを回収するステップ、及び改変Ｔ細胞セットを採取するステップのうちの１つ又は複数は、オペレーターからの介入を伴わずに、自動的に実施される。
[0035]例えば、方法についての一部の実施形態では、方法は、ワークテーブルを、形質導入、電気穿孔、試薬ベースのトランスフェクション、細胞圧縮、又は細胞圧搾ための実験機器及び／又は試薬のうちの１つ又は複数と共に設置して、組換えポリヌクレオチドを、活性化Ｔ細胞セットへと組み込むステップをさらに含む。ワークテーブルを設置するステップは、一部の例では、自動的に、又は少なくとも部分的に自動的に実施されうる。
[0036]方法についての一部の例では、方法は、改変Ｔ細胞セットを接種及び／又はインキュベートするステップをさらに含む。例えば、改変Ｔ細胞セットは、接種培地及び／又はインキュベーション培地へと自動的に移されうる。方法は、改変Ｔ細胞セットを、拡大培地へと自動的に移すことにより、改変Ｔ細胞セットを拡大するステップをさらに含みうる。一部の例では、方法は、接種手順及び／又は拡大手順のために、ワークテーブルを設置するステップを含みうる。接種手順及び／又は拡大手順のために、ワークテーブルを設置するステップは、一部の例では、自動的に、又は少なくとも部分的に自動的に実施されうる。
[0037]方法についての一部の例では、方法は、ビーズ分離ステップを含む。ビーズ分離ステップは、生細胞をカウントするために、ビーズにより分離する前に、試料を得ること、及び、ビーズが、磁界へと誘引されるか、又は磁界に応答する場合に、細胞カウンティングに基づき、磁界を加えることにより、改変Ｔ細胞セットを、ビーズにより分離することを含みうる。一部の例では、試料は、生細胞カウンティング手順のために、ビーズ分離ステップの後で得られる。サンプリングするステップ、及び／又はビーズ分離ステップは、一部の例では、自動的に、又は少なくとも部分的に自動的に実施されうる。一部の例では、ワークテーブルは、ビーズ分離ステップ及び／又は細胞をカウントする／サンプリングするために設置され、例では、ワークテーブルの設置は、自動的に、又は少なくとも部分的に自動的になされる。
[0038]方法についての一部の例では、方法は、ワークテーブルを、改変Ｔ細胞セットを回収及び／又は採取するための実験機器及び／又は試薬と共に設置するステップを含む。改変Ｔ細胞セットを回収及び／又は採取するために、ワークテーブルを設置するステップは、一部の例では、自動的に、又は少なくとも部分的に自動的になされうる。一部の例では、改変Ｔ細胞セットを採取するステップは、改変Ｔ細胞セットを、凍結保存培地と共に、クライオバイアルに入れることを含む。一部の例では、改変Ｔ細胞セットを採取するステップは、一部の例では、クライオバイアルを、液体窒素タンクに入れることをさらに含む。
[0039]方法についての一部の例では、Ｔ細胞のインプットセットは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む。
[0040]方法についての一部の例では、Ｔ細胞のインプットセットは、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。
[0041]一部の例では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む。
[0042]方法についての一部の例では、異種組換えタンパク質は、組換え受容体を含む。一例として述べると、組換え受容体は、疾患、障害、若しくは状態と関連する標的抗原、これらに特異的な標的抗原、及び／又は関連する疾患、障害、若しくは状態の細胞若しくは組織において発現される標的抗原に結合することが可能である。例えば、疾患、障害、又は状態は、感染性疾患又は障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、腫瘍又はがんのうちの１つ又は複数でありうる。複数の例では、標的抗原は、腫瘍抗原である。一部の例では、組換え受容体は、機能的な非Ｔ細胞抗原受容体、又はＴ細胞受容体の抗原結合性断片である。一部の例では、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
[0043]本開示の別の態様は、Ｔ細胞のスケールダウン製造のためのマルチプレックス自動化システムである。一部の実施形態では、システムは、自動化リキッドハンドリングシステム、並びに自動化リキッドハンドリングシステムと連通する制御システムであって、自動化リキッドハンドリングシステムを制御して、Ｔ細胞セットを活性化させるユニットプロセス；Ｔ細胞セットへと形質導入することなどにより、Ｔ細胞セットを改変するユニットプロセス；Ｔ細胞セットをビーズにより分離するユニットプロセス；Ｔ細胞セットを接種するユニットプロセス；Ｔ細胞セットを拡大するユニットプロセス；及びＴ細胞セットを採取するユニットプロセスを実施するようにプログラムされた、１つ又は複数のプロセッサーを含む制御システムを含む。
[0044]システムについての多様な実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステムは、液体を、独立のマルチチャネルピペットフォーマットで移すように構成された、フレキシブルチャネルリキッド操作モジュールを含み、この場合、各ピペットは、独立にオペレーションされるように構成される。
[0045]システムについての多様な実施形態では、フレキシブルチャネルリキッド操作モジュールは、液体クラスの決定に基づき、流体容量を、約０．５～５０００μＬの間で正確に操作するように構成される。
[0046]システムについての多様な実施形態では、フレキシブルチャネルリキッド操作モジュールは、使い捨てチップを使用して、滅菌培養物を供給するように構成される。
[0047]システムについての多様な実施形態では、フレキシブルチャネルリキッド操作モジュールは、リキッドディスプレースメント式のフレキシブルチャネルアームである。
[0048]システムについての多様な実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステムは、液体を、マルチチャネルピペットフォーマットで移すように構成された、静態マルチチャネルリキッド操作モジュールから構成される。
[0049]システムについての多様な実施形態では、静態マルチチャネルリキッド操作モジュールは、マルチチャネルアームである。
[0050]システムについての多様な実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステムは、互換性グリッパー構成部を伴う、容器操作モジュールを含む。
[0051]システムについての多様な実施形態では、互換性グリッパー構成部は、水平方向のアクセス及び実験機器の移送のために構成された離心フィンガー；実験機器への、垂直方向のアクセスのために構成された向心フィンガー；並びにチューブ型実験機器の移送のために構成されたチューブ用フィンガーを含む。
[0052]システムについての多様な実施形態では、容器操作モジュールは、ｚ軸方向に長型のロボットグリッパーアームである。
[0053]システムについての多様な実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステムは、活性化ユニットオペレーション、形質導入ユニットオペレーション、接種ユニットオペレーション、拡大ユニットオペレーション、ビーズ分離ユニットオペレーション、及び採取ユニットオペレーションのために独立に構成可能なワークテーブルを含む。
[0054]システムについての多様な実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステムは、温度制御型ロボット遠心分離機を含む。
[0055]システムについての多様な実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステムは、丸形の実験機器を保持及び把持するように構成されたバイアルグリッパーモジュールを含む。
[0056]システムについての多様な実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステムは、生細胞カウントの測定を行うように構成された、自動化細胞カウンティングモジュールを含む。
[0057]システムについての多様な実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステムは、クライオバイアルを保持するように構成された、携帯型クライオバイアル冷却チャンバー／キャップホルダーを含む。
[0058]システムについての多様な実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステムは、滅菌環境をもたらす。
[0059]一部の実施形態では、システムは、哺乳動物細胞用インキュベーターをさらに含む。
[0060]上記で記載されたシステムは、本明細書で開示される方法のうちのいずれかを実行するのに使用されうることが理解されるものとする。
[0061]実施形態は、付属の図面及び付属の特許請求の範囲を伴う、後続の詳細な記載により、たやすく理解されるであろう。実施形態は、例を目的として例示されるものであり、付属の図面の図における限定を目的とするものではない。
本明細書で開示される実施形態に従う、自動化マルチプレックス哺乳動物細胞培養システムについての概略的ブロック図である。 リキッドディスプレースメント式のフレキシブルチャネルアーム（ＦＣＡ）についての概略図である。 マルチプルチャネルアーム（ＭＣＡ）についての概略図である。 ９６チャネルアダプターの上側面についてのデジタル画像である。 図４Ａに示された９６チャネルアダプターの下側面についてのデジタル画像である。 長型ロボットグリッパーアーム（ＲＧＡ）についての概略図である。 図５に示される、長型ロボットグリッパーアーム（ＲＧＡ）のための離心フィンガーについての概略図である。 図５に示される、長型ロボットグリッパーアーム（ＲＧＡ）のための向心フィンガーについての概略図である。 図５に示される、長型ロボットグリッパーアーム（ＲＧＡ）のためのチューブ用フィンガーについての概略図である。 図２に示されたＦＣＡのためのシリンジ構成についてのデジタル画像である。 ７ｍｍマイクロプレートネストセグメント、及び７ｍｍネストについての概略図である。 １００ｍＬ試薬トラフについての概略図である。 ５０ｍＬ円錐チューブランナーについての概略図である。 ６ポジションホテル１０５についての概略図である。 ロボット遠心分離機についての概略図である。 命名された構成要素の構成を示すワークテーブル６０についての概略図である。 図２、３、及び５のそれぞれに示された、ＦＣＡ、ＭＣＡ、及びＲＧＡの構成を示すリキッドハンドリングシステムについての概略図である。 ある特定の実施形態に従う、Ｔ細胞培養の自動化方法のためのワークフローについての概略図である。
[0080]後続の詳細な記載は、その性格において、例示的なだけのものであり、対象物の実施形態、又はこのような実施形態の適用及び使用を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される、「例示的」という語は、「例、場合、又は例示として用いられること」を意味する。本明細書で、例示的なものとして記載される任意の実施は、必ずしも、他の実施を超えて好ましかったり、有利であったりすると解釈されるわけではない。さらに、前出の「分野」、「背景」、「概要」、又は後続の「詳細な記載」において提示、表明、又は含意されるいかなる理論によって束縛される意図も存在しない。
[0081]本明細書は、「１つの実施形態」又は「ある実施形態」に対する言及を含む。「一実施形態では」又は「ある実施形態では」という語句の出現は、必ずしも、同じ実施形態を指すわけではない。特定の特色、構造、又は特徴は、本開示と整合的な、任意の適切な形で組み合わされうる。
[0082]用語：以下の段落は、本開示（付属の特許請求の範囲を含む）で見出される用語についての、例示的記載及び／又は例示的文脈を提示する。
[0083]「～を含むこと」：この用語は、オープンエンドである。付属の特許請求の範囲で使用される通り、この用語は、さらなる構造又はステップを除外しない。
[0084]「～ように構成された」：１つ又は複数のタスクを実施するように「構成された」ものとしての、多様なユニット又は構成要素について記載又は主張されうる。このような文脈では、「～ように構成された」は、ユニット／構成要素が、オペレーション時に、これらの１つ又は複数のタスクを実施する構造を含むことを指し示すことにより、構造を含意するのに使用される。このように、指定されたユニット／構成要素が、現在、作動しない（例えばは、オン／活性ではない）場合であってもなお、ユニット／構成要素は、タスクを実施するように構成されるということができる。ユニット／回路／構成要素が、１つ又は複数のタスクを実施するように「構成されている」と述べることは、このユニット／構成要素について、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、第６段落を想起しないことを、明示的に意図する。
[0085]「第１の」、「第２の」など：本明細書で使用される、これらの用語は、それらが先行する名詞についての標識として使用されるものであり、任意の種類の順序（例えば、空間的順序、時間的順序、論理的順序など）を含意するものではない。
[0086]「カップリングさせた」：後続の記述は、要素又は結節又は特色が、併せて「カップリングされている」ことを指す。本明細書で使用された、そうでないことが明示的言明されない限りにおいて、「カップリングさせた」とは、１つの要素／結節／特色が、別の要素／結節／特色に、直接的に、又は間接的に接合され（又はこれらと、直接的に、又は間接的に連通され）ているが、必ずしも機械的にそうなのではないことを意味する。
[0087]加えて、ある特定の用語法はまた、後続の記述において、言及だけを目的としても使用される場合があり、したがって、限定的であることを意図しない。例えば、用語など、「上」、「下」、「上方」、「下方」、「前方」、及び「後方」とは、それについての言及がなされる図面における方向を指す。「前方」、「後部」、「後側」、「側方」、「外側」、「内側」、「左側」、及び「右側」などの用語は、構成要素の部分の配向性及び／若しくは位置について記載するか、又は議論される構成要素（複数可）について記載する文章及び関連する図面に対する明確な言及によりなされる、整合的であるが、任意の参照の枠内にある構成要素の間における、相対的な配向性及び／又は位置について記載する。このような用語法は、上記で具体的に言及された語、その派生語、及び同様の重要性を有する語を含みうる。
[0088]後続の記述では、本開示の実施形態についての完全な理解をもたらすために、具体的操作など、多数の具体的詳細が明示される。当業者には、本開示の実施形態が、これらの具体的詳細を伴わずに実施されうることが明らかであろう。他の場合に、本開示の実施形態を、不必要に不明瞭としないために、周知の技法は、詳細に記載されない。本明細書で使用される節の見出しは、構成的目的のためだけのものであり、記載される対象物を限定するものとしては解釈されないものとする。
序説
[0090]細胞療法における使用のためのＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞など、遺伝子操作Ｔ細胞の作製は、多数の変数を含む、マルチステッププロセスである。例えば、遺伝子操作Ｔ細胞を作製するために、細胞は、刺激条件下におけるインキュベーション、形質導入を介する、組換えポリペプチドの、細胞への導入、並びに増殖及び／又は拡大を促進する条件下における細胞の増殖下に置かれる。これらのプロセスの各々は、被験条件の変動、及び使用者／オペレーターのばらつきの両方である変動下に置かれうる。さらに、現行のＴ細胞スケールダウン試験は、配備されるオペレーターの数、及び、所与の時点において、オペレーターが実施しうる条件の最大数により限定されうる。試験はまた、オペレーターハンドリング及びピペッティングの不正確に起因する、変数及び不整合にも曝露される場合がある。これらのばらつきは、結果における不整合をもたらしうる。使用者／オペレーターインプットと関連する不整合を低減し、開発スループットの増大の一助とするために、自動化スケールダウンＴ細胞培養プラットフォームが必要とされる。自動化スケールダウンプラットフォームであれば、標準化Ｔ細胞培養プラットフォームをもたらし、スケールダウン実験の整合性を改善するであろう。このプラットフォームであれば、原材料の検証などのルーチン検査のために、又は培地の開発など、複雑なタスクに対して有益であろう。培地のスクリーン及び培養物サプリメントスクリーンなどのタスク、並びに大実験計画法（ＤｏＥ）による実験デザインを可能とするように、さらなる方法を書き下ろすこともできる。上記の必要を満たすために、本発明者らは、自動化ベンチトップによる細胞培養システム、及びこのシステムを使用して、治療用遺伝子操作Ｔ細胞の開発を促進する方法を開発した。
例示的システム
[0092]図１を参照しながら述べると、本明細書では、自動化Ｔ細胞スケールダウンモデルシステムと称される場合もある、自動化細胞培養システム１０が開示される。システム１０は、コンピュータ実装制御システムなどの制御システム２０、及び自動化リキッドハンドリングシステム３０を含む。示される通り、制御システム２０、及びリキッドハンドリングシステム３０は、ネットワーク４２により接続される。システムはまた、任意選択の哺乳動物細胞用インキュベーター３５も含みうる。ネットワーク４２は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）又はワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含む、任意のネットワークの場合もあり、接続が、外部のコンピュータデバイスへと（例えば、インターネットサービスプロバイダーを使用するインターネットを介して）なされるか、または無線ネットワークへとなされるか、なおまたは直接的な接続として、例えば、システム１０の内蔵型構成要素としてなされる場合もある。制御システム２０は、自動化リキッドハンドリングシステム３０の、多様なモジュールを制御する。ある特定の実施形態では、自動化リキッドハンドリングシステム３０は、例えば、滅菌細胞培養作業のための滅菌環境を含み、汚染を防止するように、フィルター及び／又は陽圧換気を有する筐体、例えば、フード又はキャビネットに含有される場合がある。リキッドハンドリングシステム３０は、リキッドハンドリングのための複数のモジュール、液体、及びＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞など、目的の哺乳動物細胞を含みうる液体を含む容器から構成される。
[0093]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、リキッドディスプレースメント式のフレキシブルチャネルアームなどのフレキシブルチャネルリキッド操作モジュール４０を含む（例えば、図２を参照されたい）。複数の実施形態では、フレキシブルチャネルリキッド操作モジュール４０は、哺乳動物細胞を含有する液体などの液体を、１つの容器、例えば、平底プレート又は丸底プレート、円錐チューブなどのチューブなどから、別の容器へと移すように構成される。このアームは、各ピペッティングチャネルが、独立に作動することが可能であり、したがって、モジュール４０は、異なる容量の液体を、同時に移すことが可能であるため、「フレキシブル」と称される。複数の実施形態では、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、Ｔ細胞などの哺乳動物細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞）を含有する、異なる液体試料などの試料を個別に操作する、複数の個別のピペッティングチャネルを有するという点で、マルチプレックスである。ある特定の実施形態では、チャネル、又はチャネルのサブセットは、独立に作動しうる。例えば、制御システム２０は、チャネル、又はチャネルのサブセットが、独立に作動するようにプログラムされうる。複数の実施形態では、各ピペッティングチャネルは、独立に作動し、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、異なる容量の液体を、同時に移すことが可能である。複数の実施形態では、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、約２～１９６の間、又はこれを超えるチャネルを有する。複数の実施形態では、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、液体の移動のために、液体置換技術を使用する。複数の実施形態では、液体の移動は、希釈器シリンジピストンにより創出される圧力差により実施される。例えば、下方へのピストン移動が、負の圧力差を創出し、ピペットの先端部における液体の吸引を可能とするのに対し、上方へのピストン移動は、正の圧力差を創出し、ピペットの先端部からの液体の分注を可能とする。ある特定の実施形態では、ピペットの先端部（複数可）（液体と接触するピペットの部分となる）は、滅菌培養物を供給するように、使い捨てチップ（ＤｉＴｉ）を使用する。他の実施形態では、先端部は、固定型であるが、例えば、ＵＶ光、又は他の化学的処理若しくは放射線処理により滅菌される。ＤｉＴｉ構成は、約１．２５ｍＬ～約５ｍＬの間など、約０．５ｍＬ～約５ｍＬの間シリンジ、例えば、１．２５ｍＬのシリンジ及び５ｍＬのシリンジの使用を可能とする。複数の実施形態では、個別のピペットチャネルは、約０．５～５０００μＬの間の流体容量を正確に操作することが可能である（下記の「液体クラスの決定」節を参照されたい）。Ｔ細胞培養に関して、下記で記載される種類など、ＤｉＴｉの種類はまた、細胞培養法の中で、直接交換することもできる。具体的な実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、リキッドディスプレースメント式のフレキシブルチャネルアーム（ＦＣＡ）を使用する（例えば、図２を参照されたい）。図２に示される実装では、リキッドＦＣＡは、液体の移動のために、液体置換技術を利用する、８つのピペッティングチャネルシステムである。標準的なＦＣＡシリンジ構成は、最大で１ｍＬの液体の移動を可能とする、１．２５ｍＬのシリンジ８本を含む。細胞培養培地のための、大容量の移動の要件のために、５ｍＬのシリンジを可能とするようなシステムのためのシリンジ構成を開発した（図９を参照されたい）。図９を参照しながら述べると、５ｍＬのシリンジを、ポジション１及び８に配置して、残りの１．２５ｍＬのシリンジ６本に対する立体障害を制限した。加えて、一連の１．２５ｍＬのシリンジを有することは、スケールダウン法のスクリプト作成に、高度に有益である。全体として、１．２５／５ｍＬのシリンジ構成は、大容量の移動を可能とするが、方法のスクリプト作成及び開発に柔軟性をもたらす。
[0094]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、任意選択で、フレキシブルチャネルリキッド操作モジュール４０に加えて、マルチプルチャネルアーム（ＭＣＡ）など、静態マルチチャネルリキッド操作モジュール４５を含む（図３を参照されたい）。静態マルチチャネルリキッド操作モジュール４５は、異なる容量の液体を、同時に、示差的に移すことが不可能であるという点で、「静態」的である。静態マルチチャネルリキッド操作モジュール４５は、液体の容量が、チャネル間で同じである場合に使用されうる。典型的に、静態マルチチャネルリキッド操作モジュール４５は、９６チャネルフォーマット又は３８４チャネルフォーマットなど、マルチウェルフォーマットにおける液体の移動に使用される。複数の実施形態では、静態マルチチャネルリキッド操作モジュール４５は、各シリンダー内の圧力差に基づき吸引ステップ及び分注ステップを実施する、３８４のプランジャーを有する空気交換システムである。しかし、フレキシブルチャネルリキッド操作モジュール４０と異なり、静態マルチチャネルリキッド操作モジュール４５のプランジャーは、共時的に動き、したがって、異なる容量の液体を、同時に、示差的に移すことが不可能である。静態マルチチャネルリキッド操作モジュール４５は、複数のアダプター型と適合性でありうる。システムについてのある特定の例では、９６チャネルアダプターを、静態マルチチャネルリキッド操作モジュール４５と共に使用する（図４Ａ及び４Ｂを参照されたい）。ある特定の実施形態では、ピペットの先端部（液体と接触するピペットの部分となる）は、滅菌培養物を供給するように、使い捨てチップ（ＤｉＴｉ）を使用する。他の実施形態では、先端部は、固定型であるが、例えば、ＵＶ光、又は他の化学的処理若しくは放射線処理により滅菌される。例として述べると、ＤｉＴｉ型の先端部を取り上げると、液体は、システム１０の構成に応じて、９６ＤｉＴｉ全てを併せて、１２ずつのＤｉＴｉの最初の２行、又はＤｉＴｉの最初の４列により移される。複数の実施形態では、９６チャネルアダプターは、ＤｉＴｉ（固定型先端部と対比した）を使用し、０．５μ～１２５μＬの間など、０．２μ～２５０μＬの間の液体の、マルチプレックスの移動を可能とする。
[0095]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、ｚ軸方向に長型のロボットグリッパーアーム（ＲＧＡ）などの容器操作モジュール５０（図５を参照されたい）を含みうる。容器操作モジュール５０は、活動に応じて、異なる形状及びサイズの容器を操作するように、異なるグリッパー構成又はヘッドと適合させることができる。ある特定の実施形態では、容器操作モジュール５０は、滅菌環境において、例えば、上記で記載された、滅菌細胞培養作業のために使用される。ある特定の実施形態では、異なるグリッパー構成又はヘッドは、例えば、制御システム２０の制御下で、システム１０により、自動的に変化させることができる。グリッパー構成に基づき、容器操作モジュール５０は、ワークテーブル６０の全体及び下方における、実験機器全体の移送を可能とする。実験機器は、マイクロプレート、深型ウェルプレート、円錐チューブ、ＤｉＴｉボックスなどを含みうる。容器操作モジュール５０はまた、保管位置及びデバイスとの往復の実験機器の移送のためにも使用されうる。ｚ軸方向に長型のロボットグリッパーアーム（ＲＧＡ）を伴う実施形態など、ある特定の実施形態では、容器操作モジュール５０は、容器を、ｘ方向、ｙ方向、及びｚ方向に移動させる。図５に描示される通り、容器操作モジュール５０のグリッパーフィンガーはまた、開閉（Ｇ）のほか、３６０°の回転（Ｒ）も行うことができる。
[0096]ある特定の構成では、容器操作モジュール５０は、離心フィンガー５２（例えば、図６を参照されたい）を使用する。離心フィンガー５２は、水平方向のアクセス及び実験機器の移送を可能とする。離心フィンガー５２は、標準的な細胞培養物（例えば、６ウェルプレート及び２４ウェルプレート）、及びサンプリングプレート（例えば、１．０ｍＬ深型ウェルプレート、９６平底／丸底プレート）の移送を可能とする。離心フィンガー５２は、ホテル１０５へのアクセス及び格納（下記で論じられる）をさらに可能とする。
[0097]ある特定の構成では、容器操作モジュール５０は、向心フィンガー５４（例えば、図７を参照されたい）を使用する。向心フィンガー５４は、実験機器への、垂直方向のアクセスを有し、水平方向のアクセスが限定されている部位にアクセスするために使用される。向心フィンガー５４は、全ての深型ウェル細胞培養物プレート（遠心分離機用プレート拡大プレート）、及び遠心分離機構成要素の、ワークテーブル６０の周囲、及び下方への移送を可能とする。
[0098]ある特定の構成では、容器操作モジュール５０は、チューブ用フィンガー５６（図８を参照されたい）を使用する。チューブ用フィンガー５６は、チューブ型実験機器の移送のために使用される。チューブ用フィンガー５６はまた、クライオバイアル（活性化ユニットオペレーション、及び採取ユニットオペレーションを参照されたい）、及び５０ｍＬ円錐チューブ（活性化ユニットオペレーションを参照されたい）を閉栓及び開栓するためにも使用されうる。
[0099]図１を再度参照して述べると、上記で論じられたモジュールに加えて、リキッドハンドリングシステム３０は、ワークテーブル６０を、下記の方法で明示される、本スケールダウン適用を可能とするように構成された構成要素と共に含む。これらの適用は、Ｔ細胞のための、活性化、形質導入、接種、拡大、ビーズ分離、及び採取のユニットオペレーションを含む。ネスト型のデッキセグメント８５（図１０を参照されたい）、トラフランナー、チューブランナー、ホテル１０５、特注の実験機器、及び内蔵型デバイスは、異なるユニットオペレーションの間で、ワークテーブル６０の著明な改変を伴わずに、各ユニットオペレーションの最大限の加工を可能とするように構成される。ユニットオペレーション法ごとのワークテーブル６０のレイアウトは、ネスト部位及びホテル１０５を使用して、使用される実験機器の量を最大化し、これにより、各ユニットオペレーションで実施される条件の数を最大化し、システム１０のマルチプレックス能を大幅に増強する。
[00100]複数の実施形態では、デッキセグメント８５は、装置使用者の構成に従い、ワークテーブル６０に配置されうる、デッキ構成要素（例えば、図１０を参照されたい）である。デッキセグメント８５は、実験機器を保持するのに利用される、ネスト部位を格納する。複数の実施形態では、ワークテーブル６０は、マイクロプレート及び深型ウェルプレートの両方の使用を可能とするように、２５×７ｍｍのネストで装飾されている。
[00101]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、３２０ｍＬ試薬トラフランナーなどのトラフランナー９０を含む。３２０ｍＬ試薬トラフランナーは、３×３２０ｍＬ試薬トラフを保持する、２ポジション型グリッドセグメントである。３２０ｍＬトラフは、最大で２５６ｍＬの液体を保持し、細胞培養培地などの大容量試薬を保持するように選び出されうる。
[00102]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、１００ｍＬ試薬トラフなどの試薬トラフ９５を含む（図１１を参照されたい）。１００ｍＬ試薬トラフは、３×１００ｍＬ試薬トラフを保持する。１００ｍＬ試薬トラフは、最大で８０ｍＬの液体を保持し、凍結保存培地、及び細胞生存率測定試薬、例えば、Ｇｕａｖａ Ｖｉａｃｏｕｎｔ試薬などの大容量試薬を保持するように選び出された。
[00103]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、５０ｍＬ円錐チューブランナーなどの円錐チューブランナー１００を含む（図１２を参照されたい）。ある例では、５０ｍＬ円錐チューブランナーは、１０×５０ｍＬ円錐チューブを保持する、２ポジション型グリッドセグメントである。自動化スケールダウン法において、５０ｍＬ円錐チューブは、大容量細胞混合物のために、すなわち、細胞が、新鮮な細胞培養培地で洗浄され、遠心分離される、活性化ユニットオペレーションにおいて使用される。
[00104]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、ホテル１０５を含む（図１３を参照されたい）。ホテル１０５は、プレート型実験機器の保管のために利用される。複数の実施形態では、ホテル１０５は、２つ～１０の間でのポジションを有する。マルチプルホテル１０５は、ポジションの数を増大させるのに使用されうる。これらは、ワークテーブル６０空間の最大化を可能とする。実験機器は、使用まで、ホテル１０５に保管し、次いで、必要とされる場合に、容器操作モジュール５０の離心フィンガー５２を介して、ワークテーブル６０へと移すことができる。ある特定の実施形態では、６ポジションホテル１０５は、多様な実験機器セットを保持する、それらの能力により選び出される。自動化スケールダウンプロセスでは、２４平底ウェルプレート、６ウェルプレート、９６ウェル深型プレート、９６平底マイクロプレート、９６丸底マイクロプレート、６ｍｍ蓋、９ｍｍプレート蓋、金属製拡大用蓋などのうちの１つ又は複数が、ユニットオペレーションのために、６ポジションホテル１０５内に保管されうる。本開示の範囲から逸脱しない限りにおいて、さらなる実験機器、又は代替的実験機器も、ホテル１０５内に保管されうることが理解されうる。
[00105]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、ロボット遠心分離機６５（例えば、図１４を参照されたい）を含む。ある特定の実施形態では、ロボット遠心分離機６５は、温度制御される。ある特定の実施形態では、ロボット遠心分離機６５は、例えば、ローターの配置を感知及び制御する、例えば、チューブ及び／又はプレートが、容易に操作される、ロボット遠心分離機６５に配置される、及び／又はこれから取り出されることを可能とする制御システム２０により、コンピュータ制御される。ある特定の実施形態では、ロボット遠心分離機６５は、柔軟性をもたらすように、１つ又は複数の容器の挿入のために、約２～約８の間のポジションを有する。ある特定の実施形態では、ロボット遠心分離機６５は、ローター配置をコンピュータ制御した、温度制御型の、４ポジション型ロボット遠心分離機である。ある特定の実施形態では、ロボット遠心分離機６５は、デッキ下方の高性能（例えば、水平方向と対比した、垂直方向のアクセス）を有する。下記で開示される自動化Ｔ細胞培養法では、ｚ軸方向に長型のロボットグリッパーアーム（ＲＧＡ）などの容器操作モジュール５０は、向心フィンガー５４により、実験機器を取り上げ、次いで、実験機器を、垂直方向に、上方の格納用自動ドアを介して、ロボット遠心分離機６５へと移す。ロボット遠心分離機６５のハンドリングを含む、これらのオペレーションは、制御システム２０により、例えば、使用者のインプット、又はロボット遠心分離機６５及び容器操作モジュール５０を作動させるための命令の、プログラムファイルへの提示に基づき制御されうる。
[00106]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、バイアルグリッパーモジュール７０）を含む。複数の実施形態では、バイアルグリッパーモジュール７０は、円錐チューブなどのチューブの閉栓及び開栓を可能とする、空気圧式デバイスである。これは、標準的な、１５ｍＬ及び５０ｍＬのチューブサイズを含みうる。円錐チューブの閉栓／開栓は、下記で開示される方法など、チューブ遠心分離ステップのためになされる。チューブ用フィンガー５６を使用して、容器操作モジュール５０は、円錐チューブを、バイアルグリッパーモジュール７０へと移し、圧力の変化に基づき、バイアルグリッパーモジュール７０は、チューブを把持する。次いで、容器操作モジュール５０は、チューブの栓を取り上げ、円錐チューブに置き、チューブを閉栓する。最後に、容器操作モジュール５０は、チューブを、ロボット遠心分離機６５における、遠心分離のための遠心分離機チューブアダプターへと移す。遠心分離後、開栓のために、チューブを、バイアルグリッパーモジュール７０へと戻す。下記の方法では、バイアルグリッパーモジュール７０は、活性化ユニットプロセスにおけるチューブ遠心分離ステップにおいて使用される。バイアルグリッパーモジュール７０のハンドリングを含む、これらのオペレーションは、制御システム２０により、例えば、使用者のインプット、又はバイアルグリッパーモジュール７０及びロボット遠心分離機６５及び容器操作モジュール５０を作動させるための命令の、プログラムファイルへの提示に基づき制御されうる。
[00107]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、任意選択で、例えば、手作業による細胞生存率の決定を回避するように、細胞カウンティングモジュール７５を含む。ある特定の実施形態では、容器操作モジュール５０は、カウンティングプレートを、直接、細胞カウンティングモジュール７５へと移す。ある特定の実施形態では、細胞カウンティングモジュール７５は、生細胞カウント（ＶＣＣ）の測定値を、制御システム２０へと移送する。自動化ＶＣＣ測定は、オペレーター間のインタラクションを伴わずに、方法の直接的な伝搬を可能とする。
[00108]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、携帯型クライオバイアル冷却チャンバー／キャップホルダー８０を含む。複数の実施形態では、クライオバイアル冷却チャンバーは、２ｍＬクライオバイアルのための、１２ポジションホルダーである。複数の実施形態では、クライオバイアル冷却チャンバー／キャップホルダー８０は、容器操作モジュール５０の、チューブ用フィンガー５６による閉栓機能及び開栓機能を可能とするように、ネジ山をつけられている。クライオバイアル冷却チャンバー／キャップホルダー８０は、使用の前に冷凍庫に入れられ、クライオバイアルを、方法の持続時間にわたり、供給源温度に保つ。クライオバイアル冷却チャンバー／キャップホルダー８０は、保留ステップ又は休止ステップ時における、温度制御型遠心分離機への移送を可能とするように、携帯型でありうる。キャップホルダーは、特注ユニットであることが可能であり、閉栓ステップ及び開栓ステップのために、２ｍＬクライオバイアルの栓を保管するのに使用されうる。
[00109]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、５０ｍＬチューブ用遠心分離機アダプター１１０などの、携帯型チューブ用遠心分離機アダプター１１０を含む。５０ｍＬチューブ用遠心分離機アダプター１１０は、５０ｍＬチューブの遠心分離を可能とする、特注の遠心分離機用バケットである。これらのアダプターはまた、チューブオペレーションを要求するステップのためのチューブホルダーとしても使用される。５０ｍＬチューブ用遠心分離機アダプター１１０は、携帯型となるように作製して、容器操作モジュール５０による、遠心分離機への出し入れにおける容易な移送を可能とした。ワークテーブル６０において、これらは、特注の遠心分離機アダプターネストに置かれる。
[00110]複数の実施形態では、リキッドハンドリングシステム３０は、５０ｍＬチューブキャップホルダーなどのチューブキャップホルダー１１５を含む。５０ｍＬチューブキャップホルダーは、閉栓ステップ及び開栓ステップのための、５０ｍＬチューブ栓を保管するのに使用される、特注のユニットである。
[00111]開示されるシステムのほか、特注のキャリアの実施は、完全自動化Ｔ細胞培養プラットフォームを可能とする。このプラットフォームの実施は、より整合的な実験を可能とし、これにより、実験に導入されるオペレーターベースの変数を減少させる。人間のオペレーターと比較して、このプラットフォームは、実施される実験の数及び実験１つ当たりに要求される時間を改善する。
[00112]制御システム２０は、１つ又は複数の計算デバイスを含みうる。複数の実施形態では、計算デバイスは、１つ又は複数のプロセッサー、及び少なくとも１つの通信モジュールなど、多数の構成要素を含む。多様な実施形態では、１つ又は複数のプロセッサーは、各々、１つ又は複数のプロセッサーコアを含む。多様な実施形態では、少なくとも１つの通信モジュールは、１つ又は複数のプロセッサーへと、物理的及び／又は電気的にカップリングされる。さらなる実装では、通信モジュールは、１つ又は複数のプロセッサーの部分である。多様な実施形態では、計算デバイスは、プリント基板（ＰＣＢ）を含む。これらの実施形態のために、１つ又は複数のプロセッサー及び通信モジュールは、ＰＣＢに配置される。その適用に応じて、計算デバイスは、ＰＣＢへと、物理的及び電気的にカップリングされる場合もあり、そうでない場合もある、他の構成要素を含む。これらの他の構成要素は、メモリコントローラー、揮発性メモリ（例えば、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）（図示しない））、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）などの非揮発性メモリ、フラッシュメモリ、Ｉ／Ｏポート、デジタルシグナルプロセッサー、クリプトプロセッサー、グラフィックスプロセッサー、１つ又は複数のアンテナ、ディスプレイ（例えば、タッチスクリーンディスプレイ）、ディスプレイコントローラー（例えば、タッチスクリーンディスプレイコントローラー）、バッテリー、オーディオコーデック、ビデオコーデック、及び大容量記憶デバイス（ハードディスクドライブ、固体ドライブ、コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）など）などを含むがこれらに限定されない。
[00113]一部の実施形態では、１つ又は複数のプロセッサーは、１つ又は複数の連結（例えば、相互接続、バスなど）を介して、システムメモリへと作動的にカップリングされる。複数の実施形態では、システムメモリは、プログラムを作動させ、実行するのに、１つ又は複数のプロセッサーが利用する情報を保存し、システムを作動させることが可能である。異なる実施形態では、システムメモリは、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）の形態など、任意の使用可能な型の読取り可能／書込み可能メモリである。複数の実施形態では、計算デバイスは、計算デバイス及び／若しくは周辺構成要素、又は１つ若しくは複数のユーザーインターフェース若しくは周辺構成要素インターフェースにより、計算デバイスと関連するデバイスとのユーザーインタラクションを可能とするように、多様なインプット及びアウトプット／フィードバックデバイスを含むか、又はこれと他の形で関連する。複数の実施形態では、ユーザーインターフェースは、物理的キーボード又はキーパッド、タッチパッド、ディスプレイデバイス（タッチスクリーン又はノンタッチスクリーン）、スピーカー、マイクロフォン、画像センサー、触覚フィードバックデバイス、及び／又は１つ又は複数のアクチュエーターなどを含みうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、計算デバイスは、取り外し型スマートチップ又は「ＳＤ」（ｓｅｃｕｒｅ ｄｉｇｉｔａｌ）カード内に存在する場合もあり、歯科検診用固定チップ内に包埋される場合もある、メモリエレメント（図示しない）を含みうる。ある特定の例実施形態では、「ＳＩＭ」（ｓｕｂｓｃｒｉｂｅｒ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｍｏｄｕｌｅ）カードを使用することができる。多様な実施形態では、メモリエレメントは、ソフトウェアアプリケーションのデバイスへの常駐を可能とする。
[00114]一部の実施形態では、１つ又は複数のプロセッサー、フラッシュメモリ、及び／又は記憶デバイスは、計算デバイスが、１つ又は複数のプロセッサーによるプログラム命令の実行に応答して、本開示の実施形態に従い、本明細書で開示される方法についての、全ての態様、又は選択された態様を実施することを可能とするように構成されたプログラム命令を保存する、関連のファームウェアを含む。
[00115]複数の実施形態では、通信モジュールは、リキッド操作システム３０及び／又はその多様なモジュールなど、計算デバイスとのデータの転送の往復のための、有線通信及び／又は無線を可能とする。多様な実施形態では、計算デバイスはまた、計算デバイスを、送信機及び受信機（又は任意選択で、送受信機）を介して無線でネットワーク接続された、及び／又は通信ポートを使用する有線接続を介してネットワーク接続された、１つ又は複数の計算デバイスへと接続するように構成されたネットワークインターフェースも含む。複数の実施形態では、ネットワークインターフェース、並びに送信機／受信機及び／又は通信ポートは、「通信モジュール」と総称される。複数の実施形態では、無線送信機／受信機及び／又は送受信機は、１つ又は複数の無線通信規格に従い作動するように構成されうる。「無線」という用語及びその派生用語は、非固体媒質を介する変調電磁放射線の使用を介して、データを通信しうる、回路、デバイス、システム、方法、技法、通信チャネルなどについて記載するのに使用されうる。「無線」という用語は、関連するデバイスが電線を含有しないことを含意しないが、一部の実施形態では、デバイスは、電線を含有しない場合もある。複数の実施形態では、計算デバイスは、データを送信し、受信する、例えば、遠隔通信ネットワークなどのネットワークへとデータ送信し、ここから受信するための無線通信モジュールを含む。複数の実施形態では、計算デバイスは、例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、及び／又はＢＬＥプロトコール、ＷｉＦｉプロトコール、赤外線通信協会（ＩｒＤＡ）プロトコール、ＡＮＴ、及び／又はＡＮＴ＋プロトコール、ＬＴＥ ＰｒｏＳｅ規格などを使用することにより、直接的な無線接続を介して、１つ又は複数のデバイスと直接接続される。複数の実施形態では、通信ポートは、シリアル通信プロトコール（例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標）、シリアルデジタルインターフェース（ＳＤＩ）、及び／又は他の同様のシリアル通信プロトコール）、パラレル通信プロトコール（例えば、ＩＥＥＥ１２８４、ＣＡＭＡＣ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、及び／又は他の同様のパラレル通信プロトコール）、及び／又はネットワーク通信プロトコール（例えば、イーサネット（登録商標）、トークンリング、ＦＤＤＩ（Ｆｉｂｅｒ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｄａｔａ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、及び／又は他の同様のネットワーク通信プロトコール）など、１つ又は複数の公知の有線通信プロトコールに従い作動するように構成される。
[00116]複数の実施形態では、計算デバイスは、１つ又は複数のアプリケーションを走らせるか、実行するか、又は他の形で作動させるように構成される。複数の実施形態では、アプリケーションは、ネイティブアプリケーション、ウェブアプリケーション、及びハイブリッドアプリケーションを含む。複数の実施形態では、ネイティブアプリケーションは、プラットフォーム又はオペレーティングシステム（ＯＳ）に、特異的又は非特異的である。複数の実施形態では、ネイティブアプリケーションは、プラットフォーム特異的開発ツール、プログラミング言語などを使用する、特異的プラットフォームのために開発される。このようなプラットフォーム特異的開発ツール、及び／又はプログラミング言語は、プラットフォームベンダーにより提供される。複数の実施形態では、ネイティブアプリケーションは、製造時に計算デバイスにプレインストールされるか、又はネットワークを介するアプリケーションサーバーにより、計算デバイスへと提供される。ウェブアプリケーションは、サービスプロバイダーからのウェブアプリケーションの要望に応答して、計算デバイスのウェブブラウザーへとロードされるアプリケーションである。複数の実施形態では、ウェブアプリケーションは、リソースの可用性、ディスプレイサイズ、タッチスクリーンによる入力など、多様な計算デバイスパラメータを考慮することにより、計算デバイスにおいて走るようにデザインされるか、又はカスタマイズされたウェブサイトである。このように、ウェブアプリケーションは、ウェブブラウザー内のネイティブアプリケーションと同様のエクスペリエンスをもたらしうる。ウェブアプリケーションは、ＰＨＰ、Ｎｏｄｅ．ｊｓ、ＡＳＰ．ＮＥＴなど、任意のサーバーサイド開発ツール及び／若しくはプログラミング言語、並びに／又はＨＴＭＬをレンダリングする、他の任意の同様の技術により開発される、任意のサーバーサイドアプリケーションでありうる。ハイブリッドアプリケーションは、ネイティブアプリケーションと、ウェブアプリケーションとのハイブリッドでありうる。ハイブリッドアプリケーションは、スタンドアローンであるか、スケルトンであるか、又はアプリケーションコンテナ内のウェブサイトにロードしうる、他の同様のアプリケーションコンテナでありうる。ハイブリッドアプリケーションは、ＨＴＭＬ５、ＣＳＳ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）などなどのウェブサイト開発ツール、及び／又はプログラミング言語を使用して書くことができる。複数の実施形態では、ハイブリッドアプリケーションは、計算デバイスのウェブブラウザーを使用せずに、計算デバイスのブラウザーエンジンを使用して、ウェブサイトのサービスを、ローカルにレンダリングする。一部の実施形態では、ハイブリッドアプリケーションはまた、アクセロメーター、カメラ、ローカルストレージなどなど、ウェブアプリケーションではアクセスできない計算デバイス能力にもアクセスする。
[00117]１つ又は複数の、コンピュータ使用可能メディア（複数可）又はコンピュータ読取り可能メディア（複数可）の任意の組合せが、本明細書で開示される実施形態と共に利用されうる。コンピュータ使用可能メディア又はコンピュータ読取り可能メディアは、例えば、電気、磁気、光学、電磁、赤外、又は半導体によるシステム、装置、デバイス、又は伝搬メディアでありうるがこれらに限定されない。コンピュータ読取り可能メディアの、より具体的な例（非網羅的リスト）は、以下：１つ又は複数の電線を有する電気的接続、携帯型コンピュータディスケット、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、消去可能プログラム可能リードオンリーメモリ（ＥＰＲＯＭ又はフラッシュメモリ）、光ファイバー、携帯型コンパクトディスクリードオンリーメモリ（ＣＤ－ＲＯＭ）、光学記憶デバイス、インターネット若しくはイントラネットをサポートする伝送メディアなどの伝送メディア、又は磁性記憶デバイスを含む。プログラムは、例えば、紙又は他のメディアの光学的スキャニングを介して、電子的にキャプチャーされ、次いで、必要な場合、適切な形で、コンパイルされる場合もあり、解釈される場合もあり、他の形で加工される場合もあり、次いで、コンピュータメモリに保存されうるので、コンピュータ使用可能メディア又はコンピュータ読取り可能メディアは、プログラムがプリントされる、紙又は別の適切なメディアでもありうることに注意されたい。このドキュメントの文脈では、コンピュータ使用可能メディア又はコンピュータ読取り可能メディアは、命令実行システム、命令実行装置、若しくは命令実行デバイスによる使用、又はこれらとの関連における使用のためにプログラムを含有しうるか、保管しうるか、を通信しうるか、伝搬しうるか、又は移植しうる、任意のメディアでありうる。コンピュータ使用可能メディアは、これと共に統合されたコンピュータで使用可能なプログラムコードと共に伝搬されるデータシグナルを、ベースバンドにおいて、又は搬送波の一部として含みうる。コンピュータで使用可能なプログラムコードは、無線、電線、光ファイバーケーブル、ＲＦなどを含むがこれらに限定されない、任意の適切な媒質を使用して送信されうる。
[00118]本開示のハンドリングを実行するためのコンピュータプログラムコードは、Ｊａｖａ、Ｓｍａｌｌｔａｌｋ、Ｃ＋＋など、オブジェクト指向のプログラミング言語、及び「Ｃ」プログラミング言語など、従来の手続き型プログラミング言語、又は同様のプログラミング言語、又は制御システム２０にネイティブであるプログラミング言語を含む、１つ又は複数のプログラミング言語の任意の組合せで書くことができる。プログラムコードは、全面的に、ユーザー計算デバイスにおいて実行される場合もあり、部分的に、ユーザー計算デバイスにおいて実行される場合もあり、スタンドアローンソフトウェアパッケージとして実行される場合もあり、部分的にユーザー計算デバイスにおいて、かつ、部分的に、リモートコンピュータにおいて実行される場合もあり、完全に、リモートコンピュータ又はサーバーにおいて実行される場合もある。後者の状況では、リモートコンピュータは、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）又はワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含む、任意の型のネットワークを介して、ユーザー計算デバイスへと接続される場合もあり、接続が、上記で記載されたデバイスなど、外部の計算デバイス（例えば、インターネットサービスプロバイダーを使用するインターネット）、又は無線ネットワークなどへとなされる場合もある。
[00119]さらに、例示的な実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、ミドルウェア、マイクロコード、ハードウェア記述言語、又はこれらの任意の組合せにより実施されうる。ソフトウェアにおいて実施される場合、必要なタスクを実施する、ファームウェア、ミドルウェア又はマイクロコード、プログラムコード又はコードセグメントは、マシン又はコンピュータで読取り可能なメディアに保存されうる。コードセグメントは、手順、機能、サブプログラム、プログラム、ルーチン、サブルーチン、モジュール、プログラムコード、ソフトウェアパッケージ、クラス、又は命令、データ構造、プログラム文などの任意の組合せを表しうる。
[00120]多様な実施形態では、本明細書で開示される、１つ又は複数の方法を実施するのに、製品が援用される場合もある。製品は、コンピュータ読取り可能非一時的保存メディア及び保存メディアを含みうる。保存メディアは、装置に、本開示の実施形態に従う、本明細書で開示される方法についての、一部の態様又は全ての態様を実施させるように構成されたプログラム命令を含みうる。
[00121]保存メディアは、フラッシュメモリ、光ディスク、又は磁性ディスクを含むがこれらに限定されない、当技術分野で公知の、広範にわたる恒久的保存メディアを表しうる。プログラム命令は、特に、装置が、命令の実行に応答して、本明細書で記載される多様なハンドリングを実施することを可能としうる。例えば、保存メディアは、装置に、本開示の実施形態に従う、本明細書の方法についての、一部の態様又は全ての態様を実施させるように構成されたプログラム命令を含みうる。
例示的プロセス
[00123]上記で記載されたシステムは、下記で記載される方法を実施するのに使用されうるが、いかなる形であれ、本明細書で開示される方法及びユニットのために使用されうる限定的システムとして解釈されるべきではない。
[00124]図１７を参照しながら述べると、開示される方法２００は、Ｔ細胞のための、活性化ユニットオペレーション２１０、形質導入ユニットオペレーション２２０、接種ユニットオペレーション２３０、拡大ユニットオペレーション２４０、ビーズ分離ユニットオペレーション２５０、及び拡大ユニットオペレーション２６０を独立に包摂する、６つのユニットを含む。本明細書で開示される方法の作業実施形態は、リキッドハンドリングシステム（例えば、高度改変型Ｔｅｃａｎ Ｆｌｕｅｎｔ ７８０システム）において実施した。開示される方法の作業実施形態は、上記で論じられた通り、ＦＣＡ、ＭＣＡ、及びＲＧＡを使用して実施した（図１６を参照されたい）。これらのアームは、それぞれ、液体及び実験機器の移動を可能とする。活性化ユニットオペレーション２１０、形質導入ユニットオペレーション２２０、接種ユニットオペレーション２３０、拡大ユニットオペレーション２４０、ビーズ分離ユニットオペレーション２５０、及び採取ユニットオペレーション２６０は、いくつかの実験設定のために、同時に実施されうることが注目される。例えば、細胞を、哺乳動物細胞用インキュベーターに入れる時間は、他の細胞を、システム１０の残りの構成要素により操作する時間と、ジグザグに、又は交互に配置することができる。
試料
[00126]本明細書で提示される方法及びシステムは、Ｔ細胞に特に関与する、対象から単離された細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞などの哺乳動物細胞と共に使用される。一部の実施形態では、本明細書で開示されるシステム及び方法は、特定の疾患若しくは状態を有する対象、又は細胞療法を必要とする対象、又は細胞療法が投与される対象などの対象から得られるか、又はこれらに由来する生物学的試料などの生物学的試料から単離された細胞又はその組成物を使用する。一部の実施形態では、本明細書で開示されるシステム及び方法は、健常ドナーなどの対象から得られるか、又はこれらに由来する生物学的試料などの生物学的試料から単離された細胞又はその組成物を使用する。一部の態様では、対象は、細胞が単離、加工、及び／又は操作される養子細胞療法など、特定の治療介入を必要とする患者である対象などのヒトである。したがって、一部の実施形態では、細胞は、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。試料は、組織、流体、及び対象から直接採取された他の試料を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られた試料の場合もあり、加工試料の場合もある。生物学的試料は、これらに由来する加工試料を含む、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、及び汗などの体液試料、組織試料、並びに臓器試料を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書で開示されるシステム及び方法は、細胞株などの非初代細胞と共に、例えば、検査手順の一部として、又は方法の検証などとして使用される。
[00127]複数の実施形態では、試料は、血液若しくは血液由来の試料であるか、又はアフェレーシス生成物若しくは白血球アフェレーシス生成物に由来する。例示的試料は、全血液、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、消化管関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、脾臓、他のリンパ系組織、肝臓、肺、胃、小腸、結腸、腎臓、膵臓、乳腺、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃腺、若しくは他の臓器、及び／又はこれらに由来する細胞を含む。試料は、細胞療法、例えば、養子細胞療法の文脈では、自家供給源及び同種供給源に由来する試料を含む。一部の例では、細胞は、アフェレーシス又は白血球アフェレーシスなどにより、対象の循環血液から得られる。一部の態様では、試料は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞を含む白血球、赤血球、及び／又は血小板を含有し、一部の態様では、赤血球及び血小板以外の細胞を含有する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるシステム及び方法における使用のための細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞についてエンリッチされたＴ細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるシステム及び方法における使用のための細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞についてエンリッチされたＴ細胞である。一部の実施形態では、エンリッチされたＣＤ４＋ Ｔ細胞、及びエンリッチされたＣＤ８＋ Ｔ細胞の、２つ個別の組成物を、個別に、本明細書で開示される、多様なシステム及び方法にかける。一部の実施形態では、単一の組成物は、エンリッチされたＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞、例えば、個別にエンリッチされ、個別の組成物から組み合わされた細胞の組成物である。当技術分野では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞についてエンリッチする方法が公知である。
活性化ユニットオペレーション
[00129]活性化ユニットオペレーション２１０は、ワークテーブルの設置で始まり、図１のシステム１０を参照して述べると、制御システム２０は、使用者／オペレーターに、例えば、ＤｉＴｉ、試薬トラフ、細胞培養培地、細胞カウンティング試薬などを伴うワークテーブル６０を設置するように促す。制御システム２０は、使用者に、Ｔ細胞ドナーの数、活性化剤の数、及び試行される条件の数などの実験パラメータをインプットするようにさらに促す。他の解析パラメータも、使用者により設定されうる。使用者は、これらのパラメータを、リアルタイムで、又は、例えば、図１７に示される通り、方法２００のシステム１０の開始の前に、使用者により設定されるスクリプトの一部として入力するように促される場合がある。複数の実施形態では、使用者は、試行される条件の数をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、所望のサンプリング容量をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、方法の終了時にサンプリングを実施するのかどうかをインプットするように促される。使用者が、「実施する」を選択する場合、使用者は、全細胞素材容量、及びＡＡＡ／フローサイトメトリーサンプリング容量を指定するように促される。複数の実施形態では、複数のドナーを選択する場合、使用者は、ＣＤ４ドナー及びＣＤ８ドナーの数のほか、方法に要求されるクライオバイアルの総数を入力するように促される。複数の実施形態では、使用者は、また、ウェルごとに分散される活性化試薬容量も組み入れるように促される。本明細書では、「活性化試薬」に言及することにより、１つ又は複数の薬剤を意味する。
[00130]実験のインプットが、制御システム２０により受け取られたら、制御システムは、選択されたパラメータに必要とされる、ワークテーブル６０の構成、及び実験機器を決定する。一部の実施形態では、このユニットプロセス及び他のユニットプロセスにおいて、例えば、制御システム２０からの指示下で、例えば、容器操作モジュール５０を使用して、実験機器を、自動化リキッドハンドリングシステム３０に、自動的に置く。他の実施形態では、実験機器の一部又は全部は、例えば、制御システム２０により促されて、１名又は複数名の使用者により、ワークテーブル６０に置かれる。ある特定の実施形態では、ドナーインプットの数に従う数の５０ｍＬ円錐チューブ（又は他の関与性のチューブ型／容量）を、ワークテーブル６０に置く。複数の実施形態では、円錐チューブを、遠心分離機のチューブアダプターに置く。複数の実施形態では、使用者は、制御システムにより、ドナーインプットの数に従い、５０ｍＬ円錐チューブを、ワークテーブル６０に置くように促される。複数の実施形態では、チューブ用フィンガー５６を伴う、ＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、５０ｍＬ円錐チューブを、バイアルグリッパーモジュール７０へと移し、これらを開栓する。チューブ栓は、円錐チューブキャップホルダーに置かれ、チューブは、遠心分離の後で遠心分離機チューブアダプターへと戻される。
[00131]ある特定の実施形態では、条件インプットの数に基づき、「ｎ」枚の細胞素材プレートを、ワークテーブル６０に置く。サンプリングプレートは、深型９６ウェルプレート、９６ウェル低付着性プレート（細胞カウンティング）、及び９６ウェル丸底プレート（ＡＡＡ／フローサイトメトリー）を含みうる。ある特定の実施形態では、使用者は、サンプリングインプットの数、及び条件インプットの数に基づき、「ｎ」枚の細胞素材プレートを伴うワークテーブル６０を設置するように促される。複数の実施形態では、離心フィンガー５２を使用するＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、全ての細胞素材及びサンプリングプレートを、ホテル１０５に収める。
[00132]ワークテーブルの設置が完了したら、制御システム２０により、洗浄を開始する。ＣＤ４＋試料及びＣＤ８＋試料の両方について、ドナー１例当たりのクライオバイアルの数を選択することができる。複数の実施形態では、クライオバイアルの数は、制御システム２０により決定することができる。ある特定の実施形態では、使用者は、ＣＤ４＋試料及びＣＤ８＋試料の両方について、ドナー１例当たりのクライオバイアルの数を選択するように促される。ワークテーブルの設置から必要とされる、インプットＣＤ４＋試料及びＣＤ８＋試料の数、クライオバイアルの数、並びにＣＤ４＋試料及びＣＤ８＋試料の両方についての、ドナー１例当たりのクライオバイアルの数を使用して、ＦＣＡなど、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、クライオバイアルにおける内容物を、５０ｍＬ円錐チューブへと移す。複数の実施形態では、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、各５０ｍＬ円錐チューブのために選択された容量に到達するように、細胞培養バランス培地を分注する。複数の実施形態では、チューブ用フィンガー５６を使用する、容器操作モジュール５０は、５０ｍＬ円錐チューブを、バイアルグリッパーモジュール７０へと移し、各チューブを、再度止栓する。複数の実施形態では、チューブ用フィンガー５６を使用する、容器操作モジュール５０は、５０ｍＬ円錐チューブを、遠心分離機チューブアダプターへと移し戻す。複数の実施形態では、容器操作モジュール５０は、チューブ用フィンガー５６を、向心フィンガー５４で置きかえ、遠心分離のために、遠心分離機チューブアダプターを、チューブと共に、ロボット遠心分離機６５へと、垂直方向に移送する。
[00133]遠心分離後、遠心分離機アダプターを、円錐チューブと共に、ワークテーブル６０へと戻す。複数の実施形態では、容器操作モジュール５０は、向心フィンガー５２を、チューブ用フィンガー５６で置きかえ、チューブを、バイアルグリッパーモジュール７０へと移し、これらを開栓する。複数の実施形態では、次いで、ＦＣＡなど、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０が、各円錐チューブについて、細胞ペレットを破壊せずに、上清を除去する。複数の実施形態では、次いで、選択されたＶＣＣ、及び追加されたクライオバイアルの数に基づき、各チューブを再懸濁させる。
[00134]洗浄が完了したら、制御システム２０により、サンプリングが開始される。次いで、各５０ｍＬ円錐チューブを混合し、チューブごとに、全試料容量を吸引し、９６ウェル深型プレートへと分注する。次いで、分注されたサンプリング容量を混合し、低付着性細胞カウンティングプレートへとアリコート分割した。次いで、条件インプットの数に従い、細胞カウンティング試薬を、低付着性細胞カウンティングプレートへと分注する。ある特定の実施形態では、サンプリングプレートについての細胞カウントを、細胞カウンティングモジュール７５により、自動的に読み取る。他の実施形態では、サンプリングプレートは、使用者の手に届きやすいように、ワークテーブル６０の前方へと持ち運ばれ、次いで、手作業による細胞カウンティングのために、使用者により、ワークテーブル６０から取り出される。細胞濃度の測定値は、システムコントローラー２０により、細胞カウンティングモジュール７５から、自動的に得られる場合もあり、使用者により、手作業で入力されて得られる場合もある。現在値ＶＣＣに基づき、標的ＶＣＣに到達するのに要求される細胞容量を計算する。
[00135]サンプリングが完了したら、制御システム２０により、活性化を開始する。活性化試薬を、ワークテーブル６０へと、例えば、自動的に添加する。ある特定の実施形態では、使用者は、活性化試薬を、ワークテーブル６０へと添加するように促される。複数の実施形態では、離心フィンガー５２を使用する、ＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、条件数に従い、「ｎ」枚のウェルプレート（例えば、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、及び／又は４８ウェルプレートなど）を、ワークテーブル６０から、ホテル１０５に置く。ウェルプレートは、丸底プレート、平底プレートなどでありうる。６ウェルプレートには、条件６つごとに１枚のプレートが要求される。複数の実施形態では、次いで、条件インプットの数に従い、活性化試薬を、プレートの各ウェルへと分注する。複数の実施形態では、次いで、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、各チューブを混合することにより進む。次いで、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、使用者のインプットに従う全有核細胞カウント（ＴＮＣ）に到達するように、要求された細胞容量を分注する。可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、これに続き、条件ごとに、所望のＶＣＣに到達するように、細胞培養バランス培地を、プレートの各ウェルへと分注する。
[00136]活性化が完了したら、制御システム２０により、任意選択で、サンプリングが開始される。サンプリングが所望される場合は、各試料ウェルを混合し、試料ごとに、全試料容量を吸引し、９６ウェル深型プレートへと分注する。次いで、分注されたサンプリング容量を混合し、細胞カウンティングプレート及びＡＡＡ／フローサイトメトリープレートへとアリコート分割した。ある特定の実施形態では、サンプリングプレートについての細胞カウントを、細胞カウンティングモジュール７５により、自動的に読み取る。他の実施形態では、次いで、サンプリングプレートは、使用者の手に届きやすいように、ワークテーブル６０の前方へと持ち運ばれ、次いで、手作業による細胞カウンティングのために、使用者により、ワークテーブル６０から取り出される。細胞濃度の測定値は、システムコントローラー２０により、細胞カウンティングモジュール７５から、自動的に得られる場合もあり、使用者により、手作業で入力されて得られる場合もある。複数の実施形態では、プレートを、自動的に再度閉蓋する。複数の実施形態では、プレートを、インキュベーターへと自動的に移す。複数の実施形態では、残りの実験機器を、ワークテーブルから自動的に取り出す。複数の実施形態では、使用者は、プレートを、インキュベーターに置くように促される。複数の実施形態では、使用者は、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから取り出すように促される。
[00137]サンプリングを行わない場合、制御システム２０によりサンプリングは開始されない。複数の実施形態では、プレートを、自動的に再度閉蓋する。複数の実施形態では、プレートを、インキュベーターへと自動的に移す。複数の実施形態では、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから自動的に取り出す。複数の実施形態では、使用者は、プレートを、インキュベーターに置くように促される。複数の実施形態では、使用者は、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから取り出すように促される。
[00138]一部の実施形態では、提供される方法及びシステムは、例えば、活性化ユニットオペレーション２２０時に、１つ又は複数の試薬を添加する活性化条件下で、細胞をインキュベートするステップとの関連で使用される。一部の実施形態では、活性化条件は、細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、又はＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるシグナルを活性化させるか、若しくは刺激する、及び／又は活性化させるか、若しくは刺激することが可能な条件を含む。一部の実施形態では、活性化条件は、細胞におけるシグナルを活性化させるか、若しくは刺激する、及び／又は活性化させるか、若しくは刺激することが可能な活性化試薬、例えば、試薬と共に、及び／又はこの存在下で、細胞を培養する、増殖させる、インキュベートする、活性化させる、繁殖させる、１つ又は複数のステップを含む。
[00139]一部の実施形態では、活性化条件下におけるインキュベーションは、活性化条件、例えば、組換え抗原受容体の導入など、形質導入のために、集団における細胞の増殖、拡大、活性化、及び／若しくは生存を誘導する、抗原への曝露を模倣する、及び／又は細胞をプライミングするようにデザインされた条件の存在下におけるインキュベーションによる培養、増殖、刺激、活性化、繁殖を含む、培養、増殖、刺激、活性化、繁殖を含みうる。特定の実施形態では、活性化条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養物、アミノ酸、抗生剤、イオン、並びに／又はサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、及び細胞を活性化させるようにデザインされた、他の任意の薬剤などの刺激因子のうちの１つ又は複数を含みうる。
[00140]特定の実施形態では、活性化条件は、細胞を、活性化試薬と共にインキュベートすること、培養すること、及び／又は増殖させることを含む。ある特定の実施形態では、活性化試薬は、ビーズを含有するか、又はこれを含む。ある特定の実施形態では、活性化条件下における、細胞のインキュベーション、培養、及び／又は増殖の開始及び／又は誘発は、細胞を、活性化試薬と接触させる、及び／又はこれと共にインキュベートする場合に生じる。特定の実施形態では、細胞へと形質導入する、例えば、形質導入又はトランスフェクションなどにより、組換えポリヌクレオチドを、細胞へと導入する前に、導入するときに、及び／又は導入した後で、細胞を、活性化試薬と共にインキュベートする。
[00141]一部の実施形態では、Ｔ細胞エンリッチ組成物を、細胞に対する比を、約３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．２５：１、１．２：１、１．１：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７５：１、０．６７：１、０．５：１、０．３：１、又は０．２：１、又はおよそこれらの比とする、活性化試薬及び／又はビーズと共にインキュベートする。特定の実施形態では、活性化試薬及び／又はビーズの、細胞に対する比は、２．５：１～０．２：１の間、２：１～０．５：１の間、１．５：１～０．７５：１の間、１．２５：１～０．８：１の間、１．１：１～０．９：１の間である。特定の実施形態では、活性化試薬の、細胞に対する比は、約１：１であるか、又は１：１である。
[00142]特定の実施形態では、活性化試薬は、１つ又は複数のサイトカインを含む。特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。一部の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、Ｔ細胞により発現される受容体、及び／又はＴ細胞に内因性である受容体に結合する、及び／又はこれへの結合が可能である。特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、又はこれらを含む。一部の実施形態では、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーは、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、ＩＬ－１５であるか、又はこれを含む。特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、ＩＬ－７であるか、又はこれを含む。特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、ＩＬ－２であるか、又はこれを含む。
[00143]特定の実施形態では、活性化試薬は、ＩＬ－２、例えば、組換えＩＬ－２を含む。理論に束縛されることを望まずに述べると、特定の実施形態は、一部の対象から得られるＣＤ４＋ Ｔ細胞が、ＩＬ－２を産生しないか、又はアウトプット細胞、例えば、細胞療法における使用に適する操作細胞の組成物を作出するためのプロセスを通して、増殖、分裂、及び拡大を可能とする量で、十分にはＩＬ－２を産生しないことを想定する。一部の実施形態では、エンリッチされたＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物を、組換えＩＬ－２の存在下にある、活性化条件下でインキュベートすることは、インキュベーションステップ時に、かつ、プロセスを通して、組成物のＣＤ４＋ Ｔ細胞が、生存、増殖、拡大、及び／又は活性化する確率又は可能性を増大させる。
[00144]ある特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインの量又は濃度は、国際単位（ＩＵ）で測定及び／又は定量される。国際単位は、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、ワクチン、血液生成物、及び同様な生物学的活性物質を定量するのに使用されうる。一部の実施形態では、ＩＵは、特異的重量及び強度の国際的参照基準との比較による、生物学的調製物の効力についての測定単位（例えば、ＷＨＯ １ｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２、８６／５０４）であるか、又はこれらを含む。国際単位とは、公表されており、国際的な共同調査研究の取組みに由来する、生物学的活性単位を報告するための、認知され、標準化された唯一の方法である。特定の実施形態では、組成物、試料、又はサイトカインの供給源のためのＩＵは、生成物の、類似のＷＨＯ標準生成物との比較試験を介して得られうる。例えば、一部の実施形態では、組成物、試料、又はヒト組換えＩＬ－２、ヒト組換えＩＬ－７、若しくはヒト組換えＩＬ－１５の供給源１ｍＬ当たりのＩＵを、それぞれ、ＷＨＯ標準ＩＬ－２生成物（ＮＩＢＳＣコード：８６／５００）、ＷＨＯ標準ＩＬ－１７生成物（ＮＩＢＳＣコード：９０／５３０）ａｎｄＷＨＯ標準ＩＬ－１５生成物（ＮＩＢＳＣコード：９５／５５４）と比較する。
[00145]一部の実施形態では、ＩＵ／ｍＬ単位の生物学的活性は、（ｎｇ／ｍｌ単位のＥＤ５０である）１×１０６と同等である。特定の実施形態では、組換えヒトＩＬ－２又は組換えヒトＩＬ－１５のＥＤ５０（投与された集団のうちの５０％において量的効果をもたらす、中央値有効用量）は、ＣＴＬＬ－２細胞（Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する細胞傷害性Ｔ細胞）による細胞増殖に対する最大半量の刺激に要求される濃度（ＸＴＴ又は切断型テトラゾリウム水酸化物）と同等である。ある特定の実施形態では、組換えヒトＩＬ－７のＥＤ５０は、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニンＰ）活性化ヒト末梢血リンパ球の増殖に対する最大半量の刺激に要求される濃度と同等である。ＩＬ－２のためのＩＵについてのアッセイ及び計算に関する詳細は、Ｗａｄｈｗａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１３）、３７９（１～２）：１～７；並びにＧｅａｒｉｎｇ及びＴｈｏｒｐｅ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８８）、１１４（１～２）：３～９において論じられており；ＩＬ－１５のためのＩＵについてのアッセイ及び計算に関する詳細は、Ｓｏｍａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００９）、３４８（１～２）：８３～９４；参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれるにおいて論じられている。
[00146]一部の実施形態では、細胞を、１ＩＵ／ｍｌ～１，０００ＩＵ／ｍｌの間、１０ＩＵ／ｍｌ～５０ＩＵ／ｍｌの間、５０ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌの間、１００ＩＵ／ｍｌ～２００ＩＵ／ｍｌの間、１００ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌの間、２５０ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌの間、又は５００ＩＵ／ｍｌ～１，０００ＩＵ／ｍｌの間の濃度のサイトカイン、例えば、組換えヒトサイトカインと共にインキュベートする。
[00147]一部の実施形態では、細胞を、１ＩＵ／ｍｌ～２００ＩＵ／ｍｌの間、１０ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌの間、５０ＩＵ／ｍｌ～１５０ＩＵ／ｍｌの間、８０ＩＵ／ｍｌ～１２０ＩＵ／ｍｌの間、６０ＩＵ／ｍｌ～９０ＩＵ／ｍｌの間、又は７０ＩＵ／ｍｌ～９０ＩＵ／ｍｌの間の濃度のＩＬ－２（例えば、ヒト組換えＩＬ－２）と共にインキュベートする。特定の実施形態では、エンリッチされたＴ細胞組成物を、５０ＩＵ／ｍｌ、５５ＩＵ／ｍｌ、６０ＩＵ／ｍｌ、６５ＩＵ／ｍｌ、７０ＩＵ／ｍｌ、７５ＩＵ／ｍｌ、８０ＩＵ／ｍｌ、８５ＩＵ／ｍｌ、９０ＩＵ／ｍｌ、９５ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１１０ＩＵ／ｍｌ、１２０ＩＵ／ｍｌ、１３０ＩＵ／ｍｌ、１４０ＩＵ／ｍｌ、若しくは１５０ＩＵ／ｍｌの濃度の組換えＩＬ－２、又はおよそこれらの濃度の組換えＩＬ－２と共にインキュベートする。
[00148]一部の実施形態では、細胞を、１００ＩＵ／ｍｌ～２，０００ＩＵ／ｍｌの間、５００ＩＵ／ｍｌ～１，０００ＩＵ／ｍｌの間、１００ＩＵ／ｍｌ～５００ＩＵ／ｍｌの間、５００ＩＵ／ｍｌ～７５０ＩＵ／ｍｌの間、７５０ＩＵ／ｍｌ～１，０００ＩＵ／ｍｌの間、又は５５０ＩＵ／ｍｌ～６５０ＩＵ／ｍｌの間の濃度の組換えＩＬ－７（例えば、ヒト組換えＩＬ－７）と共にインキュベートする。特定の実施形態では、細胞を、５０ＩＵ／ｍｌ、１００ＩＵ／ｍｌ、１５０ＩＵ／ｍｌ、２００ＩＵ／ｍｌ、２５０ＩＵ／ｍｌ、３００ＩＵ／ｍｌ、３５０ＩＵ／ｍｌ、４００ＩＵ／ｍｌ、４５０ＩＵ／ｍｌ、５００ＩＵ／ｍｌ、５５０ＩＵ／ｍｌ、６００ＩＵ／ｍｌ、６５０ＩＵ／ｍｌ、７００ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、８００ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、７５０ＩＵ／ｍｌ、又は１，０００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ－７、又はおよそこれらの濃度のＩＬ－７と共にインキュベートする。
[00149]一部の実施形態では、細胞を、０．１ＩＵ／ｍｌ～１００ＩＵ／ｍｌの間、１ＩＵ／ｍｌ～５０ＩＵ／ｍｌの間、５ＩＵ／ｍｌ～２５ＩＵ／ｍｌの間、２５ＩＵ／ｍｌ～５０ＩＵ／ｍｌの間、５ＩＵ／ｍｌ～１５ＩＵ／ｍｌの間、又は１０ＩＵ／ｍｌ～００ＩＵ／ｍｌの間の濃度の組換えＩＬ－１５（例えば、ヒト組換えＩＬ－１５）と共にインキュベートする。特定の実施形態では、細胞を、約１ＩＵ／ｍｌ、２ＩＵ／ｍｌ、３ＩＵ／ｍｌ、４ＩＵ／ｍｌ、５ＩＵ／ｍｌ、６ＩＵ／ｍｌ、７ＩＵ／ｍｌ、８ＩＵ／ｍｌ、９ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、１１ＩＵ／ｍｌ、１２ＩＵ／ｍｌ、１３ＩＵ／ｍｌ、１４ＩＵ／ｍｌ、１５ＩＵ／ｍｌ、２０ＩＵ／ｍｌ、２５ＩＵ／ｍｌ、３０ＩＵ／ｍｌ、４０ＩＵ／ｍｌ、若しくは５０ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ－１５、又はおよそこれらの濃度のＩＬ－１５と共にインキュベートする。
[00150]一部の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及び／又はＩＬ－１５は、組換えＩＬ－２、組換えＩＬ－７、及び／又は組換えＩＬ－１５である。ある特定の実施形態では、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及び／又はＩＬ－１５は、ヒトＩＬ－２、ヒトＩＬ－７、及び／又はヒトＩＬ－１５である。特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、ヒト組換えＩＬ－２、ヒト組換えＩＬ－７、及び／又はヒト組換えＩＬ－１５であるか、又はこれを含む。
[00151]特定の実施形態では、細胞を、１つ又は複数の抗酸化剤の存在下で、活性化試薬と共にインキュベートする。一部の実施形態では、抗酸化剤は、トコフェロール、トコトリエノール、アルファ－トコフェロール、ベータ－トコフェロール、ガンマ－トコフェロール、デルタ－トコフェロール、アルファ－トコトリエノール、ベータ－トコトリエノール、アルファ－トコフェロールキノン、Ｔｒｏｌｏｘ（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、フラボノイド、イソフラボン、リコペン、ベータ－カロテン、セレニウム、ユビキノン、ロイチン、Ｓ－アデノシルメチオニン、グルタチオン、タウリン、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、クエン酸、Ｌ－カルニチン、ＢＨＴ、モノチオグリセロール、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、メチオニン、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスタミン及びシススタチオニン、及び／又はグリシン－グリシン－ヒスチジンを含むがこれらに限定されない。
[00152]一部の実施形態では、１つ又は複数の抗酸化剤は、硫黄を含有する抗酸化剤であるか、又はこれらを含む。ある特定の実施形態では、硫黄を含有する抗酸化剤は、チオール含有抗酸化剤、及び／又は１つ又は複数の硫黄部分（例えば、環構造内の）を呈する抗酸化剤を含みうる。一部の実施形態では、硫黄を含有する抗酸化剤は、例えば、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）及び２，３－ジメルカプトプロパノール（ＤＭＰ）、Ｌ－２－オキソ－４－チアゾリジンカルボキシレート（ＯＴＣ）及びリポ酸を含みうる。特定の実施形態では、硫黄を含有する抗酸化剤は、グルタチオン前駆体である。一部の実施形態では、グルタチオン前駆体は、グルタチオンを誘導するように、細胞内の１つ又は複数のステップで修飾されうる分子である。特定の実施形態では、グルタチオン前駆体は、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、Ｌ－２－オキソチアゾリジン－４－カルボン酸（プロシステイン）、リポ酸、Ｓ－アリルシステイン、又はメチルメチオニンスルホニウムクロリドを含みうるがこれらに限定されない。
[00153]一部の実施形態では、活性化条件下で細胞をインキュベートすることは、１つ又は複数の抗酸化剤の存在下で、細胞をインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、細胞を、１つ又は複数の抗酸化剤の存在下で、活性化試薬により刺激する。一部の実施形態では、細胞を、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの間、１０ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌの間、１００ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの間、１μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの間、１０μｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌの間、１００μｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの間、１，５００μｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌの間、５００μｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌの間、１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌの間、又は１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの間の、１つ又は複数の抗酸化剤の存在下でインキュベートする。一部の実施形態では、細胞を、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌの、１つ又は複数の抗酸化剤、又はおよそこれらの濃度の、１つ又は複数の抗酸化剤の存在下でインキュベートする。一部の実施形態では、１つ又は複数の抗酸化剤は、硫黄を含有する抗酸化剤であるか、又はこれらを含む。特定の実施形態では、１つ又は複数の抗酸化剤は、グルタチオン前駆体であるか、又はこれらを含む。
[00154]一部の実施形態では、１つ又は複数の抗酸化剤は、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）であるか、又はこれらを含む。一部の実施形態では、活性化条件下で細胞をインキュベートすることは、ＮＡＣの存在下で、細胞をインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、細胞を、ＮＡＣの存在下で、活性化試薬により刺激する。一部の実施形態では、細胞を、１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの間、１０ｎｇ／ｍｌ～１μｇ／ｍｌの間、１００ｎｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌの間、１μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの間、１０μｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌの間、１００μｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの間、１，５００μｇ／ｍｌ～２ｍｇ／ｍｌの間、５００μｇ／ｍｌ～５ｍｇ／ｍｌの間、１ｍｇ／ｍｌ～１０ｍｇ／ｍｌの間、又は１ｍｇ／ｍｌ～１００ｍｇ／ｍｌの間のＮＡＣの存在下でインキュベートする。一部の実施形態では、細胞を、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、２００ｍｇ／ｍｌ、３００ｍｇ／ｍｌ、４００ｍｇ／ｍｌ、５００ｍｇ／ｍｌのＮＡＣ、又はおよそこれらの濃度のＮＡＣの存在下でインキュベートする。
[00155]一部の実施形態では、刺激及び／又は活性化のための条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養物、アミノ酸、抗生剤、イオン、並びに／又はサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、及び細胞を活性化させるようにデザインされた、他の任意の薬剤などの刺激因子のうちの１つ又は複数を含みうる。
[00156]一部の実施形態では、インキュベーション（例えば、活性化剤を伴う）の全持続時間は、少なくとも６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、又は７２時間など、約１時間～９６時間の間、１時間～７２時間の間、１時間～４８時間の間、４時間～３６時間の間、８時間～３０時間の間、又は１２時間～２４時間の間である。一部の実施形態では、さらなるインキュベーションは、端点を含む、約１時間～４８時間の間、４時間～３６時間の間、８時間～３０時間の間、又は１２時間～２４時間の間の時間にわたるインキュベーションである。
[00157]一部の実施形態では、細胞は、例えば、形質導入及び／又はトランスフェクションにより、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを、細胞へと導入するためのステップの前及び／又はこのときに、活性化条件下で培養される、増殖される、及び／又はインキュベートされる。ある特定の実施形態では、細胞は、形質導入ユニットオペレーションの前に、３０分間～２時間の間、１時間～８時間の間、１時間～６時間の間、６時間～１２時間の間、１２時間～１８時間の間、１６時間～２４時間の間、１２時間～３６時間の間、２４時間～４８時間の間、２４時間～７２時間の間、４２時間～５４時間の間、６０時間～１２０時間の間、９６時間～１２０時間の間、９０時間～１１０時間の間、１日間～７日間の間、３日間～８日間の間、１日間～３日間の間、４日間～６日間の間、又は４日間～５日間の間の量の時間にわたり、活性化条件下で培養される、増殖される、及び／又はインキュベートされる。
[00158]ある特定の実施形態では、細胞を、形質導入ユニットオペレーションの前及び／又はこのときに、活性化試薬と共に、及び／又はこの存在下でインキュベートする。ある特定の実施形態では、細胞を、１２時間～３６時間の間、２４時間～４８時間の間、２４時間～７２時間の間、４２時間～５４時間の間、６０時間～１２０時間の間、９６時間～１２０時間の間、９０時間～１１０時間の間、２日間～７日間の間、３日間～８日間の間、１日間～８日間の間、４日間～６日間の間、又は４日間～５日間の間の量の時間にわたり、活性化試薬と共に、及び／又はこの存在下でインキュベートする。特定の実施形態では、細胞は、形質導入ユニットオペレーションの前、及び／又はこのときに１０日間、９日間、８日間、７日間、６日間、若しくは５日間未満の量の時間、４日間、又は１６８時間、１６２時間、１５６時間、１４４時間、１３８時間、１３２時間、１２０時間、１１４時間、１０８時間、１０２時間、若しくは９６時間未満の量の時間にわたり、活性化条件下で培養される、増殖される、及び／又はインキュベートされる。特定の実施形態では、細胞を、４日間、５日間、６日間、若しくは７日間、又はおよそこの時間にわたり、活性化試薬と共に、及び／又はこの存在下でインキュベートする。
[00159]一部の実施形態では、活性化条件下で細胞をインキュベートすることは、細胞を、活性化試薬と共にインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、活性化試薬は、常磁性ビーズなどのビーズを含有するか、又はこれを含み、細胞を、活性化試薬と共に、１：１の比など、３：１（ビーズ：細胞）未満の比でインキュベートする。特定の実施形態では、細胞を、１つ若しくは複数のサイトカイン、及び／又は１つ若しくは複数の抗酸化剤の存在下で、刺激／活性化試薬と共にインキュベートする。一部の実施形態では、エンリッチされたＣＤ４＋ Ｔ細胞の組成物を、組換えのＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＮＡＣの存在下で、活性化試薬と共に、１：１（ビーズ：細胞）の比でインキュベートする。ある特定の実施形態では、エンリッチされたＣＤ８＋ Ｔ細胞の組成物を、組換えのＩＬ－２、ＩＬ－１５、及びＮＡＣの存在下で、刺激試薬と共に、１：１（ビーズ：細胞）の比でインキュベートする。一部の実施形態では、活性化試薬は、インキュベーションの開始又は誘発から（例えば、活性化試薬を、細胞へと添加するか、又は細胞と接触させた時点から）、６日、５日、若しくは４日後であるか、これらの日数以内であるか、又は約これらの日数以内に、細胞から除去及び／又は分離される。
[00160]一部の実施形態では、エンリッチされた細胞の組成物を、活性化条件下でインキュベートすることは、エンリッチされた細胞の組成物を、Ｔ細胞を活性化させること、及び／又はこれを拡大することが可能な活性化試薬と共にインキュベートすること、及び／又はこれと接触させることであるか、又はこれらを含む。一部の実施形態では、活性化試薬は、細胞における、１つ又は複数のシグナルの活性化、及び／又は細胞において、１つ又は複数のシグナルを活性化させることが可能である。一部の実施形態では、１つ又は複数のシグナルは、受容体により媒介される。特定の実施形態では、１つ又は複数のシグナルは、シグナル伝達、並びに／又は二次メッセンジャー、例えば、ｃＡＭＰ及び／若しくは細胞内カルシウムのレベル若しくは量の変化、１つ若しくは複数の細胞内タンパク質の量、細胞内局在、コンフォメーション、リン酸化、ユビキチン化、及び／若しくは切断の変化、並びに／又は細胞の活性、例えば、転写、翻訳、タンパク質分解、細胞の形状、活性化状態、及び／若しくは細胞分裂の変化であるか、又はこれと関連する。特定の実施形態では、活性化試薬は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の、１つ若しくは複数の構成要素の、１つ若しくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、並びに／又は１つ若しくは複数の共刺激分子の、１つ若しくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化させる、及び／又はこれらを活性化させることが可能である。
[00161]ある特定の実施形態では、活性化試薬は、細胞、例えば、Ｔ細胞を活性化させる、及び／又はこれを拡大することが可能な、１つ又は複数の薬剤、例えば、生体分子にコンジュゲートしているか、又は連結された粒子、例えば、ビーズを含有する。一部の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、ビーズに結合している。一部の実施形態では、ビーズは、生体適合性である、すなわち、生物学的使用に適する素材から構成される。一部の実施形態では、ビーズは、培養された細胞、例えば、培養されたＴ細胞に対して非毒性である。一部の実施形態では、ビーズは、この薬剤と細胞との相互作用を可能とする形で、薬剤に接合することが可能な、任意の粒子でありうる。
[00162]一部の実施形態では、活性化試薬は、細胞（例えば、Ｔ細胞）を活性化させること、及び／又はこれを拡大することが可能な、１つ又は複数の薬剤であって、ビーズ、例えば、ビーズの表面に結合しているか、又はこれらに、他の形で接合している薬剤を含有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、細胞以外の粒子である。特定の実施形態では、ビーズは、コロイド状粒子、マイクロスフェア、ナノ粒子、磁性ビーズなどを含みうる。一部の実施形態では、ビーズは、アガロースビーズである。ある特定の実施形態では、ビーズは、セファロースビーズである。
[00163]特定の実施形態では、活性化試薬は、単分散性のビーズを含有する。ある特定の実施形態では、単分散性のビーズは、直径の標準偏差を、互いに対して５％未満とするサイズ分散性を含む。
[00164]一部の実施形態では、ビーズは、ビーズの表面にカップリングしているか、コンジュゲートしているか、又は連結された（直接的に、又は間接的に）薬剤など、１つ又は複数の薬剤（複数可）を含有する。一部の実施形態では、本明細書で想定される薬剤は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質（例えば、酵素）、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、炭水化物、脂質、レクチン、又は所望の標的に対するアフィニティーを伴う、他の任意の生体分子を含みうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、所望の標的は、Ｔ細胞受容体、及び／又はＴ細胞受容体の構成要素である。ある特定の実施形態では、所望の標的は、ＣＤ３である。ある特定の実施形態では、所望の標的は、Ｔ細胞共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１－ＢＢ）、ＯＸ４０、又はＩＣＯＳである。１つ又は複数の薬剤は、当技術分野で公知であり、利用可能な、様々な方法により、ビーズに、直接的に、又は間接的に接合しうる。接合は、共有結合的接合、非共有結合的接合、静電接合、又は疎水性接合であることが可能であり、例えば、化学的手段、機械的手段、又は酵素的手段を含む、様々な接合手段により達せられうる。一部の実施形態では、生体分子（例えば、ビオチン化抗ＣＤ３抗体）は、ビーズに直接接合している、別の生体分子（例えば、抗ビオチン抗体）を介して、ビーズに、間接的に接合しうる。
[00165]一部の実施形態では、活性化試薬は、ビーズと、細胞の表面における高分子と直接相互作用する、１つ又は複数の薬剤とを含有する。ある特定の実施形態では、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）は、細胞における１つ又は複数の高分子（例えば、１つ又は複数の細胞表面タンパク質）に特異的な、１つ又は複数の薬剤（例えば、抗体）を介して、細胞と相互作用する。ある特定の実施形態では、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）を、一次抗体（例えば、抗ビオチン抗体）、又は他の生体分子など、本明細書で記載される、第１の薬剤で標識し、次いで、二次抗体（例えば、ビオチン化抗ＣＤ３抗体）、又は他の第２の生体分子（例えば、ストレプトアビジン）など、第２の薬剤を追加し、この場合、二次抗体、又は他の第２の生体分子は、二次抗体（例えば、ビオチン化抗ＣＤ３抗体）、又は他の第２の生体分子（例えば、ストレプトアビジン）など、第２の薬剤に特異的に結合する。
[00166]一部の実施形態では、活性化試薬は、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）に接合し、細胞（例えば、Ｔ細胞）における、以下の高分子：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ１２７、ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＯＸ４０、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４－１ＢＢＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ；ＩＦＮ－ガンマＲ、ＴＮＦ－アルファＲ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－１０Ｒ、ＣＤ１８／ＣＤｌｌａ（ＬＦＡ－１）、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）、ＣＤ２９／ＣＤ４９ｄ（ＶＬＡ－４）、Ｎｏｔｃｈリガンド（例えば、デルタ様１／４、Ｊａｇｇｅｄ１／２など）、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、及びＣＸＣＲ３、又はこれらの高分子若しくはこれらの断片に対応するリガンドを含む、これらの断片のうちの１つ又は複数に特異的に結合する、１つ又は複数の薬剤（例えば、抗体）を含有する。一部の実施形態では、ビーズに接合している薬剤（例えば、抗体）は、細胞（例えば、Ｔ細胞）における、以下の高分子：ＣＤ２８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ１２７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、及び／又はＣＤ４５ＲＯのうちの１つ又は複数に特異的に結合する。
[00167]一部の実施形態では、ビーズに接合している薬剤のうちの１つ又は複数は、抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を伴う抗体組成物、多特異性抗体（例えば、二特異的抗体）、ダイアボディー、及び単鎖分子のほか、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を含みうる。一部の実施形態では、活性化試薬は、抗体断片（抗原結合性断片を含む）、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ断片、又は（Ｆａｂ’）２断片である。本明細書で想定される抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥの定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域が使用される場合があり、このような定常領域は、任意のヒト又は動物種（例えば、マウスの種）から得られうることが察知されるであろう。一部の実施形態では、薬剤は、１つ又は複数のＴ細胞受容体の構成要素に結合する、及び／又はこれらを認識する抗体である。特定の実施形態では、薬剤は、抗ＣＤ３抗体である。ある特定の実施形態では、薬剤は、共受容体に結合する、及び／又はこれらを認識する抗体である。一部の実施形態では、活性化試薬は、抗ＣＤ２
８抗体を含む。
[00168]一部の実施形態では、ビーズは、約０．００１μｍを超えるか、約０．０１μｍを超えるか、約０．１μｍを超えるか、約１．０μｍを超えるか、約１０μｍを超えるか、約５０μｍを超えるか、約１００μｍを超えるか、又は約１０００μｍを超え、約１５００μｍを超えない直径を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約１．０μｍ～約５００μｍ、約１．０μｍ～約１５０μｍ、約１．０μｍ～約３０μｍ、約１．０μｍ～約１０μｍ、約１．０μｍ～約５．０μｍ、約２．０μｍ～約５．０μｍ、又は約３．０μｍ～約５．０μｍの直径を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約３μｍ～約５μｍの直径を有する。一部の実施形態では、ビーズは、少なくとも約０．００１μｍ、０．０１μｍ、０．１μｍ、０．５μｍ、１．０μｍ、１．５μｍ、２．０μｍ、２．５μｍ、３．０μｍ、３．５μｍ、４．０μｍ、４．５μｍ、５．０μｍ、５．５μｍ、６．０μｍ、６．５μｍ、７．０μｍ、７．５μｍ、８．０μｍ、８．５μｍ、９．０μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１２μｍ、１４μｍ、１６μｍ、１８μｍ、又は２０μｍの直径を有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、４．５μｍ、又はおよそこの直径を有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、２．８μｍ、又はおよそこの直径を有する。
[00169]一部の実施形態では、ビーズは、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、１．２ｇ／ｃｍ３を超えるか、又は１．２ｇ／ｃｍ３を超える密度を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約０．００１ｇ／ｃｍ３～約１００ｇ／ｃｍ３、約０．０１ｇ／ｃｍ３～約５０ｇ／ｃｍ３、約０．１ｇ／ｃｍ３～約１０ｇ／ｃｍ３、約０．１ｇ／ｃｍ３～約.５ｇ／ｃｍ３、約０．５ｇ／ｃｍ３～約１ｇ／ｃｍ３、約０．５ｇ／ｃｍ３～約１．５ｇ／ｃｍ３、約１ｇ／ｃｍ３～約１．５ｇ／ｃｍ３、約１ｇ／ｃｍ３～約２ｇ／ｃｍ３、又は約１ｇ／ｃｍ３～約５ｇ／ｃｍ３の間の密度を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約０．５ｇ／ｃｍ３、約０．５ｇ／ｃｍ３、約０．６ｇ／ｃｍ３、約０．７ｇ／ｃｍ３、約０．８ｇ／ｃｍ３、約０．９ｇ／ｃｍ３、約１．０ｇ／ｃｍ３、約１．１ｇ／ｃｍ３、約１．２ｇ／ｃｍ３、約１．３ｇ／ｃｍ３、約１．４ｇ／ｃｍ３、約１．５ｇ／ｃｍ３、約１．６ｇ／ｃｍ３、約１．７ｇ／ｃｍ３、約１．８ｇ／ｃｍ３、約１．９ｇ／ｃｍ３、又は約２．０ｇ／ｃｍ３の密度を有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、約１．６ｇ／ｃｍ３の密度を有する。特定の実施形態では、ビーズ又は粒子は、約１．５ｇ／ｃｍ３の密度を有する。ある特定の実施形態では、粒子は、約１．３ｇ／ｃｍ３の密度を有する。ある特定の実施形態では、複数のビーズは、均一の密度を有する。ある特定の実施形態では、均一の密度は、平均値ビーズ密度の、１０％未満、５％未満、又は１％未満の密度標準偏差を含む。一部の実施形態では、ビーズは、粒子１グラム当たり約０．００１ｍ２（ｍ２／ｇ）～約１，０００ｍ２／ｇ、約０．０１０ｍ２／ｇ～約１００ｍ２／ｇ、約０．１ｍ２／ｇ～約１０ｍ２／ｇ、約０．１ｍ２／ｇ～約１ｍ２／ｇ、約１ｍ２／ｇ～約１０ｍ２／ｇ、約１０ｍ２／ｇ～約１００ｍ２／ｇ、約０．５ｍ２／ｇ～約２０ｍ２／ｇ、約０．５ｍ２／ｇ～約５ｍ２／ｇ、又は約１ｍ２／ｇ～約４ｍ２／ｇの間の表面積を有する。一部の実施形態では、粒子又はビーズは、約１ｍ２／ｇ～約４ｍ２／ｇの表面積を有する。
[00170]一部の実施形態では、ビーズは、薬剤とカップリングさせる場合もあり、薬剤へと連結される場合もあり、コンジュゲートさせる場合もあるビーズ表面において、又はこの近傍において、少なくとも１つの素材を含有する。一部の実施形態では、ビーズは、表面官能化される、すなわち、結合性分子、例えば、ポリヌクレオチド又はポリペプチドと共有結合を形成することが可能な官能基を含む。特定の実施形態では、ビーズは、表面に露出した、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、トシル基、エポキシ基、及び／又はクロロメチル基を含む。特定の実施形態では、ビーズは、表面に露出した、アガロース及び／又はセファロースを含む。ある特定の実施形態では、ビーズ表面は、結合性分子に結合又は接合しうる活性化試薬が接合している。特定の実施形態では、生体分子は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、ビーズは、表面に露出した、プロテインＡ、プロテインＧ、又はビオチンを含む。
[00171]一部の実施形態では、ビーズは、磁界において、又は磁界に対して、反応するか、又は応答性である。一部の実施形態では、ビーズは、磁性ビーズである。一部の実施形態では、磁性ビーズは、常磁性ビーズである。特定の実施形態では、磁性ビーズは、超常磁性ビーズである。ある特定の実施形態では、ビーズは、磁界へと曝露されない限り、磁性を提示しない。
[00172]特定の実施形態では、ビーズは、磁性コア、常磁性コア、又は超常磁性コアを含む。一部の実施形態では、磁性コアは、金属を含有する。一部の実施形態では、金属は、鉄、ニッケル、銅、コバルト、ガドリニウム、マンガン、タンタル、亜鉛、ジルコニウム、又はこれらの任意の組合せでありうるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、磁性コアは、金属酸化物（例えば、酸化鉄）、フェライト（例えば、マンガンフェライト、コバルトフェライト、ニッケルフェライトなど）、ヘマタイト、及び金属合金（例えば、ＣｏＴａＺｎ）を含む。一部の実施形態では、磁性コアは、フェライト、金属、金属合金、酸化鉄、又は二酸化クロムのうちの１つ又は複数を含む。一部の実施形態では、磁性コアは、鉄元素又はその化合物を含む。一部の実施形態では、磁性コアは、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、磁赤鉄鉱（γＦｅ２Ｏ３）、又はグレイジェイト（Ｆｅ３Ｓ４）のうちの１つ又は複数を含む。一部の実施形態では、内部コアは、酸化鉄（例えば、Ｆｅ３Ｏ４）を含む。
[00173]ある特定の実施形態では、ビーズは、表面官能化コート又は表面官能化コーティングにより覆われた、磁性コア、常磁性コア、及び／又は超常磁性コアを含有する。一部の実施形態では、コートは、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、タンパク質、炭素、アガロース、セファロース、又はこれらの組合せを含みうるがこれらに限定されない材料を含有しうる。一部の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレン、又はポリビニルアルコールでありうる。ある特定の実施形態では、外層のコート又はコーティングは、ポリスチレンを含む。特定の実施形態では、外層コーティングは、表面官能化されている。
[00174]一部の実施形態では、活性化試薬は、金属酸化物コア（例えば、酸化鉄コア）と、コートとを含有するビーズを含み、この場合、金属酸化物コアは、少なくとも１つの多糖（例えば、デキストラン）を含み、コートは、少なくとも１つの多糖（例えば、アミノデキストラン）、少なくとも１つのポリマー（例えば、ポリウレタン）、及びシリカを含む。一部の実施形態では、金属酸化物コアは、コロイド状酸化鉄コアである。ある特定の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、抗体、又はこれらの抗原結合性断片を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む。一部の実施形態では、活性化試薬は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、及び抗ビオチン抗体を含む。一部の実施形態では、活性化試薬は、抗ビオチン抗体を含む。一部の実施形態では、ビーズは、約３μｍ～約１０μｍの直径を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約３μｍ～約５μｍの直径を有する。ある特定の実施形態では、ビーズは、約３．５μｍの直径を有する。
[00175]一部の実施形態では、活性化試薬は、金属酸化物コア（例えば、酸化鉄内部コア）と、コート（例えば、保護コート）とを含むビーズに接合している１つ又は複数の薬剤を含み、この場合、コートは、ポリスチレンを含む。ある特定の実施形態では、ビーズは、常磁性（例えば、超常磁性）鉄のコア、例えば、磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）及び／又は磁赤鉄鉱（γＦｅ２Ｏ３）を含むコアと、ポリスチレンによるコート又はコーティングとを含む、単分散性の常磁性（例えば、超常磁性）ビーズである。一部の実施形態では、ビーズは、非多孔性である。一部の実施形態では、ビーズは、１つ又は複数の薬剤が接合している官能化表面を含有する。ある特定の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、表面において、ビーズに共有結合的に結合している。一部の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、抗体、又はその抗原結合性断片を含む。一部の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含む。一部の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、抗ＣＤ３抗体及び／又は抗ＣＤ２８抗体、並びに標識化抗ＣＤ３抗体又は標識化抗ＣＤ２８抗体などの標識化抗体（例えば、ビオチン化抗体）への結合が可能な抗体、又はこれらの抗原結合性断片を含む。ある特定の実施形態では、ビーズは、約１．５ｇ／ｃｍ３の密度、及び約１ｍ２／ｇ～約４ｍ２／ｇの表面積を有する。特定の実施形態では、ビーズは、約４．５μｍの直径、及び約１．５ｇ／ｃｍ３の密度を有する、単分散性の超常磁性ビーズである。一部の実施形態では、ビーズは、約２．８μｍの平均値直径、及び約１．３ｇ／ｃｍ３の平均値密度を有する、単分散性の超常磁性ビーズである。
[00176]一部の実施形態では、細胞を、細胞に対する比を、３：１、２．５：１、２：１、１．５：１、１．２５：１、１．２：１、１．１：１、１：１、０．９：１、０．８：１、０．７５：１、０．６７：１、０．５：１、０．３：１、若しくは０．２：１、又はおよそこれらの比とする、活性化試薬であるビーズと共にインキュベートする。特定の実施形態では、ビーズの、細胞に対する比は、２．５：１～０．２：１の間、２：１～０．５：１の間、１．５：１～０．７５：１の間、１．２５：１～０．８：１の間、１．１：１～０．９：１の間である。特定の実施形態では、活性化試薬の、細胞に対する比は、約１：１であるか、又は１：１である。
[00177]特定の実施形態では、刺激試薬は、ＴＣＲ複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化させることが可能な、１つ又は複数の薬剤（複数可）（例えば、リガンド）にコンジュゲートしているか、連結しているか、又は接合しているオリゴマー試薬（例えば、ストレプトアビジンムテイン試薬）を含有する。一部の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、特定の結合性部位（例えば、結合性部位Ｚ）における、オリゴマー試薬への結合が可能な、結合性ドメイン又は結合パートナー（例えば、結合パートナーＣ）に接合している。一部の実施形態では、複数の薬剤は、オリゴマー試薬に不可逆的に結合している。多様な実施形態では、オリゴマー試薬は、ある特定の実施形態では、結合性ドメイン（例えば、結合パートナーＣ）において、複数の薬剤に不可逆的に結合している、複数の、特定の結合性部位を有する。一部の実施形態では、結合した薬剤の量は、競合試薬、例えば、これもまた、特定の結合性部位（例えば、結合性部位Ｚ）への結合が可能な試薬の存在下で、低減されるか、又は減少している。
[00178]一部の実施形態では、刺激試薬は、少なくとも１つの薬剤（例えば、Ｔ細胞などの細胞にシグナルをもたらすことが可能な薬剤）が、オリゴマー試薬と会合する（例えば、不可逆的に会合する）可逆系であるか、又はこれらを含む。一部の実施形態では、試薬は、薬剤への結合（例えば、不可逆的結合）が可能な、複数の結合性部位を含有する。場合によって、試薬は、Ｔ細胞などの細胞にシグナルをもたらすことが可能な、少なくとも１つの接合剤を有する、オリゴマー粒子試薬である。一部の実施形態では、薬剤は、分子のエピトープ又は領域に特異的に結合しうる、少なくとも１つの結合性部位（例えば、結合性部位Ｂ）を含有し、また、試薬の、少なくとも１つの結合性部位（例えば、試薬の結合性部位Ｚ）に特異的に結合する、本明細書ではまた、結合パートナーＣとも称される結合パートナーも含有する。一部の実施形態では、結合パートナーＣと、少なくとも１つの結合性部位Ｚとの結合性相互作用は、非共有結合的相互作用である。場合によって、結合パートナーＣと、少なくとも１つの結合性部位Ｚとの結合性相互作用は、共有結合的相互作用である。一部の実施形態では、結合パートナーＣと、少なくとも１つの結()Ｚとの非共有結合的相互作用などの結合性相互作用は、可逆的である。
[00179]このような可逆系において、オリゴマー試薬として使用されうる物質は、公知である（例えば、米国特許第５，１６８，０４９号；同第５，５０６，１２１号；同第６，１０３，４９３号；同第７，７７６，５６２号；同第７，９８１，６３２号；同第８，２９８，７８２号；同第８，７３５，５４０号；同第９，０２３，６０４号；及びＰＣＴ出願国際公開第２０１３／１２４４７４号及び国際公開第２０１４／０７６２７７号を参照されたい）。可逆的相互作用を形成することが可能な試薬及び結合パートナーのほか、このようなに結合を反転させることが可能な物質（例えば、競合試薬）の非限定例については、下記で記載される。
[00180]一部の実施形態では、オリゴマー試薬は、ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、若しくはストレプトアビジン類似体、アビジン、アビジンムテイン、若しくはアビジン類似体（ニュートラビジンなど）のオリゴマー、又はこれらの混合物であり、この場合、このようなオリゴマー試薬は、薬剤（例えば、結合パートナーＣ）の結合性ドメインとの可逆的会合のための、１つ又は複数の結合性部位を含有する。一部の実施形態では、薬剤の結合性ドメインは、ビオチン、ビオチン誘導体若しくはビオチン類似体、又はストレプトアビジン結合性ペプチド、或いはストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、又はストレプトアビジン類似体、アビジン、又はアビジンムテイン若しくはアビジン類似体に特異的に結合することが可能な他の分子でありうる。
[00181]ある特定の実施形態では、１つ又は複数の薬剤（例えば、Ｔ細胞などの細胞にシグナルをもたらすことが可能な薬剤）は、オリゴマー試薬に存在する、複数の、特定の結合性部位（例えば、結合性部位Ｚ）などを介して、オリゴマー試薬に不可逆的に結合するなど、これと会合する。場合によって、これは、薬剤が結合するか、又はそれによって認識される細胞表面分子（これらの少なくとも２つのコピー）を有する標的細胞が、薬剤と接触する場合にアビディティー効果が生じうるように、互いと近接した薬剤の配置を結果としてもたらす。
[00182]一部の実施形態では、オリゴマー試薬は、ストレプトアビジンオリゴマー、ストレプトアビジンムテインオリゴマー、ストレプトアビジン類似体オリゴマー、アビジンオリゴマー、アビジンムテイン若しくはアビジン類似体（ニュートラビジンなど）から構成されるオリゴマー、又はこれらの混合物である。特定の実施形態では、オリゴマー試薬は、薬剤の結合性ドメイン（例えば、結合パートナーＣ）に結合することが可能な、特定の結合性部位を含有する。一部の実施形態では、結合性ドメインは、ビオチン、ビオチン誘導体若しくはビオチン類似体、又はストレプトアビジン結合性ペプチド、或いはストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、又はストレプトアビジン類似体、アビジン、又はアビジンムテイン若しくはアビジン類似体に特異的に結合することが可能な他の分子でありうる。
[00183]一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、野生型ストレプトアビジン、ストレプトアビジンムテイン、又はストレプトアビジン様ポリペプチドなどのストレプトアビジン類似体でありうる。同様に、一部の態様では、アビジンは、野生型アビジン、又は修飾アルギニンを伴う脱グリコシル化アビジンであって、典型的に、より中性の等電点（ｐＩ）を呈し、天然のアビジンに対する代替物として利用可能な脱グリコシル化アビジンである、ニュートラビジンなど、アビジンのムテイン若しくは類似体を含む。一般に、アビジンの、脱グリコシル化された中性形態は、例えば、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を介して入手可能な、「Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ」、又はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）若しくはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から入手可能な、「ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ」などの市販形態を含む。
[00184]一部の実施形態では、試薬は、ストレプトアビジン若しくはストレプトアビジンムテイン、又はこれらの類似体である。一部の実施形態では、野生型ストレプトアビジン（ｗｔ－ストレプトアビジン）は、Ａｒｇａｒａｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１４（１９８６）、１８７１～１８８２（配列番号１）により開示されているアミノ酸配列を有する。一般に、ストレプトアビジンは、天然において、４つの同一なサブユニットの四量体として生じる、すなわち、ストレプトアビジンは、各サブユニットが、ビオチン、ビオチンの誘導体若しくは類似体、又はビオチン模倣体に対する、単一の結合性部位を含有する、ホモ四量体である。ストレプトアビジンサブユニットの例示的配列は、配列番号１において明示されているアミノ酸の配列であるが、このような配列また、他のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種に由来する、その相同体において存在する配列も含みうる。特に、ストレプトアビジンの各サブユニットは、ビオチンに対して、約１０－１４Ｍの桁数の解離定数（Ｋｄ）で、強力な結合アフィニティーを呈しうる。場合によって、ストレプトアビジンは、４つの結合性部位のうちの１つだけが機能的な、一価四量体（Ｈｏｗａｒｔｈら（２００６）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３：２６７～７３；Ｚｈａｎｇら（２０１５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、４６３：１０５９～６３）として存在する場合もあり、４つの結合性部位のうちの２つが機能的な、二価四量体（Ｆａｉｒｈｅａｄら（２０１３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４２６：１９９～２１４）として存在する場合もあり、単量体形態又は二量体形態（Ｗｕら（２００５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８０：２３２２５～３１；Ｌｉｍら（２０１０）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５０：８６８２～９１）において存在する場合もある。
[00185]一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、一般に、配列番号１に明示された、ストレプトマイセス・アビジニー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）に由来する野生型ストレプトアビジンの、少なくとも１つの機能的サブユニット、又はその機能的活性断片を含有するなど、ビオチン、ビオチンの誘導体若しくは類似体、又はビオチン模倣体に対する結合性部位を含有する、少なくとも１つの機能的サブユニットを含む、ストレプトマイセス属種に由来するストレプトアビジン、又はその機能的活性断片など、野生型ストレプトアビジン又は非修飾ストレプトアビジンなど、任意の形態でありうる。例えば、一部の実施形態では、ストレプトアビジンは、Ｎ末端及び／又はＣ末端において短縮された、野生型ストレプトアビジンの断片を含みうる。このような最小ストレプトアビジンは、Ｎ末端の、配列番号１のアミノ酸位置１０～１６の領域において起始し、Ｃ末端の、配列番号１のアミノ酸位置１３３～１４２の領域において終結する、任意の最小ストレプトアビジンを含む。一部の実施形態では、ストレプトアビジンの機能的活性断片は、配列番号２に明示されたアミノ酸の配列を含有する。一部の実施形態では、配列番号２に明示されたストレプトアビジンなどのストレプトアビジンは、配列番号１に明示された番号付けによる、Ａｌａ１３に対応する位置において、Ｎ末端のメチオニンをさらに含有しうる。ストレプトアビジン又はストレプトアビジンムテインにおける残基の位置に対する言及は、配列番号１における残基についての番号付けに対する言及による。
[00186]ストレプトアビジン又はストレプトアビジンムテインの例については、例えば、国際公開第８６／０２０７７号、ドイツ特許第１９６４１８７６号、米国特許第６，０２２，９５１号、国際公開第９８／４０３９６号、又は国際公開第９６／２４６０６号において言及されている。当技術分野では、ストレプトアビジンムテインの例について公知であり、例えば、米国特許第５，１６８，０４９号；同第５，５０６，１２１号；同第６，０２２，９５１号；同第６，１５６，４９３号；同第６，１６５，７５０号；同第６，１０３，４９３号号；若しくは同第６，３６８，８１３号；又はＰＣＴ出願国際公開第２０１４／０７６２７７号を参照されたい。
[00187]一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、非修飾ストレプトアビジン又は野生型ストレプトアビジンの部分ではないアミノ酸を含有する場合もあり、野生型ストレプトアビジン又は非修飾ストレプトアビジンの部分だけを含む場合もある。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号１に明示された、野生型ストレプトアビジンのサブユニット、又は、例えば、配列番号２に明示された、その機能的に活性の断片と比較するなど、非修飾ストレプトアビジン又は野生型ストレプトアビジンのサブユニットと比較して、１つ又は複数のアミノ酸置換（置きかえ）を有しうる、少なくとも１つのサブユニットを含有する。
[00188]一部の実施形態では、ストレプトアビジン又はストレプトアビジンムテインの、結合性ドメインに対する解離定数（Ｋｄ）などの結合アフィニティーは、１×１０－４Ｍ、５×１０－４Ｍ、１×１０－５Ｍ、５×１０－５Ｍ、１×１０－６Ｍ、５×１０－６Ｍ、又は１×１０－７Ｍ未満であるが、一般に、１×１０－１３Ｍ、１×１０－１２Ｍ、又は１×１０－１１Ｍを超える。例えば、米国特許第５，５０６，１２１号において開示されているペプチド配列などのペプチド配列（Ｓｔｒｅｐタグ）は、ビオチン模倣体として作用することが可能であり、ストレプトアビジンに対する結合アフィニティー（例えば、約１０－４～１０－５Ｍの間のＫｄ）を裏付ける。場合によって、ストレプトアビジン分子内に変異を施すことにより、結合アフィニティーを、さらに改善することができる（例えば、米国特許第６，１０３，４９３号、又はＰＣＴ出願国際公開第２０１４／０７６２７７号を参照されたい）。一部の実施形態では、結合アフィニティーは、本明細書で記載される任意の方法など、当技術分野で公知の方法により決定することができる。
[00189]一部の実施形態では、ストレプトアビジン又はストレプトアビジンムテインなどの試薬は、薬剤（例えば、受容体の結合剤又は選択剤）に存在する結合パートナーＣでありうる、ペプチドリガンドである結合パートナーに対する結合アフィニティーを呈する。一部の実施形態では、ペプチド配列は、配列番号３に明示された配列を含有する配列など、一般式：Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ［式中、Ｘａａは、グルタミン、アスパラギン、又はメチオニンである］を伴う配列を含有する。一部の実施形態では、ペプチド配列は、配列番号４に明示された一般式、又は配列番号５に明示された一般式などの一般式を有する。一例では、ペプチド配列は、Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（また、ストレップ－タグ（Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇ）（登録商標）とも呼ばれ、配列番号６に明示されている）である。一例では、ペプチド配列は、Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ（また、ストレップ－タグ（登録商標）とも呼ばれ、配列番号７に明示されている）である。一部の実施形態では、ペプチドリガンドは、２つのモジュールの間の距離が、少なくとも０アミノ酸であり、５０アミノ酸を超えず、１つ結合性モジュールが、３つ～８つのアミノ酸を有し、少なくとも、配列Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｘａａ［式中、Ｘａａは、グルタミン、アスパラギン、又はメチオニンである］を含有し、他の結合性モジュールが、配列番号４に明示されたストレプトアビジンペプチドリガンドなど、同じストレプトアビジンペプチドリガンド、又は異なるストレプトアビジンペプチドリガンドを有する、少なくとも２つのストレプトアビジン結合性モジュール配列の配置を含有する（例えば、ＰＣＴ出願国際公開第０２／０７７０１８号；米国特許第７，９８１，６３２号を参照されたい）。一部の実施形態では、ペプチドリガンドは、配列番号８又は９のうちのいずれかに明示された式を有する配列を含有する。一部の実施形態では、ペプチドリガンドは、配列番号１０～１２、１３～１４のうちのいずれかに明示されたアミノ酸の配列を有する。大半の場合に、これらのストレプトアビジン結合性ペプチドの全ては、同じ結合性部位、すなわち、ストレプトアビジンのビオチン結合性部位に結合する。このようなストレプトアビジン結合性ペプチドのうちの１つ又は複数を、結合パートナーＣ、例えば、Ｃ１及びＣ２として使用する場合、結合パートナーＣを介して、１つ又は複数の薬剤に結合している、多量体化試薬及び／又はオリゴマー粒子試薬は、典型的に、１つ又は複数のストレプトアビジンムテインから構成される。
[00190]一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、米国特許第６，１０３，４９３号に記載されている変異体である。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号１に明示されたアミノ酸配列など、野生型ストレプトアビジンのアミノ酸配列に基づく、アミノ酸位置４４～５３の領域内に、少なくとも１つの変異を含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、１つ又は複数の残基である、４４、４５、４６、及び／又は４７における変異を含有する。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、野生型ストレプトアビジンの４４位におけるＧｌｕの、疎水性の脂肪族アミノ酸（例えば、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、又はＬｅｕ）による置きかえ、４５位における任意のアミノ酸、４６位における疎水性の脂肪族アミノ酸など、脂肪族アミノ酸、及び／又は４７位におけるＶａｌの、塩基性アミノ酸、例えば、一般に、ＡｒｇなどのＡｒｇ若しくはＬｙｓによる置きかえを含有する。一部の実施形態では、Ａｌａは、４６位にある、及び／又はＡｒｇは、４７位にある、及び／又はＶａｌ若しくはＩｌｅは、４４位にある。一部の実施形態では、ストレプトアビジン変異体は、配列番号１５、又は配列番号１６若しくは１７に明示されたアミノ酸の配列を含有する、例示的ストレプトアビジンムテインに明示された変異体など、残基である、Ｖａｌ４４－Ｔｈｒ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含有する（また、ストレプトアビジン変異体１、ＳＡＭ１としても公知である）。一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、配列番号１８、１９、又は２０に明示されたアミノ酸の配列を含有する、例示的ストレプトアビジンムテインに明示された変異体など、残基である、Ｉｌｅ４４－Ｇｌｙ４５－Ａｌａ４６－Ａｒｇ４７を含有する（また、ＳＡＭ２としても公知である）。場合によって、このようなストレプトアビジンムテインについては、例えば、米国特許第６，１０３，４９３号において記載されており、ストレップ－タクチン（Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ）（登録商標）の商標下で市販されている。一部の実施形態では、ムテインストレプトアビジンは、配列番号２１又は配列番号２２に明示されたアミノ酸の配列を含有する。特定の実施形態では、分子は、配列番号２、１６、１９、２１、２３、１７又は２０のうちのいずれかに明示された配列を含む、ストレプトアビジン又はストレプトアビジンムテインの四量体であって、四量体として、単量体１つ当たり１つのＮ末端アミン、及び４つのリシンを含む、２０の一級アミンを含有する分子である四量体である。
[00191]一部の実施形態では、ストレプトアビジンムテインは、ペプチドリガンド（Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；また、ストレップ－タグ（登録商標）とも呼ばれ、配列番号６に明示されている）に対して、３．７×１０－５Ｍであるか、若しくはこれ未満の解離定数（ＫＤ）、及び／又はペプチドリガンド（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ；また、ストレップ－タグ（登録商標）とも呼ばれ、配列番号７に明示されている）に対して、７．１×１０－５Ｍであるか、若しくはこれ未満のＫＤ、及び／又はで配列番号７、８、９、１３、１４、１０～１２、５、６、３、４のうちのいずれかに明示されたペプチドリガンドのうちのいずれかに対して、７．０×１０－５Ｍ、５．０×１０－５Ｍ、１．０×１０－５Ｍ、５．０×１０－６Ｍ、１．０×１０－６Ｍ、５．０×１０－７Ｍ、若しくは１．０×１０－７Ｍあるか、又はこれ未満であるが、一般に、１×１０－１３Ｍ、１×１０－１２Ｍ、又は１×１０－１１Ｍを超えるＫＤにより特徴づけられる結合アフィニティーを呈する。
[00192]一部の実施形態では、結果として得られるストレプトアビジンムテインは、ペプチドリガンド（Ｔｒｐ－Ａｒｇ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ；また、ストレップ－タグ（登録商標）とも呼ばれ、配列番号６に明示されている）に対して、２．７×１０４Ｍ－１であるか、若しくはこれを超える会合定数（Ｋａ）、及び／又はペプチドリガンド（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ；また、ストレップ－タグ（登録商標）とも呼ばれ、配列番号７に明示されている）に対して、１．４×１０４Ｍ－１であるか、若しくはこれを超えるＫａ、及び／又は配列番号７、８、９、１３、１４、１０～１２、５、６、３、４のうちのいずれかに明示されたペプチドリガンドのうちのいずれかに対して、１．４３×１０４Ｍ－１、１．６７×１０４Ｍ－１、２×１０４Ｍ－１、３．３３×１０４Ｍ－１、５×１０４Ｍ－１、１×１０５Ｍ－１、１．１１×１０５Ｍ－１、１．２５×１０５Ｍ－１、１．４３×１０５Ｍ－１、１．６７×１０５Ｍ－１、２×１０５Ｍ－１、３．３３×１０５Ｍ－１、５×１０５Ｍ－１、１×１０６Ｍ－１、１．１１×１０６Ｍ－１、１．２５×１０６Ｍ－１、１．４３×１０６Ｍ－１、１．６７×１０６Ｍ－１、２×１０６Ｍ－１、３．３３×１０６Ｍ－１、５×１０６Ｍ－１、１×１０７Ｍ－１であるか、若しくはこれを超えるが、一般に、１×１０１３Ｍ－１、１×１０１２Ｍ－１、若しくは１×１０１１Ｍ－１未満であるＫａにより特徴づけられる結合アフィニティーを呈する。
[00193]本明細書の特定の実施形態では、複数のストレプトアビジン四量体、又はストレプトアビジンムテイン四量体から構成される、及び／又はこれらを含有するオリゴマー粒子試薬が提示される。ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるオリゴマー粒子試薬は、１つ又は複数の薬剤、例えば、刺激剤及び／又は選択剤に不可逆的に結合するか、又はこれらに不可逆的に結合することが可能な、複数の結合性部位を含有する。一部の実施形態では、オリゴマー粒子は、端点を含む、７０ｎｍ～１２５ｎｍの間の半径（例えば、平均半径）；端点を含む、１×１０７ｇ／モル～１×１０９ｇ／モルの間の分子量；及び／又は端点を含む、１，０００～５，０００の間のストレプトアビジン四量体又はストレプトアビジンムテイン四量体を有する。一部の実施形態では、オリゴマー粒子試薬は、細胞の表面において、分子（例えば、受容体）に結合する薬剤など、１つ又は複数の薬剤に結合している（例えば、不可逆的に結合している）。ある特定の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、本明細書で記載される薬剤である。一部の実施形態では、薬剤は、結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン結合性ペプチド、例えば、ストレップ－タグ（登録商標）ＩＩを含有する抗体、又はこれらの抗原結合性断片など、抗ＣＤ３抗体及び／若しくは抗ＣＤ２８抗体、又はこれらの抗原結合性断片である。特定の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、結合パートナー、例えば、ストレプトアビジン結合性ペプチド、例えば、ストレップ－タグ（登録商標）ＩＩを含有する、抗ＣＤ３ Ｆａｂ及び／又は抗ＣＤ２８ Ｆａｂである。
[00194]本明細書の一部の実施形態では、複数のストレプトアビジン四量体、又はストレプトアビジンムテイン四量体から構成される、及び／又はこれらを含有するオリゴマー粒子試薬が提示される。ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるオリゴマー粒子試薬は、１つ又は複数の薬剤（例えば、刺激剤及び／又は選択剤）に不可逆的に結合するか、又はこれらに不可逆的に結合することが可能な、複数の結合性部位を含有する。一部の実施形態では、オリゴマー粒子は、端点を含む、８０ｎｍ～１２０ｎｍの間の半径（例えば、平均半径）；端点を含む、７．５×１０６ｇ／モル～２×１０８ｇ／モルの間の分子量；及び／又は端点を含む、５００～１０，０００の間のストレプトアビジン四量体又はストレプトアビジンムテイン四量体を有する。一部の実施形態では、オリゴマー粒子試薬は、細胞の表面において、分子、例えば、受容体に結合する薬剤など、１つ又は複数の薬剤に結合している（例えば、不可逆的に結合している）。ある特定の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、本明細書で記載される薬剤である。一部の実施形態では、薬剤は、結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン結合性ペプチド、例えば、ストレップ－タグ（登録商標）ＩＩ）を含有する、抗ＣＤ３ Ｆａｂ及び／又は抗ＣＤ２８ Ｆａｂである。特定の実施形態では、１つ又は複数の薬剤は、結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン結合性ペプチド、例えば、ストレップ－タグ（登録商標）ＩＩ）を含有する、抗ＣＤ３ Ｆａｂ及び／又は抗ＣＤ２８ Ｆａｂである。
[00195]一部の実施形態では、細胞を、細胞１０６個当たり約０．０１μｇ、０．０２μｇ、０．０３μｇ、０．０４μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１μｇ、２μｇ、３μｇ、４μｇ、５μｇ、６μｇ、７μｇ、８μｇ、９μｇ、又は１０μｇ、又は少なくともこれらの量のオリゴマー刺激試薬の存在下で刺激する。一部の実施形態では、細胞を、細胞１０６個当たり約４μｇ、又はおよそこれらの量の存在下で刺激する。特定の実施形態では、細胞を、細胞１０６個当たり約０．８μｇ、又はおよそこれらの量の存在下で刺激する。ある特定の態様では、４μｇのオリゴマー刺激試薬は、３μｇのオリゴマー粒子及び１μｇの接合剤（例えば、０．５μｇの抗ＣＤ３ Ｆａｂ及び０．５μｇの抗ＣＤ２８ Ｆａｂ）であるか、又はこれらを含む。
形質導入／トランスフェクションユニットオペレーション
[00197]下記で明示される形質導入／トランスフェクション法は、細胞を、６ウェルプレートで活性化させる場合に、全４８条件でシステムを試行するように構成される。しかし、これは、異なるシステム、及び／又はシステム構成要素により、例えば、並行して加工される、最大で１９２条件に応じた、Ｔ細胞の活性化では、拡張される場合もあり、縮小される場合もある。このユニットオペレーションは、使用者が、活性化素材の優先について、加工進行又は全有核細胞（ＴＮＣ）加工の目標設定をインプットすることを可能とする。使用者はまた、形質導入ウェルの反復回数もインプットする。反復回数＝１の場合、プレート４枚ごとに、２４ウェル遠心分離機用プレート１枚が要求される。反復回数＝２の場合、プレート１枚について、２４ウェル遠心分離機用プレート１枚が要求される。ここで、スピノキュレーションのために、所望量を、２４ウェル平底プレート又は２４ウェルピラミッド又は丸底深型ウェルプレートへと移す。形質導入後、使用者の優先に従い、細胞を、翌日の接種のために、２４ウェルプレートにおいてインキュベートすることもでき、接種のために、２４ウェル深型拡大プレートへと移すこともできる。ここでは、ウイルス形質導入法を中心に論じるが、下記でより詳述される通り、本開示により、組換えＤＮＡを、活性化Ｔ細胞へと導入するための他の方法も包摂されることが想定される。例えば、本開示の範囲から逸脱しない限りにおいて、組換えＤＮＡを、活性化Ｔ細胞へと組み込むために、電気穿孔、試薬ベースのトランスフェクション、細胞圧縮、又は細胞圧搾のうちの１つ又は複数に依拠することができる。
[00198]図１７を参照しながら述べると、活性化ユニットオペレーション２１０が完結したら、制御システムは、形質導入／トランスフェクションユニットオペレーション２２０を開始する。形質導入ユニットオペレーション２２０は、ワークテーブルの設置で始まる。複数の実施形態では、使用者は、ＤｉＴｉ、試薬トラフ、細胞培養培地、細胞カウンティング試薬などを伴うワークテーブル６０を設置するように促される。複数の実施形態では、使用者は、２４ウェル平底バランスプレート、及び２４ウェル深型プレートを、ワークテーブル６０に置くように促される。２４ウェル平底プレートは、Ｔ細胞のスピノキュレーションのために使用される。２４ウェル深型プレートは、細胞の遠心分離のために使用される。複数の実施形態では、使用者は、形質導入モード（形質導入ＴＮＣモード、又は加工進行モードを設定する）をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、形質導入後モード（形質導入後接種モード又は形質導入後インキュベーションモード）をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、条件数、ウイルスベクター容量、形質導入の反復回数、スピノキュレーション容量、インキュベーション／接種容量をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、全サンプリング容量、及び解析（例えば、アミノ酸解析（ＡＡＡ）／フローサイトメトリー）用試料容量をインプットするように促される。使用者は、これらのパラメータを、リアルタイムで、又は、例えば、図１７に示される通り、方法２００のシステム１０の開始の前に、使用者により設定されるスクリプトの一部として入力するように促される場合がある。複数の実施形態では、使用者は、条件インプットの数に基づき、ワークテーブル６０を、「ｎ」枚の２４ウェル平底プレートと共に設置するように促される。複数の実施形態では、使用者は、条件インプットの数に基づき、ワークテーブル６０を、サンプリングプレート、及び「ｎ」枚のプレートと共に設置するように促される。サンプリングプレートは、９６ウェル深型プレート、９６ウェル低付着性プレート（細胞カウンティング）、及び９６ウェル丸底プレート（ＡＡＡ／フローサイトメトリー）を含む。
[00199]ワークテーブル６０の設置が完了したら、制御システム２０により、サンプリングが開始される。プレートを開蓋し、各試料ウェルを混合し、試料ごとに全サンプリング容量を吸引し、９６ウェル深型プレートへと分注する。プレートを、再度閉蓋する。次いで、分注されたサンプリング容量を混合し、細胞カウンティングプレート及びＡＡＡ／フローサイトメトリープレートへとアリコート分割した。次いで、条件インプットの数に従い、細胞カウンティング試薬を、低付着性細胞カウンティングプレートへと分注する。ある特定の実施形態では、サンプリングプレートについての細胞カウントを、細胞カウンティングモジュール７５により、自動的に読み取る。他の実施形態では、次いで、サンプリングプレートは、使用者の手に届きやすいように、ワークテーブル６０の前方へと持ち運ばれ、次いで、手作業による細胞カウンティングのために、使用者により、ワークテーブル６０から取り出される。細胞濃度の測定値は、システムコントローラー２０により、細胞カウンティングモジュール７５から、自動的に得られる場合もあり、使用者により、手作業で入力されて得られる場合もある。
[00200]サンプリングが完了したら、制御システム２０により、スピノキュレーションのための準備を開始する。使用者は、ウイルスベクターを、２５ｍＬトラフに入れるように促される。使用者のインプットに従い、次いで、使用者は、任意選択で、条件インプットの数に従い、「ｎ」枚の２４ウェル深型遠心分離機用プレートを、ワークテーブル６０に置くように促される。容器操作モジュール５０は、遠心分離機用プレート及びサンプリングプレートの両方を開蓋し、次いで、形質導入ＴＮＣに到達するのに要求された細胞数又は全試料を吸引し、遠心分離機用プレートへと分注する。容器操作モジュール５０は、離心フィンガー５２により、遠心分離機用プレートを閉蓋し、次いで、フィンガー交換システム（ＦＥＳ）を使用して、フィンガーを、向心フィンガー５４で置きかえる。次いで、ＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、遠心分離機用プレート及びそのバランスプレート（２４ウェル深型遠心分離機用プレートのうち、奇数番号を伴うプレートだけ）を、垂直方向に、ロボット遠心分離機６５へと移送する。遠心分離後、遠心分離機用プレートを、ワークテーブル６０へと戻す。ＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、遠心分離機用プレートを開蓋するのに続き、ＦＣＡなど、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、条件ウェルごとに上清の吸引を行う。吸引は、細胞ペレットが攪乱されないことを確保するように、ウェル補正を伴う緩徐な速度で実施される。上清の吸引は、スピノキュレーション容量インプットが各ウェルに残るまで進める。一部の実施形態では、スピノキュレーションステップは、元の容器において実施され、細胞移動ステップは行われない場合がある。この場合、先に進む前に、元の容器において所望の細胞濃度を得るように、容量の低減を行う。
[00201]スピノキュレーションのための準備が完了したら、制御システム２０により、スピノキュレーションモジュールを開始する。離心フィンガー５２を伴う、ＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、ホテル１０５から、２４ウェル平底プレートを得、条件数のインプットに要求されるプレートの数に従い、これらを、ワークテーブル６０のネストに置く。フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、２４ウェル深型遠心分離機用プレートの各ウェルを混合することにより進む。次いで、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、ウェルの内容物を吸引し、２４ウェル平底プレートへと分注する。所定数の細胞を、２４ウェル平底スピノキュレーションプレートへと分注したら、容量インプットに従い、ウェルごとにウイルスベクターを分注する。離心フィンガー５２を伴う、ＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、２４ウェル平底プレートを閉蓋し、次いで、ＦＥＳを使用して、離心フィンガーを、向心フィンガーで置きかえる。次いで、容器操作モジュール５０は、スピノキュレーションのために、２４ウェル平底プレート及びそのバランスプレート（２４ウェル深型遠心分離機用プレートのうち、奇数番号を伴うプレートだけ）を、垂直方向に、ロボット遠心分離機６５へと移送する。
[00202]形質導入に続いて使用者のインプットに従い、インキュベーションが行われる場合、スピノキュレーションが完了したら、制御システム２０により、形質導入後細胞インキュベーションを開始する。遠心分離後、２４ウェル平底プレートを、ワークテーブル６０へと戻す。容器操作モジュール５０は、２４ウェル平底プレートを開蓋し、次いで、ＦＣＡなど、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、インキュベーション容量に到達するように、新鮮な培地を、各条件ウェルへと分注する。次いで、ＦＣＡなど、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、条件数に従いプレートウェルを混合する。離心フィンガー５２を使用する、ＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、ワークテーブル６０における、全ての２４ウェル平底プレートを閉蓋する。複数の実施形態では、プレートを、接種のために、哺乳動物細胞用インキュベーターへと自動的に移す。複数の実施形態では、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから自動的に取り出す。複数の実施形態では、使用者は、接種のために、プレートを、インキュベーターに入れるように促される。複数の実施形態では、使用者は、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから取り出すように促される。次いで、使用者は、残りの実験機器全てを、ワークテーブル６０から取り出すように促される。
[00203]使用者のインプットに従い、形質導入後細胞接種を選び出す場合、遠心分離後、２４ウェル平底プレートを、ワークテーブル６０へと戻す。次いで、使用者は、２４ウェル深型拡大プレートを、ワークテーブル６０に置くように促される。離心フィンガー５２を使用する、ＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、拡大プレートを開蓋する。可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、続いて、容量インプットに従い、条件ごとに、細胞培養バランス培地を、２４ウェル深型拡大プレートの各ウェルへと分注する。ＦＣＡなど、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、２４ウェル平底プレートへと戻り、条件数に従い、プレートウェルを混合し、次いで、ウェルごとに細胞培養内容物を吸引し、これを、２４ウェル深型拡大プレートへと分注する。離心フィンガー５２を使用する、容器操作モジュール５０は、ワークテーブル６０における、全ての２４ウェル深型拡大プレートを閉蓋する。複数の実施形態では、プレートを、接種のために、哺乳動物細胞用インキュベーターへと自動的に移す。複数の実施形態では、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから自動的に取り出す。複数の実施形態では、使用者は、接種のために、プレートを、インキュベーターに入れるように促される。複数の実施形態では、使用者は、残りの実験機器全てを、ワークテーブル６０から取り出すように促される。
[00204]複数の実施形態では、本明細書で提示される方法は、ポリヌクレオチド、例えば、組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドの形質導入又はトランスフェクションのために使用される。特定の実施形態では、組換えタンパク質は、組換え受容体である。
[00205]１つ又は複数の組換えタンパク質（例えば、ＣＡＲ又はＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチド（例えば、組換えポリヌクレオチド）を導入するための、多様な方法が公知であり、提供されるシステム、方法、及び組成物と共に使用されうる。例示的方法は、ポリペプチド又は受容体をコードする核酸を導入するための方法であって、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス又はレンチウイルス、非ウイルスベクター又はトランスポゾン、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムを介する方法を含む方法を含む。遺伝子導入法は、形質導入、電気穿孔、若しくは細胞への遺伝子導入を結果としてもたらす他の方法、又は本明細書で記載される任意の送達法を含みうる。組換え産物をコードする核酸を導入するための、他の手法及びベクターは、例えば、それらの各々が、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４０５５６６８号及び米国特許第７，４４６，１９０号において記載されている、手法及びベクターである。
[00206]一部の実施形態では、組換え核酸は、電気穿孔を介して、Ｔ細胞へと導入される（例えば、Ｃｈｉｃａｙｂａｍら（２０１３）、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（３）：ｅ６０２９８；及びＶａｎ Ｔｅｄｅｌｏｏら（２０００）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、７（１６）：１４３１～１４３７を参照されたい）。一部の実施形態では、組換え核酸は、転移を介して、Ｔ細胞へと導入される（例えば、Ｍａｎｕｒｉら（２０１０）、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２１（４）：４２７～４３７；Ｓｈａｒｍａら（２０１３）、Ｍｏｌｅｃ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ、２、ｅ７４；及びＨｕａｎｇら（２００９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、５０６：１１５～１２６を参照されたい）。遺伝子素材を免疫細胞に導入し、発現させる、他の方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション（「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．において記載されているリン酸カルシウムトランスフェクションなど）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介型トランスフェクション；タングステン粒子促進型微粒子銃（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：７７６～７７７（１９９０））；ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－デキストラン／ＤＮＡトランスフェクション（Ｇｕｌｉｃｋ、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２０章：２０．４部（２００３））、及びリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿（Ｂｒａｓｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、７：２０３１～２０３４（１９８７））（これらの各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる）を含む。
[00207]別の実施形態では、免疫細胞における遺伝子素材の導入及び発現は、細胞送達媒体（例えば、カチオン性リポソーム）若しくは誘導体化（例えば、抗体コンジュゲート）ポリリシンコンジュゲート、グラミシジンＳ、及び／又は人工ウイルスエンベロープを介する。このような媒体は、プラスミド、ベクター、なお又はウイルスＤＮＡへと組み込まれた核酸を送達することができる。
[00208]別の実施形態では、目的の遺伝子を含む核酸分子を、所望の細胞（複数可）へと、可溶性分子複合体の形態で送達することができる。複合体は、担体へと、放出可能に結合している核酸であって、核酸結合剤と、所望の細胞（複数可）（例えば、Ｔ細胞）の表面分子に結合し、その後、細胞により内部化されうるサイズの細胞特異的結合剤とから構成される核酸を含有しうる。このような複合体については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，１６６，３２０号において記載されている。
[00209]細胞における、組換え受容体などの組換えタンパク質をコードする核酸分子の形質導入は、多数の公知のベクターのうちのいずれかを使用して実行することができる。このようなベクターは、レンチウイルスシステム及びガンマレトロウイルスシステムのほか、ＰｉｇｇｙＢａｃベースの遺伝子導入システム、又はＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙベースの遺伝子導入システムなど、トランスポゾンベースのシステムを含む、ウイルスシステム及び非ウイルスシステムを含む。例示的方法は、受容体をコードする核酸を導入するための方法であって、ウイルス（例えば、レトロウイルス又はレンチウイルス、とりわけ）、形質導入、トランスポゾンを介する方法を含む方法を含む。
[00210]一部の実施形態では、核酸は、電気穿孔、粒子銃、試薬ベースのトランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション）、細胞圧縮、又は細胞圧搾などを介する、物理的送達法を介して導入される。
[00211]一部の実施形態では、細胞、ウイルス粒子、及び試薬を含有する組成物のスピノキュレーション（例えば、遠心法による接種）は、一般に、例えば、チャンバー又は空洞の内壁又は外壁において測定される、１００×ｇ～３２００×ｇ、又はおよそこれらの速度で（例えば、約１００×ｇ、２００×ｇ、３００×ｇ、４００×ｇ、５００×ｇ、１０００×ｇ、１５００×ｇ、２０００×ｇ、２５００×ｇ、３０００×ｇ、若しくは３２００×ｇ、又はおよそこれらの速度、或いは少なくともこれらの速度、又は少なくともおよそこれらの速度で）など、細胞をペレット化させるのに使用される速度より低速など、比較的小さな力又は低速で回転させることができる。「相対遠心力」又はＲＣＦという用語は、一般に、物体又は物質（回転するチャンバー又は他の容器における、細胞、試料、若しくはペレット、及び／又は点など）に対して付与される、回転軸と比較した空間の特定の点における、地球の重力と比べた実効力であると理解される。値は、重力、回転速度、及び回転半径（ＲＣＦが測定される回転軸と、物体、物質、又は粒子との距離）を考慮に入れ、周知の式を使用して決定することができる。一部の実施形態では、細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激組成物に由来する細胞を、ウイルスと接触させること、ウイルスと共にインキュベートすること、及び／又はウイルスにより操作することのうちの少なくとも一部は、約１００×ｇ～３２００×ｇ、１０００×ｇ～２０００×ｇ、１０００×ｇ～３２００×ｇ、５００×ｇ～１０００×ｇ、４００×ｇ～１２００×ｇ、６００×ｇ～８００×ｇ、６００～７００×ｇ、又は５００×ｇ～７００×ｇの間の回転により実施される。
[00212]ある特定の実施形態では、操作、形質導入、及び／又はトランスフェクションの少なくとも一部は、回転、例えば、スピノキュレーション及び／又は遠心分離により実施される。一部の実施形態では、回転は、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、６０分間、９０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、若しくは少なくとも７日間、およそこれらの時間、又は少なくともこれらの時間にわたり実施される。
[00213]一部の実施形態では、遺伝子導入は、まず、細胞を、増殖、生存、及び／又は活性化、例えば、サイトカイン又は活性化マーカーの発現により測定される、増殖、生存、及び／又は活性化などの応答を誘導する刺激と組み合わせることなど、細胞を活性化させることに続く、活性化細胞への形質導入、及び培養物における、臨床適用に十分な数までの拡大により達せられる。ある特定の実施形態では、遺伝子導入は、活性化単位手順など、まず、活性化条件下で細胞をインキュベートすることにより達せられる。
[00214]一部の実施形態では、形質導入又はトランスフェクションのための方法は、組成物のうちの、１つ又は複数の細胞を、組換えタンパク質、例えば、組換え受容体をコードする核酸分子と接触させること実行される。一部の実施形態では、接触は、スピノキュレーション（例えば、遠心法による接種）などの遠心分離によりなされうる。このような方法は、国際公開第２０１６／０７３６０２号において記載されている方法のうちのいずれかを含む。
[00215]ある特定の実施形態では、細胞は、ポリカチオンなどの形質導入アジュバントの存在下で形質導入される。ある特定の実施形態では、１つ又は複数の形質導入アジュバントの存在は、形質導入の効率を増大させる。特定の実施形態では、ポリカチオンの存在下で操作される細胞のうちの、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％は、組換えポリヌクレオチドを含有するか、又は発現させる。一部の実施形態では、形質導入アジュバントの存在を伴わずに細胞を操作する、代替的方法及び／又は例示的方法と比較して、組成物のうちの、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍の細胞が、ポリカチオンの存在下で、組換え形質導入アジュバントを含有するか、又は発現させるように操作される。
[00216]一部の実施形態では、細胞は、１００μｇ／ｍｌ未満、９０μｇ／ｍｌ未満、８０μｇ／ｍｌ未満、７５μｇ／ｍｌ未満、７０μｇ／ｍｌ未満、６０μｇ／ｍｌ未満、５０μｇ／ｍｌ未満、４０μｇ／ｍｌ未満、３０μｇ／ｍｌ未満、２５μｇ／ｍｌ未満、２０μｇ／ｍｌ未満、１５μｇ／ｍｌ未満、又は１０μｇ／ｍｌ未満のアジュバントの存在下でトランスフェクト及び／又は形質導入される。ある特定の実施形態では、提供される方法を伴う使用に適するアジュバントは、ポリカチオン、フィブロネクチン又はフィブロネクチン由来の断片若しくはバリアント、及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ポリカチオンとは、正帯電イオンである。ある特定の実施形態では、ポリカチオンは、細胞と、ベクター、例えば、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターとの斥力を低減し、ベクターの、細胞表面との接触及び／又はこれへの結合を媒介する。一部の実施形態では、ポリカチオンは、ポリベン、ＤＥＡＥ－デキストラン、プロタミン硫酸塩、ポリ－Ｌ－リシン、又はカチオン性リポソームである。
[00217]一部の実施形態では、細胞を、上記の活性化単位手順で記載された活性化試薬などの活性化試薬の存在下に置く。
[00218]一部の実施形態では、細胞の操作は、ベクター（例えば、ウイルスベクター又は非ウイルスベクター）を伴う培養、接触、又はインキュベーションを含む。ある特定の実施形態では、操作は、細胞を、ベクターと共に、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、４０時間、４８時間、５４時間、６０時間、７２時間、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、若しくは７日間、又は７日間を超える時間、およそこれらの時間、或いは少なくともこれらの時間にわたり培養すること、細胞を、ベクターと、これらの時間にわたり接触させること、及び／又は細胞を、ベクターと共に、これらの時間にわたりインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、操作は、細胞を、ベクターと共に、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、若しくは７２時間、又はおよそこれらの時間にわたり、又は２日間、３日間、４日間、若しくは５日間、又はおよそこれらの時間にわたり培養すること、細胞を、ベクターと、これらの時間にわたり接触させること、及び／又は細胞を、ベクターと共に、これらの時間にわたりインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、操作するステップは、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、若しくは７２時間、又はおよそこれらの時間にわたり実施される。ある特定の実施形態では、操作は、２日間、又はおよそこれらの時間にわたり実施される。
[00219]一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルス又はレンチウイルス、非ウイルスベクター又はトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクター、レンチウイルスベクター又はガンマ－レトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するレトロウイルスベクター、ＭＰＳＶ（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＭＥＳＶ（ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ）、ＭＳＣＶ（ｍｕｒｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ）、又はＳＦＦＶ（ｓｐｌｅｅｎ ｆｏｃｕｓ ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）を含む。
[00220]一部の実施形態では、ウイルスベクター又は非ウイルスＤＮＡは、異種組換えタンパク質をコードする核酸を含有する。一部の実施形態では、異種組換え分子は、組換え受容体（例えば、抗原受容体）、ＳＢトランスポゾン（例えば、遺伝子サイレンシングのための）、カプシド封入トランスポゾン、相同二本鎖核酸（例えば、ゲノム組換えのための）、又はレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質、又はルシフェラーゼなど他のレポーター）であるか、又はこれらを含む。
[00221]一部の実施形態では、組換え核酸は、例えば、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使用して、細胞へと導入される。一部の実施形態では、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクター、又はガンマ－レトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター（例えば、Ｋｏｓｔｅら（２０１４）、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１４年４月、３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ．２０１４．２５；Ｃａｒｌｅｎｓら（２０００）、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ、２８（１０）：１１３７～４６；Ａｌｏｎｓｏ－Ｃａｍｉｎｏら（２０１３）、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ、２、ｅ９３；Ｐａｒｋら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１１年１１月、２９（１１）：５５０～５５７を参照されたい）を使用して、Ｔ細胞へと導入される。
[00222]一部の実施形態では、レトロウイルスベクターは、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）配列（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）に由来するレトロウイルスベクター、ＭＰＳＶ（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＭＥＳＶ（ｍｕｒｉｎｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ）、ＭＳＣＶ（ｍｕｒｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ）、ＳＦＦＶ（ｓｐｌｅｅｎ ｆｏｃｕｓ ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））を有する。大半のレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。一部の実施形態では、レトロウイルスは、任意の鳥類細胞供給源又は哺乳動物細胞供給源に由来するレトロウイルスを含む。レトロウイルスは、典型的に両種性であるが、これは、ヒトを含む、いくつかの種の宿主細胞に感染することが可能であることを意味する。一実施形態では、発現させられる遺伝子は、レトロウイルスのｇａｇ配列、ｐｏｌ配列、及び／又はｅｎｖ配列を置きかえる。多数の例示的なレトロウイルスシステムについて記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；同第６，２０７，４５３号；同第５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｏｓｍａｎ（１９８９）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７：９８０～９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１：５～１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８０：８４９～８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：８０３３～８０３７；並びにＢｏｒｉｓ－Ｌａｗｒｉｅ及びＴｅｍｉｎ（１９９３）、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．、３：１０２～１０９）。
[00223]レンチウイルスによる形質導入法は公知である。例示的方法については、例えば、Ｗａｎｇら（２０１２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５（９）：６８９～７０１；Ｃｏｏｐｅｒら（２００３）、Ｂｌｏｏｄ、１０１：１６３７～１６４４；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（２００９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．、５０６：９７～１１４；及びＣａｖａｌｉｅｒｉら（２００３）、Ｂｌｏｏｄ、１０２（２）：４９７～５０５において記載されている。
[00224]一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子は、レンチウイルスゲノムベースのベクターに由来するベクターなど、レトロウイルスゲノムベースのベクターに由来するゲノムを含有する。提供されるウイルスベクターについての一部の態様では、ＣＡＲなどの抗原受容体などの組換え受容体をコードする異種核酸は、ベクターゲノムの５’ＬＴＲ配列と３’ＬＴＲ配列との間に含有及び／又は配置される。
[00225]一部の実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、ＨＩＶ－１ゲノム又はＳＩＶゲノムなどのレンチウイルスゲノムである。例えば、毒性遺伝子を、多重的に弱毒化することにより、レンチウイルスベクターが作出されている、例えば、遺伝子である、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、及びｎｅｆを欠失させ、治療目的で、ベクターを安全とすることができる。レンチウイルスベクターについては公知である（Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６及び１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）；Ｄｕｌｌら、１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。一部の実施形態では、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースのベクター又はウイルスベースのベクターであり、外来核酸の組込み、核酸の選択、及び宿主細胞への導入のために不可欠の配列を保有するように構成される。公知のレンチウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０－２２０９）などの寄託機関又はコレクションからたやすく得ることもでき、一般に利用可能な技法を使用して、公知の供給源から単離することもできる。
[00226]レンチウイルスベクターの非限定例は、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）、ＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒトＴリンパ球ウイルス１（ＨＴＬＶ－１）、ＨＴＬＶ－２又はウマ伝染性貧血ウイルス（Ｅ１ＡＶ）などのレンチウイルスに由来するレンチウイルスベクターを含む。例えば、ＨＩＶ毒性遺伝子を、多重的に弱毒化することにより、レンチウイルスベクターが作出されている、例えば、遺伝子である、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、及びｎｅｆを欠失させ、治療目的で、ベクターを安全とする。当技術分野では、レンチウイルスベクターについて公知である（Ｎａｌｄｉｎｉら（１９９６及び１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら（１９９７）；Ｄｕｌｌら、１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。一部の実施形態では、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースのベクター又はウイルスベースのベクターであり、外来核酸の組込み、核酸の選択、及び宿主細胞への導入のために不可欠の配列を保有するように構成される。公知のレンチウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０－２２０９）などの寄託機関又はコレクションからたやすく得ることもでき、一般に利用可能な技法を使用して、公知の供給源から単離することもできる。
[00227]一部の実施形態では、ウイルスゲノムベクターは、レンチウイルスなど、レトロウイルスの、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲの配列を含有しうる。一部の態様では、ウイルスゲノム構築物は、レンチウイルスの、５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲに由来する配列を含有する場合があり、特に、レンチウイルスの５’ＬＴＲに由来するＲ配列及びＵ５配列、並びにレンチウイルスに由来する不活化３’ＬＴＲ又は自己不活化３’ＬＴＲを含有しうる。ＬＴＲ配列は、任意の種に由来する、任意のレンチウイルスに由来するＬＴＲ配列でありうる。例えば、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、又はＢＩＶに由来するＬＴＲ配列でありうる。典型的に、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ ＬＴＲ配列である。
[00228]一部の実施形態では、ＨＩＶウイルスベクターなどのウイルスベクターの核酸は、さらなる転写単位を欠く。ベクターゲノムは、不活化３’ＬＴＲ又は自己不活化３’ＬＴＲ（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２：９８７３、１９９８；Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２：８１５０、１９９８）を含有しうる。例えば、ウイルスベクターＲＮＡを作製するのに使用される核酸の３’ＬＴＲのＵ３領域における欠失は、自己不活化（ＳＩＮ）ベクターを作出するのに使用されうる。次いで、この欠失は、逆転写時に、プロウイルスＤＮＡの５’ＬＴＲへと導入される。自己不活化ベクターは、一般に、ベクターへの組込み時に、５’ＬＴＲへとコピーされる、３’ＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）からの、エンハンサー配列及びプロモーター配列を欠失させている。一部の実施形態では、ＴＡＴＡボックスの除去を含む、ＬＴＲの転写活性を消失させるのに十分な配列が消失しうる。これは、形質導入細胞における、全長ベクターＲＮＡの産生を防止しうる。一部の態様では、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサー配列である、ＴＡＴＡボックス部位、Ｓｐ１部位、及びＮＦ－カッパＢ部位の欠失を含有する。自己不活化３’ＬＴＲの結果として、侵入及び逆転写の後で作出されるプロウイルスは、不活化５’ＬＴＲを含有する。これは、ベクターゲノムの移動の危険性、及びＬＴＲの、近傍の細胞内プロモーターに対する影響を低減することにより、安全性を改善しうる。自己不活化３’ＬＴＲは、当技術分野で公知の任意の方法により構築されうる。一部の実施形態では、これは、ベクターの力価、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ若しくはｉｎ ｖｉｖｏにおけるベクターの特性に影響を及ぼさない。
[00229]任意選択で、レンチウイルス５’ＬＴＲに由来するＵ３配列を、異種プロモーター配列など、ウイルス構築物におけるプロモーター配列で置きかえることができる。これは、パッケージング細胞株から回収されるウイルスの力価を増大させることができる。エンハンサー配列もまた、組み込むことができる。パッケージング細胞株における、ウイルスＲＮＡゲノムの発現を増大させる、任意のエンハンサー／プロモーター組合せを使用することができる。一例では、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（米国特許第５，３８５，８３９号及び米国特許第５，１６８，０６２号）。
[00230]ある特定の実施形態では、レンチウイルスベクターゲノムなどのレトロウイルスベクターゲノムが、組込み欠損性となるように構築することにより、挿入性変異誘発の危険性を最小化させることができる。非組込型ベクターゲノムを作製するための、様々な手法を追究することができる。一部の実施形態では、不活性インテグラーゼを伴うタンパク質をコードするように、変異（複数可）を、ｐｏｌ遺伝子のインテグラーゼ酵素構成要素へと操作することができる。一部の実施形態では、例えば、接合部位の一方若しくは両方を変異若しくは欠失させるか、又は欠失若しくは修飾を介して、非機能的な３’ＬＴＲ近位ポリプリン配列（ＰＰＴ）を作製することにより、ベクターゲノム自体を修飾して、組込みを防止することもできる。一部の実施形態では、非遺伝子法も利用可能であり、これらは、インテグラーゼの１つ又は複数の機能を阻害する、薬理学的薬剤を含む。
[00231]手法は、相互に除外的ではない；すなわち、これらのうちの１つを超える手法を、一度に使用することもできる。例えば、インテグラーゼ及び接合部位のいずれもが非機能的な場合もあり、インテグラーゼ及びＰＰＴ部位のいずれもが非機能的な場合もあり、接合部位及びＰＰＴ部位のいずれもが非機能的な場合もあり、これらの全てが非機能的な場合もある。このような方法及びウイルスベクターは、公知であり、利用可能である（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ及びＴｈｒａｓｈｅｒ、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１８：４８３、２００７；Ｅｎｇｅｌｍａｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９：２７２９、１９９５；Ｂｒｏｗｎら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７３：９０１１（１９９９）；国際公開第２００９／０７６５２４号；ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７７：１１１５０、２００３；Ｐｏｗｅｌｌ及びＬｅｖｉｎ、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７０：５２８８、１９９６を参照されたい）。
[00232]一部の実施形態では、ベクターは、原核宿主細胞などの宿主細胞における繁殖のための配列を含有する。一部の実施形態では、ウイルスベクターの核酸は、細菌細胞などの原核細胞における繁殖のための、１つ又は複数の複製起点を含有する。一部の実施形態では、原核生物の複製起点を含むベクターはまた、その発現が、薬物耐性など、検出用マーカー又は選択用マーカーを付与する遺伝子も含有しうる。
[00233]ウイルスベクターゲノムは、典型的に、パッケージング細胞株又は産生細胞株へとトランスフェクトされうる、プラスミド形態で構築される。そのゲノムが、ウイルスベクターゲノムのＲＮＡコピーを含有するレトロウイルス粒子を作製するのに、様々な公知の方法のうちのいずれかを使用することができる。一部の実施形態では、少なくとも２つ構成要素が、ウイルスベースの遺伝子送達システム：第１に、ウイルスベクター粒子を作出するのに必要な、構造的タンパク質のほか、酵素を包含する、パッケージングプラスミド、並びに第２に、ウイルスベクター自体、すなわち、導入される遺伝子素材の作製に関与する。これらの構成要素の一方又は両方のデザインには、生物学的安全性の防護手段が導入されうる。
[00234]一部の実施形態では、パッケージングプラスミドは、ＨＩＶ－１など、全てのレトロウイルスの、エンベロープタンパク質以外のタンパク質（Ｎａｌｄｉｎｉら、１９９８）を含有しうる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、毒力と関連するウイルス遺伝子、例えば、ＨＩＶの一次トランス活性化因子である、ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、及びｎｅｆ、並びに／又はＴａｔなど、さらなるウイルス遺伝子を欠く場合がある。一部の実施形態では、ＨＩＶベースのレンチウイルスベクターなどのレンチウイルスベクターは、組換えを介して、野生型ウイルスの再構成の可能性を低減するか、又はこれを消失させる、親ウイルスの３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｒｅｖだけを含む。
[00235]一部の実施形態では、ウイルス粒子を、形質導入される細胞の総数当たりのウイルスベクター粒子又はその感染性ユニット（ＩＵ）のコピーのある特定の比（細胞１個当たりのＩＵ）で用意する。例えば、一部の実施形態では、ウイルス粒子は、接触時に、細胞１個当たり０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、若しくは６０ＩＵ、又はおよそこの大きさのＩＵ、又は少なくともこの大きさのＩＵのウイルスベクター粒子で存在する。
[00236]一部の実施形態では、ウイルスベクター粒子の力価は、少なくとも６×１０６ＩＵ／ｍＬ、７×１０６ＩＵ／ｍＬ、８×１０６ＩＵ／ｍＬ、９×１０６ＩＵ／ｍＬ、１×１０７ＩＵ／ｍＬ、２×１０７ＩＵ／ｍＬ、３×１０７ＩＵ／ｍＬ、４×１０７ＩＵ／ｍＬ、又は５×１０７ＩＵ／ｍＬなど、５×１０６ＩＵ／ｍＬ～５×１０７ＩＵ／ｍＬの間又はおよそこの間など、１×１０６ＩＵ／ｍＬ～１×１０８ＩＵ／ｍＬの間又はおよそこの間である。
[00237]一部の実施形態では、形質導入は、一般に、６０未満、５０、４０、３０、２０、１０、５、又はこれ未満など、１００未満の感染多重度（ＭＯＩ）で達成することができる。
[00238]一部の実施形態では、方法は、細胞を、ウイルス粒子と接触させるか、又はこれと共にインキュベートするステップを伴う。一部の実施形態では、接触は、少なくとも３０分間、１時間、２時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、若しくはこれを超える時間、又はおよそ少なくともこれらの時間など、３０分間～４８時間、３０分間～２４時間、又は１時間～２４時間など、３０分間～７２時間にわたる。
[00239]ある特定の実施形態では、インプット細胞は、ウイルスＤＮＡによりコードされる組換え受容体に結合するか、又はこれを認識する結合性分子を含む粒子により処理されるか、これらと共にインキュベートされるか、又はこれらと接触させられる。
[00240]一部の実施形態では、細胞の、ウイルスベクター粒子とのインキュベーションは、ウイルスベクター粒子により形質導入された細胞を含むアウトプット組成物を結果としてもたらすか、又はこれらをもたらす。
接種ユニットオペレーション
[00242]形質導入ユニットオペレーション２２０が完結したら、制御システムは、接種ユニットオペレーション２３０を開始する。下記に明示される接種法は、形質導入法において使用される反復ウェルの数に基づき、一度に７２の条件で、システムを試行するように構成される。しかし、これは、異なるシステム及び／又はシステム構成要素により、拡張される場合もあり、縮小される場合もある、例えば、方法において、反復回数１の使用を許容することにより、１９２の加工条件を伴う場合もある。ここで、形質導入細胞は、拡大のために、哺乳動物細胞用深型ウェルプレートへと導入され、使用者は、加工進行、又は接種ＴＮＣの目標設定についての優先をインプットするように促される。
[00243]接種ユニットオペレーション２３０は、ワークテーブルの設置で始まる。複数の実施形態では、使用者は、ワークテーブル６０を、ＤｉＴｉ、試薬トラフ、細胞培養培地、細胞カウンティング試薬と共に設置するように促される。複数の実施形態では、使用者は、所望のＴＮＣに基づき、接種モード（加工進行モード又は接種目標設定モード）をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、条件数、反復回数（形質導入法に基づく）、インキュベーション容量（形質導入接種容量に基づく）をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、全サンプリング容量、及びＡＡＡ／フローサイトメトリー容量をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、これらのパラメータを、リアルタイムで、又は、例えば、図１７に示される通り、方法２００のシステム１０の開始の前に、使用者により設定されるスクリプトの一部として入力するように促される場合がある。複数の実施形態では、使用者は、条件インプットの数に基づき、ワークテーブル６０を、サンプリングプレート及び接種プレートと共に設置するように促される。サンプリングプレートは、９６ウェル深型プレート、９６ウェル低付着性プレート（細胞カウンティング）、及び９６ウェル丸底プレート（ＡＡＡ／フローサイトメトリー）を含む。
[0244]ワークテーブル６０の設置が完了したら、制御システム２０により、サンプリングが開始される。プレートを開蓋する。反復回数＝２である場合、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、反復ウェルを、単一のウェルへと組み合わせるように進む。次いで、組み合わされた各試料ウェルを混合し、試料ごとに全サンプリング容量を吸引し、９６ウェル深型プレートへと分注する。プレートを、再度閉蓋する。次いで、分注されたサンプリング容量を混合し、細胞カウンティングプレート及び解析用試料プレート（例えば、ＡＡＡ／フローサイトメトリープレート）へとアリコート分割した。複数の実施形態では、次いで、条件インプットの数に従い、細胞カウンティング試薬を、低付着性細胞カウンティングプレートへと分注する。ある特定の実施形態では、サンプリングプレートについての細胞カウントを、細胞カウンティングモジュール７５により、自動的に読み取る。他の実施形態では、次いで、サンプリングプレートは、使用者の手に届きやすいように、ワークテーブル６０の前方へと持ち運ばれ、次いで、手作業による細胞カウンティングのために、使用者により、ワークテーブル６０から取り出される。細胞濃度の測定値は、システムコントローラー２０により、細胞カウンティングモジュール７５から、自動的に得られる場合もあり、使用者により、手作業で入力されて得られる場合もある。
[00245]サンプリングが完了したら、制御システム２０により、接種を開始する。接種目標設定を選択する場合、使用者は、測定ＶＣＣ、所望の接種ＴＮＣ、及び所望の接種ＶＣＣをインプットするように促される。現在値ＶＣＣに基づき、目標ＴＮＣに到達するのに要求される細胞容量、及び所望の接種ＶＣＣに到達するのに要求されるバランス培地容量を計算する。加工進行を選択する場合、使用者は、ＶＣＣ測定値をインプットするように促されず、直接接種を進めることができる。次いで、使用者のインプットに基づき、使用者は、条件インプットの数に従い、「ｎ」枚の２４ウェル深型拡大プレートを置くように促される。容器操作モジュール５０は、両方の拡大プレートを開蓋し、次いで、使用者のインプットに従い、いずれかの要求される拡大細胞素材を、接種ＴＮＣ含量、又は全拡大プレート含量に到達するように分注する。可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、これに続き、３ｍＬの最終接種容量に到達するように、細胞培養バランス培地を、条件ごとに、２４ウェル深型拡大プレートの各ウェルへと分注する。離心フィンガー５２を使用する、容器操作モジュール５０は、ワークテーブル６０における、全ての２４ウェル深型拡大プレートを閉蓋する。複数の実施形態では、プレートを、接種のために、哺乳動物細胞用インキュベーターへと自動的に移す。複数の実施形態では、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから自動的に取り出す。複数の実施形態では、使用者は、接種のために、プレートを、インキュベーターに入れるように促される。複数の実施形態では、使用者は、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから取り出すように促される。次いで、使用者は、残りの実験機器全てを、ワークテーブル６０から取り出すように促される。
拡大ユニットオペレーション
[00247]図１７を参照しながら述べると、接種ユニットオペレーション２３０が完結したら、制御システムは、拡大ユニットオペレーション２４０を開始する。複数の実施形態では、接種ユニットオペレーション２３０と、拡大ユニットオペレーション２４０とは、実施されるスケールダウンプロセスに基づき、インキュベーション時間、例えば、約１日間～約３日間の間隔てられる。拡大ユニットオペレーション２４０は、ワークテーブルの設置で始まる。複数の実施形態では、使用者は、ワークテーブル６０を、ＤｉＴｉ、試薬トラフ、細胞培養培地、細胞カウンティング試薬と共に設置するように促される。使用者は、２４ウェル深型バランス拡大プレートを、ワークテーブル６０に置くように促される。２４ウェル深型バランス拡大プレートは、細胞の遠心分離のために使用される。複数の実施形態では、使用者は、条件数及び拡大容量をインプットするように促される。使用者は、全サンプリング容量、及びＡＡＡ／フローサイトメトリー容量をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、条件インプットの数に基づき、ワークテーブル６０を、サンプリングプレート、及び「ｎ」枚の２４ウェル深型拡大プレートと共に設置するように促される。サンプリングプレートは、９６ウェル深型プレート、９６ウェル低付着性プレート（細胞カウンティング）、及び９６ウェル丸底プレート（ＡＡＡ／フローサイトメトリー）を含む。一部の例では、上述のステップのうちの１つ又は複数は、本開示の範囲から逸脱しない限りにおいて、自動的に実施されうる。
[00248]ワークテーブル６０の設置が完了したら、制御システム２０により、サンプリングが開始される。拡大プレートを開蓋し、次いで、試料ごとに全試料容量を吸引し、９６ウェル深型プレートへと分注する。容器操作モジュール５０を使用して、拡大プレートを、再度閉蓋する。次いで、分注されたサンプリング容量を混合し、細胞カウンティングプレート及びＡＡＡ／フローサイトメトリープレートへとアリコート分割した。次いで、条件インプットの数に従い、細胞カウンティング試薬を、低付着性細胞カウンティングプレートへと分注する。ある特定の実施形態では、サンプリングプレートについての細胞カウントを、細胞カウンティングモジュール７５により、自動的に読み取る。他の実施形態では、次いで、サンプリングプレートは、使用者の手に届きやすいように、ワークテーブル６０の前方へと持ち運ばれ、次いで、手作業による細胞カウンティングのために、使用者により、ワークテーブル６０から取り出される。細胞濃度の測定値は、システムコントローラー２０により、細胞カウンティングモジュール７５から、自動的に得られる場合もあり、使用者により、手作業で入力されて得られる場合もある。現行の拡大法は、方法が、細胞カウントから独立に進行することが可能とされる（例えば、システムは、細胞カウントから独立に、プロセスを進めることができる）ように、条件ごとに測定されたＶＣＣを使用する。
[00249]サンプリングが完了したら、制御システム２０により、ｍｏｃｋ灌流／細胞培養培地交換を開始する。向心フィンガー５４を使用する、容器操作モジュール５０は、拡大プレート及びそのバランスプレート（２４ウェル深型遠心分離機用プレートのうち、奇数番号を伴うプレートだけ）を、垂直方向に、ロボット遠心分離機６５へと移送する。遠心分離後、容器操作モジュール５０は、２４ウェル深型遠心分離機用プレートを、ワークテーブル６０へと戻す。ＦＥＳを使用して、容器操作モジュール５０向心フィンガー５４を、離心フィンガー５２で置きかえ、拡大プレートを開蓋する。次いで、ＦＣＡなど、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、細胞ペレットを、下方に取りのけずに、拡大容量細胞培養物上清の画分を除去することができる。これは、条件インプットの数に従い、ウェルごとに実施される。ＦＣＡなど、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、これに続き、最終拡大容量インプットに到達するように、条件ごとに、新鮮な細胞培養培地を、２４ウェル深型拡大プレートの各ウェルへと分注する。離心フィンガー５２を使用する、容器操作モジュール５０は、ワークテーブル６０における、全ての２４ウェル深型拡大プレートを閉蓋する。複数の実施形態では、プレートを、哺乳動物細胞用インキュベーターへと自動的に移す。複数の実施形態では、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから自動的に取り出す。複数の実施形態では、使用者は、プレートを、インキュベーターに入れるように促される。複数の実施形態では、使用者は、残りの実験機器全てを、ワークテーブルから取り出すように促される。次いで、使用者は、残りの実験機器全てを、ワークテーブル６０から取り出すように促される。
[00250]下記で明示される拡大法は、一度に、最大で１９２の条件で、システムを試行するように構成される。この方法は、サンプリングステップ及びｍｏｃｋ灌流ステップを実施する。ある特定の実施形態では、ｍｏｃｋ灌流は、拡大プレートの遠心分離に続く、培地交換により実行する。ある特定の実施形態では、細胞継代戦略は、条件ウェルごとに、ＶＣＣに基づき規定される。
[00251]一部の実施形態では、細胞は、増殖及び／又は拡大を促進する条件下で増殖させられる。一部の実施形態では、このような条件は、集団における細胞の増殖、拡大、活性化、及び／又は生存を誘導するようにデザインされうる。特定の実施形態では、活性化条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、薬剤、例えば、栄養物、アミノ酸、抗生剤、イオン、並びに／又はサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、並びに細胞の増殖、分裂、及び／又は拡大を促進するようにデザインされた他の任意の薬剤などの刺激因子のうちの１つ又は複数を含みうる。
[00252]一部の実施形態では、増殖は、一般に、ヒトＴリンパ球など、初代免疫細胞の増殖に適する温度、例えば、少なくともおよそ摂氏２５度、一般に、少なくとも約３０度を含み、一般に、摂氏３７度、又はおよそ摂氏３７度を含む条件下で実施される。一部の実施形態では、Ｔ細胞エンリッチ組成物を、３０～３７℃、例えば、３７℃±２℃、又は約３７℃±２℃など、２５～３８℃の温度でインキュベートする。一部の実施形態では、インキュベーションは、培養、例えば、増殖又は拡大が、所望の細胞の密度、数、若しくは遺伝子量、又はこれらの閾値を結果としてもたらすまでの時間にわたり実行される。一部の実施形態では、インキュベーションは、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、若しくはこれを超える時間を超えるか、若しくはおよそこれらの時間を超えるか、又はおよそこれらの時間にわたるか、若しくはこれらの時間にわたる。
[00253]一部の実施形態では、活性化試薬は、増殖の前に、細胞から除去及び／又は分離される。一部の実施形態では、活性化試薬は、活性化単位手順において記載された活性化試薬である。一部の実施形態では、活性化試薬は、増殖の後で、又は増殖時に、細胞から除去及び／又は分離される。
[00254]特定の実施形態では、細胞を１つ又は複数のサイトカインの存在下で増殖させる。ある特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、組換えサイトカインである。特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、ヒト組換えサイトカインである。ある特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、Ｔ細胞により発現される受容体、及び／又はＴ細胞に内因性である受容体に結合する、及び／又はこれへの結合が可能である。特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーであるか、又はこれらを含む。一部の実施形態では、サイトカインの４－アルファ－ヘリックスバンドルファミリーのメンバーは、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、ＩＬ－１５であるか、又はこれを含む。特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、ＩＬ－７であるか、又はこれを含む。特定の実施形態では、１つ又は複数のサイトカインは、組換えＩＬ－２であるか、又はこれを含む。
[00255]一部の実施形態では、増殖は、細胞が、閾値量、密度、及び／又は拡大を達成するために要求される量の時間にわたり実施される。一部の実施形態では、増殖は、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１週間、２週間、３週間、若しくは４週間、又はおよそこれらの時間、又はこれら未満の時間にわたり実施される。
ビーズ分離ユニットオペレーション
[00257]図１７を参照しながら述べると、拡大ユニットオペレーション２４０が完結したら、制御システムは、ビーズ分離ユニットオペレーション２５０を開始する。ビーズ分離ユニットオペレーション２５０は、ワークテーブルの設置で始まる。複数の実施形態では、使用者は、ワークテーブル６０を、ＤｉＴｉ、試薬トラフ、細胞培養培地、細胞カウンティング試薬と共に設置する促される。複数の実施形態では、使用者は、スカートマグネットを、ワークテーブル６０に置くように促される。複数の実施形態では、使用者は、条件数及び拡大容量をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、全サンプリング容量、及びＡＡＡ／フローサイトメトリー容量などの解析用試料容量をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者はまた、ビーズ分離ステップの後で、第２のサンプリングステップが所望されるのかどうかをインプットするようにも促される。複数の実施形態では、使用者は、条件インプットの数に基づき、ワークテーブル６０を、サンプリングプレート、及び「ｎ」枚の２４ウェル深型拡大プレートと共に設置するように促される。サンプリングプレートは、９６ウェル深型プレート、９６ウェル低付着性プレート（細胞カウンティング）、及び９６ウェル丸底プレート（解析用試料プレート、例えば、ＡＡＡ／フローサイトメトリー試料プレート）を含む。一部の例では、上述のステップのうちの１つ又は複数は、本開示の範囲から逸脱しない限りにおいて、自動的に実施されうる。
[00258]ワークテーブル６０設置モジュールが完了したら、制御システム２０により、サンプリングが開始される。拡大プレートを開蓋し、次いで、試料ごとに全試料容量を吸引し、９６ウェル深型プレートへと分注する。拡大プレートを、再度閉蓋する。次いで、分注されたサンプリング容量を混合し、細胞カウンティングプレート及びＡＡＡ／フローサイトメトリープレートへとアリコート分割した。次いで、条件インプットの数に従い、細胞カウンティング試薬を、低付着性細胞カウンティングプレートへと分注する。ある特定の実施形態では、サンプリングプレートについての細胞カウントを、細胞カウンティングモジュール７５により、自動的に読み取る。他の実施形態では、次いで、サンプリングプレートは、使用者の手に届きやすいように、ワークテーブル６０の前方へと持ち運ばれ、次いで、手作業による細胞カウンティングのために、使用者により、ワークテーブル６０から取り出される。細胞濃度の測定値は、システムコントローラー２０により、細胞カウンティングモジュール７５から、自動的に得られる場合もあり、使用者により、手作業で入力されて得られる場合もある。ビーズにより分離する方法は、条件ごとに測定されたＶＣＣを、ＦＩＯとして使用し、したがって、方法は、細胞カウントから独立に進行することが可能とされる。
[00259]サンプリングが完了したら、制御システム２０により、ビーズ分離ステップを開始する。複数の実施形態では、使用者は、条件インプットの数に基づき、「ｎ」枚の、未使用の２４ウェル深型拡大プレートを、ワークテーブル６０に置くように促される。離心フィンガー５２を使用する、容器操作モジュール５０は、元の２４ウェル深型拡大プレート、及び新たな２４ウェル深型拡大プレートを開蓋する。ＦＥＳを使用して、容器操作モジュール５０は、離心フィンガー５２を、向心フィンガーに置きかえ、元の拡大プレートを、スカートマグネットに置くように進む。方法は、ビーズ分離ステップが生じることを可能とするように、５分間にわたり休止する。次いで、可撓性のリキッドハンドリングモジュール４０は、ビーズ分離生成物を吸引し、これを、未使用の２４ウェル深型拡大プレートへと分注する。吸引は、下方のビーズペレットを破壊しないように、いくらかの補正をかけて行う。離心フィンガー５２を使用する、ＲＧＡなどの容器操作モジュール５０は、全ての２４ウェル深型拡大プレートを再度閉蓋する。
[00260]ビーズ分離ステップが完了したら、制御システム２０により、第２のサンプリングが開始される。次いで、使用者は、全ての実験機器を、ワークテーブル６０から取り出し、採取又は接種のために準備するように促される。
[00261]ビーズ分離ユニットプロセス２５０は、接種の前にＴ細胞の加工、及び採取の前におけるＴ細胞の加工の両方に適用可能である。ここで、２４ウェル深型拡大プレートを、デッキに置き、サンプリングし、カウントし、オンデッキの磁石に置き、２４深型ウェル拡大プレートへと移す。ビーズ分離は、方法の実行に要求されるワークテーブル６０の差違のために、採取又は接種とは独立の方法である。この方法は、２つのサンプリングステップを可能とする。一方は、ビーズ分離ステップの前であり、他方は、ビーズ分離ステップの直後である。第２のサンプリングステップは、２つの目的で用いられる。第１の目的は、ビーズ分離ステップによる細胞収量の使用者決定を可能とすることであり、他の目的は、採取方法プロセスに情報を与えるのに使用される、ビーズ分離ステップ後の細胞測定値を更新することである。
採取ユニットオペレーション
[00263]ビーズ分離ユニットオペレーション２５０が完結したら、制御システムは、採取ユニットオペレーション２６０を開始する。
[00264]採取ユニットオペレーション２６０は、ワークテーブルの設置で始まる。複数の実施形態では、使用者は、ワークテーブルを、ＤｉＴｉ、試薬トラフ、及び凍結保存培地と共に設置するように促される。一部の実施形態では、ワークテーブルはまた、記載される方法における使用の前に、試薬を冷却する、冷却デバイス６１も含む。冷却デバイス６１は、熱電冷却器、冷媒に依拠する冷却器、絶縁ゲル又は他の絶縁素材に依拠する冷却器、とりわけ、液体窒素、ドライアイス、及び／又は氷のうちの１つ又は複数を伴う使用のための冷却器でありうる。複数の実施形態では、使用者は、２４ウェル深型バランス拡大プレートを、ワークテーブル６０に置くように促される。２４ウェル深型拡大バランスプレートは、細胞の遠心分離のために使用される。複数の実施形態では、使用者は、条件数、拡大培養容量、及びビーズ分離サンプリング容量をインプットするように促される。複数の実施形態では、使用者は、条件ごとに、ＶＣＣ及び凍結保存されるバイアルの数を、採取についてのエクセルワークブックへとインプットするように促される。クライオバイアルごとに、現在値ＶＣＣ、並びに所望のＶＣＣ及びＴＮＣに基づき、要求されるビーズ分離生成物容量及び凍結保存培地を計算する。条件ごとのバイアル数は、解析用検査のための反復バイアルとして用いられる。複数の実施形態では、使用者は、インプットに従い、開栓クライオバイアルのセット数を追加することにより、ワークテーブル６０を設置するように促される。複数の実施形態では、次いで、使用者は、それらのビーズ分離生成物プレートを、ワークテーブル６０に置くように促される。
[00265]ワークテーブル６０の設置が完了したら、制御システム２０により、細胞試料の凍結保存を開始する。向心フィンガー５４を伴う、容器操作モジュール５０は、拡大プレート及びそのバランスプレートを、垂直方向に、ロボット遠心分離機６５へと移送する。遠心分離後、ビーズ分離生成物プレートを、ワークテーブル６０へと戻す。容器操作モジュール５０は、ビーズ分離生成物プレートを開蓋するのに続き、条件ウェルごとに、ＦＣＡなど、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０による上清の吸引を行う。吸引は、細胞ペレットが攪乱されないことを確保するように、ウェル補正を伴う低減速度で実施される。フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、インプットとして所望される凍結保存ＶＣＣに到達するのに要求される、バランス凍結保存用培地容量を分注する。ＦＣＡなど、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、これに続き、条件インプットの数に従い、可変容量の凍結保存培地を、ビーズ分離生成物プレートの各ウェルへと分注する。次いで、ＦＣＡなど、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、２つの混合サイクルを実施して、凍結保存培地と、ペレット化細胞との混合の完了を確保する。次いで、フレキシブルリキッドハンドリングモジュール４０は、所望のＶＣＣインプットを満たすのに要求される、クライオバイアルごとに所望のＴＮＣを吸引する。各条件について、条件ごとに割り当てられたクライオバイアルの数に基づき、細胞を、クライオバイアルへと分注する。チューブ用フィンガー５６を使用する、容器操作モジュール５０は、インプットとして要求される、全クライオバイアルに基づき、クライオバイアルの各々を閉栓する。複数の実施形態では、次いで、使用者は、クライオバイアルを、細胞冷凍容器又は速度制御型冷凍機（ＣＲＦ）に入れるように促される。離心フィンガー５２を伴う、容器操作モジュール５０は、ビーズ分離生成物プレートを再度閉蓋し、使用者に、全ての実験機器を、ワークテーブル６０から取り出すように促す。
[00266]現在のところ、記載される採取法は、一度に、最大で２４の細胞培養条件を加工し、最大で９６のバイアルを凍結保存する。ビーズ分離法において測定されるＶＣＣに基づき、使用者は、細胞を、所望の細胞密度で凍結保存することが可能である。
組換えタンパク質
[00268]複数の実施形態では、本明細書で開示される方法及びシステムは、組換え受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ））などの組換えタンパク質を含有するか、若しくは発現させる、又はこれらを含有するか、若しくは発現させるように操作されたＴ細胞、例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋ Ｔ細胞などの細胞を作製するのに使用される。ある特定の実施形態では、本明細書で提示される方法は、組換えタンパク質を発現させるか、又は含有するように操作された細胞を含有する、及び／又はこれについてエンリッチされた細胞、若しくは細胞集団、又は組成物を作製する、及び／又はこれらを作製することが可能である。
[00269]細胞は、一般に、機能的な非ＴＣＲ抗原受容体（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））、及びトランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）など、他の抗原結合性受容体を含む抗原受容体などの組換え受容体を発現させる。他のキメラ受容体もまた、受容体に含まれる。
キメラ抗原受容体
[00271]提供される方法及び使用についての一部の実施形態では、キメラ抗原受容体などのキメラ受容体は、所望の抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する特異性をもたらす、リガンド結合性ドメイン（例えば、抗体又は抗体断片）を、細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせる、１つ又は複数のドメインを含有する。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞を活性化ドメインなどの活性化細胞内ドメイン部分であり、一次活性化シグナルをもたらす。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能を促進する、共刺激シグナル伝達ドメインを含有するか、又はこれを加えて含有する。一部の実施形態では、免疫細胞へと遺伝子操作されたキメラ受容体は、Ｔ細胞活性をモジュレートし、場合によって、Ｔ細胞の分化又はホメオスタシスをモジュレートすることが可能であり、これにより、養子細胞療法における使用などのための、寿命、生存、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏにおける存続が改善された、遺伝子操作細胞を結果としてもたらす。
[00272]ＣＡＲを含む、例示的抗原受容体、並びにこのような受容体を、細胞へと操作及び導入するための方法は、例えば、国際公開第２０００１４２５７号、国際公開第２０１３１２６７２６号、国際公開第２０１２／１２９５１４号、国際公開第２０１４０３１６８７号、国際公開第２０１３／１６６３２１号、国際公開第２０１３／０７１１５４号、国際公開第２０１３／１２３０６１号、米国特許出願第２００２１３１９６０号、同第２０１３２８７７４８号、同第２０１３０１４９３３７号、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号、及び同第８，４７９，１１８号、及び欧州特許出願第２５３７４１６号において記載されている細胞、並びに／又はＳａｄｅｌａｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．、２０１３年４月、３（４）：３８８～３９８；Ｄａｖｉｌａら（２０１３）、ＰＬｏＳ ＯＮＥ、８（４）：ｅ６１３３８；Ｔｕｒｔｌｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年１０月、２４（５）：６３３～３９；Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ、２０１２年３月、１８（２）：１６０～７５により記載されている細胞を含む。一部の態様では、抗原受容体は、米国特許第７，４４６，１９０号において記載されているＣＡＲ、及び国際公開第２０１４０５５６６８号において記載されているＣＡＲを含む。ＣＡＲの例は、国際公開第２０１４０３１６８７号、米国特許第８，３３９，６４５号、米国特許第７，４４６，１７９号、米国特許出願第２０１３／０１４９３３７号、米国特許第７，４４６，１９０号、米国特許第８，３８９，２８２号、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒら、２０１３、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１０、２６７～２７６（２０１３）；Ｗａｎｇら（２０１２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５（９）：６８９～７０１；及びＢｒｅｎｔｊｅｎｓら、Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．、２０１３、５（１７７）など、前述の刊行物のうちのいずれかにおいて開示されているＣＡＲを含む。国際公開第２０１４０３１６８７号、米国特許第８，３３９，６４５号、米国特許第７，４４６，１７９号、米国特許出願第２０１３／０１４９３３７号、米国特許第７，４４６，１９０号、及び米国特許第８，３８９，２８２号もまた参照されたい。
[00273]ＣＡＲなどのキメラ受容体は、一般に、抗体分子の一部など、細胞外抗原結合性ドメイン、一般に、抗体の可変重（ＶＨ）鎖領域及び／又は可変軽（ＶＬ）鎖領域（例えば、ｓｃＦｖ抗体断片）を含む。
[00274]一部の実施形態では、受容体によりターゲティングされる抗原は、ポリペプチドである。一部の実施形態では、抗原は、炭水化物又は他の分子である。一部の実施形態では、抗原は、疾患又は状態を有する細胞、例えば、腫瘍細胞又は病原性細胞において、正常細胞若しくは非ターゲティング細胞、又は正常組織若しくは非ターゲティング組織と比較して選択的に発現されるか、又は過剰発現される。他の実施形態では、抗原は、正常細胞において発現される、及び／又は操作細胞において発現される。
[00275]一部の実施形態では、受容体によりターゲティングされる抗原は、多数の公知のＢ細胞マーカーのうちのいずれかなど、Ｂ細胞悪性腫瘍と関連する抗原を含む。一部の実施形態では、受容体によりターゲティングされる抗原は、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ２１、ＣＤ５、ＣＤ３３、Ｉｇカッパ、Ｉｇラムダ、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ３０である。
[00276]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、抗体又は抗体断片を含有する細胞外部分を含む。一部の態様では、キメラ抗原受容体は、抗体又は断片、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する細胞外部分を含む。一部の実施形態では、抗体又は断片は、ｓｃＦｖを含む。
[00277]一部の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の抗体部分は、ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ領域）、及び／又はＣＨ１／ＣＬ領域、及び／又はＦｃ領域など、免疫グロブリン定常領域のうちの少なくとも一部をさらに含む。一部の実施形態では、定常領域又は定常部分は、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１など、ヒトＩｇＧの定常領域又は定常部分である。一部の態様では、定常領域の一部は、抗原認識構成要素（例えば、ｓｃＦｖ）と、膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として用いられる。スペーサーは、抗原への結合後における、細胞の応答性の、スペーサーの非存在下と比較した増大をもたらす長さのスペーサーでありうる。例示的スペーサーは、Ｈｕｄｅｃｅｋら（２０１３）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９：３１５３、国際特許出願公開第２０１４０３１６８７号、米国特許第８，８２２，６４７号、又は米国出願公開第２０１４／０２７１６３５号において記載されているスペーサーを含むがこれらに限定されない。
[00278]一部の実施形態では、定常領域又は定常部分は、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１など、ヒトＩｇＧの定常領域又は定常部分である。
[00279]一部の実施形態では、抗原受容体は、細胞外ドメインへと、直接的に、又は間接的に連結された細胞内ドメインを含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。例えば、一部の態様では、抗原認識ドメイン（例えば、細胞外ドメイン）は、一般に、ＣＡＲの場合におけるＴＣＲ複合体などの抗原受容体複合体を介する活性化、及び／又は別の細胞表面受容体を介するシグナルを模倣するシグナル伝達構成要素など、１つ又は複数の細胞内シグナル伝達構成要素へと連結される。一部の実施形態では、キメラ受容体は、細胞外ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と、細胞内シグナル伝達ドメインとの間で、連結されるか、又は融合された膜貫通ドメインを含む。こうして、一部の実施形態では、抗原結合性構成要素（例えば、抗体）は、１つ又は複数の膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインへと連結される。
[00280]一実施形態では、天然において、受容体、例えば、ＣＡＲにおけるドメインのうちの１つと関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の場合に、このようなドメインの、同じ表面膜タンパク質、又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するように、膜貫通ドメインを選択するか、又はアミノ酸置換により修飾する。
[00281]一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、合成の供給源に由来する場合もある。一部の態様では、供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４に由来する膜貫通領域を含む（すなわち、これらのうちの、少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む）。代替的に、一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の膜貫通ドメインである。一部の態様では、合成の膜貫通ドメインは、主に、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。一部の態様では、合成膜貫通ドメインの各末端では、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットが見出される。一部の実施形態では、連結は、リンカー、スペーサー、及び／又は膜貫通ドメイン（複数可）による連結である。一部の態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通部分を含有する。
[00282]一部の実施形態では、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとは、直接的に連結される場合もあり、間接的に連結される場合もある。一部の実施形態では、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとは、本明細書で記載される任意のスペーサーなどのスペーサーにより連結される。一部の実施形態では、受容体は、ＣＤ２８の細胞外部分など、膜貫通ドメインが由来する分子の細胞外部分を含有する。
[00283]細胞内シグナル伝達ドメインの中には、天然の抗原受容体を介するシグナル、共刺激受容体と組み合わせた、このような受容体のシグナル、及び／又は共刺激受容体単独を介するシグナルを模倣するか、又はこれに近似する細胞内シグナル伝達ドメインが含まれる。一部の実施形態では、短いオリゴペプチドリンカー又はポリペプチドリンカー、グリシン及びセリンを含有するリンカー、例えば、グリシン－セリンダブレットなど、例えば、２～１０アミノ酸の間の長さのリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間に存在し、連結を形成する。
[00284]一部の態様では、Ｔ細胞の活性化は、細胞質シグナル伝達配列の２つのクラス：ＴＣＲを介する抗原依存性一次活性化（一次細胞質シグナル伝達配列）を誘発する細胞質シグナル伝達配列、及び抗原非依存的に作用して、二次シグナル又は共刺激シグナルをもたらす細胞質シグナル伝達配列（二次細胞質シグナル伝達配列）により媒介されると記載される。一部の態様では、ＣＡＲは、このようなシグナル伝達構成要素の一方又は両方を含む。
[0285]受容体（例えば、ＣＡＲ）は、一般に、少なくとも１つの細胞内シグナル伝達構成要素を含む。一部の態様では、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する、一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激性に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含有しうる。一次細胞質シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例は、ＣＤ３ゼータ鎖、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、及びＣＤ３イプシロンに由来するＩＴＡＭを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲにおける細胞質シグナル伝達分子（複数可）は、ＣＤ３ゼータに由来する細胞質シグナル伝達ドメイン、その部分、又はＣＤ３ゼータに由来する配列を含有する。
[00286]一部の実施形態では、受容体は、Ｔ細胞の活性化及び細胞傷害作用（例えば、ＣＤ３ゼータ鎖）を媒介するＴＣＲ ＣＤ３鎖など、ＴＣＲ複合体の細胞内構成要素を含む。したがって、一部の態様では、抗原結合性部分は、１つ又は複数の細胞シグナル伝達モジュールへと連結される。一部の実施形態では、細胞シグナル伝達モジュールは、ＣＤ３膜貫通ドメイン、ＣＤ３細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／又は他のＣＤ３膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、受容体（例えば、ＣＡＲ）は、Ｆｃ受容体、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、又はＣＤ１６など、１つ又は複数のさらなる分子の部分をさらに含む。例えば、一部の態様では、ＣＡＲ、又は他のキメラ受容体は、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）又はＦｃ受容体と、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５、又はＣＤ１６とのキメラ分子を含む。
[00287]一部の実施形態では、ＣＡＲ又は他のキメラ受容体がライゲーションされると、受容体の細胞質ドメイン又は細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞（例えば、ＣＡＲを発現させるように操作されたＴ細胞）の正常なエフェクター機能又は応答のうちの少なくとも１つを活性化させる。例えば、一部の文脈では、ＣＡＲは、細胞傷害活性、又はサイトカイン若しくは他の因子の分泌などのヘルパーＴ活性など、Ｔ細胞の機能を誘導する。一部の実施形態では、例えば、エフェクター機能シグナルを伝達する場合、抗原受容体構成要素の細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分、又は共刺激分子が、無傷免疫刺激鎖の代わりに使用される。一部の実施形態では、１つ又は複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞質配列を含み、一部の態様ではまた、天然の文脈では、抗原受容体の係合の後に、このような受容体と協同的に作用して、シグナル伝達を誘発する、共受容体の細胞質配列も含む。
[00288]天然ＴＣＲの文脈では、完全な活性化は、一般に、ＴＣＲを介するシグナル伝達だけでなく、また、共刺激シグナルも要求する。こうして、一部の実施形態では、完全な活性化を促進するために、二次シグナル又は共刺激シグナルを発生させるための構成要素もまた、ＣＡＲに含まれる。他の実施形態では、ＣＡＲは、共刺激シグナルを発生させるための構成要素を含まない。一部の態様では、さらなるＣＡＲは、同じ細胞において発現され、二次シグナル又は共刺激シグナルを発生させるための構成要素をもたらす。
[00289]一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、及びＩＣＯＳなど、共刺激受容体のシグナル伝達ドメイン及び／又は膜貫通部分を含む。一部の態様では、同じＣＡＲは、活性化構成要素及び共刺激構成要素の両方を含む。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は、Ｔ細胞共刺激分子又はその機能的バリアントに由来する細胞内ドメインを、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとの間などに含有する。一部の態様では、Ｔ細胞共刺激分子は、ＣＤ２８又は４１ＢＢである。
[00290]一部の実施形態では、活性化ドメインが、１つのＣＡＲ内に含まれるのに対し、共刺激構成要素は、別の抗原を認識する、別のＣＡＲによりもたらされる。一部の実施形態では、ＣＡＲは、両方が同じ細胞において発現される、活性化ＣＡＲ又は刺激ＣＡＲ、共刺激ＣＡＲを含む（国際公開第２０１４／０５５６６８号を参照されたい）。一部の態様では、細胞は、１つ又は複数の刺激ＣＡＲ若しくは活性化ＣＡＲ、及び／又は共刺激ＣＡＲを含む。一部の実施形態では、細胞は、疾患若しくは状態と関連する抗原、及び／又は疾患若しくは状態に特異的な抗原以外の抗原を認識するＣＡＲなどの、阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ；Ｆｅｄｏｒｏｖら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５（２１５）（２０１３年１２月）を参照されたい）であって、阻害性ＣＡＲの、そのリガンドへの結合により、疾患ターゲティングＣＡＲを介して送達される活性化シグナルが減弱されるか、又は阻害される（例えば、オフターゲット効果を低減する）阻害性ＣＡＲをさらに含む。
[00291]ある特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ゼータ）細胞内ドメインへと連結された、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインへと連結された、ＣＤ２８／ＣＤ１３７（４－１ＢＢ、ＴＮＦＲＳＦ９）キメラ共刺激ドメインを含む。
[00292]一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞質部分における、１つ又は複数の（例えば、２つ又はこれを超える）、共刺激ドメイン及び活性化ドメイン（例えば、一次活性化ドメイン）を包含する。例示的ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、及び４－１ＢＢの細胞内構成要素を含む。
[00293]一部の実施形態では、抗原受容体は、マーカーをさらに含む、及び／又はＣＡＲ若しくは他の抗原受容体を発現させる細胞は、受容体を発現させるような、細胞への形質導入又は細胞の操作を確認するのに使用されうる、細胞表面マーカーなどのサロゲートマーカーをさらに含む。一部の態様では、マーカーは、ＣＤ３４、ＮＧＦＲの全部若しくは一部（例えば、切断形態）、又はこのような細胞表面受容体の切断形（例えば、ｔＥＧＦＲ）などの増殖因子受容体を含む。一部の実施形態では、マーカーをコードする核酸は、切断可能リンカー配列、例えば、Ｔ２Ａなどのリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される。例えば、マーカー、及び、任意選択で、リンカー配列は、国際特許出願公開第２０１４０３１６８７号で開示されているいずれかのリンカー配列でありうる。例えば、マーカーは、任意選択で、Ｔ２Ａ切断可能リンカー配列などのリンカー配列へと連結された、切断型ＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）でありうる。
[00294]一部の実施形態では、マーカーは、天然では、Ｔ細胞に見出されないか、若しくは、天然では、Ｔ細胞の表面において見出されない分子（例えば、細胞表面タンパク質）、又はその部分である。
[00295]一部の実施形態では、分子は、非自己分子（例えば、非自己タンパク質）、すなわち、細胞が養子移入される宿主の免疫系により、「自己」として認識されない分子である。
[00296]一部の実施形態では、マーカーは、治療機能を果たさない、及び／又は遺伝子操作についてのマーカー、例えば、操作に成功した細胞を選択するためのマーカーとして使用されること以外の効果をもたらさない。他の実施形態では、マーカーは、養子移入時、及びリガンドとの会合時において、細胞の応答を増強する、及び／又は減衰させる、共刺激分子又は免疫チェックポイント分子など、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、細胞が会合するリガンドなど、治療用分子、又は、他の形で、何らかの所望の効果を及ぼす分子でありうる。
[00297]場合によって、ＣＡＲは、第１世代、第２世代、及び／又は第３世代のＣＡＲと称される。一部の態様では、第１世代のＣＡＲは、抗原への結合時に、ＣＤ３鎖により誘導されるシグナルだけをもたらすＣＡＲであり；一部の態様では、第２世代のＣＡＲは、ＣＤ２８又はＣＤ１３７などの共刺激受容体に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲなど、このようなシグナル及び共刺激シグナルをもたらすＣＡＲであり；一部の態様では、第３世代のＣＡＲは、異なる共刺激受容体の、複数の共刺激ドメインを含むＣＡＲである。
[00298]例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体、例えば、抗体断片、ＣＤ２８の膜貫通部分、又はその機能的バリアントであるか、又はこれを含有する膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８のシグナル伝達部分、又はその機能的バリアントと、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分、又はその機能的バリアントとを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体（例えば、抗体断片）、ＣＤ２８の膜貫通部分、又はその機能的バリアントであるか、又はこれを含有する膜貫通ドメイン、及び４－１ＢＢのシグナル伝達部分、又はその機能的バリアントと、ＣＤ３ゼータのシグナル伝達部分、又はその機能的バリアントとを含有する細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。一部のこのような実施形態では、受容体は、ヒンジだけのスペーサーなど、Ｉｇヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ）など、ヒトＩｇ分子など、Ｉｇ分子の部分を含有するスペーサーをさらに含む。
[00299]一部の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２８の膜貫通ドメイン（例えば、受託番号：Ｐ０１７４７．１）、又はそのバリアントであるか、又はこれらを含む。一部の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の細胞内シグナル伝達構成要素（複数可）は、天然ＣＤ２８タンパク質の１８６～１８７位において、ＬＬからＧＧへの置換を伴うドメインなど、ヒトＣＤ２８の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、又はその機能的バリアント若しくは部分を含有する。一部の実施形態では、細胞内ドメインは、４－１ＢＢ（受託番号：Ｑ０７０１１．１）の細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン、又はその機能的バリアント若しくは部分を含む。
[00300]一部の実施形態では、組換え受容体（例えば、ＣＡＲ）の細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３のアイソフォーム３の、１１２アミノ酸の細胞質ドメイン（受託番号：Ｐ２０９６３．２）、又は米国特許第７，４４６，１９０号、又は米国特許第８，９１１，９９３号において記載されている、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインなど、ヒトＣＤ３ゼータ刺激シグナル伝達ドメイン、又はその機能的バリアントを含む。
[00301]一部の態様では、スペーサーは、ヒンジだけのスペーサーなど、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１のヒンジだけなど、ＩｇＧのヒンジ領域だけを含有する。他の実施形態では、スペーサーは、任意選択で、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインへと連結された、Ｉｇヒンジ（例えば、ＩｇＧ４由来のヒンジ）であるか、又はこれを含有する。一部の実施形態では、スペーサーは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインへと連結された、Ｉｇヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ）である。一部の実施形態では、スペーサーは、ＣＨ３ドメインだけへと連結された、Ｉｇヒンジ（例えば、ＩｇＧ４ヒンジ）である。一部の実施形態では、スペーサーは、グリシン－セリンリッチ配列、又は公知の可撓性リンカーなど、他の可撓性リンカーであるか、又はこれらを含む。
[00302]例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体断片などの抗体、Ｉｇヒンジを含有するスペーサーなど、ヒンジ領域及び／又は重鎖分子の１つ若しくは複数の定常領域など、免疫グロブリン分子の一部を含有するスペーサー、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８由来の細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインの全部又は一部を含有する膜貫通ドメインなどのスペーサーを含む。一部の実施形態では、ＣＡＲは、抗体又はｓｃＦｖなどの断片、Ｉｇヒンジを含有するスペーサー、ＣＤ２８由来の膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ由来の細胞内シグナル伝達ドメイン、及びＣＤ３ゼータ由来のシグナル伝達ドメインのうちのいずれかなどのスペーサーを含む。
[00303]一部の実施形態では、このようなＣＡＲ構築物をコードする核酸分子は、Ｔ２Ａリボソームスキップエレメント及び／又はｔＥＧＦＲ配列をコードする配列（例えば、ＣＡＲをコードする配列の下流に）をさらに含む。一部の実施形態では、抗原受容体（例えば、ＣＡＲ）を発現させるＴ細胞はまた、非免疫原性の選択用エピトープとしての切断型ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ）（例えば、同じ構築物から、２つのタンパク質を発現させる、Ｔ２Ａリボソームスイッチにより隔てられた、ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔをコードする構築物の導入により）を発現させるようにも作出することができ、次いで、このＥＧＦＲｔを、このような細胞を検出するマーカーとして使用することができる（例えば、米国特許第８，８０２，３７４号を参照されたい）。場合によって、Ｔ２Ａなどのペプチドは、リボソームに、２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップ（リボソームスキッピング）させ、２Ａ配列の末端と、下流における、次のペプチドとの間の分離をもたらしうる（例えば、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ．、２：１３（２００４）；及びｄｅ Ｆｅｌｉｐｅら、Ｔｒａｆｆｉｃ、５：６１６～６２６（２００４）を参照されたい）。多くの２Ａエレメントが公知である。本明細書で開示される方法及び核酸において使用されうる、２Ａ配列の例は、限定せずに述べると、米国特許公開第２００７０１１６６９０号において記載されている、口蹄疫ウイルス、Ａ型ウマ鼻炎ウイルス、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス、及び１型ブタテッショーウイルスに由来する２Ａ配列を含む。
[00304]対象へと投与される細胞により発現されるＣＡＲなどの組換え受容体は、一般に、処置される疾患若しくは状態、又はこれを有する細胞において発現される、これらと関連する、及び／又はこれらに特異的な分子を認識するか、又はこれに特異的に結合する。分子、例えば、抗原に特異的に結合すると、受容体は、一般に、ＩＴＡＭ伝達シグナルなどの免疫刺激シグナルを、細胞へと送達し、これにより、疾患又は状態へとターゲティングされた免疫応答を促進する。例えば、一部の実施形態では、細胞は、疾患若しくは状態を有する細胞若しくは組織、又は疾患若しくは状態と関連する細胞若しくは組織により発現される抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現させる。
ＴＣＲ
[00306]一部の実施形態では、腫瘍抗原、ウイルスタンパク質、又は自己免疫タンパク質などの標的ポリペプチドのペプチドエピトープ、又はＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はその抗原結合性部分を発現させる、Ｔ細胞などの操作細胞が提供される。
[00307]一部の実施形態では、「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」とは、ＣＤ３鎖分子との複合体の部分として発現される、１つ又は複数の可変α鎖及び可変β鎖を含有する分子である。少数のＴ細胞は、可変γ鎖及び可変δ鎖により形成される、代替的な受容体を発現させる。これらの鎖の中には、ＴＣＲが結合するＭＨＣ分子に結合している抗原を決定する相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。ＴＣＲは、抗原を認識すると、それが存在するＴ細胞を活性化させ、強力な免疫応答をもたらす。典型的に、ＴＣＲは、一般に、構造的に類似するが、それらを発現させるＴ細胞は、顕著に異なる解剖学的位置又は機能を有する場合がある。ＴＣＲは、細胞の表面に見出される場合もあり、可溶性形態の場合もある。一般に、ＴＣＲは、Ｔ細胞（又はＴリンパ球）の表面において見出され、一般に、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合している抗原の認識の一因をなす。
[00308]そうでないことが言明されない限りにおいて、「ＴＣＲ」という用語は、全ＴＣＲのほか、これらの抗原結合性部分又は抗原結合性断片を包摂するように理解されるものとする。一部の実施形態では、ＴＣＲは、αβ形態及びγδ形態のＴＣＲを含む、無傷ＴＣＲ又は全長ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、全長未満であるが、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するなど、ＭＨＣ分子に結合している特異的ペプチドに結合するＴＣＲである、抗原結合性部分である。場合によって、ＴＣＲの抗原結合性部分又は抗原結合性断片は、全長ＴＣＲ又は無傷ＴＣＲの構造ドメインの一部だけを含有しうるが、完全なＴＣＲが結合するＭＨＣ－ペプチド複合体など、ペプチドエピトープに結合することが可能である。場合によって、抗原結合性部分は、ＭＨＣ－ペプチド複合体への結合に特異的な結合性部位を形成するのに十分な、ＴＣＲの可変α鎖及び可変β鎖など、ＴＣＲの可変ドメインを含有する。一般に、ＴＣＲの可変鎖は、ペプチド、ＭＨＣ、及び／又はＭＨＣ－ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域を含有する。
[00309]一部の実施形態では、ＴＣＲの可変ドメインは、一般に、抗原認識、並びに結合能及び結合特異性に対する主要な寄与因子である、超可変ループ又は相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲ、又はその組合せは、所与のＴＣＲ分子の抗原結合性部位の全て又は実質的に全てを形成する。ＴＣＲ鎖の可変領域内の多様なＣＤＲは、一般に、フレームワーク領域（ＦＲ）により隔てられている。一般に、ＴＣＲ分子間で、ＣＤＲと比較して、それほどの可変性を提示しない（例えば、Ｊｏｒｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：９１３８、１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａら、ＥＭＢＯ Ｊ．、７：３７４５、１９８８を参照されたい；また、Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７：５５、２００３も参照されたい）。一部の実施形態では、ＣＤＲ３は、抗原への結合又は特異性の一因をなし、又は抗原認識、及び／又はペプチド－ＭＨＣ複合体の、プロセシングされたペプチド部分との相互作用のために、所与のＴＣＲ可変領域における３つのＣＤＲの間で最も重要である、主要なＣＤＲである。一部の文脈では、アルファ鎖のＣＤＲ１は、ある特定の抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用しうる。一部の文脈では、ベータ鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用しうる。一部の文脈では、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ－ペプチド複合体のＭＨＣ部分との相互作用、若しくはこの認識に最も強力に寄与するか、又はこれらの一因をなす、主要なＣＤＲである。一部の実施形態では、α鎖の可変領域は、一般に、スーパー抗原への結合に関与するが、抗原認識には関与しない、さらなる超可変領域（ＣＤＲ４又はＨＶＲ４）を含有しうる（Ｋｏｔｂ（１９９５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、８：４１１～４２６）。
[00310]一部の実施形態では、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／又は短い細胞質テール（例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ」、３版、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４頁：３３、１９９７を参照されたい）も含有しうる。一部の態様では、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端における短い細胞質テールを保有しうる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体の不変タンパク質と会合する。
[00311]一部の実施形態では、ＴＣＲ鎖は、１つ又は複数の定常ドメイン（複数可）を含有する。例えば、所与のＴＣＲ鎖（例えば、α鎖又はβ鎖）の細胞外部分は、可変ドメイン（例えば、Ｖα又はＶβ；典型的に、Ｋａｂａｔによる番号付けに基づく、アミノ酸１～１１６；Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、１９９１、５版）、及び細胞膜に隣接する（例えば、α鎖及び／又はβ鎖の定常ドメイン又はＣドメイン、典型的に、Ｋａｂａｔによる番号付けに基づく、α鎖の１１７～２５９位、又はβ鎖の定常ドメイン又はＣドメイン、典型的に、Ｋａｂａｔに基づく、β鎖の１１７～２９５位）など、２つの免疫グロブリン様ドメインを含有しうる。例えば、場合によって、２つの鎖により形成される、ＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜近位定常ドメインと、可変ドメインの各々が、ＣＤＲを含有する、２つの膜遠位可変ドメインとを含有する。ＴＣＲの定常ドメインは、システイン残基が、ジスルフィド結合を形成し、これにより、ＴＣＲの２つの鎖を連結する、短い接続配列を含有しうる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲが、定常ドメインにおいて、２つのジスルフィド結合を含有するように、定常ドメインの各々において、さらなるシステイン残基を有しうる。
[00312]一部の実施形態では、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含有する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、正に帯電している。場合によって、ＴＣＲ鎖は、細胞質テールを含有する。場合によって、構造は、ＴＣＲが、ＣＤ３及びそのサブユニットと同様に、他の分子と会合することを可能とする。例えば、膜貫通領域を伴う定常ドメインを含有するＴＣＲは、ＴＣＲタンパク質を細胞膜にアンカリングし、ＣＤ３シグナル伝達装置又はＣＤ３シグナル伝達複合体の不変サブユニットと会合しうる。ＣＤ３シグナル伝達サブユニット（例えば、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、ＣＤ３ε鎖、及びＣＤ３ε鎖）の細胞内テールは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に関与する、１つ又は複数の免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ又はＩＴＡＭを含有する。
[00313]一部の実施形態では、ＴＣＲは、２つの鎖のヘテロ二量体でありうる、及び／又はＴＣＲは、単鎖ＴＣＲ構築物でありうる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、１つ又は複数のジスルフィド結合などにより連結された、２つの個別の鎖を含有するヘテロ二量体である。
[00314]一部の実施形態では、ＴＣＲは、実質的な全長コード配列がたやすく利用可能な可変（Ｖ）鎖の配列など、公知のＴＣＲ配列（複数可）から作出されうる。Ｖ鎖配列を含む全長ＴＣＲ配列を、細胞供給源から得るための方法は周知である。一部の実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸は、１つ又は複数の所与の細胞内のＴＣＲコード核酸、若しくはこれらから単離されたＴＣＲコード核酸の、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅、又は公開されているＴＣＲ ＤＮＡ配列の合成などにより、様々な供給源から得られうる。
[00315]一部の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマ、又は他の公開供給源などの細胞など、生物学的供給源から得られる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて単離された細胞から得られうる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、胸腺選択ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ネオエピトープ拘束ＴＣＲである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマ又はクローンでありうる。一部の実施形態では、ＴＣＲ又はその抗原結合性部分若しくはその抗原結合性断片は、ＴＣＲの配列についての知見から、合成により作出されうる。
[00316]一部の実施形態では、ＴＣＲは、標的ポリペプチド抗原、又はその標的Ｔ細胞エピトープに対する、候補ＴＣＲについてのスクリーニングライブラリーから同定又は選択されるＴＣＲから作出される。ＴＣＲライブラリーは、ＰＢＭＣ、脾臓、又は他のリンパ器官に存在する細胞を含む、対象から単離されたＴ細胞からの、Ｖ鎖のレパートリーの増幅により作出されうる。場合によって、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から増幅されうる。一部の実施形態では、ＴＣＲライブラリーは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞から作出されうる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、正常対象又は健常対象のＴ細胞供給源、すなわち、正常ＴＣＲライブラリーから増幅されうる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、罹患対象のＴ細胞供給源、すなわち、罹患ＴＣＲライブラリーから増幅されうる。一部の実施形態では、ヒトから得られたＴ細胞など、試料におけるＲＴ－ＰＣＲなど、Ｖ鎖配列の遺伝子レパートリーを増幅するのに、縮重プライマーが使用される。一部の実施形態では、ｓｃＴｖライブラリーは、増幅産物が、リンカーにより隔てられるようにクローニング又はアセンブルされた、ナイーブＶ鎖ライブラリーからアセンブルされうる。対象及び細胞の供給源に応じて、ライブラリーは、ＨＬＡ対立遺伝子特異的でありうる。代替的に、一部の実施形態では、ＴＣＲライブラリーは、親ＴＣＲ分子又は土台ＴＣＲ分子の変異誘発又は多様化により作出されうる。一部の態様では、ＴＣＲは、例えば、α鎖又はβ鎖の変異誘発などによる指向性進化にかけられる。一部の態様では、ＴＣＲのＣＤＲ内の特定の残基は、変更される。一部の実施形態では、選択されたＴＣＲは、アフィニティー成熟により改変されうる。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ペプチドに対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性について評価するスクリーニングなどにより選択されうる。一部の態様では、ＴＣＲ（例えば、抗原特異的Ｔ細胞において存在する）は、結合活性（例えば、抗原に対する、特定のアフィニティー又はアビディティー）などにより選択されうる。
[00317]一部の実施形態では、ＴＣＲ又はその抗原結合性部分は、改変又は操作された、ＴＣＲ又はその抗原結合性部分である。一部の実施形態では、特異的ＭＨＣ－ペプチド複合体に対する高アフィニティーを伴うなど、所望の特性の変更がなされたＴＣＲを作出するのに、指向性進化法が使用される。一部の実施形態では、指向性進化は、酵母ディスプレイ（Ｈｏｌｌｅｒら（２００３）、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、４、５５～６２；Ｈｏｌｌｅｒら（２０００）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ、９７、５３８７～９２）、ファージディスプレイ（Ｌｉら（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２３、３４９～５４）、又はＴ細胞ディスプレイ（Ｃｈｅｒｖｉｎら（２００８）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、３３９、１７５～８４）を含むがこれらに限定されないディスプレイ法により達成される。一部の実施形態では、ディスプレイ法は、公知の親ＴＣＲ又は参照ＴＣＲを操作又は改変するステップを伴う。例えば、場合によって、野生型ＴＣＲは、ＣＤＲの１つ又は複数の残基が変異され、所望の標的抗原に対する高アフィニティーなど、所望の特性の変更がなされた変異体が選択される変異ＴＣＲをもたらすための鋳型として使用されうる。
[00318]一部の実施形態では、標的ポリペプチドのうちの、目的のＴＣＲの作製又は作出における使用のためのペプチドは、公知であるか、又はたやすく同定されうる。一部の実施形態では、ＴＣＲ又は抗原結合性部分の作出における使用に適するペプチドは、下記で記載される標的ポリペプチドなど、目的の標的ポリペプチドにおける、ＨＬＡ拘束モチーフの存在に基づき決定することができる。一部の実施形態では、ペプチドは、利用可能なコンピュータ予測モデルを使用して同定される。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ結合性部位を予測するために、このようなモデルは、ＰｒｏＰｒｅｄ１（Ｓｉｎｇｈ及びＲａｇｈａｖａ（２００１）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１７（１２）：１２３６～１２３７）、及びＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｓｃｈｕｌｅｒら（２００７）、Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４０９（１）：７５～９３、２００７を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＭＨＣ拘束エピトープは、全ての白色人種のうちの、約３９～４６％において発現され、したがって、ＴＣＲ又は他のＭＨＣ－ペプチド結合性分子の調製における使用に適するＭＨＣ抗原の選出しを表す、ＨＬＡ－Ａ０２０１である。
[00319]コンピュータ予測モデルを使用するプロテアソーム及びイムノプロテアソームのための、ＨＬＡ－Ａ０２０１の結合性モチーフ及び切断部位は公知である。ＭＨＣクラスＩ結合性部位を予測するために、このようなモデルは、ＰｒｏＰｒｅｄ１（Ｓｉｎｇｈ及びＲａｇｈａｖａ、「ＰｒｏＰｒｅｄ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ－ＤＲ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ」、ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ、１７（１２）：１２３６～１２３７、２００１において、より詳細に記載されている）、及びＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｓｃｈｕｌｅｒら、「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ，Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４０９（１）巻：７５～９３、２００７を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
[00320]一部の実施形態では、ＴＣＲ又はその抗原結合性部分は、結合特徴など、１つ又は複数の特性が変更された、組換えにより作製される、天然のタンパク質又はその変異形態でありうる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、又は他の哺乳動物など、多様な動物種のうちの１つに由来しうる。ＴＣＲは、細胞結合形態の場合もあり、可溶形態の場合もある。一部の実施形態では、提供される方法のために、ＴＣＲは、細胞の表面において発現される、細胞結合形態である。
[00321]一部の実施形態では、ＴＣＲは、全長ＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲは、抗原結合性部分である。一部の実施形態では、ＴＣＲは、二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲ（ｓｃ－ＴＣＲ）である。一部の実施形態では、ｄＴＣＲ又はｓｃＴＣＲは、国際公開第０３／０２０７６３号、国際公開第０４／０３３６８５号、国際公開第２０１１／０４４１８６号において記載されている構造を有する。
[00322]一部の実施形態では、ＴＣＲは、膜貫通配列に対応する配列を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲは、細胞質配列に対応する配列を含有する。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＣＤ３と共に、ＴＣＲ複合体を形成することが可能である。一部の実施形態では、ｄＴＣＲ又はｓｃＴＣＲを含むＴＣＲのうちのいずれかは、Ｔ細胞表面において、活性ＴＣＲをもたらす、シグナル伝達ドメインへと連結されうる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、細胞の表面において発現される。
[00323]一部の実施形態では、ｄＴＣＲは、ＴＣＲ鎖の可変領域配列に対応する配列が、ＴＣＲ鎖の定常領域細胞外配列に対応するＮ末端配列へと融合させた、第１のポリペプチドと、ＴＣＲ鎖の可変領域配列に対応する配列が、ＴＣＲ鎖の定常領域細胞外配列に対応するＮ末端配列へと融合させた、第２のポリペプチドとを含有し、第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドとは、ジスルフィド結合により連結されている。一部の実施形態では、結合は、天然の二量体ＴＣＲに存在する、天然の鎖間ジスルフィド結合に対応しうる。一部の実施形態では、鎖間ジスルフィド結合は、天然のＴＣＲに存在しない。例えば、一部の実施形態では、１つ又は複数のシステインを、ｄＴＣＲポリペプチド対の、定常領域細胞外配列へと組み込むことができる。場合によって、天然のジスルフィド結合及び非天然のジスルフィド結合の両方が、所望でありうる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、膜へとアンカリングする膜貫通配列を含有する。
[00324]一部の実施形態では、ｄＴＣＲは、可変ドメイン、定常ドメイン、及び定常ドメインのＣ末端へと接合された、第１の二量体化モチーフを含有するＴＣＲ鎖と、可変ドメイン、定常ドメイン、及び定常ドメインのＣ末端へと接合された、第１の二量体化モチーフを含むＴＣＲ鎖とを含有し、この場合、第１の二量体化モチーフと、第２の二量体化モチーフとは、容易に相互作用して、第１の二量体化モチーフにおけるアミノ酸と第２の二量体化モチーフにおけるアミノ酸との間で共有結合を形成し、ＴＣＲ鎖と、ＴＣＲ鎖とを一体に連結する。
[00325]一部の実施形態では、ＴＣＲは、ｓｃＴＣＲである。典型的に、ｓｃＴＣＲは、公知の方法を使用して作出されうる（例えば、Ｓｏｏ Ｈｏｏ，Ｗ．Ｆ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８９、４７５９（１９９２）；Ｗｕｅｌｆｉｎｇ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４２、６５５（１９９４）；Ｋｕｒｕｃｚ，Ｉ．ら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９０３８３０（１９９３）；ＰＣＴ国際出願公開第９６／１３５９３号、同国際公開第９６／１８１０５号、同国際公開第９９／６０１２０号、同国際公開第９９／１８１２９号、同国際公開第０３／０２０７６３号、同国際公開第２０１１／０４４１８６号；及びＳｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６、８５９（１９９６）を参照されたい）。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲ鎖の会合を促進するように導入される、非天然の鎖間ジスルフィド結合（例えば、ＰＣＴ国際出願公開第０３／０２０７６３号を参照されたい）を含有する。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、そのＣ末端へと融合された、異種ロイシンジッパーが、鎖の会合を促進する、非ジスルフィド連結された切断型ＴＣＲ（例えば、ＰＣＴ国際出願公開第９９／６０１２０号を参照されたい）である。一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ペプチドリンカーを介して、ＴＣＲ可変ドメインへと共有結合的に連結されたＴＣＲ可変ドメイン（例えば、ＰＣＴ国際出願公開第９９／１８１２９号を参照されたい）を含有する。
[00326]一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列により構成される第１のセグメント、ＴＣＲ鎖定常ドメインの細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端へと融合させた、ＴＣＲ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列により構成される第２のセグメント、及び第１のセグメントのＣ末端を、第２のセグメントのＮ末端へと連結するリンカー配列を含有する。
[00327]一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端へと融合させた、α鎖可変領域配列により構成される第１のセグメント、及びβ鎖細胞外定常ドメイン配列及び膜貫通ドメイン配列のＮ末端へと融合させた、β鎖可変領域配列により構成される第２のセグメント、及び、任意選択で、第１のセグメントのＣ末端を、第２のセグメントのＮ末端へと連結するリンカー配列を含有する。
[00328]一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖α鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端へと融合させた、ＴＣＲ鎖可変領域配列により構成される第１のセグメント、及びα鎖β鎖細胞外定常ドメイン配列及び膜貫通ドメイン配列のＮ末端へと融合させた、β鎖可変領域配列により構成される第２のセグメント、及び、任意選択で、第１のセグメントのＣ末端を、第２のセグメントのＮ末端へと連結するリンカー配列を含有する。
[00329]一部の実施形態では、第１のＴＣＲセグメントと、第２のＴＣＲセグメントとを連結する、ｓｃＴＣＲのリンカーは、ＴＣＲの結合特異性を保持しながら、単一のポリペプチド鎖を形成することが可能な、任意のリンカーでありうる。一部の実施形態では、リンカー配列は、例えば、式：－Ｐ－ＡＡ－Ｐ－［式中、Ｐは、プロリンであり、ＡＡは、アミノ酸が、グリシン及びセリンであるアミノ酸配列を表す］を有しうる。一部の実施形態では、第１のセグメントと、第２のセグメントとを、その可変領域配列が、このような結合に配向されるように対合させる。よって、場合によって、リンカーは、第１のセグメントのＣ末端と、第２のセグメントのＮ末端との距離、又はこの逆の距離を張り渡すのに十分な長さを有するが、ｓｃＴＣＲの、標的リガンドへの結合を遮断又は低減するほどに長過ぎない。一部の実施形態では、リンカーは、１０～３０のアミノ酸、又は２６～４１のアミノ酸残基、例えば、２９、３０、３１、又は３２のアミノ酸など、１０～４５のアミノ酸、又はおよそこれらの数のアミノ酸を含有しうる。
[00330]一部の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基へと連結する共有結合的ジスルフィド結合を含有する。一部の実施形態では、天然のＴＣＲにおいて、鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、一部の実施形態では、１つ又は複数のシステインを、ｓｃＴＣＲポリペプチドの、第１のセグメント及び第２のセグメントの定常領域細胞外配列へと組み込むことができる。場合によって、天然のジスルフィド結合及び非天然のジスルフィド結合の両方が、所望でありうる。
[00331]導入された鎖間ジスルフィド結合を含有するｄＴＣＲ又はｓｃＴＣＲについての、一部の実施形態では、天然のジスルフィド結合は、存在しない。一部の実施形態では、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成する、天然のシステインのうちの１つ又は複数は、セリン又はアラニンなど、別の残基へと置換される。一部の実施形態では、導入されたジスルフィド結合は、第１のセグメント及び第２のセグメントにおけるシステイン以外の残基を、システインへと変異させることにより形成されうる。
[00332]ＴＣＲの、例示的な非天然のジスルフィド結合については、ＰＣＴ国際公開第２００６／０００８３０号において記載されている。
[00333]一部の実施形態では、ＴＣＲ又はその抗原結合性断片は、標的抗原に対する、１０－５～１０－１２Ｍの間、又はおよそこの範囲、並びにこの中の全ての個別の値及び範囲の平衡結合定数を伴うアフィニティーを呈する。一部の実施形態では、標的抗原は、ＭＨＣ－ペプチド複合体又はリガンドである。
[00334]一部の実施形態では、ＴＣＲ又はその部分をコードする、１つ又は複数の核酸は、ＰＣＲ、クローニング、又は他の適切な手段により増幅され、１つ又は複数の適切な発現ベクターへとクローニングされうる。発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであることが可能であり、任意の適切な宿主を形質転換するか、又はこれにトランスフェクトするのに使用されうる。適切なベクターは、プラスミド及びウイルスなど、繁殖及び拡大、若しくは発現、又はこれらの両方のためにデザインされたベクターを含む。
[00335]一部の実施形態では、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、又はｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）のベクターでありうる。場合によって、Ｇ１０、ＧＴ１１、ＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＭＢＬ４、及びＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターもまた、使用されうる。一部の実施形態では、植物用発現ベクターも使用される場合があり、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１、及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。一部の実施形態では、動物用発現ベクターは、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を含む。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターが使用される。
[00336]一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して調製されうる。一部の実施形態では、ベクターは、必要に応じ、ベクターが、ＤＮＡベースであるのか、ＲＮＡベースであるのかを考慮して、ベクターが導入される宿主の種類（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物）に特異的な、転写開始コドン及び翻訳開始コドン、並びに転写終結コドン及び翻訳終結コドンなどの調節配列を含有しうる。一部の実施形態では、ベクターは、ＴＣＲ又は抗原結合性部分（又は他のＭＨＣ－ペプチド結合性分子）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された非天然プロモーターを含有しうる。一部の実施形態では、プロモーターは、非ウイルスプロモーター、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びマウス幹細胞ウイルスのＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）において見出されるプロモーターなど、ウイルスプロモーターでありうる。他の公知のプロモーターもまた想定される。
[00337]一部の実施形態では、ＴＣＲをコードするベクターを作出するために、α鎖及びβ鎖（例えば）を、目的のＴＣＲを発現させるＴ細胞クローンから単離された、全ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、発現ベクターへとクローニングする。一部の実施形態では、α鎖及びβ鎖（例えば）を、同じベクターへとクローニングする。一部の実施形態では、α鎖及びβ鎖を、異なるベクターへとクローニングする。一部の実施形態では、作出されたα鎖及びβ鎖を、レトロウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターへと組み込む。
液体クラスの決定
[00339]液体クラスとは、液体をピペッティングために要求されるパラメータの集合である。開示されるシステム１０には、液体の移動と関連する、パラメータの２つセットが存在する。これらは、ピペッティングパラメータ及び較正パラメータである。ピペッティングパラメータは、確度より、精度と関連し、分注時における、吸引速度及び分注速度、エアギャップ、又は液体接触などの因子を含む。較正パラメータは、精度より確度と関連し、特異的液体クラスについての検量線の傾き及び補正を規定する。あらゆる新たな液体クラスについて、両方のパラメータセットを最適化する代わりに、正確なピペッティングのための、最適のパラメータを有する、デフォルトのクラスを識別するようにスクリーニングされた、所定の液体クラスを決定し、次いで、較正設定を補正して、ピペッティングの確度を改善する。
[00340]ピペッティングパラメータ及び較正パラメータの値は、液体の物理的特徴に依存する。これらは、液体の種類及びピペットモード（すなわち、マルチピペット分注と対比したシングルピペット分注；接触型ウェット分注と対比したフリー分注など）により規定される。１つの液体クラスは、３８４のＦＣＡ及びＭＣＡの両方について、全容量範囲をカバーする。各液体クラス内で、サブクラスを創出する。サブクラスは、アーム及び先端部の種類に基づき規定される。ピペッティングパラメータ及び較正パラメータが規定されるのは、これらのサブクラスの中においてであった。
[00341]液体クラスを創成するのに、重量測定法を援用した。Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ製のＷｅｉｇｈ Ｍｏｄｕｌｅ（分解能：０．０１ｍｇ）を、オンデッキの秤として使用した。この秤は、自動化ゼロコマンド及び測定コマンドを可能とするように、制御システム２０により組み込まれた。液体クラススクリーニング、最適化、及び確認は、各ステップに独立の方法により、自動式で実施した。
[00342]液体クラスは、手作業によるピペッティングステップを、自動化プロセスへと変換する、ピペッティングの自動化を可能とする。典型的に、ピペッティングは、容量、温度、密度、及び粘度など、いくつかの較正パラメータのほか、エアギャップ、遅延、及びピペッティング速度など、いくつかのピペッティングパラメータの影響を受ける。ＤＭＳＯ（細胞の凍結保存において使用される液体）など、粘性の大きな液体は、緩徐なピペッティング速度、並びにピペッティングの確度及び精度を、一般に、大きな速度及び短い遅延で、高度な精度及び確度をもたらす、水など、粘性の小さな液体と比較して改善する遅延を要求することが多い。複数の溶液の、不正確なピペッティングは、プロセス全体に対して、複合的影響を及ぼし、結果の解析にも影響を与えうる。自動化スケールダウンモデル法の中では、あらゆる吸引／分注／液体移動ステップは、液体クラスの創成を要求する。この液体クラスは、この特定の液体が、各先端部型により、どのように吸引／分注され、各先端部型が、方法実行時のエラーにどのように応答するのかを規定する。液体クラスはまた、測定された確度及び精度に基づき、所与の液体について、各ピペット先端部型に適切な作業容量範囲の情報を与えるためにも使用される。
液体クラスの構成要素及びパラメータ
[00344]４つの主要な構成要素が、液体クラスを創成するのに使用される。これらは、イージーコントロール、検出及びポジショニング、式、及びマイクロスクリプトコマンドを含む。
イージーコントロール
[00346]「イージーコントロール」構成要素は、吸引及び分注についての、極めて重要なパラメータのイージーコントロールを可能とするグラフエディターである。イージーコントロールでは、潜在的なエアギャップ、遅延、及び速度を視覚化するように、ピペット先端部型により、ある特定の容量をピペッティングするのに必要とされうる容量などのパラメータが補正されうる。
検出及びポジショニング
[00348]「検出及びポジショニング」構成要素は、使用者が、吸引及び分注のために、ｃＬＬＤ（ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ ｌｉｑｕｉｄ ｌｅｖｅｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、トラッキングオプション、エラーハンドリング、及び引込み特性についてのパラメータを設定することを可能とする。ｃＬＬＤは、リキッドハンドラーが、実験機器における液体の存在及び高さを感知する手段である。接地されたワークテーブル６０及び導電性のピペッティング先端部を使用して、リキッドハンドラーは、気／液インターフェースにおける容量の変化に応答する。ｃＬＬＤは、全ての自動化スケールダウンモデル適用のためにオンにされる。ｃＬＬＤは、Ｚｓｔａｒｔで始まり、Ｚｍａｘまで進行する。Ｚｔｒａｖｅｌは、自由移動時に、ピペット先端部が、実験機器に近づきうる、デッキからの最小の距離を指し示す。Ｚｓｔａｒｔは、吸引ステップの開始時に、内部の実験機器が、液体のレベルのどのくらい上方にあるかの距離である。Ｚｓｔａｒｔは、実験機器による規定により規定される。Ｚｍａｘは、ピペット先端部が、実験機器の底部を壊さないように設定され、また、実験機器による規定によっても規定される。液体クラスごとに、ｃＬＬＤが選択されると、測定感度群、及び先端部の浸漬深度がインプットされる。
[00349]ｃＬＬＤ及びトラッキングをオンにする場合、液体を吸引するにつれて、ピペットの先端部は、液体に入り、浸漬深度を設定するように進む。次いで、ピペットの先端部は、液体を吸引しながら、この浸漬深度を維持するために、液体の吸引速度で、下方へと移動する。自動化スケールダウンモデル法の中では、全ての吸引ステップのために、トラッキングをオンにする。引込み特性及び監視は、システムが、ピペット先端部の、液体からの移出をモニタリングすることを可能とし、使用者に、先端部の引込み時に、エラーを経たのかどうかについての情報を与える。エラーハンドリングセクションは、リキッドハンドラーが、実験中に経たエラーに対して、どのように応答するのかを規定する。これは、液体クラスごとに決定される。典型的に「ユーザープロンプト」は、液体クラスごとに選択され、これにより、使用者は、方法の実行時に、エラーメッセージを参照することが可能となり、これに直接応答することができる。
式
[00351]式は、リキッドハンドリングパラメータを入力する方式を、関数として提示する。これらの式は、吸引及び分注の両方について、値を固定して編集することもでき、ピペッティング容量に従属する式の場合もある。液体の異なる容量には、液体クラスに特異的なピペッティングの確度のために、異なる補正がなされる。これらの補正は、液体クラスの創成時になされる。
マイクロスクリプト
[00353]マイクロスクリプトとは、吸引、分注、及び混合時における、一連の基本動作である。吸引スクリプトでは、容量、加速、及び減速について、少数の変数（確度の調整に由来する補正を含む）を設定する。三方逆止弁を、ピペットの先端位置に向け、液体の吸引を可能とする。最先頭部のエアギャップを吸引し、次いで、変数セクションで設定されたサイクル数を設定するために、ピペット先端部を液体でプレウェッティングする。ソフトウェアは、その吸引モードを決定するために、ｃＬＬＤが、オンであるのか、オフであるのかを点検する。ｃＬＬＤを伴うか又は伴わずに液体を吸引した後で、後続のエアギャップを吸引する。液体の分注時に、スクリプトは、容量（確度の調整に由来する補正を含む）についての変数を設定する。ソフトウェアは、マルチピペッティングが、オンであるのか、オフであるのかを確認するために点検する。次いで、ソフトウェアは、液体の分注を可能とするように、三方逆止弁を、ピペット先端位置に戻す。ソフトウェアは、ｃＬＬＤが、オンであるのか、オフであるのかを確認するために、今一度点検する。次いで、ソフトウェアは、適切な設定（マルチピペッティングを伴うか、又は伴わずに、かつ、ｃＬＬＤを伴うか、又は伴わずに）により、液体を分注する。遅延が設定されている場合、ピペット先端部は、実験機器から引き込まれる前に、設定された量の時間にわたり待機する。次いで、ソフトウェアは、ｚ位置の設定に移る。後続のエアギャップを設定したら、次いで、ピペット先端部を動かす前に、空気を吸引する。
被験細胞培養液
細胞培養液
培地
基礎培地
完全
細胞溶液
細胞＋培地
細胞＋ＣｒｙｏＳｔｏｒ／ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ／ＨＳＡ
Ｃｒｙｏｓｔｏｒ／ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ／ＨＳＡ
アームの種類
ＦＣＡ
ＭＣＡ３８４
ＦＣＡサブクラス
５０００μＬのＤｉＴｉ
１０００μＬのＤｉＴｉ
２００μＬのＤｉＴｉ
５０μＬのＤｉＴｉ
１０μＬのＤｉＴｉ
ＭＣＡサブクラス
５０μＬのＤｉＴｉ
１５０μＬのＤｉＴｉ
接触型分注
フリー
接触型
分注の種類
シングル
マルチ
混合
培地
細胞＋培地
細胞＋ＣｒｙｏＳｔｏｒ／ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ／ＨＡＳ
方法
[00386]各被験液について、液体クラスワークブックを作成した。
[00387]Ｄｅｎｓｉｔｏ ３０ＰＸを使用して、被験液の密度を測定し、液体クラスワークブックの「液体詳細」タブ内に記録する。全てのさらなる３０ＰＸによる液体についての詳細は、「液体詳細」タブにおいて報告した。
[00388]検出感度コマンドを使用して、ｃＬＬＤ感度群（低、中、高）を、各被験液について検証した。感度群は、液体クラスワークブックの「液体詳細」タブ内に記録した。
[00389]理想的には、あらゆる被験液について、フリー／シングル分注用のデフォルトの液体クラスが同定されるものとした。このデフォルトの液体クラスはまた、マルチ分注用液体クラス及びＭＣＡ用液体クラスのいずれためのデフォルトとしても使用された。次いで、全てのデフォルトの液体クラスを最適化して、ピペッティング確度を改善した。フリー／シングル分注用のデフォルトの液体クラスが、マルチ分注用液体クラス及びＭＣＡ用液体クラスについて、低精度をもたらした場合は、マルチ分注用ピペッティングパラメータを、被験液について最適化した。
フレキシブルチャネルアーム用の液体クラス
フリー／シングル分注
液体クラスのスクリーニング
新たな細胞培養液
[00394]５つの確立された液体クラスに対して、あらゆる新たな液体をスクリーニングした。５００μＬを、デフォルトの液体クラスを決定するためのスクリーニング容量として使用した。分注容量の最小値、最大値、平均値、確度、及び精度を、各被験液体クラス型ごとに計算した。デフォルトクラスは、最高の精度（ＣＶ％）及び確度（ＤＥＶ％）を有するクラスとして決定した。粘性が大きな液体については、加えて、液体を、確立された接触型液体クラスに対してもスクリーニングするものとした。接触がたを使用する場合、個別の接触型液体クラスを創出した。全ての液体クラスが、確度及び精度の不良をもたらす場合は、ピペッティングパラメータを補正した。容量の測定値は、８つのＦＣＡチャネル全てにより得たが、全ての統計は、１．２５ｍＬのシリンジ単独により計算した。蒸発を防止するために、ピペッティングサイクル１サイクル当たり、１つのピペット先端部を使用した。非粘性液体のための液体クラススクリーニングは、フリー／シングル分注モードで実施した。
「公知の」細胞培養液
[00396]既に確立された液体クラスと同様の物理的特性を明示する液体は、スクリーニングステップをスキップし、確立された液体クラス、すなわち、培地処方を、そのデフォルトの（出発）液体クラスとして採用する。
液体クラスの最適化
[00398]デフォルトの液体クラスを、被験液について最適化するために、液体クラススクリーニングステップから得られるデフォルト液体クラスの複製を創出した。６つの被験容量を、ＤｉＴｉサブクラスごとに評価して、精度及び確度が高度な、最適化された被験液クラスを創出した。
ＤｉＴｉの被験容量を１０～１０００μＬとする場合のＦＣＡ１～ＦＣＡ４
[00400]液体クラスの最適化を、表１に示される通り、５つの液体サブクラス（ＦＣＡ１～ＦＣＡ５）について実行した。ピペッティング確度を評価するために、各サブクラス内で、６つの容量について調べた。液体サブクラス及び被験容量は、液体クラスワークブックの、「被験容量」タブにおいて報告した。各被験容量には、チャネル１つ当たりの反復を１回として、８回の反復がなされた。各チャネルから分注される容量の測定値は、「最適化ＦＣＡ」タブにおいて報告した。容量の測定値は、８つのＦＣＡチャネル全てにより得たが、全ての統計は、１．２５ｍＬのシリンジ単独により計算した。分注容量の最小値、最大値、平均値、確度（ＤＥＶ％）、及び精度（ＣＶ％）は、被験容量ごとに計算した。ＤＥＶ％及びＣＶ％が、合格基準内にある場合は、確認試行を開始した。ＤＥＶ％及びＣＶ％が、合格基準を上回る場合は、さらなる反復を実施した。蒸発を防止するために、ピペッティングサイクル１サイクル当たり、１つのピペット先端部を使用した。
ＤｉＴｉの被験容量を５０００μＬとする場合のＦＣＡ５
[00402]各被験容量には、チャネル１つ当たりの反復を３回として、６回の反復がなされた。各チャネルから分注される容量の測定値は、「最適化ＦＣＡ５」タブにおいて報告した。分注容量の最小値、最大値、平均値、確度（ＤＥＶ％）、及び精度（ＣＶ％）は、被験容量ごとに計算した。ＤＥＶ％及びＣＶ％が、合格基準内にある場合は、確認試行を開始することができる。ＤＥＶ％及びＣＶ％が、合格基準を上回る場合は、さらなる反復を実施した。
[00403]
Figure 2022535380000002
確認試行
[00405]実験及びデータパッケージは、液体クラスの最適化ステップと同じままとしたが、各容量について、３回にわたり調べ、最終的な確度補正を行った。最終の平均値、ＣＶ％、及びＤＥＶ％は、１．２５ｍＬのシリンジ（１．２５ｍＬのシリンジ６本で３回にわたる）及び５ｍＬのシリンジ（５ｍＬのシリンジ２本で９回にわたる）の両方について、１８回の測定から計算した。ＣＶ％及びＤＥＶ％が、合格基準内を維持する場合は、液体クラスを完了した。
マルチ分注
液体クラスの最適化
[00408]マルチ分注液体クラスについては、スクリーニングステップをスキップし、直接、最適化へと進んだ（良好な精度が維持された場合）。各被験マルチ分注液体クラスは、被験液について、既に最適化されたデフォルトのマルチ分注液体クラスの複製（すなわち、デフォルト液体クラスの「マルチ」バージョン）として作成した。表２に示される通り、各マルチ分注液体クラス（ＦＣＡ３Ｍ～ＦＣＡ５Ｍ）について、３つずつの液体サブクラスを構築した。シングル分注液体クラスと異なり、マルチ分注液体クラスのためには、１つのチャネルだけを使用した。
[00409]ピペッティング確度を評価するために、各サブクラスについて、６つの容量について調べた。液体サブクラス及び被験容量は、表２、及び液体クラスワークブックの、「被験容量」タブにおいて報告した。各被験容量には、１チャネルにより実施される反復を８回として、８回の反復がなされた。各回の分注から分注される容量の測定値は、「最適化ＦＣＡ Ｍ」タブにおいて報告した。分注容量の最小値、最大値、平均値、確度（ＤＥＶ％）、及び精度（ＣＶ％）は、被験容量ごとに計算した。ＤＥＶ％及びＣＶ％が、合格基準内にある場合は、確認試行を開始することができる。ＤＥＶ％及びＣＶ％が、合格基準を上回る場合は、さらなる反復を実施することができる。
[00410]
Figure 2022535380000003
確認試行
[00412]実験及びデータパッケージは、液体クラスの最適化ステップと同じままとしたが、各容量について、３回にわたり調べ、最終的な確度補正を行った。最終の平均値、ＣＶ％、及びＤＥＶ％は、１．２５ｍＬのシリンジ及び５ｍＬのシリンジの両方について、２４回の測定から計算した。ＣＶ％及びＤＥＶ％が、合格基準内を維持する場合は、液体クラスを完了した。
さらなる装置
[00414]
Figure 2022535380000004
[00415]
Figure 2022535380000005
Figure 2022535380000006
Figure 2022535380000007
[00416]上記では、具体的実施形態について記載されたが、これらの実施形態は、特定の特色に関して、単一の実施形態だけについて記載される場合であってもなお、本開示の範囲の限定を意図するものではない。そうでないことが言明されない限りにおいて、本開示で提示される特色の例は、限定的ではなく、例示的であることを意図するものである。本開示を利用する当業者には明らかである通り、上記の記載は、このような代替物、改変、及び同等物を対象とすることを意図する。
[00417]本開示の範囲は、本明細書で取り組まれる問題のうちのいずれか、又は全てを緩和する場合であれ、そうでない場合であれ、本明細書で開示される（明示的であれ、暗示的であれ）、任意の特色若しくは特色の組合せ、又はこれらについての任意の一般化を含む。したがって、任意のこのような特色の組合せに対する出願（又はこれに対する優先権を主張する出願）の審査中に、新たな特許請求がなされる場合もある。特に、付属の特許請求の範囲について言及すると、独立請求項の特色と組み合わされうる、従属請求項に由来する特色と、それぞれの独立請求項に由来する特色とは、付属の特許請求の範囲で列挙される、具体的組合せだけではなく、任意の適切な形で組み合わされうる。
関連出願の相互参照
[0001]本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、２０１９年６月７日に出願された米国特許仮出願第６２／８５８，７３６号に対する優先権を主張する。
配列表に対する言及
[0002]本出願は、コンピュータで読取り可能な形態で提出され、２０２０年５月２７日に作成され、１８キロバイトを含有する配列表を、参照により組み込む。

Claims (60)

  1. Ｔ細胞をスケールダウン加工するための自動化方法であって、
    １例又は複数例のドナーから得られた、Ｔ細胞のインプットセットを、１つ又は複数の活性化試薬と自動的に接触させることにより、前記Ｔ細胞のインプットセットを活性化させて、活性化Ｔ細胞セットを作出するステップ；
    前記活性化Ｔ細胞セットへのウイルス感染を促進する条件下で、前記活性化Ｔ細胞セットを、異種組換えタンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスベクターと自動的に接触させることにより、前記活性化Ｔ細胞セットへと形質導入して、形質導入Ｔ細胞セットを作出するステップ；
    前記形質導入Ｔ細胞セットを拡大するステップ；
    前記形質導入Ｔ細胞セットを、拡大培地から自動的に回収するステップ；及び
    前記形質導入Ｔ細胞セットを自動的に凍結保存することにより、前記形質導入Ｔ細胞セットを採取して、採取された形質導入Ｔ細胞セットを作出するステップ
    を含む自動化方法。
  2. 前記活性化Ｔ細胞セットを、接種培地へと自動的に移すことにより、前記活性化Ｔ細胞セットを接種するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 活性化させるステップが、
    前記Ｔ細胞のインプットセットを自動的に洗浄すること；
    任意選択で、生細胞をカウントするために、前記洗浄されたＴ細胞のインプットセットの検査試料を自動的に得ること；
    前記洗浄されたＴ細胞のインプットセットを、前記１つ又は複数の活性化試薬と自動的に接触させること；及び
    任意選択で、生細胞をカウントするために、前記１つ又は複数の活性化試薬と接触させた後で、前記活性化Ｔ細胞セットの検査試料を自動的に得ること
    を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
  4. 形質導入するステップが、
    任意選択で、生細胞をカウントするために、前記活性化Ｔ細胞セットの検査試料を自動的に得ること；
    スピノキュレーションのために、前記活性化Ｔ細胞セットを自動的に調製すること；
    前記活性化Ｔ細胞セットを、前記組換えウイルスベクターと接触させ、遠心力を、前記活性化Ｔ細胞セットへと加えることにより、前記活性化Ｔ細胞セットに自動的にスピノキュレートすること；及び
    任意選択で、形質導入した後で、哺乳動物細胞用インキュベーターにおいて、前記活性化Ｔ細胞セットをインキュベート又は接種すること
    を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 接種するステップが、
    任意選択で、生細胞をカウントするために、形質導入した後で、前記活性化Ｔ細胞セットの検査試料を自動的に得ること；及び
    前記活性化Ｔ細胞セットを、拡大プレートへと自動的に移し、前記活性化Ｔ細胞セットを含有する前記拡大プレートを、哺乳動物細胞用インキュベーターに入れることにより、前記活性化Ｔ細胞セットを接種すること
    を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 拡大するステップが、
    生細胞をカウントするために、前記形質導入Ｔ細胞セットの検査試料を得ること；及び
    ｍｏｃｋ灌流／細胞培養培地交換を自動的に実施すること
    をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ビーズ分離ステップをさらに含み、ビーズ分離ステップが、
    磁界を加えることにより、前記形質導入Ｔ細胞セット、及び／又は前記活性化Ｔ細胞セットを、自動的にビーズにより分離すること
    を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 採取するステップが、
    前記形質導入Ｔ細胞セットを、凍結保存培地と共に、クライオバイアルに入れること；及び
    前記クライオバイアルを、液体窒素タンクに入れること
    を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記異種組換えタンパク質が、組換え受容体を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記組換え受容体が、疾患、障害、又は状態の細胞又は組織と関連する、これに特異的である、及び／又はこれにおいて発現される、標的抗原に結合することが可能である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記疾患、障害、又は状態が、感染性疾患若しくは感染性障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、又は腫瘍若しくはがんである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記標的抗原が、腫瘍抗原である、請求項１３又は１４に記載の方法。
  16. 前記組換え受容体が、機能的な非ＴＣＲ抗原受容体若しくはＴＣＲ、又はこれらの抗原結合性断片であるか、又はこれを含む、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記組換えウイルスベクターが、レトロウイルスベクターであるか、又はこれを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記レトロウイルスベクターが、レンチウイルスベクター又はガンマレトロウイルスベクターである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記Ｔ細胞が、１例又は複数例のドナーから得られた初代Ｔ細胞を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記１例又は複数例のドナーが、ヒト対象である、請求項２０に記載の方法。
  22. Ｔ細胞をスケールダウン加工するための自動化方法であって、
    １例又は複数例のドナーから得られた、Ｔ細胞のインプットセットを、１つ又は複数の活性化試薬と自動的に接触させることにより、前記Ｔ細胞のインプットセットを活性化させて、活性化Ｔ細胞セットを作出するステップ；
    異種組換えタンパク質をコードする核酸を含む組換えポリヌクレオチドの、前記活性化Ｔ細胞への組込みを促進する条件下で、前記活性化Ｔ細胞を、前記組換えポリヌクレオチドと接触させることにより、前記活性化Ｔ細胞セットを改変して、改変Ｔ細胞セットを作出するステップ；
    前記改変Ｔ細胞セットを拡大するステップ；
    前記改変Ｔ細胞セットを、拡大培地から回収するステップ；及び
    前記改変Ｔ細胞セットを自動的に凍結保存することにより、前記改変Ｔ細胞セットを採取して、採取された改変Ｔ細胞セットを作出するステップ
    を含む自動化方法。
  23. 前記改変するステップが、形質導入、電気穿孔、試薬ベースのトランスフェクティング、細胞圧縮、又は細胞圧搾を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記方法の前記ステップのうちの１つ又は複数が、自動的に、及び／又はオペレーターからの介入を伴わずに実施される、請求項２２又は請求項２３に記載の方法。
  25. 前記活性化Ｔ細胞セットを、接種培地へと自動的に移すことにより、前記活性化Ｔ細胞セットを接種するステップをさらに含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 活性化させるステップが、
    前記Ｔ細胞のインプットセットを自動的に洗浄すること；
    任意選択で、生細胞をカウントするために、前記洗浄されたＴ細胞のインプットセットの検査試料を自動的に得ること；
    前記洗浄されたＴ細胞のインプットセットを、前記１つ又は複数の活性化試薬と自動的に接触させること；及び
    任意選択で、生細胞をカウントするために、前記１つ又は複数の活性化試薬と接触させた後で、前記活性化Ｔ細胞セットの検査試料を自動的に得ること
    を含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 形質導入するステップが、
    任意選択で、生細胞をカウントするために、前記活性化Ｔ細胞セットの検査試料を自動的に得ること；
    スピノキュレーションのために、前記活性化Ｔ細胞セットを自動的に調製すること；
    前記活性化Ｔ細胞セットを、前記組換えウイルスベクターと接触させ、遠心力を、前記活性化Ｔ細胞セットへと加えることにより、前記活性化Ｔ細胞セットに自動的にスピノキュレートすること；及び
    任意選択で、形質導入した後で、哺乳動物細胞用インキュベーターにおいて、前記活性化Ｔ細胞セットをインキュベート又は接種すること
    を含む、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 接種するステップが、
    任意選択で、生細胞をカウントするために、形質導入した後で、前記活性化Ｔ細胞セットの検査試料を自動的に得ること；及び
    前記活性化Ｔ細胞セットを、拡大プレートへと自動的に移し、前記活性化Ｔ細胞セットを含有する前記拡大プレートを、哺乳動物細胞用インキュベーターに入れることにより、前記活性化Ｔ細胞セットを接種すること
    を含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 拡大するステップが、
    生細胞をカウントするために、前記改変Ｔ細胞セットの検査試料を得ること；及び
    ｍｏｃｋ灌流／細胞培養培地交換を自動的に実施すること
    をさらに含む、請求項２２～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. ビーズ分離ステップをさらに含み、ビーズ分離ステップが、
    磁界を加えることにより、前記改変Ｔ細胞セット、及び／又は前記活性化Ｔ細胞セットを、自動的にビーズにより分離すること
    を含む、請求項２２～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 採取するステップが、
    前記改変Ｔ細胞セットを、凍結保存培地と共に、クライオバイアルに入れること；及び
    前記クライオバイアルを、液体窒素タンクに入れること
    を含む、請求項２２～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞を含む、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞を含む、請求項２２～３１のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記異種組換えタンパク質が、組換え受容体を含む、請求項２２～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記組換え受容体が、疾患、障害、又は状態の細胞又は組織と関連する、これに特異的である、及び／又はこれにおいて発現される、標的抗原に結合することが可能である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記疾患、障害、又は状態が、感染性疾患若しくは感染性障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、又は腫瘍若しくはがんである、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記標的抗原が、腫瘍抗原である、請求項３６又は請求項３７に記載の方法。
  39. 前記組換え受容体が、機能的な非ＴＣＲ抗原受容体若しくはＴＣＲ、又はこれらの抗原結合性断片であるか、又はこれを含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記組換え受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記Ｔ細胞が、１例又は複数例のドナーから得られた初代Ｔ細胞を含む、請求項２２～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記１例又は複数例のドナーが、ヒト対象である、請求項４１に記載の方法。
  43. 自動化リキッドハンドリングシステム、並びに
    前記自動化リキッドハンドリングシステムと連通する制御システムであって、前記自動化リキッドハンドリングシステムを制御して、
    Ｔ細胞セットを活性化させるユニットプロセス；
    前記Ｔ細胞セットを改変するユニットプロセス；
    前記Ｔ細胞セットをビーズにより分離するユニットプロセス；
    前記Ｔ細胞セットを接種するユニットプロセス；
    前記Ｔ細胞セットを拡大するユニットプロセス；及び
    前記Ｔ細胞セットを採取するユニットプロセス
    を実施するようにプログラムされた、１つ又は複数のプロセッサー
    を含む制御システム
    を含む、Ｔ細胞への形質導入のためのマルチプレックス自動化システム。
  44. 前記自動化リキッドハンドリングシステムが、液体を、独立のマルチチャネルピペットフォーマットで移すように構成された、フレキシブルチャネルリキッド操作モジュールを含み、各ピペットが、独立にオペレーションされるように構成される、請求項４３に記載のシステム。
  45. 前記フレキシブルチャネルリキッド操作モジュールが、液体クラスの決定に基づき、流体容量を、約０．５～５０００μＬの間で正確に操作するように構成される、請求項４４に記載のシステム。
  46. 前記フレキシブルチャネルリキッド操作モジュールが、使い捨てチップを使用して、滅菌培養物を供給するように構成される、請求項４４又は請求項４５に記載のシステム。
  47. 前記フレキシブルチャネルリキッド操作モジュールが、リキッドディスプレースメント式のフレキシブルチャネルアームである、請求項４４～４６のいずれか一項に記載のシステム。
  48. 前記自動化リキッドハンドリングシステムが、液体を、マルチチャネルピペットフォーマットで移すように構成された、静態マルチチャネルリキッド操作モジュールを含む、請求項４３～４７のいずれか一項に記載のシステム。
  49. 前記静態マルチチャネルリキッド操作モジュールが、リキッドディスプレースメント式のフレキシブルチャネルアーム又はフレキシブルマルチチャネルアームである、請求項４８に記載のシステム。
  50. 前記自動化リキッドハンドリングシステムが、互換性グリッパー構成部を伴う、容器操作モジュールを含む、請求項４３～４９のいずれか一項に記載のシステム。
  51. 前記互換性グリッパー構成部が、水平方向のアクセス及び実験機器の移送のために構成された離心フィンガー；実験機器への、垂直方向のアクセスのために構成された向心フィンガー；並びにチューブ型実験機器の移送のために構成されたチューブ用フィンガーを含む、請求項５０に記載のシステム。
  52. 前記容器操作モジュールが、ｚ軸方向に長型のロボットグリッパーアームである、請求項５０又は請求項５１に記載のシステム。
  53. 前記自動化リキッドハンドリングシステムが、活性化ユニットオペレーション、改変ユニットオペレーション、接種ユニットオペレーション、拡大ユニットオペレーション、ビーズ分離ユニットオペレーション、及び採取ユニットオペレーションのために独立に構成可能なワークテーブルを含む、請求項４３～５２のいずれか一項に記載のシステム。
  54. 前記自動化リキッドハンドリングシステムが、温度制御型ロボット遠心分離機を含む、請求項４３～５３のいずれか一項に記載のシステム。
  55. 前記自動化リキッドハンドリングシステムが、丸形の実験機器を保持及び把持するように構成されたバイアルグリッパーモジュールを含む、請求項４３～５４のいずれか一項に記載のシステム。
  56. 前記自動化リキッドハンドリングシステムが、生細胞カウントの測定を行うように構成された、自動化細胞カウンティングモジュールを含む、請求項４３～５５のいずれか一項に記載のシステム。
  57. 前記自動化リキッドハンドリングシステムが、クライオバイアルを保持するように構成された、携帯型クライオバイアル冷却チャンバー／キャップホルダーを含む、請求項４３～５６のいずれか一項に記載のシステム。
  58. 前記自動化リキッドハンドリングシステムが、滅菌環境をもたらす、請求項４３～５７のいずれか一項に記載のシステム。
  59. 哺乳動物細胞用インキュベーターをさらに含む、請求項４３～５８のいずれか一項に記載のシステム。
  60. 前記制御システムが、前記自動化リキッドハンドリングシステムを制御して、組換えポリヌクレオチドの、前記Ｔ細胞セットへの組込みを促進する条件下で、前記活性化Ｔ細胞を、前記組換えポリヌクレオチドと接触させることにより、前記Ｔ細胞セットを改変するようにさらにプログラムされ；前記Ｔ細胞セットの改変が、前記組換えポリヌクレオチドを前記Ｔ細胞セットへと組み込むように、形質導入オペレーション、トランスフェクトするオペレーション、細胞圧縮オペレーション、又は細胞圧搾オペレーションのうちの１つを含む、請求項４３～５９のいずれか一項に記載のシステム。

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