CN116867799A - Ras G13D突变体表位肽及识别Ras G13D突变体的T细胞受体 - Google Patents

Ras G13D突变体表位肽及识别Ras G13D突变体的T细胞受体 Download PDF

Info

Publication number
CN116867799A
CN116867799A CN202280014423.1A CN202280014423A CN116867799A CN 116867799 A CN116867799 A CN 116867799A CN 202280014423 A CN202280014423 A CN 202280014423A CN 116867799 A CN116867799 A CN 116867799A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hla
dqb1
positive
dqa1
tcr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280014423.1A
Other languages
English (en)
Inventor
牟男
于跃
袁纪军
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Genbase Biotechnology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Genbase Biotechnology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Genbase Biotechnology Co Ltd filed Critical Shanghai Genbase Biotechnology Co Ltd
Publication of CN116867799A publication Critical patent/CN116867799A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464454—Enzymes
    • A61K39/464464—GTPases, e.g. Ras or Rho
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/05—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on GTP; involved in cellular and subcellular movement (3.6.5)
    • C12Y306/05002—Small monomeric GTPase (3.6.5.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了Ras G13D突变体表位肽、表达所述表位肽的抗原提呈细胞、包含它们的肿瘤疫苗、及其用于预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤的用途；还提供了特异性识别Ras G13D突变体的T细胞受体(TCR)、包含所述TCR的缀合物和融合蛋白、表达所述TCR的免疫细胞、包含它们的T细胞药物、及其用于预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤的用途。

Description

Ras G13D突变体表位肽及识别Ras G13D突变体的T细胞受体 技术领域
本发明涉及免疫学及肿瘤治疗领域。具体而言，本发明涉及Ras G13D突变体表位肽，表达所述表位肽的抗原提呈细胞，包含它们的肿瘤疫苗，及其用于预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤的用途。本发明还涉及特异性识别Ras G13D突变体的T细胞受体(TCR)，包含所述TCR的缀合物和融合蛋白，表达所述TCR的免疫细胞，以及包含它们的T细胞药物，及其用于预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤的用途。
背景技术
RAS是一种原癌基因，具有GTP酶活性，参与众多调节细胞增殖、分化和凋亡相关的信号通路，例如MAPK、PI3K、STAT信号通路等。1982年Der CJ等人首次证实了RAS基因突变是癌症发生驱动因素(Der CJ et.Al，1982)。人类基因中有3种编码RAS基因，分别是HRAS(GeneID：3265)、NRAS(GeneID：4893)和KRAS(GeneID：3845)，三种RAS基因具有高度的序列同源性(>90％)。人类肿瘤中约有33％携带RAS基因突变，RAS基因突变也成为发生频率最高的原癌基因突变(Karnoub AE，2008)。人类肿瘤中RAS基因突变发生最高的为KRAS约占22％，NRAS约占8.0％，HRAS约占3.3％。
KRAS基因突变在实体瘤中发生率最高(约占三种RAS突变的86％)，例如，结直肠癌(30％～50％)、胰腺癌(～85％)及非小细胞肺癌(15％～25％)；KRAS突变>97％集中发生在Exon2和Exon3，其中Exon2突变频率最高(例如G12C、G12V、G12D、G13D等)，G12D和G13D突变约占结直肠癌的20％～30％、胰腺癌的60％～70％、非小细胞肺癌的约38％。KRAS突变是肿瘤耐药的驱动基因，例如EGFR TKI以及EGFR单抗药物(Cetuximab等)用药需要检测肿瘤患者KRAS突变状态，具有KRAS突变的患者对EGFR抑制剂的响应极低约为0～5％(Jackman DM et.Al，2009)。KRAS突变的肿瘤患者，相比具有KRAS野生型肿瘤患者，其无进展生存期和总生存期较短；同时具有KRAS突变患者，其术后复发和转移的可能性更高。
近几十年来，科学家对KRAS结构及生物学研究表明，GTP结合KRAS蛋白的亲和力极高(pM级别)，小分子抑制剂很难通过竞争GTP抑制KRAS活性；细胞内具有与KRAS相互作用的其他蛋白参与信号的传递，小分子化合物也很难通过竞争抑制蛋白-蛋白相互作用抑制KRAS下游的信号传递；同时，KRAS蛋白结构表明其较为平滑，缺少小分子抑制剂结合的“口袋”，因此针对KRAS蛋白本身和其相关的蛋白小分子抑制剂的开发及其困难。对KRAS抑制剂的开发主要集中在对KRAS修饰的干扰及通过合成致死治疗KRAS突变的肿瘤，例如Farnesyl transferase抑制剂的开发，但均以失败告终(Heidi Ledford，2015)。近年来，针对KRAS突变体进行药物开发主要集中在KRAS G12C突变体，通过设计化合物可与G12C突变中半胱氨酸残基进行不可逆结合修饰，将KRAS G12C突变体锁定在失活状态，从而抑制KRAS突变G12C活性；目前，尚无针对其他KRAS突变体(例如G12V和G13D)的药物开发。
世界卫生组织(WHO)统计表明，在中国RAS突变高频癌症中(例如胰腺癌、结直肠癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌)，每年发病人数达到160万人，具有Ras突变(包含G12、G13、Q61等位置)为44.9万人，含有RAS突变的患者具有更高的肿瘤复发、耐药、更差的预后和总生存期，这些患者群体亟需新的治疗方法。
T细胞受体(TCR，T Cell Receptor)识别由HLA呈递病毒蛋白、突变基因转录产物的肽段序列，TCR能够特异性识别产生突变的肽段，因此KRAS基因突变是理想的TCR靶点。T细胞受体产生自VDJ基因重排，自然发生的T细胞受体库容量约为10 16-20次方(Harlan S.Robins，2009)；T细胞受体库容量约为B细胞受体1000～10000倍，如此庞大的库容量与之对应的是人类白细胞抗原系统，HLA分为I(A、B、C等)和II型(DP、DR、DQ等)，分别呈递不同长度的肽段(8～16mer)。抗KRAS突变体TCR发现，主要由美国国家癌症研究中心进行研究，目前发现的Ras突变体TCR，分别为HLA-A*11:01限制性识别KRAS G12V和HLA-C*08:02限制性识别KRAS G12D，尚无针对KRAS G13D的TCR；并且由于HLA等位基因属于半遗传方式，其地区遗传分布性很强。因此亟待发现识别KRAS G13D的T细胞受体，并且期望能够覆盖更多地区的患者群体。
发明内容
本发明提供了Ras G13D突变体的表位肽以及特异性识别该表位肽的T细胞受体 (TCR)、包括这些表位肽或TCR的细胞和药物组合物、编码这些表位肽或TCR的核酸、用于制备这些表位肽或TCR的载体和宿主细胞以及用于使用这些表位肽或TCR治疗受试者的方法。本发明所提供的表位肽和TCR能够用于诱导针对含有Ras G13D突变的肿瘤的免疫应答并因此治疗受试者的上述肿瘤。此外本发明所提供的表位肽和TCR为MHC-II限制性，该MHC-II限制性是在亚太人种占绝对优势的等位基因，因而适用于亚太地区的患者。此外，该MHC-II限制性也广泛分布于欧洲、美洲、大洋洲人种，因而具有广泛的应用前景。
表位肽
因此，在第一方面，本发明提供了一种分离的表位肽或其变体，所述表位肽由RAS G13D突变体的11-30个(例如30个，29个，28个，27个，26个，25个，24个，23个，22个，21个，20个，19个，18个，17个，16个，15个，14个，13个，12个，或11个)连续氨基酸残基组成，且包含RAS G13D突变体的第7-17位氨基酸残基；
所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如1个，2个或3个)氨基酸残基的置换，并且在对应于RAS G13D突变体的氨基酸位置8、10、13、14和16的位置中不包含氨基酸置换，并且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。在某些实施方案中，所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如1个，2个或3个)氨基酸残基的置换，并且在对应于RAS G13D突变体的氨基酸位置8、9、10、11、13、14和16的位置中不包含氨基酸置换，并且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。所述生物学功能包括：被MHC-II类分子呈递并随后被T细胞识别，例如被T细胞上的抗原特异性T细胞受体识别的能力。
在某些实施方案中，本发明的表位肽或其变体是MHC-II限制性抗原，也就是说本发明的表位肽或其变体可以在细胞的表面上表达的MHC-II分子的背景下展示或呈递或与其形成复合物。在某些实施方案中，本发明的表位肽或其变体能够被MHC-II类分子呈递，并且与MHC-II类分子缔合的所述表位肽或其变体能够被T细胞识别，例如被T细胞上的抗原特异性T细胞受体识别。
在某些实施方案中，所述MHC-II类分子是HLA-DQ。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0603、HLA-DQB1*0604、HLA-DQB1*0302中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA- DQB1*0303、HLA-DQB1*0319中的一种。更优选地，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505、HLA-DQA1*0102、HLA-DQA1*0103、HLA-DQA1*0301中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0319或HLA-DQB1*0303中的一种(优选地为HLA-DQB1*0301)，并且还包含选自HLA-DQA1*0501或DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0505。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0505。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0505。
在某些实施方案中，所述表位肽由RAS G13D突变体的11-25个(例如11-20个，11-19个，或11-16个)连续氨基酸残基组成。
在某些实施方案中，所述RAS G13D突变体是KRAS G13D突变体。在某些实施方案中，所述RAS G13D突变体具有SEQ ID NO:51所示的序列或与其相比具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，所述RAS G13D突变体的第7-17位氨基酸残基具有SEQ ID NO:14所示的序列。
在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第7-17位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:14所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第5-23位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:15所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第5-22位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:16所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第5-21位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:17所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第4-20位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:18所示)，或 由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第5-20位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:19所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第4-19位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:20所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第5-19位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:21所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第6-19位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:22所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第7-19位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:23所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第5-18位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:26所示)，或由其组成。在某些实施方案中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第5-17位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:27所示)，或由其组成。
在某些实施方案中，所述表位肽由RAS G13D突变体的第4-19位氨基酸残基(例如SEQ ID NO:20所示)组成。
在某些实施方案中，所述表位肽包含SEQ ID NOs:14-23、26-27任一项所示的序列，或由其组成。在某些实施方案中，所述变体包含选自下列的序列或由其组成：(i)与SEQ ID NOs:14-23、26-27任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；(ii)与SEQ ID NOs:14-23、26-27任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在另一方面，本发明提供了一种MHC-肽复合物，其包含本发明的表位肽或其变体以及与之结合的MHC-II类分子。在某些实施方案中，所述MHC-II类分子是HLA-DQ。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0603、HLA-DQB1*0604、HLA-DQB1*0302中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319中的一种。更优选地，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505、HLA-DQA1*0102、HLA-DQA1*0103、HLA-DQA1*0301中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0319或HLA-DQB1*0303中的一种(优选地为HLA-DQB1*0301)，并且还包含选自HLA-DQA1*0501或DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0505。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0505。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0505。
在某些实施方案中，所述MHC-肽复合物存在于细胞的表面上。因此，本发明还涵盖表达所述MHC-肽复合物的细胞。
T细胞受体
在第二方面，本发明提供了一种分离的T细胞受体或其抗原结合片段，其能够特异性识别本发明的表位肽或其变体或MHC-肽复合物。在某些实施方案中，所述表位肽或其变体被MHC-II类分子呈递。在某些实施方案中，所述MHC-II类分子是HLA-DQ。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0603、HLA-DQB1*0604、HLA-DQB1*0302中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319中的一种。更优选地，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505、HLA-DQA1*0102、HLA-DQA1*0103、HLA-DQA1*0301中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0319或HLA-DQB1*0303中的一种(优选地为HLA-DQB1*0301)，并且还包含选自HLA-DQA1*0501或DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0505。在某些实 施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0505。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0505。
在第三方面，本发明提供了一种分离的T细胞受体或其抗原结合片段，其能够特异性识别RAS G13D突变体，所述TCR或其抗原结合片段包括α链可变区(Vα)和/或β链可变区(Vβ)，其中，
(a)所述Vα包括CDR1α、CDR2α和CDR3α，其中，所述CDR3α具有SEQ ID NO:8所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；和/或，
(b)所述Vβ包括CDR1β、CDR2β和CDR3β，其中，所述CDR3β具有SEQ ID NOs:11、54-91任一项所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述CDR3α在对应于SEQ ID NO:8的第5位氨基酸位置不包含氨基酸置换和缺失。
在某些实施方案中，所述CDR3β具有ASSX 1X 2X 3X 4PQH(SEQ ID NO:92)所示的序列；
其中，X 1选自Q，A，C，D，E，G，H，I，L，M，N，S，T，V，W或Y；X 2选自T，A，C，H，K，N，S，V或W；X 3选自V，I，S或T；X 4选自P，C，D，E，F，G，H，L，M，R，S，V或W。在某些实施方案中，X 1选自Q，A，C，E，G，M，W或Y；X 2选自T，H，K，N，S或V；X 3选自V或T；X 4选自P，C，D，E，F，M，S或W。
在某些实施方案中，所述CDR3β具有SEQ ID NOs:11、54-91任一项所示的序列。在某些实施方案中，所述CDR3β具有SEQ ID NOs:11、54-55、57-58、62、67-68、71-75、79-83、87、89、91任一项所示的序列。
在某些优选的实施方案中，所述CDR1α具有SEQ ID NO:6所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，所述CDR2α具有SEQ ID NO:7所示的序列或与其相 比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，所述CDR1β具有SEQ ID NO:9所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些优选的实施方案中，所述CDR2β具有SEQ ID NO:10所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段包括α链可变区(Vα)和/或β链可变区(Vβ)，其中，
(a)所述Vα包括下述3个互补决定区(CDRs)：
(i)CDR1α，其具有SEQ ID NO:6所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(ii)CDR2α，其具有SEQ ID NO:7所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(iii)CDR3α，其具有SEQ ID NO:8所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或，
(b)所述Vβ包括下述3个互补决定区(CDRs)：
(iv)CDR1β，其具有SEQ ID NO:9所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，
(v)CDR2β，其具有SEQ ID NO:10所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列，和
(vi)CDR3β，其具有SEQ ID NOs:11、54-91任一项所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述CDR3α在对应于SEQ ID NO:8的第5位氨基酸位置不包含氨基酸置换和缺失。
在某些实施方案中，所述CDR3β具有ASSX 1X 2X 3X 4PQH(SEQ ID NO:92)所示 的序列；
其中，X 1选自Q，A，C，D，E，G，H，I，L，M，N，S，T，V，W或Y；X 2选自T，A，C，H，K，N，S，V或W；X 3选自V，I，S或T；X 4选自P，C，D，E，F，G，H，L，M，R，S，V或W。在某些实施方案中，X 1选自Q，A，C，E，G，M，W或Y；X 2选自T，H，K，N，S或V；X 3选自V或T；X 4选自P，C，D，E，F，M，S或W。
在某些实施方案中，所述CDR3β具有SEQ ID NOs:11、54-91任一项所示的序列。在某些实施方案中，所述CDR3β具有SEQ ID NOs:11、54-55、57-58、62、67-68、71-75、79-83、87、89、91任一项所示的序列。
在某些实施方案中，上述任一实施方案中所述的置换为保守置换。
在某些实施方案中，上述任一实施方案中所述的CDR根据IMGT编号系统定义。
第二或第三方面所述的TCR可以以任何TCR结构使用。
在某些实施方案中，TCR可以是包括全长α链和全长β链的全长TCR。
在某些实施方案中，TCR是缺乏一个或多个跨膜区和/或胞质区的可溶性TCR。在某些实施方案中，通过将本发明的TCR的细胞外结构域与其它蛋白质结构域(例如，麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白、人恒定κ结构域或亮氨酸拉链)融合来产生可溶性TCR，参见例如等人,《肿瘤学前沿(Front Oncol.)》,2014；4:378，其通过引用整体并入本文中。
在某些实施方案中，本发明的TCR也可以是单链TCR(scTCR)，其包括通过肽接头连接的Vα和Vβ。此类scTCR可以包括Vα和Vβ，所述Vα和Vβ各自与TCR恒定区连接。可替代地，scTCR可以包括Vα和Vβ，其中Vα、Vβ或Vα和Vβ两者不与TCR恒定区连接。示例性scTCR描述于PCT公开第WO 2003/020763号、第WO 2004/033685号和第WO 2011/044186号中，所述公开中的每一个公开通过引用整体并入本文中。
在某些实施方案中，本发明的TCR可以包括两条多肽链(例如，α链和β链)，其中所述链已经被工程化为各自具有可以形成链间二硫键的半胱氨酸残基。因此，本发明的TCR可以包括通过工程化二硫键连接的两条多肽链。具有工程化二硫键的示例性TCR描述于美国专利第8,361,794号和第8,906,383号中，所述专利中的每一个专利通过引用整体并入本文中。
在某些实施方案中，第二或第三方面所述的T细胞受体是膜结合或可溶性的T细胞 受体。在某些实施方案中，第二或第三方面所述的T细胞受体是全长TCR、可溶性TCR或单链TCR。
在某些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段包括α链可变区(Vα)和/或β链可变区(Vβ)，所述Vα包含如SEQ ID NO:8所示的CDR3α，所述Vβ包含如ASSX 1X 2X 3X 4PQH(SEQ ID NO:92)所示的CDR3β，其中，X 1选自Q，A，C，D，E，G，H，I，L，M，N，S，T，V，W或Y；X 2选自T，A，C，H，K，N，S，V或W；X 3选自V，I，S或T；X 4选自P，C，D，E，F，G，H，L，M，R，S，V或W。在某些实施方案中，X 1选自Q，A，C，E，G，M，W或Y；X 2选自T，H，K，N，S或V；X 3选自V或T；X 4选自P，C，D，E，F，M，S或W。在某些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段包括α链可变区(Vα)和/或β链可变区(Vβ)，所述Vα包含如SEQ ID NO:8所示的CDR3α，所述Vβ包含如SEQ ID NOs:11、54-92任一项所示的CDR3β。
在某些实施方案中，所述Vα包含分别如SEQ ID NOs:6-8所示的CDR1α、CDR2α和CDR3α，所述Vβ包含如SEQ ID NO:9所示的CDR1β、如SEQ ID NO:10所示的CDR2β和如ASSX 1X 2X 3X 4PQH(SEQ ID NO:92)所示的CDR3β，其中，X 1选自Q，A，C，D，E，G，H，I，L，M，N，S，T，V，W或Y；X 2选自T，A，C，H，K，N，S，V或W；X 3选自V，I，S或T；X 4选自P，C，D，E，F，G，H，L，M，R，S，V或W。在某些实施方案中，X 1选自Q，A，C，E，G，M，W或Y；X 2选自T，H，K，N，S或V；X 3选自V或T；X 4选自P，C，D，E，F，M，S或W。
在某些实施方案中，所述Vα包含分别如SEQ ID NOs:6-8所示的CDR1α、CDR2α和CDR3α，所述Vβ包含如SEQ ID NO:9所示的CDR1β、如SEQ ID NO:10所示的CDR2β和如SEQ ID NOs:11、54-92任一项所示的CDR3β。在某些实施方案中，所述Vα包含分别如SEQ ID NOs:6-8所示的CDR1α、CDR2α和CDR3α，所述Vβ包含如SEQ ID NO:9所示的CDR1β、如SEQ ID NO:10所示的CDR2β和如SEQ ID NOs:11、54-55、57-58、62、67-68、71-75、79-83、87、89、91任一项所示的CDR3β。
在某些实施方案中，上述任一实施方案中的Vα和/或Vβ具备下述特征：
(a)所述Vα还包括FR1α、FR2α、FR3α和FR4α，其中：
所述FR1α具有SEQ ID NO:93所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
所述FR2α具有SEQ ID NO:94所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的 置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
所述FR3α具有SEQ ID NO:95所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
所述FR4α具有SEQ ID NO:96所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
和/或，
(b)所述Vβ还包括FR1β、FR2β、FR3β和FR4β，其中：
所述FR1β具有SEQ ID NO:97所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
所述FR2β具有SEQ ID NO:98所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
所述FR3β具有SEQ ID NO:99所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
所述FR4β具有SEQ ID NO:100所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列。
在某些实施方案中，所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段的Vα包含SEQ ID NO:4所示的序列或其变体，其中，所述变体选自下列的氨基酸序列：
(i)与SEQ ID NO:4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(ii)与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，(i)中所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段的Vα包含SEQ ID NO:4所示的序列或其变体，其中，所述变体在位置97不包含氨基酸置换和缺失，所述氨基酸位置根据IMGT TCR编号系统确定。
在某些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段的Vβ包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体，其中，所述变体选自下列的氨基酸序列：
(i)与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
(ii)与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
在某些实施方案中，(i)中所述的置换是保守置换。
在某些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段的Vβ包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体，其中，所述变体包含选自下列的1个或几个(例如，1个、2个、3个或4个)氨基酸置换，所述氨基酸位置根据IMGT TCR编号系统确定：(1)位置95上的氨基酸置换为A，C，D，E，G，H，I，L，M，N，S，T，V，W或Y；(2)位置96上的氨基酸置换为A，C，H，K，N，S，V或W；(3)位置97上的氨基酸置换为I，S或T；(4)位置98上的氨基酸置换为C，D，E，F，G，H，L，M，R，S，V或W。
在某些实施方案中，所述变体包含选自下列的1个或几个(例如，1个、2个、3个或4个)氨基酸置换，所述氨基酸位置根据IMGT TCR编号系统确定：(1)位置95上的氨基酸置换为A，C，E，G，M，W或Y；(2)位置96上的氨基酸置换为H，K，N，S或V；(3)位置97上的氨基酸置换为T；(4)位置98上的氨基酸置换为C，D，E，F，M，S或W。
在某些实施方案中，本发明的TCR或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:4所示的Vα和/或SEQ ID NO:5所示的Vβ。
在某些实施方案中，所述TCR或其抗原结合片段能够特异性识别本发明的表位肽或其变体(例如SEQ ID NOs:14-23、26-27任一项所示的序列)或MHC-肽复合物。在某些实施方案中，所述表位肽或其变体被MHC-II类分子呈递。
在某些实施方案中，所述MHC-II类分子是HLA-DQ。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0603、HLA-DQB1*0604、HLA-DQB1*0302中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319中的一种。更优选地，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505、 HLA-DQA1*0102、HLA-DQA1*0103、HLA-DQA1*0301中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0319或HLA-DQB1*0303中的一种(优选地为HLA-DQB1*0301)，并且还包含选自HLA-DQA1*0501或DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0505。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0505。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0505。
在某些实施方案中，当所述TCR或其抗原结合片段在T细胞的表面上表达时，所述T细胞在与展示(例如，在MHC-II背景下展示)本发明的表位肽或其变体的第二细胞共培养时活化。在某些实施方案中，T细胞的活化可使用本领域已知的任何适宜的指示物来测量。此类适宜的指示物的非限制性实例包括：细胞因子(例如，IL-2、IFN-γ等)分泌水平、增殖活性、和/或活化标记(例如，CD25、CD69、CD107a等)表达水平增加。在某些实施方案中，T细胞的活化也包括所述T细胞诱导展示(例如，在MHC-II背景下展示)本发明的表位肽或其变体的第二细胞的细胞凋亡或死亡。
缀合物及融合蛋白
在第四方面，本发明提供了一种缀合物，其包含第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段以及与其缀合的效应子部分(effector moiety)。
在该情境下，术语“效应子部分”是指能够调节(例如增加或降低)与其连接的分子的天然活性或赋予该分子新颖活性的组分或官能团。在一些实施方案中，所述效应子部分是对于TCR所靶向的细胞具有效应的化合物。
在该情境下，术语“缀合”是指用于功能性连接蛋白结构域的本领域已知的任何方法，包括但不限于：使用或不使用linker的重组融合、intein介导的融合、非共价结合和共价键合，例如二硫键合、肽键合、氢键合、静电键合和构象键合，例如生物素-亲和素结合。在某些实施方案中，与效应子部分的缀合可以通过化学或重组方式进行，所述化学方式是 在两个分子之间形成共价键以形成一个分子。
在某些实施方案中，所述效应子部分可以是治疗部分。治疗部分是指可用作治疗剂的化合物。所述缀合物利用TCR的靶向性使得治疗部分产生对TCR所靶向细胞的治疗效应。
在某些实施方案中，所述治疗部分选自免疫增强剂，例如免疫刺激性细胞因子或免疫刺激性抗体。在某些示例性实施方案中，所述免疫刺激性细胞因子选自例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF、或其任意组合。所列举的各种细胞因子是指具有该细胞因子天然生物学活性的多肽，例如包括全长蛋白、其活性片段或突变体。例如IL-2是指具有IL-2活性的多肽，其可以是全长IL-2、IL-2的活性片段或突变体。在某些示例性实施方案中，所述免疫刺激性抗体选自例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD40L(CD154)抗体、抗41BB(CD137)抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体或其任意组合。在某些实施方案中，所述免疫增强剂选自抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2、IL-15或其任意组合。
在某些实施方案中，所述治疗部分选自细胞毒剂。在本文中，所述细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。
在某些实施方案中，所述细胞毒剂选自烷化剂、微管抑制剂或有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂，及其任意组合。
可用于本发明的缀合物的烷化剂的实例包括但不限于氮芥类(如双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺等)、乙烯亚胺类(如塞替哌等)、硫酸酯及多元醇类(如白消安、二溴甘露醇)、亚硝基脲类(如卡莫司汀、洛莫司汀等)、铂类抗肿瘤剂(如顺铂、奥沙利铂、卡铂等)等。
可用于本发明的缀合物的有丝分裂抑制剂或微管抑制剂的实例包括但不限于美登素类(例如美登素、美登醇、美登醇的C-3酯等)、紫杉烷类(例如多西他赛、紫杉醇或纳米颗粒紫杉醇等)、长春花生物碱类(例如硫酸长春地辛、长春新碱、长春花碱或长春瑞滨等)
可用于本发明的缀合物的抗肿瘤抗生素的实例包括但不限于放线菌素、蒽环类抗生素(例如柔红霉素、阿霉素、表柔比星、伊达比星等)、卡利奇霉素、倍癌霉素等。
可用于本发明的缀合物的抗代谢物的实例包括但不限于叶酸拮抗剂(例如甲氨蝶呤 等)、嘧啶拮抗剂(例如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他滨、吉西他滨等)、嘌呤拮抗剂(例如6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤等)、腺苷脱氨酶抑制剂(例如克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨、喷司他丁等)。
可用于本发明的缀合物的拓扑异构酶抑制剂的实例包括但不限于(喜树碱类及其衍生物(例如伊立替康、托泊替康等)、安吖啶、道诺霉素、阿霉素、表鬼臼毒素类、玫瑰树碱类、表柔比星、依托泊苷、丙亚胺、替尼泊苷等。
可用于本发明的缀合物的酪氨酸激酶抑制剂的实例包括但不限于阿西替尼、博舒替尼、西地尼布、达沙替尼、厄洛替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、来妥替尼、尼洛替尼、司马沙尼、舒尼替尼、凡德他尼等。
可用于本发明的缀合物的放射性核素剂的实例包括但不限于于I 131、In 111、Y 90、Lu 177等。
在某些实施方案中，所述效应子部分能够增加TCR的可溶性。在某些实施方案中，所述效应子部分选自各种亚类免疫球蛋白(例如IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链恒定区的各种部分。在某些实施方案中，所述效应子部分选自人免疫球蛋白的恒定区，例如重链恒定区或轻链恒定区。
在某些实施方案中，所述效应子部分选自可检测的标记。本发明所述的可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如， 3H、 125I、 35S、 14C或 32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如， )、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。如上所述的可检测的标记可通过本领域已知的方法检测。例如，放射性标记可使用摄影胶片或闪烁计算器检测，荧光标记物可使用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物及检测通过酶对底物的作用产生的反应产物来检测，及测热标记物通过简单可视化着色标记物来检测。在某些示例性实施方案中，所述可检测的标记选自酶、放射性核素、荧光染料、发光物质(如化学发光物质)或生物素。
在某些实施方案中，本发明的TCR或其抗原结合片段任选地通过接头(例如肽接头)与效应子部分缀合。在某些实施方案中，所述效应子部分连接至本发明的TCR或其抗原结合片段的N端或C端。
在某些实施方案中，当所述效应子部分是肽或蛋白时，所述缀合物优选地是融合蛋白。
因此，在第五方面，本发明还提供了一种融合蛋白，其包含第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段以及另外的肽或蛋白。
在某些实施方案中，本发明的TCR或其抗原结合片段任选地通过肽接头与另外的肽或蛋白融合。在某些实施方案中，所述效应子部分连接至本发明的TCR或其抗原结合片段的N端或C端。
在某些实施方案中，所述另外的肽或蛋白可以选自第四方面中所描述的各种是肽或蛋白的效应子部分。
在某些实施方案中，所述另外的肽或蛋白选自治疗性肽或蛋白、免疫球蛋白恒定区(例如人免疫球蛋白恒定区)、可检测的蛋白标记物(protein label)或蛋白标签(protein tag)。
在某些实施方案中，所述治疗性肽或蛋白选自：免疫刺激性抗体(例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD40L(CD154)抗体、抗41BB(CD137)抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体或其任意组合)，免疫刺激性细胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF、或其任意组合)，或对细胞具有毒性、可抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的肽或蛋白(例如胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL或FasL)。
在某些实施方案中，所述可检测的蛋白标记物选自酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP))或生物素等。
在某些实施方案中，所述蛋白标签选自His、Flag、GST、MBP、HA或Myc等，本领域技术人员已知如何根据期望目的(例如，纯化、检测或示踪)选择合适的蛋白标签。
表位肽、TCR及融合蛋白的制备
本发明的表位肽、TCR或包含TCR的融合蛋白可以本领域已知的各种方法来制备，例如通过基因工程重组技术来获得。例如，通过化学合成或PCR扩增获得编码它们的DNA分子；将所得DNA分子插入表达载体内，然后转染宿主细胞；然后，在特定条件下 培养转染后的宿主细胞，并表达本发明的表位肽、TCR或包含TCR的融合蛋白。
因此，在第六方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含：
(i)编码第一方面所述的表位肽或其变体的核苷酸序列；
(ii)编码第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段或其α链可变区和/或β链可变区的核苷酸序列；
(iii)编码第五方面所述的融合蛋白的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述分离的核酸分子包含编码第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段的α链可变区的第一核苷酸序列和编码其β链可变区的第二核苷酸序列。在某些实施方案中，所述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列任选地通过编码自裂解肽(例如P2A，E2A，F2A或T2A)的核苷酸序列连接。在某些实施方案中，所述自裂解肽是P2A。
在第七方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含第六方面所述的分离的核酸分子。在某些实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在第八方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含第六方面所述的分离的核酸分子或第七方面所述的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。在某些实施方案中，所述宿主细胞是微生物。
在另一个方面，还提供了制备本发明的表位肽、TCR或包含TCR的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养第八方面所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述表位肽、TCR或包含TCR的融合蛋白。
经改造的抗原呈递细胞(APC)
本发明的表位肽及其变体可以用于基于T细胞的免疫治疗中。在一些情况下，T细胞可以通过其TCR识别提呈在APC表面的MHC-肽复合物，以诱导对RAS突变体的MHC限制性的免疫应答。
因此，在第九方面，本发明提供了一种经改造的抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递第一方面所述的表位肽或其变体。
在某些实施方案中，所述表位肽或其变由MHC-II类分子呈递。
在某些实施方案中，所述MHC-II类分子是HLA-DQ。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0603、HLA-DQB1*0604、HLA-DQB1*0302中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319中的一种。更优选地，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505、HLA-DQA1*0102、HLA-DQA1*0103、HLA-DQA1*0301中的一种。优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0319或HLA-DQB1*0303中的一种(优选地为HLA-DQB1*0301)，并且还包含选自HLA-DQA1*0501或DQA1*0505中的一种。
在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0301和HLA-DQA1*0505。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0303和HLA-DQA1*0505。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0501。在某些实施方案中，所述HLA-DQ包含HLA-DQB1*0319和HLA-DQA1*0505。
在某些实施方案中，所述APC选自树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴母细胞样细胞(LCL)或其任意组合。
在某些实施方案中，所述APC是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA-DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性；优选地，所述APC是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性；更优选地，所述APC是HLA-DQB1*0301阳性。
在某些实施方案中，所述APC是HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性；优选地，所述APC是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性。
在某些实施方案中，所述APC是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或 HLA-DQB1*0303阳性(优选地为HLA-DQB1*0301阳性)，并且还是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性。
在某些实施方案中，所述APC的HLA-DP配型是HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0505或HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0501。
在某些实施方案中，所述APC分离自HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA-DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性的受试者；优选地，所述APC分离自HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性的受试者；更优选地为HLA-DQB1*0301阳性。
在某些实施方案中，所述APC分离自HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性的受试者；优选地，所述APC分离自HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性的受试者。
在某些实施方案中，所述APC分离自HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或HLA-DQB1*0303阳性(优选地为HLA-DQB1*0301阳性)、并且HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性的受试者。
在某些实施方案中，所述APC分离自具有下述HLA-DP配型的受试者：HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0501或HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0501。
在某些实施方案中，所述经改造的APC通过在体外将APC与第一方面所述的表位肽或其变体接触(即将APC暴露于足量的所述表位肽或其变体)而获得。在某些实施方案中，所述经改造的APC通过在体外将包含编码第一方面所述的表位肽或其变体的核苷酸序列的表达载体引入APC而获得。
第九方面所述的APC可以是自身的/自体的(“自我”)或非自身的(“非自我”，例如同种异体的)。“自身的”是指来自同一受试者的细胞；“同种异体的”是指与比较细胞遗传不同的同一物种的细胞。
第九方面所述的APC可以从发现此类细胞的任何组织中分离或获得，或者可以以其它方式培养并且提供。例如，APC可以在哺乳动物的骨髓或外周血单个核细胞(PBMC)，哺乳动物的脾脏中或哺乳动物的皮肤中(即在皮肤中可以找到朗格汉斯细胞，其拥有与DC的特质类似的某些特质)中找到，然后在含有适当细胞因子的培养基中进行培养以及分选，从而获得APC。
在另一方面，本发明提供了制备上述经改造的APC的方法，其包括：(1)提供来自受试者的APC；(2)在体外将所述APC与第一方面所述的表位肽或其变体接触或者将包含编码第一方面所述的表位肽或其变体的核苷酸序列的表达载体引入所述APC，以获得在其表面上呈递所述表位肽或其变体的APC。
经改造的免疫细胞
本发明的TCR或其抗原结合片段可以用于基于T细胞的免疫治疗中。在一些情况下，表达本发明TCR的T细胞通过识别MHC-肽复合物，以诱导对RAS突变体的MHC限制性的免疫应答。
因此，在第十方面，本发明提供了一种经改造的免疫细胞，其在细胞表面上表达第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段。本发明的经改造的免疫细胞对RAS G13D突变体具有抗原特异性。在某些实施方案中，本发明的经改造的免疫细胞具有选自下列的一项或多项特征：
(i)特异性结合RAS G13D突变体，不结合或以较低亲和力结合其它RAS蛋白(包括野生型RAS蛋白或其他突变体)；
(ii)特异性结合第一方面所述的表位肽或其变体(例如SEQ ID NOs:14-23、26-27任一项所示的序列，特别是SEQ ID NO:20)；
(iii)在与展示(例如，在MHC-II背景下展示)本发明的表位肽或其变体的APC共培养时活化，所述活化的非限制性实例包括：细胞因子(例如，IL-2、IFN-γ等)分泌水平、增殖活性、和/或活化标记(例如，CD25、CD69、CD107a等)表达水平增加，以及对展示(例如，在MHC-II背景下展示)本发明的表位肽或其变体的第二细胞的杀伤活性增加。
在某些实施方案中，所述经改造的免疫细胞包含编码第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段的核苷酸序列。
第十方面所述的免疫细胞可以从发现此类细胞的任何组织中分离或获得。例如，APC 可以在哺乳动物的外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、腹水、胸腔积液、脾组织或肿瘤中找到，然后任选地在含有适当细胞因子的培养基中进行培养以及分选，从而获得所需的免疫细胞。或者，所述的免疫细胞也可以以其它方式培养并且提供，例如从免疫细胞的前体细胞(例如，T淋巴细胞的前体)经诱导分化获得，所述的前体细胞例如可以是多能干细胞(例如，胚胎干细胞、诱导的多能干细胞)、造血干细胞或淋巴细胞祖细胞，造血干细胞或淋巴细胞祖细胞从例如骨髓、脐带血或外周血中分离和/或富集。
在某些实施方案中，所述免疫细胞是淋巴细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、或其任意组合。可用于表达本发明的TCR的示例性免疫细胞包括PBMC、TIL和/或T细胞。在某些实施方案中，T细胞选自由：αβT细胞、γδT细胞、iPSC诱导的T细胞、CD8+细胞毒性T细胞、CD4+细胞毒性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如，Th1或Th2细胞)、CD4/CD8双阳性T细胞、肿瘤浸润T细胞、胸腺细胞、记忆T细胞、自然杀伤T细胞，例如，恒定型自然杀伤T细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞包含CD4+T细胞。本领域技术人员将理解，免疫细胞还可以包括免疫细胞的祖细胞(前体细胞)，其中所述祖细胞可以在体内或体外经诱导以分化成免疫细胞。因此，在某些实施方案中，免疫细胞包括免疫细胞的祖细胞，例如含于衍生自脐血、骨髓或流动周边血液的CD34+细胞群体内的造血干细胞(HSC)，其在施用给受试者后分化成成熟免疫细胞，或其可以在体外经诱导以分化成成熟免疫细胞。
第十方面所述的免疫细胞可以是自身的/自体的(“自我”)或非自身的(“非自我”，例如同种异体的)。“自身的”是指来自同一受试者的细胞；“同种异体的”是指与比较细胞遗传不同的同一物种的细胞。
在某些实施方案中，所述免疫细胞分离自HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA-DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性的受试者；优选地，所述免疫细胞分离自HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性的受试者；更优选地为HLA-DQB1*0301阳性。
在某些实施方案中，所述免疫细胞分离自HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性的受试者；优选地，所述免疫细胞分离自HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性 的受试者。
在某些实施方案中，所述免疫细胞分离自HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或HLA-DQB1*0303阳性(优选地为HLA-DQB1*0301阳性)、并且HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性的受试者。
在某些实施方案中，所述免疫细胞分离自具有下述HLA-DP配型的受试者：HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0505或HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0501。
应理解，本发明的经改造的免疫细胞可以包含在一种分离的细胞群体中。细胞群体可以是异质群体，例如所述细胞群体在包含本发明的经改造的免疫细胞之外还含有至少一种其他细胞，所述其他细胞对Ras G13D突变体不具有抗原特异性，或者例如所述细胞群体包含多于一种类型的免疫细胞，但这些类型的免疫细胞均表达本发明的TCR从而具有对RAS G13D突变体的抗原特异性。此外，所述细胞群体也可以是基本上同质的群，例如其中该群主要包括(如，基本上由以下组成)对Ras G13D突变体具有抗原特异性的T细胞。
在另一方面，本发明提供了制备上述经改造的免疫细胞的方法，其包括：(1)提供来自受试的免疫细胞；(2)将包含编码本发明的TCR或其抗原结合片段的核苷酸序列的核酸分子或载体引入步骤(1)所述的免疫细胞，以获得表达所述TCR或其抗原结合片段的免疫细胞。
在某些实施方案中，在步骤(1)中，所述免疫细胞经过预处理；所述预处理包括免疫细胞的分选、激活和/或增殖。在某些实施方案中，所述预处理包括将免疫细胞与选自抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2和IL-15中的一种或多种接触，从而刺激所述免疫细胞并诱导其增殖，由此生成经预处理的免疫细胞。
在某些实施方案中，在步骤(2)中，可以通过各种合适的方式将所述核酸分子或载体引入免疫细胞，例如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、显微注射、电穿孔、TALEN方法、ZFN方法、非病毒载体介导的转染(例如脂质体)或病毒载体介导的转染(如慢病毒感染，逆转录病毒感染，腺病毒感染)，以及其他用于转移入宿主细胞的物理、化学或生物学手段，如转座子技术，CRISPR-Cas9等技术。
在某些实施方案中，在步骤(2)之后，所述方法还包括：扩增步骤(2)获得的免疫细胞。
基于表位肽的疗法
本发明的表位肽或提呈该表位肽的APC可以用于基于T细胞的免疫治疗中，以诱导抗肿瘤免疫应答。
因此，在第十一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含：第一方面所述的表位肽或其变体或如上所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第九方面所述的经改造的抗原呈递细胞(APC)；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物是肿瘤疫苗。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含佐剂。佐剂是那些能够非特异性地增强免疫反应的物质，例如弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，Toll受体的配体，免疫刺激性抗体(例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD40L(CD154)抗体、抗41BB(CD137)抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体或其任意组合)或免疫刺激性细胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF、或其任意组合IL-2)等。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的治疗剂，例如抗肿瘤剂或免疫增强剂。
在某些实施方案中，所述抗肿瘤剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂(例如吉西他滨、5-氟尿嘧啶、紫杉烷、顺铂等)、抗血管生成剂、细胞因子(例如GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21等)、特异性靶向肿瘤细胞抗体(例如，CD20抗体如利妥昔单抗、Her2抗体如曲妥珠单抗、VEGF抗体如贝伐珠单抗、EGFR抗体如西妥昔单抗等)、免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体或TIM3抗体)。
在某些实施方案中，所述免疫增强剂选自免疫刺激性抗体(例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD40L(CD154)抗体、抗41BB(CD137)抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体或其任意组合)或免疫刺激性细胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF、或其任意组合)。
在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的表位肽或其变体、MHC-肽复合物、经改造的APC与所述另外的治疗剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。
在第十二方面，本发明提供了用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的第一方面所述的表位肽或其变体、如上所述MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第九方面所述的经改造的抗原呈递细胞(APC)、或第十一方面所述的药物组合物。
在某些实施方案中，所述具有RAS G13D突变的肿瘤选自结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌或急性髓系白血病。
在某些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA-DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性；更优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性。
在某些实施方案中，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性。
在某些实施方案中，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或HLA-DQB1*0303阳性(优选地为HLA-DQB1*0301阳性)，并且还是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性。
在某些实施方案中，所述受试者具有选自下列的HLA-DP配型：HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0505或HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0501。
在某些实施方案中，第一方面所述的表位肽或其变体、如上所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第九方面所述的经改造的抗原呈递细胞(APC)、或第十一方面所述的药物组合物可以与另外的治疗剂(例如免疫增强剂或抗肿瘤剂)联合施用。因此，在某些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用另外的治疗剂(例如免疫增强剂或抗肿瘤剂)，例如同时、分开或相 继施用。
在某些实施方案中，第一方面所述的表位肽或其变体、如上所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第九方面所述的经改造的抗原呈递细胞(APC)、或第十一方面所述的药物组合物可以与额外的疗法组合施用，例如同时、分开或相继施用。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗。
本发明的表位肽或其变体、如上所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、经改造的抗原呈递细胞(APC)、或包含它们的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的表位肽或其变体、如上所述的MHC-肽复合物、经改造的抗原呈递细胞(APC)或包含它们的药物组合物，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
因此，在某些示例性实施方案中，第十一方面所述的药物组合物包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的表位肽或其变体、如上所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其 变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、经改造的抗原呈递细胞(APC)、或包含它们的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的表位肽或其变体、如上所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、经改造的抗原呈递细胞(APC)、或包含它们的药物组合物通过静脉注射或推注给予。
第十一方面所述的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的表位肽或其变体、如上所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞或经改造的抗原呈递细胞(APC)。在该语境下，“治疗有效量”是能够在治疗的受试者中产生免疫应答的量，该免疫应答能够降低或抑制肿瘤细胞的增殖和/或消除肿瘤细胞。“预防有效量”是指能够在治疗的受试者中产生针对靶细胞(例如含有RAS突变的肿瘤细胞)的免疫应答的量，该免疫应答能够预防受试者中肿瘤的形成，或者能够实质上减少受试者形成肿瘤或继续形成肿瘤的机会。
在另一方面，本发明提供了第一方面所述的表位肽或其变体、如上所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第九方面所述的经改造的抗原呈递细胞(APC)、或第十一方面所述的药物组合物，在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤。
基于TCR的疗法
本发明的TCR或表达该TCR的免疫细胞可以用于基于T细胞的免疫治疗中，以实现对含有RAS G13D突变的肿瘤的杀伤。
因此，在第十三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含：第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段、第四方面所述的缀合物、或第五方面所述的融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第十方面所述的经改造的免疫细胞；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含另外的治疗剂，例如抗肿瘤剂或免疫增强剂。
在某些实施方案中，所述抗肿瘤剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂(例如吉西他滨、5-氟尿嘧啶、紫杉烷、顺铂等)、抗血管生成剂、细胞因子(例如GM-CSF、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21等)、特异性靶向肿瘤细胞抗体(例如，CD20抗体如利妥昔单抗、Her2抗体如曲妥珠单抗、VEGF抗体如贝伐珠单抗、EGFR抗体如西妥昔单抗等)、免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体或TIM3抗体)。
在某些实施方案中，所述免疫增强剂选自免疫刺激性抗体(例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD40L(CD154)抗体、抗41BB(CD137)抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体或其任意组合)或免疫刺激性细胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF、或其任意组合)。
在某些实施方案中，在所述药物组合物中，本发明的TCR或其抗原结合片段、缀合物、融合蛋白或经改造的免疫细胞与所述另外的治疗剂可以作为分离的组分或作为混合的组分提供。
在第十四方面，本发明提供了用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段、第四方面所述的缀合物、或第五方面所述的融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十三方面所述的药物组合物。
在某些实施方案中，所述具有RAS G13D突变的肿瘤选自结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌或急性髓系白血病。
在某些实施方案中，所述受试者是人。
在某些实施方案中，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA-DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301 阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性；更优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性。
在某些实施方案中，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性。
在某些实施方案中，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或HLA-DQB1*0303阳性(优选地为HLA-DQB1*0301阳性)，并且还是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性。
在某些实施方案中，所述受试者具有选自下列的HLA-DP配型：HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0301/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0501、HLA-DQB1*0303/HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0505或HLA-DQB1*0319/HLA-DQA1*0501。
在某些实施方案中，所述方法包括：(1)提供受试者所需的免疫细胞；(2)将编码第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段的核苷酸序列导入步骤(1)所述的免疫细胞，获得在表面上表达所述TCR或其抗原结合片段的免疫细胞；(3)将步骤(2)中获得的免疫细胞施用至所述受试者。
在某些实施方案中，在步骤(1)之前包括从所述受试者获得免疫细胞的步骤。免疫细胞可以从发现此类细胞的任何组织(例如外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤)中分离或获得，或者可以以其它方式培养并且提供，例如从免疫细胞的前体细胞(例如，T淋巴细胞的前体)经诱导分化获得。
在某些实施方案中，所述免疫细胞选自淋巴细胞。在某些实施方案中，所述免疫细胞选自T细胞(例如αβT细胞、γδT细胞或iPSC诱导的T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、或其任意组合。在某些实施方案中，所述免疫细胞包含CD4+T细胞。
在某些实例性实施方案中，从所述受试者获得外周血单核细胞(PBMC)和/或TIL，并对其直接进行遗传修饰以表达TCR。
在某些实例性实施方案中，从所述受试者获得T细胞，并对其进行遗传修饰以表达TCR。T细胞可获自多种来源，例如可以利用技术人员已知的多种技术(如沉积，例如FICOLLTM分离)从收集自对象的血液单位获得T细胞。在一个实施方案中，通过血浆 分离置换法(apheresis)获得来自个体循环血的细胞。血浆分离置换法的产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以对通过血浆分离置换法收集的细胞进行洗涤，以移除血浆级分，并将细胞置于合适的缓冲剂或介质中用于随后处理。如本领域普通技术人员所理解，可以通过本领域技术人员已知的方法，如通过使用半自动流通式离心机，来完成洗涤步骤。洗涤之后，可在多种生物相容的缓冲剂或者含有或不含缓冲剂的其它盐溶液中重悬细胞。在某些实施方案中，可在细胞直接重悬的培养基中移除血浆分离置换法样品中不想要的组分。在某些实施方案中，通过裂解红细胞并耗尽单核细胞(例如，通过经PERCOLLTM梯度离心)，从外周血单核细胞(PBMC)分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达下述标志物中的一种或多种的特定T细胞亚群：CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO。在一个实施方案中，通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达CD3、CD28、CD4、CD8、CD45RA和CD45RO的特定T细胞亚群。例如，可以用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择的T细胞群的富集。一种实例性方法是经负磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁性免疫粘附或流式细胞术利用针对被阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。也可将流式细胞术和细胞分选用于分离本发明使用的目的细胞群。
在某些实施方案中，在对免疫细胞(如T细胞)进行遗传修饰之前，可以在体外活化并扩增(或者在祖细胞的情况下，分化)免疫细胞。
在某些实施方案中，第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段、第四方面所述的缀合物、或第五方面所述的融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十三方面所述的药物组合物可以与另外的治疗剂(例如免疫增强剂或抗肿瘤剂)联合施用。因此，在某些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用另外的治疗剂(例如免疫增强剂或抗肿瘤剂)，例如同时、分开或相继施用。
在某些实施方案中，第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段、第四方面所述的缀合物、或第五方面所述的融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第十方面所述的经改造的免 疫细胞、或第十三方面所述的药物组合物可以与额外的疗法组合施用，例如同时、分开或相继施用。这种额外的疗法可以是已知用于肿瘤的任何疗法，例如手术、化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、激素治疗、基因治疗或姑息治疗。
本发明的TCR或其抗原结合片段、缀合物、融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、经改造的免疫细胞、或包含它们的药物组合物可以配制成医学领域已知的任何剂型，例如，片剂、丸剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、酏剂、锭剂、栓剂、注射剂(包括注射液、注射用无菌粉末与注射用浓溶液)、吸入剂、喷雾剂等。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。本发明的药物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的TCR或其抗原结合片段、缀合物、融合蛋白、经改造的免疫细胞、或包含它们的药物组合物，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
因此，在某些示例性实施方案中，第十三方面所述的药物组合物包含无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
本发明的TCR或其抗原结合片段、缀合物、融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、经改造的免疫细胞、或包含它们的药物组合物可以通过本领域已知的任何合适的方法来施用，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。但是，对于许多治疗用途 而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射或推注，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在某些实施方案中，本发明的TCR或其抗原结合片段、缀合物、融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、经改造的免疫细胞、或包含它们的药物组合物通过静脉注射或推注给予。
第十三方面所述的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的TCR或其抗原结合片段、缀合物、融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、经改造的免疫细胞、或包含它们的药物组合物。在该语境下，“治疗有效量”是能够在治疗的受试者中产生免疫应答的量，该免疫应答能够降低或抑制肿瘤细胞的增殖和/或消除肿瘤细胞。“预防有效量”是指能够在治疗的受试者中产生针对靶细胞(例如含有RAS突变的肿瘤细胞)的免疫应答的量，该免疫应答能够预防受试者中肿瘤的形成，或者能够实质上减少受试者形成肿瘤或继续形成肿瘤的机会。
在另一方面，本发明提供了第二或第三方面所述的TCR或其抗原结合片段、第四方面所述的缀合物、或第五方面所述的融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或缀合物或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或第十方面所述的经改造的免疫细胞、或第十三方面所述的药物组合物，在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤。
基于表位肽和TCR的组合疗法
在一些情况下，本发明的表位肽或提呈该表位肽的APC、与本发明的TCR或表达该TCR的免疫细胞也可以组合施用，以实现对含有RAS G13D突变的肿瘤的联合治疗。因此，本发明的另一方面还提供了一种用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者组合施用有效量的第一治疗剂和第二治疗剂，所述第一治疗剂选自本发明的表位肽或提呈该表位肽的APC，所述第二治疗剂选自本发明的TCR或表达该TCR的免疫细胞。所述第一治疗剂和第二治疗剂可以同时、分开或相继施用。本发明的另一方面还提供了本发明的表位肽或提呈该表位肽的APC、与本发明的TCR或 表达该TCR的免疫细胞，在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤。前述基于表位肽的疗法和基于TCR的疗法中所描述的剂型，给药途径，适应症，联合治疗等各个方面都可以应用到所述表位肽和TCR的组合疗法中。
术语定义
在本申请中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。除非在本文别处具体限定或不同地描述，否则以下与本发明有关的术语和描述应按照下面给出的定义来理解。
如本文中所使用的，术语“RAS”是指一种原癌基因，其所编码的RAS蛋白具有GTP酶活性，参与众多调节细胞增殖、分化和凋亡相关的信号通路，例如MAPK、PI3K、STAT信号通路等。人类基因中包含3种RAS基因，分别是HRAS(GeneID：3265)、NRAS(GeneID：4893)和KRAS(GeneID：3845)，三种RAS基因具有高度的序列同源性(>90％)。RAS基因突变是癌症发生驱动因素，并且RAS基因突变是发生频率最高的原癌基因突变。由RAS基因编码的RAS蛋白的序列是本领域技术人员熟知的，可参见各种公共数据库。例如，KRAS蛋白的序列可参见NCBI:NP_001356715.1，NRAS蛋白的序列可参见NCBI:NP_002515.1，HRAS蛋白的序列可参见NCBI:NP_001123914.1。
如本文中所使用的，术语“RAS G13D突变体”是指，第13位氨基酸残基Gly突变为Asp的RAS突变体。在一些实施方案中，RAS G13D突变体是指KRAS G13D突变体。在本文中，当提及RAS G13D突变体的氨基酸序列时，使用SEQ ID NO：51所示的序列来进行描述。例如，表述“RAS G13D突变体蛋白的第7-17位氨基酸残基”是指，SEQ ID NO：51所示序列的第7-17位氨基酸残基，或者其他RAS G13D突变体氨基酸序列的相应片段。“相应片段”是指，当对序列进行最优比对时，即当序列进行比对以获得最高百分数同一性时，进行比较的序列中位于等同位置的片段。
如本文中所使用的，术语“主要组织相容性复合体”和“MHC”可互换使用，其是一组决定移植组织是否相同、与免疫应答密切相关、紧密连锁的基因群，主要包括MHC-I类分子和MHC-II类分子。“MHC-I类分子”是指MHC I类α链和β2微球蛋白链的二聚 体，“MHC-II类分子”是指MHC II类α链和MHC II类β链的二聚体。人类的MHC称为人类白细胞抗原(HLA)复合体。
如本文中所使用的，术语“MHC-肽复合物”是指包含结合在本领域公认的MHC肽结合口袋中的肽的MHC分子(MHC I类或MHC II类)。在一些情况下，MHC分子可以是在细胞表面上表达的膜结合蛋白。在另一些情况下，MHC分子可以是缺乏跨膜区或胞质区的可溶性蛋白质。
如本文中所使用的，关于TCR的术语“表位”是指，TCR可以结合的抗原(例如，肽或肽-MHC复合物)的局部区。在某些实施方案中，TCR结合的表位可以通过例如NMR光谱、X射线衍射结晶学研究、ELISA测定、氢/氘交换质谱(例如，液相色谱电喷雾质谱法)、流式细胞术分析、诱变作图(例如，定点诱变作图)和/或结构建模来测定。在一些示例性实施方案中，使用丙氨酸扫描诱变研究测定抗原的表位。在某些实施方案中，抗原是肽-MHC复合物或由MHC分子呈递的肽。
如本文中所使用的，术语“T细胞受体”和“TCR”可互换使用并且是指包括来自αβ或γδT细胞受体的CDR或可变区的分子。TCR的实例包含但不限于全长TCR、TCR的抗原结合片段、缺乏跨膜区和胞质区的可溶性TCR、含有通过柔性接头附接的TCR可变区的单链TCR、通过工程化二硫键连接的TCR链等。
如本文中所使用的，术语“全长TCR”是指包括第一多肽链和第二多肽链的二聚体的TCR，所述多肽链中的每一个包括TCR可变区和包括TCR跨膜区和TCR胞质区的TCR恒定区。在某些实施方案中，全长TCR包括成熟的全长TCRα链和成熟的全长TCRβ链。在某些实施方案中，全长TCR包括成熟的全长TCRγ链和成熟的全长TCRδ链。
如本文中所使用的，术语“TCR可变区”是指成熟TCR多肽链(例如，TCRα链或β链)的部分，所述部分不由TCRα链的TRAC基因、TCRβ链的TRBC1基因或TRBC2基因、TCRδ链的TRDC基因或TCRγ链的TRGC1基因或TRGC2基因编码。在某些实施方案中，TCRα链的TCR可变区涵盖由TRAV基因和/或TRAJ基因编码的成熟TCRα链多肽的所有氨基酸，并且TCRβ链的TCR可变区涵盖由TRBV基因、TRBD基因和/或TRBJ基因编码的成熟TCRβ链多肽的所有氨基酸(参见例如，《T细胞受体资料手册(T cell receptor Factsbook)》,(2001),LeFranc和LeFranc,学术出版社(Academic Press),ISBN0-12-441352-8，所述文献通过引用整体并入本文中)。TCR可变区通常包括框架区(FR)1、2、3和4以及互补决定区(CDR)1、2和3。在本文中，术语“α链可变区” 和“Vα”可互换使用，并且是指TCRα链的可变区。术语“β链可变区”和“Vβ”可互换使用，并且是指TCRβ链的可变区。
如本文中所使用的，关于TCR的术语“CDR”或“互补决定区”是指在TCR链(例如，α链或β链)的可变区内发现的非邻接的抗原结合位点。这些区已经在Lefranc,(1999)《免疫学家(The Immunologist)》7:132-136；Lefranc等人,(1999)《核酸研究(Nucleic AcidsRes)》27:209-212；LeFranc(2001)《T细胞受体资料手册》,学术出版社,ISBN 0-12-441352-8；Lefranc等人,(2003)《发展竞争免疫学(Dev Comp Immunol)》27(1):55-77；以及在Kabat等人,(1991)《免疫学上所关注的蛋白的序列(Sequences of protein of immunologicalinterest)》中描述，所述文献中的每一个文献通过引用整体并入本文中。在某些实施方案中，根据上文Lefranc(1999)中所描述的IMGT编号系统定义CDR。在某些实施方案中，根据上文Kabat中所描述的Kabat编号系统定义CDR。
如本文中所使用的，关于TCR的术语“FR”或“框架区”是指TCR链(例如，α链或β链)可变区中除了如上定义的CDR以外的那些氨基酸残基。
如本文中所使用的，关于TCR的术语“恒定区”是指由TRAC基因(对于TCRα链)、TRBC1或TRBC2基因(对于TCRβ链)、TRDC基因(对于TCRδ链)或TRGC1或TRGC2基因(对于TCRγ链)编码的TCR的一部分，任选地缺少跨膜区的全部或一部分和/或胞质区的全部或一部分。在某些实施方案中，TCR恒定区缺少跨膜区和胞质区。TCR恒定区不包含由TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD、TRBJ、TRDV、TRDD、TRDJ、TRGV或TRGJ基因编码的氨基酸(参见例如，《T细胞受体资料手册》,(2001),LeFranc和LeFranc,学术出版社,ISBN0-12-441352-8，所述文献通过引用整体并入本文中)。
在TCR的背景下，术语“细胞外”是指TCR链的位于细胞外的一个或多个部分，“跨膜”是指TCR链的嵌入细胞的质膜中的一个或多个部分，“细胞质”是指TCR链的位于细胞的细胞质中的一个或多个部分。
如本文中所使用的，关于TCR的术语“抗原结合部分”是指TCR的任何部分或片段，所述部分或片段作为TCR一部分的保留了TCR(母本TCR)的生物学活性。所述生物学活性可以包括：特异性结合母本TCR所结合的相同抗原(例如RAS G13D突变体)或MHC-抗原复合物的能力。
如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以该相互作用的 平衡解离常数(K D)表示。在本发明中，术语“K D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。两分子间的特异性结合性质可使用本领域公知的方法进行测定。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。“结合速率常数”(k a或k on)和“解离速率常数”(k dis或k off)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出(参见Malmqvist M,Nature,1993,361:186-187)。kdis/kon的比率等于解离常数K D(参见Davies等人,Annual Rev Biochem,1990；59:439-473)。可用任何有效的方法测量K D、k on和k dis值，例如通过表面等离子体共振术(SPR)在Biacore中来测量，或使用生物发光干涉测量法或Kinexa来测量。
在TCR的背景下，术语“特异性结合”或“特异性识别”是指TCR优先结合特定抗原(例如，特定肽或特定肽-MHC复合物组合)的能力。通常，与抗原特异性结合的TCR不结合或以较低亲和力结合其它抗原。例如，相比于非特异性的其他抗原，抗原特异性TCR以至少缔合常数(K a)的2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1,000倍、5,000倍或10,000倍的K a与靶抗原结合。在某些实施方案中，本文所公开的TCR或其抗原结合片段与RAS G13D突变体特异性结合。在某些实施方案中，本文所公开的TCR或其抗原结合片段与第一方面所述的表位肽或其变体特异性结合。在某些实施方案中，本文所公开的TCR或其抗原结合片段与SEQ ID NOs:14-23、26-17任一项所示的序列(特别是SEQ ID NO:20)特异性结合。
如本文中所使用的，术语“抗原提呈细胞”或“APC”是指，能够在其细胞表面上呈递与主要组织相容性复合物(MHC)分子缔合的蛋白质的肽片段的任何细胞。此类细胞是本领域技术人员熟知的，包括但不限于例如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴母细胞样细胞(LCL)等等。
如本文中所使用的，术语“免疫细胞”是指具有一种或多种效应功能的免疫系统的任何细胞。免疫细胞典型地包括在免疫应答中起作用的细胞，它们通常具有造血的起源。术语“效应功能”指免疫细胞的特化功能，例如增强或促进对靶细胞的免疫攻击(例如对靶细胞的杀伤，或者抑制其生长或增殖)的功能或反应。例如，T细胞的效应功能，例如，可以是细胞溶解活性或者辅助或者包括细胞因子的分泌在内的活性。免疫细胞的实例包括T细胞(例如α/βT细胞和γ/δT细胞)、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、肥大细胞和骨髓来源巨噬细胞等等。
本发明所述的免疫细胞可以是自身的/自体的(“自我”)或非自身的(“非自我”，例如同种异体的、同基因的或异基因的)。如本文中使用的，“自身的”是指来自同一受试者的细胞；“同种异体的”是指与比较细胞遗传不同的同一物种的细胞；“同基因的”是指与比较细胞遗传相同的来自不同受试者的细胞；“异基因的”是指与比较细胞来自不同物种的细胞。在某些实施方案中，本发明的免疫细胞是自体的或同种异体的。
如本文中所使用的，术语“细胞毒剂”包括对细胞有害(例如杀死细胞)的任何试剂，例如化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。
如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞，免疫细胞(如T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞等)。宿主细胞可以包括单个细胞或细胞群体。
如本文中所使用的，术语“分离的”是指已经与天然伴随它的组分(例如核酸、蛋白质或其他天然存在的生物或有机分子)分离或纯化。
如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例 如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。还可使用已整合入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl Biosci.，4:11-17(1988))的算法，使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J MoI Biol.48:444-453(1970))算法，使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重(gap weight)和1、2、3、4、5或6的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中所使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。例如，可通过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人Proc.Natl Acad.Set USA 94:412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
本文涉及的二十个常规氨基酸的编写遵循常规用法。参见例如，Immunology-A Synthesis(2nd Edition,E.S.Golub and D.R.Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))，其以引用的方式并入本文中。在本发明中，术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩 写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，稀释剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，防腐剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于谷氨酸钠，明胶，SPGA，糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)，氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)，蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。在某些示例性实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括无菌可注射液体(如水性或非水性悬浮液或溶液)。在某些示例性实施方案中，此类无菌可注射液体选自注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化钠溶液(例如0.9％(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5％葡萄糖)、含有表面活性剂的溶液(例如0.01％聚山梨醇20)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)、Ringer氏溶液及其任意组合。
如本文中所使用的，术语“预防”是指，为了阻止或延迟疾病或病症或症状(例如，肿瘤)在受试者体内的发生而实施的方法。如本文中所使用的，术语“治疗”是指，为了获得有益或所需临床结果而实施的方法。为了本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于，减轻症状、缩小疾病的范围、稳定(即，不再恶化)疾病的状态，延迟或减缓疾病的发展、改善或减轻疾病的状态、和缓解症状(无论部分或全部)，无论是可检测或是不可检测的。此外，“治疗”还可以指，与期望的存活期相比(如果未接受治疗)，延长存活期。
如本文中所使用的，术语“有效量”是指足以获得或至少部分获得期望的效果的量。例 如，预防疾病(例如，肿瘤)有效量是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如，肿瘤)的发生的量；治疗疾病有效量是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。测定这样的有效量完全在本领域技术人员的能力范围之内。例如，对于治疗用途有效的量将取决于待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，例如灵长类哺乳动物，例如人。在某些实施方式中，术语“受试者”是指包括其中可以引出免疫应答的活生物体。在某些实施方式中，所述受试者(例如人)患有RAS G13D突变阳性肿瘤，或者，具有患有上述疾病的风险。
当本文使用术语“例如”、“如”、“诸如”、“包括”、“包含”或其类似表述时，这些术语将不被认为是限制性术语，而将被解释为表示“不限于”或“并且没有限制”。
发明的有益效果
本发明提供了Ras G13D突变体的表位肽以及特异性识别该表位肽的T细胞受体(TCR)、包括这些表位肽或TCR的细胞和药物组合物、编码这些表位肽或TCR的核酸、用于制备这些表位肽或TCR的载体和宿主细胞以及用于使用这些表位肽或TCR治疗受试者的方法。本发明所提供的表位肽和TCR能够诱导针对含有Ras G13D突变的肿瘤的免疫应答并因此治疗受试者的上述肿瘤。此外本发明所提供的表位肽和TCR为MHC-II限制性，该MHC-II限制性是在亚太人种占绝对优势的等位基因，因而特别适用于亚太地区的患者。此外，该MHC-II限制性也广泛分布于欧洲、美洲、大洋洲人种，因而具有广泛的应用前景。因此，本发明提供了全新的基于T细胞的免疫疗法，以用于Ras G13D突变阳性肿瘤的治疗，具有重大的临床价值。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
图1显示了实施例5中不同TIL克隆的IFNγ特异性释放结果。
图2显示了不同HLA-DQ配型HCT116细胞呈递G13D肽段诱导B8.2.4TCR-T特异性释放IL2的测定结果。
图3显示了不同HLA-DQ配型Lovo细胞呈递G13D肽段诱导B8.2.4TCR-T特异性释放IL2的测定结果。
图4显示了NCI-H1944细胞呈递G13D肽段诱导B8.2.4TCR-T特异性释放IL2的测定结果。
图5显示了NCI-H1944细胞呈递G13D肽段诱导B8.2.4TCR-T特异性释放IL2的测定结果。
图6显示了实施例7中负载不同长度的G13D肽段的抗原呈递细胞和B8.2.4TCR-T细胞共培养后的IL2释放结果。
图7显示了实施例8中负载含有不同位点丙氨酸替换的G13D肽段的抗原呈递细胞和B8.2.4TCR-T细胞共培养后的IL2释放结果。
图8显示了实施例9中B8.2.4TCR-T对Lovo-CIITA-DQA1*05:01/DQB1*0301-Luc细胞的选择性杀伤结果。
图9A-9B显示了实施例10中B8.2.4TCR-T对Ras G13D突变体的亲和力检测结果。
序列信息
本发明涉及的序列的信息提供于下面的表1中。
表1：序列信息
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：肿瘤浸润T细胞培养和扩增
含有Ras突变G13D结直肠癌患者手术切除肿瘤用外壳手术刀切碎至2mm-4mm肿瘤块，并用DPBS溶液清洗2次，培养于24孔板中，培养于TIL培养基含有IL2(6000IU/ml)、人AB血清(2％)、Hepes(25mM)、Xvivo15。每2-3天，更换一半培养基，待肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL，Tumor infiltrating T Lymphocytes)生长汇片至60-80％(含约0.5-3.0×10 6个TILs)时，收获TIL保存于CS10冻存液。
将TIL细胞按照1:30-1:200比例与经γ射线辐照的混合供体来源的外周血单核细胞(pooled PBMC，供体>3个)，混合培养于T175培养瓶，每个培养瓶细胞不超过1×108个(培养基为添加10ng/ml OKT3的TIL培养基)，培养3天后，更换一半培养基(含有3000IU/ml IL2、2％人AB血清的Xvivo15培养基)，培养7天后，细胞清洗一次后，更换培养基并按照1.0×10 6/ml传代；细胞培养10-14天后收获冻存。
实施例2：Ras G13D抗原mRNA制备
将含有Ras突变G13D序列，按照如下设计构建载体UTR-LAMP3 Lumenal-KRAS G13D-LMP3 Sorting-UTR，序列如SEQ ID NO:1所示，在表1中，KRAS以单下划线标出，G13D突变以双下划线标出。将以上序列经基因合成并克隆至pcDNA3.1载体，利用T7启动子在体外进行mRNA转录(mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit，Thermofisher)，将转录的mRNA分装保存于-80℃。
实施例3：抗原呈递筛选
DC细胞成熟(Dendritic Cell，树突状细胞)：将患者自体外周血CD14阳性细胞 用MACS CD14 Isolation Kit进行分选，并培养于AIM-V培养基含IL4(1000IU/ml)、GM-CSF(1000IU/ml)和1％人AB血清。培养至第三天更换新鲜培养基并在培养5-6天冻存于CS10冻存液中。
LCL细胞诱导(Lymphoblastoid Cell Line，淋巴母细胞系)：将患者外周血单核细胞5×10 6用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，并加入含有EBV的B95.8细胞培养液，诱导一般在14-30天时间完成，在诱导期间每7天更换一半培养基，将诱导建立的LCL细胞系扩增冻存。
将TIL细胞复苏后，培养至少48小时可用于筛选实验。将DC细胞或LCL细胞，简称抗原呈递细胞APC(Antigen Presenting Cell)利用Neon电转仪进行KRAS G13D mRNA转染(APC细胞重悬于电转液至1×10 7/ml，每次电转100μl，加入5-8μg mRNA；1500V，30ms，1pulse)后第二天可用于筛选实验。在96孔U型底板中，加入1-2×10 5TIL细胞和经电转的0.5×10 5DC细胞或4×10 5LCL细胞培养于Xvivo15培养基中，培养16小时后收集细胞培养上清，利用Human IFNγFlex Set测定上清中IFNγ释放。编号为B8患者为转移性结直肠癌，其肿瘤具有KRAS G13D突变，TIL筛选结果如下：
表2：TIL筛选结果
TIL Fraction IFNγ-Ctrl IFNγ-G13D 相对变化
B8.1 726 755 1.0
B8.2 744 1877 2.5
B8.3 1086 3559 3.3
B8.4 14464 15413 1.1
B8.5 776 837 1.1
B8.6 1188 2172 1.8
B8.7 3146 3197 1.0
B8.8 1226 1198 0.9
Ctrl：TIL与未电转的APC共同培养
G13D：TIL与经G13D mRNA电转的APC共同培养
实施例4：TIL分选和扩增
将经APC细胞刺激的TIL细胞，进行流式分选，取1×10 6TIL细胞重悬于流式缓冲 液(1％人AB血清、2mM EDTA的DPBS溶液)中，加入CD3/CD137抗体和PI(碘化丙啶溶液)，于4℃孵育1小时后，用流式缓冲液清洗2次，并用BD FACSAiraII流式分选仪进行分选，分选群体为PI阴性中，CD3阳性和CD137阳性细胞群体。分选的细胞保存于含10％人AB血清的RPMI1640培养基中，并放置于冰上。将收集的分选细胞(CD3和CD137+)，在4℃时，300g离心10分钟，去除80％保存液，并用DPBS溶液清洗2次后，重悬于DPBS中，进行10×Genomics单细胞测序。
实施例5：识别KRAS G13D TCR筛选
将单细胞测序中TCR克隆按照TRAVmCa-P2A-TRBVmCb顺序进行基因合成，其中TRAV为TCR的α链可变区，mCa为鼠TCRα恒定区(其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:45和46所示)，TRBV为TCR的β链可变区，mCb为鼠TCRβ恒定区(其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:47和48所示)，P2A为自裂解肽(其核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示)；将上述序列克隆至慢病毒穿梭载体(GV401)；将穿梭载体按照标准的慢病毒载体包装方法瞬时转染293T细胞，收集培养上清，则培养上清中含有表达TCR的慢病毒载体。将来自健康捐献者的T细胞，经OKT3/15E8抗体包被的6孔板激活24小时，用含有TCR的慢病毒载体转导并继续培养6-8天用于TCR筛选(将经转导的T细胞收集，用FACS缓冲液清洗，1×10 6经修饰的T细胞加入识别鼠TCRβ恒定区抗体进行染色，可检测重组TCR表达)，以获得经重组TCR修饰的T细胞。
将编号B8患者自体的LCL细胞按照“实施例3”中电转方法，瞬时转染KRAS G13DmRNA，过夜培养；将经重组TCR修饰的T细胞与经电转的LCL细胞按照1×10 5：1×10 5接种共同培养于96孔U型底板中，检测上清中IFNγ特异性释放，结果如图1所示。筛选结果表明，克隆编号B8.2.4TCR可特异性识别KRAS G13D点突变而不识别野生型RAS。B8.2.4TCR序列如下表所示：
表3.B8.2.4 TCR序列
实施例6：B8.2.4 TCR HLA限制性测定
根据实施例5中所述的方法制备表达重组B8.2.4 TCR的T细胞(以下简称为B8.2.4 TCR-T)，包括将包含编码该重组TCR的核苷酸序列的慢病毒载体转导来自健康捐献者的T细胞，其中所述重组TCR的α链(TRAVmCa)和β链(TRBVmCb)的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:49和50所示。通过下述方法测定B8.2.4 TCR的HLA限制性。
HCT116和Lovo细胞系(结直肠癌)为含有KRAS G13D杂合子突变；NCI-H1944细胞系(肺癌)含有KRAS G13D杂合子突变；其HLA-DQ配型如下表4所示：
表4.不同细胞的HLA-DQ配型
将CIITA基因(Genebank ID：4261)过表达于HCT116、Lovo、NCI-H1944细胞，构建SW620-CIITA或CFPAC1-CIITA细胞系，并将HLA-DQA1*05:01/05:05和HLA-DQB1*03:01/03:03/03:19过表达构建HLA-DQ基因配型的细胞系(HLA-DQ组合参见表5)。将以上细胞收集后重悬于RPMI1640培养基中，加入10μg/ml Ras WT 23mer(序列如SEQ ID NO:12所示)或G13D 23mer(序列如SEQ ID NO:13所示)肽段(合成后，加入DMSO溶解)。37℃培养2小时后，用DPBS溶液清洗2次，按照2×10 4：2×10 4比例将负载肽段的抗原呈递细胞和B8.2.4 TCR-T细胞共同过夜培养于含有2％胎牛血清的RPMI1640培养基中，并测定上清中IL2或IFNγ释放，结果如图2-5所示。
表5.HLA-DQ组合
HLA-DQ组合 HLA-DQA1 HLA-DQB1
组合1 DQA1*05:01 DQB1*03:01
组合2 DQA1*05:01 DQB1*03:03
组合3 DQA1*05:05 DQB1*03:01
组合4 DQA1*05:05 DQB1*03:03
组合5 DQA1*05:01 DQB1*03:19
组合6 DQA1*05:05 DQB1*03:19
结果显示，B8.2.4 TCR可识别由HCT116细胞(HLA-DQA1*05:01或HLA-DQA1*05:05/DQB1*03:19)及HCT116-DQ(过表达表5中所示的前四种DQA1/DQB1组合)经外源呈递的RasG13D肽段，但不识别内源呈递的RasG13D表位。B8.2.4 TCR可识别Lovo细胞过表达HLA-DQ基因组合(见表5)由外源呈递的RasG13D肽段，同时可识别由HLA-DQ组合HLA-DQA1*05:01/05:05与HLA-DQB1*0301内源呈递的RasG13D表位。B8.2.4 TCR可识别由NCI-H1944细胞(HLA-DQ见表4)内源呈递的RasG13D表位。
HCT116结直肠癌细胞在抗原呈递通路(antigen processing and presentation pathway)可能发生缺失或突变，导致内源性RasG13D表位无法装载于HLA-DQ复合体。Lovo结直肠癌细胞中，过表达HLA-DQA1*05:01/05:05与HLA-DQB1*0301组合可有效呈递内源性RasG13D表位；而HLA-DQA1*05:01/05:05与HLA-DQB1*0303组合内源性呈递RasG13D表位效率较低，但可高效外源呈递RasG13D。
综上结果表明，B8.2.4 TCR可高效识别由HLA-DQA1*05:01或DQA1*05:05与HLA-DQB1*03:01组合呈递的RasG13D表位，也可识别由HLA-DQA1*05:01或DQA1*05:05与HLA-DQB1*03:03组合呈递的RasG13D表位，但相对能力较弱。
实施例7：RasG13D呈递表位测定
将含有G13D突变位点的23肽(SEQ ID NO:13)，按照下表合成并通过自体LCL细胞呈递抗原后，测定IFNγ释放，筛选B8.2.4 TCR识别的RasG13D表位。
表6.RasG13D表位筛选表
肽段编号 肽段长度 氨基酸序列
G13D-RT1 19 KL VVVGAGDVGKSALTIQL
G13D-RT2 18 KL VVVGAGDVGKSALTIQ
G13D-RT3 17 KL VVVGAGDVGKSALTI
G13D-RT4 17 YKL VVVGAGDVGKSALT
G13D-RT5 16 KL VVVGAGDVGKSALT
G13D-RT6 16 YKL VVVGAGDVGKSAL
G13D-RT7 15 KL VVVGAGDVGKSAL
G13D-RT8 14 L VVVGAGDVGKSAL
G13D-RT9 13 VVVGAGDVGKSAL
G13D-RT10 12 VVGAGDVGKSAL
G13D-RT11 11 VGAGDVGKSAL
G13D-RT12 14 KL VVVGAGDVGKSA
G13D-RT13 13 KL VVVGAGDVGKS
G13D-RT14 12 KLV VVGAGDVGK
G13D-RT15 11 KLV VVGAGDVG
将以上肽段合成后，加入DMSO溶解，将B8患者自体LCL细胞重悬于RPMI1640培养基中加入以上肽段至终浓度1μg/ml，孵育2小时后，用DPBS溶液清洗2次，用含2％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬至2×10 5/ml，按照2×10 4：2×10 4比例将负载肽段的抗原呈递细胞和B8.2.4 TCR-T细胞共同过夜培养，并测定上清中IFNγ释放，结果如图6所示。
以上结果表明，G13D-RT6肽段(SEQ ID NO：20)可最有效诱导B8.2.4 TCR-T的IL2释放，因此HLA-DQ组合(见表5)呈递的RasG13D表位为G13D-RT6肽段，其中RasG13D表位核心序列为VVVGAGDVGKS(SEQ ID NO：14)。以上结果还表明，包含RAS G13D突变体的第7-17位氨基酸残基的肽段能够有效激活T淋巴细胞，从而诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答。
实施例8：丙氨酸扫描确定RasG13D表位呈递的关键氨基酸
通过将RasG13D表位肽段，进行逐个丙氨酸替换，可筛选出RasG13D表位中参与抗原呈递的关键氨基酸，丙氨酸突变后肽段(突变氨基酸下划线标出)如下表所示：
表7.RasG13D表位丙氨酸扫描
肽段编号 突变氨基酸 氨基酸序列
G13D-RT6-A1 pY4A AKLVVVGAGDVGKSAL
G13D-RT6-A2 pK5A Y ALVVVGAGDVGKSAL
G13D-RT6-A3 pL6A YK AVVVGAGDVGKSAL
G13D-RT6-A4 pV7A YKL AVVGAGDVGKSAL
G13D-RT6-A5 pV8A YKLV AVGAGDVGKSAL
G13D-RT6-A6 pV9A YKLVV AGAGDVGKSAL
G13D-RT6-A7 pG10A YKLVVV AAGDVGKSAL
G13D-RT6-G8 pA11G YKLVVVG GGDVGKSAL
G13D-RT6-A9 pG12A YKLVVVGA ADVGKSAL
G13D-RT6-A11 pV14A YKLVVVGAGD AGKSAL
G13D-RT6-A12 pG15A YKLVVVGAGDV AKSAL
G13D-RT6-A13 pK16A YKLVVVGAGDVG ASAL
G13D-RT6-A14 pS17A YKLVVVGAGDVGK AAL
G13D-RT6-G15 pA18G YKLVVVGAGDVGKS GL
G13D-RT6-A16 pL19A YKLVVVGAGDVGKSA A
将以上肽段合成后，按照实施例7方法测定抗原呈递细胞与B8.2.4 TCR-T共培养后上清中IFNγ或IL2，结果如图7所示。以上结果表明，RasG13D肽段中p8V、p10G、p14V、p16K位置氨基酸对B8.2.4 TCR识别最为重要，而p9V和p11G氨基酸对B8.2.4 TCR识别次为重要。
实施例9：B8.2.4 TCR-T肿瘤细胞杀伤实验
将Lovo-CIITA-DQA1*05:01/DQB1*0301-Luc(表达Firefly luciferase)细胞重悬于含2％FBS的RPMI1640培养基中，按照2×10 4/孔接种于96孔板中，并按照E:T比例10、3、1、0.3、0.1加入Mock-T、B8.2.4 TCR-CD4+T，并设置不含有T细胞对照(阴性对照孔RLU)，共同孵育24小时后，每孔加入100μl One-Glo luciferase底物，并读取Luminescence(Relative light unit，RLU)。
杀伤率＝1-(测试孔RLU/阴性对照孔RLU)
结果如图8所示。结果表明B8.2.4 TCR-T可剂量依赖性杀伤肿瘤细胞，且呈现对CD4的依赖性。
实施例10：B8.2.4 TCR亲和力测定
将B8自体LCL细胞分别与不同浓度的Ras G13D-RT6肽段(SEQ ID NO:20)和对应的野生型肽段(SEQ ID NO:52)进行抗原负载(10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml、0.001μg/ml)于37℃培养2小时后，用DPBS溶液清洗2次，按照2×10 4：2×10 4比例将抗原呈递细胞和B8.2.4 TCR-T细胞共同过夜培养于含有2％胎牛血清的RPMI1640培养基中，并测定上清中IL2和IFNγ释放，结果如图9A-9B所示。结果表明，B8.2.4 TCR-T在测试浓度范围内均能够特异性识别Ras G13D突变肽，并能够释放IFNγ和IL2，且在抗原肽浓度为0.01μg/ml时仍能高效识别Ras G13D突变肽，表明表达该TCR的T细胞对Ras G13D突变体具有高亲和力和高特异性。
实施例11.B8.2.4TCR亲和力成熟
按照下表，对B8.2.4TCR Vα和Vβ进行点突变，并构建编码TCR突变体的慢病毒载体穿梭质粒，在293T细胞中经标准的慢病毒载体包装，并进行B8.2.4TCR突变体功能筛选。对应待突变位点如表8所示，其中所述氨基酸位置根据IMGT TCR numbering确定。
表8.待突变氨基酸位点
突变区域 突变位置氨基酸
Vα-CDR3 97R
Vβ-CDR3 95Q，96T，97V，98P
TCR CDR3突变体筛选
将TCR突变体(CDR3区域)慢病毒载体转导Jurkat-NFAT-Luc细胞系，利用装载KRAS G13D抗原(G13D-RT6,SEQ ID NO:20)的Lovo-DPA0301：DPB0501细胞作为抗原呈递细胞(简称APC)，将2×10 4TCR-T和2×10 4负载抗原的APC细胞共同培养16-24小时，加入ONE Glo Luciferase检测荧光信号表达，并计算TCR Mut RLU/WT RLU(TCR突变体RLU信号值与野生型B8.2.4TCR RLU信号值比值)，结果如表9所示。
表9.各突变体TCR Mut RLU/WT RLU
TCR Clone TCR Mut RLU/WT RLU mTCRβ％
α97R-A 0.13 47.2％
α97R-C 0.27 63.2％
α97R-D 0.17 61.7％
α97R-E 0.16 67.3％
α97R-F 0.21 81％
α97R-G 0.16 77.5％
α97R-H 0.13 66.2％
α97R-I 0.16 74.9％
α97R-K 0.24 63.8％
α97R-L 0.19 78％
α97R-M 0.17 71.1％
α97R-N 0.16 69.9％
α97R-P 0.21 52.5％
α97R-Q 0.16 69.1％
α97R-S 0.22 52％
α97R-T 0.23 73％
α97R-V 0.16 76.7％
α97R-W 0.18 80.2％
α97R-Y 0.16 80％
β95Q-A 0.86 74.9％
β95Q-C 1.14 82.1％
β95Q-D 0.60 77.1％
β95Q-E 0.81 36.5％
β95Q-F 0.34 80％
β95Q-G 1.03 76.6％
β95Q-H 0.68 69.2％
β95Q-I 0.74 75.6％
β95Q-K 0.30 73.7％
β95Q-L 0.64 68.6％
β95Q-M 0.99 82.1％
β95Q-N 0.60 75.1％
β95Q-P 0.21 76.8％
β95Q-R 0.43 73.6％
β95Q-S 0.61 77.3％
β95Q-T 0.59 66.8％
β95Q-V 0.76 62.7％
β95Q-W 0.88 78.2％
β95Q-Y 0.92 78.4％
β96T-A 0.77 76.4％
β96T-C 0.78 82.3％
β96T-D 0.28 73.8％
β96T-E 0.06 73.8％
β96T-F 0.42 76.9％
β96T-G 0.05 55.3％
β96T-H 0.82 76.2％
β96T-I 0.41 64.6％
β96T-K 0.84 72％
β96T-L 0.31 73.1％
β96T-M 0.35 67.9％
β96T-N 0.82 74.1％
β96T-P 0.39 46.6％
β96T-R 0.49 69.2％
β96T-Q 0.57 81.5％
β96T-S 0.80 61.9％
β96T-V 0.97 54.5％
β96T-W 0.64 67.4％
β96T-Y 0.40 69.9％
β97V-A 0.56 71.3％
β97V-C 0.37 52.6％
β97V-D 0.21 65.6％
β97V-E 0.31 78.4％
β97V-F 0.31 77.2％
β97V-G 0.26 74.3％
β97V-H 0.44 53.6％
β97V-I 0.61 69.9％
β97V-K 0.48 65.5％
β97V-L 0.58 63.8％
β97V-M 0.35 28％
β97V-N 0.26 52.4％
β97V-P 0.32 53.4％
β97V-R 0.37 55.2％
β97V-Q 0.30 74.5％
β97V-S 0.78 72.2％
β97V-T 0.98 64.7％
β97V-W 0.52 74.5％
β97V-Y 0.54 36.9％
β98P-A 0.50 67.6％
β98P-C 1.11 80.7％
β98P-D 0.80 82％
β98P-E 0.99 60.8％
β98P-F 0.96 82.5％
β98P-G 0.73 81.5％
β98P-H 0.60 72.9％
β98P-I 0.33 66.4％
β98P-K 0.47 63.8％
β98P-L 0.67 72.5％
β98P-M 0.83 61.2％
β98P-N 0.41 75.8％
β98P-R 0.73 78％
β98P-Q 0.45 67.8％
β98P-S 0.94 76.3％
β98P-T 0.47 54％
β98P-V 0.63 77.2％
β98P-W 0.81 81％
β98P-Y 0.25 54％
以上结果表明：
1)mTCRβ表达检测结果表明，所有的TCR突变体均可表达于Jurkat-NFAT-Luc细胞 表面；
2)B8.2.4TCR CDRα3和CDRβ3突变区域中，对TCR特异性具有重要影响的氨基酸位置为CDRα3-97R，所述位置氨基酸突变后，大部分突变体均无法有效识别由抗原呈递细胞呈递的KRASG13D抗原肽；
3)统计具有活性的TCR CDRα3和CDRβ3突变体(保持约60％及以上的野生型B8.2.4TCR RLU信号值的突变体)，见表10，优选TCR突变体(保持≥80％野生型B8.2.4TCR RLU信号值的突变体)用下划线标出。
表10.活性TCR CDRα3和CDRβ3突变体
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (32)

  1. 一种分离的表位肽或其变体，所述表位肽由RAS G13D突变体的11-30个(例如30个，29个，28个，27个，26个，25个，24个，23个，22个，21个，20个，19个，18个，17个，16个，15个，14个，13个，12个，或11个)连续氨基酸残基组成，且包含RAS G13D突变体的第7-17位氨基酸残基；
    所述变体与其所源自的表位肽相异仅在于1个或几个(例如1个，2个或3个)氨基酸残基的置换，并且在对应于RAS G13D突变体的氨基酸位置8、10、13、14和16的位置中不包含氨基酸置换，并且保留了其所源自的表位肽的生物学功能；
    优选地，所述表位肽由RAS G13D突变体的11-25个(例如11-20个，11-19个，或11-16个)连续氨基酸残基组成。
  2. 权利要求1所述的变体，其在对应于RAS G13D突变体的氨基酸位置8、9、10、11、13、14和16的位置中不包含氨基酸置换，并且保留了其所源自的表位肽的生物学功能。
  3. 权利要求1或2所述的表位肽或其变体，其中，所述表位肽或其变体能够被MHC-II类分子呈递，并且与MHC-II类分子缔合的所述表位肽或其变体能够被T细胞识别，例如被T细胞上的抗原特异性T细胞受体识别；
    优选地，所述MHC-II类分子是HLA-DQ；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0603、HLA-DQB1*0604、HLA-DQB1*0302中的一种；优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319中的一种；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505、HLA-DQA1*0102、HLA-DQA1*0103、HLA-DQA1*0301中的一种；优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505中的一种；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0319或HLA-DQB1*0303中的一种，并且还包含选自HLA-DQA1*0501或DQA1*0505中的一种。
  4. 权利要求1-3任一项所述的表位肽或其变体，其中，所述RAS G13D突变体的第7-17位氨基酸残基具有SEQ ID NO:14所示的序列。
  5. 权利要求1-4任一项所述的表位肽或其变体，其中，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第7-17位氨基酸残基、第5-23位氨基酸残基、第5-22位氨基酸残基、第5-21位氨基酸残基、第4-20位氨基酸残基、第5-20位氨基酸残基、第4-19位氨基酸残基、第5-19位氨基酸残基、第6-19位氨基酸残基、第7-19位氨基酸残基、第5-18位氨基酸残基或第5-17位氨基酸残基；
    优选地，所述RAS G13D突变体的第7-17位氨基酸残基、第5-23位氨基酸残基、第5-22位氨基酸残基、第5-21位氨基酸残基、第4-20位氨基酸残基、第5-20位氨基酸残基、第4-19位氨基酸残基、第5-19位氨基酸残基、第6-19位氨基酸残基、第7-19位氨基酸残基、第5-18位氨基酸残基和第5-17位氨基酸残基分别具有如SEQ ID NOs:14-23、26-27所示的序列；
    优选地，所述表位肽包含RAS G13D突变体的第4-19位氨基酸残基。
  6. 权利要求1-5所述的表位肽或其变体，其中，所述RAS G13D突变体具有SEQ ID NO:51所示的序列。
  7. 权利要求1-6任一项所述的表位肽或其变体，其中，所述表位肽包含SEQ ID NOs:14-23、26-27任一项所示的序列；所述变体包含选自下列的序列：(i)与SEQ ID NOs:14-23、26-27任一项所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；(ii)与SEQ ID NOs:14-23、26-27任一项所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
  8. 一种MHC-肽复合物，其包含权利要求1-7任一项所述的的表位肽或其变体，以及，与所述表位肽或其变体结合的MHC-II类分子；
    优选地，所述MHC-II类分子是HLA-DQ；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0603、HLA-DQB1*0604、HLA-DQB1*0302中的一种；优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319中的一种；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505、HLA-DQA1*0102、HLA-DQA1*0103、HLA-DQA1*0301中的一种；优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505中的一种；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0319或HLA-DQB1*0303中的一种，并且还包含选自HLA-DQA1*0501或DQA1*0505中的一种。
  9. 一种分离的T细胞受体或其抗原结合片段，其能够特异性识别权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体或权利要求8所述的MHC-肽复合物；
    优选地，所述T细胞受体或其抗原结合片段能识别被MHC-II类分子呈递的所述表位肽或其变体；
    优选地，所述MHC-II类分子是HLA-DQ；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0603、HLA-DQB1*0604、HLA-DQB1*0302中的一种；优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319中的一种；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505、HLA-DQA1*0102、HLA-DQA1*0103、HLA-DQA1*0301中的一种；优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505中的一种；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0319或HLA-DQB1*0303中的一种，并且还包含选自HLA-DQA1*0501或DQA1*0505中的一种；
    优选地，所述TCR是可溶性或膜结合的；
    优选地，所述TCR是全长TCR、可溶性TCR或单链TCR。
  10. 一种分离的T细胞受体(TCR)或其抗原结合片段，其能够特异性识别RAS G13D突变体，所述TCR或其抗原结合片段包括α链可变区(Vα)和/或β链可变区(Vβ)，其中，
    (a)所述Vα包括CDR1α、CDR2α和CDR3α，其中所述CDR3α具有SEQ ID NO:8所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    和/或，
    (b)所述Vβ包括CDR1β、CDR2β和CDR3β，其中所述CDR3β具有SEQ ID NOs:11、54-91任一项所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    优选地，所述CDR3α在对应于SEQ ID NO:8的第5位氨基酸位置不包含氨基酸置换和缺失；
    优选地，所述CDR1α具有SEQ ID NO:6所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    优选地，所述CDR2α具有SEQ ID NO:7所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    优选地，所述CDR1β具有SEQ ID NO:9所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    优选地，所述CDR2β具有SEQ ID NO:10所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    优选地，所述置换为保守置换；
    优选地，所述TCR是可溶性或膜结合的；
    优选地，所述TCR是全长TCR、可溶性TCR或单链TCR。
  11. 权利要求10所述的TCR或其抗原结合片段，其中，所述CDR3β具有ASSX 1X 2X 3X 4PQH(SEQ ID NO:92)所示的序列；
    其中，X 1选自Q，A，C，D，E，G，H，I，L，M，N，S，T，V，W或Y；X 2选自T，A，C，H，K，N，S，V或W；X 3选自V，I，S或T；X 4选自P，C，D，E，F，G，H，L，M，R，S，V或W；
    优选地，X 1选自Q，A，C，E，G，M，W或Y；X 2选自T，H，K，N，S或V；X 3选自V或T；X 4选自P，C，D，E，F，M，S或W。
  12. 权利要求10或11所述的TCR或其抗原结合片段，其中，所述CDR3β具有SEQ ID NOs:11、54-91任一项所示的序列；
    优选地，所述CDR3β具有SEQ ID NOs:11、54-55、57-58、62、67-68、71-75、79-83、87、89、91任一项所示的序列。
  13. 权利要求10-12任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中，
    (a)所述Vα还包括FR1α、FR2α、FR3α和FR4α，其中：
    所述FR1α具有SEQ ID NO:93所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    所述FR2α具有SEQ ID NO:94所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    所述FR3α具有SEQ ID NO:95所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    所述FR4α具有SEQ ID NO:96所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    和/或，
    (b)所述Vβ还包括FR1β、FR2β、FR3β和FR4β，其中：
    所述FR1β具有SEQ ID NO:97所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    所述FR2β具有SEQ ID NO:98所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    所述FR3β具有SEQ ID NO:99所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    所述FR4β具有SEQ ID NO:100所示的序列或与其相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个或3个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；
    优选地，所述的置换是保守置换。
  14. 权利要求10-13任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中，所述TCR或其抗原结合片段的Vα包含SEQ ID NO:4所示的序列或其变体，其中，所述变体选自下列的氨基酸序列：
    (i)与SEQ ID NO:4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
    (ii)与SEQ ID NO:4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
    优选地，(i)中所述的置换是保守置换；
    优选地，所述变体在位置97不包含氨基酸置换和缺失，所述氨基酸位置根据IMGTTCR编号系统确定。
  15. 权利要求10-14任一项的TCR或其抗原结合片段，其中，所述TCR或其抗原结合片段的Vβ包含SEQ ID NO:5所示的序列或其变体，其中，所述变体选自下列的氨基酸序列：
    (i)与SEQ ID NO:5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个或5个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或
    (ii)与SEQ ID NO:5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
    优选地，(i)中所述的置换是保守置换；
    优选地，所述变体包含选自下列的1个或几个(例如，1个、2个、3个或4个)氨基酸置换，所述氨基酸位置根据IMGT TCR编号系统确定：(1)位置95上的氨基酸置换为A，C，D，E，G，H，I，L，M，N，S，T，V，W或Y；(2)位置96上的氨基酸置换为A，C，H，K，N，S，V或W；(3)位置97上的氨基酸置换为I，S或T； (4)位置98上的氨基酸置换为C，D，E，F，G，H，L，M，R，S，V或W；
    优选地，所述变体包含选自下列的1个或几个(例如，1个、2个、3个或4个)氨基酸置换，所述氨基酸位置根据IMGT TCR编号系统确定：(1)位置95上的氨基酸置换为A，C，E，G，M，W或Y；(2)位置96上的氨基酸置换为H，K，N，S或V；(3)位置97上的氨基酸置换为T；(4)位置98上的氨基酸置换为C，D，E，F，M，S或W。
  16. 权利要求10-15任一项所述的TCR或其抗原结合片段，其中，所述TCR或其抗原结合片段能够特异性识别权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体或权利要求8所述的MHC-肽复合物；
    优选地，所述TCR或其抗原结合片段能识别被MHC-II类分子呈递的所述表位肽或其变体；
    优选地，所述MHC-II类分子是HLA-DQ；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319、HLA-DQB1*0201、HLA-DQB1*0603、HLA-DQB1*0604、HLA-DQB1*0302中的一种；优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0303、HLA-DQB1*0319中的一种；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505、HLA-DQA1*0102、HLA-DQA1*0103、HLA-DQA1*0301中的一种；优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQA1*0501、HLA-DQA1*0505中的一种；
    优选地，所述HLA-DQ包含选自HLA-DQB1*0301、HLA-DQB1*0319或HLA-DQB1*0303中的一种，并且还包含选自HLA-DQA1*0501或DQA1*0505中的一种；
    优选地，当所述TCR或其抗原结合片段在T细胞的表面上表达时，所述T细胞在与展示权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体的第二细胞(例如APC)共培养时活化。
  17. 缀合物，其包含权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段以及与其缀合的效应子部分；
    优选地，所述效应子部分选自治疗部分、免疫球蛋白恒定区(例如人免疫球蛋白 恒定区)或可检测的标记；
    优选地，所述治疗部分选自免疫增强剂或细胞毒剂；
    优选地，所述免疫增强剂选自免疫刺激性抗体(例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD40L(CD154)抗体、抗41BB(CD137)抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体或其任意组合)或免疫刺激性细胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF、或其任意组合)；
    优选地，所述细胞毒剂选自烷化剂、微管抑制剂、抗癌性抗生素或抗代谢剂；
    优选地，所述TCR或其抗原结合片段是可溶性的。
  18. 融合蛋白，其包含权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段以及另外的肽或蛋白；
    优选地，所述另外的肽或蛋白选自治疗性肽或蛋白、免疫球蛋白恒定区(例如人免疫球蛋白恒定区)、可检测的蛋白标记物或蛋白标签；
    优选地，所述治疗性肽或蛋白选自：免疫刺激性抗体(例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD40L(CD154)抗体、抗41BB(CD137)抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体或其任意组合)，免疫刺激性细胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF、或其任意组合)，或对细胞具有毒性、可抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的肽或蛋白(例如胸苷激酶TK(TK/GCV)、TRAIL或FasL)；
    优选地，所述TCR或其抗原结合片段是可溶性的。
  19. 分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体的核苷酸序列，或者包含编码权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段或其α链可变区和/或β链可变区的核苷酸序列，或者包含编码权利要求18所述的融合蛋白的核苷酸序列。
  20. 载体，其包含权利要求19所述的分离的核酸分子；
    优选地，所述载体包含编码权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体的核苷酸序列；
    优选地，所述载体包含编码权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段 或其α链可变区和/或β链可变区的核苷酸序列；
    优选地，所述载体包含编码权利要求18所述的融合蛋白的核苷酸序列；
    优选地，所述载体是病毒载体，例如慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或杆状病毒载体。
  21. 宿主细胞，其包含权利要求19所述的分离的核酸分子，或权利要求20所述的载体；
    优选地，所述宿主细胞包含编码权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体的核苷酸序列；
    优选地，所述宿主细胞包含编码权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段或其α链可变区和/或β链可变区的核苷酸序列；
    优选地，所述宿主细胞包含编码权利要求18所述的融合蛋白的核苷酸序列；
    优选地，所述宿主细胞包含大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞。
  22. 制备权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体、或权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段、或权利要求18所述的融合蛋白的方法，其包括，在允许蛋白表达的条件下，培养权利要求21所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述表位肽或其变体、或TCR或其抗原结合片段、或融合蛋白。
  23. 经改造的抗原呈递细胞(APC)，其在细胞表面上呈递权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体；
    优选地，所述APC选自树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴母细胞样细胞(LCL)或其任意组合；
    优选地，所述APC是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA-DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性；优选地，所述APC是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性；
    优选地，所述APC是HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性；优选地，所述 APC是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性；
    优选地，所述APC是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或HLA-DQB1*0303阳性，并且还是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性。
  24. 制备权利要求23所述的经改造的APC的方法，其包括：(1)提供来自受试者的APC；(2)在体外将所述APC与权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体接触或者将包含编码权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体的核苷酸序列的表达载体引入所述APC，以获得在其表面上呈递所述表位肽或其变体的APC。
  25. 经改造的免疫细胞，其在细胞表面上表达权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段；
    优选地，所述经改造的免疫细胞包含编码权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段的核苷酸序列；
    优选地，所述免疫细胞是淋巴细胞；
    优选地，所述免疫细胞选自T细胞(例如αβT细胞、γδT细胞或iPSC诱导的T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、或其任意组合。
  26. 制备权利要求25所述的经改造的免疫细胞的方法，其包括：(1)提供来自受试的免疫细胞；(2)将权利要求19所述的分离的核酸分子或权利要求20所述的载体引入步骤(1)所述的免疫细胞，所述核酸分子或载体包含编码权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段的核苷酸序列，以获得表达所述TCR或其抗原结合片段的免疫细胞；
    优选地，在步骤(1)中，所述免疫细胞经过预处理；所述预处理包括免疫细胞的分选、激活和/或增殖；
    优选地，所述预处理包括将免疫细胞与选自抗CD3抗体、抗CD28抗体、IL-2和IL-15中的一种或多种接触，从而刺激所述免疫细胞并诱导其增殖，由此生成经预处理的免疫细胞。
  27. 药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体、权利要求8所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或权利要求23所述的经改造的抗原呈递细胞(APC)；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
    优选地，所述药物组合物是肿瘤疫苗；
    优选地，所述药物组合物包含佐剂；
    优选地，所述药物组合物还包含另外的治疗剂，例如抗肿瘤剂或免疫增强剂；
    优选地，所述抗肿瘤剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体或TIM3抗体)；
    优选地，所述免疫增强剂选自免疫刺激性抗体(例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD40L(CD154)抗体、抗41BB(CD137)抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体或其任意组合)或免疫刺激性细胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF、或其任意组合)。
  28. 药物组合物，其包含权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段、权利要求17所述的缀合物、权利要求18所述的融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或权利要求25所述的经改造的免疫细胞；以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；
    优选地，所述药物组合物还包含另外的治疗剂，例如抗肿瘤剂或免疫增强剂；
    优选地，所述抗肿瘤剂选自烷化剂、有丝分裂抑制剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢物、拓扑异构酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、放射性核素剂、放射增敏剂、抗血管生成剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂(例如，PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG-3抗体或TIM3抗体)；
    优选地，所述免疫增强剂选自免疫刺激性抗体(例如抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD40L(CD154)抗体、抗41BB(CD137)抗体、抗OX40抗体、抗GITR抗体或其任意组合)或免疫刺激性细胞因子(例如IL-2、IL-3、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-γ、IL-10、TGF-β、GM-CSF、或其任意组合)。
  29. 权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体、权利要求8所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或权利要求23所述的经改造的抗原呈递细胞(APC)、或权利要求27所述的药物组合物，在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤；
    优选地，所述具有RAS G13D突变的肿瘤选自结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌或急性髓系白血病；
    优选地，所述受试者是人；
    优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA-DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性；
    优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性；
    优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或HLA-DQB1*0303阳性，并且还是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性；
    优选地，所述表位肽或其变体、MHC-肽复合物、核酸分子或载体或宿主细胞、经改造的抗原呈递细胞(APC)、或药物组合物与另外的治疗剂联合施用，例如同时、分开或相继施用；优选地，所述另外的治疗剂是免疫刺激剂或抗肿瘤剂。
  30. 权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段、权利要求17所述的缀合物、权利要求18所述的融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或权利要求25所述的经改造的免疫细胞、或权利要求27所述的药物组合物，在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤；其中，所述核酸分子、载体或宿主细胞包含编码所述TCR或 其抗原结合片段、或融合蛋白的核苷酸序列；
    优选地，所述具有RAS G13D突变的肿瘤选自结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌或急性髓系白血病；
    优选地，所述受试者是人；
    优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA-DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性；
    优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性；
    优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或HLA-DQB1*0303阳性，并且还是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性；
    优选地，所述TCR或其抗原结合片段、缀合物、融合蛋白、核酸分子或载体或宿主细胞、经改造的免疫细胞、或药物组合物与另外的治疗剂联合施用，例如同时、分开或相继施用；优选地，所述另外的治疗剂是免疫刺激剂或抗肿瘤剂。
  31. 用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求1-7任一项所述的表位肽或其变体、权利要求8所述的MHC-肽复合物、包含编码所述表位肽或其变体的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或权利要求23所述的经改造的抗原呈递细胞(APC)、或权利要求27所述的药物组合物；
    优选地，所述具有RAS G13D突变的肿瘤选自结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌或急性髓系白血病；
    优选地，所述受试者是人；
    优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA- DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性；
    优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性；
    优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或HLA-DQB1*0303阳性，并且还是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性；
    优选地，所述方法还包括向所述受试者施用另外的治疗剂，例如免疫增强剂或抗肿瘤剂。
  32. 用于在受试者中诱导针对具有RAS G13D突变的肿瘤的免疫应答、和/或在受试者中预防或治疗具有RAS G13D突变的肿瘤的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段、权利要求17所述的缀合物、权利要求18所述的融合蛋白、包含编码所述TCR或其抗原结合片段或融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子或载体或宿主细胞、或权利要求25所述的经改造的免疫细胞、或权利要求28所述的药物组合物；
    优选地，所述具有RAS G13D突变的肿瘤选自结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、头颈部癌或急性髓系白血病；
    优选地，所述受试者是人；
    优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性、HLA-DQB1*0319阳性、HLA-DQB1*0201阳性、HLA-DQB1*0603阳性、HLA-DQB1*0604阳性或HLA-DQB1*0302阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0303阳性或HLA-DQB1*0319阳性；
    优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性、HLA-DQA1*0505阳性、HLA-DQA1*0102阳性、HLA-DQA1*0103阳性或HLA-DQA1*0301阳性；优选地，所述受试者是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性；
    优选地，所述受试者是HLA-DQB1*0301阳性、HLA-DQB1*0319阳性或HLA- DQB1*0303阳性，并且还是HLA-DQA1*0501阳性或HLA-DQA1*0505阳性；
    优选地，所述方法还包括向所述受试者施用另外的治疗剂，例如免疫增强剂或抗肿瘤剂；
    优选地，所述方法包括：(1)提供受试者所需的免疫细胞；(2)将编码权利要求9-16任一项所述的TCR或其抗原结合片段的核苷酸序列导入步骤(1)所述的免疫细胞，获得在表面上表达所述TCR或其抗原结合片段的免疫细胞；(3)将步骤(2)中获得的免疫细胞施用至所述受试者；
    优选地，所述免疫细胞是淋巴细胞；
    优选地，所述免疫细胞选自T细胞(例如αβT细胞、γδT细胞或iPSC诱导的T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、或其任意组合。
CN202280014423.1A 2021-02-10 2022-01-29 Ras G13D突变体表位肽及识别Ras G13D突变体的T细胞受体 Pending CN116867799A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2021076432 2021-02-10
CNPCT/CN2021/076432 2021-02-10
PCT/CN2022/075005 WO2022171032A1 (zh) 2021-02-10 2022-01-29 Ras G13D突变体表位肽及识别Ras G13D突变体的T细胞受体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116867799A true CN116867799A (zh) 2023-10-10

Family

ID=82837418

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280014423.1A Pending CN116867799A (zh) 2021-02-10 2022-01-29 Ras G13D突变体表位肽及识别Ras G13D突变体的T细胞受体

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20240123070A1 (zh)
EP (1) EP4293043A1 (zh)
JP (1) JP2024508725A (zh)
CN (1) CN116867799A (zh)
WO (1) WO2022171032A1 (zh)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA04001974A (es) 2001-08-31 2004-07-16 Avidex Ltd Receptor de celula t soluble.
NZ539225A (en) 2002-10-09 2006-09-29 Avidex Ltd Single chain recombinant T cell receptors
US8361794B2 (en) 2004-06-29 2013-01-29 Immunocore Limited Cells expressing a modified T cell receptor
GB0712670D0 (en) 2007-06-29 2007-08-08 King S College London Isolated peptides and uses thereof
US10464987B2 (en) 2009-10-06 2019-11-05 Abbvie Inc. Human single-chain T cell receptors
WO2015086590A2 (en) * 2013-12-09 2015-06-18 Targovax As A peptide mixture
JP2018518177A (ja) * 2015-06-16 2018-07-12 タルゴバックス エーエスエー Ｒａｓタンパク質の突然変異フラグメント
WO2018102584A1 (en) * 2016-11-30 2018-06-07 Advaxis, Inc. Immunogenic compositions targeting recurrent cancer mutations and methods of use thereof
WO2018144775A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Modernatx, Inc. Immunomodulatory therapeutic mrna compositions encoding activating oncogene mutation peptides
MX2020009149A (es) * 2018-03-02 2021-01-15 Elicio Therapeutics Inc Compuestos que incluyen una secuencia de kras mutante y un lipido y usos de los mismos.
TW202039534A (zh) * 2018-12-14 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 KRAS變體mRNA分子
JPWO2020145222A1 (zh) * 2019-01-07 2020-07-16

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022171032A1 (zh) 2022-08-18
US20240123070A1 (en) 2024-04-18
JP2024508725A (ja) 2024-02-28
EP4293043A1 (en) 2023-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11945854B2 (en) Transfected T-cells and T-cell receptors for use in immunotherapy against cancers
JP6378172B2 (ja) マウス抗ｎｙ−ｅｓｏ−１ｔ細胞受容体
CN114401989B (zh) 靶向bcma的抗体及嵌合抗原受体
KR20180118783A (ko) 암에 대한 면역요법에서의 사용을 위하여 형질주입된 t 세포 및 t 세포 수용체
CN110719799A (zh) Cd39和cd103在鉴定用于癌症治疗的人肿瘤反应性t细胞中的应用
Bank et al. Vδ2+ γδ T lymphocytes are cytotoxic to the MCF 7 breast carcinoma cell line and can be detected among the T cells that infiltrate breast tumors
US20230080742A1 (en) Hla class i-restricted t cell receptors against ras with g12d mutation
JP2022538148A (ja) ｐ５３におけるＲ１７５Ｈ又はＹ２２０Ｃ変異を認識するＴ細胞受容体
US20200405762A1 (en) Cyclin a1 specific t cell receptors and uses thereof
CA3117272A1 (en) Tcr and peptides
WO2022111451A1 (zh) Ras突变体表位肽及识别ras突变体的t细胞受体
WO2022171032A1 (zh) Ras G13D突变体表位肽及识别Ras G13D突变体的T细胞受体
JP6666342B2 (ja) 抗サイログロブリンｔ細胞レセプター
CN116194575A (zh) 多亚基蛋白质组件、表达多亚基蛋白质组件的细胞及其用途
US20230057987A1 (en) Antigen binding proteins specifically binding ct45
US20210087252A1 (en) Mutant IDH1 Specific T Cell Receptor
He Simultaneous Targeting of Multiple Cancer-Specific Antigens on a Cancer Cell by One Chimeric Antigen Receptor
CN117203329A (zh) 选择具有改善的抗癌活性的t细胞的方法
EP4326751A1 (en) Hla class i-restricted t cell receptors against ras with q61k mutation
CN117980324A (zh) 特异性结合ct45的抗原结合蛋白
WO2023288271A1 (en) T cell receptors (tcr) to human papillomavirus proteins, compositions, and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination