JP2018518177A - Rasタンパク質の突然変異フラグメント - Google Patents
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Abstract
免疫応答を惹起するのに適したペプチドが開示される。該ペプチドはRASタンパク質のフラグメントに対応し、RASタンパク質の突然変異位置を含む8個のアミノ酸の領域を含む。該領域は突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有する。上記ペプチドは突然変異位置に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、突然変異位置はRASタンパク質の146位又は117位である。【選択図】図1
Description
本発明は、免疫応答を惹起するRASタンパク質のペプチド、免疫応答を惹起するRASタンパク質のペプチドを含むペプチド混合物、MHC分子上に提示された場合にかかるペプチドに特異的なT細胞、並びにMHC分子上に提示された場合にかかるペプチドに特異的なT細胞を含むT細胞混合物及びT細胞製剤を提供する。本発明は、かかるペプチド、ペプチド混合物、T細胞、並びにT細胞混合物及び製剤を含む医薬配合物、癌の予防及び/又は治療のために用いられるペプチド、ペプチド混合物、T細胞、並びにT細胞混合物及び製剤の使用、並びに癌の治療に対してペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞混合物及びT細胞製剤を選択する方法にも関する。
癌発病の遺伝学的背景は、癌原遺伝子、癌遺伝子、及び腫瘍抑制遺伝子の改変である。癌原遺伝子は、癌遺伝子になる可能性のある細胞の正常な遺伝子である。全ての癌遺伝子はタンパク質をコードし、それによって機能する。ほとんどの場合、癌遺伝子は、シグナル伝達経路の構成要素であることが示されている。癌遺伝子は、点突然変異又は転座によって癌原遺伝子から自然に発生することにより、突然変異を持つ細胞の形質転換状態をもたらす。癌は、癌遺伝子及び腫瘍抑制細胞における幾つかの変異事象を含む多段階のプロセスにより発症する。
その最も単純な形態では、癌原遺伝子における単一の塩基置換が、コードされるタンパク質の1つのアミノ酸の相違を引き起こす場合がある。
マウスの腫瘍を含む実験モデルでは、細胞内の「自己」タンパク質における点突然変異が、正常なペプチドとは単一のアミノ酸が異なるペプチドからなる腫瘍拒絶抗原をもたらす場合があることが示されている。腫瘍細胞表面における主要組織適合性(MHC)分子との関連でこれらのペプチドを認識するT細胞は、腫瘍細胞を殺傷することができ、そのようにして宿主から腫瘍を拒絶する(非特許文献1)。
過去30年間で、ヒト腫瘍抗原に対する抗体の分析に対して特別な努力がなされてきた。かかる抗体を診断及び治療の両方の目的で、例えば抗癌剤と組み合せて使用可能であることが示唆されている。1つの問題は、抗体が腫瘍細胞表面に露出される腫瘍抗原にしか結合することができないことである。この理由のため、身体の免疫系に基づく癌治療をもたらすための努力は、予想されていたほど成功していない。
抗体は、典型的には未変性の立体構造の遊離型抗原を認識し、抗原表面に露出されるほとんどの任意部位を潜在的に認識することができる。B細胞によって産生される抗体とは対照的に、T細胞は、ヒトではHLA(ヒト白血球抗原)と示されるMHC分子と関連してのみ、また通常はMHC分子の溝に適合するペプチドを生じる、そのタンパク質のタンパク質分解断片化からなる適切な抗原処理の後にのみ抗原を認識する。これによりT細胞が細胞内タンパク質に由来するペプチドを認識することを可能とする。したがって、MHC分子によって腫瘍細胞の表面に提示された場合に、T細胞は腫瘍細胞のいずれかの部分に由来する異常なペプチドを認識することができる。その後、T細胞は、異常なペプチドを持つ腫瘍細胞を排除するように活性化され得る。
T細胞は、様々な機構によって癌の発症及び成長を制御し得る。細胞毒性T細胞、HLAクラスI制限CD8+及びHLAクラスII制限CD4+の両方は、適切な腫瘍抗原を持つ腫瘍細胞を直接殺傷し得る。CD4+ヘルパーT細胞は、細胞毒性T細胞応答の誘導及び維持、また同様に抗体応答、並びにマクロファージ及びリンホカイン活性化キラー細胞(LAK細胞)の殺傷の誘導に必要である。
多くの癌遺伝子及びそれらのタンパク質生成物が同定されている。さらに、健康な人のT細胞レパートリーは、適切なHLA分子上に提示された場合に、1つのp21 RAS癌遺伝子産物に由来する合成ペプチドフラグメントに対する特異性を有するT細胞を含むことが示されている。さらに、全ての癌のおよそ20%がRAS癌遺伝子における突然変異と関連することが予想される。
上皮成長因子受容体(EGFR)抗体療法が癌治療の第一選択レジメンである。しかしながら、大腸癌では、KRAS遺伝子のエクソン2のコドン12及び13における点突然変異がEGFR抗体による治療に対する耐性の前兆となり、EGFR抗体による治療が、かかる突然変異を発現する腫瘍を有する患者には効果がないことがわかっている。野生型KRASコドン12及び/又は13を発現する腫瘍を有する患者の半数以上がEGFR抗体療法にも耐性を示すことが更にわかっている(非特許文献2)。さらに、任意のRAS突然変異を有する患者がパニツムマブ−FOLFOX4治療によっても傷害を受ける可能性があることが報告されている(非特許文献3)。特に、現在の臨床ガイドラインでは、RAS野生型腫瘍を有する患者のみを、FOLFIRI又はFOLFOX化学療法と組み合わせたセツキシマブ又はパニツムマブによって治療すべきことが推奨されている(非特許文献4)。
非特許文献4(JCO、2015年1月20日の発行に先立ってオンラインで公表された)は、KRASコドン12及び13以外の位置にRAS突然変異を有する腫瘍を保有する大腸癌患者における、FOLFIRI単独と比較したFOLFIRI+セツキシマブの効果を判断する研究の結果を開示している。最もよく見られる突然変異部位(KRASコドン12及び13を除く)がKRASエクソン4内にあり、FOLFIRIへのセツキシマブの添加が、コドン12及び13以外の遺伝子座に腫瘍RAS突然変異を有する患者において治療有効性のいかなる改善ももたらさないことがわかった。しかしながら、この文献はRAS突然変異を有する患者のいかなる代替治療も開示又は示唆していない。
非特許文献5は、エクソン2の他にNRAS又はKRAS突然変異(「新たな」RAS突然変異と称される)を有する腫瘍を有する転移性大腸癌患者における抗EGFR mAb療法の有効性を評価する研究を報告している。検討される「新たな」突然変異は、エクソン3(コドン59及び61)若しくはエクソン4(コドン117及び146)におけるKRAS突然変異、又はエクソン2、3若しくは4におけるNRAS突然変異であった。「新たな」RAS突然変異を有する患者において抗EGFR mAb療法による無進行生存(PFS)又は全生存(OS)の改善が見られず、野生型RASを有する患者が、「新たな」RAS突然変異を有する患者と比較して顕著に優れた抗EGFR mAb有効性を有することがわかった。この文献は、大腸癌患者の約11%が「新たな」RAS突然変異を有し、したがってEGFR抗体療法に耐性を示す可能性があることを更に開示している。しかしながら、この文献はEGFR抗体療法のいかなる代替治療も示唆していない。
非特許文献6は、抗EGFR mAb療法がRAS遺伝子に突然変異を有する患者において効果がないことを開示し、大腸癌患者におけるKRAS及びNRAS突然変異の検出のための高解像度融解曲線分析(high-resolution melting)(HRM)法を開発及び確認する研究を報告している。この文献は、野生型KRASエクソン2を有する研究した大腸癌患者の15.31%がKRASエクソン3若しくは4、又はNRASエクソン2、3若しくは4に突然変異を有することを開示している。特に、エクソン4突然変異は、KRAS及びNRASエクソン3の各々の1.91%と比較して、研究した患者におけるエクソン2以外のRAS突然変異の5.3%を占めていた。しかしながら、この文献はRAS突然変異を有する患者、特にRASエクソン2突然変異以外にRAS突然変異を有する患者に対するEGFR抗体療法の代替治療を示唆していない。
非特許文献4、非特許文献5及び非特許文献6より前には、RASタンパク質のエクソン4における突然変異が癌と関連することは知られていなかった。したがって、RASタンパク質のエクソン4に対応するペプチドは、癌の治療におけるそれらの有用性について提案又は試験されていない。
特許文献1は、RASに関連する癌に対するワクチン及び癌の治療用組成物として用いられる、T細胞免疫を惹起する合成ペプチド及び癌遺伝子のタンパク質生成物のフラグメントを開示する。上記ペプチドは、癌細胞によって提示される癌遺伝子の活性なフラグメントに対応し、癌遺伝子の突然変異に対応する1以上の位置において突然変異を含まなければならない。この文献は、RASタンパク質の12位、13位及び61位における突然変異を開示し、具体的には、G12A、G12V、G12C、G12S、G12K、G12D、G12R、Q61R、Q61K、Q61L、Q61H、G13V及びG13Dの突然変異のみを開示する。しかしながら、この文献は12、13及び61以外のコドンに突然変異を有する任意のペプチドの使用、特にRASエクソン4に対応するペプチドの使用を開示していない。加えて、この文献は、ワクチンが、癌遺伝子タンパク質に最も共通して見られる突然変異を有するペプチドの選択を含んでもよいことに言及するが、ペプチドのいかなる具体的な組合せも示唆していない。
特許文献2は、癌ワクチンとして用いられるT細胞免疫を惹起する合成ペプチド混合物を考察する。該ペプチド混合物は、RAS p21変異体ペプチドからなり、この文献は具体的にはG12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61H、Q61K、Q61L、Q61R及びG13Dの突然変異のみを開示する。この文献は、ペプチドのカクテルによって惹起された免疫応答が単独のペプチドによって惹起されたものよりも著しく高かったことも開示しているが、コドン12、13若しくは61以外に、又は特にエクソン4に突然変異を有するいかなるRASペプチドも示唆していない。加えて、この文献は、文献内に具体的に開示された以外のペプチドの任意の他の組合せが有用であり得ることを開示していない。
特許文献3は、特定の細胞毒性T細胞応答を誘導することが可能なペプチド(CD8+)がp21 RAS癌原遺伝子タンパク質の12位及び/又は13位又は61位を含むp21 ras癌原遺伝子タンパク質の8個〜10個のアミノ酸を含み、12位、13位又は61位にアミノ酸置換を有することを開示している。この文献は、ペプチドを癌ワクチン及び抗癌治療用の組成物として使用し得ることも開示している。しかしながら、12位、13位又は61位に突然変異を有するもの以外のペプチドは開示されておらず、特に有用なものとして具体的なペプチド混合物は開示されていない。
さらに、これらの文献のいずれも、特定のペプチドが特定のタイプの癌とどのように関連するかについては考察していない。
混合物中のペプチドの幾つかが免疫優性であり、他のペプチドのHLA提示を抑制するというリスクのために、患者のワクチン接種のためにペプチド混合物を使用することに関して大きな懸念がある(非特許文献7)。in vitroで行われた実験から、様々な突然変異RASペプチドが関連T細胞への提示を担うHLA分子への結合について競合し、同じ長さであるが、異なる突然変異を示すペプチドが、異なる程度の有効性で別の突然変異を示すペプチドの結合及び認識を阻害する可能性があることが知られている(非特許文献8及び非特許文献9)。これらの事実から、免疫優性問題は突然変異RASペプチドワクチンに関する問題とみなされているが、この問題は前段落で言及した文献のいずれにおいても考察されていない。
非特許文献10は、合成変異体RASペプチドと顆粒球マクロファージコロニー刺激因子とを組み合せてワクチン接種した膵臓の腺癌を有する患者を含む第I相/第II相の試験を開示する。この試験は、単独のペプチドワクチン又は4つの変異体ペプチドの混合物を使用した。該混合ワクチンは、膵臓腺癌に見られる4つの最も一般的なKRAS突然変異、すなわちG12V、G12D、G12C又はG12Rの突然変異を有するペプチドで構成された。しかしながら、この文献は、有用であり得るペプチドの任意の他の組合せを開示しておらず、癌と関連するRASタンパク質の任意の他の突然変異を開示しておらず、特定のペプチドが特定のタイプの癌とどのように関連するかを考察しておらず、免疫優性及びワクチンにおける余剰性の問題を考察していない。
非特許文献11は、合成変異体RASペプチドでワクチン接種した膵臓腺癌を有する患者の長期フォローアップを報告する。該ワクチンは、単独のRASペプチド又は7つのRASペプチドのカクテルのいずれかからなる。特に、この試験で使用された7つのRASペプチドは、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V又はG13Dの突然変異を有した。しかしながら、この文献は特定のペプチドが特定のタイプの癌とどのように関連するかを考察しておらず、有用であり得るペプチドの任意の他の組合せを開示しておらず、免疫優性及びワクチンにおける余剰性の問題を考察していない。
非特許文献12は、第1のエンドポイントとして安全性、第2のエンドポイントとしてRASペプチドの免疫原性を含む、RASペプチドのin vivo免疫原性の臨床予備実験を報告する。黒色腫の患者を4つのコドン61の突然変異を有するN−rasペプチド(残基49〜73)を用いて皮内に免疫した。8名の患者は陽性DTH応答を示した。しかしながら、この文献は特定のペプチドが特定のタイプの癌とどのように関連するかを考察しておらず、有用であり得るペプチドの任意の他の組合せを開示しておらず、免疫優性及びワクチンにおける余剰性の問題を考察していない。
非特許文献13は、異なる種類の癌は、特定のRASアイソフォームの突然変異と結び付けられ、各アイソフォームは独特のコドン突然変異の特徴を有することを開示する。さらに、非特許文献13は、RASタンパク質の12位、13位及び61位の各位置において6つの突然変異が生じることによって合計18の突然変異が起こることを開示する。また、この総説は、RAS機能に対するこれらの突然変異の効果、及びRASアイソフォーム突然変異の差次的なパターンをもたらす可能性のある機構を考察する。しかしながら、この文献は癌の治療若しくは予防、又は免疫優性及びワクチンにおける余剰性の問題に対処していない。加えて、癌に対するワクチン又は治療は開示されておらず、この文献は有用であり得るペプチドの任意の組合せを開示していない。
Boon, T. et al, Cell 1989, Vol. 58, p.293-303
Vaughn C P et al., Genes Chromosomes Caner, 2011, 50, 307-12
Douillard J Y et al., N Eng J Med 2013, 369, 1023-34
Van Cutsem et al., JCO, 2015 Jan 20; National Comprehensive Cancer Network: NCCN Guidelines Colon cancer, version 2.2015
Sorich et al. (Annals of Oncology, 26: 13-21, 2015)
Negru et al. (BMJ Open 2014, 4)
Pion S, et al., Blood, 1999 Feb 1; 93(3): p952-62
T. Gedde-Dahl III et al., Human Immunol. 1994, 33, p. 266-274
B. H. Johanssen et al., Scand. J. Immunol., 1994, 33, p. 607-612
Gjertsen et al. (Int. J. Cancer 2001, 92, p.441-450)
Weden et al. (Int. J. Cancer 2010, 128(5), p. 1120-1128)
Hunger et al. (Exp. Dermatol. 2001, 10: 161-167)
Prior et al. (Cancer Res. 2012, 72(10), p. 2457-2467)
したがって、RAS突然変異を有する腫瘍を保有する癌患者に対して行うことができる、EGFR抗体療法の代替治療を提供する必要がある。特に、RASエクソン4突然変異を有する腫瘍を保有する患者、特に大腸癌を有する患者に対するEGFR抗体療法の代替治療を提供することが望ましい。加えて、免疫優性及び余剰性の問題を克服し、コスト効率がよい、特定の癌に対して標的化された代替治療を提供する必要がある。さらに、可能な限り多くの大腸癌患者に対してワクチン及び/又は治療を提供する必要がある。
本発明は、RAS遺伝子のエクソン4のコドンに対応するアミノ酸に点突然変異を有するペプチド、及び少なくとも1つのかかるペプチドを含むペプチド混合物を、RASタンパク質突然変異と関連する癌に対するワクチン及び/又はその治療として使用し得ることが今回わかったことから、上で考察される問題に対する解決策を提供する。特に、本発明のペプチド混合物の少なくとも幾つかを、RASタンパク質の突然変異と関連する癌の99%超に対するワクチン及び/又はその治療、また全ての大腸癌の10%に対するワクチン及び/又はその治療として使用し得ることがわかった。特に、TG02として知られるペプチド混合物(本明細書で更に考察する)との組合せで検討した場合、本発明のペプチド及びペプチド混合物は全ての大腸癌の少なくとも50%の治療に使用することができる。本発明のペプチド及びペプチド混合物は、EGFR抗体療法に耐性を示す患者に対する代替治療をもたらす。さらに、本発明のペプチド及びペプチド混合物は免疫優性の問題を軽減し、医薬組成物における有効成分の余剰性を低減することで、ペプチド及びペプチド混合物をよりコスト効率のよいワクチン及び/又は治療とする。加えて、本発明は、特定のタイプの癌に標的化されたワクチン接種及び/又は治療、並びに特定のタイプの癌に標的化されたペプチドの混合物を選択する方法を可能とする。
したがって、本発明の第1の態様では、免疫応答を惹起するのに適したペプチドであって、該ペプチドがRASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、
上記領域が突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、
上記領域が上記突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、
上記領域が上記突然変異位置に点突然変異を有し、
上記突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位である、
ペプチドが提供される。
上記領域が突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、
上記領域が上記突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、
上記領域が上記突然変異位置に点突然変異を有し、
上記突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位である、
ペプチドが提供される。
有利には、点突然変異がK117N、A146T又はA146Vの突然変異である。
好ましくは、ペプチドは、ワクチン又は薬剤として用いられる。
本発明の第2の態様では、各々がRASタンパク質のフラグメントに対応する第1及び第2のペプチドを含む、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
第1のペプチドが第1の突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、
第2のペプチドが第2の突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、
第1及び第2のペプチドの上記領域が各々独立して、上記第1及び第2の突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、
第1及び第2のペプチドが各々、上記第1及び第2の突然変異位置に点突然変異を有し、
第1の突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位であり、第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位であり、
第1の突然変異位置の点突然変異が、第2の突然変異位置の点突然変異とは異なる、
ペプチド混合物が提供される。
第1のペプチドが第1の突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、
第2のペプチドが第2の突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、
第1及び第2のペプチドの上記領域が各々独立して、上記第1及び第2の突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、
第1及び第2のペプチドが各々、上記第1及び第2の突然変異位置に点突然変異を有し、
第1の突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位であり、第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位であり、
第1の突然変異位置の点突然変異が、第2の突然変異位置の点突然変異とは異なる、
ペプチド混合物が提供される。
有利には、第1のペプチドの点突然変異がK117N、A146T又はA146Vの突然変異から選択される。
便利には、第2のペプチドの点突然変異がK117N、A146T、A146V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異から選択される。
第1のペプチドがRASタンパク質の146位に点突然変異を有し、第2のペプチドがRASペプチドの61位に突然変異を有するのが好ましい。
有利には、ペプチド混合物が、RASタンパク質のフラグメントに対応する少なくとも1つの更なるペプチドを含み、
上記少なくとも1つの更なるペプチドが、突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、
上記少なくとも1つの更なるペプチドの上記領域が上記突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、
上記少なくとも1つの更なるペプチドが上記突然変異位置に点突然変異を有し、
少なくとも1つの更なるペプチドの上記突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位であり、
上記少なくとも1つの更なるペプチドの点突然変異が、第1及び第2のRASペプチドの各々の点突然変異とは異なる。
上記少なくとも1つの更なるペプチドが、突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、
上記少なくとも1つの更なるペプチドの上記領域が上記突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、
上記少なくとも1つの更なるペプチドが上記突然変異位置に点突然変異を有し、
少なくとも1つの更なるペプチドの上記突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位であり、
上記少なくとも1つの更なるペプチドの点突然変異が、第1及び第2のRASペプチドの各々の点突然変異とは異なる。
好ましくは、第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位又は61位である。
有利には、第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位であり、少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の13位である。
便利には、第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、第2の突然変異位置がRASタンパク質の13位であり、少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の61位である。
好ましくは、第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位であり、第1の更なるペプチドがRASタンパク質の13位に突然変異位置を有し、ペプチド混合物が、RASタンパク質の61位に突然変異位置を有する第2の更なるペプチドを更に含む。
有利には、第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、第2の突然変異位置がRASタンパク質の13位であり、第1の更なるペプチドがRASタンパク質の13位に突然変異位置を有し、ペプチド混合物が、RASタンパク質の61位に突然変異位置を有する第2の更なるペプチドを更に含む。
便利には、ペプチド混合物は、A146Tの突然変異を有する第1のペプチドと、G13Rの突然変異を有する第2のペプチドと、G13Vの突然変異を有する第3のペプチドと、Q61Rの突然変異を有する第4のペプチドと、Q61Kの突然変異を有する第5のペプチドと、Q61Hの突然変異を有する第6のペプチドと、Q61Lの突然変異を有する第7のペプチドとを含む。
ペプチド混合物は、配列番号1又は配列番号2によって表される配列を含む第1のペプチドと、配列番号33によって表される配列を含む第2のペプチドと、配列番号34によって表される配列を含む第3のペプチドと、配列番号35によって表される配列を含む第4のペプチドと、配列番号36によって表される配列を含む第5のペプチドと、配列番号37によって表される配列を含む第6のペプチドと、配列番号38によって表される配列を含む第7のペプチドとを含むか、又はそれらから本質的になるのが好ましい。
本発明の第3の態様では、MHC分子上に提示された場合に上に記載される第1又は第2の態様によるペプチドに特異的なT細胞が提供される。
本発明の第4の態様では、上に記載される第3の態様によるT細胞を含むT細胞製剤が提供される。
本発明の第5の態様では、MHC細胞上に提示された場合に、上に記載される第2の態様によるペプチド混合物の1つのペプチドの各々に特異的なT細胞を含むT細胞混合物が提供される。
本発明の第6の態様では、MHC分子上に提示された場合に、上に記載される第1の態様によるペプチド又は第1の態様による用途に用いられるペプチドに特異的なT細胞受容体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
本発明の第7の態様では、上に記載される第1の態様によるペプチド、上に記載される第1の態様による用途に用いられるペプチド、又は上に記載される第6の態様によるT細胞受容体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。
本発明の第8の態様では、上に記載される第7の態様による核酸を含むベクターが提供される。
本発明の第9の態様では、上に記載される第8の態様によるベクターを含む宿主細胞が提供される。
本発明の第10の態様では、上に記載される第1の態様によるペプチド、上に記載される第1の態様による用途に用いられるペプチド、上に記載される第2の態様によるペプチド混合物、上に記載される第3の態様によるT細胞、上に記載される第4の態様によるT細胞製剤、上に記載される第5の態様によるT細胞混合物、上に記載される第6の態様によるT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、上に記載される第7の態様による核酸、上に記載される第8の態様によるベクター、又は上に記載される第9の態様による宿主細胞と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び/又は賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。
本発明の第11の態様では、癌の予防及び/又は治療のために用いられる、上に記載される第1の態様によるペプチド、上に記載される第1の態様による用途に用いられるペプチド、上に記載される第2の態様によるペプチド混合物、上に記載される第3の態様によるT細胞、上に記載される第4の態様によるT細胞製剤、上に記載される第5の態様によるT細胞混合物、上に記載される第6の態様によるT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、上に記載される第7の態様による核酸、上に記載される第8の態様によるベクター、上に記載される第9の態様による宿主細胞、又は上に記載される第10の態様による医薬組成物が提供される。
有利には、癌が副腎、自律神経節、胆道、骨、乳房、中枢神経系、頸部、結腸直腸、子宮内膜、造血器、リンパ系、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、上気道消化管及び尿路の癌、及び/又は悪性黒色腫である。
癌は大腸癌であるのが好ましい。
本発明の第12の態様では、上に記載される第1の態様によるペプチド、上に記載される第1の態様による用途に用いられるペプチド、上に記載される第2の態様によるペプチド混合物、上に記載される第3の態様によるT細胞、上に記載される第4の態様によるT細胞製剤、上に記載される第5の態様によるT細胞混合物、上に記載される第6の態様によるT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、上に記載される第7の態様による核酸、上に記載される第8の態様によるベクター、又は上に記載される第9の態様による医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌の治療又は予防の方法が提供される。
本発明の第13の態様では、
a)患者から採取された試料中のRASタンパク質突然変異を同定することと、
b)試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含む本発明の第1の態様によるペプチド;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含む本発明の第1の態様による用途に用いられるペプチド;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドを含む本発明の第2の態様によるペプチド混合物;MHC分子上に提示された場合に、試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的な本発明の第3の態様によるT細胞;MHC分子上に提示された場合に、試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なT細胞を含む本発明の第4の態様によるT細胞製剤;MHC分子上に提示された場合に、試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なT細胞を含む本発明の第5の態様によるT細胞混合物;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的な本発明の第6の態様によるT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドをコードする本発明の第7の態様による核酸;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドをコードする本発明の第8の態様によるベクター;又は試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチド、ワクチン若しくは薬剤として用いられるペプチド、ペプチド混合物、若しくはMHC分子上に提示された場合に、試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なT細胞、T細胞製剤若しくはT細胞を含むT細胞混合物、若しくは試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、若しくは試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドをコードする核酸若しくはベクターを含む本発明の第9の態様による医薬組成物を選択することと、
c)ペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞製剤、T細胞混合物、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸、又はベクターを患者に投与することと、
を含む癌の治療又は予防の方法が提供される。
a)患者から採取された試料中のRASタンパク質突然変異を同定することと、
b)試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含む本発明の第1の態様によるペプチド;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含む本発明の第1の態様による用途に用いられるペプチド;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドを含む本発明の第2の態様によるペプチド混合物;MHC分子上に提示された場合に、試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的な本発明の第3の態様によるT細胞;MHC分子上に提示された場合に、試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なT細胞を含む本発明の第4の態様によるT細胞製剤;MHC分子上に提示された場合に、試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なT細胞を含む本発明の第5の態様によるT細胞混合物;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的な本発明の第6の態様によるT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドをコードする本発明の第7の態様による核酸;試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドをコードする本発明の第8の態様によるベクター;又は試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチド、ワクチン若しくは薬剤として用いられるペプチド、ペプチド混合物、若しくはMHC分子上に提示された場合に、試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なT細胞、T細胞製剤若しくはT細胞を含むT細胞混合物、若しくは試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドに特異的なT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、若しくは試料中で同定されたRASタンパク質突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含むペプチドをコードする核酸若しくはベクターを含む本発明の第9の態様による医薬組成物を選択することと、
c)ペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞製剤、T細胞混合物、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸、又はベクターを患者に投与することと、
を含む癌の治療又は予防の方法が提供される。
本明細書で使用される「ペプチド」の用語は、より長いタンパク質のフラグメントである(又はそれに対応する配列を有する)アミノ酸残基のポリマーを指す。また、該用語は、1以上のアミノ酸残基が改変残基、又は非天然残基、例えば対応する天然アミノ酸の人工的な化学的模倣物である、アミノ酸ポリマー、また同じく天然アミノ酸ポリマーにも適用される。
本明細書で使用される「アミノ酸」の用語は、天然及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様の機能を有するアミノ酸アナログ及びアミノ酸模倣物を指す。天然アミノ酸は遺伝コードによってコードされるもの、及び細胞内で翻訳後に改変されるものである(例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸及びO−ホスホセリン)。「アミノ酸アナログ」の表現は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造(水素、カルボキシ基、アミノ基及びR基に結合したα炭素)を有するが、改変R基又は改変主鎖を有する化合物(例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム)を指す。「アミノ酸模倣物」の表現は、異なる構造を有する化学化合物を指す。
2つの配列間のパーセント「同一性」は、デフォルトのパラメーターを使用するBLASTPアルゴリズムバージョン2.2.2(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)を使用して決定されてもよい。特に、BLASTアルゴリズムは、URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/を使用してインターネット上でアクセス可能である。
本明細書で使用される「免疫応答」の用語は、幾つかの実施の形態では、細胞表面の主要組織適合性(MHC)分子によるペプチドの提示に応じたT細胞媒介免疫応答を指し、特に、ペプチドの提示に応じたT細胞の活性化を指す。
本明細書で使用される「RASタンパク質」の用語は、ras癌原遺伝子によってコードされる一群の小さなGTPアーゼタンパク質を指し、RASタンパク質の3つのアイソフォームであるHRAS、KRAS、及びNRASの全てを含む。幾つかの実施の形態では、「RASタンパク質」の用語は、UniProtKB/Swiss−Protアクセッション番号P01112.1に対応し、配列番号39に示されるタンパク質、UniProtKB/Swiss−Protアクセッション番号P01116に対応し、配列番号44に示されるタンパク質、又はUniProtKB/Swiss−Protアクセッション番号P01111に対応し、配列番号45に示されるタンパク質を指す。
本明細書で使用される「RASタンパク質の117位」の用語は、N末端から数えて、野生型RASタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において117番目のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される「RASタンパク質の146位」の用語は、N末端から数えて、野生型RASタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において146番目のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される「RASタンパク質の13位」の用語は、N末端から数えて、野生型RASタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において13番目のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される「RASタンパク質の12位」の用語は、N末端から数えて、野生型RASタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において12番目のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される「RASタンパク質の61位」の用語は、N末端から数えて、野生型RASタンパク質の一次構造を形成するアミノ酸鎖において61番目のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される「117位に対応するアミノ酸」の用語は、N末端から数えて、RASタンパク質のアミノ酸配列の117番目のアミノ酸に対応する位置におけるそのペプチドのアミノ酸鎖に位置するRASタンパク質のペプチド中のアミノ酸を意味する。対応する意味は、「12位に対応するアミノ酸」、「13位に対応するアミノ酸」、「61位に対応するアミノ酸」及び「146位に対応するアミノ酸」の用語に与えられる。
本明細書で使用される「ペプチド混合物」の用語は、混合されているが、化合していない2つ以上のペプチドを指す。混合物は乾燥粉末、溶液、懸濁液又はコロイドとして存在してもよく、均一であっても又は不均一であってもよい。
本明細書で使用される「RASタンパク質の突然変異」の用語は、被験体から採取された試料に存在するRASタンパク質中に存在する1以上の点突然変異を指す。
本明細書で使用される「点突然変異」の用語は、異なるアミノ酸残基を有するタンパク質生成物のポリペプチド鎖における単一のアミノ酸残基の置換を指す。
例えば、本明細書で使用される「G12Vの突然変異」の用語は、結果的に野生型RASタンパク質の12位のグリシン(G)がバリン(V)で置換されている点突然変異を指す。同様の定義が、K117N、A146T、G13C、G13R、Q61H等の類似する用語に適用される。
本明細書で使用される「核酸」又は「核酸分子」の用語は、多数のヌクレオチドのポリマーを指す。核酸は天然ヌクレオチドを含んでいても、又はペプチドヌクレオチド、モルホリン及びロックド(locked)ヌクレオチド、並びにグリコールヌクレオチド及びトレオースヌクレオチド等の人工ヌクレオチドを含んでいてもよい。
本明細書で使用される「ヌクレオチド」の用語は、細胞酵素によって認識される天然ヌクレオチド及び合成ヌクレオチドアナログを指す。
本明細書で使用される「医薬組成物」の用語は、意図されるヒト又は動物の被験体に対する治療目的の投与に適した医薬製剤を意味する。
配列表の簡単な説明
配列番号1はA146Tの突然変異を有するKRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号2はA146Tの突然変異を有するNRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号3はA146Vの突然変異を有するKRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号4はA146Vの突然変異を有するNRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号5はK117Nの突然変異を有するKRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号6はK117Nの突然変異を有するNRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号7はG13Cの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号8はG13Rの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号9はG13Dの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号10はG13Vの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号11はG13Aの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号12はG13Sの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号13はG12Aの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号14はG12Cの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号15はG12Dの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号16はG12Rの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号17はG12Sの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号18はG12Vの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号19はQ61Rの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号20はQ61Kの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号21はQ61Hの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号22はQ61Lの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号23はQ61Eの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号24はQ61Pの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号25はG13Cの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号26はG13Dの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号27はG12Aの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号28はG12Cの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号29はG12Dの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号30はG12Rの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号31はG12Sの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号32はG12Vの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号33はG13Rの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号34はG13Vの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号35はQ61Rの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号36はQ61Kの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号37はQ61Hの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号38はQ61Lの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号39は野生型HRASタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号40はRASタンパク質の117位を含む野生型KRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号41はRASタンパク質の117位を含む野生型NRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号42はRASタンパク質の146位を含む野生型KRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号43はRASタンパク質の146位を含む野生型NRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号44は野生型KRASタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号45は野生型NRASタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号1はA146Tの突然変異を有するKRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号2はA146Tの突然変異を有するNRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号3はA146Vの突然変異を有するKRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号4はA146Vの突然変異を有するNRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号5はK117Nの突然変異を有するKRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号6はK117Nの突然変異を有するNRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号7はG13Cの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号8はG13Rの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号9はG13Dの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号10はG13Vの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号11はG13Aの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号12はG13Sの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号13はG12Aの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号14はG12Cの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号15はG12Dの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号16はG12Rの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号17はG12Sの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号18はG12Vの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号19はQ61Rの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号20はQ61Kの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号21はQ61Hの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号22はQ61Lの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号23はQ61Eの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号24はQ61Pの突然変異を有するRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号25はG13Cの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号26はG13Dの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号27はG12Aの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号28はG12Cの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号29はG12Dの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号30はG12Rの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号31はG12Sの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号32はG12Vの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号33はG13Rの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号34はG13Vの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号35はQ61Rの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号36はQ61Kの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号37はQ61Hの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号38はQ61Lの突然変異を有するペプチド混合物の一実施形態のRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号39は野生型HRASタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号40はRASタンパク質の117位を含む野生型KRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号41はRASタンパク質の117位を含む野生型NRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号42はRASタンパク質の146位を含む野生型KRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号43はRASタンパク質の146位を含む野生型NRASペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号44は野生型KRASタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
配列番号45は野生型NRASタンパク質の全長アミノ酸配列を示す。
発明の詳細な説明
本発明は包括的に言えば、RASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含むRASタンパク質のペプチドであって、上記領域が突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、ペプチドが突然変異位置に点突然変異を有し、突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位である、ペプチドに関する。上で考察されるように、これらのペプチドは癌に対するワクチン及び/又は癌の治療として使用することができ、これらの突然変異ペプチドが免疫原性であることが今回初めて示された。例えば、RASタンパク質の146位に突然変異を有するペプチドが免疫原性であり、T細胞の誘導を刺激することが図11に示される。
本発明は包括的に言えば、RASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含むRASタンパク質のペプチドであって、上記領域が突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、ペプチドが突然変異位置に点突然変異を有し、突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位である、ペプチドに関する。上で考察されるように、これらのペプチドは癌に対するワクチン及び/又は癌の治療として使用することができ、これらの突然変異ペプチドが免疫原性であることが今回初めて示された。例えば、RASタンパク質の146位に突然変異を有するペプチドが免疫原性であり、T細胞の誘導を刺激することが図11に示される。
さらに、本発明は、RASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含むRASタンパク質の少なくとも第1及び第2のペプチドを含むペプチド混合物であって、上記領域が少なくとも8個のアミノ酸を含み、第1のペプチドが第1の突然変異位置を含み、第2のペプチドが第2の突然変異位置を含み、第1及び第2のペプチドが各々、第1及び第2の突然変異位置に点突然変異を有し、第1の突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位であり、第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位であり、突然変異の各々が互いに異なる、ペプチド混合物に関する。かかるペプチド混合物の一例がペプチド混合物だけでなく、ペプチド混合物中の個々のペプチドにも対するT細胞応答を誘導するのに効果的であることが図12に示されるが、146位、13位及び61位に突然変異を有するペプチドを含むペプチド混合物が組み合わせて使用した場合に免疫原性であることが初めて示された。
本発明のペプチドはHRAS、KRAS又はNRASのいずれかに対応するペプチドであってもよい。これらの3つのRASアイソフォームはいずれもGDP/GTP結合を担うエクソン2及び3の領域の全てにおいて配列同一性を共有し、GDP/GTP結合を担うエクソン4の領域、すなわち、癌において突然変異に供される領域の全てにおいて非常に高い配列相同性を共有する。例えば、RASタンパク質の146位を中心とする25アミノ酸配列の領域において、野生型HRAS及び野生型NRASはどちらも野生型KRASと92%の配列相同性(すなわち、2アミノ酸の差異)を有する。RASタンパク質の117位を中心とする25アミノ酸の領域において、野生型NRASは野生型KRASと92%の相同性(すなわち、2アミノ酸の差異)を有し、野生型HRASは野生型KRASと80%の相同性(すなわち、5アミノ酸の差異)を有する。野生型エクソン4によってコードされる配列中の差異はGDP/GTP結合を妨げず、これはGDP/GTP結合に影響をもたらす本明細書で指定される発癌突然変異である。
幾つかの実施形態では、上記ペプチドは、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも20個、少なくとも24個、又は少なくとも30個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、ペプチドは少なくとも8個のアミノ酸を含む。他の好ましい実施形態では、ペプチドは少なくとも17個のアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態では、ペプチドは30個以下のアミノ酸残基を含む。例えば、ペプチドは或る特定の実施形態では28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個又は8個以下のアミノ酸を含む。
幾つかの実施形態では、ペプチドは、RASタンパク質とは無関係の要素を含むより長いポリペプチドの一部として提示される。特に、より長いポリペプチドはRASタンパク質とは無関係の1つ以上の領域を含んでもよい。
ペプチドはRASタンパク質の117位又は146位に点突然変異を有する。野生型RASタンパク質は117位にリシン(K)、146位にアラニン(A)を含む。したがって、117位の突然変異はリシンから任意の他のアミノ酸への点突然変異であり、146位の突然変異はアラニンから任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。しかしながら、K117N、A146T及びA146Vの突然変異が特に癌と関連することがわかっている。したがって、好ましい実施形態では、ペプチドの点突然変異はK117N、A146T及びA146Vの突然変異の1つである。特に好ましい実施形態では、点突然変異はA146T又はA146Vの突然変異である。更により好ましい実施形態では、点突然変異はA146Tの突然変異であるが、かかるペプチドが免疫原性であり、T細胞増殖を誘導するのに効率的であることが図11に示される。
幾つかの実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも37%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する。他の実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して100%の配列同一性を有する。特に好ましい実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号4のうちの1つに対して100%の配列同一性を有する。更により好ましい実施形態では、ペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1及び配列番号2のうちの1つに対して100%の配列同一性を有する。
上述のペプチド混合物の幾つかの実施形態では、第1及び第2のペプチドは各々独立して少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも20個、少なくとも24個又は少なくとも30個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、第1及び第2のペプチドは各々少なくとも8個のアミノ酸を含む。他の好ましい実施形態では、第1及び第2のペプチドは各々少なくとも17個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、第1及び第2のペプチドは各々独立して30個以下のアミノ酸残基を含む。例えば、或る特定の実施形態では、第1及び第2のペプチドは各々28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個又は8個以下のアミノ酸を含む。第1及び第2のペプチドは同じ数のアミノ酸を有していても、又は異なる数のアミノ酸を有してもよい。
幾つかの実施形態では、第1及び第2のペプチドは各々、突然変異位置を含む領域以外の位置においてRASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも37%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、第1のペプチドは、突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうち1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、第1のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する。他の実施形態では、第1のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して100%の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号24のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。好ましい実施形態では、第2のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号24のうちの1つに対して少なくとも95%の配列同一性を有する。他の実施形態では、第2のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号24のうちの1つに対して100%の配列同一性を有する。
幾つかの実施形態では、第1のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して或る割合の配列同一性を有し、第2のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号24のうちの異なる1つに対して異なる割合の配列同一性を有する。他の実施形態では、第1のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して或る割合の配列同一性を有し、第2のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号24のうちの1つに対して同じ割合の配列同一性を有する。全ての実施形態において、第1及び第2のペプチドは各々、免疫応答を惹起することが可能である。
第1のペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の117位である場合、第1のペプチドの点突然変異はリシン(K)から任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。第1のペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の146位である場合、第1のペプチドの点突然変異はアラニン(A)から任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。幾つかの実施形態では、第1のペプチドの点突然変異はK117N、A146T及びA146Vの突然変異の1つである。幾つかの実施形態では、第1のペプチドの点突然変異はA146Tの突然変異であり、他の実施形態では、第1のペプチドの点突然変異はA146Vの突然変異である。更なる実施形態では、第1のペプチドの点突然変異はK117Nの突然変異である。
第2のペプチドの点突然変異は、野生型アミノ酸から任意の他のアミノ酸への点突然変異であってもよい。例えば、野生型RASタンパク質は12位及び13位の各々にグリシン(G)、61位にグルタミン(Q)を含む。したがって、第2のペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の13位である場合、13位の突然変異はグリシンから任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。同様に、第2のペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の12位又は61位である場合、12位又は61位の突然変異はグリシン又はグルタミンから、必要に応じて任意の他のアミノ酸への点突然変異であり得る。第2のペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位である場合、突然変異位置での突然変異はリシン又はアラニンのそれぞれから任意の他のアミノ酸へのものであり得る。好ましい実施形態では、第2のペプチドの点突然変異は、第1のペプチドの点突然変異とは独立してK117N、A146T、A146V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異のいずれか1つである。
幾つかの実施形態では、第1のペプチドの突然変異位置での点突然変異はA146Tの突然変異であり、第2のペプチドの突然変異位置での点突然変異はA146V、K117N、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異のいずれか1つである。幾つかの実施形態では、第1のペプチドの点突然変異はA146Tの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はA146Vの突然変異である。他の実施形態では、第1のペプチドの点突然変異はA146Tの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はK117Nの突然変異である。他の実施形態では、第1のペプチドの点突然変異はA146Tの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はG13C、G13D又はQ61Rの突然変異である。
他の実施形態では、第1のペプチドの突然変異位置での点突然変異はA146Vの突然変異であり、第2のペプチドの突然変異位置での点突然変異はA146T、K117N、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異のいずれか1つである。幾つかの実施形態では、第1のペプチドの点突然変異はA146Vの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はK117Nの突然変異である。
また他の実施形態では、第1のペプチドの突然変異位置での点突然変異はK117Nの突然変異であり、第2のペプチドの突然変異位置での点突然変異はG13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異のいずれか1つである。
本発明の代替的な実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むRASタンパク質の少なくとも1つの更なるペプチドを含んでもよい。少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置は、RASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位であり、少なくとも1つの更なるペプチドは、第1及び第2のペプチドの点突然変異とは異なる突然変異位置での点突然変異を有し得る。少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置での点突然変異は、第1及び第2のペプチドの点突然変異とは独立してK117N、A146T、A146V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異のいずれか1つであり得る。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置は、第1及び第2のペプチドの点突然変異とは独立してRASタンパク質の12位、13位又は61位、好ましくはG13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異である。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置は、第1及び第2のペプチドの点突然変異とは独立してG13C、G13D又はQ61Rの突然変異である。
ペプチド混合物は2つ以上の更なるペプチドを含んでもよい。例えば、ペプチド混合物は2つの更なるペプチド、3つの更なるペプチド、4つの更なるペプチド又はそれ以上を含んでもよい。ペプチド混合物が1つ以上の更なるペプチドを含む実施形態では、更なるペプチドは各々独立して、本明細書に記載される少なくとも1つの更なるペプチドの特徴を有する。
ペプチド混合物が少なくとも1つの更なるペプチドを含む実施形態では、第1、第2及び少なくとも1つの更なるペプチドは各々独立して少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも12個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも20個、少なくとも24個又は少なくとも30個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態では、ペプチドは各々少なくとも8個のアミノ酸を含む。他の好ましい実施形態では、ペプチドは各々少なくとも17個のアミノ酸を含む。更なる実施形態では、ペプチドは各々少なくとも18個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態では、第1、第2及び少なくとも1つの更なるペプチドは各々独立して30個以下のアミノ酸残基を含む。例えば、或る特定の実施形態では、第1及び第2のペプチドは各々28個、26個、24個、22個、20個、18個、16個、14個、12個、10個又は8個以下のアミノ酸を含む。概して、ペプチド混合物中の各々のペプチドは、ペプチド混合物中の1つ以上の他のペプチドとは異なる数のアミノ酸を含み得る。
ペプチド混合物が少なくとも1つの更なるペプチドを含む実施形態では、RASタンパク質の突然変異位置に対応するアミノ酸は点突然変異を有する。第2のペプチドと同様に、突然変異位置での点突然変異は野生型アミノ酸から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。したがって、少なくとも1つの更なるペプチドがRASタンパク質の146位を含む場合、点突然変異はアラニン(A)から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。少なくとも1つの更なるペプチドがRASタンパク質の117位を含む場合、点突然変異はリシン(K)から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。少なくとも1つの更なるペプチドがRASタンパク質の61位を含む場合、点突然変異はグルタミン(Q)から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。少なくとも1つの更なるペプチドがRASタンパク質の13位を含む場合、点突然変異はグリシン(G)から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。少なくとも1つの更なるペプチドがRASタンパク質の12位を含む場合、点突然変異はグリシン(G)から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。
少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の146位である実施形態では、ペプチドは146位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの更なるペプチドは146位を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号4のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。
少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の117位である実施形態では、ペプチドは117位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの更なるペプチドは117位を含む領域以外の位置において、配列番号5又は配列番号6のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。
少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の13位である実施形態では、ペプチドは13位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの更なるペプチドは、13位を含む領域以外の位置において、配列番号7〜配列番号12、配列番号25、配列番号26、配列番号33及び配列番号34のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、RASタンパク質の13位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、RASタンパク質の13位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する、RASタンパク質の2以上の更なるペプチドが存在する。かかる実施形態では、13位に突然変異を有するペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の12位である実施形態では、ペプチドは12位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの更なるペプチドは、12位を含む領域以外の位置において、配列番号13〜配列番号18及び配列番号27〜配列番号32のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、RASタンパク質の12位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、RASタンパク質の12位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する、RASタンパク質の2以上の更なるペプチドが存在する。かかる実施形態では、12位に突然変異を有するペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の61位である実施形態では、ペプチドは61位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、少なくとも1つの更なるペプチドは、61位を含む領域以外の位置において、配列番号19〜配列番号24及び配列番号35〜配列番号38のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、RASタンパク質の61位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、RASタンパク質の61位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する、RASタンパク質の2以上の更なるペプチドが存在する。かかる実施形態では、61位に突然変異を有するペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は第1、第2及び第3のペプチドを含み、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位、13位又は61位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位、13位又は61位であり、第2のペプチドの点突然変異は第3のペプチドの点突然変異とは異なる。
幾つかの実施形態では、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位又は61位である。幾つかの実施形態では、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位であるが、他の実施形態では、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の61位である。
他の実施形態では、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位又は61位である。幾つかの実施形態では、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の61位である。他の実施形態では、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位である。
他の実施形態では、ペプチド混合物は第1、第2及び第3のペプチドを含み、第1のペプチドの点突然変異はA146Tの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はA146Vの突然変異であり、第3のペプチドの点突然変異はK117Nの突然変異である。第1のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第1のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、配列番号1又は配列番号2のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第2のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、配列番号3又は配列番号4のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第3のペプチドは117位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第3のペプチドは117位を含む領域以外の位置において、配列番号5又は配列番号6のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は第1のペプチドと、第2のペプチドと、第3のペプチドとからなり、第1のペプチドの点突然変異はA146Tの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はA146Vの突然変異であり、第3のペプチドの点突然変異はK117Nの突然変異であり、ペプチドは上に記載されるようなものである。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は、RASタンパク質の突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むRASタンパク質の第4のペプチドを含む。第4のペプチドの突然変異位置は第1、第2及び第3のペプチドの突然変異位置とは独立してRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位である。第4のペプチドは第1、第2及び第3のペプチドの各々の点突然変異とは異なる突然変異位置で点突然変異を有する。上で考察される第3のペプチドと同様に、第4のペプチドの点突然変異は野生型アミノ酸から任意の他のアミノ酸へのものであり得る。好ましい実施形態では、第4のペプチドの点突然変異はK117N、A146T、A146V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異である。
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第1、第2、第3及び第4のペプチドを含み、第1のペプチドの突然変異位置はRASペプチドの146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位であり、第4のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の61位である。他のペプチドの点突然変異とは独立して、第1のペプチドの点突然変異はA146T又はA146Vの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はG12A、G12C、G12D、G12R、G12S又はG12Vの突然変異であり、第3のペプチドの点突然変異はG13A、G13C、G13D、G13R、G13S又はG13Vの突然変異であり、第4のペプチドの点突然変異はQ61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異であり得る。第1のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第1のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号4のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第2のペプチドは12位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは12位を含む領域以外の位置において、配列番号13〜配列番号18及び配列番号27〜配列番号32のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第3のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第3のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、配列番号7〜配列番号12、配列番号25、配列番号26、配列番号33及び配列番号34のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第4のペプチドは61位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは61位を含む領域以外の位置において、配列番号19〜配列番号24及び配列番号35〜配列番号38のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第1、第2、第3及び第4のペプチドを含み、第1のペプチドの突然変異位置はRASペプチドの146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位であり、第4のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の61位である。他のペプチドの点突然変異とは独立して、第1のペプチドの点突然変異はA146T又はA146Vの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はG13A、G13C、G13D、G13R、G13S又はG13Vの突然変異であり、第3のペプチドの点突然変異はG13A、G13C、G13D、G13R、G13S又はG13Vの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異は、第3のペプチドの点突然変異とは異なり、第4のペプチドの点突然変異はQ61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異であり得る。第1のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第1のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号4のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第2のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、配列番号7〜配列番号12、配列番号25、配列番号26、配列番号33及び配列番号34のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第3のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第3のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、配列番号7〜配列番号12、配列番号25、配列番号26、配列番号33及び配列番号34のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第4のペプチドは61位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは61位を含む領域以外の位置において、配列番号19〜配列番号24及び配列番号35〜配列番号38のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第1、第2、第3及び第4のペプチドを含み、第1のペプチドの突然変異位置はRASペプチドの117位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位であり、第4のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の61位である。他のペプチドの点突然変異とは独立して、第1のペプチドの点突然変異はK117Nの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はG12A、G12C、G12D、G12R、G12S又はG12Vの突然変異であり、第3のペプチドの点突然変異はG13A、G13C、G13D、G13R、G13S又はG13Vの突然変異であり、第4のペプチドの点突然変異はQ61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異であり得る。第1のペプチドは117位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第1のペプチドは117位を含む領域以外の位置において、配列番号5又は配列番号6のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第2のペプチドは12位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは12位を含む領域以外の位置において、配列番号13〜配列番号18及び配列番号27〜配列番号32のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第3のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第3のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、配列番号7〜配列番号12、配列番号25、配列番号26、配列番号33及び配列番号34のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第4のペプチドは61位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは61位を含む領域以外の位置において、配列番号19〜配列番号24及び配列番号35〜配列番号38のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第1、第2、第3、第4及び第5のペプチドを含み、第1のペプチドの突然変異位置はRASペプチドの146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位であり、第3のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位であり、第4のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の61位であり、第5のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の117位である。他のペプチドの点突然変異とは独立して、第1のペプチドの点突然変異はA146T又はA146Vの突然変異であり、第2のペプチドの点突然変異はG12A、G12C、G12D、G12R、G12S又はG12Vの突然変異であり、第3のペプチドの点突然変異はG13A、G13C、G13D、G13R、G13S又はG13Vの突然変異であり、第4のペプチドの点突然変異はQ61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異であり、第5のペプチドの点突然変異はK117Nの突然変異であり得る。第1のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第1のペプチドは146位を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号4のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第2のペプチドは12位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは12位を含む領域以外の位置において、配列番号13〜配列番号18及び配列番号27〜配列番号32のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第3のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第3のペプチドは13位を含む領域以外の位置において、配列番号7〜配列番号12、配列番号25、配列番号26、配列番号33及び配列番号34のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第4のペプチドは61位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第2のペプチドは61位を含む領域以外の位置において、配列番号19〜配列番号24及び配列番号35〜配列番号38のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第5のペプチドは117位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。幾つかの実施形態では、第5のペプチドは117位を含む領域以外の位置において、配列番号5又は配列番号6のうちの1つと少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。上述の配列番号の任意の組合せが本発明のペプチド混合物において想定される。
幾つかの実施形態では(表6及び表7を参照されたい)、ペプチド混合物はA146Tの突然変異を有するペプチドと、G12Cの突然変異を有するペプチドと、G12Dの突然変異を有するペプチドと、G12Vの突然変異を有するペプチドと、G13Dの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号1又は配列番号2及び配列番号9、配列番号14、配列番号15及び配列番号18のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1又は配列番号2及び配列番号26、配列番号28、配列番号29及び配列番号32のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。表6及び表7に、好ましくはこれらの実施形態において存在するペプチドを示す。
幾つかの実施形態では(表8及び表9を参照されたい)、ペプチド混合物はA146Tの突然変異を有するペプチドと、Q61Rの突然変異を有するペプチドと、Q61Kの突然変異を有するペプチドと、Q61Hの突然変異を有するペプチドと、Q61Lの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号1又は配列番号2及び配列番号19、配列番号20、配列番号21及び配列番号22のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1又は配列番号2及び配列番号35、配列番号36、配列番号37及び配列番号38のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。表8及び表9に、好ましくはこれらの実施形態において存在するペプチドを示す。
幾つかの実施形態では、RASペプチドの117位に点突然変異を有するペプチド及び/又は146位に点突然変異を有するペプチドに加えて、ペプチド混合物は配列番号25〜配列番号32に対してそれぞれ100%の配列同一性を有するG13Cの突然変異を有するペプチドと、G13Dの突然変異を有するペプチドと、G12Aの突然変異を有するペプチドと、G12Cの突然変異を有するペプチドと、G12Dの突然変異を有するペプチドと、G12Rの突然変異を有するペプチドと、G12Sの突然変異を有するペプチドと、G12Vの突然変異を有するペプチドとを含み、RASペプチドの12位又は13位に突然変異を有するペプチドのこの特定の組合せを、本明細書においてTG02と呼ぶ。図3に、好ましくはTG02に存在するペプチドを示す。RAS突然変異と関連する癌、肺癌及び大腸癌におけるこれらの突然変異の発生率を、それぞれ図2、図4及び図5に示す。TG02によるマウスのワクチン接種後の脾細胞増殖アッセイの結果を図9に示すが、TG02が免疫応答を誘導するのに効果的であることが示される。
幾つかの実施形態では、RASタンパク質の117位に点突然変異を有するペプチド及び/又は146位に点突然変異を有するペプチドに加えて、ペプチド混合物はG13Rの突然変異を有するペプチドと、G13Vの突然変異を有するペプチドと、Q61Rの突然変異を有するペプチドと、Q61Kの突然変異を有するペプチドと、Q61Hの突然変異を有するペプチドと、Q61Lの突然変異を有するペプチドとを含み、ペプチドは配列番号33〜配列番号38のそれぞれに対して100%の配列同一性を有し、RASペプチドの13位又は61位に点突然変異を有するペプチドのこの特定の組合せを、本明細書においてTG03と呼ぶ。図3にTG03のペプチドを示す。悪性黒色腫におけるこれらの突然変異の発生率を図6に示す。
幾つかの実施形態では(表10及び表11を参照されたい;本明細書においてTG02+A146Tと呼ぶ)、ペプチド混合物はA146Tの突然変異を有するペプチドと、G13Cの突然変異を有するペプチドと、G13Dの突然変異を有するペプチドと、G12Aの突然変異を有するペプチドと、G12Cの突然変異を有するペプチドと、G12Dの突然変異を有するペプチドと、G12Rの突然変異を有するペプチドと、G12Sの突然変異を有するペプチドと、G12Vの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号1(KRAS A146Tペプチド)又は配列番号2(NRAS A146Tペプチド)、及び配列番号7、配列番号9及び配列番号13〜配列番号18のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1(KRAS A146Tペプチド)又は配列番号2(NRAS A146Tペプチド)、及び配列番号25〜配列番号32のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。表10及び表11に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
幾つかの実施形態では(表12及び表13を参照されたい;TG02+A146V)、ペプチド混合物はA146Vの突然変異を有するペプチドと、G13Cの突然変異を有するペプチドと、G13Dの突然変異を有するペプチドと、G12Aの突然変異を有するペプチドと、G12Cの突然変異を有するペプチドと、G12Dの突然変異を有するペプチドと、G12Rの突然変異を有するペプチドと、G12Sの突然変異を有するペプチドと、G12Vの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号3(KRAS A146Vペプチド)又は配列番号4(NRAS A146Vペプチド)、及び配列番号7、配列番号9及び配列番号13〜配列番号18のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号3又は配列番号4、及び配列番号25〜配列番号32のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。表12及び表13に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
幾つかの実施形態では(表14及び表15;TG03+A146T)、ペプチド混合物はA146Tの突然変異を有するペプチドと、G13Rの突然変異を有するペプチドと、G13Vの突然変異を有するペプチドと、Q61Rの突然変異を有するペプチドと、Q61Kの突然変異を有するペプチドと、Q61Hの突然変異を有するペプチドと、Q61Lの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号1(KRAS A146Tペプチド)又は配列番号2(NRAS A146Tペプチド)、及び配列番号8、配列番号10及び配列番号19〜配列番号22のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1(KRAS A146Tペプチド)又は配列番号2(NRAS A146Tペプチド)、及び配列番号33〜配列番号38のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。表14及び表15に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
幾つかの実施形態では(表16及び表17を参照されたい;TG03+A146V)、ペプチド混合物はA146Vの突然変異を有するペプチドと、G13Rの突然変異を有するペプチドと、G13Vの突然変異を有するペプチドと、Q61Rの突然変異を有するペプチドと、Q61Kの突然変異を有するペプチドと、Q61Hの突然変異を有するペプチドと、Q61Lの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号3(KRAS A146Vペプチド)又は配列番号4(NRAS A146Vペプチド)、及び配列番号8、配列番号10及び配列番号19〜配列番号22のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号3(KRAS A146Vペプチド)又は配列番号4(NRAS A146Vペプチド)、及び配列番号33〜配列番号38のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。表16及び表17に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
幾つかの実施形態では(表18及び表19を参照されたい;TG02+K117N)、ペプチド混合物はK117Nの突然変異を有するペプチドと、G13Cの突然変異を有するペプチドと、G13Dの突然変異を有するペプチドと、G12Aの突然変異を有するペプチドと、G12Cの突然変異を有するペプチドと、G12Dの突然変異を有するペプチドと、G12Rの突然変異を有するペプチドと、G12Sの突然変異を有するペプチドと、G12Vの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号5(KRAS K117Nペプチド)又は配列番号6(NRAS K117Nペプチド)、及び配列番号7、配列番号9及び配列番号13〜配列番号18のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号5(KRAS K117Nペプチド)又は配列番号6(NRAS K117Nペプチド)、及び配列番号25〜配列番号32のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。表18及び表19に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
幾つかの実施形態では(表20及び表21を参照されたい;TG03+K117N)、ペプチド混合物はK117Nの突然変異を有するペプチドと、G13Rの突然変異を有するペプチドと、G13Vの突然変異を有するペプチドと、Q61Rの突然変異を有するペプチドと、Q61Kの突然変異を有するペプチドと、Q61Hの突然変異を有するペプチドと、Q61Lの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は、突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号5(KRAS K117Nペプチド)又は配列番号6(NRAS K117Nペプチド)、及び配列番号8、配列番号10及び配列番号19〜配列番号22のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号5(KRAS K117Nペプチド)又は配列番号6(NRAS K117Nペプチド)、及び配列番号33〜配列番号38のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。表20及び表21に、好ましくはこの実施形態において存在するペプチドを示す。
幾つかの実施形態では(表22及び表23を参照されたい;TGX3)、ペプチド混合物はA146Tの突然変異を有するペプチドと、G13Cの突然変異を有するペプチドと、G13Dの突然変異を有するペプチドと、Q61Rの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号1(KRAS A146Tペプチド)又は配列番号2(NRAS A146Tペプチド)、及び配列番号7、配列番号9及び配列番号19のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1(KRAS A146Tペプチド)又は配列番号2(NRAS A146Tペプチド)、及び配列番号25、配列番号26及び配列番号35のいずれかに対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、G13C、G13D及びQ61Rペプチドは配列番号25、配列番号26及び配列番号35のそれぞれに対して100%の配列同一性を有し、A146Tペプチドは配列番号1と100%の配列同一性を有し、ペプチドのこの特定の組合せを本明細書においてTGX3と呼ぶ。表22にTGX3に存在するペプチドを示し、このペプチド混合物がペプチド混合物、またTGX3中の個々のペプチドの各々に対してT細胞応答を誘導するのに効果的であることが図12に示される。好ましくはTGX3の代替形態に存在するペプチドを表23に示すが、A146Tの突然変異を有するペプチドは配列番号2と100%の配列同一性を有する。
他の実施形態では、ペプチド混合物はA146T、A146V又はK117Nの突然変異を有するペプチドと、G13Cの突然変異を有するペプチドと、G13Dの突然変異を有するペプチドと、G13Rの突然変異を有するペプチドと、G12Aの突然変異を有するペプチドと、G12Cの突然変異を有するペプチドと、G12Dの突然変異を有するペプチドと、G12Rの突然変異を有するペプチドと、G12Sの突然変異を有するペプチドと、G12Vの突然変異を有するペプチドとからなる。かかる実施形態では、ペプチド混合物は117位、146位、12位又は13位を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号1〜配列番号9及び配列番号13〜配列番号18に対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は117位、146位、12位又は13位を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号1〜配列番号6及び配列番号25〜配列番号33に対して独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有するペプチドからなる。配列番号25〜配列番号33によって表されるペプチドからなるペプチド混合物によるPMBCのin vitro刺激後のT細胞増殖アッセイの結果を図8に示すが、T細胞がこの混合物によって刺激されたことが示される。したがって、RASペプチド混合物は免疫応答を誘導するのに効果的である。
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は本明細書に記載される第1、第2、第3、第4及び第5のペプチドからなり、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の117位又は146位である。第2、第3、第4及び第5のペプチドの各々の突然変異位置はRASタンパク質の13位であり、第2、第3、第4及び第5のペプチドは各々独立して、13位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第2、第3、第4及び第5のペプチドは各々独立して、13位を含む領域以外の位置において、配列番号7〜配列番号12、配列番号25、配列番号26、配列番号33及び配列番号34のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し得る。第2、第3、第4及び第5のペプチドは各々、RASペプチドの13位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、第2、第3、第4及び第5のペプチドは各々、他のペプチドの点突然変異とは異なる点突然変異を有する。一実施形態では、第1のペプチドはA146T、A146V又はK117Nの突然変異を有するペプチドであり、第2のペプチドはG13Rの突然変異を有するペプチドであり、第3のペプチドはG13Aの突然変異を有するペプチドであり、第4のペプチドはG13Sの突然変異を有するペプチドであり、第5のペプチドはG13Vの突然変異を有するペプチドである。
代替的な実施形態は、RASタンパク質の少なくとも6個のペプチドを含むペプチド混合物であって、6個のペプチドの各々がRASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域が本明細書に記載される突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、少なくとも6個のペプチドの1つの突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位である、ペプチド混合物を含む。少なくとも6個のペプチドは各々独立して、突然変異位置を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。幾つかの実施形態では、ペプチド混合物は第1、第2、第3、第4、第5及び第6のペプチドを含み、第1のペプチドの突然変異位置はRASペプチドの117位又は146位であり、第2、第3、第4、第5及び第6のペプチドの各々の突然変異位置はRASタンパク質の13位である。第1のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有し、第2、第3、第4、第5及び第6のペプチドは各々独立して、13位を含む領域以外の位置において、配列番号7〜配列番号12、配列番号25、配列番号26、配列番号33及び配列番号34のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%の配列同一性を有する。第1のペプチドはA146T、A146V及びK117Nの突然変異から選択される点突然変異を有し、第2、第3、第4、第5及び第6のペプチドは各々G13A、G13C、G13D、G13R、G13S又はG13Vの突然変異から独立して選択されるRASタンパク質の13位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、第2、第3、第4、第5及び第6のペプチドの各々の点突然変異は他のペプチドの点突然変異とは異なる。幾つかの実施形態では、第1のペプチドはA146Tの突然変異を有し、幾つかの実施形態では、第1のペプチドはA146Vの突然変異を有する。他の実施形態では、第1のペプチドはK117Nの突然変異を有する。
別の実施形態では、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物はRASタンパク質の7個のペプチドからなり、各ペプチドはRASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域は突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の117位又は146位であり、第2〜第7のペプチドの各々の突然変異位置はRASタンパク質の12位である。第1のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を有し、及び/又は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を有する。第2〜第7のペプチドの各々が、12位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を独立して有し、及び/又は12位を含む領域以外の位置において、配列番号13〜配列番号18、及び配列番号27〜配列番号32のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を独立して有する。第2〜第7のペプチドは各々、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S又はG12Vの突然変異から選択されるRASタンパク質の12位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、各ペプチドの点突然変異は他のペプチドの点突然変異と異なる。
別の実施形態では、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物はRASタンパク質の7個のペプチドからなり、各ペプチドはRASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域は突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の117位又は146位であり、第2〜第7のペプチドの各々の突然変異位置はRASタンパク質の61位である。第1のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を有し、及び/又は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を有する。第2〜第7のペプチドの各々が、61位を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を独立して有し、及び/又は61位を含む領域以外の位置において、配列番号19〜配列番号24、及び配列番号35〜配列番号38のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を独立して有する。第2〜第7のペプチドは各々、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異から選択されるRASタンパク質の61位に対応するアミノ酸に点突然変異を有し、各ペプチドの点突然変異は他のペプチドの点突然変異と異なる。
更なる実施形態では、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物はRASタンパク質の第1、第2、第3、第4及び第5のペプチドからなり、ペプチドは各々RASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域は突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含む。第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の117位又は146位であり、第2、第3及び第4のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位であり、第5のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の13位である。第1のペプチドは突然変異位置を含む領域以外の位置において、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を有し、及び/又は突然変異位置を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号6のうちの1つに対して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を有する。第2、第3、第4及び第5のペプチドは各々、12位若しくは13位を含む領域以外の位置において、それぞれ、RASタンパク質と少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を有し、及び/又は12位若しくは13位を含む領域以外の位置において、それぞれ配列番号7〜配列番号18、及び配列番号25〜配列番号34のうちの1つに対してそれぞれ独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%、若しくは100%の配列同一性を有する。第2、第3、第4及び第5のペプチドは各々、RASタンパク質の上記12位又は13位に対応するアミノ酸にそれぞれ点突然変異を有する。幾つかの実施形態では、第2のペプチドはG12Aの突然変異を有するペプチドであり、第3のペプチドはG12Rの突然変異を有するペプチドであり、第4のペプチドはG12Sの突然変異を有するペプチドであり、第5のペプチドはG13Cの突然変異を有するペプチドである。
概して、本発明のペプチドは12位、13位、61位、117位又は146位を含む8個のアミノ酸の領域内に、12位、13位、61位、117位又は146位のそれぞれの残基以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有する。さらに、概して、本発明のペプチドはRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位を含む領域以外の位置において、配列番号1〜配列番号38のうちの1つに対してそれぞれ独立して少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも66%、少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも95%、少なくとも99%又は100%を有する。
幾つかの実施形態では、ペプチド混合物中に最大で12個の異なるペプチドが存在する。他の実施形態では、最大で8個、10個、12個、14個又は16個の異なるペプチドが存在する。ペプチド混合物がRASタンパク質の突然変異位置を含む領域を含む少なくとも1つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチド混合物は、RASタンパク質の突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、突然変異位置での点突然変異を有する1個、2個、3個、4個、5個又は6個のペプチドを含む。ペプチドの突然変異位置は各々独立して117位、146位、12位、13位又は61位であり、各ペプチドは他のペプチドとは異なる突然変異位置での点突然変異を有する。ペプチド混合物がRASタンパク質の12位を含む領域を含む少なくとも1つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチド混合物は、RASペプチドの12位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、RASタンパク質の12位に対応する位置に点突然変異を有する1個、2個、3個、4個、5個又は6個のペプチドを含む。ペプチド混合物がRASタンパク質の61位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含む少なくとも1つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチド混合物は、RASタンパク質の61位を含む領域を含み、RASタンパク質の61位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する1個、2個、3個、4個、5個又は6個のペプチドを含み、ペプチドは各々異なる点突然変異を有する。ペプチド混合物がRASタンパク質の13位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含む少なくとも1つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチド混合物は、RASタンパク質の13位を含む領域を含み、RASタンパク質の13位に対応するアミノ酸に点突然変異を有する1個、2個、3個、4個、5個又は6個のペプチドを含み、ペプチドは各々異なる点突然変異を有する。
幾つかの実施形態では、RASペプチドの117位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の107位〜127位を含む。代替的な実施形態では、RASタンパク質の117位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の108位〜126位を含むが、他の実施形態では、ペプチドはRASタンパク質の109位〜125位を含む。更なる実施形態では、RASタンパク質の117位に対応するアミノ酸はペプチドのC末端にある。更なる実施形態では、RASタンパク質の117位に対応するアミノ酸はペプチドのN末端にある。概して、RASタンパク質の117位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、117位を含むRASタンパク質の任意の8個の位置からなり得る。例えば、117位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、RASタンパク質の110位〜117位、111位〜118位、112位〜119位、113位〜120位、114位〜121位、115位〜122位、116位〜123位又は117位〜124位のアミノ酸からなり得る。幾つかの実施形態では、RASタンパク質の117位に対応するアミノ酸はペプチドの中央にある。
幾つかの実施形態では、RASペプチドの146位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の136位〜156位を含む。代替的な実施形態では、RASタンパク質の146位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の137位〜155位を含むが、他の実施形態では、ペプチドはRASタンパク質の138位〜154位を含む。更なる実施形態では、RASタンパク質の146位に対応するアミノ酸はペプチドのC末端にある。更なる実施形態では、RASタンパク質の146位に対応するアミノ酸はペプチドのN末端にある。概して、RASタンパク質の146位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、146位を含むRASタンパク質の任意の8個の位置からなり得る。例えば、146位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、RASタンパク質の139位〜146位、140位〜147位、141位〜148位、142位〜149位、143位〜150位、144位〜151位、145位〜152位又は146位〜153位のアミノ酸からなり得る。幾つかの実施形態では、RASタンパク質の146位に対応するアミノ酸はペプチドの中央にある。
ペプチド混合物の幾つかの実施形態では、RASペプチドの12位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の1位〜30位を含む。他の実施形態では、RASタンパク質の12位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の5位〜21位を含む。代替的な実施形態では、RASタンパク質の12位に対応するアミノ酸はペプチドのC末端にある。更なる実施形態では、RASタンパク質の12位に対応するアミノ酸はペプチドのN末端にある。概して、RASタンパク質の12位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、12位を含むRASタンパク質の任意の8個の位置からなり得る。例えば、12位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、RASタンパク質の5位〜12位、6位〜13位、7位〜14位、8位〜15位、9位〜16位、10位〜17位、11位〜18位又は12位〜19位のアミノ酸からなり得る。
ペプチド混合物の幾つかの実施形態では、RASペプチドの13位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の1位〜30位を含む。代替的な実施形態では、RASタンパク質の13位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の5位〜21位を含む。更なる実施形態では、RASタンパク質の13位に対応するアミノ酸はペプチドのC末端にある。更なる実施形態では、RASタンパク質の13位に対応するアミノ酸はペプチドのN末端にある。概して、RASタンパク質の13位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、13位を含むRASタンパク質の任意の8個の位置からなり得る。例えば、13位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、RASタンパク質の6位〜13位、7位〜14位、8位〜15位、9位〜16位、10位〜17位、11位〜18位、12位〜19位又は13位〜20位のアミノ酸からなり得る。
ペプチド混合物の幾つかの実施形態では、RASペプチドの61位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の47位〜76位を含む。他の実施形態では、RASペプチドの61位を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含むペプチドは、RASタンパク質の53位〜69位を含む。代替的な実施形態では、RASタンパク質の61位に対応するアミノ酸はペプチドのC末端にある。更なる実施形態では、RASタンパク質の61位に対応するアミノ酸はペプチドのN末端にある。概して、RASタンパク質の61位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、13位を含むRASタンパク質の任意の8個の位置からなり得る。例えば、61位を含む少なくとも8個のアミノ酸を有する領域は、RASタンパク質の54位〜61位、55位〜62位、56位〜63位、57位〜64位、58位〜65位、59位〜66位、60位〜67位又は61位〜68位のアミノ酸からなり得る。
本発明のペプチド混合物は、等しい又は異なる比率でペプチドを含有し得る。幾つかの実施形態では、第1及び第2のペプチドは混合物中にペプチドの絶対数で等しい比率で存在し、すなわち、各ペプチドはペプチド混合物のペプチド構成要素中のペプチドの総数の50%を占める。他の実施形態では、ペプチドの絶対数で第2のペプチドよりも大きな比率の第1のペプチドがペプチド混合物中に存在する。例えば、第1のペプチドは、ペプチド混合物のペプチド構成要素中のペプチドの総数の少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%を占めることができる。代替的な実施形態では、第1のペプチドよりも大きな比率の第2のペプチドがペプチド混合物中に存在する。例えば、第2のペプチドはペプチド混合物のペプチド構成要素の少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%を占めることができる。少なくとも1つの更なるペプチドを含む実施形態では、ペプチドはペプチド混合物のペプチド構成要素中に等比率で存在する。他の実施形態では、第1、第2及び少なくとも1つの更なるペプチドは互いに異なる比率で存在する。例えば、第1、第2及び少なくとも1つの更なるペプチドは各々独立して、ペプチド混合物のペプチド構成要素の少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%又は少なくとも90%を占めることができる。
更なる実施形態では、上に記載されるペプチドはワクチン又は薬剤として用いられる。ペプチドはRASタンパク質のフラグメントに対応し、突然変異位置を含むRASタンパク質の少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、突然変異位置はRASタンパク質の117位又は146位である。少なくとも8個のアミノ酸の領域は、突然変異位置以外にRASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有する。ワクチン又は薬剤として用いられるペプチドは突然変異位置での点突然変異を有し、突然変異位置はRASタンパク質の117位又は146位である。幾つかの実施形態では、ペプチドの点突然変異はK117N、A146T又はA146Vの突然変異の1つである。上で考察されるように、117位又は146位に点突然変異を有するRASタンパク質のペプチド、特にK117N、A146T及びA146Vペプチドが免疫原性であり、T細胞増殖を誘導することが今回わかった。特に、RASタンパク質の146位に突然変異を有するペプチド(より具体的には、A146Tペプチド)がT細胞の誘導を刺激することが図11に示される。
さらに、ペプチド混合物が野生型RASタンパク質の異なる領域に由来するペプチドを含有する場合であっても、ペプチド混合物に対する免疫原性応答が得られることが図12に示される。したがって、関連T細胞への提示を担うHLA分子の結合について混合物のペプチド間に競合が見られず、かかる免疫優性が本発明のペプチド混合物にとって重要な問題でないことが図12に示される。
本発明のペプチドは、細胞表面においてMHC II分子によって提示されるRASタンパク質フラグメントに対応するペプチドである。したがって、本発明のペプチドは、RASタンパク質の細胞内タンパク質分解によって生じ、その後HLA分子上に提示され得て、概して個体がT細胞レパートリー中にそれに対する応答性T細胞を有する、タンパク質フラグメントに対応するペプチドである。
本発明の別の態様では、MHC分子上に提示された場合に、RASタンパク質の117位又は146位に突然変異位置を含む、上に記載される本発明のペプチドに特異的なT細胞及びT細胞を含むT細胞製剤が提供される。本発明の更なる態様では、本発明のペプチド混合物の1つの各々のペプチドに特異的なT細胞を含むT細胞混合物が提供される。
T細胞、T細胞製剤及びT細胞混合物は、少なくとも1つの応答性T細胞を、RASタンパク質のペプチド又は少なくともRASタンパク質の第1及び第2のペプチドを含むペプチド混合物で刺激することによって作製することができる。例えば、一実施形態では、T細胞又はT細胞製剤はRASタンパク質のフラグメントに対応するペプチドに特異的であり、ペプチドはRASタンパク質の117位又は146位である突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、T細胞はペプチドの突然変異位置での点突然変異に特異的である。別の実施形態では、例えば、T細胞製剤はRASタンパク質のフラグメントに対応するペプチドに特異的な複数のT細胞を含み、ペプチドは突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、突然変異位置はRASタンパク質の117位又は146位であり、T細胞製剤中の各々のT細胞はペプチドの突然変異位置での点突然変異に特異的である。別の実施形態では、例えば、T細胞混合物は複数のT細胞を含み、第1及び第2のT細胞は、RASタンパク質のフラグメントに対応する第1及び第2のペプチドにそれぞれ特異的であり、各ペプチドは突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、第1のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の117位又は146位であり、第2のペプチドの突然変異位置はRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位であり、第1及び第2のT細胞が各々、上記突然変異位置に対応するアミノ酸での点突然変異に特異的であり、第1のT細胞が特異的な点突然変異は第2のT細胞が特異的な点突然変異とは異なる。
本発明の更なる態様では、MHC分子上に提示された場合に、本発明のペプチド又は本発明のペプチド混合物のペプチドに特異的なT細胞受容体又はその抗原結合フラグメントが提供される。RASタンパク質のペプチドに特異的なT細胞受容体又はその抗原結合フラグメントであって、ペプチドがRASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域が突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、該領域が突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸を含み、突然変異位置が点突然変異を有し、突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位又は61位である、T細胞受容体又はその抗原結合フラグメントも提供される。T細胞受容体の抗原結合フラグメントは、T細胞受容体の完全な可変領域又は好適なフレームワーク領域中のその相補性決定領域を含み得る。
本発明の別の態様では、少なくとも上に記載されるような第1及び第2のT細胞受容体又はその抗原結合フラグメントを含むT細胞受容体混合物が提供される。RASタンパク質のペプチドに特異的な少なくとも第1及び第2のT細胞受容体又はその抗原結合フラグメントを含むT細胞受容体混合物であって、ペプチドがRASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、該領域が突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、該領域が突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸を含み、突然変異位置が点突然変異を有し、各ペプチドの突然変異位置が独立してRASタンパク質の117位、146位、12位、13位又は61位であり、第1及び第2のT細胞受容体又はその抗原結合フラグメントの各々が異なる点突然変異を有するペプチドに特異的である、T細胞受容体混合物も提供される。幾つかの実施形態では、T細胞受容体混合物は、上に記載されるペプチド混合物のいずれかのペプチドの各々に特異的なT細胞受容体又はその抗原結合フラグメントを含む。
本発明の別の態様では、MHC分子上に提示された場合に、本発明のペプチド又は本発明のペプチド混合物のペプチドに特異的なT細胞受容体をコードするmRNAが提供される。幾つかの実施形態では、mRNAを使用して宿主細胞にトランスフェクトし、コードされたT細胞受容体を宿主細胞上に提示させる。
本発明の別の態様では、本発明のペプチド又は本発明のペプチド混合物のペプチドをコードする配列を含む核酸が提供される。核酸の混合物が本発明のペプチド混合物をコードするように、混合物の各核酸が本発明のペプチド混合物の異なるペプチドをコードする配列を含む核酸の混合物も提供される。
幾つかの実施形態では、核酸及びその混合物を使用して、本発明のペプチド又はペプチド混合物を合成する。例えば、本発明のペプチドは核酸を被験体に投与することによって合成することができるが、その際に核酸が被験体により発現され、それにより本発明のペプチドがin situで生じる。産生されるペプチドはその後、被験体において免疫応答を惹起する。別の例では、宿主細胞が核酸を発現して本発明のペプチドを産生し、これをその後回収及び精製するように、核酸を使用して、宿主細胞を本発明の核酸で形質転換又はトランスフェクトすることによって本発明のペプチドを合成することができる。幾つかの実施形態では、本発明のペプチドは、当該技術分野で既知の方法を用いた化学合成によって作製される。
本発明の別の態様では、本発明のペプチド又はT細胞受容体をコードする配列を含む核酸を含むベクターが提供される。更なる態様では、上に記載されるベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞をベクターでトランスフェクト又は形質転換することで、宿主細胞にベクターによりコードされる核酸を発現させる。
ペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞製剤、T細胞混合物、T細胞受容体及びその抗原結合フラグメント、核酸、ベクター及び宿主細胞が癌、特にRAS癌遺伝子の突然変異と関連する癌の治療及び/又は予防に使用される。癌としては、副腎、自律神経節、胆道、骨、乳房、中枢神経系、頸部、結腸直腸、子宮内膜、造血器、リンパ系、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、上気道消化管及び尿路の癌、並びに悪性黒色腫を挙げることができ、本発明のペプチド混合物、ペプチド、T細胞混合物、T細胞製剤、核酸、ベクター及び宿主細胞は、これらのタイプの癌の2つ以上の予防及び/又は治療に使用することができる。幾つかの実施形態では、A146T、A146V若しくはK117Nの突然変異を有する本発明のペプチド、第1のペプチドがA146T、A146V若しくはK117Nの突然変異を有する本発明のペプチド混合物、A146T、A146V若しくはK117Nの突然変異を有するペプチドに特異的な本発明のT細胞、T細胞がA146T、A146V若しくはK117Nの突然変異を有するペプチドに特異的な本発明のT細胞製剤、第1のT細胞がA146T、A146V若しくはK117Nの突然変異を有するペプチドに特異的な本発明のT細胞混合物、A146T、A146V若しくはK117Nの突然変異を有するペプチドに特異的な本発明のT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、A146T、A146V若しくはK117Nの突然変異を有するペプチド、若しくはペプチドに特異的なT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする配列を含む本発明の核酸、A146T、A146V若しくはK117Nの突然変異を有するペプチド、若しくはペプチドに特異的なT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む本発明のベクター、又はA146T、A146V若しくはK117Nの突然変異を有するペプチド、若しくはペプチドに特異的なT細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含むベクターを含む本発明の宿主細胞が癌の予防及び/又は治療に使用される。T細胞受容体又はその抗原結合フラグメントはトランスジェニックT細胞、例えばキメラ抗原受容体T細胞(CART)の操作に有用である。かかるCARTは、例えば静注による個別癌療法に使用することができる。かかる実施形態では、癌が大腸癌、肺癌及び膵臓癌の1つ以上であるのが好ましい。幾つかの実施形態では、癌は大腸癌である。特に、本発明のペプチド及びペプチド混合物から選択する場合に、RASタンパク質の突然変異と関連する癌の99%を治療し得ることがわかった。
より具体的には、A146Tの突然変異を有するペプチドと、G13Rの突然変異を有するペプチドと、G13Vの突然変異を有するペプチドと、Q61Rの突然変異を有するペプチドと、Q61Kの突然変異を有するペプチドと、Q61Hの突然変異を有するペプチドと、Q61Lの突然変異を有するペプチドとを含むペプチド混合物を、RASの突然変異と関連するかを問わず全ての大腸癌の10%の治療に使用し得ることがわかった。さらに、全ての大腸癌の少なくとも50%を上述のペプチド混合物のいずれか、又はG13Cの突然変異を有するペプチドと、G13Dの突然変異を有するペプチドと、G12Aの突然変異を有するペプチドと、G12Cの突然変異を有するペプチドと、G12Dの突然変異を有するペプチドと、G12Rの突然変異を有するペプチドと、G12Sの突然変異を有するペプチドと、G12Vの突然変異を有するペプチドとを含むペプチド混合物(例えば、TG02)により治療し得ることがわかった。したがって、本発明のペプチド及びペプチド混合物は、ますます多くの数の大腸癌患者のワクチン及び/又は治療をもたらす。
上に記載されるペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞混合物、T細胞製剤又は核酸を含む医薬組成物も提供される。かかる医薬組成物は少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び/又は賦形剤を含んでもよい。幾つかの実施形態では、医薬組成物は1つ以上の付加的な有効成分及び/又はアジュバントを更に含む。或る特定の実施形態では、医薬組成物は同じ疾患の兆候に対して治療的に有効な1つ以上の成分を更に含んでもよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物は1つ以上の更なる化学療法剤、1つ以上の抗体、1つ以上の小分子及び/又は1つ以上の免疫刺激剤(例えば、サイトカイン)を更に含んでもよい。幾つかの実施形態では、ペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞製剤、T細胞混合物、核酸又は医薬組成物は他の形態の免疫療法と組み合わせて使用することができる。
或る特定のタイプの癌がRASタンパク質の或る特定の突然変異と関連することがわかっており、最近になって、図1に示されるようにA146T、A146V及びK117Nの突然変異が癌、特に大腸癌と関連することがわかってきた。したがって、或る特定のタイプの癌を標的とするようにペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞製剤、T細胞混合物、T細胞受容体又はその抗原結合フラグメント、核酸、ベクター及び宿主細胞を調整することが可能である。
本発明のペプチド、ペプチド混合物又は医薬組成物は、当業者に既知の任意の好適な送達技法によって被験体に投与されてもよい。例えば、他の技法のうち、ペプチド、ペプチド混合物又は医薬組成物は、溶液の形態、リポソームの形態又は乾燥形態(例えば、被覆粒子の形態等)で注射によって被験体に投与されてもよい。幾つかの実施形態では、ペプチド又はペプチド混合物は、GM−CSF等の免疫促進剤とともに投与される。GM−CSFを使用する実施形態では、GM−CSFはどのようなGM−CSFであってもよい。幾つかの実施形態では、ペプチド、ペプチド混合物又は医薬組成物は、例えば1μg〜1gの各ペプチドの量で3日に1回、週1回、月1回、3ヶ月に1回、4ヶ月に1回又は6ヶ月に1回投与することができる。
本発明のT細胞、T細胞混合物及びT細胞製剤は、静脈内注射及び/又は点滴によって投与することができ、例えばペプチド混合物のペプチド又はペプチドに特異的な各T細胞を106〜1012の量で月1回、2ヶ月に1回、3ヶ月に1回、6ヶ月に1回又は年1回投与することができる。投薬量を2ヶ月〜5ヶ月にわたって月1回投与し、続いてより少ない頻度で投与するのが好ましい。
本発明の核酸及び核酸の混合物は、筋肉内注射及び/又は皮下注射によって投与することができる。
被験体への本発明のペプチド又はペプチド混合物の投与は、ペプチド又はペプチド混合物に対する免疫応答、特にT細胞媒介免疫応答を惹起する。ペプチド又はペプチド混合物の各ペプチドは抗原提示細胞(APC)によってプロセシングされ、MHC分子上に提示される。T細胞はT細胞受容体がAPCによってMHC分子上に提示されるペプチドへ結合することによって活性化され、それにより投与されたペプチド(複数の場合もある)中に存在するものに対応する突然変異を有する腫瘍細胞に対する免疫応答が生じる。
対応するRAS突然変異と関連する癌を有する被験体への本発明のT細胞又はT細胞混合物の投与は、投与されたT細胞による腫瘍細胞に対する免疫応答を惹起する。特に、上述のように、T細胞が細胞内タンパク質に由来するペプチドを認識するため、投与されたT細胞は、MHC分子により腫瘍細胞の表面上に提示された場合に腫瘍細胞の突然変異RASタンパク質を認識することができる。
上述のように、異なるタイプの癌がRASタンパク質の異なる突然変異と関連するという知見は、ワクチン及び治療を特定の癌に標的化し得ることを意味する。したがって、本発明の別の態様では、癌の診断及び適切な治療の選択を含む方法に使用されるペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞混合物、T細胞製剤、核酸及び/又はベクターが提供される。該方法は、a)患者から採取された試料中に存在するRASタンパク質の点突然変異を同定する工程と、b)試料中で同定されたRASタンパク質の点突然変異の少なくとも1つに対応する点突然変異を含む、上に記載されるペプチド、ペプチドを含む上に記載されるペプチド混合物、上に記載されるT細胞、ペプチドに特異的なT細胞を含む上に記載されるT細胞混合物、ペプチドに特異的なT細胞を含む上に記載されるT細胞製剤、ペプチドをコードする配列を含む上に記載される核酸、及び/又はペプチドをコードする配列を含む核酸をコードする上に記載されるベクターを選択する工程とを含む。例えば、被験体から採取された試料がA146Tの突然変異を有するRASタンパク質を含有することがわかった場合、A146Tの突然変異を含むペプチド、ペプチドを含むペプチド混合物、T細胞、ペプチドに特異的なT細胞を含むT細胞混合物及び/又は製剤、ペプチドをコードする配列を含む核酸、及び/又はペプチドをコードする配列を含む核酸をコードするベクターを選択する。試料が、例えばA146Tの突然変異及びG13Cの突然変異を含むRASタンパク質を含有する状況では、A146Tの突然変異を含むペプチドとG13Cの突然変異を含むペプチドとを含むペプチド混合物、A146Tを含むペプチドに特異的なT細胞とG13Cの突然変異を含むペプチドに特異的なT細胞とを含むT細胞混合物、A146Tの突然変異を有するペプチドをコードする配列を含む核酸及びG13Cの突然変異を有するペプチドをコードする配列を含む核酸、及び/又はA146Tの突然変異を有するペプチドをコードする配列を含む核酸をコードするベクター及びG13Cの突然変異を有するペプチドをコードする配列を含む核酸をコードするベクターを選択する。上記方法は選択されたペプチド混合物、ペプチド、T細胞、T細胞混合物、T細胞製剤、核酸及び/又はベクターを含む医薬組成物を患者に投与する工程を含んでもよい。したがって、幾つかの実施形態では、上記方法は、本明細書においてTG02及びTG03と呼ばれる表6〜表23に記載のペプチド混合物の1つを投与する工程を含む。他の実施形態では、上記方法は、表6〜表23の1つのペプチド混合物TG02及びTG03に特異的なT細胞を含むT細胞混合物、表6〜表23の1つのペプチド混合物TG02及びTG03をコードする核酸、及び/又は表6〜表23の1つのペプチド混合物TG02及びTG03をコードする配列(単数又は複数)を含む核酸をコードするベクター(単数又は複数)を投与する工程を含む。特に好ましい実施形態では、ペプチド混合物はTG02、TG03、表14の混合物及び表15の混合物の1つである。
本発明の更なる態様では、本明細書に記載されるペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞混合物、T細胞製剤、核酸、核酸混合物、T細胞受容体、T細胞受容体混合物、ベクター、宿主細胞及び/又はmRNAを含むキットが提供される。ペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞混合物、T細胞製剤、核酸、核酸混合物、T細胞受容体、T細胞受容体混合物、ベクター、宿主細胞及び/又はmRNA自体がキット内に存在していてもよく、又はペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞混合物、T細胞製剤、核酸、核酸混合物、T細胞受容体、T細胞受容体混合物、ベクター、宿主細胞及び/又はmRNAが医薬配合物としてキット内に存在してもよい。幾つかの実施形態では、ペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞混合物、T細胞製剤、核酸、核酸混合物、T細胞受容体、T細胞受容体混合物、ベクター、宿主細胞及び/又はmRNAを例えばバイアル、ボトル、フラスコ内にパッケージ化し、これを例えば箱、封筒又は袋内に更にパッケージ化してもよい。幾つかの実施形態では、キットはペプチド混合物、T細胞混合物、核酸混合物及び/又はT細胞受容体混合物を含み、ペプチド、T細胞、核酸及び/又はT細胞受容体が別個の容器内で提供され、ペプチド、T細胞、核酸及び/又はT細胞受容体は使用者によって混合される。
実施例1
本実施例では、バフィーコートを4人の正常ヒトドナーから収集し(バフィー1、バフィー2、バフィー3及びバフィー4)、in vitroで培養した。in vitro PBMCを単独のRASペプチド又はRASペプチドの混合物で刺激し、T細胞増殖アッセイを行った。結果を図7〜図9に示す。
本実施例では、バフィーコートを4人の正常ヒトドナーから収集し(バフィー1、バフィー2、バフィー3及びバフィー4)、in vitroで培養した。in vitro PBMCを単独のRASペプチド又はRASペプチドの混合物で刺激し、T細胞増殖アッセイを行った。結果を図7〜図9に示す。
方法
機器/試薬
Hettich Rotina 420(半径210)又は同等品
KOJAIR Silverline Blue Seriesラミナーフローフード又は同等品
CO2インキュベーター、Forma Scientific Model 3111又は同等品
水浴37℃
KOVA Glassticスライド(カタログ番号87144E、Hycor Biomedical Inc,Garden Grove,USA)
TopCount、マイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard Instrument Company,Meriden,USA)
Cell Harvester Filtermate 196ハーベスター(Packard Instrument Company,Meriden,USA)
Unifilter GF/C(カタログ番号6−005174、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
Microscint−0シンチレーション液(カタログ番号6013611、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
Topseal−A(カタログ番号6005185、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
3H−チミジン(カタログ番号ART178−D、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
CellGro DC培地(カタログ番号0020801−0500、CellGenix GmbH,Freiburg,Germany)又は同等品
RPMI−1640(カタログ番号E15−840、PAA Labs,Linz,Austria)又は同等品
ジメチルスルホキシド(DMSO)(カタログ番号D5879−500ML、Sigma-Aldrich Norway AS,Oslo,Norway)又は同等品
Mucomyst(カタログ番号019249、Meda AS,Asker,Norway)又は同等品
組換えヒトインターロイキン−2(IL−2、Proleukin(商標))(Chiron Therapeutics,Emeryville,USA)又は同等品
4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)バッファー1M(カタログ番号S11−001、Fisher Scientific AS,Oslo,Norway)又は同等品
IL−7(カタログ番号207−IL−025、R & D Systems Europe Ltd,Abingdon,UK)又は同等品
ゲンタマイシン40mg/ml(カタログ番号Sanofi Aventis Norge AS,Lysaker,Norway)又は同等品
ヒト血清アルブミン20%(カタログ番号SW2G0013、Baxter AS,Oslo,Norway)又は同等品
24ウェル組織培養プレート(カタログ番号734−1605、VWR International AS,Oslo,Norway)又は同等品
96ウェル丸底マイクロプレート(カタログ番号734−1797、VWR International AS,Oslo,Norway)又は同等品
ブドウ球菌エンテロトキシンC型(SEC−3)(カタログ番号CT333、Toxin Technology Inc,Sarasota,USA)。
機器/試薬
Hettich Rotina 420(半径210)又は同等品
KOJAIR Silverline Blue Seriesラミナーフローフード又は同等品
CO2インキュベーター、Forma Scientific Model 3111又は同等品
水浴37℃
KOVA Glassticスライド(カタログ番号87144E、Hycor Biomedical Inc,Garden Grove,USA)
TopCount、マイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard Instrument Company,Meriden,USA)
Cell Harvester Filtermate 196ハーベスター(Packard Instrument Company,Meriden,USA)
Unifilter GF/C(カタログ番号6−005174、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
Microscint−0シンチレーション液(カタログ番号6013611、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
Topseal−A(カタログ番号6005185、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
3H−チミジン(カタログ番号ART178−D、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
CellGro DC培地(カタログ番号0020801−0500、CellGenix GmbH,Freiburg,Germany)又は同等品
RPMI−1640(カタログ番号E15−840、PAA Labs,Linz,Austria)又は同等品
ジメチルスルホキシド(DMSO)(カタログ番号D5879−500ML、Sigma-Aldrich Norway AS,Oslo,Norway)又は同等品
Mucomyst(カタログ番号019249、Meda AS,Asker,Norway)又は同等品
組換えヒトインターロイキン−2(IL−2、Proleukin(商標))(Chiron Therapeutics,Emeryville,USA)又は同等品
4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)バッファー1M(カタログ番号S11−001、Fisher Scientific AS,Oslo,Norway)又は同等品
IL−7(カタログ番号207−IL−025、R & D Systems Europe Ltd,Abingdon,UK)又は同等品
ゲンタマイシン40mg/ml(カタログ番号Sanofi Aventis Norge AS,Lysaker,Norway)又は同等品
ヒト血清アルブミン20%(カタログ番号SW2G0013、Baxter AS,Oslo,Norway)又は同等品
24ウェル組織培養プレート(カタログ番号734−1605、VWR International AS,Oslo,Norway)又は同等品
96ウェル丸底マイクロプレート(カタログ番号734−1797、VWR International AS,Oslo,Norway)又は同等品
ブドウ球菌エンテロトキシンC型(SEC−3)(カタログ番号CT333、Toxin Technology Inc,Sarasota,USA)。
培養に使用する完全CellGro DC培地:
以下のものを最終濃度で500mlのCellGro DC培地に添加した:
ゲンタマイシン50μg/ml(630μLの40mg/mlストックを500mLの培地に添加する)
Mucomyst 1.6mg/ml(4mLの200mg/mlストックを500mLの培地に添加する)
HEPESバッファー0.01M(5mlの1Mストックを500mLの培地に添加する)
以下のものを最終濃度で500mlのCellGro DC培地に添加した:
ゲンタマイシン50μg/ml(630μLの40mg/mlストックを500mLの培地に添加する)
Mucomyst 1.6mg/ml(4mLの200mg/mlストックを500mLの培地に添加する)
HEPESバッファー0.01M(5mlの1Mストックを500mLの培地に添加する)
手順
a. 凍結PBMCの融解
手順は項目5まで室温で行わなければならない。開放での細胞の取扱いは全て垂直ラミナーフローフード内で行う。
1. 迅速にバフィーコート(バフィー1、バフィー2、バフィー3及びバフィー4)に由来する凍結PBMCの入った各バイアルを、37℃の水浴内に移す。
2. バイアルを手作業により一定間隔(およそ2分〜3分)で振盪し、幾らかの氷が残っているうちに水浴から取り出す。
3. 全ての氷が融解した時点で、1mlのCellGro DC培地の液滴を細胞懸濁液に移す。
4. 細胞懸濁液を、20mlのCellGro DC培地を含有する50ml容チューブに移す。
5. 細胞を500G、室温で5分間遠心分離する。
6. 細胞を5mlのCellGro DC培地に再懸濁する。
7. ビルケルチャンバ又はKOVA Galssticスライドを用いて生存細胞数を計数し、細胞濃度を完全CellGro DC培地(配合表を参照されたい)中で2×106細胞/mlに調整する。総細胞数:バフィー1 − 45×106、バフィー2 − 27.5×106、バフィー3 − 40.5×106及びバフィー4 − 40.5×106細胞。
a. 凍結PBMCの融解
手順は項目5まで室温で行わなければならない。開放での細胞の取扱いは全て垂直ラミナーフローフード内で行う。
1. 迅速にバフィーコート(バフィー1、バフィー2、バフィー3及びバフィー4)に由来する凍結PBMCの入った各バイアルを、37℃の水浴内に移す。
2. バイアルを手作業により一定間隔(およそ2分〜3分)で振盪し、幾らかの氷が残っているうちに水浴から取り出す。
3. 全ての氷が融解した時点で、1mlのCellGro DC培地の液滴を細胞懸濁液に移す。
4. 細胞懸濁液を、20mlのCellGro DC培地を含有する50ml容チューブに移す。
5. 細胞を500G、室温で5分間遠心分離する。
6. 細胞を5mlのCellGro DC培地に再懸濁する。
7. ビルケルチャンバ又はKOVA Galssticスライドを用いて生存細胞数を計数し、細胞濃度を完全CellGro DC培地(配合表を参照されたい)中で2×106細胞/mlに調整する。総細胞数:バフィー1 − 45×106、バフィー2 − 27.5×106、バフィー3 − 40.5×106及びバフィー4 − 40.5×106細胞。
b. RASペプチド応答性T細胞の数を増大するためのバルク培養
1. 1mlの融解PBMC(DC培地中2×106細胞/ml)を24ウェルプレートの各ウェルに移す。
1. 1mlの融解PBMC(DC培地中2×106細胞/ml)を24ウェルプレートの各ウェルに移す。
2. 各20μlの13C及び13Rペプチド又は20μlの13R及び60μlのTG02−ミックスを、ウェルに各ペプチド10μMの最終濃度で添加する。
3. 細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で3日間培養する。
4. 3日目:最終濃度20iU/mlの組換えヒトインターロイキン−2(rIL−2)(すなわち、1000iU/mlのストック溶液から50μl)及び最終濃度5ng/mlの組換えヒトIL−7(すなわち、500μg/mlのストック溶液から10μl)を細胞培養物に添加し、インキュベーションを37℃/5%CO2で継続する。この工程は細胞が良好に成長する場合には任意である。
5. 4日目〜6日目:細胞を顕微鏡下で定期的に検査し、必要な場合には分割する(500μlを各ウェルから取り出し、40iU/ml IL−2及びIL−7が添加された、500μlの新鮮CellGro DC培地に置き換えた)。
6. 7日目〜14日目:細胞を毎日検査し、成長の遅い細胞を含むウェルを混合する。
3. 細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で3日間培養する。
4. 3日目:最終濃度20iU/mlの組換えヒトインターロイキン−2(rIL−2)(すなわち、1000iU/mlのストック溶液から50μl)及び最終濃度5ng/mlの組換えヒトIL−7(すなわち、500μg/mlのストック溶液から10μl)を細胞培養物に添加し、インキュベーションを37℃/5%CO2で継続する。この工程は細胞が良好に成長する場合には任意である。
5. 4日目〜6日目:細胞を顕微鏡下で定期的に検査し、必要な場合には分割する(500μlを各ウェルから取り出し、40iU/ml IL−2及びIL−7が添加された、500μlの新鮮CellGro DC培地に置き換えた)。
6. 7日目〜14日目:細胞を毎日検査し、成長の遅い細胞を含むウェルを混合する。
c. i)3日間のT細胞増殖アッセイ
1. 工程bのバルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数する。
1. 工程bのバルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数する。
2. 1ウェル当たり5×104個のT細胞をバルク培養物から丸底96ウェルプレートに移す。
3. 1バイアルのCellGro DC培地中の自己PBMC試料を融解する。PBMCに照射し(30Gy)、計数し、5×104個の細胞を各ウェルに添加し、DC培地で総容量を200μl/ウェルに調整する。
4. 以下の試料をプレートレイアウトに従って三連で調製する:
陰性対照:
T細胞のみ
各時点のT細胞+照射PBMC
陽性対照:
各時点のT細胞+照射PBMC+1μg/ml SEC−3。
試験試料:
各時点のT細胞+照射PBMC(10μMの各ペプチド):
I)13C+13Rで刺激したバルク培養物については:13C+13Rミックス又は単独のG13Cペプチド
II)TG02+13Rで刺激したバルク培養物については:TG02+13R、13C+13Rミックス又は単独のG13Cペプチド
細胞を37℃/5%CO2で48時間インキュベートする。
5. 20μLの3H−チミジン(3.7×104Bq)を添加する。
6. 37℃/5%CO2で17時間インキュベートする。
7. Filtermate 196ハーベスターを用いて細胞をUnifilterに摘出し、フィルターを45℃で完全に乾燥するまで乾燥させる(通常は、これは1.5時間後に達成されるが、この後に45℃で放置する時間数は重要でないため、プレートを60時間後に計数してもよい)。
8. Unifilterの底面を接着カバー(Unifilterとともに供給される)で覆い、25μlのマイクロシンチレーション液を各ウェルに添加する。プレートをTopSealで覆い、フィルターをTopCount Packardマイクロプレートシンチレーションベータカウンターに入れる。アッセイウィザードプログラムを入力する。プロトコル/プログラム3Hチミジンを三連で選択する。レポート定義及びASCIIファイルアウトプットを入力する。ディレクトリ下で、データフォルダを選択する(各使用者が別個のフォルダを有するものとする)。保存する実験ファイル名を選ぶ。スタッカをオン又はオフにする(2つ以上のプレートの場合にスタッカを使用する)。アッセイプログラムを開始する。
3. 1バイアルのCellGro DC培地中の自己PBMC試料を融解する。PBMCに照射し(30Gy)、計数し、5×104個の細胞を各ウェルに添加し、DC培地で総容量を200μl/ウェルに調整する。
4. 以下の試料をプレートレイアウトに従って三連で調製する:
陰性対照:
T細胞のみ
各時点のT細胞+照射PBMC
陽性対照:
各時点のT細胞+照射PBMC+1μg/ml SEC−3。
試験試料:
各時点のT細胞+照射PBMC(10μMの各ペプチド):
I)13C+13Rで刺激したバルク培養物については:13C+13Rミックス又は単独のG13Cペプチド
II)TG02+13Rで刺激したバルク培養物については:TG02+13R、13C+13Rミックス又は単独のG13Cペプチド
細胞を37℃/5%CO2で48時間インキュベートする。
5. 20μLの3H−チミジン(3.7×104Bq)を添加する。
6. 37℃/5%CO2で17時間インキュベートする。
7. Filtermate 196ハーベスターを用いて細胞をUnifilterに摘出し、フィルターを45℃で完全に乾燥するまで乾燥させる(通常は、これは1.5時間後に達成されるが、この後に45℃で放置する時間数は重要でないため、プレートを60時間後に計数してもよい)。
8. Unifilterの底面を接着カバー(Unifilterとともに供給される)で覆い、25μlのマイクロシンチレーション液を各ウェルに添加する。プレートをTopSealで覆い、フィルターをTopCount Packardマイクロプレートシンチレーションベータカウンターに入れる。アッセイウィザードプログラムを入力する。プロトコル/プログラム3Hチミジンを三連で選択する。レポート定義及びASCIIファイルアウトプットを入力する。ディレクトリ下で、データフォルダを選択する(各使用者が別個のフォルダを有するものとする)。保存する実験ファイル名を選ぶ。スタッカをオン又はオフにする(2つ以上のプレートの場合にスタッカを使用する)。アッセイプログラムを開始する。
ii)2回目のバルク培養物の刺激
残りの細胞(1×106〜2×106個のT細胞/ウェル)を、自己PBMC(100万個/ウェル)及びペプチドミックス(工程b.に記載される)でもう一度再刺激した。
残りの細胞(1×106〜2×106個のT細胞/ウェル)を、自己PBMC(100万個/ウェル)及びペプチドミックス(工程b.に記載される)でもう一度再刺激した。
1. 細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で3日間培養する(工程b.に記載される)。
2. 17日目:最終濃度40iU/mlの組換えヒトインターロイキン−2及び最終濃度5ng/mlの組換えヒトIL−7を細胞培養物に添加し、インキュベーションを37℃/5%CO2で継続する。細胞を定期的に顕微鏡下で検査し、必要な場合には分割する。
3. 19日目〜21日目:500μlを各ウェルから取り出し、40iU/ml IL−2及びIL−7が添加された、500μlの新鮮CellGro DC培地に置き換えた。
4. 22日目〜27日目:細胞を定期的に毎日検査し、成長の遅いT細胞を含むウェルを混合した(工程b.と同様)。
2. 17日目:最終濃度40iU/mlの組換えヒトインターロイキン−2及び最終濃度5ng/mlの組換えヒトIL−7を細胞培養物に添加し、インキュベーションを37℃/5%CO2で継続する。細胞を定期的に顕微鏡下で検査し、必要な場合には分割する。
3. 19日目〜21日目:500μlを各ウェルから取り出し、40iU/ml IL−2及びIL−7が添加された、500μlの新鮮CellGro DC培地に置き換えた。
4. 22日目〜27日目:細胞を定期的に毎日検査し、成長の遅いT細胞を含むウェルを混合した(工程b.と同様)。
d. i)3日間のT細胞増殖アッセイ
1. バルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数する。
1. バルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数する。
2. 1ウェル当たり5×104個のT細胞をバルク培養物から丸底96ウェルプレートに移す。
3. 1バイアルのCellGro DC培地中の自己PBMC試料を融解する。PBMCに照射し(30Gy)、計数し、5×104個の細胞を各ウェルに添加し、DC培地で総容量を200μl/ウェルに調整する(工程c.i)に記載される)。
3. 1バイアルのCellGro DC培地中の自己PBMC試料を融解する。PBMCに照射し(30Gy)、計数し、5×104個の細胞を各ウェルに添加し、DC培地で総容量を200μl/ウェルに調整する(工程c.i)に記載される)。
ii)27日目〜42日目:3回目のバルク培養物の刺激
残りの細胞(100万個〜200万個のT細胞/ウェル)を、自己PBM(100万個/ウェル)及びペプチドミックス(工程b.に記載される)でもう一度再刺激した。
残りの細胞(100万個〜200万個のT細胞/ウェル)を、自己PBM(100万個/ウェル)及びペプチドミックス(工程b.に記載される)でもう一度再刺激した。
e)3日間のT細胞増殖アッセイ
1. バルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数する。
1. バルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数する。
2. 1ウェル当たり5×104個のT細胞をバルク培養物から丸底96ウェルプレートに移す。
3. 1バイアルのCellGro DC培地中の自己PBMC試料を融解する。PBMCに照射し(30Gy)、計数し、5×104個の細胞を各ウェルに添加し、DC培地で総容量を200μl/ウェルに調整する(工程c.i)に記載される)。
3. 1バイアルのCellGro DC培地中の自己PBMC試料を融解する。PBMCに照射し(30Gy)、計数し、5×104個の細胞を各ウェルに添加し、DC培地で総容量を200μl/ウェルに調整する(工程c.i)に記載される)。
結果
バルク培養物の3回の刺激後のペプチド混合物を用いたT細胞増殖アッセイの結果を、それぞれ表30〜表32及び図7〜図9に示す。表30〜表32に、各反復試験物についてのカウント毎分(CPM)及び各ドナーについての平均CPMを示す。
バルク培養物の3回の刺激後のペプチド混合物を用いたT細胞増殖アッセイの結果を、それぞれ表30〜表32及び図7〜図9に示す。表30〜表32に、各反復試験物についてのカウント毎分(CPM)及び各ドナーについての平均CPMを示す。
陽性対照の結果を確認したが、倍率の理由から図7〜図9には含めていない。明らかなように、ペプチド混合物及び単独のペプチドの両方がT細胞増殖を誘導し、ペプチド及びペプチド混合物がヒトにおいて免疫応答を誘導可能であることが示された。
実施例2
本実施例では、免疫応答を分析するために、マウスに繰り返しTG02を皮下ワクチン接種した。ワクチン接種後に脾細胞を摘出し、脾細胞の増殖性応答を測定した。結果を図10に示す。
本実施例では、免疫応答を分析するために、マウスに繰り返しTG02を皮下ワクチン接種した。ワクチン接種後に脾細胞を摘出し、脾細胞の増殖性応答を測定した。結果を図10に示す。
方法
試験品の特性
名称:TG02
製品:TG02は等量(重量)の8つの異なるペプチド(12A、12C、12D、12R、12S、12V、13C、13D)からなる
バッチ番号:12A:ロット番号1034804;12C:ロット番号1034803;
12D:ロット番号1034801;12R:ロット番号1034802;
12S:ロット番号1034805;12V:ロット番号1034800;
13C:ロット番号1050468;13D:ロット番号1034806
治療指標:癌
物理的状態:粉末
色:白色
純度:バイアル1本当たり正味80mgのペプチド(正味10mgの各ペプチド)
保存条件:−15℃〜−20℃及び遮光
使用期限:2014年12月31日
安全措置:日常的な衛生手順が関係者の健康及び安全性を確保するのに十分であった。
試験品の特性
名称:TG02
製品:TG02は等量(重量)の8つの異なるペプチド(12A、12C、12D、12R、12S、12V、13C、13D)からなる
バッチ番号:12A:ロット番号1034804;12C:ロット番号1034803;
12D:ロット番号1034801;12R:ロット番号1034802;
12S:ロット番号1034805;12V:ロット番号1034800;
13C:ロット番号1050468;13D:ロット番号1034806
治療指標:癌
物理的状態:粉末
色:白色
純度:バイアル1本当たり正味80mgのペプチド(正味10mgの各ペプチド)
保存条件:−15℃〜−20℃及び遮光
使用期限:2014年12月31日
安全措置:日常的な衛生手順が関係者の健康及び安全性を確保するのに十分であった。
ビヒクル1の特性
名称:ViscoGel
バッチ番号:VG14056
治療指標:癌
物理的状態:ゲル粒子
色:無色
含水量:99%
保存条件:2℃〜8℃
使用期限:2015年6月1日
安全措置:日常的な衛生手順が関係者の健康及び安全性を確保するのに十分である。
名称:ViscoGel
バッチ番号:VG14056
治療指標:癌
物理的状態:ゲル粒子
色:無色
含水量:99%
保存条件:2℃〜8℃
使用期限:2015年6月1日
安全措置:日常的な衛生手順が関係者の健康及び安全性を確保するのに十分である。
ビヒクル2の特性
本研究に使用するビヒクル2は注射用水である。供給業者により提供される仕様を以下に挙げる:
名称:注射用水
物理的状態:液体
保存条件:室温
安全措置:日常的な衛生手順が関係者の健康及び安全性を確保するのに十分であった。
本研究に使用するビヒクル2は注射用水である。供給業者により提供される仕様を以下に挙げる:
名称:注射用水
物理的状態:液体
保存条件:室温
安全措置:日常的な衛生手順が関係者の健康及び安全性を確保するのに十分であった。
試験品の調製
5mlの注射用水を1本のバイアルTG02(80mg)に添加し、静かに回し(発泡を回避する)、1mL当たり16mgのTG02の均質なストック溶液を得た。
5mlの注射用水を1本のバイアルTG02(80mg)に添加し、静かに回し(発泡を回避する)、1mL当たり16mgのTG02の均質なストック溶液を得た。
群1(表28を参照されたい)の動物については、1mLのTG02ストック溶液をシリンジで抜き取り、1mLの注射用水と混合して8mg/mLの最終濃度を得た。
群2及び群3の動物については(表28を参照されたい)、1mlのTG02ストック溶液をシリンジで抜き取り、1mLのViscoGel(商標)と混合して8mg/mLの最終濃度を得た。
試験品配合物は、2℃〜8℃で6時間にわたって安定しているとみなした。
試験システム
種/株:健常BALB/cマウス(完全隔離)BALB/cAnNCrl
供給元:Charles River,97633 Sulzfeld,Germany
性別:雌
処理期間開始時の年齢:およそ6週齢〜8週齢
動物数:30(1群当たり10匹の動物)
種/株:健常BALB/cマウス(完全隔離)BALB/cAnNCrl
供給元:Charles River,97633 Sulzfeld,Germany
性別:雌
処理期間開始時の年齢:およそ6週齢〜8週齢
動物数:30(1群当たり10匹の動物)
動物は、制御された完全隔離維持繁殖システム(SPF)に由来するものであった。ドイツ動物福祉法第9条第2項第7文に従い、動物を実験目的で繁殖させた。
飼育及び給餌の条件
空調室での完全隔離。
温度:22±3℃。
相対湿度:55±10%。
人工光、12時間明期、12時間暗期の連続。
換気:10回/時間。
ラット及びマウスのためのAltromin 1324維持食の自由摂取。
およそ2.8のpHまで硫黄酸性化した水道水(飲用水、都市用水残留物制御(municipal residue control)、定期的な微生物制御)の自由摂取。
動物は、1ケージ当たり5匹の動物の群でIVCケージ、タイプII L、ポリスルホンケージ内、Altrominおがくず(saw fibre)敷料において維持する。
飼料、水及び敷料の証明書はBSL BIOSERVICEで提出された。
実験室条件下で適切な順化期間(少なくとも5日間)。
空調室での完全隔離。
温度:22±3℃。
相対湿度:55±10%。
人工光、12時間明期、12時間暗期の連続。
換気:10回/時間。
ラット及びマウスのためのAltromin 1324維持食の自由摂取。
およそ2.8のpHまで硫黄酸性化した水道水(飲用水、都市用水残留物制御(municipal residue control)、定期的な微生物制御)の自由摂取。
動物は、1ケージ当たり5匹の動物の群でIVCケージ、タイプII L、ポリスルホンケージ内、Altrominおがくず(saw fibre)敷料において維持する。
飼料、水及び敷料の証明書はBSL BIOSERVICEで提出された。
実験室条件下で適切な順化期間(少なくとも5日間)。
動物の割当て及び識別
投与前に病理学的兆候を示す動物は研究から除外した。代わりに追加の同腹動物を準備した。個々の識別のために各動物に耳標により印を付けた。
投与前に病理学的兆候を示す動物は研究から除外した。代わりに追加の同腹動物を準備した。個々の識別のために各動物に耳標により印を付けた。
実験手順
研究を、各々が10匹の雌性BALB/cマウスを含む3つの群で行った。研究の開始を2つの別々の日に行い、1群当たり5匹の動物を処理した。したがって、群をI部及びII部に分けた。動物を種々の時点で皮下処理した(表30)。
研究を、各々が10匹の雌性BALB/cマウスを含む3つの群で行った。研究の開始を2つの別々の日に行い、1群当たり5匹の動物を処理した。したがって、群をI部及びII部に分けた。動物を種々の時点で皮下処理した(表30)。
投与期間にわたって、動物を毒性の兆候について毎日精密に観察した。最終投与の48時間後に動物を安楽死させ、肉眼で検査し、脾臓を更なる分析のために準備した。
投薬量
全ての群に試験品を首筋と肩との間への皮下注射により反復時点(表33)で投与した。全ての群に対する適用容量は0.1mL(0.80mgのTG02)とした。
全ての群に試験品を首筋と肩との間への皮下注射により反復時点(表33)で投与した。全ての群に対する適用容量は0.1mL(0.80mgのTG02)とした。
臨床観察
全ての動物を、24日間の処理期間全体にわたって臨床兆候について観察した。
全ての動物を、24日間の処理期間全体にわたって臨床兆候について観察した。
全体的な臨床観察を少なくとも1日1回、好ましくは投薬後の予想される効果のピーク期間を考慮して毎日同じ時点で行った。動物の健康状態を記録した。
各々の動物について、皮膚及び被毛、眼、並びに粘膜の変化を含む全体的な臨床観察を、好ましくは投薬後の予想される効果のピーク期間を考慮して毎日同じ時点で行った。呼吸器系、循環系、自律神経系及び中枢神経系、並びに身体運動(somatomotor)活動及び行動パターンも検査した。アナフィラキシー様反応、麻痺、振戦、痙攣、流涎、下痢、嗜眠、睡眠及び昏睡の兆候の観察に特に配慮した。さらに、注射部位に配慮した。
病理−全身解剖
最終投与(研究24日目)の48時間後に動物を頸椎脱臼により屠殺し、身体の外表面、全ての開口部、並びに頭蓋腔、胸腔及び腹腔、並びにそれらの内容物の慎重な検査を含む詳細な全身解剖に供した。
最終投与(研究24日目)の48時間後に動物を頸椎脱臼により屠殺し、身体の外表面、全ての開口部、並びに頭蓋腔、胸腔及び腹腔、並びにそれらの内容物の慎重な検査を含む詳細な全身解剖に供した。
脾臓細胞の細胞培養及び刺激
全動物の脾臓を取り出し、細胞培養培地(10%FCS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L−グルタミン及び50μM β−メルカプトエタノールを添加したRPMI 1640培地)に移し、氷上で保管した。全工程を無菌で行い、細胞を氷上に維持した。
全動物の脾臓を取り出し、細胞培養培地(10%FCS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、2mM L−グルタミン及び50μM β−メルカプトエタノールを添加したRPMI 1640培地)に移し、氷上で保管した。全工程を無菌で行い、細胞を氷上に維持した。
セルストレーナーを用いて脾臓細胞から単一細胞懸濁液を生成した。遠心分離(350g、5分間、5±3℃)後に、上清を除去し、細胞ペレットをACKバッファーに再懸濁し、室温で5分間インキュベートした。10mLの細胞培養培地を添加した。試料を5分間ベンチトップ上に置き、細胞残屑を沈殿させた。細胞残屑上の懸濁液を別のチューブに移し、遠心分離した(350g、5分間、5±3℃)。上清を除去し、細胞ペレットを10mLの細胞培養培地に再懸濁した。細胞を計数した後、0.2Mio細胞を96ウェルプレートに播種した(1ウェル当たり180μL;1.1×106細胞/mL)。各脾臓について9つの反復試験物を各プレート上にプレーティングした。
(1)24時間後のサイトカイン測定について上清を摘出するための1つのプレート(結果は示さない)
(2)48時間後のサイトカイン測定について上清を摘出するための1つのプレート(結果は示さない)
(3)増殖アッセイのための1つのプレート
(1)24時間後のサイトカイン測定について上清を摘出するための1つのプレート(結果は示さない)
(2)48時間後のサイトカイン測定について上清を摘出するための1つのプレート(結果は示さない)
(3)増殖アッセイのための1つのプレート
以下の刺激を行った:
3つの反復試験物:刺激せず(20μLの細胞培養培地の添加)
3つの反復試験物:10μM TG02による刺激(8つのペプチド、1ペプチド当たり10μM最終濃度、20μLの細胞培養培地中での添加)
3つの反復試験物:1μg/200μL ConA(コンカナバリンA)による刺激(20μLの細胞培養培地中1μgのConAの添加)
24時間(1)、48時間(2)又は5日間(3)にわたる37℃及び5%CO2でのインキュベーション。
3つの反復試験物:刺激せず(20μLの細胞培養培地の添加)
3つの反復試験物:10μM TG02による刺激(8つのペプチド、1ペプチド当たり10μM最終濃度、20μLの細胞培養培地中での添加)
3つの反復試験物:1μg/200μL ConA(コンカナバリンA)による刺激(20μLの細胞培養培地中1μgのConAの添加)
24時間(1)、48時間(2)又は5日間(3)にわたる37℃及び5%CO2でのインキュベーション。
残りの細胞を遠心分離し(350g、5分間、5±3℃)、1.5mL容のチューブに移し、再度遠心分離し(350g、5分間、5±3℃)、上清を完全に除去し、細胞ペレットを−70℃以下で凍結した。
(1)24時間後に、対応するプレートを遠心分離し(350g、室温)、150μLの上清を摘出し、−70℃以下で凍結した。
(2)48時間後に、対応するプレートを遠心分離し(350g、室温)、150μLの上清を摘出し、−70℃以下で凍結した。
(1)24時間後に、対応するプレートを遠心分離し(350g、室温)、150μLの上清を摘出し、−70℃以下で凍結した。
(2)48時間後に、対応するプレートを遠心分離し(350g、室温)、150μLの上清を摘出し、−70℃以下で凍結した。
増殖アッセイ
(3)5日後に、1μCi/ウェルの3H−チミジンを試料に添加し、これを続いて37℃及び5%CO2で18時間インキュベートした。次いで、プレートを−20℃以下で凍結した。
(3)5日後に、1μCi/ウェルの3H−チミジンを試料に添加し、これを続いて37℃及び5%CO2で18時間インキュベートした。次いで、プレートを−20℃以下で凍結した。
プレートを室温で融解させた。ハーベスターを洗い流した後、ハーベスターを用いて試料をフィルタープレートに移し、続いて水を用いて5回の洗浄工程を行った。フィルタープレートを室温で一晩乾燥させた。ホイルをフィルタープレートの底面に貼り付け、20μLのシンチレーション液をウェルに添加した。室温で1時間のインキュベーション後に、TopCount NXTを用いて試料を測定し、刺激指数(SI)を算出した。SI=刺激した試料のCPM/対照試料のCPM。
結果
表34及び図10に脾細胞増殖アッセイの結果を示す。表34に、各反復試験物のCPM及び各マウスについての平均CPMを示す。明らかなように、TG02で刺激した脾細胞は刺激していない脾細胞と比較してCPMの増大を示し、TG02が免疫応答を誘導することが示された。
表34及び図10に脾細胞増殖アッセイの結果を示す。表34に、各反復試験物のCPM及び各マウスについての平均CPMを示す。明らかなように、TG02で刺激した脾細胞は刺激していない脾細胞と比較してCPMの増大を示し、TG02が免疫応答を誘導することが示された。
実施例3
本実施例では、RASにおけるエクソン2、3及び4突然変異を反映する選択ペプチドに対するT細胞応答を試験するために、バフィーコートを3人の正常ドナーから収集した(バフィー5、バフィー6及びバフィー7)。KRASペプチドワクチン接種(TG01)による臨床研究におけるT細胞応答のモニタリングのための標準操作手順(SOP)を、ペプチドカクテルTGX3及び個々のペプチドの試験に用いた。
本実施例では、RASにおけるエクソン2、3及び4突然変異を反映する選択ペプチドに対するT細胞応答を試験するために、バフィーコートを3人の正常ドナーから収集した(バフィー5、バフィー6及びバフィー7)。KRASペプチドワクチン接種(TG01)による臨床研究におけるT細胞応答のモニタリングのための標準操作手順(SOP)を、ペプチドカクテルTGX3及び個々のペプチドの試験に用いた。
方法
試験ペプチド
試験ペプチド
ペプチドカクテルTGX3は、等モル量のA146T+G13C+G13D+Q61Rの混合物であった。
機器/試薬
Hettich Rotina 420(半径210)又は同等品
KOJAIR Silverline Blue Seriesラミナーフローフード又は同等品
CO2インキュベーター、Forma Scientific Model 3111又は同等品
水浴37℃
KOVA Glassticスライド(カタログ番号87144E、Hycor Biomedical Inc,Garden Grove,USA)
TopCount、マイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard Instrument Company,Meriden,USA)
Cell Harvester Filtermate 196ハーベスター(Packard Instrument Company,Meriden,USA)
Unifilter GF/C(カタログ番号6−005174、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
Microscint−0シンチレーション液(カタログ番号6013611、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
Topseal−A(カタログ番号6005185、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
3H−チミジン(カタログ番号ART178−D、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
CellGro DC培地(カタログ番号0020801−0500、CellGenix GmbH,Freiburg,Germany)又は同等品
RPMI−1640(カタログ番号E15−840、PAA Labs,Linz,Austria)又は同等品
ジメチルスルホキシド(DMSO)(カタログ番号D5879−500ML、Sigma-Aldrich Norway AS,Oslo,Norway)又は同等品
Mucomyst(カタログ番号019249、Meda AS,Asker,Norway)又は同等品
組換えヒトインターロイキン−2(IL−2、Proleukin(商標))(Chiron Therapeutics,Emeryville,USA)又は同等品
4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)バッファー1M(カタログ番号S11−001、Fisher Scientific AS,Oslo,Norway)又は同等品
IL−7(カタログ番号207−IL−025、R & D Systems Europe Ltd,Abingdon,UK)又は同等品
ゲンタマイシン40mg/ml(カタログ番号Sanofi Aventis Norge AS,Lysaker,Norway)又は同等品
ヒト血清アルブミン20%(カタログ番号SW2G0013、Baxter AS,Oslo,Norway)又は同等品
24ウェル組織培養プレート(カタログ番号734−1605、VWR International AS,Oslo,Norway)又は同等品
96ウェル丸底マイクロプレート(カタログ番号734−1797、VWR International AS,Oslo,Norway)又は同等品
Hettich Rotina 420(半径210)又は同等品
KOJAIR Silverline Blue Seriesラミナーフローフード又は同等品
CO2インキュベーター、Forma Scientific Model 3111又は同等品
水浴37℃
KOVA Glassticスライド(カタログ番号87144E、Hycor Biomedical Inc,Garden Grove,USA)
TopCount、マイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard Instrument Company,Meriden,USA)
Cell Harvester Filtermate 196ハーベスター(Packard Instrument Company,Meriden,USA)
Unifilter GF/C(カタログ番号6−005174、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
Microscint−0シンチレーション液(カタログ番号6013611、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
Topseal−A(カタログ番号6005185、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
3H−チミジン(カタログ番号ART178−D、Nerliens Meszansky,Oslo,Norway)又は同等品
CellGro DC培地(カタログ番号0020801−0500、CellGenix GmbH,Freiburg,Germany)又は同等品
RPMI−1640(カタログ番号E15−840、PAA Labs,Linz,Austria)又は同等品
ジメチルスルホキシド(DMSO)(カタログ番号D5879−500ML、Sigma-Aldrich Norway AS,Oslo,Norway)又は同等品
Mucomyst(カタログ番号019249、Meda AS,Asker,Norway)又は同等品
組換えヒトインターロイキン−2(IL−2、Proleukin(商標))(Chiron Therapeutics,Emeryville,USA)又は同等品
4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)バッファー1M(カタログ番号S11−001、Fisher Scientific AS,Oslo,Norway)又は同等品
IL−7(カタログ番号207−IL−025、R & D Systems Europe Ltd,Abingdon,UK)又は同等品
ゲンタマイシン40mg/ml(カタログ番号Sanofi Aventis Norge AS,Lysaker,Norway)又は同等品
ヒト血清アルブミン20%(カタログ番号SW2G0013、Baxter AS,Oslo,Norway)又は同等品
24ウェル組織培養プレート(カタログ番号734−1605、VWR International AS,Oslo,Norway)又は同等品
96ウェル丸底マイクロプレート(カタログ番号734−1797、VWR International AS,Oslo,Norway)又は同等品
培養に使用する完全CellGro DC培地
これは、以下のものを最終濃度で500mlの培地に添加したCellGro DC培地である:
ゲンタマイシン50μg/ml(ストックは40mg/mlであり、630μLのストックを500mLの培地に添加する)
Mucomyst 1.6mg/ml(ストックは200mg/mlであり、4mLのストックを500mLの培地に添加する)
HEPESバッファー0.01M(ストックは1Mであり、5mlのストックを500mLの培地に添加する)
これは、以下のものを最終濃度で500mlの培地に添加したCellGro DC培地である:
ゲンタマイシン50μg/ml(ストックは40mg/mlであり、630μLのストックを500mLの培地に添加する)
Mucomyst 1.6mg/ml(ストックは200mg/mlであり、4mLのストックを500mLの培地に添加する)
HEPESバッファー0.01M(ストックは1Mであり、5mlのストックを500mLの培地に添加する)
実験手順
a)バフィーコートからのPBMCの単離
手順は室温で行った。開放での細胞の取扱いは全て垂直ラミナーフローフード内で行った。
1. 3つのバフィーコートをBlodbanken(Ulleval,OUS,Norway)から注文した。
2. PBMCを方法C001−003(血小板−低)に従って単離した。
3. KOVA Galssticスライドを用いて生存細胞数を計数し、細胞濃度を完全CellGro DC培地(配合表を参照されたい)中で4×106細胞/mlに調整した。総細胞数:バフィー5 − 585×106、バフィー6 − 360×106及びバフィー7 − 405×106細胞。
a)バフィーコートからのPBMCの単離
手順は室温で行った。開放での細胞の取扱いは全て垂直ラミナーフローフード内で行った。
1. 3つのバフィーコートをBlodbanken(Ulleval,OUS,Norway)から注文した。
2. PBMCを方法C001−003(血小板−低)に従って単離した。
3. KOVA Galssticスライドを用いて生存細胞数を計数し、細胞濃度を完全CellGro DC培地(配合表を参照されたい)中で4×106細胞/mlに調整した。総細胞数:バフィー5 − 585×106、バフィー6 − 360×106及びバフィー7 − 405×106細胞。
b)1回目の刺激−TGX3及びペプチド応答性T細胞の数を増大させるためのバルク培養
1. 1mlの異なるPBMC(DC培地中4×106細胞/ml)を24ウェルプレートの各ウェルに移した。
1. 1mlの異なるPBMC(DC培地中4×106細胞/ml)を24ウェルプレートの各ウェルに移した。
2. TGX3−ミックス/単独のペプチドを、各ウェルに各ペプチド10μMの最終濃度で添加した。
3. 細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で3日間培養した。
4. 3日目:最終濃度20iU/mlの組換えヒトインターロイキン−2(rIL−2、b#77)及び最終濃度5ng/mlの組換えヒトIL−7(b#25)を細胞培養物に添加し、インキュベーションを37℃/5%CO2で継続した。これは細胞が成長する速度に左右され、T細胞培養の経験を有する訓練を受けた者によって決定する必要があった(Section for Cell Therapyの訓練チェックリストに従う)。
5. 4日目〜12日目:細胞を顕微鏡下で定期的に検査し、必要な場合には分割し(500μlを各ウェルから取り出し、20iU/ml IL−2及び5ng/ml IL−7が添加された、500μlの新鮮CellGro DC培地に置き換えた)、成長の遅い細胞を含むウェルを混合した。
3. 細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で3日間培養した。
4. 3日目:最終濃度20iU/mlの組換えヒトインターロイキン−2(rIL−2、b#77)及び最終濃度5ng/mlの組換えヒトIL−7(b#25)を細胞培養物に添加し、インキュベーションを37℃/5%CO2で継続した。これは細胞が成長する速度に左右され、T細胞培養の経験を有する訓練を受けた者によって決定する必要があった(Section for Cell Therapyの訓練チェックリストに従う)。
5. 4日目〜12日目:細胞を顕微鏡下で定期的に検査し、必要な場合には分割し(500μlを各ウェルから取り出し、20iU/ml IL−2及び5ng/ml IL−7が添加された、500μlの新鮮CellGro DC培地に置き換えた)、成長の遅い細胞を含むウェルを混合した。
c)バルク培養物の2回目の刺激(14日目)
1. 14日目:6.2のバルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数した。
1. 14日目:6.2のバルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数した。
バルク培養細胞(約2×106個のT細胞/ウェル)を、自己照射(30Gy)APC(約2×106個のAPC/ウェル)でもう一度再刺激し、それらのそれぞれのペプチドを添加した(上記工程b)に記載される)。
2. 細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で3日間培養した。
3. 2回目の刺激の3日後(すなわち、手順の17日目):最終濃度20iU/mlの組換えヒトインターロイキン−2(rIL−2、b#77)及び最終濃度5ng/mlの組換えヒトIL−7(b#25)を細胞培養物に添加し、インキュベーションを37℃/5%CO2で継続した(上記工程b)に記載される)。
4. 18日目〜26日目:細胞を顕微鏡下で定期的に検査し、必要な場合には分割し(500μlを各ウェルから取り出し、20iU/ml IL−2及び5ng/ml IL−7が添加された、500μlの新鮮CellGro DC培地に置き換えた)、成長の遅い細胞を含むウェルを混合した(上記工程b)を参照されたい)。
2. 細胞を37℃/5%CO2の加湿インキュベーター内で3日間培養した。
3. 2回目の刺激の3日後(すなわち、手順の17日目):最終濃度20iU/mlの組換えヒトインターロイキン−2(rIL−2、b#77)及び最終濃度5ng/mlの組換えヒトIL−7(b#25)を細胞培養物に添加し、インキュベーションを37℃/5%CO2で継続した(上記工程b)に記載される)。
4. 18日目〜26日目:細胞を顕微鏡下で定期的に検査し、必要な場合には分割し(500μlを各ウェルから取り出し、20iU/ml IL−2及び5ng/ml IL−7が添加された、500μlの新鮮CellGro DC培地に置き換えた)、成長の遅い細胞を含むウェルを混合した(上記工程b)を参照されたい)。
d)3回目の刺激(19日目)及び3日間のT細胞増殖アッセイの特異性についての試験−バルク培養
1. 19日目:6.3のバルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数した。
1. 19日目:6.3のバルク培養物中のT細胞を摘出、洗浄及び計数した。
2. 1ウェル当たり5×104個のT細胞をバルク培養物から平底96ウェルプレートのウェルに移した。
3. 1又は2バイアルのCellGro DC培地中の自己PBMC試料を融解した。PBMCに照射し(30Gy)、計数し、5×104個の細胞を各ウェルに添加し、それらのそれぞれのペプチドにより刺激した。
4. 5×104個のT細胞をそれらのそれぞれのウェルに添加した(表39を参照されたい)。
3. 1又は2バイアルのCellGro DC培地中の自己PBMC試料を融解した。PBMCに照射し(30Gy)、計数し、5×104個の細胞を各ウェルに添加し、それらのそれぞれのペプチドにより刺激した。
4. 5×104個のT細胞をそれらのそれぞれのウェルに添加した(表39を参照されたい)。
5. 3回目の刺激:残りの細胞を、照射自己APC(200万個/ウェル)でもう一度再刺激し(約2×106個のT細胞/ウェル)、それらのそれぞれのペプチドを添加した(6.2に記載される)。
6. 21日目:20μLの3H−チミジン(3.7×104Bq)を添加した。
7. 37℃/5%CO2で17時間インキュベートした。
8. 22日目:Filtermate 196ハーベスターを用いて細胞をUniflterに摘出し、フィルターを45℃で完全に乾燥するまで乾燥させた(通常は、これは1.5時間後に達成されるが、この後に45℃で放置する時間数は重要でないため、プレートを60時間後に計数してもよい)。
9. Unifilterの底面を接着カバー(Unifilterとともに供給される)で覆い、25μlのマイクロシンチレーション液を各ウェルに添加した。プレートをTopSealで覆い、フィルターをTopCount Packardマイクロプレートシンチレーションベータカウンターに入れた。アッセイウィザードプログラムを入力した。プロトコル/プログラム3Hチミジンを三連で選択した。レポート定義及びASCIIファイルアウトプットを入力した。
6. 21日目:20μLの3H−チミジン(3.7×104Bq)を添加した。
7. 37℃/5%CO2で17時間インキュベートした。
8. 22日目:Filtermate 196ハーベスターを用いて細胞をUniflterに摘出し、フィルターを45℃で完全に乾燥するまで乾燥させた(通常は、これは1.5時間後に達成されるが、この後に45℃で放置する時間数は重要でないため、プレートを60時間後に計数してもよい)。
9. Unifilterの底面を接着カバー(Unifilterとともに供給される)で覆い、25μlのマイクロシンチレーション液を各ウェルに添加した。プレートをTopSealで覆い、フィルターをTopCount Packardマイクロプレートシンチレーションベータカウンターに入れた。アッセイウィザードプログラムを入力した。プロトコル/プログラム3Hチミジンを三連で選択した。レポート定義及びASCIIファイルアウトプットを入力した。
結果
ペプチド混合物を用いたT細胞増殖アッセイの結果を図11及び図12に示す。特に、RASタンパク質の146位に突然変異を有するペプチドが免疫原性であり、T細胞の誘導を刺激することが図11に示される。ペプチド混合物TGX3がペプチド混合物だけでなく、ペプチド混合物中の個々のペプチドにも対するT細胞応答の誘導に効果的であることが図12に示される。したがって、各々が13位、61位又は146位に点突然変異を有するペプチドを含むペプチド混合物がT細胞応答を誘導し得ることが図12に初めて示される。
ペプチド混合物を用いたT細胞増殖アッセイの結果を図11及び図12に示す。特に、RASタンパク質の146位に突然変異を有するペプチドが免疫原性であり、T細胞の誘導を刺激することが図11に示される。ペプチド混合物TGX3がペプチド混合物だけでなく、ペプチド混合物中の個々のペプチドにも対するT細胞応答の誘導に効果的であることが図12に示される。したがって、各々が13位、61位又は146位に点突然変異を有するペプチドを含むペプチド混合物がT細胞応答を誘導し得ることが図12に初めて示される。
Claims (25)
- 免疫応答を惹起するのに適したペプチドであって、該ペプチドがRASタンパク質のフラグメントに対応する領域を含み、
前記領域が突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸を含み、
前記領域が前記突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、
前記領域が前記突然変異位置に点突然変異を有し、
前記突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位である、
ペプチド。 - 前記点突然変異がK117N、A146T又はA146Vの突然変異である、請求項1に記載のペプチド。
- ワクチン又は薬剤として用いられる、請求項1又は2に記載のペプチド。
- 各々がRASタンパク質のフラグメントに対応する第1及び第2のペプチドを含む、免疫応答を惹起するのに適したペプチド混合物であって、
前記第1のペプチドが第1の突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、
前記第2のペプチドが第2の突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、
前記第1及び第2のペプチドの領域が各々独立して、前記第1及び第2の突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、
前記第1及び第2のペプチドが各々、前記第1及び第2の突然変異位置に点突然変異を有し、
前記第1の突然変異位置がRASタンパク質の117位又は146位であり、前記第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位であり、
前記第1の突然変異位置の点突然変異が、前記第2の突然変異位置の点突然変異とは異なる、
ペプチド混合物。 - 前記第1のペプチドの点突然変異がK117N、A146T又はA146Vの突然変異から選択される、請求項4に記載のペプチド混合物。
- 前記第2のペプチドの点突然変異がK117N、A146T、A146V、G13A、G13C、G13D、G13R、G13S、G13V、G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61E、Q61H、Q61K、Q61L、Q61P又はQ61Rの突然変異から選択される、請求項4又は5に記載のペプチド混合物。
- 前記ペプチド混合物が、RASタンパク質のフラグメントに対応する少なくとも1つの更なるペプチドを含み、
前記少なくとも1つの更なるペプチドが、突然変異位置を含む少なくとも8個のアミノ酸の領域を含み、
前記少なくとも1つの更なるペプチドの前記領域が前記突然変異位置以外に、RASタンパク質の対応する領域と同一の少なくとも6個のアミノ酸残基を有し、
前記少なくとも1つの更なるペプチドが前記突然変異位置に点突然変異を有し、
前記少なくとも1つの更なるペプチドの前記突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位、61位、117位又は146位であり、
前記少なくとも1つの更なるペプチドの点突然変異が、前記第1及び第2のRASペプチドの各々の点突然変異とは異なる、
請求項4〜6のいずれか一項に記載のペプチド混合物。 - 前記第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、前記第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位、13位又は61位である、請求項4〜7のいずれか一項に記載のペプチド混合物。
- 前記第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、前記第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位であり、前記少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の13位である、請求項7に記載のペプチド混合物。
- 前記第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、前記第2の突然変異位置がRASタンパク質の13位であり、前記少なくとも1つの更なるペプチドの突然変異位置がRASタンパク質の61位である、請求項7に記載のペプチド混合物。
- 前記第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、前記第2の突然変異位置がRASタンパク質の12位であり、第1の更なるペプチドがRASタンパク質の13位に突然変異位置を有し、第2の更なるペプチドがRASタンパク質の61位に突然変異位置を有する、請求項7に記載のペプチド混合物。
- 前記第1の突然変異位置がRASタンパク質の146位であり、前記第2の突然変異位置がRASタンパク質の13位であり、前記第1の更なるペプチドがRASタンパク質の13位に突然変異位置を有し、前記ペプチド混合物が、RASタンパク質の61位に突然変異位置を有する第2の更なるペプチドを更に含む、請求項7に記載のペプチド混合物。
- A146Tの突然変異を有するペプチドと、
G13Rの突然変異を有するペプチドと、
G13Vの突然変異を有するペプチドと、
Q61Rの突然変異を有するペプチドと、
Q61Kの突然変異を有するペプチドと、
Q61Hの突然変異を有するペプチドと、
Q61Lの突然変異を有するペプチドと、
を含む、請求項4〜8、10及び12のいずれか一項に記載のペプチド混合物。 - MHC分子上に提示された場合に請求項1〜3のいずれか一項に記載のペプチドに特異的なT細胞。
- 請求項14に記載のT細胞を含むT細胞製剤。
- MHC細胞上に提示された場合に請求項4〜13のいずれか一項に記載のペプチド混合物の1つのペプチドの各々に特異的なT細胞を含むT細胞混合物。
- MHC分子上に提示された場合に、
請求項1若しくは2に記載の、ペプチド、又は
請求項3に記載の、用途に用いられるペプチド
に対して特異的な、T細胞受容体又はその抗原結合フラグメント。 - 請求項1若しくは2に記載の、ペプチド、
請求項3に記載の、用途に用いられるペプチド、又は
請求項17に記載のT細胞受容体
をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。 - 請求項18に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項19に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1若しくは2に記載の、ペプチド、
請求項3に記載の、用途に用いられるペプチド、
請求項4〜13のいずれか一項に記載の、ペプチド混合物、
請求項14に記載の、T細胞、
請求項15に記載の、T細胞製剤、
請求項16に記載の、T細胞混合物、
請求項17に記載の、T細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、
請求項18に記載の、核酸、
請求項19に記載の、ベクター、又は
請求項20に記載の、宿主細胞
と、薬学的に許容可能な担体、希釈剤及び/又は賦形剤とを含む医薬組成物。 - 癌の予防及び/又は治療のために用いられる、
請求項1若しくは2に記載の、ペプチド、
請求項3に記載の、用途に用いられるペプチド、
請求項4〜13のいずれか一項に記載の、ペプチド混合物、
請求項14に記載の、T細胞、
請求項15に記載の、T細胞製剤、
請求項16に記載の、T細胞混合物、
請求項17に記載の、T細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、
請求項18に記載の、核酸、
請求項19に記載の、ベクター、
請求項20に記載の、宿主細胞、又は
請求項21に記載の、医薬組成物。 - 前記癌が副腎、自律神経節、胆道、骨、乳房、中枢神経系、頸部、結腸直腸、子宮内膜、造血器、リンパ系、腎臓、大腸、肝臓、肺、食道、卵巣、膵臓、前立腺、唾液腺、皮膚、小腸、胃、精巣、胸腺、甲状腺、上気道消化管及び尿路の癌、及び/又は悪性黒色腫である、請求項22に記載の、用途に用いられるペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞製剤、T細胞混合物、医薬組成物、T細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸、ベクター、又は宿主細胞。
- 前記癌が大腸癌である、請求項23に記載の、用途に用いられるペプチド、ペプチド混合物、T細胞、T細胞製剤、T細胞混合物、医薬組成物、T細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、核酸、又はベクター。
- 癌の治療又は予防の方法であって、
請求項1若しくは2に記載の、ペプチド、
請求項3に記載の、用途に用いられるペプチド、
請求項4〜13のいずれか一項に記載の、ペプチド混合物、
請求項14に記載の、T細胞、
請求項15に記載の、T細胞製剤、
請求項16に記載の、T細胞混合物、
請求項17に記載の、T細胞受容体若しくはその抗原結合フラグメント、
請求項18に記載の、核酸、
請求項19に記載の、ベクター、又は
請求項21に記載の、医薬組成物
を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
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Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001514190A (ja) * | 1997-08-27 | 2001-09-11 | ノルスク・ヒドロ・アーエスアー | 細胞傷害性t細胞免疫を引き出すペプチド |
JP2002543149A (ja) * | 1999-04-30 | 2002-12-17 | ノルスク ハイドロ アーエスアー | RASオンコージンp21ペプチドワクチン |
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---|---|---|---|---|
JP2001514190A (ja) * | 1997-08-27 | 2001-09-11 | ノルスク・ヒドロ・アーエスアー | 細胞傷害性t細胞免疫を引き出すペプチド |
JP2002543149A (ja) * | 1999-04-30 | 2002-12-17 | ノルスク ハイドロ アーエスアー | RASオンコージンp21ペプチドワクチン |
JP2009531068A (ja) * | 2006-03-27 | 2009-09-03 | グローブイミューン,インコーポレイテッド | Ras変異並びにこれに関連する組成物及び方法 |
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CANCER RESEARCH, vol. 72, no. 10, JPN5018003510, 2012, pages 2457 - 2467, ISSN: 0004440786 * |
GENES, CHROMOSOMES AND CANCER, vol. 50, JPN6020022961, 2011, pages 307 - 312, ISSN: 0004295279 * |
NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY, vol. 13, no. 11, JPN5018003511, 2014, pages 1 - 47, ISSN: 0004440787 * |
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