JP2005514006A - 物質 - Google Patents

Abstract

【課題】
【解決手段】本発明は、（ｉ）膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部又は一部と、（ｉｉ）膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部又は一部とを備えた可溶性Ｔ細胞受容体（sTCR）を提供する。（ｉ）及び（ｉｉ）は、それぞれ、TCR鎖の機能的可変ドメインと定常ドメインの少なくとも一部とを備え、定常ドメイン残基の間が天然のTCR中には存在しないジスルフィド結合によって連結されている。

Description

発明の背景

本発明は、可溶性Ｔ細胞受容体（TCR）に関する。

WO99/60120号に記載されているように、TCRは、Ｔ細胞による特異的主要組織適合複合体（ＭＨＣ）−ペプチド複合体の認識を媒介し、このため、免疫系の細胞性免疫が機能する上で不可欠である。

抗体とTCRという２種類の分子のみが抗原を特異的に認識するので、TCRは、ＭＨＣに提示されたペプチド抗原に対する唯一の受容体であって、外来ペプチドは細胞内の異常を示す唯一の兆候となることが多い。Ｔ細胞の認識は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）が物理的に直接接触したときに起こり、抗原特異的TCRとｐＭＨＣ複合体の連結によって開始される。

TCRは、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するヘテロ二量体の細胞表面タンパク質であり、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合している。TCRはαβ及びγδ型として存在しており、これらは構造的に類似しているが、それらを発現しているＴ細胞は極めて異なる解剖学的分布を有し、おそらく機能も異なっていると思われる。TCRの細胞外部分は、２つの膜近位定常ドメインと２つの膜遠位可変ドメインとからなっており、可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（CDR）と同様の多型ループを有している。TCR分子の結合部位を形成して、ペプチドの特異性を決定するのはこれらのループである。ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩリガンドも、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であるが、抗原提示に特化しており、ＡＰＣ細胞表面に多様な短いペプチド断片を提示することを可能とする多型ペプチド結合部位を有している。

可溶性TCRは、特異的なTCR−ｐＭＨＣ相互作用の研究のために有用であるのみならず、感染又は自己免疫疾患マーカーを検出する診断ツールとしても有用であろう。可溶性TCRは、染色にも使用される（例えば、ＭＨＣの中に提示されたペプチド抗原の存在を調べるために細胞を染色する）。同様に、可溶性TCRは、特定の抗原を提示している細胞に、治療剤（例えば、細胞毒性化合物又は細胞刺激化合物）を送達するために使用することができる。可溶性TCRは、Ｔ細胞（例えば、自己免疫ペプチド抗原に反応するＴ細胞）を阻害するために使用することもできる。

多くの場合、タンパク質は膜貫通領域によって安定化されているので、２以上のポリペプチドサブユニットから構成され且つ膜貫通ドメインを有するタンパク質を可溶型として作製することは困難なことがある。このことはTCRについても当てはまり、細胞外ドメインのみ又は細胞外ドメインと細胞質ドメインの何れかを含有する末端切断型のTCRであって、TCR特異的抗体によって認識することができるが（抗体によって認識される組換えTCRの一部が正しくフォールディングされていることを示している）、高い収率で製造することができず、低濃度では不安定であり及び／又はＭＨＣ−ペプチド複合体を認識することができないことが科学文献にも記載されていることは、その反映である。この文献は、WO99/60120号で概説されている。

各サブユニットを接続する天然のジスルフィド架橋を含んだTCRヘテロ二量体の作製を、数多くの文献が記載している(Garboczi, et al., (1996), Nature 384 (6605)：134-41;Garboczi, et al., (1996), J Immunol 157(12)：5403-10; Chang et al., (1994), PNAS USA 91：11408-11412; Davodeau et al., (1993) J.Biol. Chem. 268(21)：15455-15460; Golden et al., (1997), J. Imm. Meth. 206：163-169; 米国特許第6080840号)。しかし、かかるTCRはTCR特異的抗体によって認識され得るが、何れも比較的高濃度でなければ天然リガンドを認識せず及び／又は安定でないことが示された。

WO99/60120号には、その天然リガンドを認識することができるように正しくフォールディングされ、長時間にわたって安定であり、相当な量を作製することができる可溶性TCRが記載されている。このTCRは、Ｃ末端の二量体化ペプチド対（ロイシンジッパーなど）によって、それぞれ、TCR β鎖又はδ鎖細胞外ドメインと二量体を形成したTCR α鎖又はγ鎖細胞外ドメインを備えている。このTCR作製法は、概ね全てのTCRに適用することが可能である。

Reiterら、Immunity、1995、2：281-287は、ジスルフィドで安定化されたTCRα及びβ可変ドメインを備え、そのうちの１つが末端切断型のPseudomonas exotoxin(PE38)に連結された可溶性分子の構築について詳述している。この分子を作製した理由の１つとして記載されているのは、一本鎖TCRに固有の不安定性を克服することであった。TCR可変ドメイン中の新規ジスルフィド結合の位置は、以前にこれらを導入した抗体の可変ドメインとの相同性を通じて確定された(例えば、Brinkmann, et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：7538-7542、及び Reiter, et al. (1994) Biochemistry 33：5451-5459)。しかし、抗体とTCR定常ドメイン間にはこのような相同性は存在しないので、TCR定常ドメインの間に新しい鎖間ジスルフィド結合を導入するのに適した部位を同定するために、このような技術を用いることはできなかった。

可溶性TCRの重要性に鑑みれば、このような分子を作製するための代替的な方法を提供することが望ましいであろう。

第一の側面によれば、本発明は、（ｉ）膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部又は一部と、（ｉｉ）膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部又は一部とを備えた可溶性Ｔ細胞受容体（sTCR）であって、（ｉ）及び（ｉｉ）が、それぞれ、TCR鎖の機能的可変ドメインと定常ドメインの少なくとも一部とを備え、天然のTCR中には存在しないジスルフィド結合によって、（ｉ）及び（ｉｉ）の定常ドメインの残基が連結されている、可溶性Ｔ細胞受容体を提供する。

別の側面では、本発明は、可溶性αβ型Ｔ細胞受容体（sTCR）であって、共有ジスルフィド結合が、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する、可溶性αβ型Ｔ細胞受容体を提供する。

本発明のsTCRには、免疫原性を示すか、あるいは体外から速やかにsTCRが排出されてしまう可能性がある異種ポリペプチドを含有していないという利点がある。さらに、本発明のTCRは、元になった天然のTCRと極めて類似した三次元構造を有しており、この構造的類似性の故に、本発明のTCRは免疫原性を示さないものと思われる。本発明のsTCRは、クラスＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体又はクラスＩＩ ＭＨＣ−ペプチド複合体を認識するために用いることができる。

本発明のTCRは可溶性である。本出願において、可溶性(solubility)とは、単分散へテロ二量体として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(KCL 2.7mM、KH₂PO₄ 1.5mM、NaCl 137mM、及びNa₂PO₄ 8mM、 pH 7.1-7.5. Life Technologies, Gibco BRL)中に、１ｍｇ／ｍＬの濃度でTCRを精製することが可能であり、且つ２５℃で１時間インキュベートした後においても、前記TCRの９０％超がなお単分散へテロ二量体であることをいう。TCRの溶解性を評価するためには、まず、実験例２に記載されているようにTCRを精製する。この精製を行った後に、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＰＢＳで平衡化したPharmaciaのSuperdex ７５ ＨＲカラムを用いて）１００μｇのTCRを分析する。２５℃で１時間、さらに１００ｇのTCRをインキュベートした後、前述のとおりに、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析する。次いで、サイズ排除のトレースを積算により分析し、単分散へテロ二量体に対応するピーク下領域面積を比較する。当該ピークは、分子量既知のタンパク質標準の溶出位置と比較することによって同定することができる。単分散へテロ二量体可溶性TCRは、約５０ｋＤａの分子量を有する。上述したように、本発明のTCRは可溶性である。しかし、以下でさらに詳述されているように、得られた複合体が不溶性となるように、又はTCRが不溶性固相支持体の表面上に提示され得るように、ある成分（ｍｏｉｅｔｙ）にTCRをカップルさせることができる。

本明細書で用いられているTCRアミノ酸の番号は、「The T Cell Receptor Factsbook, 2001, LeFranc & LeFranc, Academic Press」に記載されているＩＭＧＴシステムに従っている。このシステムでは、α鎖定常ドメインは、TRAC^＊０１という表記を有している（ここで、「ＴＲ」はＴ細胞受容体遺伝子を表し、「Ａ」はα鎖遺伝子を表し、「Ｃ」は定常領域を表し、「^＊０１」は対立遺伝子１を表す）。β鎖定常ドメインは、TRBC^＊０１という表記を有している。この例では、２つの定常領域遺伝子「Ｃ１」及び「Ｃ２」が存在し得る。各対立遺伝子によってコードされる翻訳されたドメインは、複数のエキソンの遺伝コードから構成されることもあるので、これらも特定される。アミノ酸は、それらが存在するドメインのエキソンに従って番号が付される。

天然のTCRの細胞外部分は、各々が膜近位定常ドメインと膜遠位可変ドメインを有する２つのポリペプチド（αβ又はγδ）からなる（図１参照）。前記定常ドメインと可変ドメインのそれぞれには、鎖内ジスルフィド結合が含まれる。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（CDR）に類似した多型性が高いループを含有する。TCRのCDR３は、ＭＨＣによって提示されるペプチドと相互作用し、CDR１とCDR２はペプチド及びＭＨＣと相互作用する。TCR配列の多様性は、連結される可変（Ｖ）、多様（Ｄ）、連結（Ｊ）、及び定常遺伝子の体細胞での再構成を通じて生成される。機能的なα鎖ポリペプチドは、再構成されたＶ−Ｊ−Ｃ領域によって形成されるのに対して、β鎖はＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃ領域からなる。細胞外定常ドメインは、膜近位領域と免疫グロブリン領域を有している。膜近位領域は、膜貫通ドメインと膜近位システイン残基の間に位置するアミノ酸からなる。定常免疫グロブリンドメインは、残りの定常ドメインアミノ酸残基からなり、膜近位システインから連結領域(joining region)の先頭にまで及び、免疫グロブリン型の折り畳み(fold)の存在を特徴とする。Ｃα１又はTRAC^＊０１として知られる単一のα鎖定常ドメインと、Ｃβ１又はTRBC^＊０１及びＣβ２又はTRBC２^＊０１として知られる２つの異なるβ定常ドメインとが存在する。これらの異なるβ定常ドメイン間の差は、エキソン１のアミノ酸残基４、５、及び３７に存する。このため、TRBC１^＊０１は、そのエキソン１の中に４Ｎ、５Ｋ、及び３７を有し、TRBC２^＊０１は、そのエキソン１の中に４Ｋ、５Ｎ、及び３７Ｙを有する。各TCR細胞外ドメインの範囲は、若干変化し得る。

本発明では、各鎖の定常ドメイン（又はその一部）中に位置する残基の間にジスルフィド結合が導入される。TCRの各鎖は、ｐＭＨＣ複合体と相互作用できるのに十分な、それらの可変ドメインを備える。このような相互作用は、それぞれ、本明細書の実験例３又はWO99/6120号に記載されているように、BIAcore３０００^ＴＭ又はBIAcore２０００^ＴＭ装置を用いて測定することができる。

ある実施態様では、本発明のsTCRの各鎖は、その鎖内ジスルフィド結合も備える。本発明のTCRは、各TCR鎖の細胞外定常Ｉｇ領域を全て、好ましくは各鎖の細胞外ドメインを全て（すなわち、膜近位領域を含む）備えてもよい。天然のTCRには、各鎖の保存された膜近位領域を連結するジスルフィド結合が存在する。本発明の一実施形態では、このジスルフィド結合が存在しない。これは、適切なシステイン残基（それぞれ、アミノ酸４、TRAC^＊０１遺伝子のエキソン２、並びにTRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１のアミノ酸２）を別のアミノ酸に変異させることによって、又はシステイン残基が含まれないように各鎖を末端切断することによって行うことができる。本発明の好ましい可溶性TCRは、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除外されるようにＣ末端が切断された（すなわち、前記システイン残基のＮ末端側残基１、２、３、４、５、６，７、８、９、又は１０の箇所で切断された）天然のα及びβ TCR鎖を備える。しかし、天然の鎖間ジスルフィド結合が本発明のTCR中に存在してもよく、一部の実施形態では、TCR鎖のうち１つのみが、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成する天然のシステイン残基を有することに留意しなければならない。このシステインは、成分をTCRに付着させるために使用することができる。

しかし、各TCR鎖は、さらに短くしてもよい。定常ドメインは、ペプチド−ＭＨＣリガンドとの接触に直接関与していないので、実質的に機能性を失わせずに、Ｃ末端切断点を変化させることもできる。

あるいは、本発明で好まれるものより大きな定常ドメインの断片が存在してもよい（すなわち、定常ドメインは、必ずしも、鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインの直前で切断する必要はない）。例えば、膜貫通ドメインを除く定常ドメイン全体（すなわち、細胞外ドメインと細胞質ドメイン）を含めることもできるであろう。この場合には、細胞のTCR中で鎖間ジスルフィド結合を形成している１以上のシステイン残基を変異させて、ジスルフィド結合の形成に関与しない別のアミノ酸残基にするか、これらの残基を１以上欠失させるのが有利となり得る。

シグナルペプチドは、成熟TCR中では、そのリガンド結合能力に関して何の意味もなく、環境によっては、機能的な可溶性TCRの形成を妨げることもあるので、可溶性TCRを原核細胞、例えば、E.Coli中で発現させるのであれば、シグナルペプチドは省略してもよい。多くの場合には、シグナルペプチドが成熟TCR鎖から除去される切断部位は予測され、実験的に決定されるわけではない。そのＮ末端が数アミノ酸（すなわち、例えば、最大約１０アミノ酸）長い又は短いように、発現されるTCR鎖を設計すると、可溶性TCRの機能性（すなわち、ｐＭＨＣを認識する能力）に影響がないであろう。元のタンパク質配列中に存在しない付加を加えることもできる。例えば、TCRの抗原結合部位の正しい構造とフォールディングを妨害しないのであれば、TCR鎖の精製を容易にし得る短いタグ配列を付加してもよい。

E.Coli中で発現させるためには、翻訳の開始を可能とするために、予想される成熟タンパク質配列のＮ末端開始点上にメチオニン残基を工作してもよい。

TCR鎖の可変ドメイン中に存在する全ての残基が、抗原特異性と機能性に不可欠だというわけではない。このため、抗原特異性と機能性に影響を与えずに、このドメイン中に多数の変異を導入することができる。TCR鎖の定常ドメイン中に存在する全ての残基が、抗原特異性と機能性に不可欠だというわけではない。このため、抗原特異性に影響を与えずに、このドメイン中に多数の変異を導入することができる。

TCRのβ鎖は、細胞のTCR又は天然のTCR中に、対を形成していないシステイン残基を含有している。不適切な鎖内又は鎖間対形成を避けるために、このシステイン残基は除去するか、あるいは別の残基に変異させることが好ましい。このシステイン残基を別の残基（例えば、セリン又はアラニン）に置換することによって、インビトロでのリフォールディング効率に著しく好ましい効果がもたらされ得る。

各鎖上に存在する非システイン残基をシステインに変異させ、変異された残基間に結合を形成させることによって、ジスルフィド結合は形成させることができる。天然の残基の代わりに導入されたシステイン残基の間に、ジスルフィド結合が形成され得るように、天然のTCR中で、それぞれのβ炭素の距離が約６Å（０．６ｎｍ）以下であり、好ましくは３．５Å（０．３５ｎｍ）乃至５．９Å（０．５９ｎｍ）離れている残基が好ましい。ジスルフィド結合は膜近位領域の残基間にあってもよいが、定常免疫グロブリン領域中の残基の間にあることが好ましい。ジスルフィド結合を形成させるためにシステインを導入することができる好ましい部位は、TCRのα鎖に関してはTRAC^＊０１のエキソン１、TCRのβ鎖に関してはTRBC１^＊０１又はTRBC２^＊０１のエキソン１に存在する以下の残基である。

本発明のsTCRのうち１つは、Ａ６ Ｔａｘ TCRに由来する(Garboczi et al, Nature, 1996,384 (6605)： 134-141)。ある実施形態では、前記sTCRは、TRAC^＊０１のエキソン２、残基４のＮ末端にあるTCRのα鎖全体（Garbocziらが用いた番号によると、α鎖のアミノ酸残基１−１８２）と、TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１の両方のエキソン２、残基２のＮ末端にあるTCRのβ鎖全体（Garbocziらが用いた番号によると、β鎖のアミノ酸残基１−２１０）とを備える。ジスルフィド結合を形成させるためには、TRAC^＊０１中のエキソン１のトレオニン４８（Garbocziらが用いた番号によると、α鎖のトレオニン１５８）とTRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１中に存在するエキソン１のセリン５７（Garbocziらが用いた番号によると、β鎖のセリン１７２）を、それぞれシステインに変異させ得る。これらのアミノ酸は、それぞれ、α及びβ TCR鎖の定常ドメインのβストランドＤの中に位置する。

図３ａと３ｂでは、残基１（Garbocziらの用いた番号による）は、それぞれＫとＮであることに留意しなければならない。天然のＡ６ Ｔａｘ TCR中には、Ｎ末端のメチオニン残基は存在せず、上述したように、細菌の発現系の中で、各鎖が作製される場合には存在することがある。

新しい鎖間ジスルフィド結合を形成させるために、システイン残基に変異させることができるヒトTCR中の残基は特定されているので、当業者であれば、同じように、任意のTCRを変異させて、新しい鎖間ジスルフィド結合を有する可溶型のTCRを作製することができるであろう。ヒトの場合、当業者は、各TCR鎖中に以下のモチーフを探して、変異させるべき残基を同定する必要があるにすぎない（影が付されている残基は、システインに変異される残基である）。

α鎖 Ｔｈｒ４８： ＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫ（TRAC^＊０１遺伝子のエキソン１のアミノ酸３９−５８）
α鎖 Ｔｈｒ４５： ＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭ（TRAC^＊０１遺伝子のエキソン１のアミノ酸３６−５５）
α鎖 Ｔｙｒ１０： ＤＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫ（TRAC^＊０１遺伝子のエキソン１のアミノ酸１−２０）
α鎖 Ｓｅｒ１５： ＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦ（TRAC^＊０１遺伝子のエキソン１のアミノ酸６−２５）
β鎖 Ｓｅｒ５７： ＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰ（TRBC１^＊０１遺伝子とTRBC２^＊０１遺伝子のエキソン１のアミノ酸４８−６７）
β鎖 Ｓｅｒ７７： ＡＬＮＤＳＲＹＡＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷ（TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１遺伝子のエキソン１のアミノ酸６８−８７）
β鎖 Ｓｅｒ１７： ＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡ（TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１遺伝子のエキソン１のアミノ酸８−２７）
β鎖 Ａｓｐ５９： ＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬ（TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１遺伝子のエキソン１のアミノ酸５０−６９）
β鎖 Ｇｌｕ１５： ＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱ（TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１遺伝子のエキソン１のアミノ酸６−２５）
その他の種では、TCR鎖は、上記モチーフと１００％の同一性を有する領域を有していないことがある。しかしながら、当業者であれば、TCRのα鎖又はβ鎖の等価な部分を同定して、システインに変異させるべき残基を同定するために上記モチーフを用いることが可能であろう。この点では、アラインメント技法を用いることができる。例えば、TCR配列の変異に適した部分の位置を決定するために、European Bioinformatics Institute website(http：//www.ebi.ac.uk/index.html)から入手できるClustal Wを用いて、上記モチーフを、特定のTCR鎖配列と比較することができる。

ヒトのジスルフィド連結αβ TCRのみならず、他の哺乳動物（マウス、ラット、ブタ、ヤギ、及びヒツジが含まれるが、これらに限定されない）のジスルフィド連結αβ TCRも、本発明の範囲に属する。上述したように、当業者であれば、システイン残基を導入して鎖間ジスルフィド結合を形成させることができる、上記ヒトの部位と等価な部位を決定することができるであろう。例えば、TCR鎖間ジスルフィド結合を形成させるためにシステインに変異させることができる、上記ヒトの残基と等価なマウスの残基を示すモチーフとともに、マウスＣα及びＣβ可溶性ドメインのアミノ酸配列が、以下に示されている（当該残基に影が付されている）。

マウスのＣα可溶性ドメイン：
PYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVP
マウスのＣβ可溶性ドメイン：
EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGREVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRAD
ヒトα鎖Ｔｈｒ４８のマウスにおける等価物：ESGTFITDKTVLDMKAMDSK
ヒトα鎖Ｔｈｒ４５のマウスにおける等価物：KTMESGTFITDKTVLDMKAM
ヒトα鎖Ｔｙｒ１０のマウスにおける等価物：YIQNPEPAVYQLKDPRSQDS
ヒトα鎖Ｓｅｒ１５のマウスにおける等価物：AVYQLKDPRSQDSTLCLFTD
ヒトβ鎖Ｓｅｒ５７のマウスにおける等価物：NGREVHSGVSTDPQAYKESN
ヒトβ鎖Ｓｅｒ７７のマウスにおける等価物：KESNYSYCLSSRLRVSATFW
ヒトβ鎖Ｓｅｒ１７のマウスにおける等価物：PPKVSLFEPSKAEIANKQKA
ヒトβ鎖Ａｓｐ５９のマウスにおける等価物：REVHSGVSTDPQAYKESNYS
ヒトβ鎖Ｇｌｕ１５のマウスにおける等価物：VTPPKVSLFEPSKAEIANKQ。

本発明の好ましい実施形態では、前記TCRの（ｉ）及び（ｉｉ）の各々が、第二のTCRの定常ドメインの全部又は一部に融合された第一のTCRの機能的可変ドメインを備え、前記第一及び第二のTCRは同一の種から得られたものであり、天然のTCRには存在しない前記各定常ドメインの全部又は一部中の残基の間に鎖間ジスルフィド結合が存在する。ある実施形態では、前記第一及び第二のTCRはヒトのものである。換言すれば、ジスルフィド結合によって連結された定常ドメインは、その上に可変ドメインを融合させることができるフレームワークとして機能する。得られたTCRは、第一のTCRの元となった天然のTCRと実質的に同一であろう。このような系によって、安定な定常ドメインフレームワーク上にあらゆる機能的可変ドメインを容易に発現することが可能となる。

その上に異種の可変ドメインを融合することができるフレームワークとして、上記Ａ６ Ｔａｘ sTCRの定常ドメイン、あるいは、実際には、上述した新しい鎖間ジスルフィド結合を有する任意の変異αβ TCRの定常ドメインを用いることができる。融合タンパク質は、異種可変ドメインのコンフォメーションをできる限り保持していることが好ましい。従って、導入されるシステイン残基と定常ドメインのＮ末端との間にある何れかの部位で、異種の可変ドメインが定常ドメインに連結されていることが好ましい。Ａ６ Ｔａｘ TCRの場合、α及びβ鎖上の導入されたシステイン残基は、それぞれ、TRAC^＊０１中のエキソン１のトレオニン４８（Garbocziらが用いた番号によると、α鎖のトレオニン１５８）、及びTRBC１^＊０１とTRBC２^＊０１中のエキソン１のセリン５７（Garbocziらが用いた番号によると、β鎖のセリン１７２）に位置することが好ましい。従って、異種のα及びβ鎖可変ドメイン付着点は、それぞれ、残基４８（Garbocziらが用いた番号によると１５９）又は残基５８（Garbocziらが用いた番号によると１７３）とα又はβ定常ドメインのＮ末端との間に存在することが好ましい。

Ａ６ Ｔａｘ TCR中の前記付着点に対応する異種α及びβ鎖の定常ドメイン中の残基は、配列の相同性によって同定することができる。融合タンパク質は、好ましくは、付着点のＮ末端の異種配列を全て包含するように構築することが好ましい。

以下でさらに詳細に論述されているように、本発明のsTCRは、そのＣ末端又はＮ末端を成分(moiety)で誘導体化し、又は成分に融合させてもよい。結合ドメインから遠位にあるので、Ｃ末端が好ましい。ある実施形態では、TCR鎖の一方又は双方が、このような成分を融合させることができるシステイン残基を、そのＣ末端及び／又はＮ末端に有する。

本発明の可溶性TCR（好ましくは、ヒトのもの）は、実質的に純粋な形態で、又は精製された若しくは単離された調製物として提供することができる。例えば、本発明の可溶性TCRは、他のタンパク質が実質的に存在しない形態で提供することができる。

本発明の複数の可溶性TCRを、多価複合体中に与えてもよい。このように、本発明は、ある側面において、本明細書に記載されている可溶性Ｔ細胞受容体を複数備えた、多価Ｔ細胞受容体（TCR）複合体を提供する。前記複数の可溶性TCRは各々、同一であることが好ましい。

別の側面では、本発明は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を検出する方法であって、
（ｉ）本明細書に記載された可溶性Ｔ細胞受容体又は多価Ｔ細胞受容体複合体を準備することと、
（ｉｉ）前記可溶性Ｔ細胞受容体又は多価TCR複合体を前記ＭＨＣ−ペプチド複合体と接触させることと、
（ｉｉｉ）前記ＭＨＣ−ペプチド複合体への前記可溶性Ｔ細胞受容体又は多価TCR複合体の結合を検出することと、
を備えた方法を提供する。

本発明の多価複合体において、前記TCRは多量体の形態をとるか、及び／又は、脂質二重層（例えば、リポソーム）上に存在し若しくは脂質二重層（例えば、リポソーム）と会合してもよい。
最も単純な形態では、本発明の多価TCR複合体は、好ましくはリンカー分子を介して、（例えば、共有結合で、又はその他の結合で）互いに会合(associate)した２又は３又は４以上のＴ細胞受容体分子の多量体を備える。適切なリンカー分子には、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジン、及びエキストラビジン（これらは、それぞれ、ビオチンの結合部位を４つ有している）等の多価接着分子(attachment molecuLe)が含まれるがこれらに限定されるものではない。このように、複数のTCR結合部位を有するＴ細胞受容体の多量体中に、ビオチン化されたTCR分子を形成することができる。多量体中に存在するTCR分子の数は、多量体を作るために用いられるリンカー分子の量に対するTCRの量に依存するとともに、他のあらゆるビオチン化された分子の有無にも依存するであろう。好ましい多量体は、二量体、三量体、又は四量体のTCR複合体である。

特定のＭＨＣ−ペプチド複合体を発現している細胞を追跡し又は誘導する際には、TCR四量体より大きな構造体を用いてもよい。前記構造体は、直径１０ｎｍ乃至１０μｍの範囲にあることが好ましい。該構造体上に存在する２以上のTCR分子が細胞上の２以上のＭＨＣ−ペプチド複合体に同時に結合して、多量体の結合成分の細胞に対する結合親和性が増大し得るように十分な距離を置いて、各構造体に、複数のTCR分子をディスプレイしてもよい。

本発明で使用するのに適した構造体には、リポソーム等の膜構造体、及び固体構造体(solid structures)（ビース、例えば、ラテックスビーズなどの粒子であることが好ましい）が含まれる。Ｔ細胞受容体分子で外部を被覆することができる他の構造体も適切である。前記構造体は、各個のＴ細胞受容体分子で被覆するよりも、Ｔ細胞受容体多量体で被覆することが好ましい。

リポソームの場合には、Ｔ細胞受容体分子又はその多量体を膜に付着(attach)させるか、あるいは、膜と会合させてもよい。このための技術は、当業者に周知である。

標識又はそれ以外の成分（毒性成分又は治療成分など）を、本発明の多価TCR複合体中に包含させてもよい。例えば、混合分子多量体の中に、標識その他の成分を包含させることができる。このような多量体分子の例は、３つのTCR分子と１つのペルオキシダーゼ分子を含有するテトラマーである。これは、TCRと酵素を３：１のモル比で混合して四量体複合体を生成させ、分子を正しい比率で含有していない全ての複合体から、所望の複合体を単離することによって達成することができるであろう。立体的な障害が生じないか、又は分子の所望の機能が著しく損なわれなければ、これらの混合分子は、あらゆる組合せの分子を含有することができる。ストレプトアビジン分子上の結合部位の位置関係は、立体的な障害が起こりにくいので、混合型四量体に適している。

TCRをビオチン化する他の手段も可能であろう。例えば、化学的なビオチン化を使用することができる。ビオチンタグ配列中の一定のアミノ酸は不可欠であるが(Schatz、(1993).Biotechnology NY11(10)：1138-43)、別のビオチン化タグを用いてもよい。ビオチン化に用いる混合物を変化させることもできる。前記酵素は、Ｍｇ−ＡＴＰと低イオン強度を必要とするが、これらの条件は何れも変化させることができる（例えば、さらに高いイオン強度とさらに長い反応時間を使用することも可能であろう）。TCRの多量体を形成させるために、アビジン又はストレプトアビジン以外の分子を使用することも可能であろう。ビオチンを多価で結合するあらゆる分子が適しているであろう。あるいは、全く異なる連結（キレートされたニッケルイオンへのポリヒスチジンタグなど(Quiagen Product Guide 1999,Chapter 3“Protein Expression, Purification, Detection and Assay” p.35-37))を考案することもできるであろう。ペプチド−ＭＨＣ複合体との相互作用における構造的な障害の程度を最少に抑えるために、前記タグは、タンパク質のＣ末端方向に位置することが好ましい。

前記TCR鎖の一方又は双方を、検出可能な標識（例えば、診断用途に適した標識）で標識することもできる。このように、本発明は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を検出する方法であって、ＭＨＣ−ペプチド複合体を、該ＭＨＣ−ペプチド複合体に特異的である本発明のTCR又は多量体TCR複合体と接触させることと、前記TCR又は多量体TCR複合体の前記ＭＨＣ−ペプチド複合体への結合を検出することと、を備えた方法を提供する。ビオチン化されたヘテロ二量体を用いて形成された四量体TCRでは、検出可能な標識を与えるために、蛍光ストレプトアビジン（市販されている）を使用することができる。例えば、TCRが特異性を示すペプチドを担持する抗原提示細胞を検出するために、蛍光標識されたテトラマーは、ＦＡＣＳ分析で使用するのに適している。

本発明の可溶性TCRを検出することができる別の方法は、TCR特異的な抗体、特にモノクローナル抗体を使用することである。それぞれ、α鎖とβ鎖の定常領域を認識するαＦ１やβＦ１等の市販の抗TCR抗体が数多く存在する。

これに代えて又はこれに加えて、本発明のTCR（又はその多価複合体）に、例えば、細胞を死滅させるのに使用する毒性成分又はインターロイキン若しくはサイトカイン等の免疫刺激因子であり得る治療剤を（例えば、共有結合その他の結合で）結合させてもよい。本発明の多価TCR複合体は、多量体でないＴ細胞受容体ヘテロ二量体と比べて、ｐＭＨＣに対する結合能が増強されている場合がある。このように、本発明の多価TCR複合体は、インビトロ又はインビボで、特定の抗原を提示する細胞を追跡し又は標的とするのに特に有用であり、このような用途を有する多価TCR複合体をさらに作製するための中間体としても有用である。従って、前記TCR又は多価TCR複合体は、インビボで使用するための薬学的に許容される製剤に加えることができる。

本発明は、標的細胞に治療剤を送達する方法であって、TCR又は多価TCR複合体を前記標的細胞に付着させることが可能な条件下で、本発明のTCR又は多価TCR複合体を標的細胞となり得る細胞に接触させることを備え、前記TCR又は多価TCR複合体がＭＨＣ−ペプチド複合体に対して特異的であり、且つTCR又は多価TCR複合体に前記治療剤が結合されている、方法も提供する。

特に、前記可溶性TCR又は多価TCR複合体を用いて、ある抗原を提示する細胞が存在する場所に治療剤を送達することができる。これは、多くの状況において、とりわけ、癌を攻撃する上で有用であろう。治療剤は、その効果が局所的であるが、当該治療剤が結合する細胞のみに効果が限定されないように、送達することもできるであろう。このように、ある方法では、Ｔ細胞受容体又は多価TCR複合体に連結された腫瘍抗原特異的抗腫瘍分子を想定している。

多くの治療剤、例えば、放射性化合物、酵素（例えば、パーフォリン）、又は化学療法剤（例えば、シスプラチン）をこの用途に利用することができるであろう。所望の場所で確実に毒性効果が発揮されるようにするために、化合物がゆっくり放出されるように、ストレプトアビジンにトキシンを連結して、リポソームの内側に入れることもできるであろう。これによって、体内での輸送中に効果が損なわれることが防止され、TCRが所定の抗原提示細胞に結合した後に、トキシンが最大の効果を有することが確保されるであろう。

他の適切な治療剤には、
・小分子細胞毒性物質（すなわち、７００ダルトン未満の分子量を有し、哺乳類細胞を死滅させることができる化合物）。このような化合物は、細胞毒性効果を有することができる有毒金属も含有し得るであろう。さらに、これらの小分子細胞毒性物質には、プロドラッグ（すなわち、生理的条件下で崩壊し、又は変換を受けて、細胞毒性物質を放出する化合物）も含まれることを理解しなければならない。このような物質の例として、シスプラチン、メイタイシン誘導体、レイチェルマイシン(rachelmycin)、カリチェアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イフォスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルファイマー(sorfimer)、ナトリウムフォトフリンＩＩ、テモゾルミド(temozolmide)、トポテカン、トリメトレエートグルクロネート(trimetreate glucuronate)、アウリスタチンＥ(auristatin E)、ビンクリスチン、及びドキソルビシンが挙げられる；
・ペプチドサイトトキシン（すわち、哺乳類細胞を死滅させることができるタンパク質又はその断片）。例として、リシン、ジフテリアトキシン、シュードモナスバクテリアトキシンＡ、ＤＮＡアーゼ及びＲＮＡアーゼが含まれる；
・放射線核種（すなわち、α若しくはβ粒子又はγ線のうち１以上を放出しながら崩壊する、元素の非安定同位体）。例として、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５、並びにアスタチン２１３などが含まれる；
・抗体に誘導される酵素プロドラッグ(antibody directed enzyme pro-drug)などのプロドラッグ；
・免疫刺激物質(immuno-stimulant)（すなわち、免疫反応を刺激する成分）。例として、ＩＬ−２などのサイトカイン、ＩＬ−８、血小板因子４、メラノーマ増殖刺激タンパク質などのケモカイン、抗体又はその断片、補体活性化因子、異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、並びにウイルス／細菌ペプチドが含まれる。

本発明の可溶性TCR又は多価TCR複合体は、プロドラッグを薬物に転換することができる酵素に連結させてもよい。これにより、プロドラッグは、必要とされている部位に限って、薬物に転換することが可能となる（すなわち、TCRによって誘導される）。

本発明のTCRに対する適切なＭＨＣ−ペプチド標的の例には、ＨＴＬＶ−１エピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２に拘束されるＴａｘペプチド、ＨＴＬＶ−１は白血病に関連している。）、ＨＩＶエピトープ、ＥＢＶエピトープ、ＣＭＶエピトープなどのウイルスエピトープ、メラノーマエピトープ（例えば、ＭＡＧＥ−１ ＨＬＡ−Ａ１拘束エピトープ）、及び他の癌特異的エピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２によって拘束される腎細胞癌腫随伴抗原Ｇ２５０）、慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患に関連するエピトープが含まれるが、これらに限定されない。疾病に関連するｐＭＨＣであって本発明での使用に適したｐＭＨＣ標的が、さらに、「HLA Factbook(Barclay(Ed) Academic Press)」に列記されており、他にも多くのものが同定されつつある。可溶性TCRの特異性によって薬物を局在化させることによって、複数の疾病の治療を強化させ得る可能性もある。

薬物が存在するウイルス疾患（例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ）では、感染細胞の近傍で放出又は活性化される薬物が有益であろう。癌の場合、腫瘍又は転移の近傍に局在化させることによって、トキシン又は免疫刺激物質の効果が増強するであろう。自己免疫疾患では、患者の全体的な免疫能への影響を最小限に抑えつつ、免疫抑制剤をゆっくり放出させ、長期間にわたって、より局所的な効果を与えることができるであろう。移植片の拒絶を抑制する場合には、免疫抑制剤の効果を同様に最適化することができるであろう。ワクチンを送達する場合、抗原提示細胞の近傍にワクチン抗原を局在化させることにより、抗原の効力を増強させることができるであろう。本方法は、画像診断にも適用することができる。

本発明の可溶性TCRは、特異的なｐＭＨＣを結合させてＴ細胞の活性化をモジュレートすることにより、Ｔ細胞の活性化を阻害するために使用することもできる。Ｔ細胞を介した炎症及び／又は組織傷害を伴う自己免疫疾患、例えば、Ｉ型糖尿病は、このアプローチに適しているであろう。この用途では、当該ｐＭＨＣによって提示される特異的なペプチドエピトープを知ることが必要である。

本発明の医薬は、無菌の薬学的組成物（薬学的に許容される担体を含むのが通常である）の一部として供給されるのが通常であろう。この薬学的組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）任意の適切な形態であり得る。前記薬学的組成物は、単位投薬形態として提供することができ、密封された容器中に入れるのが一般的であり、キットの一部として提供してもよい。このようなキットには、（必ずというわけではないが）通常、使用説明書が添付されているであろう。キットには、複数の単位投薬形態が含まれていてもよい。

前記薬学的組成物は、任意の適切な経路、例えば、経口（口腔粘膜(buccal)又は舌下を含む）、直腸、経鼻、局所（口腔粘膜、舌下、又は経皮を含む）、膣又は非経口（皮下、筋肉内、静脈内、又は皮内を含む）経路による投与に適合させ得る。このような組成物は、薬学の分野で公知のあらゆる方法によって、例えば、滅菌条件下で、活性成分を担体又は賦形剤と混合することによって、調製することができる。

経口投与向けの薬学的組成物は、カプセル又は錠剤などの分離したユニットとして、粉末又は顆粒として、溶液、シロップ、又は懸濁液として（水性又は非水性液中に、又は食べられるフォーム(foam)又はホイップとして、又はエマルジョンとして）与えることができる。錠剤又はハードゼラチンカプセルに適した賦形剤には、ラクトース、トウモロコシのデンプン又はその誘導体、ステアリン酸又はその塩が含まれる。ソフトゼラチンカプセルとともに使用するのに適した賦形剤には、例えば、植物油、蝋(wax)、脂肪、半固体又は液体のポリオールなどが含まれる。

溶液及びシロップを調製する場合には、使用し得る賦形剤には、例えば、水、ポリオール、及び糖が含まれる。懸濁油（例えば、植物油）の調製には、水中油又は油中水懸濁液を与えるために使用することができる。経皮投与向けの薬学的組成物は、長期間にわたって、受療者の表皮と密接した状態を保つための分離したパッチ(discrete patch)として与えることができる。例えば、活性成分は、「Pharmaceutical Research 3(6)：318(1986)」に概説されているイオントフォレーシスにより、パッチから送達することができる。局所投与向けの薬学的組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、パウダー、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又はオイルとして調合することができる。目又はその他の外部組織（例えば、口や皮膚）の感染症には、前記組成物を局所軟膏又はクリームとして与えることが好ましい。軟膏中に調合する場合には、パラフィン又は水混和性軟膏基剤とともに、前記活性成分を用いることができる。あるいは、前記活性成分は、水中油クリーム基剤又は油中水基剤とともに、クリーム中に調合してもよい。

目への局所投与向けの薬学的組成物には、適切な担体（特に、水性溶媒）中に前記活性成分を溶解又は懸濁させた点眼薬が含まれる。口腔中への局所投与向けの薬学的組成物には、トローチ剤、芳香錠剤、及びうがい薬が含まれる。

直腸投与向けの薬学的組成物は、座剤又は浣腸として与えることができる。経鼻投与向けの薬学的組成物であって、担体が固体である組成物には、例えば、２０乃至５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有し、鼻から吸い込む様式で（すなわち、鼻に近付けた粉末の容器から鼻を通じて素早く吸引することによって）投与される粗い粉末が含まれる。点鼻スプレー又は点鼻薬として適した、担体が液体である組成物には、活性成分の水溶液又は油溶液が含まれる。吸引による投与向けの薬学的組成物には、様々なタイプの定量加圧エアロゾル、噴霧器、又は吸入器によって生成することができる微粒子ダスト又はミストが含まれる。経膣投与向けの薬学的組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、又はスプレー調合物として与えることができる。非経口投与向けの薬学的組成物には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び前記製剤を対象となる受療者の血液とほぼ等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性滅菌注射溶液と、懸濁剤及び濃縮剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液とが含まれる。注射溶液に使用できる賦形剤には、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン、及び植物油が含まれる。前記組成物は、単一投薬又は複数投薬容器、例えば、密閉されたアンプルやバイアル中に入れ、使用直前に、滅菌された液体担体(carried)（例えば、注射水）を加えるだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即時調合注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。

前記薬学的組成物は、防腐剤、可溶化剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、着臭剤、塩（本発明の物質自体を、薬学的に許容される塩の形態で与えてもよい）、緩衝液、被覆剤、又は抗酸化剤を含有してもよい。前記薬学的組成物は、本発明の物質に加えて、治療的に活性な物質を含有してもよい。

本発明の物質の投薬量は、治療すべき疾病又は疾患、治療すべき個体の年齢と症状などに応じて、幅広く変動させることができ、終局的には、使用すべき適切な投薬量を医師が決定することになろう。適切な頻度で複数回投薬を行ってもよい副作用が生じた場合には、一般的な治療の方法に従って、投薬の量及び／又は頻度を減少させることができる。

本発明のTCRを好ましくは実質的に純粋な形態で提供するために、遺伝子クローニング技術を用いることができる。これらの技術は、例えば、「J.Sambrook et al Molecular Cloning 2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)」に開示されている。このため、さらなる側面において、本発明は、本発明の可溶性TCRの鎖をコードする配列又はこれと相補的な配列を備えた核酸分子を提供する。このような核酸配列は、TCRをコードする核酸をＴ細胞クローンから単離し、（挿入、欠失、又は置換によって）適切な変異を作製することによって得ることができる。

前記核酸分子は、単離された形態又は組換え形態とすることができる。前記核酸分子をベクター中に取り込ませ、そのベクターを宿主細胞中に取り込ませてもよい。このようなベクター及び適切な宿主も、本発明のさらなる側面を構成する。

本発明は、TCR鎖を得る方法であって、TCR鎖の発現が引き起こされる条件下で、このような宿主細胞をインキュベートすることと、次いで、前記ポリペプチドを精製することとを備えた方法も提供する。

本発明の可溶性TCRは、封入体としてE.Coliなどの細菌中で発現させた後、インビトロでリフォールディングさせることによって得ることができる。

TCR鎖のリフォールディングは、適切なリフォールディング条件の下、インビトロで行うことができる。ある実施形態では、正しいコンフォメーションを有するTCRは、可溶化剤（例えば、尿素）を含むリフォールディング緩衝液中で可溶化されたTCR鎖をリフォールディングすることによって取得される。有利には、前記尿素は、少なくとも０．１Ｍ又は少なくとも１Ｍ又は少なくとも２．５Ｍ又は約５Ｍの濃度で存在し得る。使用可能な別の可溶化剤は、０．１Ｍと８Ｍの間、好ましくは、少なくとも１Ｍ又は少なくとも２．５Ｍの濃度のグアニジンである。リフォールディングの前に、システイン残基を完全に還元させるために、還元剤を用いることが好ましい。必要であれば、ＤＴＴやグアニジンなどの変性剤をさらに使用してもよい。リフォールディング工程の前に、異なる変性剤と還元剤を用いてもよい（例えば、尿素、β−メルカプトエタノール）。リフォールディングの間に、シスタミン／システアミン酸化還元対、ＤＴＴ又はβ−メルカプトエタノール／大気の酸素、及び還元型と酸化型のシステインなどの別の酸化還元対を用いてもよい。

フォールディング効率は、他のタンパク質成分、例えば、シャペロンタンパク質をリフォールディング混合物に加えることによって増加させることもできる。リフォールディングは、ミニ−シャペロンが固定化されたカラムにタンパク質を通過させることによって、改善される(Altamirano et al. (1999). Nature Biotechnology 17：187-191 ; Altamirano, et al. (1997). Proc Natl Acad Sci USA 94(8)：3576-8)。

あるいは、昆虫細胞などの真核細胞系の中に発現させることによって、本発明の可溶性TCRを取得してもよい。

TCRの精製は、多くの様々な手段によって行うことができる。他の様式のイオン交換を利用してもよいし、ゲル濾過クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーなどのそれ以外の様式のタンパク質精製を使用してもよい。

本発明の可溶性TCR及び多価TCR複合体は、TCRがｐＭＨＣ複合体に結合するのを阻害できる物質（小さな化学的化合物など）をスクリーニングする際にも使用できる。従って、さらなる側面において、本発明は、Ｔ細胞受容体のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、物質の存在下で、本発明の可溶性Ｔ細胞受容体のペプチド−ＭＨＣ複合体との結合をモニタリングすることと、このような結合を阻害する物質を選択することとを備えた方法を提供する。

このようなスクリーニング法に適した技術には、WO01/22084号に記載されている表面プラズモン共鳴に基づく方法が含まれる。このスクリーニング法の基礎を成し得る他の周知の技術は、シンチレーション近接分析（ＳＰＡ）や増幅ルミネッセント近接アッセイである。

本発明のクリーニング法によって選択された物質は、薬物として使用することができ、あるいは、創薬プログラムの基礎として、医薬として投与するのにさらに適する特徴を有するように修飾し又はその他の改良を施すことができる。このような医薬は、望ましくないＴ細胞反応成分を有する症状を治療するために使用することができる。このような症状には、癌（例えば、腎臓、卵巣、腸、頭部及び頸部）、精巣、肺、胃、子宮頚(cervical)、膀胱、前立腺、又はメラノーマ）、自己免疫疾患、移植片の拒絶、移植片対宿主病が含まれる。

本発明の各側面の好ましい特徴は、相互に、他の側面の好ましい特徴となる。本明細書に記載されている従来技術の文献は、法が許容する最大限度まで、本明細書に組み込まれる。

実験の詳細

本発明をさらに以下の実験例で説明するが、これらの例は決して本発明を限定するものではない。

以下の添付の図面を参照されたい。

以下の実験例のすべてにおいて、別段の記載がない限り、産生された可溶性TCR鎖は、天然鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基のＣ末端直近で切断される。

実験例１： Ａ６ Ｔａｘ TCRα鎖及びβ鎖のプライマー設計及び突然変異誘発
TRAC^＊０１中のエキソン１のＡ６ Ｔａｘトレオニン４８をシステインに突然変異させるために、以下のプライマーを設計した（突然変異を小文字で示す）。

5’-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT
5’-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G
TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１の両方におけるエキソン１のＡ６ Ｔａｘセリン５７をシステインに突然変異させるために、以下のプライマーを設計した（突然変異を小文字で示す）。

5’-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC GC
5’-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G
ＰＣＲ突然変異誘発：
Ａ６ Ｔａｘ TCRα鎖又はβ鎖の各遺伝子を含む発現プラスミドを、それぞれα鎖プライマー又はβ鎖プライマーを用いて、以下のように突然変異させた。プラスミド１００ｎｇを１０ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ、１０ｘＰｆｕ緩衝剤(Stratagene)２５μＬ、Ｐｆｕポリメラーゼ(Stratagene)１０単位と混合し、最終体積をＨ_２Ｏで２４０μＬに調節した。この混合物４８μＬに、最終反応体積５０μＬ中最終濃度が０．２μＭになるように希釈したプライマーを補充した。９５℃３０秒の初期変性ステップの後、Ｈｙｂａｉｄ ＰＣＲ発現ＰＣＲ装置を用いて、反応混合物を１５ラウンドの変性（９５℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、６０秒）及び伸長（７３℃、８分）に供した。次いで、この生成物を、ＤｐｎＩ制限酵素(New England Biolabs)１０単位を用いて３７℃で５時間消化した。消化された反応物１０μＬをコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌に形質転換して、３７℃で１８時間増殖させた。単一コロニーを選択し、ＴＹＰ＋アンピシリン（１６ｇ／Ｌバクトトリプトン、１６ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／ＬＮａＣｌ、２．５ｇ／ＬＫ_２ＨＰＯ_４、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）５ｍＬ中で終夜増殖させた。ＱＩＡｇｅｎミニプレップカラムを用いて製造者の指示に従ってプラスミドＤＮＡを精製し、オックスフォード大学生化学科の配列決定施設における自動配列決定によってその配列を確認した。α鎖の突然変異核酸配列及びアミノ酸配列のそれぞれを図２ａ及び３ａに、β鎖の突然変異核酸配列及びアミノ酸配列のそれぞれを図２ｂ及び３ｂに示す。

実験例２： 可溶性TCRの発現、リフォールディング及び精製
突然変異α鎖及びβ鎖を含む各発現プラスミドをそれぞれE.Coli菌株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳに別個に形質転換し、単一のアンピシリン耐性コロニーをＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）培地中３７℃でＯＤ_６００が０．４になるまで増殖させてから０．５ｍＭ ＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘導した。誘導から３時間後にBeckman J-6Bを用いて４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞を回収した。細胞のペレットを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０を含有する緩衝液に再懸濁した。終夜の凍結融解ステップ後、再懸濁した細胞を、Ｍｉｌｓｏｎｉｘ ＸＬ２０２０超音波処理器中で直径１２ｍｍの標準プローブを用いて１分のバーストで合計約１０分間超音波処理した。封入体のペレットをＢｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１遠心分離器を用いて１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して回収した。次いで、洗浄剤による洗浄を３回実施して細胞片及びメンブレン成分を除去した。毎回、トリトン緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．５％トリトンＸ１００、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０）で封入体ペレットをホモジナイズした後に、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１を用いて１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してペレット化した。次いで、以下の緩衝液、すなわち、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０中で同様に洗浄して、洗浄剤及び塩を除去した。最後に、封入体を３０ｍｇの一定分量に分割して、−７０℃で凍結させた。６Ｍグアニジン−ＨＣｌで可溶化し、Bradford色素結合アッセイ（ＰｅｒＢｉｏ）で測定することによって、封入体タンパク質収率を定量した。

可溶化した各封入体鎖約３０ｍｇ（すなわち、１μモル）を凍結貯蔵物から融解し、次いで試料を混合し、その混合物をグアニジン溶液（６Ｍグアニジン−塩酸塩、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）１５ｍＬに希釈して、鎖が完全に変性されたことを確認した。次いで、十分に還元され変性されたTCR鎖を含有するグアニジン溶液を、１リットルの以下のリフォールディング緩衝液、すなわち、１００ｍＭトリス ｐＨ８．５、４００ｍＭ Ｌ−アルギニン、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ還元グルタチオン、０．５ｍＭ酸化グルタチオン、５Ｍ尿素、０．２ｍＭ ＰＭＳＦ中に注入した。この溶液を２４時間静置した。次いで、リフォールディング体を２回、すなわち、最初に１０リットルの１００ｍＭ尿素で、次に１０リットルの１００ｍＭ尿素、１０ｍＭトリス ｐＨ８．０で透析した。リフォールディングと透析の両方のステップを６〜８℃で実施した。

透析したリフォールディング体をPOROS 50HQ陰イオン交換カラムに充填し、Ａｋｔａ精製装置(Pharmacia)を用いて５０カラム体積にわたる０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で、結合したタンパク質を図４のように溶出させることによって、分解生成物及び不純物からsTCRを分離させた。ピーク画分を４℃で貯蔵し、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図５）によって分析した後、プールし濃縮した。最後に、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ノニデットｐ４０）中で予め平衡化させたSuperdex ２００ＨＲゲルろ過カラム（図６）を用いてsTCRを精製しその特徴を調べた。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出したピークをプールし濃縮した後、BIAcore表面プラズモン共鳴分析によってその特徴を調べた。

実験例３： 特定のｐＭＨＣに結合するsTCRのBIAcore表面プラズモン共鳴キャラクタリゼーション
表面プラズモン共鳴バイオセンサー（BIAcore 3000（商標））を用いて、ペプチド−ＭＨＣリガンドに対するsTCRの結合性を分析した。この分析は、ストレプトアビジンで被覆された結合表面に半配向して固定された（以下に記載する）単一のｐＭＨＣ複合体を作製することによって容易になり、（別個のフローセル上に固定された）最高４種類の異なるｐＭＨＣに対する可溶性Ｔ細胞受容体の結合性を同時に効率的に試験することが可能になる。ＨＬＡ複合体を手動で注入することによって、固定クラスＩ分子の正確な濃度を容易に操作できるようになる。

このような固定複合体は、可溶相にいずれも注入することができるＴ細胞受容体及び補助受容体ＣＤ８ααの両方に結合することができる。TCRの特異的結合は低濃度（少なくとも４０μｇ／ｍＬ）でも得られ、このことはTCRが比較的安定であることを意味する。sTCRは、可溶相で使用しても固定相で使用しても、そのｐＭＨＣ結合諸特性が定性的及び定量的に類似していることが認められている。これは、可溶性種の活性を部分的に制御するのに重要であり、ビオチン化ｐＭＨＣ複合体が非ビオチン化複合体と生物学的に同等の活性を有することも示唆している。

構成要素のサブユニットタンパク質及び合成ペプチドを含有し細菌によって発現される封入体から、ビオチン化クラスＩ ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体をインビトロでリフォールディングさせ、次いで精製し、インビトロで酵素によってビオチン化した(O’Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266：9〜15)。ＨＬＡ重鎖は、適切な構築物においてタンパク質の膜貫通領域及び細胞質領域を置換するＣ末端ビオチン化タグと共に発現された。約７５ｍｇ／リットル細菌培養物の封入体発現レベルが得られた。ＨＬＡ軽鎖又はβ２−ミクログロブリンも、E.Coliにおいて適切な構築物から約５００ｍｇ／リットル細菌培養物の濃度で封入体として発現された。

E.Coli細胞を溶解し封入体を純度約８０％に精製した。封入体からのタンパク質を６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、５０ｍＭトリス ｐＨ８．１、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ中で変性し、単一パルスの変性タンパク質を５℃未満のリフォールディング緩衝液に添加することによって、３０ｍｇ／リットル重鎖、３０ｍｇ／リットルβ２ｍの濃度で、０．４Ｍ Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、１００ｍＭトリス ｐＨ８．１、３．７ｍＭ シスタミン、ｍＭ システアミン、４ｍｇ／ｍＬペプチド（例えば、ｔａｘ １１−１９）中にリフォールディングした。リフォールディングは、４℃において、１時間以上で完結させることができた。

１０倍容量の１０ｍＭ トリス ｐＨ８．１中で透析して緩衝液を交換した。溶液のイオン強度を十分低下させるには２回緩衝液を変える必要があった。次いで、タンパク質溶液を、１．５μｍ酢酸セルロースフィルターを通してろ過し、POROS 50HQ陰イオン交換カラムに充填した（総容積８ｍＬ）。タンパク質を線状０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ勾配で溶出させた。ＨＬＡ−Ａ２−ペプチド複合体は約２５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、ピーク画分を収集し、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Calbiochem)を添加し、その画分を氷上で冷却した。

ビオチン化タグ付きＨＬＡ複合体の緩衝液を、同じ緩衝液で平衡化させたＰｈａｒｍａｃｉａの急速脱塩カラムを用いて、１０ｍＭトリス ｐＨ８．１、５ｍＭ ＮａＣｌと交換した。タンパク質含有画分を、溶出後速やかに氷冷し、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Calbiochem)を添加した。次いで、ビオチン化試薬を添加した：１ｍＭビオチン、５ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ８に緩衝）、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び５μｇ／ｍＬ ＢｉｒＡ酵素（O’Callaghan等(1999)Anal.Biochem.266：9〜15に従って精製した）。次いで、この混合物を室温で終夜インキュベートした。

ゲルろ過クロマトグラフィを用いてビオチン化ＨＬＡ複合体を精製した。ろ過したＰＢＳを用いてPharmacia Superdex 75 HR 10/30カラムを予め平衡化し、１ｍＬのビオチン化反応混合物を充填し、ＰＢＳを用いて０．５ｍＬ／ｍｉｎで展開した。ビオチン化ＨＬＡ複合体は、約１５ｍＬで単一ピークとして溶出した。タンパク質を含有する画分をプールし、氷冷し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した。クーマシー結合アッセイ（ＰｅｒＢｉｏ）によってタンパク質濃度を決定し、一定量のビオチン化ＨＬＡ複合体を−２０℃で凍結保存した。ストレプトアビジンを標準アミンカップリング法によって固定した。

新規鎖間結合を含むＡ６ Ｔａｘ sTCRと、そのリガンド／ＭＨＣ複合体又はその生成について上述した無関係なＨＬＡ−ペプチド化合物との相互作用を、BIAcore ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーを用いて分析した。受容体リガンド相互作用を検出し、それらの親和性及び動力学パラメータを解析するのに用いることができる原理である、小さなフローセル内のセンサー表面近くの応答単位（ＲＵ）で表される屈折率変化が、ＳＰＲによって測定される。β２ｍ上に架橋結合されたビオチンと、フローセルの活性化された表面に化学的に架橋結合されたストレプトアビジンとを結合させて、個々のＨＬＡ−ペプチド複合体を別個のフローセル中に固定することによって、プローブフローセルを調製した。次いで、異なるフローセルの表面を一定流量でsTCRを通過させ、そのＳＰＲ応答を測定することによってアッセイを実施した。まず、２つの異なる表面、すなわち、約５０００ＲＵの特異的ペプチド−ＨＬＡ複合体で被覆された表面と約５０００ＲＵの非特異的ペプチド−ＨＬＡ複合体で被覆されたもう１つの表面にわたって５μＬ／ｍｉｎの一定流量でsTCRを通過させることによって相互作用の特異性を確認した（図７挿入グラフ）。可溶性sTCRを、一定流量かつ様々な濃度でペプチド−ＨＬＡ複合体に注入してバックグラウンド共鳴を確定した。図７に示すように、これらの対照測定の値を特異的ペプチド−ＨＬＡ複合体によって得られる値から差し引き、その値を用いて解離定数Ｋｄとして表される結合親和性を計算した(Price&Dwek、Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists(2^nd Edition)1979、Clarendon Press、Oxford)。

得られたＫｄ値（１．８μＭ）は、新規ジスルフィド結合のないＡ６ Ｔａｘ sTCRとｐＭＨＣの相互作用に対する報告値(0.91μM-Ding等、1999、Inmmunity 11：45〜56)に近い。

実験例４： 新規ジスルフィド結合を含む可溶性ＪＭ２２ TCRの生成
実験例１において調製した可溶性A6 TCRのβ鎖は、連結部位として使用するのに適したＢｇｌＩＩ制限酵素切断部位（ＡＡＧＣＴＴ）を天然配列中に含む。

ＰＣＲ突然変異誘発を以下のように実施してＢａｍＨ１制限酵素切断部位（ＧＧＡＴＣＣ）を可溶性A6 TCRのα鎖、新規システインコドンの５’に導入した。図２ａに記載した配列をこの突然変異誘発用テンプレートとして用いた。以下のプライマーを使用した。

プラスミド１００ｎｇを１０ｍＭ ｄＮＴＰ５μＬ、１０ｘＰｆｕ緩衝液(Stratagene)２５μＬ、Ｐｆｕポリメラーゼ(Stratagene)１０単位と混合し、Ｈ_２Ｏを用いて最終体積を２４０μＬに調整した。この混合物４８μＬに、最終反応体積５０μＬ中最終濃度が０．２μＭになるように希釈したプライマーを補充した。９５℃３０秒の初期変性ステップの後、Ｈｙｂａｉｄ ＰＣＲ発現ＰＣＲ装置を用いて、反応混合物を１５ラウンドの変性（９５℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、６０秒）及び伸長（７３℃、８分）に供した。次いで、この生成物を、ＤｐｎＩ制限酵素(New England Biolabs)１０単位を用いて３７℃で５時間消化した。消化された反応物１０μＬをコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌に形質転換して、３７℃で１８時間増殖させた。単一コロニーを選択し、ＴＹＰ＋アンピシリン（１６ｇ／Ｌバクトトリプトン、１６ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／ＬＮａＣｌ、２．５ｇ／ＬＫ_２ＨＰＯ_４、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）５ｍＬ中で終夜増殖させた。ＱＩＡｇｅｎミニプレップカラムを用いて製造者の指示に従ってプラスミドＤＮＡを精製し、オックスフォード大学生化学科の配列決定施設における自動配列決定によってその配列を確認した。α鎖に導入された突然変異は「サイレント」であり、したがってこの鎖のアミノ酸配列は、図３Ａに詳述されたものと同じである。突然変異α鎖のＤＮＡ配列を図８Ａに示す。

新規ジスルフィド結合が組み込まれた可溶性ＪＭ２２ TCRを生成させるために、α鎖ＢａｍＨ１及びβ鎖ＢｇｌＩＩ制限酵素切断部位を含むA6 TCRプラスミドをテンプレートとして使用した。以下のプライマーを使用した。

ＪＭ２２ TCRα鎖及びβ鎖構築物を以下のようにＰＣＲクローニングによって得た。上述のプライマー及びＪＭ２２ TCR鎖を含むテンプレートを用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物を該当する制限酵素で消化し、ｐＧＭＴ７にクローン化して発現プラスミドを得た。プラスミド挿入断片の配列を、自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。図８ｂ及び８ｃに、ＪＭ２２ TCRの突然変異α鎖及びβ鎖それぞれのＤＮＡ配列を示す。図９ａ及び９ｂに、得られたアミノ酸配列を示す。

実験例１及び２に記載したように、それぞれのTCR鎖が発現され、共にリフォールディングされ、精製された。図１０に、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムから溶出した可溶性ジスルフィド連結ＪＭ２２ TCRタンパク質の溶出を示す。図１１に、図１０に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）の両方のゲルの結果を示す。ピーク１が鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含むことは明らかである。図１２に、図１０のピーク１からプールされた画分のサイズ排除カラムからのタンパク質溶出を示す。

ｐＭＨＣに対するＪＭ２２ TCRの結合のBIAcore分析を、実験例３に記載したように実施した。図１３ａに、ＨＬＡ−Ｆｌｕ複合体に対するジスルフィド連結ＪＭ２２可溶性TCRの特異的結合のBIAcore分析結果を示す。図１３ｂに、ジスルフィド連結ＪＭ２２可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答を示す。ＨＬＡ−ＦＬＵ複合体に対するこのジスルフィド連結TCRのＫｄは７．９±０．５１μＭと決定された。

実験例５： 新規ジスルフィド結合を含む可溶性NY-ESO TCRの生成
NY-ESO TCRをコードするｃＤＮＡを、Enzo Cerundolo(Institute of MolecuLar Medicine、University of Oxford)によって提供されたＴ細胞から既知の技術に従って単離した。NY-ESO TCRをコードするｃＤＮＡを、ｍＲＮＡを逆転写酵素で処理することによって生成させた。

新規ジスルフィド結合が組み込まれた可溶性NY-ESO TCRを生成させるために、α鎖ＢａｍＨＩ及びβ鎖ＢｇｌＩＩ制限酵素切断部位を含むA6 TCRプラスミドを実験例４に記載したようにテンプレートとして使用した。以下のプライマーを使用した。

NY-ESO TCRα鎖及びβ鎖構築物を以下のようにＰＣＲクローニングによって得た。上述のプライマー及びNY-ESO TCR鎖を含むテンプレートを用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物を該当する制限酵素で消化し、ｐＧＭＴ７にクローン化して発現プラスミドを得た。プラスミド挿入断片の配列を、自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。図１４ａ及び１４ｂに、NY-ESO TCRの突然変異α鎖及びβ鎖それぞれのＤＮＡ配列を示す。図１５ａ及び１５ｂに、得られたアミノ酸配列を示す。

プロトコルにおける以下の変更点を除いて実験例１及び２に記載したように、それぞれのTCR鎖が発現され、共にリフォールディングされ、精製された。

可溶性TCRの変性；可溶化されたTCRβ鎖封入体３０ｍｇ及び可溶化されたTCRα鎖封入体６０ｍｇを凍結貯蔵物から融解した。封入体を６Ｍグアニジン溶液中５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に希釈し、ＤＴＴ（２Ｍ貯蔵物）を添加して最終濃度１０ｍＭにした。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。

可溶性TCRのリフォールディング：リフォールディング緩衝液１Ｌを５℃±３℃で激しく撹拌した。酸化還元対（２−メルカプトエチルアミン及びシスタミン（それぞれ最終濃度６．６ｍＭ及び３．７ｍＭ））を添加し、その約５分後に変性TCR鎖を添加した。次いで、このタンパク質を、５℃±３℃で約５時間±１５分撹拌しながらリフォールディングさせた。

リフォールディングされた可溶性TCRの透析：リフォールディングされたTCRを、Spectrapor １メンブレン（Spectrum；製品番号132670）を用いて、１０Ｌの１０ｍＭトリス ｐＨ８．１に対して５℃±３℃で１８〜２０時間透析した。この時間が経過した後、透析緩衝液を新しい１０ｍＭトリス ｐＨ８．１（１０Ｌ）に変え、５℃±３℃でさらに２０〜２２時間透析を続けた。

図１６に、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムから溶出した可溶性ＮＹ−ＥＳＯジスルフィド連結TCRタンパク質の溶出を示す。図１７に、図１６に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）の両方のゲルの結果を示す。ピーク１及び２が鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含むことは明らかである。図１８に、図１７のピーク１（Ａ）及びピーク２（Ｂ）からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィを示す。タンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。

ｐＭＨＣに対するジスルフィド連結NY-ESO TCRの結合のBIAcore分析を、実験例３に記載したように実施した。図１９に、ＨＬＡ−NYESO複合体に対するジスルフィド連結ＮＹ−ＥＳＯ可溶性TCRの特異的結合のBIAcore分析結果を示す。Ａ．ピーク１、Ｂ．ピーク２。

HLA-NY-ESO複合体に対するこのジスルフィド連結TCRのＫｄは、９．４±０．８４μＭと決定された。

実験例６： 新規ジスルフィド鎖間結合、及び天然ジスルフィド鎖間結合を形成するのに必要な２つのシステインのうち少なくとも１つを含む可溶性NY-ESO TCRの生成
新規ジスルフィド結合、及び天然ジスルフィド鎖間結合に関与するシステイン残基の少なくとも１つが組み込まれた可溶性NY-ESO TCRを生成させるために、実験例４に記載したように、α鎖ＢａｍＨＩ及びβ鎖ＢｇｌＩＩ制限酵素切断部位を含むプラスミドをフレームワークとして使用した。以下のプライマーを使用した。

NY-ESO TCRα鎖及びβ鎖構築物を以下のようにＰＣＲクローニングによって得た。上述のプライマー及びNY-ESO TCR鎖を含むテンプレートを用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物を該当する制限酵素で消化し、ｐＧＭＴ７にクローン化して発現プラスミドを得た。プラスミド挿入断片の配列を、自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。図２０ａ及び２０ｂに、NY-ESO TCRの突然変異α鎖及びβ鎖それぞれのＤＮＡ配列を示す。図２１ａ及び２１ｂに、得られたアミノ酸配列を示す。

非天然ジスルフィド鎖間結合及び天然ジスルフィド鎖間結合の両方を含む可溶性NY-ESO TCRを生成させるために、上記プライマーの両方を用いて単離されたＤＮＡを使用した。非天然ジスルフィド鎖間結合、及び天然ジスルフィド鎖間結合に関与するシステイン残基の１つのみを含む可溶性NY-ESO TCRを生成させるために、上記プライマーの１つと実験例５からの適切なプライマーとを用いて単離されたＤＮＡを使用した。

実験例５に記載したように、それぞれのTCR鎖が発現され、共にリフォールディングされ、精製された。

図２２〜２４に、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQ陰イオン交換カラムから溶出した可溶性NY-ESO TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓ（すなわち、両方の鎖の非天然及び天然システインを含む）、TCRα^ｃｙｓ（両方の鎖の非天然システインを含むがα鎖のみの天然システインしか含まない）、及びTCRβ^ｃｙｓ（両方の鎖の非天然システインを含むがβ鎖のみの天然システインしか含まない）タンパク質の溶出を示す。図２５及び２６に、図２２〜２４に示したNY-ESO TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓ、TCRα^ｃｙｓ及びTCRβ^ｃｙｓカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）ゲル及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）ゲルそれぞれの結果を示す。これらは、鎖間ジスルフィドによって連結されたTCRヘテロダイマーが形成されたことを明瞭に示している。図２７〜２９に、それぞれ図２２〜２４に示したNY-ESO TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓ、TCRα^ｃｙｓ及びTCRβ^ｃｙｓ陰イオン交換カラム分析からプールされた画分のゲルろ過クロマトグラフィのタンパク質溶出プロファイルを示す。タンパク質は、TCRヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。

ｐＭＨＣに対するsTCRの結合のBIAcore分析を、実験例３に記載したように実施した。図３０〜３２に、ＨＬＡ−NYESO複合体に対するNY-ESO TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓ、TCRα^ｃｙｓ及びTCRβ^ｃｙｓそれぞれの特異的結合のBIAcore分析結果を示す。

TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓのＫｄは１８．０８±２．０７５μＭであり、TCRα^ｃｙｓのＫｄは１９．２４±２．０１μＭであり、TCRβ^ｃｙｓのＫｄは２２．５±４．０６９２μＭであった。

実験例７： 新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性ＡＨ−１．２３ TCRの生成
ＡＨ−１．２３ TCRをコードするｃＤＮＡを、Hill Gaston(Medical School、Addenbrooke’s Hospital、Cambridge)によって提供されたＴ細胞から既知の技術に従って単離した。NY-ESO TCRをコードするｃＤＮＡを、ｍＲＮＡを逆転写酵素で処理することによって生成させた。

新規ジスルフィド結合が組み込まれた可溶性ＡＨ−１．２３ TCRを生成させるために、α鎖ＢａｍＨＩ及びβ鎖ＢｇｌＩＩ各制限酵素切断部位を含む各TCRプラスミドを実験例４に記載したようにフレームワークとして使用した。以下のプライマーを使用した。

ＡＨ−１．２３ TCRα鎖及びβ鎖構築物を以下のようにＰＣＲクローニングによって得た。上述のプライマー及びＡＨ−１．２３ TCR鎖を含むテンプレートを用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物を該当する制限酵素で消化し、ｐＧＭＴ７にクローン化して発現プラスミドを得た。プラスミド挿入断片の配列を、自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。図３３ａ及び３３ｂに、ＡＨ−１．２３ TCRの突然変異α鎖及びβ鎖それぞれのＤＮＡ配列を示す。図３４ａ及び３４ｂに、得られたアミノ酸配列を示す。

実験例５に記載したように、それぞれのTCR鎖が発現され、共にリフォールディングされ、精製された。

図３５に、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQ陰イオン交換カラムから溶出した可溶性ＡＨ−１．２３ジスルフィド連結TCRタンパク質の溶出を示す。図３６及び３７に、図３５に示したカラム分析画分のそれぞれ還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）ゲル及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）ゲルの結果を示す。これらのゲルは、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーの存在を明示している。図３８は、図３５に示した陰イオン交換カラム分析からプールされた画分のSuperdex 75 HRゲルろ過カラムの溶出プロファイルである。タンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。

実験例８： 定常ドメインの免疫グロブリン領域内の別の位置における新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの生成
TRAC^＊０１のエキソン１のトレオニン４８とTRBC１^＊０１／TRBC２^＊０１両方のエキソン１のセリン５７との間以外の位置にあるTCR免疫グロブリン領域において、新規ジスルフィド結合を含む機能的可溶性TCRを形成できるかどうかを検討するために以下の実験を実施した。

A6 TCRα鎖を突然変異させるために、以下のプライマーを設計した（プライマー名称内の番号はTRAC^＊０１のエキソン１中で突然変異するアミノ酸残基の位置を示し、突然変異した残基を小文字で示す）。

Ｔ４８→Ｃ 突然変異
5’-CACAGACAAAtgTGTGCTAGACAT-3’
5’-ATGTCTAGCACAcaTTTGTCTGTG-3’
Ｙ１０→Ｃ 突然変異
5’-CCCTGCCGTGTgCCAGCTGAGAG-3”
5’-CTCTCAGCTGGcACACGGCAGGG-3’
Ｌ１２→Ｃ 突然変異
5’-CCGTGTACCAGtgcAGAGACTCTAAATC-3’
5’-GATTTAGAGTCTCTgcaCTGGTACACGG-3’
Ｓ１５→Ｃ 突然変異
5’-CAGCTGAGAGACTgTAAATCCAGTGAC-3’
5’-GTCACTGGATTTAcAGTCTCTCAGCTG-3’
Ｖ２２→Ｃ 突然変異
5’-CAGTGACAAGTCTtgCTGCCTATTCAC-3’
5’-GTGAATAGGCAGcaAGACTTGTCACTG-3’
Ｙ４３→Ｃ 突然変異
5’-GATTCTGATGTGTgTATCACAGACAAAT-3’
5’-ATTTGTCTGTGATAcACACATCAGAATC-3’
Ｔ４５→Ｃ 突然変異
5’-CTGATGTGTATATCtgtGACAAAACTGTGC-3’
5’-GCACAGTTTTGTCacaGATATACACATCAG-3’
Ｌ５０→Ｃ 突然変異
5’-AGACAAAACTGTGtgtGACATGAGGTCT-3’
5’-AGACCTCATGTCacaCACAGTTTTGTCT-3’
M52→C 突然変異
5’-ACTGTGCTAGACtgtAGGTCTATGGAC-3’
5’-GTCCATAGACCTacaGTCTAGCACAGT-3’
S61→C 突然変異
5’-CTTCAAGAGCAACtGTGCTGTGGCC-3’
5’-GGCCACAGCACaGTTGCTCTTGAÅG-3’
TCR Ａ６β鎖を突然変異させるために、以下のプライマーを設計した（プライマー名称内の番号はTRBC２^＊０１のエキソン１中で突然変異するアミノ酸残基の位置を示し、突然変異した残基を小文字で示す）。

S57→Ｃ 突然変異
5’-CAGTGGGGTCtGCACAGACCC-3’
5’-GGGTCTGTGCaGACCCCACTG-3’
V13→Ｃ 突然変異
5’-CCGAGGTCGCTtgtTTTGAGCCATCAG-3’
5’-CTGATGGCTCAAAacaAGCGACCTCGG-3’
F14→Ｃ 突然変異
5’-GGTCGCTGTGtgtGAGCCATCAGA-3’
5’-TCTGATGGCTCacaCACAGCGACC-3’
S17→Ｃ 突然変異
5’-GTGTTTGAGCCATgtGAAGCAGAGATC-3’
5’-GATCTCTGCTTCacATGGCTCAAACAC-3’
G55→Ｃ 突然変異
5’-GAGGTGCACAGTtGtGTCAGCACAGAC-3’
5’-GTCTGTGCTGACaCaACTGTGCACCTC-3’
D59→Ｃ 突然変異
5’-GGGTCAGCACAtgCCCGCAGCCC-3’
5’-GGGCTGCGGGcaTGTGCTGACCC-3’
L63→Ｃ 突然変異
5’-CCCGCAGCCCtgCAAGGAGCAGC-3’
5’-GCTGCTCCTTGCaGGGCTGCGGG-3’
S77→Ｃ 突然変異
5’-AGATACGCTCTGtGCAGCCGCCT-3’
5’-AGGCGGCTGCaCAGAGCGTATCT-3’
R79→Ｃ 突然変異
5’-CTCTGAGCAGCtGCCTGAGGGTC-3’
5’-GACCCTCAGGCaGCTGCTCAGAG-3’
E15→Ｃ 突然変異
5’-GCTGTGTTTtgtCCATCAGAA-3’
5’-TTCTGATGGacaAAACACAGC-3’
以下のアミノ酸対間に新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性TCRを生成させるために、ＰＣＲ突然変異誘発、α及びβTCR構築物増幅、ライゲーション及びプラスミド精製を、上記プライマーの適切な組み合わせを用いて、実験例１に記載したように実施した。

図３９〜５８に、上記プライマーによって増幅された突然変異A6 TCR鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す。突然変異システインをコードするコドンを強調して示す。

実験例５に記載したように、それぞれのTCR鎖が発現され、共にリフォールディングされ、精製された。POROS 50HQ陰イオン交換カラムで精製した後、正確にリフォールディングされた可溶性TCRが形成されたかどうかを評価するために、得られたタンパク質をＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルにかけた。精製材料における正確な分子量のジスルフィド連結タンパク質の有無を確認するためにこれらのゲルも評価した。以下の新規ジスルフィド鎖間結合を含む研究対象のTCRは、この細菌発現システムでは正確な分子量のジスルフィド連結タンパク質が生成せず、これらをさらに評価することはしなかった。しかし、別の原核生物又は真核生物発現システムが利用可能である。

図５９〜６４に、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ ２００ＨＱ陰イオン交換カラムからの以下の残基間、すなわち、Ｔｈｒ ４８−Ｓｅｒ ５７、Ｔｈｒ ４５−Ｓｅｒ ７７、Ｔｙｒ １０−ＳＥＲ １７、Ｔｈｒ ４５−Ａｓｐ ５９、Ｍｅｔ ５２−Ｇｌｙ ５５及びＳｅｒ １５−Ｇｌｕ １５間それぞれの新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性TCRの溶出を示す。図６５〜７０に、図５９〜６４に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）ゲル及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）ゲルそれぞれの結果を示す。これらのゲルは、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーの存在を明示している。

図７１〜７６は、図５９〜６４に示した陰イオン交換カラム分析からプールされた画分のSuperdex ２００ ＨＲゲルろ過カラムからの溶出プロファイルである。

ｐＭＨＣに対するTCRの結合のBIAcore分析を、実験例３に記載したように実施した。図７７〜８２は、ＨＬＡ−Ａ２ ｔａｘ ｐＭＨＣ複合体に対する精製可溶性TCRの結合能力を示すBIAcoreトレースである。

Ｔｈｒ ４８−Ｓｅｒ ５７のＫｄは７．８μＭであり、Ｔｈｒ ４５−Ｓｅｒ ７７のＫｄは１２．７μＭであり、Ｔｙｒ １０−Ｓｅｒ １７のＫｄは３４μＭであり、Ｔｈｒ ４５−Ａｓｐ ５９のＫｄは１４．９μＭであり、Ｓｅｒ １５−Ｇｌｕ １５のＫｄは６．３μＭであった。Ｍｅｔ ５２−Ｇｌｙ ５５は、その天然の「標的」であるＨＬＡ−Ａ２ ｔａｘ複合体に結合可能であるが、「無関係な」標的であるＨＬＡ−Ａ２−ＮＹ−ＥＳＯ複合体にも同様に結合した（図８１参照）。

実験例９： ＮＹ−ＥＳＯ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に特異的なジスルフィド連結ＮＹ−ＥＳＯ Ｔ細胞受容体のＸ線結晶学
ＮＹ−ＥＳＯ dsTCRを実験例５に記載したようにクローン化し以下のように発現させた。

突然変異α鎖及びβ鎖を含む各発現プラスミドをそれぞれE.Coli菌株ＢＬ２１ｐＬｙｓＳに別個に形質転換し、単一のアンピシリン耐性コロニーをＴＹＰ（アンピシリン１００μｇ／ｍＬ）培地中３７℃でＯＤ_６００が０．７になるまで増殖させてから０．５ｍＭ ＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘導した。誘導後１８時間してＢｅｃｋｍａｎ Ｊ−６Ｂを用いて４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して細胞を回収した。細胞のペレットを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．１、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセリンを含有する溶解緩衝液に再懸濁した。細菌培養物１Ｌごとに、リゾチーム（２０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬ及びＤｎａｓｅＩ（２０μｇ／ｍＬ）１００μＬを添加した。細菌懸濁液を、氷上で３０分間インキュベーションした後、直径１２ｍｍの標準プローブの付いたＭｉｌｓｏｎｉｘ ＸＬ２０２０超音波処理器を用いて１分のバーストで合計１０分間超音波処理した。Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１遠心分離器（４℃）を用いて１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して封入体のペレットを回収した。次いで、トリトン洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．１、０．５％トリトンＸ１００、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）、２ｍＭ ＤＴＴ）による洗浄を３回実施して、細胞片及びメンブレン成分を除去した。毎回、封入体ペレットをトリトン洗浄緩衝液にホモジナイズした後、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１を用いて１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してペレット化した。次いで、再懸濁緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．１、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム、２ｍＭ ＤＴＴ）中で同様に洗浄して、洗浄剤及び塩を除去した。最後に、封入体を、６Ｍグアニジン緩衝液（６Ｍグアニジン−塩酸塩、５０ｍＭトリス ｐＨ８．１、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ）に可溶化し、１２０ｍｇの一定分量に分割し、−７０℃で凍結させた。６Ｍグアニジン−ＨＣｌで可溶化しＢｒａｄｆｏｒｄ色素結合アッセイ（ＰｅｒＢｉｏ）で測定することによって封入体を定量した。

凍結可溶化されたアルファ鎖約６０ｍｇ（すなわち、２．４μモル）を凍結可溶化されたベータ鎖３０ｍｇ（すなわち、１．２μモル）と混合した。このTCR混合物を６Ｍグアニジン緩衝液で最終体積１８ｍＬに希釈し、３７℃に３０分間加熱して鎖変性を確実に終了させた。次いで、完全に還元され変性されたTCR鎖を含有するグアニジン溶液を冷リフォールディング緩衝液（１００ｍＭトリス ｐＨ８．１、４００ｍＭ Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、６．６ｍＭ ２−メルカプトエチルアミン、３．７ｍＭシスタミン、５Ｍ尿素）１リットルに撹拌しながら混合した。この溶液を５時間低温室（５℃±３℃）に静置してリフォールディングさせた。次いで、リフォールディング体を水１２リットルで１８〜２０時間透析し、その後１２リットルの１０ｍＭトリス ｐＨ８．１で１８〜２０時間（５℃±３℃）透析した。分子量カットオフが６〜８０００ｋＤａであるSpectrapor １（Spectrum Laboratories 製品番号132670）透析メンブレンをこの透析プロセスに使用した。透析したタンパク質を、Ｎａｌｇｅｎｅろ過ユニットに装着した細孔サイズ０．４５μｍのフィルター(Schleicher and Schuell、参照番号10 404012)を通してろ過した。

透析したリフォールディング体をPOROS 50HQ(Applied Bio Systems)陰イオン交換カラムに充填しＡＫＴＡ精製装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、リフォールディングされたNY-ESO TCRを分解生成物及び不純物から分離させた。ＰＯＲＯＳ ５０ ＨＱカラムを１０カラム体積の緩衝液Ａ（１０ｍＭトリス ｐＨ８．１）で予め平衡化した後、それにタンパク質を充填した。７カラム体積にわたる０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配によって、結合したタンパク質を溶出させた。還元及び非還元試料緩衝液を用いた変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥでピーク画分（１ｍＬ）を分析した。２５ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．５で予め平衡化したSuperdex ７５ＨＲゲルろ過カラムを用いて、アルファ−ベータヘテロダイマー複合体を含有するピーク画分をさらに精製した。相対分子量約５０ｋＤａで溶出したタンパク質ピークをプールし、Ultrafree遠心濃縮装置（Millipore、部品番号UFV2BGC40）で４２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃で保存した。

当量の結晶化緩衝液と混合した、５ｍＭ Ｍｅｓ ｐＨ６．５に希釈したタンパク質溶液（８．４ｍｇ／ｍＬ）１μＬを用いて、ハンギングドロップ法によって１８℃でNY-ESO TCRの結晶化を実施した。Crystal Screen緩衝液(Hampton Research)を用いたいくつかの異なる条件下で結晶が出現した。単一の立方晶（＜１００μｍ）が３０％ＰＥＧ４０００、０．１Ｍクエン酸ナトリウム ｐＨ５．６、０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中で成長し、構造決定に使用された。

NY-ESO TCRの結晶を急速冷凍し、DaresburyシンクロトロンのＸ線回折試験に供した。この結晶は０．２５ｎｍ（２．５Å）の分解能で回折した。１組のデータを収集し処理して、約０．２７ｎｍ（２．７Å）が妥当であるが０．２５ｎｍ（２．５Å）まで使用可能である９８．６％完全な振幅セットが得られた。組み合わせＲ因子(merging R-factor)、すなわち結晶学的に等価な反射を複数回測定した一致度は、すべてのデータに対して１０．８％であった。これは、最高分解能シェルでは限界である。空間群は、細胞サイズＡ＝４．２５ｎｍ（４２．５Å）、ｂ＝５．９５ｎｍ（５９．５Å）、ｃ＝８．１７ｎｍ（８１．７Å）、β＝９１．５°のＰ２_１であった。細胞サイズ及び対称性から、細胞中には２つのコピーが存在することが示された。検討を要する非対称単位ａｕ又は最小体積は一方の分子のみであり、細胞中の他方の分子は２_１対称操作によって作製される。ａｕにおける分子の位置決めはｙ方向で任意である。ｘ−ｚ面内で正確な位置にある限り、ｙ方向に自由に移動させることができる。これは、この「極性」空間群ではフリーパラメータと呼ばれる。

ＰＤＢデータベースには、Ａ／ＢヘテロダイマーTCRを含有するエントリーは、１ＢＤ２の１つしかない。このエントリーは、TCRを含む複合体におけるＨＬＡ同族ペプチド(cognate peptide)の座標も有する。TCR鎖ＢはＮＹ−ＥＳＯで同じであったが、鎖ＡはＣドメインで僅かな差がありＮドメインでかなりの差があった。１ＢＤ２ Ａ／Ｂモデルを分子置換ＭＲに使用すると、対称等価な分子との広範な重複によって示されるように、不正確な解が得られた。Ｂ鎖のみを使用すると、近隣分子とさほど衝突しないより良い解が得られた。相関係数は４９％であり、結晶学的Ｒ因子は５０％であり、最短近接（重心〜重心）は０．４９ｎｍ（４９Å）であった。鎖Ｂの出発モデルをＭＲ等価物に変換するために必要な回転及び並進操作を鎖Ａに適用した。このようにして生成されたハイブリッドＭＲ解は、細胞内にうまく充填され、衝突は最小に抑えられた。

電子密度地図はこのモデルとほぼ一致し、NY-ESO TCRの配列に合致するように調節された。しかし、出発モデルには多数の相違があり、特に、このモデルの不規則に配列した部分に特徴的である側鎖の欠損があった。鎖間のヘアピンループの多くは極めて低い密度を有し、モデル化が困難であった。このモデルの結晶学的Ｒ因子は３０％である。Ｒ因子は、残差、すなわち、振幅の計算値と測定値の差である。

図８３ａ及び８３ｂに示すように、１ＢＤ２からの入力配列は、密度とあまり一致しない。モデルの鎖Ａの１６４位及び鎖Ｂの１７４位をＣｙｓに変更し、その後さらに改良すると、この配列指定が密度と極めて良く適合することが明らかになった。しかし、側鎖のサイズの差は極めてわずかで、このモデルに乱れはほとんどなかった。この領域の電子密度はほとんど変化しなかった。

この研究の最も重要な側面は、新しいTCRが、発表されたモデル（１ＢＤ２）に構造的に極めて類似していることである。この比較には、TCRのすべて、定常ドメイン、又は突然変異点近くの小部分を含めることができる。

ｒ．ｍ．ｓ偏差値を下表に列記する。構造の比較を図８４に示す。

ショートストレッチとは、目下ジスルフィド架橋によって連結されている鎖Ａからの一本鎖（Ａ１５７〜Ａ１６９）及び鎖Ｂからの一本鎖（Ｂ１７０〜Ｂ１８３）を指す。主鎖の原子に対してのみ偏差を計算した。

これらの結果から、ジスルフィド結合を導入しても、その周囲のTCRの局所構造がほとんど影響を受けないことがわかる。A6 TCRの発表された構造（１ＢＤ２）とTCRを比較すると、いくつかのより大きな効果が認められるが、ＲＭＳ変移の増加はループコンホメーションの違いによるところが大きい（図８４参照）。これらのループは、特徴的なＩｇフォールド(Ig fold)を形成する一連のβシートによって形成されるTCRのコア構造の一部を形成しない。α鎖全体に対するＲＭＳ偏差は、A6 TCR（１ＢＤ２）とNY-ESO TCRとの可変ドメイン配列の違いのために特に大きい。しかし、A6 TCR及びNY-ESO TCRは同じ可変βドメインを有し、β鎖全体のＲＭＳ偏差から、新しいジスルフィド結合を含むTCRにおいてもこの可変ドメインの構造が維持されることがわかる。したがって、これらのデータは、新しいジスルフィド結合を含むTCRの結晶構造においても、TCRのコア構造が維持されることを示している。

実験例１０： 新規ジスルフィド鎖間結合及びＣ末端β鎖タギング部位を含む可溶性NY-ESO TCRの生成
新規ジスルフィド結合が組み込まれた可溶性NY-ESO TCRを生成させるために、実験例４に記載したように、α鎖ＢａｍＨＩ及びβ鎖ＢｇｌＩＩ制限酵素切断部位を含むA6 TCRプラスミドをフレームワークとして使用した。

NY-ESO TCRβ鎖構築物を、以下のようにＰＣＲクローニングによって得た。以下に示すプライマー、及びNY-ESO TCR鎖を含むテンプレートを用いてＰＣＲ反応を実施した。

ＰＣＲ産物を該当する制限酵素で消化し、ビオチン認識配列を含むｐＧＭＴ７にクローン化して発現プラスミドを得た。プラスミド挿入断片の配列を、自動ＤＮＡ配列決定によって確認した。図８５ａに、ビオチン認識部位が組み込まれたNY-ESO TCRのβ鎖のＤＮＡ配列を示す。図８５ｂに得られたアミノ酸配列を示す。

α鎖構築物を実験例５に記載したように生成させた。実験例５に記載したように、それぞれのTCR鎖が発現され、共にリフォールディングされ、精製された。

非天然ジスルフィド鎖間結合とβ鎖Ｃ末端のヘキサ−ヒスチジンタグとを含む可溶性NY-ESO TCRを生成させるために、同じプライマー及びＮＹ−ＥＳＯテンプレートを上述のように使用した。ＰＣＲ産物を該当する制限酵素で消化し、ヘキサ−ヒスチジン配列を含むｐＧＭＴ７にクローン化して発現プラスミドを得た。図８６ａに、ヘキサ−ヒスチジンタグが組み込まれたNY-ESO TCRのβ鎖のＤＮＡ配列を示す。図８６ｂに得られたアミノ酸配列を示す。

図８７に、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQ陰イオン交換カラムからの、新規ジスルフィド結合及びビオチン認識配列を含む可溶性NY-ESO TCRの溶出を示す。図８８に、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQ陰イオン交換カラムからの、新規ジスルフィド結合及びヘキサ−ヒスチジンタグを含む可溶性NY-ESO TCRの溶出を示す。

図８９及び９０は、図８７及び８８によって示されたそれぞれＮＹ−ＥＳＯ−ビオチン及びＮＹ−ＥＳＯ−ヘキサ−ヒスチジンタグ付き陰イオン交換カラム分析からプールされた画分のゲルろ過クロマトグラフィからのタンパク質溶出プロファイルである。タンパク質は、TCRヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。

ｐＭＨＣに対するsTCRの結合のBIAcore分析を、実験例３に記載したように実施した。ＮＹ−ＥＳＯ−ビオチンTCRのＫｄは７．５μＭであった。ＮＹ−ＥＳＯ−ヘキサ−ヒスチジンタグ付きTCRのＫｄは９．６μＭであった。

実験例１１： 新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性NY-ESO TCRの蛍光標識四量体を用いた細胞染色
TCR四量体の調製
実験例１０のように調製した、新規ジスルフィド結合及びビオチン認識配列を含むＮＹ−ＥＳＯ可溶性TCRを利用して、細胞染色に必要な可溶性TCR四量体を形成させた。精製可溶性TCR溶液（約０．２ｍｇ／ｍＬ）２．５ｍＬの緩衝液を、ＰＤ−１０カラム(Pharmacia)を用いてビオチン化反応緩衝液（５０ｍＭトリス ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）に置換した。分子量カットオフが１０ｋＤａであるcentricon濃縮装置(Amicon)を用いて溶出液（３．５ｍＬ）を１ｍＬに濃縮した。これに、貯蔵物（ｐＨ７．０に調整された０．１ｇ／ｍＬ）からＡＴＰを添加して１０ｍＭにした。次いで、多量のプロテアーゼ阻害剤のカクテル（プロテアーゼ阻害剤カクテルＳｅｔ １、Calbiochem Biochemicals）を、供給された貯蔵溶液の１／１００の最終プロテアーゼカクテル濃度にするのに十分な量添加し、その後（０．２Ｍ貯蔵物から添加された）１ｍＭ ビオチン及び（０．５ｍｇ／ｍＬの貯蔵物からの）２０μｇ／ｍＬ 酵素を添加した。次いで、この混合物を終夜室温でインキュベートした。Ｓ７５ ＨＲカラムのサイズ排除クロマトグラフィによって、この溶液から過剰のビオチンを除去した。NY-ESO TCRのビオチン化レベルを、以下のように、サイズ排除ＨＰＬＣベースの方法によって決定した。５０ｕＬ一定量のビオチン化NY-ESO TCR（２ｍｇ／ｍＬ）を、ストレプトアビジンで被覆したアガロースビーズ(Sigma)５０ｕＬと共に１時間インキュベートした。次いで、このビーズを遠心沈殿させ、未結合試料５０μＬを、ＴＳＫ ２０００ ＳＷカラム(Tosoohaas)に流量０．５ｍＬ／ｍｉｎ（２００ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ７．０）で３０分間かけた。ビオチン化NY-ESO TCRの存在を、ＵＶ分光計によって２１４ｎｍ及び２８０ｎｍで検出した。ビオチン化ＮＹ−ＥＳＯを非ビオチン化NY-ESO TCR対照と対比して測定した。非ビオチン化タンパク質のピーク面積からビオチン化タンパク質のピーク面積を減算してビオチン化の割合を計算した。

ビオチン化可溶性TCRの四量体化を、neutravidin−フィコエリトリン複合体(Cambridge Biosciences、UK)を用いて行った。ビオチン化可溶性TCRの濃度をクーマシータンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって測定し、可溶性TCR ０．８ｍｇ／ｍｇ neutravidin−フィコエリトリン複合体の比を、ビオチン化TCRによるneutravidin−ＰＥの飽和を１：４の比で達成するように計算した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した６．１５ｍｇ／ｍＬビオチン化ＮＹ−ＥＳＯ可溶性TCR溶液１９．５μＬを、氷上の１ｍｇ／ｍＬ可溶性neutravidin-PE １５０μＬに静かに撹拌しながら徐々に添加した。次いで、ＰＢＳ １００．５μＬをこの溶液に添加して最終NY-ESO TCR四量体濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。

染色手順
ＰＢＳ ０．５ｍＬで希釈した０．３×１０^６ＨＬＡ−Ａ２陽性ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系（ＰＰ ＬＣＬ）の４つのアリコートを、ＨＬＡ−Ａ２ NYESOペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）の濃度を変えて（０、１０^−４、１０^−５及び１０^−６Ｍ）３７℃で２時間インキュベートした。次いで、これらのＰＰ ＬＣＬ細胞を、ハンクス緩衝食塩水溶液（ＨＢＳＳ）（Gibco、ＵＫ）で２回洗浄した。

４つのアリコートの各々を等分し、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ−フィコエリトリンを用いて新たに四量体化したビオチン化ＮＹ−ＥＳＯジスルフィド連結TCRで染色した。５又は１０μｇフィコエリトリン標識dsTCR複合四量体と共に細胞を氷上で３０分間インキュベートし、ＨＢＳＳで洗浄した。細胞を再度洗浄し、ＨＢＳＳに再懸濁させ、FACSVantageで分析した。２５，０００回測定し、ＷｉｎＭＩＤＩソフトウエアを用いてデータを解析した。

結果
図９１ａ〜ｈに、上述したように調製した試料の各々に対して得られたＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅデータをヒストグラムとして示す。以下の表に、各々の試料に対して観察された陽性染色細胞の割合を列記する。

これらのデータは、NY-ESO TCR四量体によって標識された細胞の比率が、インキュベートしたペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）濃度に相関して増加することを明示している。したがって、これらのNY-ESO TCR四量体は、ＨＬＡ−Ａ２ ＮＹ−ＥＳＯ複合体の発現に基づく特異的細胞標識に適した成分である。

本実験例では、蛍光性の複合化されたNY-ESO TCR四量体を使用した。しかし、適切な治療成分(therapeutic moiety)でこの標識を置換しても、同様なレベルの細胞結合が期待される。

実験例１２： Ｃβ１定常領域が組み込まれた、新規ジスルフィド結合を含む可溶性A6 TCRの生成
上記実験例はすべて、Ｃβ２定常領域が組み込まれた、新規ジスルフィド結合を含む可溶性TCRの生成について説明している。本実験例では、Ｃβ１定常領域が組み込まれた、可溶性TCRを首尾よく生成可能であることを示す。

A6 TCRβ鎖Ｖ−ドメインをＣβ１にＰＣＲステッチングするためのプライマーの設計
A6 TCRβ鎖Ｖ−ドメインのＰＣＲ構築用に以下のプライマーを設計した。

5’-GGAGATATACATATGAACGCTGGTGTCACT-3’
5’-CCTTGTTCAGGTCCTCTGTGACCGTGAG-3’
Ｃβ１のＰＣＲ構築用に以下のプライマーを設計した。

5’-CTCACGGTCACAGAGGACCTGAACAAGG-3’
5’-CCCAAGCTTAGTCTGCTCTACCCCAGGCCTCGGC-3’
ベータＶTCR構築物及びＣβ１構築物を標準ＰＣＲ法によって別々に増幅した。これらを、ステッチングＰＣＲによって連結させた。ＱＩＡｇｅｎミニプレップカラムを用いて製造者の指示に従ってプラスミドＤＮＡを精製し、オックスフォード大学生化学科の配列決定施設における自動配列決定によってその配列を確認した。Ａ６＋Ｃβ１の配列を図９２に示す。

その結果、Ａ６＋Ｃβ１鎖は、両方の鎖のＣドメインにシステインが導入され、鎖間ジスルフィド結合によってＡ６アルファTCRと一対になった。

実験例２に記載したように、可溶性TCRが発現され、リフォールディングされた。

リフォールディングされた可溶性TCRの精製：
透析したリフォールディング体をPOROS 50HQ陰イオン交換カラムに充填し、Ａｋｔａ精製装置(Pharmacia)を用いて５０カラム体積にわたる０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で、結合したタンパク質を図９３のように溶出させることによって、分解生成物及び不純物からsTCRを分離させた。ピーク画分を４℃で貯蔵し、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９４）によって分析した後、プールし濃縮した。最後に、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ノニデットｐ４０）中で予め平衡化させたSuperdex ２００ＨＲゲルろ過カラム（図９５）を用いてsTCRを精製しその特徴を調べた。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出したピークをプールし濃縮した後、BIAcore表面プラズモン共鳴分析によってその特徴を調べた。

ｐＭＨＣに対するジスルフィド連結A6 TCRの結合のBIAcore分析を、実験例３に記載したように実施した。図９６に、その同族ｐＭＨＣに対するジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの特異的結合のBIAcore分析結果を示す。

Ｃβ１定常領域が組み込まれた、新規ジスルフィド結合を含む可溶性A6 TCRは、その同族ｐＭＨＣに対して２．４２±０．５５μＭのＫ_ｄを有した。この値は、Ｃβ２定常領域が組み込まれた、新規ジスルフィド結合を含む可溶性A6 TCRに対して実験例３で決定されたＫ_ｄの１．８μＭに極めて近い。

実験例１３： β鎖に「遊離の」システインが組み込まれた、新規ジスルフィド結合を含む可溶性A6 TCRの生成
TCRのβ鎖定常領域には、鎖間又は鎖内ジスルフィド結合形成に関与しないシステイン残基（TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１のエキソン１における残基７５）が含まれる。上記実験例はすべて、機能性TCRの収率低下をもたらし得る「不適切な」ジスルフィド結合が形成される可能性を回避するために、この「遊離の」システインがアラニンに突然変異した、新規ジスルフィド結合を有する可溶性TCRの生成について述べている。本実験例では、この「遊離の」システインが組み込まれた可溶性TCRを生成させ得ることを示す。

TCRβ鎖のプライマー設計及び突然変異誘発
TCRβ鎖アラニン（TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７５）をシステインに突然変異させるために、以下のプライマーを設計した（突然変異を小文字で示す）。

5’-T GAC TCC AGA TAC tgT CTG AGC AGC CG
5’-CG GCT GCT CAG Aca GTA TCT GGA GTC A
可溶性TCRのＰＣＲ突然変異誘発、発現及びリフォールディングを、実験例２に記載したように実施した。

リフォールディングされた可溶性TCRの精製：
透析したリフォールディング体をPOROS 50HQ陰イオン交換カラムに充填し、Ａｋｔａ精製装置(Pharmacia)を用いて５０カラム体積にわたる０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で、結合したタンパク質を図９８のように溶出させることによって、分解生成物及び不純物からsTCRを分離させた。ピーク画分を４℃で貯蔵し、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９９）によって分析した後、プールし濃縮した。最後に、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ノニデットｐ４０）中で予め平衡化させたSuperdex ２００ＨＲゲルろ過カラム（図１００）を用いてsTCRを精製しその特徴を調べた。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出したピークをプールし濃縮した後、BIAcore表面プラズモン共鳴分析によってその特徴を調べた。

ｐＭＨＣに対するジスルフィド連結A6 TCRの結合のBIAcore分析を、実験例３に記載したように実施した。図１０１に、その同族ｐＭＨＣに対するジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの特異的結合のBIAcore分析結果を示す。

β鎖に「遊離の」システインが組み込まれた新規ジスルフィド結合を含む可溶性A6 TCRは、その同族ｐＭＨＣに対して２１．３９±３．５５μＭのＫ_ｄを有した。

実験例１４： β鎖の「遊離の」システインがセリンに突然変異した、新規ジスルフィド結合を含む可溶性A6 TCRの生成
本実験例では、β鎖の「遊離の」システイン（TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７５）がセリンに突然変異した、新規ジスルフィド結合を含む可溶性TCRが首尾よく生成可能であることを示す。

TCRβ鎖のプライマー設計及び突然変異誘発
天然システイン（TRBC１^＊０１及びTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７５）を予め置換したTCRβ鎖アラニンをセリンに突然変異させるために、以下のプライマーを設計した（突然変異を小文字で示す）。

5’-T GAC TCC AGA TAC tCT CTG AGC AGC CG
5’-CG GCT GCT CAG AGa GTA TCT GGA GTC A
可溶性TCRの（図１０２に示す突然変異ベータ鎖をもたらす）ＰＣＲ突然変異誘発、発現及びリフォールディングを、実験例２に記載したように実施した。

リフォールディングされた可溶性TCRの精製：
透析したリフォールディング体をPOROS 50HQ陰イオン交換カラムに充填し、Akta精製装置(Pharmacia)を用いて５０カラム体積にわたる０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配で、結合したタンパク質を図１０３に示すように溶出させることによって、分解生成物及び不純物からsTCRを分離させた。ピーク画分を４℃で貯蔵し、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０４）によって分析した後、プールし濃縮した。最後に、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ノニデットｐ４０）中で予め平衡化させたSuperdex ２００ＨＲゲルろ過カラム（図１０５）を用いてsTCRを精製しその特徴を調べた。約５０ｋＤａの相対分子量で溶出したピークをプールし濃縮した後、BIAcore表面プラズモン共鳴分析によってその特徴を調べた。

ｐＭＨＣに対するジスルフィド連結A6 TCRの結合のBIAcore分析を、実験例３に記載したように実施した。図１０６に、その同族ｐＭＨＣに対するジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの特異的結合のBIAcore分析結果を示す。

β鎖の「遊離の」システインがセリンに突然変異した、新規ジスルフィド結合を含む可溶性A6 TCRは、その同族ｐＭＨＣに対して２．９８±０．２７μＭのＫ_ｄを有した。この値は、β鎖の「遊離の」システインがアラニンに突然変異した、新規ジスルフィド結合を含む可溶性A6 TCRに対して実験例３で決定されたＫ_ｄの１．８μＭに極めて近い。

実験例１５： 新規ジスルフィド結合を含むＮＹ−ＥＮＯ TCRα鎖及びβ鎖の酵母発現ベクターへのクローニング
NY-ESO TCRα鎖及びβ鎖を、Saccharomyces cerevisiae由来のプレプロα接合因子配列のＣ末端に融合させ、それぞれ酵母発現ベクターｐＹＸ１２２及びｐＹＸ１１２にクローン化した（図１０７及び１０８参照）。

S.cerevisiae菌株ＳＥＹ６２１０(Robinson等(1991)、Mol Cell Biol.11(12)：5813〜24)由来のプレプロα接合因子配列をＰＣＲ増幅してTCRα鎖に融合させるために、以下のプライマーを設計した。

5’-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3’
5’-TCA CCT CCT GGG CTT CAG CCT CTC TTT TAT C-3’
S.cerevisiae菌株ＳＥＹ６２１０由来のプレプロα接合因子配列をＰＣＲ増幅してTCRβ鎖に融合させるために、以下のプライマーを設計した。

5’-TCT GAA TTC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT AC-3’
5’-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3’
S.cerevisiae菌株ＳＥＹ６２１０のコロニーを０．２５％ＳＤＳ水溶液３０μＬに再懸濁し、９０℃で３分間加熱して、酵母ＤＮＡを調製した。TCRα鎖及びβ鎖に融合させるためのプレプロα接合因子配列を、それぞれ上述のプライマー対を用いて以下のＰＣＲ条件で酵母ＤＮＡ０．２５μＬをＰＣＲ増幅することによって生成させた。各プライマー１２．５ｐモルを、２００μＭ ｄＮＴＰ、１０ｘＰｆｕ緩衝液５μＬ及びＰｆｕポリメラーゼ(Stratagene)１．２５単位と最終体積５０μＬ中で混合した。９２℃３０秒の初期変性ステップの後、反応混合物をＨｙｂａｉｄ ＰＣＲ発現ＰＣＲ装置によって３０ラウンドの変性（９２℃、３０秒）、アニーリング（４６．９℃、６０秒）及び伸長（７２℃、２分）に供した。

上述のプレプロα接合因子配列に融合させるTCRα鎖をＰＣＲ増幅するために、以下のプライマーを設計した。

5’-GGC TGA AGC CCA GGA GGT GAC ACA GAT TCC-3’
5’-CTC CTC TCG AGT TAG GAA CTT TCT GGG CTG GG-3’
上述のプレプロα接合因子配列に融合させるTCRβ鎖をＰＣＲ増幅するために、以下のプライマーを設計した。

5’-GGC TGA AGC CGG CGT CAC TCA GAC CCC AAA AT-3’
5’-GTG TCT CGA GTT AGT CTG CTC TAC CCC AGG C-3’
TCRα鎖及びβ鎖を増幅するためのＰＣＲ条件は、以下の変更点以外上述したのと同じであった。すなわち、TCRα鎖及びβ鎖を増幅するために使用したＤＮＡテンプレートは、それぞれ（実験例５において調製した）NY-ESO TCRα鎖及びβ鎖であり、使用したアニーリング温度は６０．１℃であった。

次いで、初期ＰＣＲ産物に導入した相補的重複配列を利用したＰＣＲステッチング反応にＰＣＲ産物を用いて、完全長キメラ遺伝子を作製した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲ Ｉ及びＸｈｏ Ｉで消化し、同じ酵素で消化したｐＹＸ１２２又はｐＹＸ１１２にクローン化した。得られたプラスミドをＱｉａｇｅｎ（商標）ミニプレップカラムを用いて製造者の指示に従って精製し、その配列を、Genetics Ltd、Queensway、New Milton、Hampshire、United Kingdomの配列決定施設における自動配列決定によって確認した。図１０９及び１１０に、クローン化されたキメラ産物のＤＮＡ配列及びタンパク質配列を示す。

実験例１６： 新規ジスルフィド結合を含む可溶性NY-ESO TCRの酵母中での発現
それぞれ実験例１５に記載したように生成されたTCRα鎖及びβ鎖を含む酵母発現プラスミドを、Agatep等(1998)(Technical Tips Online(http：//tto.trends.com)1：51：P01525)によるプロトコルを用いて、S.cerevisiae菌株ＳＥＹ６２１０に同時形質転換した。ヒスチジン及びウラシルを含有する合成ドロップアウト(SD、synthetic dropout)寒天(Qbiogene、Illkirch、France)上で増殖させた単一のコロニーを、ヒスチジン及びウラシルを含有するＳＤ培地１０ｍＬ中３０℃で終夜培養した。その終夜培養したものを、ヒスチジン及びウラシルを含有する新鮮なＳＤ培地１０ｍＬ中１：１０で継代培養し、３０℃で４時間増殖させた。その培養物を、Heraeus Megafuge 2.0R(Kendro Laboratory Products Ltd、Bishop’s Stortford、Hertfordshire、UK)を用いて３８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を回収した。StratClean Resin(Stratagene)５μＬを上清と混合し、ブラッドホイール中４℃で終夜回転させた。StratClean ResinをHeraeus Megafuge ２．０Ｒを用いて３８００ｒｐｍで遠心沈殿させ、培地を廃棄した。還元試料緩衝液（２Ｍ ＤＴＴ５０μＬを含有するLaemmLi試料緩衝液(Biorad)９５０μＬ）２５μＬを樹脂に添加し、その試料を９５℃で５分間加熱し、次いで、氷冷した後、混合物２０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに０．８ｍＡ一定／ｃｍ^２ゲル表面で１時間かけた。ゲル中のタンパク質を、以下の変更点以外下記実験例１７に記載したように、Immuno-Blot PVDFメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移し、TCR抗α鎖抗体でプローブした。１次抗体（TCR抗α鎖）及び２次抗体をそれぞれ１／２００及び１／１０００に希釈して用いた。図１１１に、展開したメンブレンの写真を示す。その結果、酵母培養によって培地中に低レベルのTCRが分泌されることが判明した。

実験例１７： バキュロウイルスにおけるジスルフィドＡ６ Ｔａｘ TCRα鎖及びβ鎖発現
クローニング戦略
ジスルフィドＡ６ Ｔａｘ TCRのα鎖及びβ鎖を、ｐＧＭＴ７からｐＥＸ１７２と称するｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＫＳ２ベースのベクターにクローン化した。このベクターは、ＤＲＢ１^＊０１０１のリーダー配列、様々なペプチドコード配列を挿入するためのＡｇｅＩ部位、リンカー領域、次いでＪｕｎロイシンジッパー配列の前のＤＲβ鎖をクローン化するＭｌｕＩ及びＳａｌＩ部位を用いて、昆虫細胞を発現させるための様々なＭＨＣクラスＩＩβ鎖をクローニングするように設計された。ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−のＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間に位置し、ｐＥＸ １７２がｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−と異なる配列を図１１２に示す。昆虫細胞においてTCR鎖をクローニングするために、このｐＥＸ１７２がＡｇｅＩ及びＳａｌＩと共に切断されてリンカー領域及びＭｌｕＩ部位が除去され、ペプチド配列が始まる箇所にTCR鎖が入る。TCR配列は、５’末端にＢｓｐＥＩ部位（これはＡｇｅＩ適合付着末端を含んでいた）及び３’末端にＳａｌＩ部位を含むｐＧＭＴ７からクローン化された。ＤＲβリーダー配列の除去用切断部位を用意するために、ＤＲβ鎖の最初の３つの残基（ＧＤＴ）を保存した。Ｊｕｎロイシンジッパー配列が転写されるのを防止するために、ＳａｌＩ部位の前に終止コドンを挿入する必要があった。この構築物の概略については、図１１３を参照されたい。TCR鎖がこのプラスミドに入った後、ＢａｍＨＩ断片を切り出し、バキュロウイルスに対して相同組換え部位を有するｐＡｃＡＢ３ベクターにサブクローニングした。ｐＡｃＡＢ３ベクターは、２つの異なるプロモーターを有し、１つはＢａｍＨＩ部位を含み、１つはＢｇｌＩＩクローニング部位を含む。A6 TCRβ鎖にはＢｇｌＩＩ部位があるので、A6 TCRα鎖がＢｇｌＩＩ部位に挿入され、次いでβ鎖がＢａｍＨＩ部位にサブクローニングされる。

上記クローニング戦略に従い、以下のプライマーを設計した（ベクターに相同な部分を大文字で示す）。

Ａ６α：Ｆ：5’-gtagtccggagacaccggaCAGAAGGAAGTGGAGCAGAAC
Ｒ：5’-gtaggtcgacTAGGAACTTTCTGGGCTGGG
Ａ６β：Ｆ：5’-gtagtccggagacaccggaAACGCTGGTGTCACTCAGA
Ｒ：5’-gtaggtcgacTAGTCTGCTCTACCCCAGG
ＰＣＲ、クローニング及びサブクローニング：
ジスルフィドＡ６ Ｔａｘ TCRα鎖又はβ鎖の遺伝子を含有する発現プラスミドを、以下のＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。プラスミド１００ｎｇを１０ｍＭ ｄＮＴＰ １μＬ、１０ｘＰｆｕ緩衝液(Stratagene)５μＬ、Ｐｆｕポリメラーゼ(Stratagene)１．２５単位、上記Ａ６αプライマー５０ｐモルと混合し、最終体積をＨ_２Ｏで５０μＬに調節した。同様の反応混合物を、βプラスミド及びβプライマー対を用いてβ鎖用に準備した。これらの反応混合物を、Ｈｙｂａｉｄ ＰＣＲ発現ＰＣＲ装置を用いて３５ラウンドの変性（９５℃、６０秒）、アニーリング（５０℃、６０秒）及び伸長（７２℃、８分）に供した。次いで、生成物を、ＢｓｐＥＩ制限酵素１０単位を用いて３７℃で２時間消化し、ＳａｌＩ(New England Biolabs)１０単位でさらに２時間消化した。これらの消化された反応物を、ＡｇｅＩ及びＳａｌＩで消化したｐＥＸ１７２に連結し、これらをコンピテントなＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌に形質転換し、３７℃で１８時間増殖させた。単一のコロニーをα及びβ調製物の各々から選択し、ＴＹＰ＋アンピシリン（１６ｇ／Ｌバクトトリプトン、１６ｇ／Ｌ酵母抽出物、５ｇ／ＬＮａＣｌ、２．５ｇ／ＬＫ_２ＨＰＯ_４、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン）５ｍＬ中で終夜増殖させた。ＱＩＡｇｅｎミニプレップカラムを用いて製造者の指示に従ってプラスミドＤＮＡを精製し、Ｇｅｎｅｔｉｘの配列決定施設における自動配列決定によってその配列を確認した。α鎖及びβ鎖それぞれについて、ＢａｍＨＩ挿入断片のアミノ酸配列を図１１４及び１１５に示す。

ｐＥＸ１７２におけるこれらα及びβジスルフィドＡ６ Ｔａｘ TCR鎖構築物を、ＢａｍＨＩ制限酵素（New England Biolabs）を用いて３７℃で２時間消化して除去した。α鎖のＢａｍＨＩ挿入断片を、ＢｇｌＩＩ酵素で消化したｐＡｃＡＢ３ベクター（Pharmingen-BD Biosciences：21216P）に連結した。これをコンピテントなＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌に形質転換し、３７℃で１８時間増殖させた。このプレートから単一のコロニーを選択し、ＴＹＰ＋アンピシリン５ｍＬ中で終夜増殖させ、プラスミドＤＮＡを先と同様に精製した。次いで、このプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、β鎖ＢａｍＨＩ挿入断片を連結し、コンピテントなＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌に形質転換し、終夜増殖させ、ＴＹＰ−アンピシリンで選択し、増殖させた後、ＱＩＡｇｅｎミニプレップカラムを用いて先と同様にミニプレップを行った。α鎖及びβ鎖両方の正確な配向を、以下の配列決定プライマーを用いて配列を決定することによって確認した。

ｐＡｃＡＢ３ α 順方向：5’-gaaattatgcatttgaggatg
ｐＡｃＡＢ３ β 順方向：5’-attaggcctctagagatccg
昆虫細胞内におけるトランスフェクション、感染、発現及びA6 TCRの分析
ＢａｃｕＬｏｇｏｌｄ形質移入キット(Pharmingen-BD Biosciences:21100K)を用いて製造者の指示に従って、無血清培地（Pharmingen-BD Biosciences：551411）で増殖させたｓｆ９細胞（Pharmingen-BD Biosciences：21300C）に、α鎖及びβ鎖を含む発現プラスミドを形質移入した。２７℃で５日後、これらの形質移入細胞を増殖させた培地２００μＬを、無血清培地中の１×１０^６細胞／ｍＬのHigh Five細胞１００ｍＬに添加した。２７℃でさらに６日後、この培地１ｍＬを取り出し、Hereus microfugeを用いて１３，０００ＲＰＭで５分間遠心して細胞片をペレット化した。

この昆虫Ａ６ジスルフィド連結TCR上清１０μＬを、正の対照の細菌Ａ６ジスルフィド連結TCR５μｇ及び１０μｇと一緒にプレキャスト４〜２０％トリス／グリシンゲル（Invitrogen：EC60252）上に流した。還元試料緩衝液（９５０μＬのLaemmLi試料緩衝液（Bio-Rad：161-0737）５０μＬの２Ｍ ＤＴＴ）１０μＬを添加し、９５℃で５分間加熱し、室温で１０分間冷却し、次いで２０μＬを充填することによって還元試料を調製した。ＬａｅｍｍＬｉ試料緩衝液１０μＬを添加し、２０μＬを充填することによって非還元試料を調製した。

Novex-Xcellゲルタンク中で１時間このゲルに１５０ボルトをかけ、その後ゲルを静かに撹拌しながらクーマシーゲル染料５０ｍＬで１時間染色した（メタノール５００ｍＬ中でクーマシー粉１．１ｇを１時間撹拌し、酢酸１００ｍＬを添加し、Ｈ_２Ｏで１リットルとし、１時間撹拌し、次いで０．４５μｍフィルターでろ過する）。脱染剤(destain)（クーマシー粉を除いたクーマシーゲル染料）５０ｍＬ中でゲルを静かに撹拌しながら３０分間３回脱染した。

先と同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを操作してウェスタンブロットを実施した。但し、クーマシーでゲルを染色するのではなく、タンパク質をImmuno-Blot PVDFメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ：１６２−０１７４）に移した。６枚のろ紙をゲルのサイズに合わせて切り、転写緩衝液（グリシン２．３９ｇ、トリス塩基５．８１ｇ、ＤＴＴ０．７７ｇをＨ_２Ｏ ５００ｍＬに溶解し、メタノール２００ｍＬを添加し、次いでＨ_２Ｏで１０００ｍＬにした）に浸漬した。ＰＶＤＦメンブレンを、メタノールに１分間、次いで転写緩衝液に２分間浸漬して調製した。Immno-Blot装置(Pharmacia-Novablot)のアノード表面に３枚のろ紙を置き、次いでその上にメンブレンを置き、その上にゲルを置き、最後に別の３枚のろ紙をカソード側に置いた。０．８ｍＡ一定／ｃｍ^２ゲル表面で１時間Immuno-blotを用いて分析した。

ブロッティング後、ブロッキング緩衝液（トリス緩衝食塩錠剤(Sigma:T5030)４個、脱脂粉乳(Sigma:M7409)３ｇ、Tween 20 ３０μＬをＨ_２Ｏで３０ｍＬに調整）７．５ｍＬ中で６０分間静かに撹拌しながらメンブレンをブロックした。ＴＢＳ洗浄緩衝液（ＴＢＳ錠剤２０個、Tween 20 １５０μＬをＨ_２Ｏで３００ｍＬに調整）でメンブレンを３回５分間洗浄した。次いで、ブロッキング緩衝液７．５ｍＬで希釈した抗TCRα鎖クローン３Ａ８（Serotec:MCA987）又は抗TCRβ鎖クローン８Ａ３（Serotec:MCA988）で１／５０に希釈した１次抗体中で１時間静かに撹拌しながらメンブレンをインキュベートした。先と同様にしてメンブレンをＴＢＳ洗浄緩衝液で洗浄した。次に、ブロッキング緩衝液７．５ｍＬで１／１０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗体（Santa Cruz Biotech：Sc-2005）の２次抗体インキュベーションを、静かに撹拌しながら３０分間実施した。先と同様にしてメンブレンを洗浄し、次いでＴＢＳ錠剤２個を含むＨ_２Ｏ３０ｍＬで洗浄した。

Ｏｐｔｉ−４ＣＮ色度検出（Biorad：170-8235）（Ｏｐｔ−４ＣＮ希釈剤１．４ｍＬ、Ｈ_２Ｏ１２．６ｍＬ、Ｏｐｔｉ−４ＣＮ基質０．２８ｍＬ）によって抗体結合を検出した。メンブレンを３０分間着色し、次いでＨ_２Ｏで１５分間洗浄した。メンブレンを室温で乾燥し、走査イメージをクーマシー染色ゲルのイメージと並べた（図１１６）。

結果
図１１６から、両方のジスルフィドTCRが、ＳＤＳゲル中で安定なヘテロダイマーとして形成されることがわかる。これらは両方とも、還元するとα鎖とβ鎖に分解する。昆虫ジスルフィドTCRヘテロダイマーは、おそらく昆虫細胞によるグリコシレーションのために、細菌によって産生されたものよりもやや大きな分子量を有する。この場合、昆虫細胞はα鎖を過剰に産生し、遊離のα鎖が抗αウェスタンブロットの非還元レーンに見られることが判明した。

これらのデータから、上述のバキュロウイルス発現システムが、新規ジスルフィド結合を含む可溶性TCRの原核生物発現に対して、実行可能な代替システムとなることが明確に示された。

図１は、本発明によって導入された鎖間ジスルフィド結合を有する可溶性TCRの概略図である。 図２ａ及び２ｂは、システインコドンを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのそれぞれα鎖及びβ鎖の核酸配列である。陰影付きの部分は、導入したシステインコドンである。 図３ａは、新規ジスルフィド鎖間結合を生成させるために使用したＴ_４８→Ｃ突然変異（下線部）を含めたA6 TCRα鎖細胞外アミノ酸配列である。図３ｂは、新規ジスルフィド鎖間結合を生成させるために使用したＳ_５７→Ｃ突然変異（下線部）を含めたA6 TCRβ鎖細胞外アミノ酸配列である。 図４は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィによって得られたトレースである。 図５−Ａ．図４に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図４に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。ピーク１はジスルフィドによって連結されていないβ鎖を主として含んでいることが明らかであり、ピーク２は鎖間ジスルフィドによって連結されたTCRヘテロダイマーを含み、ショルダーは鎖間ジスルフィド連結sTCRに混入したＥ．ｃｏｌｉ汚染物質によるものであり、この複製では見え難い。 図６は、図５のピーク１からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィによって得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。 図７は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ複合体に対するジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの特異的結合のBIAcore応答曲線である。挿入グラフは、ジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答である。 図８ａは、突然変異してＢａｍＨｌ制限酵素切断部位が組み込まれた新規システイン残基を含むA6 TCRα鎖配列である。陰影付きの部分は、導入されてＢａｍＨｌ制限酵素切断部位を形成した突然変異を示す。図８ｂ及び８ｃは、突然変異して追加のシステイン残基を含み非天然(non-native)ジスルフィド結合を形成するＪＭ２２ TCRのα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列である。 図９ａ及び９ｂは、それぞれ図８ａ及び８ｂのＤＮＡ配列から産生されるＪＭ２２ TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列である。 図１０は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性ジスルフィド連結ＪＭ２２ TCRの陰イオン交換クロマトグラフィによって得られたトレースである。 図１１ａは、図１０に示すカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。図１１ｂは、図１０に示すカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。ピーク１が鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含んでいるのは明らかである。 図１２は、図１０のピーク１からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィによって得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。収率は８０％である。 図１３−Ａ．ＨＬＡ−Ｆｌｕ複合物に対するジスルフィド連結ＪＭ２２可溶性TCRの特異的結合のBIAcore応答曲線である。Ｂ．ジスルフィド連結ＪＭ２２可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答である。 図１４ａ及び１４ｂは、突然変異して追加のシステイン残基を含み非天然ジスルフィド結合を形成したＮＹ−ＥＳＯのα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列である。 図１５ａ及び１５ｂは、それぞれ図１４ａ及び１４ｂのＤＮＡ配列から産生されたNY-ESO TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列である。 図１６は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性ＮＹ−ＥＳＯジスルフィド連結TCRの陰イオン交換クロマトグラフィによって得られたトレースである。 図１７−Ａ．図１６に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図１６に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。ピーク１及び２が、鎖間ジスルフィドによって連結されたTCRヘテロダイマーを含んでいることは明らかである。 図１８ 図１７のピーク１（Ａ）及びピーク２（Ｂ）からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィを示すグラフである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。 図１９は、ＨＬＡ−NYESO複合体に対するジスルフィド連結ＮＹ−ＥＳＯ可溶性TCRの特異的結合のBIAcore応答曲線である。Ａ．ピーク１、Ｂ．ピーク２。 図２０ａ及び２０ｂは、（陰影付きで示された）新規システインコドンを導入するように突然変異した可溶性NY-ESO TCRのそれぞれα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列である。これらの配列は、（太字のコドンで示された）天然ジスルフィド鎖間結合に関与するシステインを含む。 図２１ａ及び２１ｂは、それぞれ図２０ａ及び２１ｂのＤＮＡ配列から産生されるNY-ESO TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列である。 図２２は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図２３は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRα^ｃｙｓの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図２４は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRβ^ｃｙｓの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図２５は、図２２〜２４の陰イオン交換カラム分析からのそれぞれNY-ESO TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓ、TCRα^ｃｙｓ、TCRβ^ｃｙｓ各画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。レーン１及び７はＭＷマーカーであり、レーン２はNYESOdsTCRlg4 α-cys βピーク（EB/084/033）であり、レーン３はNYESOdsTCRlg4 α-cys β小ピーク（EB/084/033）であり、レーン４はNYESOdsTCRlg4 α β-cys（EB/084/034）であり、レーン５はNYESOdsTCRlg4 α-cys β-cys小ピーク（EB/084/035）であり、レーン６はNYESOdsTCRlg4 α-cys β-cysピーク（EB/084/035）である。 図２６は、図２２〜２４それぞれの陰イオン交換カラム分析からのNY-ESO TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓ、TCRα^ｃｙｓ、及びTCRβ^ｃｙｓ各画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。レーン１及び７はＭＷマーカーであり、レーン２はNYESOdsTCRlg4 α-cys βピーク（EB/084/033）であり、レーン３はNYESOdsTCRlg4 α-cys β小ピーク（EB/084/033）であり、レーン４はNYESOdsTCRlg4 α β-cys（EB/084/034）であり、レーン５はNYESOdsTCRlg4 α-cys β-cys小ピーク（EB/084/035）であり、レーン６はNYESOdsTCRlg4 α-cys β-cysピーク（EB/084/035）である。 図２７は、図２２からプールされた画分のタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓのサイズ排除交換クロマトグラフィから得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。 図２８は、図２２からプールされた画分のタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRα^ｃｙｓのサイズ排除交換クロマトグラフィから得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。 図２９は、図２２からプールされた画分のタンパク質溶出を示す、可溶性NY-ESO TCRβ^ｃｙｓのサイズ排除交換クロマトグラフィから得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。 図３０は、HLA-NY-ESO複合体に対するNY-ESO TCRα^ｃｙｓβ^ｃｙｓの特異的結合のBIAcore応答曲線である。 図３１は、HLA-NY-ESO複合体に対するNY-ESO TCRα^ｃｙｓの特異的結合のBIAcore応答曲線である。 図３２は、HLA-NY-ESO複合体に対するNY-ESO TCRβ^ｃｙｓの特異的結合のBIAcore応答曲線である。 図３３ａ及び３３ｂは、（陰影付きで示された）新規システインコドンを導入するように突然変異した可溶性ＡＨ−１．２３ TCRのそれぞれα鎖及びβ鎖のＤＮＡ配列である。これらの配列は、（太字のコドンによって示される）天然ジスルフィド鎖間結合に関与するシステインを含む。 図３４ａ及び３４ｂは、図３３ａ及び３３ｂの各ＤＮＡ配列から産生されるＡＨ−１．２３ TCRα鎖及びβ鎖の細胞外アミノ酸配列である。 図３５は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、可溶性ＡＨ−１．２３ TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図３６は、図３５における陰イオン交換カラム分析のＡＨ−１．２３ TCR画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、クーマシー染色）を示す図である。試験したタンパク質は、リフォールディング体３からのTCR １．２３ Ｓ−Ｓの陰イオン交換画分である。レーン１はＭＷマーカーであり、レーン２はＢ４であり、レーン３はＣ２であり、レーン４はＣ３であり、レーン５はＣ４であり、レーン６はＣ５であり、レーン７はＣ６であり、レーン８はＣ７であり、レーン９はＣ８であり、レーン１０はＣ９である。 図３７は、図３５における陰イオン交換カラム分析のＡＨ−１．２３ TCR画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、クーマシー染色）を示す図である。試験したタンパク質は、リフォールディング体３からのTCR １．２３ Ｓ−Ｓの陰イオン交換画分である。レーン１はＭＷマーカーであり、レーン２はＢ４であり、レーン３はＣ２であり、レーン４はＣ３であり、レーン５はＣ４であり、レーン６はＣ５であり、レーン７はＣ６であり、レーン８はＣ７であり、レーン９はＣ８であり、レーン１０はＣ９である。 図３８は、図３５からプールされた画分のタンパク質溶出を示す、可溶性ＡＨ−１．２３ TCRのサイズ排除交換クロマトグラフィから得られたトレースである。このタンパク質は、ヘテロダイマーに対応する単一の主ピークとして溶出する。 図３９ａ及び３９ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基４８に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４０ａ及び４０ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基４５に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４１ａ及び４１ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基６１に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４２ａ及び４２ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基５０に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４３ａ及び４３ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基１０に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４４ａ及び４４ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基１５に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４５ａ及び４５ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基１２に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４６ａ及び４６ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基２２に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４７ａ及び４７ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基５２に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４８ａ及び４８ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基４３に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図４９ａ及び４９ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１中の残基５７に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのα鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５０ａ及び５０ｂは、TRBC２^＊０１のエキソン１中の残基７７に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５１ａ及び５１ｂは、TRBC２^＊０１のエキソン１中の残基１７に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５２ａ及び５２ｂは、TRBC２^＊０１のエキソン１中の残基１３に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５３ａ及び５３ｂは、TRBC２^＊０１のエキソン１中の残基５９に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５４ａ及び５４ｂは、TRBC２^＊０１のエキソン１中の残基７９に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５５ａ及び５５ｂは、TRBC２^＊０１のエキソン１中の残基１４に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５６ａ及び５６ｂは、TRBC２^＊０１のエキソン１中の残基５５に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５７ａ及び５７ｂは、TRBC２^＊０１のエキソン１中の残基６３に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５８ａ及び５８Ｂは、TRBC２^＊０１のエキソン１中の残基１５に新規システインを導入するように突然変異した可溶性A6 TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。陰影付きのヌクレオチドは導入された新規システインコドンを示し、下線のアミノ酸は導入されたシステインを示す。 図５９は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図６０は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図６１は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図６２は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図６３は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図６４は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたＰＯＲＯＳ ５０カラムからのタンパク質溶出を示す、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５５との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィから得られたトレースである。 図６５ａ及び６５ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図５９の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図６６ａ及び６６ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６０の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図６７ａ及び６７ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６１の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図６８ａ及び６８ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６２の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図６９ａ及び６９ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６３の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図７０ａ及び７０ｂは、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのそれぞれ還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。画分を図６４の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図７１は、Superdex ２００ ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図５９の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図７２は、Superdex ２００ ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６０の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図７３は、Superdex ２００ ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６１の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図７４は、Superdex ２００ ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６２の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図７５は、Superdex ２００ ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC^＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６３の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図７６は、Superdex ２００ ＨＬゲルろ過カラムからのタンパク質溶出を示す、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRのサイズ排除クロマトグラフィから得られたトレースである。画分を図６４の陰イオン交換カラム分析から収集した。 図７７は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ ｐＭＨＣに対する、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、及びTRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。 図７８は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ ｐＭＨＣに対する、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、及びTRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。 図７９は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ ｐＭＨＣに対する、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、及びTRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。 図８０は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ ｐＭＨＣに対する、それぞれTRAC^＊０１のエキソン１の残基４８とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基７７との間、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１０とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１７との間、及びTRAC^＊０１のエキソン１の残基４５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５９との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。 図８１は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ及びＨＬＡ−Ａ２−ＮＹ−ＥＳＯ ｐＭＨＣに対する、TRAC^＊０１のエキソン１の残基５２とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基５５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの非特異的結合を示すBIAcoreトレースである。 図８２は、ＨＬＡ−Ａ２−ｔａｘ ｐＭＨＣに対する、TRAC^＊０１のエキソン１の残基１５とTRBC２^＊０１のエキソン１の残基１５との間の新規ジスルフィド鎖間結合を含む可溶性A6 TCRの結合を示すBIAcore応答曲線である。 図８３ａは、１ＢＤ２配列を含むモデルの周囲の電子密度地図である（鎖Ａ Ｔｈｒ１６４、鎖Ｂ Ｓｅｒ １７４）。地図には、１．０、２．０及び３．０σの等高線が記されている。図８３ｂは、２つの位置Ａ１６４及びＢ１７４においてＣｙｓで改良（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）した後の電子密度地図である。この地図も、図８３ａと同じσレベルで等高線が記されている。 図８４は、１ＢＤ２ TCRの構造を本発明のNY-ESO TCRの構造と、リボン表示及びコイル表示で前記各構造を重ね合わせることによって比較した図である。 図８５ａ及び８５ｂは、ビオチン認識部位が導入されたNY-ESO TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。ビオチン認識部位を強調して示す。 図８６ａ及び８６ｂは、ヘキサ−ヒスチジンタグを導入したNY-ESO TCRのβ鎖のそれぞれＤＮＡ配列及びアミノ酸配列である。ヘキサ−ヒスチジンタグを強調して示す。 図８７は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQ陰イオン交換カラムからの新規ジスルフィド結合及びビオチン認識配列を含む可溶性NY-ESO TCRの溶出を示すグラフである。 図８８は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQ陰イオン交換カラムからの新規ジスルフィド結合及びヘキサ−ヒスチジンタグを含む可溶性NY-ESO TCRの溶出を示すグラフである。 図８９は、図８７に示したＮＹ−ＥＳＯ−ビオチンタグ付き陰イオン交換カラム分析からプールされた画分のゲルろ過クロマトグラフィによるタンパク質溶出プロファイルである。 図９０は、図８８に示したＮＹ−ＥＳＯ−ヘキサ−ヒスチジンタグ付き陰イオン交換カラム分析からプールされた画分のゲルろ過クロマトグラフィによるタンパク質溶出プロファイルである。 図９１ａ〜ｈは、それぞれ以下の濃度のＮＹ−ＥＳＯペプチド及び蛍光NY-ESO TCR四量体と共にインキュベートしたＨＬＡ−Ａ２陽性ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系（ＰＰ ＬＣＬ）を２５，０００回測定して得られた染色強度を示すＦＡＣＳヒストグラムである。NYESO ０ TCR ５μｇ、NYESO １０^−４Ｍ TCR ５μｇ、NYESO １０^−５Ｍ TCR ５μｇ、NYESO １０^−６Ｍ TCR ５μｇ、NYESO ０ TCR １０μｇ、NYESO １０^−４Ｍ TCR １０μｇ、NYESO １０^−５Ｍ TCR １０μｇ、NYESO １０^−６Ｍ TCR １０μｇ。 図９１−１の説明に同じ。 図９１−１の説明に同じ。 図９２は、TRBC１^＊０１定常領域が組み込まれたA6 TCRのベータ鎖のＤＮＡ配列である。 図９３は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示した、TRBC１^＊０１定常領域が組み込まれた可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィのトレースである。 図９４−Ａ．図９３に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図９３に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。 図９５は、図９３のピーク２からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィを示すグラフである。ピーク１は、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含む。 図９６−Ａ．ＨＬＡ−Ｆｌｕ複合体に対するジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの特異的結合のBIAcore分析結果を示すグラフである。Ｂ．ジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答を示すグラフである。 図９７は、「フリーの」システインが組み込まれたA6 TCRの突然変異ベータ鎖の核酸配列である。 図９８は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、「フリーの」システインが組み込まれた可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィを示すグラフである。 図９９−Ａ．図９８に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図９８に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。 図１００は、図９８のピーク２からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィを示す図である。ピーク１は、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含む。 図１０１−Ａ．ＨＬＡ−Ｆｌｕ複合体に「フリーの」システインが組み込まれたジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの特異的結合のBIAcore分析結果を示すグラフである。Ｂ．ジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答を示すグラフである。 図１０２は、「フリーの」システインが突然変異したセリン残基が組み込まれたA6 TCRの突然変異ベータ鎖の核酸配列である。 図１０３は、点線で示した０〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いたPOROS 50HQカラムからのタンパク質溶出を示す、「フリーの」システインが突然変異したセリン残基が組み込まれた可溶性A6 TCRの陰イオン交換クロマトグラフィを示すグラフである。 図１０４−Ａ．図１０３に示したカラム分析画分の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。Ｂ．図１０３に示したカラム分析画分の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クーマシー染色）を示す図である。ピーク２が、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含んでいることは明らかである。 図１０５は、図１０３のピーク２からプールされた画分のサイズ排除クロマトグラフィを示すグラフである。ピーク１は、鎖間ジスルフィド連結されたTCRヘテロダイマーを含む。 図１０６−Ａ．「フリーの」システインが突然変異したセリン残基が組み込まれたジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRのＨＬＡ−Ｆｌｕ複合体に対する特異的結合のBIAcore分析結果を示すグラフである。Ｂ．ジスルフィド連結Ａ６可溶性TCRの単回投与の対照と比較した結合応答を示すグラフである。 図１０７は、ｐＹＸ１１２のヌクレオチド配列である。 図１０７−１の説明に同じ。 図１０８は、ｐＹＸ１２２のヌクレオチド配列である。 図１０７−１の説明に同じ。 図１０９は、TCRα鎖に融合したプレプロα接合因子のＤＮＡ配列及びタンパク質配列である。 図１１０は、TCRβ鎖に融合したプレプロα接合因子のＤＮＡ配列及びタンパク質配列である。 図１１１は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌株ＳＥＹ６２１０において発現される可溶性TCRのウェスタンブロットの写真である。レーンＣは、対照として精製可溶性NY-ESO TCR ６０ｎｇを含む。レーン１及び２は、２つの別個のTCR形質転換酵母培養物から収集したタンパク質を含む。 図１１２は、ｐＥＸ１７２プラスミドのＫｐｎＩ〜ＥｃｏＲＩ挿入断片の核酸配列である。プラスミドの残部は、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−である。 図１１３は、バキュロウイルスにクローニングするためのTCR鎖の概略図である。 図１１４は、ｐＡｃＡＢ３発現プラスミドに挿入するためのＢａｍＨＩ挿入断片としてのジスルフィドＡ６ α TCR構築物の核酸配列である。 図１１５は、ｐＡｃＡＢ３発現プラスミドに挿入するためのＢａｍＨＩ挿入断片としてのジスルフィドＡ６ β TCR構築物を示す図である。 図１１６は、細菌によって産生されたジスルフィドA6 TCR及び昆虫ジスルフィドA6 TCRに対するクーマシー染色ゲル及びウェスタンブロットを示す写真である。

Claims (32)

1. （ｉ）膜貫通ドメインを除くTCRα鎖の全部又は一部と、（ｉｉ）膜貫通ドメインを除くTCRβ鎖の全部又は一部とを備えた可溶性Ｔ細胞受容体（sTCR）であって、（ｉ）及び（ｉｉ）が、それぞれ、TCR鎖の機能的可変ドメインと定常ドメインの少なくとも一部とを備え、定常ドメイン残基の間が天然のTCR中には存在しないジスルフィド結合によって連結されている、可溶性Ｔ細胞受容体。
2. （ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は双方が、TCR鎖の細胞外定常Ｉｇドメインの全部を備える、請求項１に記載のsTCR。
3. （ｉ）及び（ｉｉ）の一方又は双方が、TCR鎖の細胞外ドメインの全部を備える、請求項１又は２に記載のsTCR。
4. 可溶性αβ型Ｔ細胞受容体（sTCR）であって、共有ジスルフィド結合が、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する、可溶性αβ型Ｔ細胞受容体。
5. 天然のTCR中の鎖間ジスルフィド結合が存在しない、先行する請求項の何れかに記載のsTCR。
6. 天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が除外されるように、天然のα及びβ TCR鎖のＣ末端が切断されている、請求項５に記載のsTCR。
7. 天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が別の残基に置換されている、請求項５に記載のsTCR。
8. 天然の鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基がセリン又はアラニンに置換されている、請求項７に記載のsTCR。
9. 天然のTCR β鎖中に存在する対を成していないシステイン残基が存在しない、先行する請求項の何れかに記載のsTCR。
10. 天然のTCR中に存在しない前記ジスルフィド結合が、天然のTCR構造中においてβ炭素原子が０．６ｎｍ未満離れている残基を置換するシステインの間でなされている、先行する請求項の何れかに記載のsTCR。
11. 天然のTCR中に存在しない前記ジスルフィド結合が、TRAC^＊０１のエキソン１のＴｈｒ４８を置換するシステイン残基とTRBC１^＊０１又はTRBC２^＊０１のエキソン１のＳｅｒ５７を置換するシステイン残基との間でなされている、先行する請求項の何れかに記載のsTCR。
12. 天然のTCR中に存在しない前記ジスルフィド結合が、TRAC^＊０１のエキソン１のＴｈｒ４５を置換するシステイン残基とTRBC１^＊０１又はTRBC２^＊０１のエキソン１のＳｅｒ７７を置換するシステイン残基との間でなされている、請求項１乃至１０の何れか１項に記載のsTCR。
13. 天然のTCR中に存在しない前記ジスルフィド結合が、TRAC^＊０１のエキソン１のＴｙｒ１０を置換するシステイン残基とTRBC１^＊０１又はTRBC２^＊０１のエキソン１のＳｅｒ１７を置換するシステイン残基との間でなされている、請求項１乃至１０の何れか１項に記載のsTCR。
14. 天然のTCR中に存在しない前記ジスルフィド結合が、TRAC^＊０１のエキソン１のＴｈｒ４５を置換するシステイン残基とTRBC１^＊０１又はTRBC２^＊０１のエキソン１のＡｓｐ５９を置換するシステイン残基との間でなされている、請求項１乃至１０の何れか１項に記載のsTCR。
15. 天然のTCR中に存在しない前記ジスルフィド結合が、TRAC^＊０１のエキソン１のＳｅｒ１５を置換するシステイン残基とTRBC１^＊０１又はTRBC２^＊０１のエキソン１のＧｌｕ１５を置換するシステイン残基との間でなされている、請求項１乃至１０の何れか１項に記載のsTCR。
16. 請求項１、２、及び５乃至１５の何れか１項に記載のsTCRであって、（ｉ）及び（ｉｉ）が、それぞれ、第二のTCRの定常ドメインの全部又は一部に融合された第一のTCRの機能的可変ドメインを備え、前記第一及び第二のTCRが同一の種から得られたものである、sTCR。
17. 前記第二のTCRの定常ドメインが、前記天然に存在しない鎖間ジスルフィド結合を形成する残基のＮ末端側において切断されている、請求項１６に記載のsTCR。
18. 前記鎖の一方又は双方のＣ末端又はＮ末端が或る成分で誘導体化され又は該成分に融合されている、先行する請求項の何れかに記載のsTCR。
19. 前記鎖の一方又は双方が、成分を融合することができるシステイン残基をＣ末端及び／又はＮ末端に有する、先行する請求項の何れかに記載のsTCR。
20. 検出可能な標識をさらに備える、先行する請求項の何れかに記載のsTCR。
21. 治療剤が会合された、先行する請求項の何れかに記載のsTCR。
22. 先行する請求項の何れかに記載のsTCRを複数備えた、多価Ｔ細胞受容体（TCR）複合体。
23. sTCR多量体を備えた、請求項２２に記載の複合体。
24. 好ましくはリンカー分子を介して互いに会合した２又は３又は４以上のＴ細胞受容体分子を備えた、請求項２３に記載の複合体。
25. 前記sTSR又はsTCR多量体が脂質二重層中に存在するか又は粒子に付着されている、請求項２２、２３、又は２４に記載の複合体。
26. ＭＨＣ−ペプチド複合体を検出する方法であって、
    （ｉ）請求項１乃至２１の何れか１項に記載された可溶性TCR又は請求項２２乃至２５の何れか１項に記載された多価Ｔ細胞受容体複合体を準備することと、
    （ｉｉ）前記可溶性TCR又は多価TCR複合体をＭＨＣ−ペプチド複合体と接触させることと、
    （ｉｉｉ）前記ＭＨＣ−ペプチド複合体への前記可溶性TCR又は多価TCR複合体の結合を検出することと、
    を備えた方法。
27. 薬学的に許容される担体とともに、請求項１乃至２１の何れか１項に記載のsTCR及び／又は請求項２２乃至２５の何れか１項に記載の多価TCR複合体を備えた薬学的製剤。
28. 請求項１乃至２１の何れか１項に記載のsTCRの（ｉ）若しくは（ｉｉ）をコードする配列又はこれに相補的な配列を備えた核酸分子。
29. 請求項２８に記載の核酸分子を備えたベクター。
30. 請求項２９に記載のベクターを備えた宿主細胞。
31. 請求項１乃至２１の何れか１項に記載された（ｉ）又は（ｉｉ）を得る方法であって、前記ペプチドを発現せしめる条件下で、請求項３０に記載の宿主細胞をインキュベートした後に、前記ポリペプチドを精製することを備えた方法。
32. 適切なリフォールディング条件下で、（ｉ）と（ｉｉ）を混合することをさらに備えた、請求項３１に記載の方法。

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