KR20230111186A

KR20230111186A - Mage-a3 특이적 t 세포 수용체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20230111186A
Application number: KR1020237013602A
Authority: KR
Inventors: 카트린 다파리; 트리스탄 홀랜드; 크리스티안 엘링거
Original assignee: 메디진 이뮤노테라피스 게엠바하
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2023-07-25
Also published as: CA3193172A1; CN116615446A; IL301554A; US20230340064A1; EP4217379A1; AU2021347595A9; BR112023005296A2; AU2021347595A1; JP2023542208A; WO2022063965A1; MX2023003371A

Abstract

본 발명은 MAGE-A3 유래 펩티드에 특이적인 단리된 T 세포 수용체 (TCR), 및 TCR의 기능성 부분을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 다가 TCR 복합체, TCR을 코딩하는 핵산 서열, TCR을 발현하는 세포 및 TCR을 포함하는 제약 조성물이 추가로 포함된다. 본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 TCR, 특히, 암 치료에서 사용하기 위한 TCR에 관한 것이다.

Description

MAGE-A3 특이적 T 세포 수용체 및 그의 용도

본 발명은 MAGE-A3 유래 펩티드에 특이적인 단리된 T 세포 수용체 (TCR), 및 TCR의 기능성 부분을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 다가 TCR 복합체, TCR을 코딩하는 핵산, TCR을 발현하는 세포 및 TCR을 포함하는 제약 조성물이 추가로 포함된다. 본 발명은 또한 의약으로 사용하기 위한 TCR, 특히, 암 치료에서 사용하기 위한 TCR에 관한 것이다.

흑색종 연관 항원 3으로도 불리는 MAGE-A3은 서로 높은 상동성을 갖는 다수의 단백질을 코딩하는 MAGE-A 유전자 패밀리의 구성원이다. MAGE-A 항원은 암/고환 항원 (CTA) 패밀리에 속하고, 분자 수준에서 확인된 최초의 인간 종양 연관 항원이었다 (Science 1991. 254: 1643-1647/ republished in J. Immunol. 2007; 178:2617-2621). MAGE-A 유전자 패밀리는 염색체 Xq28 상에 위치하는 12개의 고도로 상동성인 유전자를 포함한다. 그의 발현은 조직학적 기원이 상이한 암, 예컨대, 비소세포 폐암, 방광암, 식도암, 두부경부암 및 육종 뿐만 아니라, 골수종, 특정 유형의 유방암에서, 및 생식 세포에서도 일관되게 검출된다 (Front Med (Lausanne). 2017; 4: 18.). MAGE-A3은 사이토졸/세포질 단백질이고, MAGE-A3 단백질로부터 유래된 펩티드는 MHC-클래스 I 배경에, 즉, 인간 백혈구 항원 (HLA) 분자 상에 제시된다. 더욱 구체적으로, MAGE-A3 유래 에피토프는 HLA-A1 분자 상에 제시되며, 이는 T 세포-매개 암 면역요법에 대해 유망한 표적으로서의 적합성을 나타내는 것이다. 입양 세포 전달 (ACT)을 이용한 암 면역요법의 원리를 통해 환자 자신의 면역계를 이용한 고도로 종양 특이적인 암 치료가 가능해진다. ACT는 MAGE-A3과 같은 세포내 단백질로부터 유래된 정의된 에피토프에 대하여 특이성을 갖는 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하도록 유전자 조작된 생체외 확장된 자가 (환자 유래) T 세포를 이용한다.

HLA-A*01:01-제한 MAGE-A3 (EVDPIGHLY; 서열식별번호(SEQ ID NO:) 1)에 대한 친화성 강화 TCR의 개방 표지 시험에서, 심각한 부작용이 발생하였다. 연구에서는 심장 조직의 T 세포 침윤에 기인하여 심근 손상이 나타났다. 분자 수준에서의 연구에 따르면, TCR은 횡문근 단백질인 티틴의 유사한 에피토프와 교차 반응한다는 것 또한 밝혀졌다 ([Cameron, et al. Science Tranlational Medcine 5 (197): 1-11;2013]; [Linetteet al. Blood, 122(6), 863-871; 2013]).

따라서, 오직 종양 특이적/제한 항원 MAGE-A3만을 표적화하고, 이로써, 암 면역요법에 대한 탁월한 잠재력을 갖는 매우 효율적인 TCR이 여전히 요구되고 있다. 따라서, 건강한 조직에 대한 교차 반응성이 전혀 없거나, 또는 매우 낮은, MAGE-A3을 표적화하는 상기의 특이적 TCR이 요구되고 있다.

본 발명의 한 목적은 MAGE-A3에 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 제공하는 것이다. 특히, TCR은 서열식별번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 MAGE-A3 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있다. 바람직하게는 TCR은 서열식별번호 1의 아미노산 서열의 HLA-A1 결합된 형태를 특이적으로 인식하고, 더욱 바람직하게는 TCR은 HLA-A*01:01 코딩된 분자에 의해 제시되는 서열식별번호 1의 아미노산 서열을 특이적으로 인식한다.

에피토프의 단편은 상기 항원에 특이적인, 즉, 포유동물, 특히, 인간의 또 다른 단백질 또는 펩티드에는 존재하지 않는 단백질 서열일 수 있다. 단편은 항원의 서열보다 짧을 수 있고, 예컨대, 항원보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 90% 더 짧을 수 있다. 단편의 길이는 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15개 또는 그 초과의 아미노산 길이일 수 있다.

구체적인 실시양태에서, TCR은 서열식별번호 54의 아미노산 서열 또는 그의 단편의 티틴 에피토프를 인식하지 못한다. 원치않는 심각한 부작용을 피하기 위해 티틴 유래 에피토프와의 교차 반응이 없거나, 또는 실질적으로 없는 것이 바람직하다.

서열식별번호 1의 에피토프에 대한 종래 기술에서 기술된 TCR은 심각한 부작용을 유발하는 것으로 나타났다. 또한, 서열식별번호 1의 MAGE-A3 에피토프와 유사한 서열식별번호 54의 티틴 에피토프에의 종래 기술 TCR의 결합으로 인해 이상 반응이 발생한 것으로 나타났다. 따라서, 인간 치료에 사용되는 MAGE-A3, 특히, 서열식별번호 1의 에피토프에 대한 TCR이 티틴 유래 에피토프, 특히, 서열식별번호 54의 티틴 에피토프에 결합하여 활성화되지 않는다는 것이 중요하다.

바람직하게는 TCR은 다른 MAGE-A 패밀리 구성원, 구체적으로, MAGE-A6에 대해 교차 반응성을 보이지 않는다.

구체적인 실시양태에서, 단리된 TCR은

a) - 서열식별번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR α 쇄, 및

- 서열식별번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 쇄; 또는

b) - 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR α 쇄, 및

- 서열식별번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 쇄; 또는

c) - 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR α 쇄, 및

- 서열식별번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 쇄를 포함한다.

TCR은 추가로

a) 서열식별번호 8과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는

b) 서열식별번호 16과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 17과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는

c) 서열식별번호 24와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 25와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역에 의해 정의될 수 있다.

본 발명에 따른 TCR은 단리 및/또는 정제된 것이고, 가용성 또는 막 결합된 것일 수 있다.

일부 실시양태에서, TCR의 아미노산 서열은 하나 이상의 표현형상의(phenotypically) 침묵 치환을 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 TCR은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 추가로, 또는 대안적으로, 아미노산 서열은 치료제 또는 약동학적 변형 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. 치료제는 면역 이펙터 분자, 세포독성제 및 방사성핵종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 면역 이펙터 분자는 예를 들어, 시토카인일 수 있다. 약동학적 변형 모이어티는 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 반복 단위, 적어도 하나의 글리콜 기, 적어도 하나의 시알릴 기, 또는 그의 조합일 수 있다.

본 발명에 따른 TCR, 특히, 가용성 형태의 TCR은 예컨대, 면역원성 감소, 유체역학적 크기 (용액에서의 크기) 용해도 및/또는 (예컨대, 단백질의 가수 분해에 대한 보호 증강에 의한) 안정성 증가 및/또는 혈청 반감기의 연장을 위해 추가의 기능성 모이어티를 부착시킴으로써 변형될 수 있다. 다른 유용한 기능성 모이어티 및 변형은 환자의 신체에서 본 발명의 TCR을 보유하는 이펙터 숙주 세포를 차단하거나 또는 작동시키는 데, 또는 트랜스제닉 TCR 그 자체를 차단하거나 또는 작동시키는 데 사용될 수 있는 "자살(suicide)" 또는 "안전 스위치(safety switch)"를 포함한다. 글리코실화 패턴이 변경된 TCR 또한 본원에서 구상된다.

TCR, 특히, 가용성 형태의 본 발명의 TCR에 예컨대, 소분자 화합물과 같은 약물 또는 치료 엔티티를 첨가하는 것 또한 구상될 수 있다.

TCR, 특히, 가용성 형태의 본 발명의 TCR은 각 분자의 확인, 추적, 정제 및/또는 단리를 돕는 추가 도메인 (태그)을 도입하기 위해 추가로 변형될 수 있다.

일부 실시양태에서, TCR은 TCR α 쇄 및 TCR β 쇄가 링커 서열에 의해 연결되어 있는 단일 쇄 타입의 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 기능성 부분을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서,

여기서, 기능성 부분은

a) 서열식별번호 2, 3, 4, 5, 6, 및 7의 아미노산 서열, 또는

b) 서열식별번호 10, 11, 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 서열, 또는

c) 서열식별번호 18, 19, 20, 21, 22, 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

구체적인 실시양태에서, 기능성 부분은 TCR α 가변 쇄 및/또는 TCR β 가변 쇄를 포함한다.

적어도 하나의 본원에 기술된 바와 같은 TCR을 포함하는 다가 TCR 복합체를 추가로 고려한다.

따라서, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 TCR을 발현하는 세포, 예컨대, T 세포의 IFN-γ 분비가 HLA-A*01:01 분자에 의해 제시되는 서열식별번호 1의 아미노산 서열에의 결합에 의해 유도되는 것인, 본원에 기술된 바와 같은 단리된 TCR, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드, 본원에 기술된 바와 같은 다가 TCR 복합체에 관한 것이다.

본원에 기술된 바와 같은 TCR을 코딩하거나, 또는 본원에 기술된 바와 같은 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또한 고려된다.

따라서, 또 다른 측면은 본원에 기술된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터로서, 여기서 벡터는 바람직하게 발현 벡터, 더욱 바람직하게는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 벡터에 관한 것이다.

또한, 추가 측면은 본원에 기술된 바와 같은 TCR을 발현하는 세포를 정의한다.

MAGE-A3에 대한 특이성을 매개하는 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서,

바람직하게는 여기서, MAGE-A3 특이성을 매개하는 TCR의 부분이

a) 서열식별번호 4의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 7의 베타 쇄의 CDR3; 또는

b) 서열식별번호 12의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 15의 베타 쇄의 CDR3; 또는

c) 서열식별번호 20의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 23의 베타 쇄의 CDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또한 구상된다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 바와 같은 TCR, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드, 본원에 기술된 바와 같은 다가 TCR 복합체, 본원에 기술된 바와 같은 핵산, 본원에 기술된 바와 같은 벡터, 본원에 기술된 바와 같은 세포, 또는 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

전형적으로, 제약 조성물은 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함한다.

또 다른 측면은 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TCR, 다가 TCR 복합체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 항체에 관한 것이다.

특히, 암이 전립선암, 자궁암, 갑상선암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 편평 세포 암종, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 간세포 암종, 두부경부암, 위암, 자궁내막암, 자궁경부암, 결장직장암, 위 선암종, 담관암종, 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병, 암종, 육종 또는 골육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 암 치료에서 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TCR, 다가 TCR 복합체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 항체에 관한 것이다.

도 1은 3개의 상이한 MAGE-A3 반응성 TCR의 펩티드 선택성을 보여주는 것이다. 시험관내 프라이밍 접근법을 사용하여 MAGE-A3-반응성 T 세포 클론을 단리시키고, 3개의 상이한 TCR 각각에 대해 동일한 TCR을 발현하는 3개의 개별 대표 클론이 제시된다. T 세포 클론을, 관련 펩티드 (EVD) 또는 비관련 펩티드 (ESD)가 로딩되거나, 또는 전장 MAGE-A3을 코딩하는 ivt-RNA가 전기천공된, 이전에 HLA-A1-GFP가 형질도입된 DU-145 세포 (DU-145_A1)와 함께 공동 배양하였다. 시토카인 방출을 분석하기 위해, 24 h 후, 공동 배양 상청액을 수확하고, IFN-γ 농도를 표준 샌드위치 ELISA (BD 인간 IFN-γ ELISA 세트)에 의해 분석하였다.
도 2는 상이한 MAGE-A3-반응성 TCR이 형질도입된 T 세포 및 비형질도입된 T 세포 (UTD)의 MAGE-A3_EVD-MHC-다량체 결합을 보여주는 것이다. CD8 T 세포를 건강한 공여자의 PBMC로부터 단리시키고, 3개의 상이한 MAGE-A3-반응성 TCR을 형질도입시켰다. 형질도입된 CD8⁺ T 세포를 형질도입에 대한 마커로서 불변 베타 1 영역을 사용하여 FACS에 의해 농축시켰다. 상기 세포 확장 후, MAGE-A3_EVD-MHC-다량체 (우측 패널) 또는 CD8 및 Cβ1에 대한 항체 (좌측 패널)로 염색하고, 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 집단을 단일의 생 세포에서 게이팅하였다.
도 3은 MAGE-A3-TCR-트랜스제닉 T 세포가 내인적으로 프로세싱되고, HLA-A1 상에 제시된 MAGE-A3_EVD 펩티드를 선택적으로 인식한다는 것을 보여주는 것이다. DU-145_A1 세포를 mCherry 단독 (음성 대조군), MAGE-A3-mCherry 또는 MAGE-A6-mCherry를 발현하도록 추가 조작하였다. 3명의 공여자의 비형질도입 (UTD) 및 트랜스제닉 T 세포를 관련 펩티드 (EVD)가 언로딩 또는 로딩된 형질도입된 세포와 함께 공동 배양하였다. 표준 ELISA에 의해 공동 배양 상청액 중 IFN-γ 농도를 측정함으로써 표적 세포의 인식을 분석하였다.
도 4는 MAGE-A3-TCR-트랜스제닉 T 세포가 내인성 MAGE-A3-양성 종양 세포주를 인식한다는 것을 보여주는 것이다. 3명의 공여자의 비형질도입 (UTD) 및 트랜스제닉 T 세포를 내인적으로 MAGE-A3-양성 또는 -음성 종양 세포주와 함께 공동 배양하였다. 종양 세포주는 내인적으로 HLA-A1-양성이거나, 또는 HLA-A1 발현을 위해 조작하였다 (TD). 모든 종양 세포주를 언로딩, 또는 관련 펩티드 (EVD)로 로딩하여 시험하였다. 표준 ELISA에 의해 공동 배양 상청액 중 IFN-γ 농도를 측정함으로써 표적 세포의 인식을 분석하였다.

본 발명을 바람직한 실시양태들 중 일부와 관련하여 상세하게 기술하기 전에, 하기의 일반적인 정의를 제공한다.

하기에서 예시적으로 설명된 바와 같은 본 발명은 본원에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들 없이 적합하게 실시될 수 있다.

본 발명은 특정 실시양태에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술되겠지만, 본 발명은 이에 제한되지 않으며, 청구범위에 의해서만 제한된다.

"포함하는(comprising)"이라는 용어가 본 설명 및 청구범위에서 사용되는 경우, 다른 요소를 배제하지 않는다. 본 발명의 목적을 위해, "~로 이루어진"이라는 용어는 "~으로 구성된"이라는 용어의 바람직한 실시양태로 간주된다. 이하, 그룹이 적어도 특정 수의 실시양태를 포함하는 것으로 정의되는 경우, 이는 또한 바람직하게는 이러한 실시양태만으로 이루어진 그룹을 개시하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 목적을 위해, "수득된"이라는 용어는 "수득가능한"이라는 용어는의 바람직한 실시양태인 것으로 간주된다. 이하, 예컨대, 항체가 특정 공급원으로부터 수득가능한 것으로 정의될 경우, 이는 또한 상기 공급원으로부터 수득된 항체를 개시하는 것으로 이해되어야 한다.

단수 명사를 언급할 때 단수 용어, 예컨대 "하나"가 사용되는 경우, 이는 특별히 다른 언급이 없는 한, 상기 명사의 복수를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 "약" 또는 "대략"이라는 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자가 해당 특징의 기술적 효과를 여전히 보장하도록 이해하는 정확도의 차를 나타낸다. 상기 용어는 전형적으로 표시된 수치로부터 ±10%, 바람직하게는 ±5%의 편차를 나타낸다.

기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 그의 상식 또는 의미로 사용된다. 특정 용어에 특정한 의미가 전달되는 경우, 용어의 정의는 해당 용어가 사용되는 맥락에서 하기에 제공될 것이다.

TCR 배경

TCR은 상이한 별개의 두 단백질 쇄, 즉, TCR 알파 (α) 및 TCR 베타 (β) 쇄로 구성된다. TCR α 쇄는 가변 (V), 연결 (J) 및 불변 (C) 영역을 포함한다. TCR β 쇄는 가변 (V), 다양성 (D), 연결 (J) 및 불변 (C) 영역을 포함한다. TCR α 및 TCR β 쇄, 둘 모두의 재배열된 V(D)J 영역은 초가변 영역 (CDR, 상보성 결정 영역)을 함유하고, 그 중 CDR3 영역이 특정 에피토프 인식을 결정한다. TCR α 쇄 및 TCR β 쇄 둘 모두는 C-말단 영역에서 소수성 막횡단 도메인을 함유하고, 짧은 세포질 테일로 끝난다.

전형적으로, TCR은 하나의 α 쇄 및 하나의 β 쇄로 이루어진 이종이량체이다. 상기 이종이량체는 펩티드를 제시하는 MHC 분자에 결합할 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "가변 TCR α 영역" 또는 "TCR α 가변 쇄" 또는 "가변 도메인"은 TCR α 쇄의 가변 영역을 지칭한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "가변 TCR β 영역" 또는 "TCR β 가변 쇄"는 TCR β 쇄의 가변 영역을 지칭한다.

TCR 유전자좌 및 유전자는 국제 면역유전학(International Immunogenetics, IMGT) TCR 명명법을 사용하여 명명된다 (IMGT 데이터베이스(IMGT Database), www. IMGT.org; 문헌 [Giudicelli, V., et al. IMGT/LIGM-DB, the IMGT® comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979]; [T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12- 441352-8]).

표적

본원에 기술된 바와 같은 TCR에 대한 표적은 MAGE-A3 (NCBI 레퍼런스 시퀀스(NCBI Reference Sequence): NP_005353.1 유래 펩티드 EVD (서열식별번호 1))이다.

따라서, TCR은 서열식별번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 갖는 MAGE-A3 에피토프를 특이적으로 인식할 수 있다. 바람직하게는 TCR은 서열식별번호 1의 아미노산 서열의 HLA-A1 결합된 형태를 특이적으로 인식하고, 더욱 바람직하게는 TCR은 HLA-A*01:01 코딩된 분자에 의해 제시되는 서열식별번호 1의 아미노산 서열을 특이적으로 인식한다.

단편은 상기 항원에 특이적인, 즉, 포유동물, 특히, 인간의 또 다른 단백질 또는 펩티드에는 존재하지 않는 항원의 서열일 수 있다. 단편은 항원의 서열보다 짧을 수 있고, 예컨대, 항원보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 90% 더 짧을 수 있다. 단편의 길이는 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15개 또는 그 초과의 아미노산 길이일 수 있다.

TCR 특이적 서열

일부 실시양태는

- 서열식별번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 쇄를 포함하는 단리된 TCR에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, TCR은

c) 서열식별번호 24와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 25와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "적어도 80% 동일한," 특히 "적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는"이라는 것은 아미노산 서열이 기술된 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다는 것을 포함한다.

다중 서열들 간의 동일성(%) 결정은 바람직하게 벡터 NTI 어드밴스™ 10(Vector NTI Advance^TM 10) 프로그램 (인비크로겐 코포레이션(Invitrogen Corporation: 미국 캘리포니아주 칼즈배드))의 AlignX 응용프로그램을 사용하여 달성된다. 상기 프로그램은 수정된 Clustal W 알고리즘을 사용한다 ([Thompson et al., 1994. Nucl Acids Res. 22: pp. 4673-4680]; [Invitrogen Corporation; Vector NTI Advance™ 10 DNA and protein sequence analysis software. User's Manual, 2004, pp.389-662]). 동일성(%) 결정은 AlignX 응용프로그램의 표준 파라미터를 이용하여 수행된다.

바람직한 실시양태는

a) 서열식별번호 8의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 9의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는

b) 서열식별번호 16의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 17의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는

c) 서열식별번호 24의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 25의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역을 포함하는 TCR에 관한 것이다.

본 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 TCR은 MAGE-A3에 특이적이고, 다른 에피토프 또는 항원에 대해 매우 낮은 교차 반응성을 나타낸다. 특히, 본 실시예는 서열식별번호 54의 유사한 티틴 에피토프에 대해 실질적인 교차 반응성이 없다는 것을 보여준다. 또한, 본 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, MAGE-A 패밀리의 다른 항원, 예컨대 MAGE-A6에 대해서도 실질적인 교차 반응성이 없다.

구체적인 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 TCR은 서열식별번호 50과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR α 영역, 및 서열식별번호 51과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR β 영역을 포함한다.

따라서, 더욱 구체적으로, 일부 실시양태에서, TCR은

a) 서열식별번호 8과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가변 TCR α 영역, 서열식별번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가변 TCR β 영역, 서열식별번호 50과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR α 영역, 및 서열식별번호 51과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR β 영역; 또는

b) 서열식별번호 16과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가변 TCR α 영역, 서열식별번호 17과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가변 TCR β 영역, 서열식별번호 50과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR α 영역, 및 서열식별번호 51과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR β 영역; 또는

c) 서열식별번호 24와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가변 TCR α 영역, 서열식별번호 25와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가변 TCR β 영역, 서열식별번호 50과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR α 영역, 및 서열식별번호 51과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR β 영역을 포함할 수 있다.

더욱더 구체적인 실시양태에서, TCR은

a) 서열식별번호 8의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역, 서열식별번호 9의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역, 서열식별번호 50의 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR α 영역, 및 서열식별번호 51의 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR β 영역; 또는

b) 서열식별번호 16의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역, 서열식별번호 17의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역, 서열식별번호 50의 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR α 영역, 및 서열식별번호 51의 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR β 영역; 또는

c) 서열식별번호 24의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역, 서열식별번호 25의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역, 서열식별번호 50의 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR α 영역, 및 서열식별번호 51의 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR β 영역을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 TCR은 단리되거나, 또는 정제된 것이다. 본 발명의 맥락에서 "단리된"이란, TCR이 원래 자연에서 발생했던 환경에 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 맥락에서 "정제된"이란, 예컨대, TCR의 유래 기점이 된 세포의 다른 단백질 및 비-단백질 부분이 없거나, 또는 실질적으로 없다는 것을 의미한다.

일부 실시양태에서, TCR의 아미노산 서열은 하나 이상의 표현형상의 침묵 치환을 포함할 수 있다.

"표현형상의 침묵 치환"은 또한 "보존적 아미노산 치환"으로도 명명된다. "보존적 아미노산 치환"의 개념은 통상의 기술자에 의해 이해되고, 바람직하게는 양으로 하전된 잔기 (H, K, 및 R)를 코딩하는 코돈이 양으로 하전된 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환되고, 음으로 하전된 잔기 (D 및 E)를 코딩하는 코돈은 음으로 하전된 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환되고, 중성 극성 잔기 (C, G, N, Q, S, T, 및 Y)를 코딩하는 코돈은 중성 극성 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환되며, 중성 비-극성 잔기 (A, F, I, L, M, P, V, 및 W)를 코딩하는 코돈은 중성 비-극성 잔기를 코딩하는 코돈으로 치환되는 것을 의미한다. 상기 변이는 자발적으로 발생하거나, 또는 무작위 돌연변이유발에 의해 도입되거나, 또는 유도 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 상기 변화는 상기 폴리펩티드의 본질적인 특성을 파괴하지 않고 이루어질 수 있다. 통상의 기술자는 상기 변이가 리간드 결합 능력을 실질적으로 감소시키거나, 또는 파괴하는지 여부를 결정하기 위해 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 변이체 아미노산 및/또는 그를 코딩하는 핵산을 용이하게 및 통상적으로 스크리닝할 수 있다.

통상의 기술자는 TCR을 코딩하는 핵산 또한 변형될 수 있다는 것을 이해한다. 전체 핵산 서열에서 유용한 변형은 서열의 코돈 최적화를 포함한다. 발현된 아미노산 서열 내에서 보존적 치환을 유도하는 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 변이는 기능에 영향을 미치지 않는 TCR 쇄의 아미노산 서열의 상보성 결정 및 비-상보성 결정 영역에서 이루어질 수 있다. 일반적으로, CDR3 영역에서는 부가 및 결실이 수행되지 않아야 한다.

본 발명의 일부 실시양태에 따라, TCR의 아미노산 서열은 검출가능한 표지, 치료제 또는 약동학적 변형 모이어티를 포함하도록 변형된다.

검출가능한 표지에 대한 비제한적인 예로는 방사성표지, 형광 표지, 핵산 프로브, 효소 및 조영제가 있다. TCR과 회합될 수 있는 치료제로는 방사성 화합물, 면역조정제, 효소 또는 화학요법제를 포함한다. 치료제는 화합물이 표적 부위에서 천천히 방출될 수 있도록 TCR에 연결된 리포솜에 의해 둘러싸일 수 있다. 이는 체내 수송 중 손상을 막고, 치료제, 예컨대, 독소가 관련 항원 제시 세포에 TCR이 결합된 후 최대 효과를 발휘하도록 할 것이다. 치료제의 다른 예로는 펩티드 세포독소, 즉, 예컨대, 리신, 디프테리아 독소, 슈도모나스 박테리아 외독소 A, DNase 및 RNase와 같은 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 단백질 또는 펩티드가 있다. 소분자 세포독성제, 즉, 분자량이 700 달톤 미만인, 포유동물 세포를 사멸시키는 능력을 갖는 화합물. 상기 화합물은 세포독성 효과를 가질 수 있는 독성 금속을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 소분자 세포독성제는 또한 프로드럭, 즉, 생리학적 조건하에서 붕괴되거나, 또는 전환되어 세포독성제를 방출하는 화합물도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기와 같은 작용제로는 예를 들어, 도세탁셀, 젬시타빈, 시스플라틴, 메이탄신 유도체, 라첼마이신, 칼리키아미신, 에토포시드, 이포스파미드, 이리노테칸, 포르피머 소듐 포토프린 II, 테모졸로미드, 토포테칸, 트리메트렉세이트 글루코로네이트, 미톡크산트론, 아우리스타틴 E, 빈크리스틴 및 독소루비신; 방사성핵종, 예컨대, 아이오딘 131, 레늄 186, 인듐 111, 이트륨 90. 비스무트 210 미 213, 악티늄 225 및 아스타틴 213을 포함할 수 있다. 방사성핵종의 TCR 또는 그의 유도체와의 회합은 예를 들어, 킬레이트제; 면역증강물질(immunostimulant)로도 알려진 면역자극제, 즉, 면역 반응을 자극하는 면역 이펙터 분자에 의해 수행될 수 있다. 예시적인 면역자극제로는 시토카인, 예컨대 IL-2 및 IFN-γ, 항-T 세포 또는 NK 세포 결정기 항체 (예컨대, 항-CD3, 항-CD28 또는 항-CD16)를 비롯한, 항체 또는 그의 단편; 항체 유사 결합 특징을 갖는 대안적인 단백질 스캐폴드; 슈퍼항원, 즉, 폴리클로날 T 세포 활성화 및 대량의 시토카인 방출을 초래하는 T-세포의 비-특이적 활성화를 야기하는 항원 및 그의 돌연변이체; 케모카인, 예컨대, IL-8, 혈소판 인자 4, 흑색종 성장 자극 단백질 등, 보체 활성인자; 이종발생 단백질 도메인, 동종이계 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 단백질 도메인, 바이러스/박테리아 펩티드가 있다.

인간 T 림프구 상의 항원 수용체 분자 (T 세포 수용체 분자)는 세포 표면에서 CD3 (T3) 분자 복합체와 비공유결합으로 회합되어 있다. 항-CD3 모노클로날 항체와 상기 복합체의 교란은 T 세포 활성화를 유도한다. 따라서, 일부 실시양태는 항-CD3 항체와 (일반적으로 알파 또는 베타 쇄의 N- 또는 C-말단에의 융합에 의해) 회합된 본원에 기술된 바와 같은 TCR, 또는 상기 항-CD3 항체의 기능성 단편 또는 변이체에 관한 것이다. 본원에 기술된 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 항체 단편 및 변이체/유사체는 미니바디, Fab 단편, F(ab<'>)2단편, dsFv 및 scFv 단편, 나노바디즈(Nanobodies)™ (아블링스(Ablynx: 벨기에)), 카멜리드(camelid) (예컨대, 낙타 또는 라마) 항체로부터 유래된 합성 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인을 포함하는 분자, 및 도메인 항체 (친화성 성숙 단일 면역글로불린 가변 중쇄 도메인 또는 면역글로불린 가변 경쇄 도메인을 포함하는 것 (도만티스(Domantis: 벨기에))) 또는 항체-유사 결합 특징을 나타내는 대안적인 단백질 스캐폴드, 예컨대 어피바디즈(Affibodies) (조작된 단백질 A 스캐폴드 어피바디(Affibody) (스웨덴) 포함) 또는 안티칼린즈(Anticalins) (조작된 안티칼린 피에리스(Pieris) (독일) 포함)을 포함한다.

치료제는 바람직하게 면역 이펙터 분자, 세포독성제 및 방사성핵종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 면역 이펙터 분자는 시토카인이다.

약동학적 변형 모이어티는 예를 들어, 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 반복 단위, 적어도 하나의 글리콜 기, 적어도 하나의 시알릴 기, 또는 그의 조합일 수 있다. 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 반복 단위, 적어도 하나의 글리콜 기, 적어도 하나의 시알릴 기의 회합은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방식으로 야기될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단위는 TCR에 공유결합으로 연결된다. 본 발명에 따른 TCR은 하나 또는 수 개의 약동학적 변형 모이어티에 의해 변형될 수 있다. 특히, 가용성 형태의 TCR은 하나 또는 수 개의 약동학적 변형 모이어티에 의해 변형된다. 약동학적 변형 모이어티는 치료제의 약동학적 프로파일에 유리한 변화, 예를 들어, 혈장 반감기의 개선, 면역원성의 감소 또는 증진 및 용해도 개선을 달성할 수 있다.

본 발명에 따른 TCR은 가용성이거나, 또는 막 결합된 것일 수 있다. "가용성"이라는 용어는 예를 들어, 항원 제시 세포에 치료제를 전달하기 위한 표적화제로서의 용도를 위한 가용성 형태 (즉, 막횡단 또는 세포질 도메인이 없는 형태)의 TCR을 지칭한다. 안정성을 위해, 가용성 αβ 이종이량체 TCR은 바람직하게는 예를 들어, WO 03/020763에 기술된 바와 같이 각각의 불변 도메인의 잔기 사이에 도입된 이황화 결합을 갖는다. 본 발명의 αβ 이종이량체에 존재하는 불변 도메인 중 하나 또는 둘 모두는 예를 들어, 최대 15개, 또는 최대 10개, 또는 최대 8개 이하의 아미노산이 C 말단 또는 C 말단들에서 말단절단될 수 있다. 입양 요법에서 사용하기 위해, αβ 이종이량체 TCR은 예를 들어, 세포질 및 막횡단 도메인 둘 모두를 갖는 전장 쇄로서 형질감염될 수 있다. TCR은 각각의 알파와 베타 불변 도메인 사이에 천연적으로 발견되는 것에 상응하는 이황화 결합을 함유할 수 있고, 추가로 또는 대안적으로, 비-천연 이황화 결합이 존재할 수 있다.

본 발명에 따른 TCR, 특히, 가용성 형태의 TCR은 예컨대, 면역원성 감소, 유체역학적 크기 (용액에서의 크기) 용해도 및/또는 (예컨대, 단백질의 가수 분해에 대한 보호 증강에 의한) 안정성 증가 및/또는 혈청 반감기의 연장을 위해 추가의 기능성 모이어티를 부착시킴으로써 변형될 수 있다.

다른 유용한 기능성 모이어티 및 변형은 환자의 신체에서 본 발명의 TCR을 보유하는 이펙터 숙주 세포를 차단하는 데 사용될 수 있는 "자살" 또는 "안전 스위치"를 포함한다. 한 예로 문헌 [Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235]에 기술되어 있는, 유도성 카스파제 9 (iCasp9) "안전 스위치"가 있다. 간략하면, 이펙터 숙주 세포는 널리 공지된 방법에 의해 이량체화가 예컨대, AP1903/CIP와 같은 소분자 이량체화제 약물에 의존하고, 변형된 이펙터 세포에서 아폽토시스의 빠른 유도를 초래하는 카스파제 9 도메인을 발현하도록 변형된다. 상기 시스템은 예를 들어, EP2173869 (A2)에 기술되어 있다. 다른 "자살," 또는 "안전 스위치"에 대한 예는 예컨대, 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex Virus) 티미딘 키나제 (HSV-TK), CD20의 발현, 및 항-CD20 항체 또는 myc 태그를 이용한 후속 고갈과 같이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Kieback et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15;105(2):623-8).

글리코실화 패턴이 변경된 TCR 또한 본원에서 구상된다. 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 글리코실화 패턴은 아미노산 서열 (예컨대, 하기에서 논의되는, 특정 글리코실화 아미노산 잔기의 존재 또는 부재) 및/또는 단백질이 생산되는 숙주 세포 또는 유기체에 따라 달라질 수 있다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결 중 하나이다. N-연결은 아스파라긴 잔기 측쇄에의 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. 결합 분자에의 N-연결 글리코실화 부위의 부가는 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)으로부터 선택되는 하나 이상의 트리-펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. O-연결 글리코실화 부위는 출발 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가 또는 치환함으로써 도입될 수 있다.

TCR의 글리코실화의 또 다른 수단은 단백질에의 글리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링에 의한 것이다. 사용되는 커플링 모드에 따라, 당(들)은 (a) 아르기닌 및 히스티딘, (b) 유리 카르복실 기, (c) 유리 술프히드릴 기, 예컨대, 시스테인의 것, (d) 유리 히드록실 기, 예컨대, 세린, 트레오닌 또는 히드록시프롤린의 것, (e) 방향족 잔기, 예컨대, 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판의 것, 또는 (f) 글루타민의 아미드 기에 부착될 수 있다. 유사하게, 탈글리코실화 (즉, 결합 분자에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거)는 예컨대, 트리플루오로메탄술폰산에 TCR을 노출시켜 화학적으로, 또는 엔도- 및 엑소-글리코시다제를 이용하여 효소적으로 달성될 수 있다.

TCR, 특히, 가용성 형태의 본 발명의 TCR에 약물, 예컨대, 소분자 화합물을 첨가하는 것 또한 구상될 수 있다. 연결은 공유 결합 또는 예컨대, 정전기력과 같은 비공유 결합 상호작용을 통해 달성될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 다양한 링커들이 약물 접합체를 형성하기 위해 이용될 수 있다.

TCR, 특히, 가용성 형태의 본 발명의 TCR은 각 분자의 확인, 추적, 정제 및/또는 단리를 돕는 추가 도메인 (태그)을 도입하기 위해 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, TCR α 쇄 또는 TCR β 쇄는 변형되어 에피토프 태그를 포함할 수 있다.

에피토프 태그는 본 발명의 TCR에 포함될 수 있는 태그의 유용한 예이다. 에피토프 태그는 특정 항체의 결합을 허용하는 아미노산의 짧은 스트레치이고, 따라서, 가용성 TCR 또는 환자의 신체 내의 숙주 세포 또는 배양된 (숙주) 세포의 결합 및 이동의 확인과 추적을 가능하게 한다. 에피토프 태그, 및 따라서, 태그부착된 TCR의 검출은 다수의 상이한 기술을 이용하여 달성될 수 있다.

태그는 추가로 상기 태그에 대해 특이적인 결합 분자 (항체)의 존재하에 세포를 배양하여 본 발명의 TCR을 보유하는 숙주 세포의 자극 및 확장에 이용될 수 있다.

일반적으로, TCR은 일부 경우에 표적 항원과 TCR의 친화도 및 오프-속도를 변형시키는 다양한 돌연변이로 변형될 수 있다. 특히, 돌연변이는 친화도를 증가시킬 수 있고/거나, 오프-속도를 감소시킬 수 있다. 따라서, TCR은 적어도 하나의 CDR 및 그의 가변 도메인 프레임워크 영역에서 돌연변이화될 수 있다.

그러나, 바람직한 실시양태에서, TCR의 CDR 영역은 예컨대, 실시예의 TCR 수용체와 같이 변형되거나 또는 시험관내 친화성 성숙이 이루어지지 않는다. 이는 CDR 영역이 자연적으로 발생된 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 이는 시험관내 친화성 성숙이 TCR 분자에 대한 면역원성으로 이어질 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 이는 치료 효과 및 치료를 감소시키거나, 또는 불활성화시키고/거나, 부작용을 유도하는 항-약물 항체의 생산으로 이어질 수 있다.

돌연변이는 하나 이상의 치환(들), 결실(들) 또는 삽입(들)일 수 있다. 상기 돌연변이는 예컨대, 예를 들어, 문헌 [Sambrook, Molecular Cloning - 4^th Edition (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기술되어 있는 중합효소 연쇄 반응, 제한 효소 기반 클로닝, 라이게이션 비의존적 클로닝 절차와 같이, 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 도입될 수 있다.

이론적으로, 내인성 및 외인성 TCR 쇄 간의 쌍형성오류에 기인하여 교차 반응성의 위험이 있는 예측불가의 TCR 특이성이 발생할 수 있다. TCR 서열의 쌍형성오류를 피하기 위해, 재조합 TCR 서열은 수개의 상이한 형질도입된 TCR 쇄의 정확한 쌍형성을 효과적으로 증진시키는 것으로 밝혀진 기술로, 최소로 뮤린화된 Cα 및 Cβ 영역을 함유하도록 변형될 수 있다. TCR의 뮤린화 (즉, 알파 및 베타 쇄에서 인간 불변 영역을 그의 뮤린 대응물로 교환)는 숙주 세포에서 TCR의 세포 표면 발현을 개선시키기 위해 통상적으로 적용되는 기술이다. 특정 이론에 제한되는 것을 바라지 않으면서, 뮤린화된 TCR은 CD3 공-수용체와 더욱 효과적으로 회합되고/거나; 우선적으로 서로 쌍을 형성하고, 원하는 항원 특이성의 TCR을 발현하도록 생체외에서 유전적으로 변형된 인간 T 세포 상의 혼합 TCR을 형성하는 경향이 더 작지만, 그의 "원래의" TCR을 여전히 보유하고, 발현하는 것으로 간주된다.

뮤린화된 TCR의 발현 개선을 담당하는 9개의 아미노산이 확인되었고 (Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jun 1; 184(11):6223-31), 그의 뮤린 대응 잔기에 대해 TCR 알파 및/또는 베타 쇄 불변 영역에 있는 하나의 또는 모든 아미노산 잔기를 치환하는 것이 구상된다. 이러한 기술은 "최소 뮤린화"로도 지칭되고, 세포 표면 발현을 증진시키면서, 동시에 아미노산 서열에서 "외래" 아미노산 잔기의 수를 감소시키고, 이로써 면역원성의 위험을 감소시키는 이점을 제공한다.

일부 실시양태는 TCR α 쇄 및 TCR β 쇄가 링커 서열에 의해 연결되어 있는 단일 쇄 타입의 것인, 본원에 기술된 바와 같은 단리된 TCR에 관한 것이다.

적합한 단일 쇄 TCR 형태는 가변 TCR α 영역에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성되는 제1 세그먼트, TCR β 쇄 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된, 가변 TCR β 영역에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성되는 제2 세그먼트, 및 제1 세그먼트의 C 말단과 제2 세그먼트의 N 말단을 연결하는 링커 서열을 포함한다. 대안적으로, 제1 세그먼트는 TCR β 쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성될 수 있고, 제2 세그먼트는 TCR α 쇄 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된, TCR α 쇄 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성될 수 있다. 상기 단일 쇄 TCR은 제1 쇄와 제2 쇄 사이에 이황화 결합을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 링커 서열의 길이 및 이황화 결합의 위치는 제1 세그먼트 및 제2 세그먼트의 가변 도메인 서열이 실질적으로 천연 T 세포 수용체에서와 같이 상호 배향되도록 하는 것이다. 더욱 구체적으로, 제1 세그먼트는 TCR α 쇄 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된, TCR α 쇄 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성될 수 있고, 제2 세그먼트는 TCR β 쇄 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된, TCR β 쇄 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열에 의해 구성될 수 있고, 이황화 결합은 제1 쇄와 제2 쇄 사이에 제공될 수 있다. 링커 서열은 TCR의 기능을 손상시키지 않는 임의의 서열일 수 있다.

본 발명의 맥락에서, "기능성" TCR α 및/또는 β 쇄 융합 단백질은 적어도 실질적인 생물학적 활성을 유지하는, 예를 들어, 아미노산의 부가, 결실 또는 치환에 의해 변형된 TCR 또는 TCR 변이체를 의미하여야 한다. TCR의 α 쇄 및/또는 β 쇄의 경우에, 이는 두 쇄 모두 그의 생물학적 기능, 특히, 상기 TCR의 특정 펩티드-MHC 복합체에의 결합 및/또는 특정 펩티드:MHC 상호작용시 기능적 신호 전달을 나타내는 (비-변형된 α 쇄 및/또는 β 쇄, 또는 본 발명의 또 다른 융합 단백질 α 쇄 및/또는 β 쇄 중 하나를 갖는) T-세포 수용체를 여전히 그대로 형성할 수 있다는 것을 의미하여야 한다.

구체적인 실시양태에서, TCR은 기능성 T-세포 수용체 (TCR) α 쇄 및/또는 β 쇄 융합 단백질이 되도록 변형될 수 있고, 여기서 상기 에피토프-태그 길이는 6 내지 15개의 아미노산, 바람직하게는 9 내지 11개의 아미노산 길이이다. 또 다른 실시양태에서, TCR은 기능성 T-세포 수용체 (TCR) α 쇄 및/또는 β 쇄 융합 단백질이 되도록 변형될 수 있고, 여기서 상기 T-세포 수용체 (TCR) α 쇄 및/또는 β 쇄 융합 단백질은 이격되거나, 또는 일직선으로 직렬로 된 2개 이상의 에피토프-태그를 포함한다. 융합 단백질의 실시양태는 융합 단백질이 그의 생물학적 활성/활성들을 유지하는 ("기능적인") 한, 2, 3, 4, 5개 또는 훨씬 더 많은 에피토프-태그를 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 기능성 T-세포 수용체 (TCR) α 쇄 및/또는 β 쇄 융합 단백질이 바람직하고, 여기서 상기 에피토프-태그는 제한하는 것은 아니지만, CD20 또는 Her2/neu 태그, 또는 다른 통상적인 태그, 예컨대, myc-태그, FLAG-태그, T7-태그, HA (헤마글루티닌)-태그, His-태그, S-태그, GST-태그 또는 GFP-태그로부터 선택된다. myc, T7, GST, GFP 태그는 기존 분자에서 유래한 에피토프이다. 그에 반해, FLAG는 높은 항원성을 위해 디자인된 합성 에피토프 태그이다 (예컨대, 미국 특허 번호 4,703,004 및 4,851,341 참조). myc 태그는 고품질의 시약이 그의 검출을 위해 사용하는 데 이용가능한 바, 바람직하게 사용될 수 있다. 에피토프 태그는 물론 항체에 의한 인식을 넘어서 하나 이상의 추가 기능을 가질 수 있다. 상기 태그의 서열들이 문헌에 기술되어 있으며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

TCR 변이체

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 기능성 부분을 포함하는 폴리펩티드로서, 여기서 기능성 부분은

a) 서열식별번호 2, 3, 4, 5, 6, 및 7의 아미노산 서열, 또는

b) 서열식별번호 10, 11, 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 서열, 또는

c) 서열식별번호 18, 19, 20, 21, 22, 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인 폴리펩티드에 관한 것이다.

기능성 부분은 TCR의 항원, 특히, 항원-MHC 복합체에의 결합을 매개할 수 있다.

한 실시양태에서, 기능성 부분은 본원에 기술된 바와 같은 TCR α 가변 쇄 및/또는 TCR β 가변 쇄를 포함한다.

TCR 변이체 분자는 TCR 수용체의 결합 특성을 가질 수 있지만, (T 세포 이외의) 이펙터 세포의 신호전달 도메인과, 특히, NK 세포의 신호전달 도메인과 조합할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태는 이펙터 세포, 예컨대, NK 세포의 신호전달 도메인과 함께 조합하여 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 기능성 부분을 포함하는 단백질에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 바와 같은, 적어도 하나의 TCR, 바람직하게는 적어도 2개의 TCR을 포함하는 다가 TCR 복합체에 관한 것이다. 상기 측면의 한 실시양태에서, 적어도 2개의 TCR 분자는 링커 모이어티를 통해 연결되어 다가 복합체를 형성한다. 바람직하게는 복합체는 수용성이므로, 링커 모이어티는 그에 따라 선택되어야 한다. 링커 모이어티는 TCR 분자의 정의된 위치에 부착할 수 있는 바, 형성된 복합체의 구조적 다양성이 최소화되는 것이 바람직한다. 본 측면의 한 실시양태는 중합체 쇄 또는 펩티드 링커 서열이 TCR의 가변 영역 서열에 위치하지 않는 각 TCR의 아미노산 잔기 사이에서 연장되는 본 발명의 TCR 복합체를 제공한다. 본 발명의 복합체가 의약용으로 사용할 수 있는 바, 링커 모이어티는 예를 들어, 그의 면역원성과 같은 그의 제약 적합성을 고려하여 선택되어야 한다. 상기 바람직한 기준을 충족하는 링커 모이어티의 예는 관련 기술분야, 예를 들어, 항체 단편을 연결하는 분야에 공지되어 있다.

링커의 예로는 친수성 중합체 및 펩티드 링커가 있다. 친수성 중합체의 예로는 폴리알킬렌 글리콜이 있다. 상기 부류 중 가장 일반적으로 이용되는 것은 폴리에틸렌 글리콜 또는 PEG에 기반하는 것이다. 그러나, 다른 것은 다른 적합한, 임의적으로 치환된, 폴리프로필렌 글리콜을 비롯한 폴리알킬렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체에 기반하는 것이다. 펩티드 링커는 아미노산 쇄로 구성되고, TCR 분자가 부착될 수 있는 단순 링커 또는 다량체화 도메인을 생산하는 작용을 한다.

한 실시양태는 상기 TCR 중 적어도 하나는 치료제와 회합되어 있는 다가 TCR 복합체에 관한 것이다.

시토카인 및 케모카인 방출

일부 실시양태는, IFN-γ 분비가 이펙터 세포 상에서 발현된 본 발명의 TCR이 HLA-A*01 결합된 형태의, 서열식별번호 1로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 결합함으로써 유도되는 것인, 본원에 기술된 바와 같은 단리된 TCR, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드, 본원에 기술된 바와 같은 다가 TCR 복합체에 관한 것이다.

이펙터 세포 상에서 발현된 본 발명의 TCR이 HLA-A*01 결합된 형태의, 서열식별번호 1의 아미노산 서열에 결합함으로써 유도되는 IFN-γ 분비는 500 pg/ml 초과, 더욱 바람직하게는 1000 pg/ml 초과, 가장 바람직하게는 2000 pg/ml 초과일 수 있다. IFN-γ 분비는 HLA-A*01 결합된 형태의 서열식별번호 1의 아미노산 서열에 결합하였을 때, HLA-A*01 결합된 형태의 비관련 펩티드 (예컨대, 서열식별번호 54)에의 결합과 비교하여 적어도 5배 더 높을 수 있다.

따라서, "여기서, TCR이 아미노산 서열을 인식하지 못하는 경우"라는 것은 비-표적 아미노산과의 접촉시, 본 발명의 TCR의 IFN-γ 분비가 300 pg/ml 미만, 200 pg/ml 미만, 100 pg/ml 미만이라는 것을 의미한다. 특히, 서열식별번호 54의 티틴 에피토프와의 접촉시, 본 발명의 TCR의 IFN-γ 분비는 300 pg/ml 미만, 바람직하게는 200 pg/ml 미만, 더욱 바람직하게는 100 pg/ml 미만이다.

"이펙터 세포"는 말초 혈액 림프구 (PBL) 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)일 수 있다. 전형적으로, 이펙터 세포는 면역 이펙터 세포, 특히, T 세포이다. 다른 적합한 세포 유형은 감마-델타 T 세포, 및 NK-유사 T 세포를 포함한다.

본 발명은 또한 후보 TCR 또는 그의 항원 결합 단편을 서열식별번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 HLA-A*01 결합된 형태, 바람직하게는 또는 HLA-A*01:01 결합된 형태와 접촉시키는 단계, 및 후보 TCR 또는 그의 항원 결합 단편이 표적에 결합하는지 및/또는 면역 반응을 매개하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 표적인 서열식별번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 HLA-A*01 결합된 형태, 바람직하게는 또는 HLA-A*01:01 결합된 형태에 결합하는 TCR 또는 그의 단편을 확인하는 방법에 관한 것이다. 후보 TCR 또는 그의 항원 결합 단편이 면역 반응을 매개하는지 여부는 예를 들어, 시토카인 분비, 예컨대, IFN-γ 분비를 측정함으로써 결정될 수 있다. 시토카인 분비는 서열식별번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 ivtRNA로 형질감염된, HLA-A1이 형질도입된 DU-145 세포 (또는 HLA-A1이 형질도입된 다른 APC)를 조사하고자 하는 TCR 또는 TCR의 단편을 포함하는 분자를 발현하는 CD8+ 농축 PBMC와 함께 인큐베이션시키는 시험관내 검정법에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 TCR은 높은 종양 세포 인식 능력을 보이기 때문에 특히 유용하다. 추가로, 본원에 기술된 바와 같은 TCR은 높은 종양 세포 사멸 능력을 나타낸다. 추가로, 본 발명의 TCR은 높은 기능적 결합성을 갖는다.

또한, TCR은 효과적인 종양 퇴행에 유익한, 바람직한 시토카인 방출 패턴을 나타낸다.

핵산, 벡터

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 바와 같은 TCR을 코딩하는, 또는 본원에 기술된 바와 같은 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

"핵산 분자"는 일반적으로 천연 공급원으로부터 합성되거나, 수득된 (예컨대, 단리 및/또는 정제된) 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드를 함유할 수 있고, 비변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 사이에서 발견되는 포스포디에스테르 대신, 천연, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드간 연결, 예컨대, 포스포로아미데이트 연결 또는 포스포로티오에이트 연결을 함유할 수 있는, DNA 또는 RNA의 중합체를 의미한다. 바람직하게는 본원에 기술된 핵산은 재조합 핵산이다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "재조합"은 (i) 살아있는 세포에서 복제할 수 있는 핵산 분자에 천연 또는 합성 핵산 세그먼트를 연결하여 살아있는 세포 외부에서 구축된 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에 기술된 것의 복제로 생성된 분자를 지칭한다. 본원에서의 목적을 위해, 복제는 시험관내 복제 또는 생체내 복제일 수 있다. 핵산은 관련 기술분야에 공지되거나, 또는 상업적으로 이용가능한 (예컨대, 진스크립트(Genscript), 써모 피셔(Thermo Fisher) 및 유사 회사) 절차를 이용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 라이게이션 반응에 기초하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al.]을 참조한다. 예를 들어, 핵산은 자연적으로 발생된 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키기 위해 또는 하이브리드화시 형성되는 이중체의 물리적 안정성을 증가시키기 위해 (예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환 뉴클레오티드) 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산은 재조합 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질 또는 그의 기능성 부분 또는 기능성 변이체 중 어느 것을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 개시내용 또한 변이체 핵산이 본원에 기술된 TCR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 단리된 또는 정제된 핵산의 변이체를 제공한다. 상기 변이체 뉴클레오티드 서열은 MAGE-A3을 특이적으로 인식하는 기능성 TCR을 코딩한다.

본 개시내용은 또한 본원에 기술된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열 또는 엄격한 조건하에서 본원에 기술된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열과 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 정제된 핵산을 제공한다.

엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 고도로 엄격한 조건하에서 하이브리드화한다. "고도로 엄격한 조건"은 뉴클레오티드 서열이 비특이적 하이브리드화보다 더 강하게 검출가능한 양으로 표적 서열 (본원에 기술된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 하이브리드화한다는 것을 의미한다. 고도로 엄격한 조건은 정확한 상보성 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 뉴클레오티드 서열과 매칭되는 소수의 작은 영역 (예컨대, 3-10개의 염기)을 우연히 갖는 무작위 서열로부터 소수의 산재된 미스매치만을 함유하는 것을 구별하는 조건을 포함한다. 상기 작은 상보성 영역은 14-17개 이상의 염기로 이루어진 전장 상보체보다 쉽게 용융되고, 고도로 엄격한 하이브리드화로 인해 쉽게 구별될 수 있다. 상대적으로 고도로 엄격한 조건은 예를 들어, 저염 및/또는 고온 조건, 예컨대, 약 50-70℃의 온도에서 약 0.02-0.1 M NaCl 또는 등가물에 의해 제공되는 것과 같은 조건을 포함할 것이다. 상기 고도로 엄격한 조건은 뉴클레오티드 서열과 주형 또는 표적 가닥 사이의 미스매치 (만약 있다면)를 거의 허용하지 않으며, 본원에 기술된 임의의 TCR의 발현을 검출하는 데 특히 적합하다. 일반적으로 조건은 포름아미드의 양을 증가시키며 첨가함으로써 더욱 엄격해질 수 있는 것으로 이해된다.

본원의 다른 곳에서 이미 기술된 바와 같이, TCR을 코딩하는 핵산은 변형될 수 있다. 전체 핵산 서열에서 유용한 변형은 코돈 최적화일 수 있다. 발현된 아미노산 서열 내에서 보존적 치환을 유도하는 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 변이는 기능에 영향을 미치지 않는 TCR 쇄의 아미노산 서열의 상보성 결정 및 비-상보성 결정 영역에서 이루어질 수 있다. 일반적으로, CDR3 영역에서는 부가 및 결실이 수행되지 않아야 한다.

또 다른 실시양태는 본원에 기술된 바와 같은 TCR을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

벡터는 바람직하게 플라스미드, 셔틀 벡터, 파지미드, 코스미드, 발현 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 유전자 요법에서 사용되는 입자 및/또는 벡터이다.

"벡터"는 코딩된 폴리펩티드의 합성이 일어날 수 있는 적합한 숙주 세포 내로 핵산 서열을 운반할 수 있는 임의의 분자 또는 조성물이다. 전형적으로, 및 바람직하게는 벡터는 관련 기술분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 원하는 핵산 서열 (예컨대, 본 발명의 핵산)을 포함하도록 조작된 핵산이다. 벡터는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있고/거나, 리포솜을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 셔틀 벡터, 파지미드, 코스미드, 발현 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 또는 유전자 요법에서 사용되는 입자 및/또는 벡터일 수 있다. 벡터는 숙주 세포에서 복제를 허용하는 핵산 서열, 예컨대, 복제 기점을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선별가능한 마커 유전자 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산의 발현을 허용하는 서열에 작동가능하게 연결된 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터이다.

바람직하게는 벡터는 발현 벡터이다. 더욱 바람직하게는 벡터는 레트로바이러스, 더욱 구체적으로, 감마-레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터이다.

세포, 세포주

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 바와 같은 TCR을 발현하는 세포에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 세포는 단리되거나, 또는 비자연적으로 발생된 것이다.

구체적인 실시양태에서, 세포는 본원에 기술된 바와 같은 TCR을 코딩하는 핵산, 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.

세포에 상기 기술된 TCR을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 상기 기술된 벡터는 도입될 수 있거나, 또는 상기 TCR을 코딩하는 ivtRNA가 도입될 수 있다. 세포는 말초 혈액 림프구, 예컨대, T 세포일 수 있다. TCR의 클로닝 및 외인적 발현 방법은 예를 들어, 문헌 [Engels et al. (Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013)]에 기술되어 있다. 렌티바이러스 벡터로의 1차 인간 T 세포의 형질도입은 예를 들어, 문헌 [Cribbs "simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells" BMC Biotechnol. 2013; 13: 98]에 기술되어 있다.

"형질감염" 및 "형질도입"이라는 용어는 상호교환적이고, 외인성 핵산 서열이 숙주 세포, 예컨대, 진핵 숙주 세포에 도입되는 프로세스를 지칭한다. 핵산 서열의 도입 또는 전달은 언급된 방법으로 제한되지 않고, 전기천공법, 미세주사법, 유전자 총 전달법, 리포펙션, 슈퍼펙션, 및 레트로바이러스, 또는 형질도입 또는 형질감염에 적합한 다른 바이러스에 의한 언급된 감염을 비롯한, 다수의 임의의 수단으로 달성될 수 있다는 점에 유의한다.

일부 실시양태는

a) 본원에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 발현 벡터, 또는

b) 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 알파 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 베타 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 세포를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 세포는 말초 혈액 림프구 (PBL) 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)이다. 세포는 자연 살해 세포, 또는 T 세포일 수 있다. 바람직하게는 세포는 T 세포이다. T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포 유사 기억 T 세포이다.

줄기 세포 유사 기억 T 세포 (TSCM)는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 덜 분화된 서브집단으로, 이는 자가 재생 능력 및 장기간 지속 능력을 특징으로 한다. 일단 상기 세포는 생체내에서 그의 항원을 만나면, 중앙 기억 T 세포 (TCM), 이펙터 기억 T 세포 (TEM) 및 일부 TSCM은 진행이 중단된 상태 그대로 남아있는 최종적으로 분화된 이펙터 기억 T 세포 (TEMRA)로 추가로 분화한다 (Flynn et al., Clinical & Translational Immunology (2014). 상기의 남아있는 TSCM 세포는 생체내에서 지속가능한 면역학적 기억을 구축하는 능력을 나타내고, 따라서, 입양 T 세포 요법에 중요한 T 세포 서브집단으로 간주된다 (Lugli et al., Nature Protocols 8, 33-42 (2013) Gattinoni et al., Nat. Med. 2011 Oct; 17(10): 1290-1297). T 세포 풀을 줄기 세포 기억 T 세포 서브타입으로 한정하기 위해 면역-자기 선별이 사용될 수 있다. 문헌 [Riddell et al. 2014, Cancer Journal 20(2): 141-44]를 참조한다.

TCR을 표적화하는 항체

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서 TCR의 부분은

c) 서열식별번호 20의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 23의 베타 쇄의 CDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 MAGE-A3에 대한 특이성을 매개하는 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, MAGE-A3 특이성을 매개하는 TCR의 부분은

a) (i) 서열식별번호 2의 알파 쇄의 CDR1,

서열식별번호 4의 알파 쇄의 CDR3; 및/또는

(ii) 서열식별번호 5의 베타 쇄의 CDR1,

서열식별번호 7의 베타 쇄의 CDR3; 또는

b) (i) 서열식별번호 10의 알파 쇄의 CDR1,

서열식별번호 12의 알파 쇄의 CDR3; 및/또는

(ii) 서열식별번호 13의 베타 쇄의 CDR1,

서열식별번호 15의 베타 쇄의 CDR3; 또는

c) (i) 서열식별번호 18의 알파 쇄의 CDR1,

서열식별번호 20의 알파 쇄의 CDR3; 및/또는

(ii) 서열식별번호 21의 베타 쇄의 CDR1,

서열식별번호 23의 베타 쇄의 CDR3을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 MAGE-A3에 대한 특이성을 매개하는 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 한 실시양태에서, MAGE-A3 특이성을 매개하는 TCR의 부분은

a) (i) 서열식별번호 2의 알파 쇄의 CDR1,

서열식별번호 3의 알파 쇄의 CDR2,

서열식별번호 4의 알파 쇄의 CDR3; 및/또는

(ii) 서열식별번호 5의 베타 쇄의 CDR1,

서열식별번호 6의 알파 쇄의 CDR2,

서열식별번호 7의 베타 쇄의 CDR3; 또는

b) (i) 서열식별번호 10의 알파 쇄의 CDR1,

서열식별번호 11의 알파 쇄의 CDR2,

서열식별번호 12의 알파 쇄의 CDR3 및/또는

(ii) 서열식별번호 13의 베타 쇄의 CDR1,

서열식별번호 14의 베타 쇄의 CDR2,

서열식별번호 15의 베타 쇄의 CDR3; 또는

c) (i) 서열식별번호 18의 알파 쇄의 CDR1,

서열식별번호 19의 알파 쇄의 CDR2,

서열식별번호 20의 알파 쇄의 CDR3 및/또는

(ii) 서열식별번호 21의 베타 쇄의 CDR1,

서열식별번호 22의 베타 쇄의 CDR2,

서열식별번호 23의 베타 쇄의 CDR3을 포함한다.

항체 항원 결합 단편은 TCR의 활성을 조정할 수 있다. 이는 MAGE-A3과 TCR의 결합을 차단할 수 있거나, 또는 차단하지 않을 수 있다. 이는 TCR의 치료 활성을 조정하는 데, 또는 진단 목적으로 사용될 수 있다.

제약 조성물, 의학적 치료 및 키트

본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 바와 같은 TCR을 포함하는 제약 조성물, 상기 TCR의 기능성 부분을 포함하는 폴리펩티드, 본원에 기술된 바와 같은 다가 TCR 복합체, TCR을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 TCR을 포함하는 세포, 또는 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 부분에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

상기 본 발명의 활성 성분은 바람직하게는 상기 제약 조성물에서 허용되는 담체 또는 담체 물질과 혼합된 용량으로 사용되어 질환을 치료하거나, 또는 적어도 완화시킬 수 있다. 상기 조성물은 (활성 성분 및 담체에 추가하여) 충전 물질, 염, 완충제, 안정제, 가용화제 및 최신 기술로 알려진 다른 물질을 포함할 수 있다.

"제약상 허용되는"이라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 비독성 물질로 정의된다. 담체의 선택은 적용에 따라 달라진다.

제약 조성물은 활성 성분의 활성을 증강시키거나, 또는 치료를 보충하는 추가 성분을 함유할 수 있다. 상기 추가 성분 및/또는 인자는 시너지 효과를 달성하거나, 또는 부작용 또는 원하지 않는 효과를 최소화하는 제약 조성물의 일부일 수 있다.

본 발명의 활성 성분의 제제화 또는 제조 및 적용/약물 치료를 위한 기술은 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA] 최신판에 공개되어 있다. 적절한 적용은 비경구적 적용, 예를 들어, 근육내, 피하, 골수내 주사 뿐만 아니라, 척수강내, 직접 심실내, 정맥내, 결절내, 복강내 또는 종양내 주사이다. 정맥내 주사는 환자에게 바람직한 치료이다.

바람직한 실시양태에 따라, 제약 조성물은 주입 또는 주사에 의한다.

주사가능한 조성물은 적어도 하나의 활성 성분, 예컨대, TCR을 발현하는 확장된 T 세포 집단 (예를 들어, 치료하고자 하는 환자에 대해 자가 또는 동종이계)을 포함하는 제약상 허용되는 유체 조성물이다. 활성 성분은 일반적으로 생리학적으로 허용되는 담체에 용해되거나, 또는 현탁되고, 조성물은 소량의 하나 이상의 비-독성 보조 물질, 예컨대, 유화제, 보존제 및 pH 완충화제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 개시내용의 융합 단백질과 함께 사용하기에 유용한 상기 주사가능한 조성물이 통상적이며; 적절한 제제는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 측면은 의약으로서 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TCR, 상기 TCR의 기능성 부분을 포함하는 폴리펩티드, 본원에 기술된 바에 따른 다가 TCR 복합체, 상기 TCR을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 TCR을 포함하는 세포, 또는 본원에 기술된 바와 같은 TCR의 부분에 특이적으로 결합하는 항체에 관한 것이다.

일부 실시양태는 암 치료에서 사용하기 위한, 본원에 기술된 바와 같은 TCR, 상기 TCR의 기능성 부분을 포함하는 폴리펩티드, 본원에 기술된 바에 따른 다가 TCR 복합체, 상기 TCR을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터, 상기 TCR을 포함하는 세포에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 암은 혈액암 또는 고형 종양이다.

혈액암은 또한 고형 종양을 형성하지 않는 바, 이로써, 신체에 분산되는 혈액 암으로도 명명된다. 혈액암의 예로는 백혈병, 림프종 또는 다발성 골수종이 있다. 고형 종양에는 육종과 암종의 두 가지 주요 유형이 있다. 육종은 예를 들어, 혈관, 뼈, 지방 조직, 인대, 림프관, 근육 또는 힘줄의 종양이다.

한 실시양태에서, 암은 전립선암, 자궁암, 갑상선암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 편평 세포 암종, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 간세포 암종, 두부경부암, 위암, 자궁내막암, 자궁경부암, 결장직장암, 위 선암종, 담관암종, 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병, 암종, 육종 또는 골육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원에서는 또한 (i) 본원에 기술된 바와 같은 단리된 TCR; (ii) 재조합 TCR을 코딩하는 핵산을 포함하는 바이러스 입자; (iii) 본원에 기술된 바와 같은 재조합 TCR을 발현하도록 변형된 면역 세포, 예컨대, T 세포 또는 NK 세포; (iv) 본원에 기술된 바와 같은 재조합 TCR을 코딩하는 핵산 중 하나 이상의 것을 함유하는 제약 조성물 및 키트도 고려한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기술된 재조합 TCR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터 입자를 포함하는 조성물 (또는 재조합 TCR을 발현하도록 본원에 기술된 벡터 입자를 이용하여 변형된 T 세포)을 제공한다. 상기 조성물은 본원에 추가로 기술된 바와 같이 본 개시내용의 방법에서 대상체에게 투여될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 변형된 T 세포를 포함하는 조성물은 공지된 기술에 따른 입양 면역요법을 위한 방법 및 조성물, 또는 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 그의 변형에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 세포는 먼저 세포를 그의 배양 배지로부터 수확한 후, 이어서, 세포를 치료 유효량으로 투여에 적합한 배지 및 용기 시스템 ("제약상 허용되는" 담체)에서 세척 및 농축시킴으로써 제제화된다. 적합한 주입 매질은 임의의 등장성 매질 제제일 수 있고, 전형적으로, 생리 식염수, 노르모솔 R(Normosol R) (애보트(Abbott)) 또는 플라즈마-라이트 A(Plasma-Lyte A) (박스터(Baxter))일 수 있지만, 물 중 5% 덱스트로스 또는 링거 락테이트(Ringer's lactate)도 이용될 수 있다. 주입 매질은 인간 혈청 알부민으로 보충될 수 있다.

효과적인 치료를 위한 조성물 중의 세포수는 전형적으로 10개 초과의 세포 및 최대 10⁶개, 최대 10⁸ 또는 10⁹개의 세포 (10⁸ 또는 10⁹개의 세포 포함)이고, 10¹⁰개 초과의 세포일 수 있다. 세포수는 조성물에 포함된 세포의 유형과 같이 조성물이 의도하는 최종 용도에 따라 달라질 것이다. 본원에서 제공하는 용도를 위해, 세포는 일반적으로 1 L 이하의 부피이고, 500 ml 이하, 심지어 250 ml 또는 100 ml 이하일 수 있다. 따라서, 바람직한 세포의 밀도는 전형적으로 10⁶개 초과의 세포/ml이고, 일반적으로, 10⁷개 초과의 세포/ml, 일반적으로, 10⁸개 이상의 세포/ml이다. 누적하여 10⁹, 10¹⁰또는 10¹¹개 이상의 세포로 임상적으로 적절한 개수의 면역 세포를 다회 주입물에 배분할 수 있다. 본원에서 제공하는 제약 조성물은 다양한 형태, 예컨대, 고형, 액체, 분말, 수성 또는 동결건조 형태일 수 있다. 적합한 제약 담체의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 상기 담체 및/또는 첨가제는 종래 방법으로 제제화될 수 있고, 적합한 용량으로 대상체에 투여될 수 있다. 안정화제, 예컨대, 지질, 뉴클레아제 억제제, 중합체 및 킬레이트제가 체내에서의 분해로부터 조성물을 보존할 수 있다. 주사에 의해 투여되는 것으로 의도되는 조성물에는, 계면활성제, 보존제, 습윤화제, 분산화제, 현탁화제, 완충제, 안정제 및 등장화제 중 하나 이상의 것이 포함될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 재조합 TCR, 또는 본원에서 제공된 재조합 TCR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스 벡터 입자가 키트로서 패키징될 수 있다. 키트는 임의적으로 예컨대, 사용 지침서, 장치 및 추가의 시약과 같은 하나 이상의 구성 요소 및 예컨대, 튜브, 용기 및 시린지와 같은 방법의 실시를 위한 구성 요소를 포함할 수 있다. 예시적인 키트는 재조합 TCR을 코딩하는 핵산, 재조합 TCR 폴리펩티드 또는 본원에서 제공된 바이러스를 포함할 수 있고, 임의적으로 사용 지침서, 대상체에서 바이러스를 검출하기 위한 장치, 대상체에게 조성물을 투여하기 위한 장치 및 대상체에게 조성물을 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다.

관심 유전자 (예컨대, 재조합 TCR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트 또한 본원에서 고려된다. 관심 서열 (예컨대, 재조합 TCR) 및 임의적으로, 면역 체크포인트 억제제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 코딩하는 바이러스 벡터를 포함하는 키트 또한 본 발명에서 고려된다.

본 발명에서 고려되는 키트는 또한 본원에 개시된 TCR 중 어느 하나 이상의 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 특히, 상기 진단 키트는 본원에 개시된 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위해 딥 시퀀싱을 수행하기 위한 적절한 증폭 및 검출 프라이머 및 다른 연관된 시약의 세트를 포함할 수 있다. 추가 실시양태에서, 본원의 키트는 본원에 개시된 TCR을 검출하기 위한 시약, 예컨대, 항체 또는 다른 결합 분자를 포함할 수 있다. 진단 키트는 또한 본원에 개시된 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 결정하거나, 또는 본원에 개시된 TCR의 존재를 결정하기 위한 지침서를 함유할 수 있다. 키트는 지침서를 함유할 수 있다. 지침서는 전형적으로 키트에 포함된 구성 요소를 설명하는 명백한 표현 및 대상체의 적절한 상태, 적절한 투여량 및 적절한 투여 방법을 결정하는 방법을 포함하는 투여 방법을 포함한다. 지침서는 또한 치료 시간 기간에 걸쳐 대상체를 모니터링하는 것에 관한 가이던스를 포함할 수 있다.

본원에 제공된 키트는 또한 본원에 기술된 조성물을 대상체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 약물 또는 백신을 투여하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 다양한 장치가 본원에 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시적인 장치는 피하 주사 바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 바늘이 없는 주사 장치, 흡입기 및 예컨대, 점안기와 같은 액체 분배기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 키트의 바이러스를 투여하기 위한 장치는 키트의 바이러스와 양립가능할 것이며; 예를 들어, 고압 주사 장치와 같은 바늘이 없는 주사 장치는 고압 주사에 의해 손상되지 않은 바이러스를 갖는 키트에는 포함될 수 있지만, 고압 주사에 의해 손상되는 바이러스를 갖는 키트에는 전형적으로 포함되지 않는다.

본원에 제공된 키트는 또한 예컨대, T 세포 활성제 또는 자극제와 같은 화합물 또는 TLR4 효능제와 같은 TLR 효능제를 대상체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 대상체에게 약물을 투여하기 위해 관련 기술분야에 공지된 임의의 다양한 장치가 본원에 제공된 키트에 포함될 수 있다. 예시적인 장치는 피하 주사 바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 바늘이 없는 주사 장치를 포함하나, 피하 주사 바늘, 정맥내 바늘, 카테터, 바늘이 없는 주사 장치, 흡입기 및 예컨대, 점안기와 같은 액체 분배기로 제한되지 않는다. 전형적으로, 키트의 화합물을 투여하기 위한 장치는 바람직한 화합물 투여 방법과 양립가능할 것이다.

실험

실시예 1: MAGE-A3-반응성 T 세포 클론은 MAGE- A3 _EVD -펩티드를 선택적으로 인식한다.

MAGE-A3-반응성 T 세포 클론을 단리시키는 시험관내 프라이밍 접근법을 사용하였다. 프라이밍 시스템은 HLA-A*01:01-양성 뿐만 아니라, HLA-A*01:01-음성 공여자의 성숙한 수지상 세포 (mDC)를 항원 제시 세포로서, 및 자가 CD8⁺-농축 T 세포를 반응 세포로서 사용한다. 인간 MAGEA3 유전자를 코딩하는 시험관내 전사된 RNA (ivtRNA)는 특정 항원의 공급원으로서의 역할을 한다. mDC로의 전기천공 후, MAGE-A3 코딩 ivtRNA는 단백질로 번역되고, 이어서, mDC에서 HLA-A*01:01-코딩 분자에 의해 펩티드로 프로세싱되고, 제시된다. HLA-A*01:01-음성 공여자의 경우, 항원 제시 세포에서 각각의 HLA 대립유전자를 트랜스제닉 방식으로 발현시키는 데 MAGE-A3 ivtRNA 이외에도 HLA-A*01:01을 코딩는 ivtRNA가 되었다 (동종이계 접근법). 동일한 공여자로부터의 ivtRNA-형질감염된 mDC와 T 세포의 시험관내 공동 배양은 상응하는 TCR의 공급원으로 작용하는 항원 특이적 T 세포를 새로(de novo) 유도한다. 항원 특이적 T 세포는 다양한 방법으로 농축될 수 있으며, 제한 희석 또는 FACS 기반 단일 세포 분류에 의해 클로닝된다. 단리 및 확장된 MAGE-A3-반응성 T 세포 클론을 포화량 (10^-5 M)의 MAGE-A3_EVD-펩티드 또는 티틴 유래 대조군 펩티드 (ESD)가 로딩된, 이전에 HLA-A1-GFP가 형질도입된 DU-145 세포 (DU-145_A1)와 함께 공동 배양하였다. 티틴 유래 ESD-대조군 펩티드는 친화성 성숙 MAGE-A3-반응성 TCR에 의해 교차 인식되어 임상 시험 동안 주요 심혈관 독성을 유발하였다 (Brian J. Cameron, 2013; Linette et al., 2013). 20-24 h 후, 공동 배양 상청액 중의 IFN-γ 농도를 표준 샌드위치 ELISA (BD 인간 IFN-γ ELISA 세트)에 의해 분석하였다.

결과:

모든 MAGE-A3-반응성 T 세포 클론은 MAGE-A3_EVD-펩티드를 선택적으로 인식한 반면, 티틴_ESD-펩티드는 인식되지 않았다. 추가로, 시험된 T 세포 클론은 인간 MAGEA3 유전자를 코딩하는 ivtRNA가 전기천공된 DU-145_A1 세포에서 내인적으로 프로세싱되고, 제시된 MAGE-A3_EVD-펩티드를 인식하였다 (도 1).

실시예 2: 단리된 MAGE-A3-반응성 TCR은 트랜스제닉 방식으로 발현될 수 있다.

MAGE-A3-반응성 T 세포 클론의 TCR-α 및 TCR-β 쇄의 서열을 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing)에 의해 확인하고, 그의 최소 뮤린화된 대응물에 의한 불변 TCR 영역 교환 후, 레트로바이러스 벡터 pES.12-6로 클로닝하였다. β 쇄의 경우, Cβ1 서열을 사용하였다. 3명의 건강한 공여자의 PBMC를 피콜 구배 원심분리에 의해 단리시켰다. CD8-양성 Cβ1-음성 T 세포를 음성 자기 선별 (밀테니(Miltenyi))에 의해 농축시키고, CD3 및 CD28에 특이적인 플레이트 결합 항체가 있는 비조직 배양 24-웰 플레이트에서 자극시켰다. 각각의 TCR 코딩 레트로바이러스 플라스미드 및 2개의 발현 플라스미드로 HEK293T 세포를 형질감염시켜 암포트로픽 레트로바이러스 입자를 생산하였다. 자극 3일 후, CD8-양성 Cβ1-음성 T 세포를 형질도입하고, 10일째, 형질도입에 대한 마커로서 Cβ1 불변 베타 영역을 사용하여 MACS-분리에 의해 형질도입된 CD8⁺ 세포를 농축시킨 후, REP에 의해 확장시켰다. 트랜스제닉 T 세포를 HLA-A1-제한 MAGE-A3_EVD-MHC-다량체 (MAGE-A3, EVDPIGHLY; 이뮨어웨어(immuneAware)) 또는 CD8 및 불변 β1 영역에 대한 항체로 염색하였다.

결과:

TCR_1 및 TCR_2를 발현하는 트랜스제닉 T 세포 집단은 약 70%의 Cβ1-양성 CD8-양성 T 세포로 효율적으로 형질도입되었다. 두 MAGE-A3-TCR-트랜스제닉 T 세포 집단 모두 MAGE-A3_EVD-MHC-다량체에 효율적으로 결합하였다 (TCR_1의 경우, >40% 및 TCR_2의 경우, 20%). TCR_3으로 형질도입된 T 세포 집단의 25%만이 Cβ1에 대해 양성으로 TCR 발현을 나타내었고, T 세포의 5%가 MAGE-A3_EVD-MHC-다량체에 결합하였다. 비형질도입된 CD8-양성 T 세포에서는 극도로 낮은 MAGE-A3_EVD-MHC-다량체-염색이 관찰되었고, Cβ1 항체 염색은 전혀 관찰되지 않았다. 상기 결과는 MAGE-A3-반응성 T 세포 클론으로부터 단리된 TCR이 건강한 공여자의 T 세포에서 트랜스제닉 방식으로 발현될 수 있다는 것을 보여주는 것이다 (도 2).

실시예 3: 트랜스제닉 방식으로 TCR을 발현하는 T 세포는 내인적으로 프로세싱되고, 제시된 펩티드를 인식한다.

트랜스제닉 T 세포의 표적 특이성을 평가하기 위해, DU-145 세포에 앞서 HLA-A1-GFP를 형질도입하고, mCherry 단독 (음성 대조군), MAGE-A3-mCherry 또는 MAGE-A6-mCherry를 발현하도록 추가 조작하였다. MAGE-A3 및 MAGE-A6은 뉴클레오티드 98% 정렬 및 단백질 서열 95% 정렬로 고도의 상동성을 보이는 바, 따라서, 교차 반응할 가능성이 있다 (Newman et al., 2016). 3명의 공여자의 비형질도입 (UTD) 및 트랜스제닉 T 세포를 관련 펩티드 (EVD)가 언로딩 또는 로딩된 형질도입된 세포와 함께 공동 배양하였다. 인식 검정을 위해, 공동 배양물을 이펙터 대 표적 비를 1:1로 설정하였고, 여기서는 15,000개의 TCR-트랜스제닉 Cβ1-양성 T 세포 및 15,000개의 종양 세포로 진행하였다. 표준 ELISA에 의해 공동 배양 상청액 중 IFN-γ 농도를 측정함으로써 표적 세포의 인식을 분석하였다.

결과:

모든 TCR-트랜스제닉 T 세포 집단은 공여자에 의존하여 그 변화에 따라 모든 펩티드 로딩된 표적 세포에 대하여 강건한 인식을 보였다. MAGE-A6을 과다발현하는 DU-145_A1 세포는 인식되지 않은 반면, MAGE-A3 조작된 DU-145_A1만이 인식되었다. 모든 공여자의 비형질도입된 T 세포는 시험된 조건 중 어느 것에서도 IFN-γ를 분비하지 않았고, 이는 어떤 활성화 사인도 없었다는 것을 나타내는 것이다. 본 결과는 TCR_1, _2 및 _3이 선택적으로 MAGE-A3은 인식하지만, 고도로 상동성인 패밀리 구성원, 예컨대, MAGE-A6은 인식하지 못한다는 것을 보여주는 것이다 (도 3).

실시예 4: MAGE-A3- TCR - 트랜스제닉 T 세포는 내인적으로 MAGE-A3-양성 종양 세포주를 인식한다.

적정량의 MAGE-A3을 발현하는 3개의 종양 세포주 (SK-Mel23, MelA375, K562) 및 3개의 MAGE-A3-음성 종양 세포주 (OV-7, MS751, DU-145)를 실험에 사용한다. 종양 세포주는 내인적으로 HLA-A1-양성이거나, 또는 HLA-A1 발현을 위해 조작하였다 (K562, MS751, DU-145). 모든 종양 세포주를 언로딩, 또는 포화 농도의 MAGE-A3_EVD-펩티드 (10^-5 M)로 로딩하여 시험하였다. 인식 검정을 위해, 공동 배양물을 이페터 대 표적 비를 약 1:1로 설정하고, 여기서는 15,000개의 TCR-트랜스제닉 Cβ1-양성 T 세포 및 15,000개의 종양 세포로 진행하였다. 표준 ELISA에 의해 공동 배양 상청액 중 IFN-γ 농도를 측정함으로써 표적 세포의 인식을 분석하였다.

결과:

모든 TCR-트랜스제닉 T 세포 집단은 공여자에 의존하여 그 변화에 따라 모든 펩티드 로딩된 표적 세포를 인식하는 것으로 나타났으며 이는 표적 세포 상에서의 충분한 HLA-A1 발현을 나타낸다. TCR_1 및 TCR_2를 발현하는 TCR-트랜스제닉 T 세포 집단은 가능한 최대 IFN-γ 방출을 나타내는 펩티드 로딩된 표적 세포와 유사한 IFN-γ 수준으로 MAGE-A3 내인성 종양 세포주에 대하여 강건한 인식을 나타내었다. 공여자 1의 TCR_3 트랜스제닉 T 세포는 TCR_1 및 TCR_2 트랜스제닉 T 세포와 유사한 정도로 MAGE-A3 발현 표적 세포를 인식한 반면, 공여자 2 및 및 공여자 3에서의 전체 IFN-γ 방출은 더 낮았다. 펩티드 언로딩시, MAGE-A3-음성 종양 세포주만이 인식되었다. 모든 공여자의 비형질도입된 T 세포는 시험된 세포주 또는 조건 어느 것도 인식하지 못했다. 상기 결과는 MAGE-A3-TCR-트랜스제닉 T 세포가 고도로 선택적인 방식으로 내인적으로 MAGE-A3-양성 종양 세포를 효율적으로 인식할 수 있다는 것을 보여주는 것이다 (도 4).

본 출원은 하기 항들을 추가로 포함한다:

제1항: MAGE-A3에 특이적인 단리된 T 세포 수용체 (TCR).

제2항: 제1항에 있어서, TCR이 서열식별번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 것인 단리된 TCR.

제3항: 제1항 또는 제2항에 있어서, TCR이 서열식별번호 54의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 인식하지 못하는 것인 단리된 TCR.

제4항: 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 HLA-A*01 유전자에 의해 코딩된 분자에 의해 제시되는 서열식별번호 1의 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 것인 단리된 TCR.

제5항: 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 HLA-A*01:01 코딩된 분자에 의해 제시되는 서열식별번호 1의 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 것인 단리된 TCR.

제6항: 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이

- 서열식별번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 쇄를 포함하는 것인 단리된 TCR.

제7항: 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이

c) 서열식별번호 24와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 25와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역을 포함하는 것인 단리된 TCR.

제8항: 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이

c) 서열식별번호 24의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 25의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역을 포함하는 것인 단리된 TCR.

제9항: 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이

서열식별번호 50과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR α 영역, 및 서열식별번호 51과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR β 영역을 포함하는 것인 단리된 TCR.

제10항: 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이

서열식별번호 50의 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR α 영역, 및 서열식별번호 51의 아미노산 서열을 갖는 불변 TCR β 영역을 포함하는 것인 단리된 TCR.

제11항: 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 정제된 것인 단리된 TCR.

제12항: 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 아미노산 서열이 하나 이상의 표현형상의 침묵 치환을 포함하는 것인 단리된 TCR.

제13항: 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 그의 아미노산 서열이 검출가능한 표지, 치료제 또는 약동학적 변형 모이어티를 포함하도록 변형된 것인 단리된 TCR.

제14항: 제13항에 있어서, 치료제가 면역 이펙터 분자, 세포독성제 및 방사성핵종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 TCR.

제15항: 제14항에 있어서, 면역 이펙터 분자가 시토카인인 단리된 TCR.

제16항: 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 가용성 또는 막 결합된 것인 단리된 TCR.

제17항: 제13항에 있어서, 약동학적 변형 모이어티가 적어도 하나의 폴리에틸렌 글리콜 반복 단위, 적어도 하나의 글리콜 기, 적어도 하나의 시알릴 기, 또는 그의 조합인 단리된 TCR.

제18항: 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 단일 쇄 타입의 것이고, 여기서 TCR α 쇄 및 TCR β 쇄가 링커 서열에 의해 연결되어 있는 것인 단리된 TCR.

제19항: 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, TCR α 쇄 또는 TCR β 쇄가 에피토프 태그를 포함하도록 변형된 것인 단리된 TCR.

제20항: 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 TCR의 기능성 부분을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서, 여기서 기능성 부분이

d) 서열식별번호 2, 3, 4, 5, 6, 및 7의 아미노산 서열, 또는

e) 서열식별번호 10, 11, 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 서열, 또는

f) 서열식별번호 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.

제21항: 제20항에 있어서, 기능성 부분이

c) 서열식별번호 24의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 25의 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.

제22항: 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에서 구현된 TCR 중 적어도 하나를 포함하는 다가 TCR 복합체.

제23항: 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에서 구현된 TCR 중 적어도 2개를 포함하는 다가 TCR 복합체.

제24항: 제1항 내지 제19항에 있어서, 제20항 내지 제21항에 있어서, 제22항 내지 제23항에 있어서, IFN-γ 분비가 HLA-A*01:01 코딩된 분자에 의해 제시되는 서열식별번호 1의 아미노산 서열에의 결합에 의해 유도되는 것인, 단리된 TCR, 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체.

제25항: 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 TCR을 코딩하는, 또는 제20항 내지 제21항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.

제26항: 제25항의 핵산을 포함하는 벡터.

제27항: 제26항에 있어서, 벡터가 발현 벡터인 벡터.

제28항: 제26항 또는 제27항에 있어서, 벡터가 레트로바이러스 벡터인 벡터.

제29항: 제26항 또는 제27항에 있어서, 벡터가 렌티바이러스 벡터인 벡터.

제30항: 제1항 내지 제19항에 따른 TCR, 또는 제20항 또는 제21항에 따른 단리된 폴리펩티드를 발현하는 세포.

제31항: 제30항에 있어서, 세포가 단리되거나, 또는 비-자연적으로 발생된 것인 세포.

제32항: 제30항 또는 제331항에 있어서, 세포가 제25항에 따른 핵산, 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 것인 세포.

제33항: 제30항 내지 제32항에 있어서, 세포가

a) 제25항에서 구현된 적어도 하나의 핵산을 포함하는 발현 벡터, 또는

b) 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에서 구현된 TCR의 알파 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터, 및 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에서 구현된 TCR의 베타 쇄를 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터를 포함하는 것인 세포.

제34항: 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 말초 혈액 림프구 (PBL) 또는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)인 세포.

제35항: 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포인 세포.

제36항: MAGE-A3에 대한 특이성을 매개하는, 제1항 내지 제19항에 따른 TCR의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.

제37항: 제36항에 있어서, MAGE-A3 특이성을 매개하는 TCR의 부분이

d) 서열식별번호 4의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 7의 베타 쇄의 CDR3; 또는

e) 서열식별번호 12의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 15의 베타 쇄의 CDR3; 또는

f) 서열식별번호 20의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 23의 베타 쇄의 CDR3을 포함하는 것인 항체.

제38항: 제1항 내지 제19항에 따른 TCR, 제20항 내지 제22항에 따른 폴리펩티드, 제22항 내지 제23항에 따른 다가 TCR 복합체, 제25항에 따른 핵산, 제26항 내지 제29항에 따른 벡터, 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 따른 세포, 또는 제36항 내지 제37항에 따른 항체를 포함하는 제약 조성물.

제39항: 제38항에 있어서, 제약 조성물이 적어도 하나의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 것인 제약 조성물.

제40항: 제1항 내지 제19항에 있어서, 제20항 내지 제21항에 있어서, 제22항 내지 제23항에 있어서, 제25항에 있어서, 제26항 내지 제29항에 있어서, 제30항 내지 제31항에 있어서, 또는 제36항 내지 제37항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, TCR, 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 항체.

제41항: 제1항 내지 제19항에 있어서, 제20항 내지 제21항에 있어서, 제22항 내지 제23항에 있어서, 제25항에 있어서, 제26항 내지 제27항에 있어서, 또는 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료에서 사용하기 위한 용도의, TCR, 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체, 핵산, 벡터, 또는 세포.

제42항: 제41항에 있어서, 암이 혈액암 또는 고형 종양인, 사용하기 위한 용도의, TCR, 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체, 핵산, 벡터 또는 세포.

제43항: 제41항 및 제42항에 있어서, 암이 전립선암, 자궁암, 갑상선암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 편평 세포 암종, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 간세포 암종, 두부경부암, 위암, 자궁내막암, 자궁경부암, 결장직장암, 위 선암종, 담관암종, 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병, 암종, 육종 또는 골육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 사용하기 위한 용도의, TCR, 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체, 핵산, 벡터 또는 세포.

제44항: 제43항에 있어서, 암이 바람직하게 육종 또는 암종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 사용하기 위한 용도의, TCR, 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체, 핵산, 벡터 또는 세포.

SEQUENCE LISTING <110> Medigene Immunotherapies GmbH <120> MAGE-A3 specific T cell receptors and their use <130> M11653EP <150> EP20198049.7 <151> 2020-09-24 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu 1 5 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Ala Val Ile Glu Tyr Gly Asn Lys Leu Val Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Asn His Asn Val 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe 1 5 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Cys Ala Thr Ser Trp Asp Arg Gly Tyr Glu Gln Phe Phe 1 5 10 <210> 8 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Ile 100 105 110 Glu Tyr Gly Asn Lys Leu Val Phe Gly Ala Gly Thr Ile Leu Arg Val 115 120 125 Lys Ser Tyr 130 <210> 9 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Gly Pro Gly Leu Leu His Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Thr 1 5 10 15 Gly His Gly Asp Ala Met Val Ile Gln Asn Pro Arg Tyr Gln Val Thr 20 25 30 Gln Phe Gly Lys Pro Val Thr Leu Ser Cys Ser Gln Thr Leu Asn His 35 40 45 Asn Val Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Ser Gln Ala Pro Lys Leu 50 55 60 Leu Phe His Tyr Tyr Asp Lys Asp Phe Asn Asn Glu Ala Asp Thr Pro 65 70 75 80 Asp Asn Phe Gln Ser Arg Arg Pro Asn Thr Ser Phe Cys Phe Leu Asp 85 90 95 Ile Arg Ser Pro Gly Leu Gly Asp Ala Ala Met Tyr Leu Cys Ala Thr 100 105 110 Ser Trp Asp Arg Gly Tyr Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Leu 130 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu 1 5 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Cys Ala Val Arg Trp Glu Thr Ser Gly Ser Arg Leu Thr Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Gly Asp Leu Ser 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu 1 5 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Cys Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe 1 5 10 <210> 16 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg 100 105 110 Trp Glu Thr Ser Gly Ser Arg Leu Thr Phe Gly Glu Gly Thr Gln Leu 115 120 125 Thr Val Asn Pro Asp 130 <210> 17 <211> 131 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr 20 25 30 Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp 35 40 45 Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe 50 55 60 Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu 65 70 75 80 Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn 85 90 95 Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Val Gly Gly Gly Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Thr 130 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Thr Arg Asp Thr Thr Tyr Tyr 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn 1 5 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Cys Ala Leu Ser Glu Ala Leu Gly Tyr Ser Ser Ala Ser Lys Ile Ile 1 5 10 15 Phe <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Gly His Thr Ala 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Phe Gln Gly Asn Ser Ala 1 5 <210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Cys Ala Ser Ser Asp Pro Met Ser Gly Ala Gln Glu Thr Gln Tyr Phe 1 5 10 15 <210> 24 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Leu Thr Ala Ser Leu Leu Arg Ala Val Ile Ala Ser Ile Cys Val 1 5 10 15 Val Ser Ser Met Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Thr Glu Ile Ser 20 25 30 Val Val Glu Lys Glu Asp Val Thr Leu Asp Cys Val Tyr Glu Thr Arg 35 40 45 Asp Thr Thr Tyr Tyr Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Pro Ser Gly Glu 50 55 60 Leu Val Phe Leu Ile Arg Arg Asn Ser Phe Asp Glu Gln Asn Glu Ile 65 70 75 80 Ser Gly Arg Tyr Ser Trp Asn Phe Gln Lys Ser Thr Ser Ser Phe Asn 85 90 95 Phe Thr Ile Thr Ala Ser Gln Val Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 100 105 110 Ala Leu Ser Glu Ala Leu Gly Tyr Ser Ser Ala Ser Lys Ile Ile Phe 115 120 125 Gly Ser Gly Thr Arg Leu Ser Ile Arg Pro Asn 130 135 <210> 25 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Met Gly Thr Arg Leu Leu Phe Trp Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asp His Thr Gly Ala Gly Val Ser Gln Ser Pro Ser Asn Lys Val Thr 20 25 30 Glu Lys Gly Lys Asp Val Glu Leu Arg Cys Asp Pro Ile Ser Gly His 35 40 45 Thr Ala Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ser Leu Gly Gln Gly Leu Glu Phe 50 55 60 Leu Ile Tyr Phe Gln Gly Asn Ser Ala Pro Asp Lys Ser Gly Leu Pro 65 70 75 80 Ser Asp Arg Phe Ser Ala Glu Arg Thr Gly Gly Ser Val Ser Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Gln Arg Thr Gln Gln Glu Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala 100 105 110 Ser Ser Asp Pro Met Ser Gly Ala Gln Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro 115 120 125 Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu 130 135 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 26 gacagcgcca tctacaac 18 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 27 attcagagca gccagagaga g 21 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 28 tgcgccgtga tcgagtacgg caacaagctg gtgttt 36 <210> 29 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 29 ctgaaccaca acgtg 15 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 30 tactacgaca aggacttc 18 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 31 tgtgccacca gctgggatag aggctacgag cagtttttc 39 <210> 32 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 32 atggagacac tgctgggact gctgattctg tggctgcagc ttcagtgggt gtccagcaag 60 caagaagtga cacagatccc tgccgctctg tctgtgcctg agggcgaaaa cctggtgctg 120 aactgctcct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttcagaca ggaccccggc 180 aagggactga caagcctgct gctcattcag agcagccaga gagagcagac cagcggcaga 240 ctgaatgcca gcctggataa gtcctccggc agaagcaccc tgtatatcgc cgcttctcag 300 cctggcgata gcgccacata tctgtgcgcc gtgatcgagt acggcaacaa gctggtgttt 360 ggcgccggaa ccatcctgag agtgaagtcc tat 393 <210> 33 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 33 atgggacctg gactgctgca ttggatggcc ctgtgtctgc tcggaacagg acatggcgac 60 gctatggtca ttcagaaccc cagataccaa gtgacccagt tcggcaagcc cgtgacactg 120 agctgtagcc agacactgaa ccacaacgtg atgtactggt atcagcagaa gtcctctcag 180 gcccctaagc tgctgttcca ctactacgac aaggacttca acaacgaggc cgacacaccc 240 gacaacttcc agagcagaag gcccaatacc agcttctgct tcctggacat cagaagccct 300 ggcctgggag atgccgccat gtatctgtgt gccaccagct gggatagagg ctacgagcag 360 tttttcggcc ctggcaccag actgacagtg ctg 393 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 34 gacagcgcca tctacaac 18 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 35 attcagagca gccagagaga g 21 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 36 tgcgccgtca gatgggagac aagcggctcc agactgacat tt 42 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 37 agcggcgacc tgagc 15 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 38 tactacaacg gcgaggaa 18 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 39 tgtgcctctt ctgtcggcgg aggctacgag cagtatttc 39 <210> 40 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 40 atggagacac tgctgggact gctgattctg tggctgcagc ttcagtgggt gtccagcaag 60 caagaagtga cacagatccc tgccgctctg tctgtgcctg agggcgaaaa cctggtgctg 120 aactgctcct tcaccgacag cgccatctac aacctgcagt ggttcagaca ggaccccggc 180 aagggactga caagcctgct gctcattcag agcagccaga gagagcagac cagcggcaga 240 ctgaatgcca gcctggataa gtcctccggc agaagcaccc tgtatatcgc cgcttctcag 300 cctggcgata gcgccacata tctgtgcgcc gtcagatggg agacaagcgg ctccagactg 360 acatttggcg agggcacaca gctgaccgtg aatcccgat 399 <210> 41 <211> 393 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 41 atgggcttca gactgctgtg ctgcgtggcc ttttgtctgc ttggagccgg acctgtggat 60 agcggcgtta cccagacacc taagcacctg atcacagcca caggccagcg cgtgaccctg 120 agatgttctc ctagaagcgg cgacctgagc gtgtactggt atcagcagtc tctggaccag 180 ggcctgcagt tcctgatcca gtactacaac ggcgaggaaa gagccaaggg caacatcctg 240 gaacggttca gcgcccagca gttcccagat ctgcacagcg agctgaacct gagcagcctg 300 gaactgggag atagcgccct gtacttctgt gcctcttctg tcggcggagg ctacgagcag 360 tatttcggcc ctggcaccag actgaccgtg aca 393 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 42 acacgggaca ccacctacta c 21 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 43 cggaacagct tcgacgagca gaac 24 <210> 44 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 44 tgcgccctgt ctgaggccct gggctacagc tctgccagca agatcatctt t 51 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 45 agcggacaca cagcc 15 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 46 ttccaaggca acagcgcc 18 <210> 47 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 47 tgtgccagca gcgatcctat gtctggcgcc caagagacac agtacttc 48 <210> 48 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 48 atgctgacag cctctctgct gagagccgtg atcgccagca tctgtgtggt gtctagcatg 60 gcccagaaag tgacacaggc ccagaccgag atcagcgtgg tggaaaaaga agatgtgacc 120 ctggactgcg tgtacgagac acgggacacc acctactacc tgttctggta caagcagcct 180 cctagcggcg agctggtgtt cctgatcaga cggaacagct tcgacgagca gaacgagatc 240 tccggccggt acagctggaa cttccagaag tccaccagca gcttcaactt caccatcacc 300 gccagccagg tggtggatag cgccgtgtat ttttgcgccc tgtctgaggc cctgggctac 360 agctctgcca gcaagatcat ctttggcagc ggcacccggc tgagcatcag acctaat 417 <210> 49 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 49 atgggcacca gactgctgtt ctgggtcgcc ttttgtctgc tgggcgccga tcatacaggt 60 gccggtgttt ctcagagccc cagcaacaaa gtgaccgaga agggcaaaga cgtggaactg 120 agatgcgacc ccatcagcgg acacacagcc ctgtactggt acagacagtc tctcggccag 180 ggcctcgagt tcctgatcta cttccaaggc aacagcgccc ctgacaagag cggcctgcct 240 agcgatagat tcagcgccga aagaacaggc ggcagcgtgt ccacactgac catccagaga 300 acccagcaag aggacagcgc cgtgtacctg tgtgccagca gcgatcctat gtctggcgcc 360 caagagacac agtacttcgg ccctggaaca cggctgctgg ttctt 405 <210> 50 <211> 140 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 1 5 10 15 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 20 25 30 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val 35 40 45 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 50 55 60 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 65 70 75 80 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val 85 90 95 Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln 100 105 110 Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly 115 120 125 Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 140 <210> 51 <211> 177 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro 1 5 10 15 Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu 20 25 30 Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn 35 40 45 Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys 50 55 60 Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu 65 70 75 80 Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys 85 90 95 Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp 100 105 110 Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg 115 120 125 Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser 130 135 140 Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala 145 150 155 160 Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp 165 170 175 Phe <210> 52 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 52 atccagaatc cggaccccgc cgtgtaccag ctgcgcgaca gcaagagcag cgacaagagc 60 gtgtgcctgt tcaccgactt cgacagccag accaacgtga gccagagcaa ggacagcgac 120 gtgtacatca ccgacaagac cgtgctggac atgcgcagca tggacttcaa gagcaacagc 180 gccgtggcct ggagcaacaa gagcgacttc gcctgcgcca acgccttcaa caacagcatc 240 atccccgagg acaccttctt ccccagcagc gatgtgccgt gcgacgtgaa gctggtggag 300 aagagcttcg agaccgacac caacctgaac ttccagaacc tgagcgtgat cggcttccgc 360 atcctgctgc tgaaggtggc cggcttcaac ctgctgatga ccctgcgcct gtggagcagc 420 <210> 53 <211> 531 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon optimized <400> 53 gaggacctga acaaggtgtt ccctccggag gtggccgtgt tcgagcccag caaagccgag 60 atcgcgcaca cccagaaggc caccctggtg tgcctggcca ccggcttctt ccccgaccac 120 gtggagctga gctggtgggt gaacggcaag gaggtgcaca gcggcgtgag caccgacccc 180 cagcccctga aggagcagcc cgccctgaac gacagccgct actgcctgag cagccgcctg 240 cgcgtgagcg ccaccttctg gcagaacccc cgcaaccact tccgctgcca ggtgcagttc 300 tacggcctga gcgagaacga cgagtggacc caggaccgcg ccaagcccgt gacccagatc 360 gtgagcgccg aggcctgggg ccgcgccgac tgcggcatta ccagcgcgag ctaccatcag 420 ggcgtgctga gcgccaccat cctgtacgag atcctgctgg gcaaggccac cctgtacgcc 480 gtgctggtga gcgccctggt gctgatggcg atggtgaagc gcaaggactt c 531 <210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Glu Ser Asp Pro Ile Val Ala Gln Tyr 1 5

Claims

MAGE-A3에 특이적인 단리된 T 세포 수용체 (TCR).
제1항에 있어서, TCR이 서열식별번호(SEQ ID NO:) 1의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 것인 단리된 TCR.
제1항에 있어서, TCR이 서열식별번호 54의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 인식하지 못하는 것인 단리된 TCR.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이 서열식별번호 1의 아미노산 서열의 HLA-A1 결합된 형태를 특이적으로 인식하고, 바람직하게는 TCR이 HLA-A*01:01-코딩된 분자에 의해 제시되는 서열식별번호 1의 아미노산 서열을 특이적으로 인식하는 것인 단리된 TCR.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이
a) - 서열식별번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 3의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 4의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR α 쇄, 및
- 서열식별번호 5의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 6의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 7의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 쇄; 또는
b) - 서열식별번호 10의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 11의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 12의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR α 쇄, 및
- 서열식별번호 13의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 14의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 15의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 쇄; 또는
c) - 서열식별번호 18의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 19의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 20의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR α 쇄, 및
- 서열식별번호 21의 아미노산 서열을 갖는 CDR1, 서열식별번호 22의 아미노산 서열을 갖는 CDR2, 및 서열식별번호 23의 아미노산 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 TCR β 쇄를 포함하는 것인 단리된 TCR.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, TCR이
a) 서열식별번호 8과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 9와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는
b) 서열식별번호 16과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 17과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역; 또는
c) 서열식별번호 24와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR α 영역 및 서열식별번호 25와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 TCR β 영역을 포함하는 것인 단리된 TCR.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 TCR의 기능성 부분을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서, 여기서 기능성 부분이
a) 서열식별번호 2, 3, 4, 5, 6, 및 7의 아미노산 서열, 또는
b) 서열식별번호 10, 11, 12, 13, 14, 및 15의 아미노산 서열, 또는
c) 서열식별번호 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 폴리펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 청구된 적어도 하나의 TCR을 포함하는 다가 TCR 복합체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-γ 분비가 HLA-A*01:01-코딩된 분자에 의해 제시되는 서열식별번호 1의 아미노산 서열에의 결합에 의해 유도되는 것인, 단리된 TCR, 단리된 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 TCR을 코딩하거나, 또는 제7항에 따른 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
제10항의 핵산을 포함하는 벡터로서, 벡터가 바람직하게는 발현 벡터, 더욱 바람직하게는 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 벡터.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 TCR을 발현하는 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 TCR의 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로서, 여기서 TCR의 부분은
a) 서열식별번호 4의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 7의 베타 쇄의 CDR3; 또는
b) 서열식별번호 12의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 15의 베타 쇄의 CDR3; 또는
c) 서열식별번호 20의 알파 쇄의 CDR3 및/또는 서열식별번호 23의 베타 쇄의 CDR3을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제8항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, TCR, 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 항체.
제1항 내지 제8항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 전립선암, 자궁암, 갑상선암, 고환암, 신장암, 췌장암, 난소암, 식도암, 비소세포 폐암, 폐 선암종, 편평 세포 암종, 비호지킨 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 간세포 암종, 두부경부암, 위암, 자궁내막암, 자궁경부암, 결장직장암, 위 선암종, 담관암종, 유방암, 방광암, 골수성 백혈병 및 급성 림프모구성 백혈병, 암종, 육종 또는 골육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 치료에서 사용하기 위한, TCR, 폴리펩티드, 다가 TCR 복합체, 핵산, 벡터, 세포, 또는 항체.