JP2000184883A

JP2000184883A - 新規アミラーゼ

Info

Publication number: JP2000184883A
Application number: JP36248898A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Hagiwara; 萩原　　浩; Kaori Kitayama; 香織北山; Yasuhiro Hayashi; 康弘林; Kazuaki Igarashi; 一暁五十嵐; Keiji Endo; 圭二遠藤; Katsuya Ozaki; 克也尾崎
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2000-07-04

Abstract

(57)【要約】【課題】従来の洗剤用酸化剤耐性アミラーゼに比べて
高い酵素比活性を有する酸化剤耐性アルカリ液化型アミ
ラーゼの提供。【解決手段】以下の性質を有するアルカリ液化型アミ
ラーゼ及びこれを含有する洗浄剤。１）酸化剤耐性２％Ｈ₂Ｏ₂存在下、pH１０、３０℃、６０分間処理後に
７０％以上の残存活性を有する。２）酵素比活性 pH１０、５０℃、１５分間反応（可溶性澱粉を基質）で
の酵素活性値と、プロテインアッセイキット（バイオラ
ド社製）により測定したタンパク質量より算出される酵
素比活性が、３０００Ｕ／mg以上である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、高い比活性と酸化
剤耐性を有し、洗浄剤配合成分として有用なアルカリ液
化型アミラーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】α−ア
ミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業
及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗
浄剤への配合の適性が知られており、洗浄力増強成分と
して自動食器洗浄機用洗剤や衣料用洗剤などへも配合が
行われている（Enzymes in Detergency, P203. Marcel
Dekker Inc., New York(1995））。

【０００３】洗浄剤用として有用なアルカリ側に最適作
用を有している液化型α−アミラーゼとしては、本発明
者らが以前に見出したバチルスエスピー（Bacillus s
p.）ＫＳＭ−１３７８（ＦＥＲＭＢＰ−３０４８）株
由来のものが知られていた（ＷＯ９４／２６８８１）。
また最近、至適pHを８〜８．５付近に有するα−アミラ
ーゼが開示された（ＷＯ９５／２６３９）が、これはＫ
ＳＭ−１３７８株のアミラーゼとその性質及び構造が酷
似しているものであった。

【０００４】近年、自動食器洗浄機用洗剤のみならず、
衣料用洗浄剤等にも漂白作用を期待した酸化剤配合品が
上市されており、洗剤用アミラーゼとしては、充分な酸
化剤耐性能を有するものが洗浄力及び安定性の面に於い
てより有利となっている。このようなアミラーゼは、未
だ自然界に於いて見出されておらず（ＷＯ９４／１８３
１４）、今まで知られている洗剤用酸化剤耐性アミラー
ゼはいずれも、タンパク工学により構築されている。

【０００５】しかしながら、一般的にタンパク工学に於
けるアミノ酸置換等により、酵素比活性は野性型に比べ
低下することが多く、例えば、本発明者らが見出したバ
チルスエスピーＫＳＭ−１３７８株のアミラーゼ
（ＬＡＭＹ）の場合にも、Ｍｅｔ２０２残基の置換によ
り（ＬＡＭＹ・Ｍ２０２Ｔ）酸化剤耐性能が付与できる
が、その比活性は置換前の約４０％に低下し、約１７０
０Ｕ／mgとなった（ＷＯ９８／４４１２６）。また最
近、洗剤用酸化剤耐性アミラーゼとして各種洗浄剤に用
いられているデュラミル（ノボ社製）の比活性は更に低
く、わずかに約５００Ｕ／mgであった。

【０００６】従って、本発明は、従来の洗剤用酸化剤耐
性アミラーゼに比べて高い比活性を有する酸化剤耐性ア
ルカリ液化型アミラーゼ、及びこれを配合した洗浄剤組
成物を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の酵素学的
性質を有するアルカリ液化型アミラーゼを提供するもの
である。１）酸化剤耐性２％Ｈ₂Ｏ₂存在下、pH１０、３０℃、６０分間処理後に
７０％以上の残存活性を有する。２）酵素比活性 pH１０、５０℃、１５分間反応（可溶性澱粉を基質）で
の酵素活性値と、プロテインアッセイキット（バイオラ
ド社製）により測定したタンパク質量より算出される酵
素比活性が、３０００Ｕ／mg以上である。

【０００８】また、本発明はバチルス属に属し、当該ア
ルカリ液化型アミラーゼを産生する微生物を提供するも
のである。更にまた、本発明は当該アルカリ液化型アミ
ラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明において、アルカリα−ア
ミラーゼとは、至適pHがアルカリ領域にあるものをい
う。また、中性とはpH６〜８の範囲をいい、アルカリ性
とはそれ以上の範囲をいう。更に、HANDBOOK OF AMYLAS
ES AND RELATED ENZYMES〔Ｐ４０〜４１．The Amylase
Research Society of Japan(1988）〕に記載されている
ように、液化型とは澱粉及び澱粉系多糖類を高ランダム
に分解するものをいう。

【００１０】本発明酵素は前記の性質を有すればよい
が、更に次の３）及び４）の性質を有するもの、特に次
の３）〜７）の性質を有するものが好ましい。３）最適作用pH 最適作用pHがpH８．０を超える（可溶性澱粉を基質、５
０℃、１５分間反応）。４）作用澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分
解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、アミロース
からはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マル
トトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、
マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ
６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成する。ただ
しプルランには作用しない。５）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）４０℃、３０分間処理条件下で、pH６．５〜１１．０の
範囲で７０％以上の残存活性を示す。６）作用温度範囲及び最適作用温度２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温度は５０〜
６０℃である。７）温度安定性５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中、
３０分間処理で、４０℃で８０％以上の残存活性を示
し、４５℃でも約６０％の残存活性を示す。

【００１１】本発明の酵素は、例えばバチルス属に属す
るその生産菌を培養した後培養物から採取することによ
り製造される。かかる生産菌の野生株としては、例えば
下記の菌学的性質を有するＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ
−Ｋ３８株が挙げられる。

【００１２】

【表１】

【００１３】以上の菌学的性質に関する検討に基づき、
バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バ
クテリオロジー〔Bergey's Mannual of Systematic Bac
teriology, Williams & Wilkins, United States of Am
erica(1986）〕及びジーナス・バチルス〔The Genus Ba
cillus, Agricultural Research Service, Washington,
D. C.(1973)〕を参照し、比較検討した結果、両菌株は
有胞子桿菌であるバチルス（Bacillus）属の一種である
と認められる。しかし、両菌株は中性領域では生育でき
ず、専ら高アルカリ領域で良好な生育を示すことから、
いわゆる好アルカリ性（Alkaliphilic）微生物に属し、
従来の中性で生育するバチルス属細菌とは区別される。
更に、菌学的及び生理学的性質を公知の好アルカリ性バ
チルスと比較した〔Microbiol., 141, 1745(1995）〕結
果、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株は公知の好
アルカリ性バチルスのいずれとも一致しないので、これ
らを新規菌株と判断して、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ
−Ｋ３８株をそれぞれ、第１６８１６号（ＦＥＲＭＰ
−１６８１６）及び第１６８１７号（ＦＥＲＭＰ−１
６８１７）として通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託した。

【００１４】上記の微生物を用いて本発明のアルカリ液
化型アミラーゼを得るには、培地に微生物を接種し、常
法に従って培養すればよく、好アルカリ性菌である為
に、培地のpHがアルカリ性であることが望ましい。斯く
して得られた培養物中から目的のアルカリ液化型アミラ
ーゼを採取することができる。この培養上清液は、その
まま使用することができるが、必要に応じて、塩析法、
沈殿法、限外濾過法の分離手段により粗酵素を得、更に
公知の方法により精製結晶化することにより精製酵素と
して使用することも可能である。

【００１５】以下、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ
の精製法の一例を挙げる。培養上清液について、（１）
硫安沈殿、（２）ＤＥＡＥ−トヨパール（トーソー社
製）カラムクロマトグラフィー、（３）ゲル濾過をする
ことにより、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度１０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気
泳動で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができ
る。

【００１６】更に、本発明のアルカリ液化型アミラーゼ
は、例えば、本発明アルカリ液化型アミラーゼをコード
する遺伝子及びこれを含有するベクタープラスミドを取
得し、次いで該プラスミドを用いて、適当な微生物、好
ましくはバチルス属細菌を形質転換し、これを培養する
ことにより得ることもできる。

【００１７】前記の如く本発明のアルカリ液化型アミラ
ーゼはアルカリ側に最適作用pHを有し、かつ高い酸化剤
耐性及び比活性を有するので、洗浄剤、特に漂白剤等の
酸化剤配合洗浄剤配合用酵素として特に有用である。ま
た、ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株由来のアミ
ラーゼは、更に高いキレート剤耐性も有するので、更に
キレート剤配合洗浄剤にも配合可能である。本発明酵素
の洗浄剤への配合量は、０．００１〜５重量％が好まし
い。

【００１８】本発明洗浄剤組成物には、前記アルカリ液
化型アミラーゼのほかに、公知の洗浄剤成分を配合する
ことができ、当該公知の洗浄成分としては、ＷＯ９４／
２６８８１の第５頁、右上欄、第１４行〜右下欄、第２
９行記載のもの、例えば界面活性剤、キレート剤、アル
カリ剤及び無機塩、漂白剤、蛍光剤等を使用することが
できる。

【００１９】界面活性剤は、洗浄剤組成物中０．５〜６
０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗
浄剤組成物については１０〜４５％、液体洗浄剤組成物
については２０〜５０％配合することが好ましい。ま
た、本発明洗浄剤組成物が漂白洗浄剤又は自動食器洗浄
機用洗剤である場合、界面活性剤は一般に１〜１０％、
好ましくは１〜５％配合される。二価金属イオン捕捉剤
は０．０１〜５０％、好ましくは５〜４０％配合され
る。アルカリ剤及び無機塩は０．０１〜８０％、好まし
くは１〜４０％配合される。再汚染防止剤は０．００１
〜１０％、好ましくは１〜５％配合される。本発明のア
ミラーゼ以外にプロテアーゼ、セルラーゼ、プロトペク
チナーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、
β−グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ等を使用することができる。これ
らの酵素は０．００１〜５％、好ましくは０．１〜３％
配合される。漂白剤（例えば過酸化水素、過炭酸塩等）
は１〜１０％配合するのが好ましい。漂白剤を使用する
とき漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０
％配合することができる。蛍光剤はビフェニル型蛍光剤
（例えばチノパールＣＢＳ−Ｘ）やスチルベン型蛍光剤
（例えばＤＭ型蛍光染）等が挙げられる。蛍光剤は０．
００１〜２％配合するのが好ましい。

【００２０】上記の洗浄剤組成物の形態は、例えば液
体、粉末、顆粒等とすることができる。また、この洗浄
剤組成物は、衣料用洗剤、自動食器洗浄機用洗剤、排水
管洗浄剤、義歯洗浄剤、漂白剤等として使用することが
できる。

【００２１】

【実施例】酵素活性の測定には次の緩衝液を用い、以下
の方法に従って行った。 pH４．５〜６．０酢酸緩衝液 pH６．０〜８．０リン酸カリウム緩衝液 pH９．０〜１０．５グリシン水酸化ナトリウム緩衝液 pH１０．０〜１２．０炭酸緩衝液 pH４．０〜１２．０ブリットン−ロビンソン緩衝液

【００２２】〔アミラーゼ活性測定方法〕１．試薬の調製法（１％可溶性澱粉水溶液の調製法）可溶性澱粉（ポテト
由来、シグマ社製）５ｇをイオン交換水４００mLに懸濁
した後、沸騰水中で攪拌しながら約１０分間加熱溶解
し、イオン交換水にて５００mLに定容する。（２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）
の調製法）グリシン（和光純薬社製特級）９．３８ｇを
イオン交換水約３００mLに溶解した後、pHメーターを用
い、約５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを１０に調
整する。更にイオン交換水にて５００mLに定容する。（ＤＮＳ試薬の調製法）水酸化ナトリウム（和光純薬社
製特級）８ｇをイオン交換水３００mLに溶解する。これ
に３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ、和光純薬社製
特級）２．５ｇを徐々に添加しながら溶解する。ＤＮＳ
を完全に溶解させた後、酒石酸ナトリウムカリウム（和
光純薬社製特級）を１５０ｇ加える。完全に溶解させた
後、イオン交換水にて５００mLに定容する。（検量線作成用ブドウ糖溶液の調製法）ブドウ糖標準液
（光電用、和光純薬社製）とイオン交換水を用い、０、
１、２、３、４、５（μmol／０．１mL）のブドウ糖溶
液を調製する。２．アミラーゼ活性の測定法（酵素溶液の希釈）精製酵素を、δ吸光度〔＝（サンプ
ルの吸光度）−（ブランクの吸光度）〕が０．６以下に
なるように１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH
１０）で希釈する。（サンプルの測定）試験管に１％可溶性澱粉水溶液０．
５mL、２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１
０）０．２mL、イオン交換水０．２mLを加え（以下、基
質溶液と略す）、これを５０℃の水浴中で約５分間予熱
する。予熱後、適当に希釈した酵素溶液０．１mLを加
え、５０℃で、１５分間反応させる。反応終了後、ＤＮ
Ｓ試薬１．０mLを加え、沸騰水中で５分間加熱発色さ
せ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換
水４．０mLを加え、混合し、５３５nmにおける吸光度を
測定する。（ブランクの測定）試験管に基質溶液０．９mLを入れ、
これにＤＮＳ試薬１．０mLを加える。更に酵素溶液０．
１mLを加え、沸騰水中で５分間加熱発色させ、直ちに氷
水中に入れ冷却する。冷却後、イオン交換水４．０mLを
加え、混合し、５３５nmにおける吸光度を測定する。（検量線の作成）試験管に基質溶液０．９mLを入れ、こ
れにＤＮＳ試薬１．０mLを加える。更に各濃度の検量線
作成用ブドウ糖溶液０．１mLを加え、沸騰水中で５分間
加熱発色させ、直ちに氷水中に入れ冷却する。冷却後、
イオン交換水４．０mLを加え、混合し、５３５nmにおけ
る吸光度を測定する。横軸にブドウ糖溶液の濃度（μmo
l／０．１mL）、縦軸に吸光度をとり、最小二乗法によ
り傾きを求め、換算係数（Ｆ）を次式に従って算出す
る。換算係数（Ｆ）＝〔１／傾き〕×〔１／１５〕×〔１０
００／０．１〕尚、検量線は活性測定毎に作成するものとする。（活性の算出）酵素の力価は、１分間に１μmolのブド
ウ糖に相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（Ｕ）
とし、次式に従って算出する。アミラーゼ活性（Ｕ／Ｌ）＝〔δ吸光度〕×〔換算係数
（Ｆ）〕×〔酵素希釈倍率〕

【００２３】〔キレート剤耐性能試験方法〕（ＥＤＴＡ溶液の調製）ＥＤＴＡ（シグマ社製）９．３
ｇをイオン交換水約８０mLに溶解した後、pHメーターを
用い、約５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液にてpHを８に調
整する。更にイオン交換水にて１００mLに定容すること
によって２５０mM ＥＤＴＡ溶液を調製する。次にこれ
をイオン交換水で希釈して１０〜１００mMのＥＤＴＡを
調製する。ＥＧＴＡ（シグマ社製）９．５ｇをイオン交
換水約８０mLに溶解した後、pHメーターを用い、約５Ｎ
の水酸化ナトリウム水溶液にてpHを８に調整する。更に
イオン交換水にて１００mLに定容することによって２５
０mM ＥＧＴＡ溶液を調製する。次にこれをイオン交換
水で希釈して、１０〜１００mMのＥＧＴＡ溶液を調製す
る。（キレート剤耐性能の試験法）１mM ＥＤＴＡ、４０℃、３０分間処理の場合試験管に
１０mM ＥＤＴＡ溶液０．１mL、２５０mMグリシン水酸
化ナトリウム緩衝液（pH１０）０．２mL、イオン交換水
０．１mLを加え、４５℃の水浴中で約５分間予熱する。
予熱後、１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１
０）で適当に希釈した酵素溶液０．１mLを加え、４５℃
で、３０分間保温する。３０分後、予め５０℃の水浴中
で予熱した基質溶液０．９mLに処理溶液０．１mLを加
え、アミラーゼ活性測定方法に準じて残存酵素活性を測
定する。

【００２４】〔酸化剤耐性能試験方法〕試験管に過酸化
水素（３０％過酸化水素水、和光純薬社製）０．０６
７mL、２５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１
０）０．２mL、イオン交換水０．６３３mLを加え、３０
℃の水浴中で約５分間予熱する。予熱後、１０mMグリシ
ン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した
酵素溶液０．１mLを加え、３０℃で、６０分間保温す
る。６０分後、予め氷水中に準備したカタラーゼ（牛肝
臓由来、ベーリンガーマンハイム社製）１μＬ添加試験
管に処理溶液０．２mLを加え、過酸化水素を失活させ反
応を停止する。その後、予め５０℃の水浴中で予熱した
基質溶液０．９mLにこの反応停止処理溶液０．１mLを加
え、アミラーゼ活性測定方法に準じて残存酵素活性を測
定する。〔タンパク質定量法〕タンパク質は、バイオラッド社製
のプロテインアッセイキットII（カタログ番号５００−
０００２）を用い、標準アッセイ法に従って、キットに
添付されたウシ血清アルブミンを標準タンパク質として
定量した。

【００２５】実施例１酸化剤耐性能を有するアルカリ
液化型アミラーゼのスクリーニング土壌約０．５ｇを滅菌水に懸濁し、８０℃で１５分間加
熱処理した。この熱処理液の上清を適当に滅菌水で希釈
して、分離用寒天培地（培地Ａ）に塗布した。次いで、
これを３０℃で２日間培養し、集落を形成させた。集落
の周に澱粉溶解に基づく透明帯を形成するものを選出
し、これをアミラーゼ生産菌として分離した。更に、分
離菌を培地Ｂに接種し、３０℃で２日間好気的に振盪培
養した。培養後、遠心分離した上清液について、酸化剤
耐性能を測定し、更に最適作用pHを測定して、本発明の
アルカリ液化型アミラーゼ生産菌をスクリーニングし
た。

【００２６】上述の方法により、バチルスエスピー
（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ３６株及びバチルスエス
ピー（Bacillus sp.) ＫＳＭ−Ｋ３８株を取得すること
ができた。

【００２７】（pH １０）

【００２９】実施例２ＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−
Ｋ３８株の培養実施例１の液体培地Ｂに、ＫＳＭ−Ｋ３６株あるいはＫ
ＳＭ−Ｋ３８株を接種し、３０℃で２日間好気的に振盪
培養した。遠心分離上清についてアミラーゼ活性（pH
８．５）を測定した結果、培養液１Ｌ当たり、それぞれ
１１７７Ｕ及び５５７Ｕの活性を有していた。

【００３０】実施例３本発明のアルカリ液化型アミラ
ーゼの精製実施例２で得られたバチルスエスピーＫＳＭ−Ｋ３
６株の培養上清液に８０％飽和濃度になるように硫酸ア
ンモニウムを加えて攪拌後、生成した沈殿を回収し、２
mM ＣａＣｌ₂を含む１０mMトリス塩酸緩衝液（pH７．
５）に溶解し、同緩衝液に対して一晩透析した。得られ
た透析内液を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパー
ル６５０Ｍカラムに添着し、同緩衝液を用いてＯ−１Ｍ
の食塩の濃度勾配によりタンパクを溶出した。活性画分
を同緩衝液にて透析後、ゲル濾過カラムクロマトグラフ
ィーにより得た活性画分を上記緩衝液にて透析すること
によってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度１
０％）及びソディウムドデシル硫酸（ＳＤＳ）電気泳動
で単一のバンドを与える精製酵素を得ることができた。
尚、バチルスエスピーＫＳＭ−Ｋ３８株の培養上清
液からも同様の方法で精製酵素を得ることができた。

【００３１】実施例４本発明アルカリ液化型アミラー
ゼの酸化剤耐性能及び酵素比活性実施例３でＫＳＭ−Ｋ３６株及びＫＳＭ−Ｋ３８株の培
養上清液から得た本発明のアルカリ液化型アミラーゼ精
製品（以下、それぞれＫ３６及びＫ３８と略す）を用
い、酸化剤及び酵素比活性耐性能を測定した。

【００３２】終濃度２％（５８０mM）のＨ₂Ｏ₂を含む５
０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中に、
１０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）で適
当に希釈した酵素（Ｋ３６、Ｋ３８、ターマミル及びデ
ュラミル）を添加し、３０℃で６０分間処理を行い、経
時的にアミラーゼ活性測定法〔５０mMグリシン水酸化ナ
トリウム緩衝液（pH１０）使用〕に準じて残存活性を測
定した。酸化剤耐性能はそれぞれ、未処理での活性を１
００％として、残存活性で示した。

【００３３】その結果（図１）、Ｋ３６及びＫ３８はい
ずれも、２％Ｈ₂Ｏ₂存在下、pH１０、３０℃、６０分間
処理後でも７０％以上、特に９４％以上の残存活性を維
持しており、充分な酸化剤耐性能を有することが認めら
れた。また、pH１０、５０℃、１５分間反応（可溶性澱
粉を基質）での酵素活性値と、プロテインアッセイキッ
ト（バイオラド社製）により測定したタンパク質量より
算出したＫ３６、Ｋ３８、ＬＡＭＹ、ＬＡＭＹ・Ｍ２０
２Ｔ及びデュラミルの酵素比活性は、それぞれ、４３０
０Ｕ／mg、３６００Ｕ／mg、４０００Ｕ／mg、１７００
Ｕ／mg及び５００Ｕ／mgとなり（表２）、両酵素はいず
れも３０００Ｕ／mg以上の比活性を有し、タンパク工学
によって構築された酸化剤耐性酵素と比較して、極めて
高い酵素比活性を有することが明らかになった。従っ
て、本発明のアルカリ液化型アミラーゼは、洗剤への配
合量などの面や工業的発酵生産の面に於いて優位であ
る。

【００３４】

【表２】

【００３５】実施例５本発明アルカリ液化型アミラー
ゼの作用pH及び最適作用pH 終濃度５０mMの各種緩衝液〔酢酸緩衝液（pH４．５〜
６．０）、リン酸カリウム緩衝液（pH６．０〜８．
０）、グリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０〜１
０．５）及び炭酸緩衝液（pH１０．０〜１２．０）〕を
用い、アミラーゼ活性測定法に準じてＫ３６及びＫ３８
を測定し、それぞれ最大の活性を１００％として、相対
活性で示した。

【００３６】この結果（図２及び３）、いずれも、pH
６．０〜１０．０の範囲で作用し、最適作用pHは８．０
〜９．０であることが明らかになった。尚、pHは反応液
の実測値を測定して示した。

【００３７】実施例６本発明アルカリ液化型アミラー
ゼのキレート剤耐性能１）ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡ耐性能終濃度０〜１００mMのＥＤＴＡ（シグマ社製）あるいは
ＥＧＴＡ（シグマ社製）を含む５０mMグリシン水酸化ナ
トリウム緩衝液（pH１０）中に、１０mMグリシン水酸化
ナトリウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した精製酵素
を添加し、所定の温度（３０℃、４０℃及び４５℃）で
３０分間処理を行い、アミラーゼ活性測定法〔５０mMグ
リシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）使用〕に準じ
て残存酵素活性を測定した。尚、対照として、バチルス
リケニフォルミス由来のアミラーゼである、ターマミ
ル及びデュラミル（いずれもノボ社製の造粒物より精製
したもの）を使用した。

【００３８】その結果、図４及び５に示したように、Ｋ
３６及びＫ３８とも高濃度のＥＤＴＡ及びＥＧＴＡによ
っても全く影響を受けず、ターマミル及びデュラミルと
比べて、高度な耐性能を有することが明らかになった。

【００３９】２）クエン酸及びゼオライト耐性能終濃度０〜０．５％のクエン酸三ナトリウム二水和物
（和光純薬社製特級）あるいは合成ゼオライトＡ−３
（和光純薬社製）を含む５０mMグリシン水酸化ナトリウ
ム緩衝液（pH１０）中に、１０mMグリシン水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH１０）で適当に希釈した精製酵素を添加
し、所定の温度（４０℃及び４５℃）で３０分間処理を
行い、アミラーゼ活性測定法〔５０mMグリシン水酸化ナ
トリウム緩衝液（pH１０）使用〕に準じて残存酵素活性
を測定した。

【００４０】その結果、Ｋ３６及びＫ３８ともクエン酸
及びゼオライトにより全く影響を受けないことが示され
た（図６〜９）。

【００４１】実施例７本発明アルカリ液化型アミラー
ゼ（Ｋ３６及びＫ３８）のその他の酵素学的性質両精製酵素の解析を行った結果、以下の特性が明らかに
なった。

【００４２】（１）作用いずれも、澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれ
らの部分分解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、
アミロースからはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ
２）、マルトトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース
（Ｇ４）、マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサ
オース（Ｇ６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成
する。ただしプルランには作用しない。（２）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）いずれも、４０℃、３０分間処理条件下で、pH６．５〜
１１．０の範囲で７０％以上の残存活性を示す。（３）作用温度範囲及び最適作用温度いずれも、２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温
度は５０〜６０℃である。（４）温度安定性５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中に
て温度を変化させ、各温度で３０分間処理することによ
り失活の条件を調べると、いずれも４０℃で８０％以上
の残存活性を示し、４５℃でも約６０％の残存活性を示
した。（５）分子量いずれも、ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により測定した分子量は５５，０００±
５，０００である。（６）等電点いずれも、等電点電気泳動法により測定した等電点は
４．２付近である。（７）界面活性剤の影響直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル
硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルホン
酸ナトリウム、α−スルホン化脂肪酸エステルナトリウ
ム、アルキルスルホン酸ナトリウム、ＳＤＳ、石鹸及び
ソフタノール等の各種界面活性剤０．１％溶液中で、pH
１０、３０℃で３０分間処理しても、いずれも殆ど活性
阻害を受けない（活性残存率９０％以上）。（８）金属塩の影響各種金属塩と共存させて、pH１０、３０℃で３０分間処
理してその影響を調べた。Ｋ３６は、１mMのＭｎ²⁺によ
り阻害され（阻害率約９５％）、１mMのＨｇ²⁺、Ｂｅ²⁺
及びＣｄ²⁺により若干阻害される（阻害率３０〜４０
％）。Ｋ３８は、１mMのＭｎ²⁺により阻害され（阻害率
約７５％）、１mMのＳｒ²⁺及びＣｄ²⁺により若干阻害さ
れる（阻害率約３０％）。（９）Ｎ末端アミノ酸配列両アミラーゼのＮ末端アミノ酸配列をエンドマン分解法
〔Edman, P., Acta Chem. Scand., 4, 283,(1948）〕に
よりプロテイン−ケンサー（ＡＢＩ社製）４７７Ａを用
いて測定した結果、いずれも、Asp-Gly-Leu-Asn-Gly-Th
r-Met-Met-Gln-Tyr-Tyr-Glu-Trp-His-Leu の配列を有す
ることが判った。

【００４３】実施例８本発明アルカリ液化型アミラー
ゼの自動食器洗浄機用洗剤洗浄力評価本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及びＫ３
８）の自動食器洗浄機用洗剤での洗浄評価を下記条件で
行った。別に対照として本発明酵素を含有しない洗剤を
用いた。１）汚染皿の調製沸騰水道水で煮沸した後、水道水を加えて溶液状にした
オートミール（クエーカー社製）１mLを磁性皿に塗布
し、室温で約３時間乾燥させた後、使用直前まで５℃
（半密閉状態）にて保存した。１回の洗浄には３枚供し
た。２）洗浄条件・使用機種；松下電器（株）製全自動食器洗い機ＮＰ−
８１０・洗浄温度；水温から約５５℃まで徐々に昇温する。・洗浄用水；水道水・洗浄剤濃度；０．２重量％・洗浄時間；洗浄約２０分→すすぎ約２０分（標準コー
ス）・洗浄時の循環水量；３．５Ｌ３）洗剤組成（％は重量％を示す）プルロニックＬ−６１２．２％、炭酸ナトリウム２
４．７％、炭酸水素ナトリウム２４．７％、過炭酸ナト
リウム１０．０％、１号珪酸ナトリウム１２．０％及び
クエン酸３ナトリウム２０．０％、ポリプロピレングリ
コール３０００２．２％、シリコーンＫＳＴ−０４（東
芝シリコーン社製）０．２％、ソカランＣＰ−４５（Ｂ
ＡＳＦ社製）４．０％。４）添加酵素量緩衝液としてグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１
０）を用い、上述のアミラーゼ活性測定法により実施例
３で得られた精製酵素の活性値を測定し、洗浄当たり１
５０Ｕ添加した。５）洗浄力評価方法洗浄後の皿にヨウ素溶液を塗布し、ヨウ素−澱粉反応に
よる色を目視で判定した。

【００４４】その結果、本発明酵素含有洗剤を用いた場
合汚れを完全に除去でき、本発明酵素を含有しない場合
と比べ極めて優れた洗浄性能を有していた。

【００４５】

【発明の効果】本発明のアルカリ液化型アミラーゼは、
洗剤用として充分な酸化剤耐性能を有し、且つ今までに
知られている洗剤用酸化剤耐性アミラーゼと比較して、
極めて高い酵素比活性を有する。また最適作用pHは８を
超える。従って、本発明のアルカリ液化型アミラーゼは
アルカリ領域で澱粉を加工する工程など極めて広範囲の
産業分野で使用され得る。特に、酸化剤を含有する自動
食器洗浄機用洗剤、衣料用洗剤及び漂白剤等に配合する
ことにより有利に使用することができ、洗剤への配合量
及び工業的発酵生産の点に於いて極めて大きな意義を有
するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及
びＫ３８）と既知の洗剤用アミラーゼのＨ₂Ｏ₂処理時間
と残存活性との関係を示す図面である。

【図２】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３６の反
応pHと相対活性との関係を示す図面である。

【図３】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３８の反
応pHと相対活性との関係を示す図面である。

【図４】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及
びＫ３８）と既知の洗剤用アミラーゼのＥＤＴＡ処理濃
度と残存活性との関係を示す図面である。

【図５】本発明のアルカリ液化型アミラーゼ（Ｋ３６及
びＫ３８）と既知の洗剤用アミラーゼのＥＧＴＡ処理濃
度と残存活性との関係を示す図面である。

【図６】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３６のゼ
オライト処理濃度と残存活性との関係を示す図面であ
る。

【図７】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３６のク
エン酸処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。

【図８】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３８のゼ
オライト処理濃度と残存活性との関係を示す図面であ
る。

【図９】本発明のアルカリ液化型アミラーゼＫ３８のク
エン酸処理濃度と残存活性との関係を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者林康弘栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者五十嵐一暁栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者遠藤圭二栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内 (72)発明者尾崎克也栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会社研究所内Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 EE10 FF04E FF05E FF12E FF13E LL04 4B065 AA15X AC14 AC15 CA32 CA57 4H003 DA01 DA19 EC01 FA16 FA28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の酵素学的性質を有するアルカリ液化
型アミラーゼ。１）酸化剤耐性２％Ｈ₂Ｏ₂存在下、pH１０、３０℃、６０分間処理後に
７０％以上の残存活性を有する。２）酵素比活性 pH１０、５０℃、１５分間反応（可溶性澱粉を基質）で
の酵素活性値と、プロテインアッセイキット（バイオラ
ド社製）により測定したタンパク質量より算出される酵
素比活性が、３０００Ｕ／mg以上である。
【請求項２】更に次の酵素学的性質を有するものであ
る請求項１記載のアルカリ液化型アミラーゼ。３）最適作用pH 最適作用pHがpH８．０を超える（可溶性澱粉を基質、５
０℃、１５分間反応）。４）作用澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分
解物のα−１，４グルコシド結合を分解し、アミロース
からはグルコース（Ｇ１）、マルトース（Ｇ２）、マル
トトリオース（Ｇ３）、マルトテトラオース（Ｇ４）、
マルトペンタオース（Ｇ５）、マルトヘキサオース（Ｇ
６）及びマルトヘプタオース（Ｇ７）を生成する。ただ
しプルランには作用しない。５）pH安定性（ブリットン−ロビンソン緩衝液）４０℃、３０分間処理条件下で、pH６．５〜１１．０の
範囲で７０％以上の残存活性を示す。６）作用温度範囲及び最適作用温度２０〜８０℃の広範囲で作用し、最適作用温度は５０〜
６０℃である。７）温度安定性５０mMグリシン水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０）中、
３０分間処理で、４０℃で８０％以上の残存活性を示
し、４５℃でも約６０％の残存活性を示す。
【請求項３】バチルス属に属し、請求項１又は２記載
のアルカリ液化型アミラーゼを産生する微生物。
【請求項４】請求項１又は２記載のアルカリ液化型ア
ミラーゼを含有する洗浄剤組成物。