JP3403255B2 - 洗浄剤組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、澱粉枝切り酵素及び液
化型アルカリα−アミラーゼを含有し、特に食べこぼし
汚れ等の澱粉質汚れに対する洗浄力に優れる洗浄剤組成
物に関する。

【０００２】

【従来の技術】α−アミラーゼは、澱粉、アミロース、
アミロペクチン等の澱粉系多糖類の分子中のα-1,4グル
コシド結合のみを切断する酵素で、1833年にPayenとPer
sozにより麦芽抽出液より初めて見出されて以来、バチ
ルス ズブチリス マールブルグ（Bacillus subtilis
Marburg）、バチルス ズブチリス ナットウ（Bacillu
s subtilis natto）、バチルス アミロリケファシエン
ス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス リケニ
フォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス セ
レウス（Bacillus cereus）、バチルス サーキュラン
ス（Bacillus circulans）、バチルス マセランス（Ba
cillus macerans）、シュードモナス シュツッツェリ
（Pseudomonas stutzeri）、クレブシェラ アエロゲネ
ス（Klebusiella aerogenes）等のバチルス属を中心と
する細菌、ストレプトマイセス グリセウス（Streptom
yces griseus）等の放線菌、アスペルギルス オリザエ
（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス ニガー（As
pergillus niger）等のアスペルギルス属を中心とする
カビ類、イネ科及びマメ科植物の種子、ヒト及びブタな
どの動物の消化腺など多くの生物から結晶標品あるいは
電気泳動的に均一な標品として得られている。

【０００３】α−アミラーゼは、昔から醸造産業で穀類
やイモ類の糖化、繊維産業で澱粉糊抜き剤、医薬品産業
で強力な消化剤としての利用、食品産業で水飴の製造等
に広く利用されてきた。また、洗浄剤においては、特に
澱粉質汚れの除去を目的としてα−アミラーゼが配合さ
れている。

【０００４】しかしながら、自然界において従来見出さ
れているα−アミラーゼのほとんどが、中性ないし酸性
領域において最大且つ安定な酵素活性を示す、いわゆる
中性若しくは酸性のα−アミラーゼに分類されるもので
あり、pHがアルカリ側にある界面活性剤含有液中では活
性が低下してしまうという欠点があった。これに対し、
アルカリ領域で最大活性を示すか、あるいはアルカリ耐
性を有するα−アミラーゼ、いわゆるアルカリα−アミ
ラーゼ及びアルカリ耐性α−アミラーゼは、かかる欠点
がなく、洗浄剤の配合成分として有用である。このよう
なアルカリα−アミラーゼ及びアルカリ耐性α−アミラ
ーゼの存在は、バチルス A-40-2株の生産する酵素〔Agr
ic. Biol. Chem., 35, 1783(1971)〕、バチルス NRRL B
-3881株の生産する酵素〔J. Bacteriol., 110, 992(197
2)〕、ストレプトマイセス KSM-9株（Streptomyces sp.
KSM-9）の生産する酵素（特開昭61-209588号公報)、バ
チルス H-167株（Bacillus sp. H-167）の生産する酵素
（特開昭62-208278号公報）、バチルス アルカロサー
モフィラス A3-8株（Bacillus alcalothermophilus A3-
8）の生産する酵素（特開平2-49584号公報）及びナトロ
コッカス Ah-36株の生産する酵素（特開平4-211369号公
報）が知られているのみである。なお、ここでアルカリ
α−アミラーゼとは、至適pHがアルカリ領域にあるもの
をいい、アルカリ耐性α−アミラーゼとは、至適pHは中
性から酸性領域にあるが、アルカリ領域においても至適
pHにおける活性に比較して充分に活性を有しかつ安定性
を保持するものをいう。また、中性とはpH６〜８の範囲
をいい、アルカリ性とはそれ以上のpH範囲をいう。

【０００５】しかしながら、本発明者らの知るかぎり、
これらのアルカリ酵素のほとんどは、澱粉又は澱粉系多
糖類をグルコース、マルトース又はマルトトリオースに
まで低分子化させる、いわゆる糖化型アルカリα−アミ
ラーゼに属するものであるため、糖の製造用酵素として
は好適であるが、洗剤用酵素としては問題があった。そ
こで、本発明者らは、界面活性剤に対する耐性を有し、
かつ澱粉又は澱粉系多糖類を高ランダムに分解する、い
わゆる液化型α−アミラーゼに着目し検討を行ったとこ
ろ、従来アルカリ領域で作用するα−アミラーゼとして
は糖化型の特性を示すものが知られているのみで、液化
型アルカリα−アミラーゼについては全く報告されてい
ないことが分かった。なお、ここでいう糖化型α−アミ
ラーゼとは、グルコアミラーゼとは異なるものである。

【０００６】また、上記従来のアルカリα−アミラーゼ
の取得には数ステップの精製工程を要し、工業化レベル
での酵素精製方法としては問題があった。そこで酵素の
特性を利用して簡易に精製酵素を得ることを目的とし
て、表面電荷が高い酵素蛋白に着眼したところ、従来知
られているアルカリα−アミラーゼの等電点は全て3.0
〜8.0程度であり、当該範囲を超える高い等電点を有す
るアルカリα−アミラーゼについては全く報告されてい
ないことが分かった。

【０００７】そして、従来のα−アミラーゼを配合した
洗浄剤においては、被洗物を洗浄液に長時間浸漬させて
おくことにより、澱粉質汚れに対する洗浄力を向上させ
ることはできるが、５〜30分という通常の洗浄時間内で
はα−アミラーゼの機能を十分に引出すことは困難であ
った。

【０００８】一方、本出願人らはプルラナーゼ、イソプ
ルラナーゼ及びイソアミラーゼからなる群から選ばれる
澱粉枝切り酵素を従来のα−アミラーゼと共に洗浄剤に
配合することにより、食器、繊維等に強固に付着した澱
粉質汚れに対する洗浄力が顕著に向上することを見出
し、特許出願した（特開平2-132194号公報）。

【０００９】しかしながら、かかる澱粉枝切り酵素を配
合した洗浄剤においても澱粉質汚れに対する洗浄力の改
善は十分ではなかった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、食
べこぼし汚れ等の澱粉質汚れに対し極めて優れた洗浄力
を有し、工業的に有利に製造し得る洗浄剤組成物を提供
することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは、上記条件を具備する液化型アルカリα−ア
ミラーゼを生産する微生物を自然界に求め、鋭意探索を
続けてきたところ、α−アミラーゼ活性とプルラナーゼ
活性を有する、分子量200,000±5,000の酵素を産生する
微生物として先に報告（特開平3-108482号公報）したバ
チルス属に属する微生物の培養物中に、液化型反応特性
を有する新規なアルカリα−アミラーゼを見出した。そ
して、この液化型アルカリα−アミラーゼと澱粉枝切り
酵素を併用して洗浄剤に配合すると、カレー、ケチャッ
プ等の食べこぼしによる複合的な汚れに対する洗浄力が
顕著に向上することを見出し、本発明を完成した。

【００１２】すなわち本発明は、澱粉枝切り酵素及び次
の酵素学的性質を有する液化型アルカリα−アミラーゼ
を含有する洗浄剤組成物に係るものである。

【００１３】(1)作用 澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分
解物のα-1,4グルコシド結合を分解し、アミロースから
はグルコース（G1）、マルトース（G2）、マルトトリオ
ース（G3）、マルトテトラオース（G4）、マルトペンタ
オース（G5）及びマルトヘキサオース（G6）を生成す
る。ただしプルランには作用しない。

【００１４】(2)等電点 等電点電気泳動法による等電点が8.5を超える。

【００１５】本発明に用いる液化型アルカリα−アミラ
ーゼは、洗浄剤配合成分としての観点より、至適pHを8.
0〜10.0の範囲内に有することが好ましい。

【００１６】かかる液化型アルカリα−アミラーゼを生
産する微生物としては、高ランダムに澱粉又は澱粉系多
糖類を分解する性質を有し、かつ至適pHがアルカリ領域
にあり、等電点の高いα−アミラーゼを生産する能力を
有するものであれば特に限定されないが、例えば特開平
3-108482号公報掲載のバチルス属に属するバチルスエス
ピー．（Bacillus sp.）KSM-AP1378（FERM BP-3048）が
挙げられる。

【００１７】上記の菌株を用いて液化型アルカリα−ア
ミラーゼを得るには、培地にこの菌株を接種し、常法に
従って培養すればよい。培地中には、資化し得る炭素源
及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好ましい。
この炭素源及び窒素源については特に制限はないが、そ
の例としては、窒素源としてコーングルテンミール、大
豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母エキ
ス、ファーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソイト
ン、ハイプロ、アジパワー、ソイビーンミール、綿実油
粕、カルチベーター、アジプロン、ゼストなどの有機窒
素源、及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、
酢酸アンモニウム等の無機窒素源が挙げられる。また炭
素源としては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロペクチ
ン、グリコーゲン、プルラン及びこれらの部分分解によ
り生じたオリゴ糖に加え、資化し得る炭素源、例えばグ
ルコース、マルトース、アラビノース、キシロース、リ
ボース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、麦
芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニット、ソル
ビット、グリセリンや資化し得る有機酸、例えば酢酸な
どが挙げられる。またその他、リン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コバルト塩、
ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必要であれ
ば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加すること
もできる。

【００１８】かくして得られた培養物中からの液化型ア
ルカリα−アミラーゼの採取及び精製は、一般の酵素の
採取及び精製の手段に準じて行うことができる。すなわ
ち、遠心分離又は濾過等の通常の固液分離手段により菌
体を培養液から除去して粗酵素を得ることができる。こ
の粗酵素液は、そのまま使用することもできるが、必要
に応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法、ゲル濾過法等
の分離手段により粗酵素を得、更に等電点が高いことを
利用してゲル等電点電気泳動法、密度勾配等電点電気泳
動法、イオン交換クロマトグラフィー等により精製結晶
化して、精製酵素として使用することも可能である。

【００１９】かくして得られるα−アミラーゼは、アル
カリ側に至適pHを有するのみならず、高ランダム分解
性、すなわち液化型であり、かつ等電点が高いという従
来のアルカリα−アミラーゼと異なる特異な性質を有す
るものである。以下に、菌株としてバチルス エスピ
ー．KSM-AP1378（FERM BP-3048）を用いて得られた液化
型アルカリα−アミラーゼの酵素化学的諸性質について
説明する。

【００２０】なお、酵素活性の測定は次の緩衝液（各々
40mM）を用い、以下の方法に従って行った。 pH４〜６： 酢酸緩衝液 pH６〜８： トリス−塩酸緩衝液 pH８〜11： グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝
液 pH11〜12： 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液

【００２１】酵素活性測定法（DNS法によるアミラーゼ
活性の測定）：各種緩衝液中に可溶性澱粉（和光純薬社
製，反応系における最終濃度は0.5％）を溶解させた緩
衝液0.9mlに、酵素液0.1mlを加え、40℃で、30分間反応
させた。反応後、3,5-ジニトロサリチル酸（DNS）法に
て、還元糖の定量を行った。すなわち、反応液1.0mlにD
NS試薬1.0mlを加え、５分間、100℃で加熱発色させ、冷
却後、4.0mlの脱イオン水を加えて希釈し、波長535nmで
比色定量した。酵素の力価は、１分間に１μmolのグル
コースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（１
Ｕ）とした。

【００２２】（酵素化学的諸性質） (1)作用 澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分
解物のα-1,4グルコシド結合を分解する。ただし、プル
ランには作用しない。なお、種々の基質に対する作用を
表１に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】(2)作用pH及び至適pH pH5.0〜11.0付近の範囲で作用し、至適pHは8.0〜9.0で
ある（図１）。

【００２５】(3)pH安定性 pH6.5から10.0で極めて安定であり、pH5.0〜10.5におい
ても約50％以上の活性を維持する（図２）。

【００２６】(4)作用温度範囲及び最適温度 20〜80℃の広範囲で作用し、最適作用温度は45〜55℃で
ある（図３）。

【００２７】(5)温度安定性 本酵素についてpH8.5の条件で温度を変化させ、各温度
で30分間処理することにより失活の条件を調べると50℃
までは極めて安定であった（図４）。

【００２８】(6)分子量 ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法（12.5％ポリアクリルアミドゲル，95℃，４分処
理，Quick CBB染色）により測定した分子量は50,000±
5,000である（図５）。

【００２９】(7)等電点 等電点電気泳動法により測定した等電点は、8.7〜9.7、
具体的には9.2付近である。

【００３０】(8)金属塩の影響 表２に示す各種金属塩を反応系に共存させて50℃で15分
間処理してその影響を調べたところ、一般に水道水中に
含まれるＫ⁺、Na⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Fe
²⁺、Fe³⁺及びAl³⁺に対して極めて安定であった。

【００３１】

【表２】

【００３２】(9)界面活性剤の影響 各種界面活性剤（例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホ
ン酸ナトリウム（LAS）、アルキル硫酸エステルナトリ
ウム（AS）、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル
ナトリウム（ES）、アルキルスルホン酸ナトリウム（SA
S）、石鹸及びポリオキシエチレンアルキルエーテル）
の0.05％溶液で40℃、30分間処理してもほとんど活性阻
害は受けなかった。

【００３３】(10)澱粉の加水分解率 ポテト由来澱粉の分解率は約32％であり、またアミロー
ス（重合度：グルコース117個）からはグルコース（G
1）、マルトース（G2）、マルトトリオース（G3）、マ
ルトテトラオース（G4）、マルトペンタオース（G5）及
びマルトヘキサオース（G6）を分解生成する。

【００３４】(11)Ｎ末端アミノ酸配列の解析 本アミラーゼのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解法
〔Edman, P.,Acta Chem.Scand., 4, 283(1948)〕により
プロテインシーケンサー477A（ABI社製）を用いて測定
した結果、液化型アミラーゼ特有の共通配列（Asn−Gly
−Thr−Met−(Met)−Gln−Tyr−Phe−Glu−Trp）がＮ末
端領域に存在することが判った。なお、液化型α−アミ
ラーゼのＮ末端領域に関する文献としては、J. Bioche
m., 98, 1147-1156(1985)、J. Biochem., 98, 95-103(1
985)等が挙げられる。

【００３５】本発明に用いられる澱粉枝切り酵素として
はプルラナーゼ、イソプルラナーゼ及びイソアミラーゼ
が挙げられる。これら澱粉枝切り酵素は、α−アミラー
ゼ及びβ−アミラーゼと同様に澱粉質の分解に関与する
ものであるが、α−アミラーゼ及びβ−アミラーゼがア
ミロース及びアミロペクチン中の糖鎖のα-1,4結合を切
断するのに対して、プルラナーゼ及びイソアミラーゼは
アミロペクチン中の糖鎖のα-1,6結合を、イソプルラナ
ーゼは糖鎖のα-1,6結合近傍のα-1,4結合を選択的に切
断する酵素として知られている。すなわちアミロペクチ
ン中の分岐鎖を切断する点でα−アミラーゼ及びβ−ア
ミラーゼと異なっている。

【００３６】これらの澱粉枝切り酵素は種々の起源から
得られるが、一般には菌類から誘導される。好適な澱粉
枝切り酵素としては、クレブシェラ属に属する菌、バチ
ルス属に属する菌、アスペルギルス属に属する菌、シュ
ードモナス属に属する菌等から得られたアミロペクチン
-6-グルカノヒドラーゼ活性を示すプルラナーゼ、イソ
プルラナーゼ及びイソアミラーゼが挙げられる。

【００３７】また、澱粉枝切り酵素は市販品を用いるこ
ともできる。市販されているプルラナーゼとしては、ス
プレンターゼ（天野製薬社製）、プロモザイム200L（ノ
ボ・インダストリー社製）等が、イソアミラーゼとして
は、イソアミラーゼ（生化学工業社製）等が挙げられ
る。

【００３８】澱粉枝切り酵素としては、アルカリ性、特
にpH８〜11に至適pHを有するものが好ましく、特にアル
カリプルラナーゼが好ましい。アルカリプルラナーゼ生
産菌としては、バチルス エスピー．KSM-AP1876（FERM
BP-3049）が利用できる。ここで、至適pHは、0.25％プ
ルラン、10mM酢酸緩衝液（pH４〜６）、リン酸緩衝液
（pH６〜８）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝
液（pH８〜11）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩
衝液（pH11〜12）の反応系を用い、45℃で10分間反応さ
せて測定することができる。

【００３９】本発明の洗浄剤組成物への液化型アルカリ
α−アミラーゼの配合量は、ポテト由来可溶化澱粉の分
解活性にして１〜10,000U/g、更に５〜5,000U/g、特に1
0〜1,000U/gが好ましい。また、液化型アルカリα−ア
ミラーゼと澱粉枝切り酵素との配合比率は、ポテト由来
可溶化澱粉の分解活性にして100/1〜1/10、特に50/1〜2
/1の範囲内が好ましい。

【００４０】また、本発明の洗浄剤組成物には、公知の
洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成
分としては、例えば次のものが挙げられる。

【００４１】(1)界面活性剤：平均炭素数10〜16のアル
キル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、平
均炭素数10〜20の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、
１分子内に平均0.5〜８モルのエチレンオキサイドを付
加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均炭素数10〜20のア
ルキル基を有するアルキル硫酸塩、平均炭素数10〜20の
オレフィンスルホン酸塩、平均炭素数10〜20のアルカン
スルホン酸塩、平均炭素数10〜20のα−スルホ脂肪酸メ
チルエステル塩あるいはα−スルホ脂肪酸エチルエステ
ル塩、平均炭素数８〜20の高級脂肪酸塩、平均炭素数10
〜20の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、１分子内に
平均0.5〜８モルのエチレンオキサイドを付加したアル
キルエーテルカルボン酸塩などのアニオン性界面活性
剤；平均炭素数10〜20のアルキル基を有し、１〜20モル
のエチレンオキシドを付加したポリオキシエチレンアル
キルエーテル、高級脂肪酸アルカノールアミド又はその
アルキレンオキサイド付加物、またプロピレンオキサイ
ドとプロピレングリコールとの縮合物にエチレンオキサ
イドを付加させた「プルロニック」という名称で知られ
ているものなどの非イオン性界面活性剤；その他ベタイ
ン型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リ
ン酸エステル系界面活性剤、アミノ酸型界面活性剤、カ
チオン性界面活性剤など。特に、アニオン性界面活性剤
及び／又は非イオン性界面活性剤を配合するのが好まし
い。

【００４２】これらの界面活性剤は洗浄剤組成物中0.5
〜60重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉体状
洗浄剤組成物については10〜45％、液体洗浄剤組成物に
ついては20〜50％配合することが好ましい。また、本発
明洗浄剤組成物が漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗浄
剤である場合、界面活性剤は一般に１〜10％、好ましく
は１〜５％配合される。

【００４３】(2)二価金属イオン捕捉剤：トリポリリン
酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸
塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶
性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢
酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカ
ルボン酸塩など。配合量は０〜50％、特に５〜40％とす
るのが好ましい。また、リンを含有しない二価金属イオ
ン捕捉剤を用いることがより好ましい。

【００４４】(3)アルカリ剤及び無機塩：ケイ酸塩、炭
酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、アルカノールアミンな
ど。配合量は０〜80％、特に１〜40％とするのが好まし
い。

【００４５】(4)再汚染防止剤：ポリエチレングリコー
ル、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸コポリマー、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキ
シメチルセルロースなど。再汚染防止剤の一部は、二価
金属イオン捕捉剤としても使用できる。配合量は０〜10
％、特に１〜５％とするのが好ましい。

【００４６】(5)酵素：セルラーゼ、液化型アルカリα
−アミラーゼ以外のアミラーゼ、リパーゼ、ヘミセルラ
ーゼ、β−グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、
コレステロールオキシダーゼ、プロテアーゼなど。

【００４７】(6)水道水中の有効塩素の捕捉剤又は還元
剤：有効塩素の捕捉剤として、硫酸アンモニウム、尿
素、塩酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸
グアニジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、
ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、またグリ
シン、グルタミン酸ナトリウム等で代表されるアミノ酸
及び牛血清アルブミン、カゼインなどの蛋白質、更には
蛋白質の加水分解物、肉エキス、魚肉エキスなどが挙げ
られる。還元剤として、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、亜ニチ
オン酸塩等のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、
ロンガリットＣなどが挙げられる。特に亜硫酸塩が好ま
しく、洗濯液中の酵素を安定化させる。

【００４８】(7)漂白剤：過炭酸塩、過硼酸塩、スルホ
ン化フタロシアニンの亜鉛塩又はアルミニウム塩、過酸
化水素など。漂白洗浄剤とする場合は、特に過炭酸ナト
リウムが効果的であり、配合量は１〜95％、更に５〜95
％、特に20〜95％とするのが好ましい。

【００４９】(8)蛍光染料：通常洗浄剤に用いられる蛍
光染料。

【００５０】(9)可溶化剤：液体洗剤の場合には次のよ
うな可溶化剤を用いることができる。エタノール等の低
級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスル
ホン酸塩等の低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プロ
ピレングリコール等のポリオール類など。

【００５１】(10)その他：上記以外に、従来公知の香
料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、
防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤、酵素安定化
剤、相調節剤等の洗剤に常用の成分を必要に応じて配合
することができる。

【００５２】本発明の洗浄剤組成物は、前記の澱粉枝切
り酵素、液化型アルカリα−アミラーゼ及び上記公知の
洗浄成分を組み合せ、常法に従い製造することができ
る。洗浄剤の形態は、用途に応じて選択することがで
き、例えば液体、粉末、顆粒等とすることができる。ま
た、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、漂白洗浄
剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、配水管洗浄剤、義歯洗浄
剤等として使用することができるが、特に衣料用洗浄
剤、漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗浄剤として好適
に使用することができる。

【００５３】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００５４】参考例１ 特開平3-108482号公報の実施例１に記載のバチルス エ
スピー．KSM-AP1378（FERM BP-3048）株を１％可溶性澱
粉（ポテト由来）、1.0％ポリペプトン、0.5％酵母エキ
ス、0.1％ＫＨ₂ＰＯ₄、0.25％Ｎａ₂ＨＰＯ₄・12Ｈ₂Ｏ、
0.02％ＭｇＳＯ4・７Ｈ₂Ｏ、0.02％ＣａＣｌ₂・２Ｈ
₂Ｏ、0.001％ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、0.0001％ＭｎＣｌ₂
・４Ｈ₂Ｏ及び1.0％Ｎａ₂ＣＯ₃を含む培地で、30℃にて
３日間好気的に振盪培養し、得られた培養液から菌体を
除き、上澄液を得た。次いで、該上澄液に硫安を20％飽
和になるように加え、５℃にて２時間撹拌し蛋白を沈澱
させ遠心分離にて除去した。更に該上澄液に硫安を40％
飽和になるように加え、５℃にて12時間撹拌し蛋白を沈
澱させた後、遠心分離により沈澱物を回収し、10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH８）に懸濁した後、同緩衝液にて一
昼夜透析した。次いで透析液を高速液体クロマトを用い
たゲル濾過（TSK-G3000SWカラム）にて分画し、その活
性画分を集めた。集められた活性画分は、限外濾過膜を
用いて濃縮した後、10mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）を
用いて一夜透析した。かくして得られる精製酵素は、ソ
ディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度7.5％）で単一のバンドを与え、活性収率は
約6.4％であった。得られた酵素は前記の酵素化学的性
質を有していた。

【００５５】実施例１ アルカリプルラナーゼ及び液化型アルカリα−アミラー
ゼを配合した洗浄剤と、アルカリプルラナーゼ及び従来
のα−アミラーゼ活性を有する酵素を配合した洗浄剤の
洗浄力を比較した。なお、以下におけるDNS試薬の調製
法、酵素活性の測定・算出方法、汚染布の作製法、洗浄
力の評価方法を下に示す。

【００５６】〈DNS試薬の調製法〉水酸化ナトリウム16
ｇをイオン交換水200mlに溶解する。これに DNS ５ｇを
徐々に添加しながら溶解する。DNSを完全に溶解させた
後、酒石酸ナトリウムカリウムを300ｇ加える。完全に
溶解させた後、イオン交換水にて1000mlに調製する。

【００５７】〈可溶性澱粉分解活性の測定方法（酵素配
合量の決定）〉 (1)基質 ポテト由来可溶性澱粉（和光純薬社製）の0.5％水溶液 (2)基質溶液の調製 1.0ｇのポテト由来可溶性澱粉（和光純薬社製）を100ml
のイオン交換水に溶解する。 (3)サンプルの調製 試験管に基質溶液を0.5ml入れ、そこに50mMリン酸緩衝
液（pH7.0）0.4ml及び適当に希釈した酵素液0.1mlを加
え、40℃の恒温槽中で30分間反応させる。反応終了後、
DNS試薬を１ml添加し、沸騰水中で正確に５分間発色さ
せ、発色後、直ちに氷水浴中に入れ冷却する。冷却後、
イオン交換水４mlを加え、よく混合し、速やかに535nm
における吸光度を測定する。 (4)ブランクの調製 試験管に基質溶液を0.5ml入れ、そこに50mMリン酸緩衝
液（pH7.0）0.4ml及びDNS試薬を１ml添加し、沸騰水中
で正確に５分間発色させ、発色後、直ちに氷水浴中に入
れ冷却する。冷却後、イオン交換水４mlを加え、よく混
合し、速やかに535nmにおける吸光度を測定する。 (5)検量線の作成 試験管に基質溶液を0.5ml入れ、そこに50mMリン酸緩衝
液（pH7.0）を0.4ml、更にブドウ糖濃度が260〜1500μ
Ｍになるように検量線用ブドウ糖溶液を0.1ml加える。
そこにDNS試薬を１ml添加し、沸騰水中で正確に５分間
発色させ、発色後、直ちに氷水浴中に入れ冷却する。冷
却後、イオン交換水４mlを加え、よく混合し、速やかに
535nmにおける吸光度を測定する。横軸にブドウ糖濃
度、縦軸に吸光度をとり傾きを求め、換算係数（Ｆ）を
次式に従って算出する。 Ｆ＝〔１／(傾き)〕×〔１／15〕×〔１／0.1〕 次に、アミロースに対する分解活性を次式に従って算出
する。 活性（Ｕ／リットル）＝δ吸光度×Ｆ×希釈倍率 （δ吸光度＝サンプルの吸光度−ブランクの吸光度）

【００５８】〈カレー人工汚染布の作製方法〉ボンカレ
ーゴールド中辛（大塚食品社製）をミキサーにて粉砕
し、綿布をこの液に接触、ブラッシングし、過剰付着汚
れを脱落させた後、10cm×10cmの試験片を調製する。

【００５９】〈洗浄力の評価方法〉汚染前の原布及び洗
浄前後の汚染布の460nmにおける反射率を自記色彩計
（島津製作所社製）にて測定し、次式から求まる洗浄率
（％）により、洗浄力を評価した。

【００６０】

【数１】

【００６１】〈液体洗剤の調製〉表３に示す成分の５倍
濃度の溶液を調製し、１Ｎ塩酸にてpHを7.0に調整す
る。次いでイオン交換水で表３に示す濃度にまで希釈
し、pH7.0の液体洗剤を得た。

【表３】 成 分 配合量(％) アルカリプルラナーゼ^*1 0.1 非イオン性界面活性剤^*2 25.0 アニオン性界面活性剤^*3 15.0 クエン酸 5.0 モノエタノールアミン 5.0 ポリエチレングリコール（平均分子量約１万） 1.0 エタノール 5.0 水 バランス 総計 100.0

【００６２】＊１：バチルス エスピー．KSM-AP1876
（FERM BP-3049）由来，比活性20,000U/g ＊２：アルキル基の平均炭素数12（直鎖）、EO平均付加
モル数７のポリオキシエチレンアルキルエーテル ＊３：炭素数12〜14の直鎖アルキル基を有し、EO平均付
加モル数が2.5のポリオキシエチレンアルキル硫酸ナト
リウム

【００６３】得られた液体洗剤1.3mlを４°DHの水１リ
ットルに添加し、更にpH7.0において各種のα−アミラ
ーゼを150Ｕ／リットルとなるように加えて洗浄液を調
製した（各酵素の実際の添加量は１ml以下になるので、
酵素添加によるスケールアップは無視する）。30℃に調
整した該洗浄液１リットルにカレー人工汚染布を浸漬
し、30分間静置する。静置後、洗剤溶液と人工汚染布を
そのままターゴトメーター用ステンレスビーカー（１リ
ットル）に移し、ターゴトメーターにて100rpm、20℃、
10分間攪拌する。流水下で充分すすいだ後、アイロンプ
レスを行い、反射率を測定し、洗浄率を求めた。この結
果を表４に示す。表４より、活性が同じ条件であって
も、液化型アルカリα−アミラーゼを配合した洗浄剤は
従来のα−アミラーゼを配合した洗浄剤より優れた洗浄
力を有することがわかる。

【００６４】

【表４】

【００６５】＊１：バチルス エスピー．KSM-AP1378
（FERM BP-3048）由来，分子量約50,000 ＊２：バチルス サブチリス由来（和光純薬社製） ＊３：バチルス エスピー．KSM-AP1378（FERM BP-304
8）由来，分子量約200,000〔特開平3-108482号公報記載
のプルラナーゼ活性及びα−アミラーゼ活性（糖化型）
を有する酵素〕 ＊４：アスペルギルス オリザエ由来（シグマ社製） ＊５：ブタ膵臓由来（シグマ社製） ＊６：バチルス リケニホルミス（ターマミル，ノボ社
製）

【００６６】実施例２ 以下のようにして調製した洗剤粒子、アルカリプルラナ
ーゼ造粒品及び液化型アルカリα−アミラーゼ造粒品を
ドライブレンドして表５に示す組成の粒状洗剤を調製
し、洗浄力を評価した。

【００６７】〈洗浄剤の製法〉 (1) 表５に示す成分（α−アミラーゼ及びプルラナー
ゼ以外）のうち、4A型ゼオライト10％、蛍光増白剤及び
香料を除いた成分からなる50％水分量のスラリー混合物
を調製し、噴霧乾燥して洗剤生地粒子を得る。これをハ
イスピードミキサーに入れて粉砕造粒し、先に除いてお
いた成分を添加して洗剤粒子を得た（本発明品３，６以
外）。 (2) 表５に示す本発明品３の成分（α−アミラーゼ及
びプルラナーゼ以外）のうち、非イオン界面活性剤、4A
型ゼオライト10％、吸油担体、蛍光増白剤及び香料を除
いた成分からなる50％水分量のスラリー混合物を調製
し、噴霧乾燥して洗剤生地粒子を得る。これをハイスピ
ードミキサーに入れて粉砕造粒し、先に除いておいた成
分を添加して洗剤粒子を得た（本発明品３）。 (3) 表５に示す本発明品６の成分（α−アミラーゼ及
びプルラナーゼ以外）のうち、非イオン界面活性剤、4A
型ゼオライト10％、蛍光増白剤及び香料を除いた成分を
レディゲミキサーにて攪拌しながら非イオン界面活性剤
を徐々に添加する。添加後、残る成分を添加して洗剤粒
子を得た（本発明品６）。 (4) 実施例１で得られた液化型アルカリα−アミラー
ゼ又はバチルス エスピー．KSM-AP1876（FERM BP-304
9）由来のアルカリプルラナーゼを、芒硝と少量のポリ
エチレングリコールでそれぞれ造粒し、(1)〜(3)で得た
洗剤粒子とドライブレンドし、表５に示す組成の粒状洗
剤を得た。

【００６８】〈評価方法〉得られた粒状洗剤を４°DHの
水に添加して、0.0833％水溶液の洗浄液を調製した。30
℃に調整した該洗浄液１リットルに、実施例１と同様に
して調製したカレー人工汚染布を浸漬し、10分間静置す
る。静置後、洗剤溶液と人工汚染布をそのままターゴト
メーター用ステンレスビーカー（１リットル）に移し、
ターゴトメーターにて100rpm、20℃、10分間撹拌する。
流水下で充分すすいだ後、アイロンプレスを行い、実施
例１と同様にして反射率を測定し、洗浄率を求めた。こ
の結果を表５に示す。

【００６９】

【表５】

【００７０】＊１：バチルス エスピー．KSM-AP1876
（FERM BP-3049）由来，比活性2,000U/g（造粒品として
の活性） ＊２：バチルス エスピー．KSM-AP1378（FERM BP-304
8）由来，分子量約50,000，比活性3,000U/g（造粒品と
しての活性） ＊３：炭素数12〜14，中和度100％ ＊４：平均粒径0.9μｍ ＊５：ポリオキシエチレンアルキルエーテル（EO平均付
加モル数８，アルキル基炭素数12） ＊６：直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ア
ルキル基炭素数12〜16） ＊７：アルキル硫酸ナトリウム（アルキル基炭素数12〜
14） ＊８：平均分子量約8,000。配合量はα−アミラーゼ粒
子中のものを除く。 ＊９：平均分子量約10,000 ＊10：トクシールNR（徳山曹達社製） ＊11：チノパールCBS（チバガイギー社製）

【００７１】実施例３ 表６に示す組成の液体洗剤を調製し、実施例１と同様に
洗浄試験を行い、洗浄率を求めた。この結果を表６に示
す。

【００７２】

【表６】

【００７３】＊１：バチルス エスピー．KSM-AP1876
（FERM BP-3049）由来，比活性2,000U/g（水希釈後の活
性） ＊２：バチルス エスピー．KSM-AP1378（FERM BP-304
8）由来，分子量約50,000，比活性3,000U/g（水希釈後
の活性） ＊３：ポリオキシエチレンアルキルエーテル（EO平均付
加モル数７，アルキル基炭素数12〜14） ＊４：ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム（EO
平均付加モル数2.5，アルキル基炭素数12〜14） ＊５：平均分子量約8,000 ＊６：チノパールCBS（チバガイギー社製）

【００７４】実施例４ 表７に示す組成のうち、過炭酸ナトリウムとソーダ灰
（デンス灰）を撹拌混合しながら、ポリアクリル酸ナト
リウム40％水溶液及び直鎖アルキルベンゼンスルホン酸
ナトリウム又は非イオン性界面活性剤を添加した。次い
で実施例２で用いたアルカリプルラナーゼ造粒物及び液
化型アルカリα−アミラーゼ造粒物を添加し全体的に均
一になる程度に撹拌することにより、表７記載の漂白洗
浄剤を得た。漂白条件は0.05％水溶液、40℃、30分間と
する以外は実施例２と同じ条件とし、洗浄率を求めた。
結果を表７に併せて示した。

【００７５】

【表７】

【００７６】＊１：粒径500〜700μｍ ＊２：直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（炭
素数12〜14） ＊３：ポリオキシエチレンアルキルエーテル（アルキル
基の炭素数12〜14，EO平均付加モル数12） ＊４：平均分子量約8,000

【００７７】実施例５ 表８に示す組成の自動食器洗浄用洗剤を、実施例４と同
様にして調製した。

【００７８】

【表８】

【００７９】＊１：ポリオキシエチレン−ポリオキシプ
ロピレン共重合体（平均分子量2,000，旭電化工業社
製） ＊２：炭素数12〜14のsec-アルコールのエチレンオキサ
イド７モル及びプロピレンオキサイド8.5モル付加物
（日本触媒工業社製） ＊３：平均分子量約8,000 得られた自動食器洗浄用洗剤について、下記条件で洗浄
評価を行ったところ、いずれも優れた洗浄効果が得られ
た。

【００８０】〈汚染皿の調製〉軟質の炊き上がり米飯を
30分間室温に放置し、３ｇを直径25cmの磁性の皿に引き
伸ばし塗布し、室温で一昼夜風乾したもの６枚を試験に
供する。

【００８１】〈米飯汚れの洗浄力評価方法〉洗浄後の皿
の米飯の残存液を、ヨード呈色反応によって、肉眼判定
する。

【００８２】〈洗浄力試験法〉 洗浄条件： ・使用機種；松下電器（株）製全自動食器洗い機NP-720
（洗浄剤水溶液が回転ノズルから噴射され、その噴射軌
道上面に設置された食器類を洗浄する形式のもの） ・洗浄温度；５℃から55℃まで徐々に上昇する。 ・使用水；硬度3.5°DHの水 ・洗浄剤濃度；0.2重量％ ・洗浄時間；洗浄20分→すすぎ20分 ・洗浄時の循環水量；2.5リットル

【００８３】

【発明の効果】本発明の洗浄剤組成物は、特に食べこぼ
し汚れ等の澱粉質汚れに対して優れた洗浄力を有する。
また本発明の洗浄剤組成物に配合する液化型アルカリα
−アミラーゼは、高い等電点を有し簡易に精製できるた
め、本発明の洗浄剤組成物は、工業的に有利に製造でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】バチルス エスピー．KSM-AP1378（FERM BP-30
48）由来の液化型アルカリα−アミラーゼの作用pHを示
す図である。

【図２】バチルス エスピー．KSM-AP1378（FERM BP-30
48）由来の液化型アルカリα−アミラーゼのpH安定性を
示す図である。

【図３】バチルス エスピー．KSM-AP1378（FERM BP-30
48）由来の液化型アルカリα−アミラーゼの作用温度範
囲を示す図である。

【図４】バチルス エスピー．KSM-AP1378（FERM BP-30
48）由来の液化型アルカリα−アミラーゼの温度安定性
を示す図である。

【図５】バチルス エスピー．KSM-AP1378（FERM BP-30
48）由来の液化型アルカリα−アミラーゼのソディウム
ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を
示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１１Ｄ 3:386） (56)参考文献 特開 平６−172796（ＪＰ，Ａ) 国際公開94／026881（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C11D 3/386 C11D 1/02 C11D 1/66 C11D 10/02

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 澱粉枝切り酵素及び次の酵素学的性質を
   有する液化型アルカリα−アミラーゼを含有することを
   特徴とする洗浄剤組成物。 (1)作用 澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分
   解物のα-1,4グルコシド結合を分解し、アミロースから
   はグルコース（G1）、マルトース（G2）、マルトトリオ
   ース（G3）、マルトテトラオース（G4）、マルトペンタ
   オース（G5）及びマルトヘキサオース（G6）を生成す
   る。ただしプルランには作用しない。 (2)等電点 等電点電気泳動法による等電点が8.5を超える。
2. 【請求項２】 液化型アルカリα−アミラーゼの等電点
   が、8.7〜9.7である請求項１記載の洗浄剤組成物。
3. 【請求項３】 液化型アルカリα−アミラーゼの至適pH
   が、8.0〜10.0である請求項１又は２記載の洗浄剤組成
   物。
4. 【請求項４】 液化型アルカリα−アミラーゼが、次の
   酵素学的性質を有するものである請求項１〜３のいずれ
   かに記載の洗浄剤組成物。 (1)作用 澱粉、アミロース、アミロペクチン及びそれらの部分分
   解物のα-1,4グルコシド結合を分解し、アミロースから
   はグルコース（G1）、マルトース（G2）、マルトトリオ
   ース（G3）、マルトテトラオース（G4）、マルトペンタ
   オース（G5）及びマルトヘキサオース（G6）を生成す
   る。ただしプルランには作用しない。 (2)作用pH及び至適pH pH5.0〜11.0の範囲で作用し、至適pHは8.0〜9.0であ
   る。 (3)pH安定性 pH6.5〜10.0の範囲で極めて安定であり、pH5.0〜10.5に
   おいても、50％以上の活性を維持する（40℃，30分間処
   理）。 (4)作用温度範囲及び最適温度 20〜80℃の範囲で作用し、最適作用温度は45〜55℃であ
   る。 (5)温度安定性 50℃以下で極めて安定である（pH8.5のグリシン−食塩
   −水酸化ナトリウム緩衝液中，30分間処理）。 (6)分子量 ソディウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳
   動法による分子量は50,000±5,000である。 (7)等電点 等電点電気泳動法による等電点は9.2付近である。 (8)金属塩の影響 Ｋ⁺、Na⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺
   及びAl³⁺に対して極めて安定である。 (9)界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル
   硫酸エステルナトリウム、ポリオキシエチレンアルキル
   硫酸エステルナトリウム、アルキルスルホン酸ナトリウ
   ム、石鹸及びポリオキシエチレンアルキルエーテルによ
   ってほとんど活性阻害を受けない。
5. 【請求項５】 液化型アルカリα−アミラーゼが、Ｎ末
   端アミノ酸領域に、Asn−Gly−Thr−Met−(Met)−Gln−
   Tyr−Phe−Glu−Trpの配列を有する請求項１〜４のいず
   れかに記載の洗浄剤組成物。
6. 【請求項６】 液化型アルカリα−アミラーゼが、バチ
   ルス エスピー．（Bacillus sp.）KSM-AP1378（FERM B
   P-3048）から生産されたものである請求項１〜５のいず
   れかに記載の洗浄剤組成物。
7. 【請求項７】 液化型アルカリα−アミラーゼの配合量
   が、可溶化澱粉に対する分解活性で、１〜10,000U/gで
   ある請求項１〜６のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
8. 【請求項８】 澱粉枝切り酵素の可溶性澱粉に対する至
   適pHが、８〜11である請求項１〜７のいずれかに記載の
   洗浄剤組成物。
9. 【請求項９】 澱粉枝切り酵素が、アルカリプルラナー
   ゼである請求項１〜８のいずれかに記載の洗浄剤組成
   物。
10. 【請求項１０】 アルカリプルラナーゼが、バチルス
    エスピー．（Bacillus sp.）KSM-AP1876（FERM BP-304
    9）から生産されたものである請求項９記載の洗浄剤組
    成物。
11. 【請求項１１】 液化型アルカリα−アミラーゼと澱粉
    枝切り酵素との配合比率が、可溶性澱粉に対する分解活
    性で、100/1〜1/10である請求項１〜10のいずれかに記
    載の洗浄剤組成物。
12. 【請求項１２】 アニオン性界面活性剤及び／又は非イ
    オン性界面活性剤を0.5〜60重量％含有する請求項１〜1
    1のいずれかに記載の洗浄剤組成物。