JPH0699715B2 - 自動食器洗浄機用洗浄剤組成物 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、澱粉質汚れのみならず、澱粉質の汚れと油脂
汚れ、蛋白質汚れ等が混じり合った複合汚れに対する洗
浄力の優れた自動食器洗浄機用洗浄剤組成物に関するも
のである。

〔従来の技術及びその課題〕

現在家庭用に普及している自動食器洗浄機は、加温した
洗浄剤水溶液を回転式スプレーアームノズルにより食器
に噴射して洗浄し、その後連続して、すすぎ工程、乾燥
工程に入るタイプのものである。この様な洗浄機による
汚れ落ちは、機械力、洗浄温度、洗浄時間により大きく
左右されるが、これらの要素は洗浄機の特性として各洗
浄機に固有のものである。この為、自動食器洗浄機用洗
剤は、一定の機械力、洗浄温度、洗浄時間の下で種々の
汚れに有効に作用し、高い洗浄力を発揮できるものでな
ければならない。

従来の自動食器洗浄機用洗剤は、炭酸塩、珪酸塩、ほう
酸塩等のアルカリ剤を主成分とし、これに使用水中の硬
度成分によるスケールの食器或いは洗浄機内への付着を
防止する目的でトリポリリン酸塩、オルトリン酸塩、ピ
ロリン酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、ニトリロ三酢
酸塩等のキレート剤が配合されている。また、界面活性
剤は、洗浄時に発泡し、洗浄機の運転に支障を来すこと
のない様に、低泡性の非イオン性界面活性剤が少量配合
されているか、もしくは全く含まないものが多く、洗浄
剤水溶液の液性は強アルカリ性のものが多い。この様な
洗浄剤は、油汚れに対する洗浄力は強いが、澱粉質の汚
れや、澱粉質の汚れと蛋白質汚れ、油汚れ等が混じり合
った複合汚れに対する洗浄力は充分とは言えず、また食
器の光沢を失わしめると言う欠点があった。

一方、澱粉質の汚れ、例えば、日本人の主食である米飯
のこびりつき汚れ等に対しては、澱粉加水分解酵素が有
効であるとされ、一般的には澱粉分子のα−1,4−グリ
コシド結合に作用するα−アミラーゼが使用されてい
る。しかし、食器類に強固に付着した澱粉質の汚れを短
時間で落とすことは、自動食器洗浄機用洗剤にα−アミ
ラーゼを配合しても未だ充分とは言えなかった。これに
対し、本発明者らは特定のプルラナーゼが食器等に強固
に付着した澱粉質汚れに効果的に作用し洗浄力を顕著に
向上せしめ得ることを見出した（特開平2-132193号、及
び特開平2-132194号）。しかしながら、かかるプルラナ
ーゼを用いても、澱粉質の汚れと蛋白質汚れ、油汚れ等
が複雑に混じり合った複合汚れに対しては、まだまだ満
足できる洗浄レベルには達し得なかった。

従って、澱粉質汚れ、油脂汚れ、蛋白質汚れ等が複雑に
混じり合った複合汚れに対して有効に作用し、高い洗浄
力を発揮できる自動食器洗浄機用洗浄剤組成物が望まれ
ていた。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実情において本発明者らは、鋭意研究を行った結
果、特定の非イオン性界面活性剤及びカルシウム捕捉キ
レート剤に、特定のアルカリプルラナーゼ及びリパーゼ
を配合し、特定のpH範囲を有する洗浄剤組成物が、上記
複合汚れに対して有効に作用し、高い洗浄力を発揮する
ことを見出し本発明を完成した。

すなわち本発明は、次の成分（ａ）〜（ｄ） （ａ） 非イオン性界面活性剤 １〜30重量％ （ｂ） カルシウムイオン捕捉キレート剤１〜50重量％ （ｃ） リパーゼ （ｄ） 次の酵素学的性質を有するアルカリプルラナー
ゼ １）作用 プルランのα−1,6グルコシド結合を分解してマルトト
リオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、グ
リコーゲン又はこれらの部分分解物のα−1,6グリコシ
ド結合を加水分解する。

２）基質特異性 α−1,6グルコシド結合で分岐した枝分かれ構造を有す
る糖のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分かれ
構造を加水分解する。

３）作用pH及び至適pH 作用pHはpH5〜11の範囲であり、至適pHは9.5〜11の範囲
である。

４）pH安定性 pH8〜10の範囲で極めて安定であり、pH7〜10.5の範囲に
於いても、50％以上の相対活性を有する（45℃、10分間
処理による）。

５）作用温度範囲及び最適温度 10〜60℃の範囲で作用し、その最適作用温度は約50℃で
ある。

６）温度安定性 40℃までは極めて安定である（pH9.5の10mMグリシン−
食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、30分間処理によ
る）。

７）分子量 ソディウムドデシル硫酸電気泳動法による分子量は120,
000±5,000である。

８）金属イオンの影響 Hg²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺及びPb²⁺で阻害される。

９）界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ソディウ
ムドデシル硫酸、石鹸及びソフタノール等の界面活性剤
によって殆ど活性阻害を受けない。

10）キレート剤の影響 EDTA、EGTA、クエン酸及びゼオライトで殆ど活性阻害を
受けない。

11）プロテアーゼ耐性 アルカリプロテアーゼに対して強い耐性を有する。

を含有し、0.2重量％水溶液のpHが７〜10である自動食
器洗浄機用洗浄剤組成物を提供するものである。

本発明に用いる（ａ）成分の非イオン性界面活性剤とし
ては、次の一般式（Ｉ） R¹O（C₂H₄O）ｍ（C₃H₇O）nH （Ｉ） （式中、R¹は炭素数８〜20のアルキル若しくはアルケニ
ル基であり、ｍは平均付加モル数で５〜15の数を示し、
ｎは平均付加モル数で３〜15の数を示す） で表わされる高級アルコールのエチレンオキシドとプロ
ピレンオキシド付加体、分子量1,000〜10,000のポリオ
キシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体、
1,000〜10,000の分子量を有するエチレンジアミンのポ
リオキシエチレンポリオキシプロピレン付加体等が好ま
しい例として挙げられる。これらの非イオン性界面活性
剤は一種でも二種以上を混合して用いてもよい。本発明
組成物中への非イオン性界面活性剤（ａ）の配合量は１
〜30重量％である。１重量％未満では、油汚れ及びリパ
ーゼによる分解物（主に脂肪酸）を洗浄液中に分散させ
る作用が不充分であり、30重量％を超えると発泡が多く
なりすぎ、洗浄機の運転に支障を来すおそれがあり、い
ずれも好ましくない。特に好ましい配合量は２〜10重量
％である。

本発明に用いられる（ｂ）成分のカルシウムイオン捕捉
キレート剤としては例えばクエン酸塩、リンゴ酸塩、酒
石酸塩等のヒドロキシ多価カルボン酸、ポリアクリル酸
塩、アクリル酸と無水マレイン酸との共重合体の塩、無
水マレイン酸とメチルビニルエーテルとの共重合体の
塩、無水マレイン酸とオレフィンとの共重合体の塩、ア
クリル酸とメタクリル酸との共重合体の塩等の高分子電
解質、無水マレイン酸と酒石酸の縮合物、ゼオライト等
が挙げられる。

（ｂ）成分のキレート剤は、そのキレート効果を有効に
発揮させるため本発明組成物中に１〜50重量％配合され
る。１重量％未満ではキレート効果が不充分であり、50
重量％を超えるとリパーゼ活性を阻害するため好ましく
ない。

本発明の（ｃ）成分であるリパーゼは、市販のもの、例
えば、リパーゼAP、リパーゼM-AP、リパーゼＰ、リパー
ゼF-AP、リパーゼＤ、リパーゼAY、リパーゼＬ、リパー
ゼＧ、リパーゼＲ、リパーゼCE,リパーゼCES、リパーゼ
GC、リパーゼＮ、（以上、天野製薬（株））、LIPASE
（東洋醸造（株））、リパーゼＢ（サッポロビール
（株））、オリパーゼ、サイケン100、Lipase P（以
上、長瀬産業（株））、リパーゼ（生化学工業
（株））、タリパーゼ（田辺製薬（株））、リパーゼO
F、リパーゼMY（以上、名糖産業（株））、Palatase
A、Palatase M、LIPOLASE（以上、ノボ・インダストリ
ー・ジャパン）等を用いることができる。（ｃ）成分は
本発明組成物1g中にリパーゼ活性として１〜500単位、
特に好ましくは50〜500単位含有せしめるのが好まし
い。１単位未満では洗浄力が不充分であり、500単位を
超えると効果に比して経済的に不利となる為好ましくな
い。

なお、リパーゼの酵素活性は実施例に示す方法によって
測定されるものである。

本発明に用いられる（ｄ）成分のアルカリプルラナーゼ
は、例えば好アルカリ性微生物の一種であるバチルス
エスピー（Bacillus sp.）KSM-AP1876（FERM P-10887）
が産生するものが挙げられる。

この微生物は、次のような菌学的性質を有する。尚、以
下において菌株の分類に用いた培地は次の培地１〜21の
21種類であり、これらは何れも別滅菌した炭酸ナトリウ
ム（Na₂CO₃）を0.5重量％（以下、単に％という）含有
する。

使用した培地の組成（表示は％）： 培地1. ニュートリエントブロス,0.8;寒天末（和光純
薬製）,1.5 培地2. ニュートリエントブロス,0.8 培地3. ニュートリエントブロス,0.8;ゼラチン,20.0;
寒天末（和光純薬製）,1.5 培地4. バクトリトマスミルク,10.5 培地5. ニュートリエントブロス,0.8;KNO₃,0.1 培地6. バクトペプトン,0.7;NaCl,0.5;ブドウ糖,0.5 培地7. SIM寒天培地（栄研化学製），指示量 培地8. TSI寒天培地（栄研化学製），指示量 培地9. 酵母エキス,0.5;バクトペプトン,1.5;K₂HPO₄,
0.1;MgSO₄・7H₂O,0.02;可溶性澱粉,2.0;寒天末（和光純
薬製）,1.5 培地10. コーサー培地（栄研化学製），指示量 培地11. クリステンセン培地（栄研化学製），指示量 培地12. 酵母エキス,0.05;Na₂SO₄,0.1;KH₂PO₄,0.1;
ブドウ糖,1.0 酵母エキス,0.05;Na₂SO₄,0.1;KH₂PO₄,0.1;ブドウ糖,
1.0;CaCl₂・2H₂O,0.05;MnSO₄・４〜6H₂O,0.01;FeSO₄・7
H₂O,0.001;MgSO₄・7H₂O,0.02 窒素源としては、硝酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、
塩化アンモニウム及びリン酸アンモニウムをそれぞれ0.
25％、0.2025％、0.158％、0.195％となるように上記
及びの培地に加えて用いた。

培地13. キングＡ培地“栄研”（栄研化学製），指示
量 培地14. キングＢ培地“栄研”（栄研化学製），指示
量 培地15. 尿素培地“栄研”（栄研化学製），指示量 培地16. チトクローム・オキシダーゼ試験用濾紙（日
本製薬製） 培地17. ３％過酸化水素水 培地18. バクトペプトン,0.5;酵母エキス,0.5;K₂HPO₄,
0.1;ブドウ糖,1.0;MgSO₄・7H₂O,0.02 培地19. バクトペプトン,2.7;NaCl,5.5;K₂HPO₄,0.3;ブ
ドウ糖,0.5;ブロモチモールブルー,0.06;寒天末（和光
純薬製）,1.5 培地20. （NH₄）₂HPO₄,0.1;KCl,0.02;MgSO₄・7H₂O,0.0
2;酵母エキス,0.05;糖,1.0 培地21. カゼイン,0.5;酵母エキス,0.5;ブドウ糖,1.0;
K₂HPO₄,0.1;MgSO₄・7H₂O,0.02;寒天末（和光純薬製）,
1.5 〔菌学的性質〕 （ａ） 顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、1.0〜2.2μｍ×2.2〜4.4μｍの桿菌で
あり、菌体の一端に楕円形の内生胞子（0.8〜1.0μｍ×
1.0〜1.8μｍ）を作る。周鞭毛を有し運動性がある。グ
ラム染色は不定。抗酸性はない。

（ｂ） 各種培地に於ける生育状態 肉汁寒天平板培養（培地１） 生育状態は良い。集落の形状は円形であり、表面は円
滑、周縁は円滑又は波状である。又集落の色調は乳白色
半透明で光沢がある。

肉汁寒天斜面培養（培地１） 生育する。その状態は拡布状で光沢が有り、乳白色半透
明である。

肉汁液体培養（培地２） 生育する。

肉汁ゼラチン穿刺培養（培地３） 生育状態は良い。ゼラチンの液化が認められる。

リトマスミルク培地（培地４） ミルクの凝固、ペプトン化は認められない。リトマスの
変色は培地がアルカリ性のため判定できない。

（ｃ） 生理学的性質 硝酸塩の還元及び脱窒反応（培地５） 硝酸塩の還元は陽性。脱窒反応は陰性。

MRテスト（培地６） 培地がアルカリ性のため判定できない。

VPテスト（培地６） 陰性。

インドールの生成（培地７） 陰性。

硫化水素の生成（培地８） 陰性。

澱粉の加水分解（培地９） 陽性。

クエン酸の利用 コーサー培地（培地10）で陰性。クリステンセン培地
（培地11）では陽性か陰性か判定できない。

無機窒素源の利用（培地12） 硝酸塩、アンモニウム塩、亜硝酸塩ともに利用する。

色素の生成（培地13,14） 陰性。

ウレアーゼ（培地15） 陰性。

オキシダーゼ（培地16） 陽性、陰性のどちらとも判断できない。

カタラーゼ（培地17） 陽性。

生育の範囲（培地18） 生育の温度範囲は20〜40℃、生育最適温度範囲は30〜35
℃であった。

生育のpH範囲はpH7〜10.5、生育最適pHはpH10であっ
た。

酸素に対する態度 好気的。

O-Fテスト（培地19） アルカリ性のため変色は判定できない。好気状態でのみ
生育する。

糖の利用性（培地20） Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトー
ス、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビ
ット、Ｄ−マンニット、グリセリン、デンプン、サリシ
ン、Ｄ−リボース及びデキストリンを利用する。

食塩含有培地に於ける生育（培地１を改変）食塩濃
度が５％では生育するが、７％で生育できない。

カゼインの分解（培地21） 陽性。

以上の菌学的性質に関する検討に基づき、バージーズ・
マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロ
ジー（Bergey′s Mannual of Determinative Bacteriol
gy）第８版及びザ・ジーナス・バチルス（“The Genus
Bacillus"Ruth,E.Gordon,Agriculture Handbook No.42
7,Agricultural Research Service,U.S.Department of
Agriculture Washington D.C.,（1973））を参照し、比
較検索した結果、本菌株は有胞子桿菌であるバチルス
（Bacillus）属の一種であると認められる。しかし、本
菌株は中性領域では生育できず、専ら高pH領域で良好な
生育を示すことから、最近、HorikoshiとAkiba（“Alka
lophilic Microorganism",Japan Scientific Society P
ress（Tokyo）,1982年刊）の主張している、所謂好アル
カリ性（Alkalophilic）微生物に属し、暫定的に、従来
の中性で生育するバチルス属細菌とは区別される。

更に、本菌株の菌学的性質は公知の好アルカリ性バチル
スのいずれとも一致しないので、これを新規菌株と判断
してバチルス エスピー KSM-AP1876と命名し、微工研
菌寄第10887号（FERM P-10887）として通産省工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託した。

上記の微生物を用いて本発明に使用される（ｄ）成分の
アルカリプルラナーゼを得るには、培地に微生物を接種
し、常法に従って培養すればよい。また、培地中には、
資化し得る炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておく
ことが好ましい。この炭素源及び窒素源は特に制限され
ないが、例えば、窒素源として、コーングルテンミー
ル、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ酸、酵母
エキス、ファーマメディア、肉エキス、トリプトン、ソ
イトン、ハイプロ、アジパワー、ソルビーンミール、綿
実油粕、カルチベーター、アジプロン、ゼストなどの有
機窒素源及び硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リ
ン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウ
ム、酢酸アンモニウム等の無機窒素源が挙げられる。ま
た炭素源としては、可溶性澱粉、不溶性澱粉、アミロペ
クチン、グリコーゲン、プルラン及びこれらの部分分解
により生じた分岐オリゴ糖に加え、資化し得る炭素源、
例えばグリコース、マルトース、アラビノース、キシロ
ース、リボース、マンノース、フランクトース、ガラク
トース、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、マンニ
ット、ソルビット、グリセリンや資化し得る有機酸、例
えば酢酸などが挙げられる。またその他、リン酸塩、マ
グネシウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、コ
バルト塩、ナトリウム塩、カリウム塩等の無機塩や、必
要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加
することもできる。

斯くして得られた培養物中からの目的物質であるアルカ
リプルラナーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及
び精製の手段に準じて行うことができる。即ち、遠心分
離または濾過等の通常の固液分離手段により菌体を培養
液から除去すれば、粗酵素液を得ることができる。この
粗酵素液は、そのまま使用することもできるが、必要に
応じて、塩析法、沈澱法、限外濾過法等の分離手段によ
り粗酵素を得、更に公知の方法により精製結晶化するこ
とにより精製酵素として使用することも可能である。

以下、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの精製
法の一例を挙げ、更に詳しく説明する。

アリカリ性バチルス属細菌KSM-AP1876株を、１％プルラ
ン、0.2％トリプトン、0.1％酵母エキス、0.03％KH₂P
O₄、0.02％Cacl₂・2H₂O、0.1％（NH₄）₂SO₄、0.001％Fe
SO₄・7H₂O、0.0001％MnCl₂・4H₂O、0.02％MgSO₄・7H₂O
及び0.5％炭酸ナトリウムを含む培地で、30℃にて３日
間好気的に振盪培養し、得られる培養液から菌体を除
き、上澄液を得る。次いで、該上澄液にDEAE−セルロー
ス粉末を加え、上澄液中のプルラナーゼを完全にDEAE−
セルロースに吸着させる。次いで、10mMトリス−塩酸緩
衝液（pH8）で樹脂を洗浄した後、0.6Mの食塩を含む同
緩衝液で酵素を溶出する。更に、10mMトリス−塩酸緩衝
液（pH8）に対して透析濃縮後、同緩衝液で平衡化したD
EAE−セルロースDE52に吸着させ、同緩衝液を用いて０
〜1Mの食塩の濃度勾配により溶出し、その活性画分を集
め、平均分画分子量10,000の限外濾過膜を用いて濃縮し
た後、0.1M食塩を含む同緩衝液を用いて一夜透析する。
これを濃縮し、次いで透析後、0.1M食塩を含む同緩衝液
で平衡化したセファクリルS-200カラムに吸着後、0.1M
食塩を含む同緩衝液で溶出し、その活性画分を集め、更
にDEAEトヨパール650Sカラムに吸着させる。吸着した酵
素を、10mMトリス−塩酸緩衝液（pH8）中、0.1〜1Mの食
塩の濃度勾配により溶出し、その活性画分を集める。集
められた活性画分を、限外濾過膜を用いて濃縮した後、
2M硫酸アンモニウムを含む同緩衝液で平衡化したブチル
トヨパール650Sカラムに吸着させ、10mMトリス−塩酸
緩衝液（pH8）を用いて２〜0Mの硫酸アンモニウムの濃
度勾配により溶出し、その活性画分を集める。集められ
た活性画分を、限外濾過膜を用いて濃縮した後、同緩衝
液を用いて一夜透析する。斯くして得られる精製酵素は
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度15％）及び
ソディウムドデシル硫酸（SDS）電気泳動で単一のバン
ドを与え、活性収率は約４％であった。

斯くして得られる、アルカリプルラナーゼの酵素化学的
諸性質について、以下に説明する。

尚、酵素活性の測定は次の緩衝液（各々10mM宛）を用
い、以下の方法に従って行った。

pH4〜６ 酢酸緩衝液 pH6〜８ リン酸緩衝液 pH8〜11 グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液 pH11〜12 塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液 酵素活性測定法： 各種緩衝液中にプルラン（反応系に於ける最終濃度は0.
25％）を溶解させた基質溶液0.9mlに、酵素液0.1mlを加
え、40℃で、30分間反応させた。反応後、3,5−ジニト
ロサリチル酸（3,5−dinitrosalicylic acid（DNS））
法にて、還元糖の定量を行った。即ち、反応液1.0mlにD
NS試薬1.0mlを加え、５分間、100℃で加熱発色させ、冷
却後、4.0mlの脱イオン水を加えて希釈し、波長535nmで
比色定量した。酵素の力価は、１分間に１μmolのグル
コースに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位（1
U）とした。

（酵素学的諸性質） 作用 プルランのα−1,6グルコシド結合を分解してマルトト
リオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、グ
リコーゲン又はこれらの部分分解物のα−1,6グルコシ
ド結合も加水分解する。

基質特異性 α−1,6グルコシド結合で分岐した枝分かれ糖のうち、
マルトース以上の重合度を有する枝分かれ構造を加水分
解する（表１）。

作用pH及び至適pH 作用pHをpH5〜11の範囲に有し、至適pHを9.5〜11の範囲
に有する。

尚、各pHにおけるプルラナーゼ活性を、0.25％プルラ
ン、10mM酢酸緩衝液（pH4〜６）、リン酸緩衝液（pH6〜
8.5）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
8.5〜11）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液
（pH11〜12）の反応系を用い、40℃で30分間反応させて
測定した結果を第１図に示す。

pH安定性 pH8〜10で極めて安定であり、pH7〜10.5に於いても、約
50％以上の活性を維持する。

尚、各pHにおけるプルラナーゼ活性を、0.25％プルラ
ン、10mM酢酸緩衝液（pH4〜６）、リン酸緩衝液（pH6〜
8.5）、グリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
8.5〜11）及び塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液
（pH11〜12）の反応系を用い、45℃で10分間反応させて
測定した結果を第２図に示す。

作用温度範囲及び最適温度 10℃〜60℃の広範囲で作用し、その最適作用温度は約50
℃に認められる（第３図）。

温度安定性 本酵素についてpH9.5の条件で温度を変化させ、各温度
で30分間処理することにより失活の条件を調べると、40
℃までは極めて安定であり、また、50℃に於いても約50
％以上の残存活性を有する（第４図）。

分子量 SDS電気泳動法（ゲル濃度7.5％）による分子量は約120,
000±5,000である。

金属イオンの影響 1mMのHg²⁺、Cd²⁺、及びMn²⁺で強く阻害され、Pb²⁺で若
干疎外された。

界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、SDS、石
鹸、ソフタノール（登録商標）等の各種界面活性剤の0.
05％溶液で40℃にて15分間処理しても殆ど活性阻害を受
けない。

キレート剤の影響 キレート剤であるEDTA（10mM）、EGTA（10mM）、クエン
酸（0.05％）及びゼオライト（0.05％）は殆ど活性を阻
害しない。

プロテアーゼ耐性 API-21（昭和電工社製）、マクサターゼ（IBIS社製）、
サビナーゼ、アルカラーゼ、エスペラーゼ（ノポ社製）
等のアルカリプロテアーゼを活性測定時に共存（0.2AU/
）させても、何れのプロテアーゼに対しても強い耐性
を有する。上記アルカリプルラナーゼは、本発明自動食
器洗浄機用洗浄剤組成物中に、通常0.1〜10％配合され
る。

なお、アルカリ又はアルカリ耐性プルラナーゼは、精製
酵素を用いてもよいし、培養液をそのまま粗製酵素とし
て用いてもよい。

本発明の自動食器洗浄機用洗浄剤組成物には、上記の必
須成分に加え、目的とする性能を損なわない範囲で、必
要に応じて種々の任意成分を添加することができる。

その様な成分としては、カルボキシメチルセルロース、
ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエ
チレングリコール等の再汚染防止剤、炭酸ナトリウム、
炭酸水素ナトリウム、ホウ砂、珪酸塩等のアルカリ剤、
芒硝等の増量剤、香料、色素、過炭酸ナトリウム、過ホ
ウ酸ナトリウム等の漂白剤、シリコーン等の消泡剤、液
体洗浄剤の場合はエタノール、イソプロパノール、プロ
ピレングリコール等のハイドロトロープ剤、防腐・防黴
剤等が挙げられる。

本発明の自動食器洗浄機用洗浄剤組成物は、その0.2％
水溶液におけるpHが７〜10の範囲内である必要があり、
pH7未満では油性汚れに対する洗浄力が低下する為好ま
しくなく、またpH10を超えると、酵素活性が失われる
か、或いは著しく低下し充分な洗浄効果を得られない。
特に好ましいpHの範囲は8.5〜9.5である。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
が、本発明はこれらの実施例により限定されるものでは
ない。

なお、本発明に用いるリパーゼ及びプルラナーゼの活性
は次の如くして測定した。

＜リパーゼの活性測定方法＞ 本発明におけるリパーゼ活性は、反応基質としてオリー
ブ油を用い、１分間に１μmolの脂肪酸を遊離する酵素
量を１単位と定め、以下の方法で測定した。

（１） サンプルの測定 オリーブ油4mlと0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）4mlとを50m
l容共栓三角フラスコに正確に取り、よく混合し、37℃
の恒温水槽中で10分間予熱する。これに試料溶液1mlを
正確に加え、よく混合し、正確に20分後アセトン・エタ
ノール混合液20mlを注ぎ、ついでフェノールフタレイン
試液５滴を指示薬として、0.05N水酸化ナトリウム試液
で滴定する。

（２） ブランクの測定 オリーブ油5mlと0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）4mlとを50m
l容共栓三角フラスコに正確に取り、37℃の恒温水槽中
で30分間加熱後、アセトン・エタノール混合液20mlを注
ぎ、ついで水1mlを正確に加え、フェノールフタレイン
試液５滴を指示薬として、0.05N水酸化ナトリウム試液
で滴定する。

（３） リパーゼ活性の算出 以下の式により活性を算出する。

＜プルラナーゼの活性測定方法＞ 10mMグリシン−食塩−水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.
0）中にプルラン（反応系における最終濃度は0.25％）
を溶解させた基質溶液0.9mlに、酵素液0.1mlを加え40℃
で30分間反応させる。反応後、3,5−ジニトロサリチル
酸（3,5−dinitrosalicylic acid（DNS））法にて、還
元糖の定量を行った。即ち、反応液1.0mlにDNS試薬1.0m
lを加え、５分間、100℃で加熱発色させ、冷却後、4.0m
lの脱イオン水を加えて希釈し、波長535nmで比色定量し
た。酵素の力価は、１分間に１μmolのグルコースに相
当する還元糖を生成する酵素量を１単位（1U）とした。

製造例１ （１） 神奈川県横浜市の土壌を薬匙一杯（約0.5g）、
滅菌生理食塩水に懸濁し、80℃で15分間熱処理した。こ
の熱処理液の上清を適当に希釈して、分離用寒天培地
（培地Ａ）に塗布した。次いで、これを30℃にて３日間
培養し、集落を形成させた。集落の周囲にプルランの溶
解に基づく透明帯を形成するものを選出し、プルラナー
ゼ生産菌を取得した。更に、取得菌を培地Ｂの液体培地
に接種し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、遠心分
離した上清液について、プルラナーゼ活性をpH10にて測
定し、アルカリプルラナーゼ生産菌をスクリーニングし
た。

上述の方法により、アルカリプルラナーゼ生産菌バチル
ス エスピー KSM-AP1876（FERM P-10887）を取得する
ことが出来た。

培地A.プルラン 0.8％ 着色プルラン 0.2％ ポリペプトン 0.2％ 酵母エキス 0.1％ KH₂PO₄ 0.03％ （NH₄）₂SO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％ CaCl₂・2H₂O 0.02％ FeSO₄・7H₂O 0.001％ MnCl₂・4H₂O 0.0001％ 寒天 1.5％ Na₂CO₃ 0.5％ pH10.0 培地B.プルラン １％ トリプトン 0.2％ 酵母エキス 0.1％ KH₂PO₄ 0.03％ （NH₄）₂SO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％ CaCl₂・2H₂O 0.02％ FeSO₄・7H₂O 0.001％ MnCl₂・4H₂O 0.0001％ Na₂CO₃ 0.5％ pH10.0 （２） アルカリプルラナーゼ生産菌であるバチルスエ
スピー KSM-AP1876株を参考例１の液体培地Ｂに接種
し、30℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分
離して除き、粗プルラナーゼ酵素液とした。更に、通常
の方法に従って、エタノール乾燥粉末とし、以下の表２
に示す粗酵素標品を得た。なお、表２の酵素活性はpH9
に於ける測定値である。

（３） （２）で得られた粗酵素液について、DEAEセ
ルロース吸着、DEAEセルロース（ワットマン社製）ク
ロマトグラフィー、セファクリル（ファルマシア社
製）クロマトグラフィー、DEAEトヨパール（東洋曹達
社製）クロマトグラフィー、ブチル トヨパール（東
洋曹達社製）クロマトグラフィーをすることによって精
製を行い、アルカリプルラナーゼを得た。

得られたアルカリプルラナーゼについてデービス（Davi
s D.J.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,121,404（1964））の方法に
従って電気泳動を行った後、コマシー・ブリリアント・
ブルーで染色して単一のバンドを与えることを確認した
（第５図）。

（４） （３）で得られたアルカリプルラナーゼについ
て常法に従い、SDS電気泳動を行った（第６図）。この
結果から、本酵素の分子量は120,000±5,000であった。

実施例１ 下記の第３表及び第４表の組成の自動食品洗浄機用洗浄
剤組成物を調製し、その洗浄力の測定を行った。結果を
第４表に示す。尚、洗浄力の測定は以下に示す試験法に
より行った。

洗浄条件 使用機種；松下電気（株）製全自動食器洗い機 『NP-600』 洗浄温度;5℃から55℃まで徐々に上昇する。

使用水；硬度3.5゜DHの水 洗浄剤濃度;0.2％ 洗浄時間；洗浄20分→すすぎ20分 洗浄時の循環水量；約2.5 〔米飯汚れ洗浄力測定法〕 汚染皿の調製 軟質の炊き上がり米飯を30分間室温にて放置し、3gを直
径25cmの磁性の皿に引き伸ばして塗布し、室温で１昼夜
風乾したものを６枚洗浄に供した。

米飯汚れ洗浄力評価方法 洗浄後の皿の米飯の残留を沃素の呈色反応によって生じ
た青色部分の面積（Ｐ）を写真判定によって測り、初期
の汚染面積（Ｓ）から各皿の洗浄率を下式によって求め
た。更に、６枚の皿の洗浄率を平均し、平均洗浄率とし
た。

〔複合汚れ洗浄力測定法〕 汚染皿の調製 ホワイトソース（ハインツ社製の缶詰）100gにマーガリ
ン（雪印社製『ネオソフト』）10gを加え、60℃に加温
し良く混合し複合汚れとする。

直径25cmの磁性の皿一枚当たりに、上記の複合汚れ5gを
塗布し、120℃で15分間焼き付ける。これを一昼夜放置
した後洗浄に供した。

洗浄試験と洗浄力評価方法 汚染皿５枚を洗浄機に入れ、上記の洗浄条件にて洗浄を
行った。洗浄後の皿は一枚づつ下記の判断基準により判
定し、下式により洗浄評価点を算出した。

完全に洗浄された。 ５点 わずかに汚れの残留があるが許容範囲内である。 ４点 少量の汚れの残留が認められる。 ３点 皿の約1/4に汚れの残留が認められる。 ２点 皿の約1/2に汚れの残留が認められる。 １点 全く洗浄されなかった。 ０点 洗浄評価点＝〔各汚染皿の評価点の和〕×４ 実施例２ 第５表の組成の自動食器洗浄機用洗剤を調製し、その洗
浄力を実施例１と同様に測定した。

〔発明の効果〕 本発明の自動食器洗浄機用洗浄剤組成物は澱粉質汚れの
みならず、澱粉質、油脂及び蛋白質汚れ等が混じり合っ
た複合汚れに対しても優れた洗浄力を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
反応pHと相対活性との関係を示す図面である。 第２図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
処理pHと残存活性との関係を示す図面である。 第３図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
反応温度（pH9.5）と相対活性との関係を示す図面であ
る。 第４図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
処理温度（pH9.5）と残存活性との関係を示す図面であ
る。 第５図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
電気泳動の結果を示す図面である。 第６図は、本発明に使用されるアルカリプルラナーゼの
SDS電気泳動の結果を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１１Ｄ 3:12 3:20 3:37 3:386） (Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 出口 勝彦 栃木県宇都宮市石井町3413―107 (56)参考文献 特開 平２−132194（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−132192（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−77498（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−161086（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の成分（ａ）〜（ｄ） （ａ）非イオン性界面活性剤 １〜30重量％ （ｂ）カルシウムイオン捕捉キレート剤 １〜50重量％ （ｃ）リパーゼ （ｄ）次の酵素学的性質を有するアルカリプルラナーゼ １）作用 プルランのα−1,6グルコシド結合を分解してマルトト
   リオースを生成する。また、澱粉、アミロペクチン、グ
   リコーゲン又はこれらの部分分解物のα−1,6グリコシ
   ド結合を加水分解する。 ２）基質特異性 α−1,6グルコシド結合で分岐した枝分かれ構造を有す
   る糖のうち、マルトース以上の重合度を有する枝分かれ
   構造を加水分解する。 ３）作用pH及び至適pH 作用pHはpH5〜11の範囲であり、至適pHは9.5〜11の範囲
   である。 ４）pH安定性 pH8〜10の範囲で極めて安定であり、pH7〜10.5の範囲に
   於いても、50％以上の相対活性を有する（45℃、10分間
   処理による）。 ５）作用温度範囲及び最適温度 10〜60℃の範囲で作用し、その最適作用温度は約50℃で
   ある。 ６）温度安定性 40℃までは極めて安定である（pH9.5の10mMグリシン−
   食塩−水酸化ナトリウム緩衝液中、30分間処理によ
   る）。 ７）分子量 ソディウムドデシル硫酸電気泳動法による分子量は120,
   000±5,000である。 ８）金属イオンの影響 Hg²⁺,Cd²⁺,Mn²⁺及びPb²⁺で阻害される。 ９）界面活性剤の影響 直鎖アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウム、アルキ
   ル硫酸エステルナトリウム塩、ポリオキシエチレンアル
   キル硫酸エステルナトリウム塩、α−オレフィンスルフ
   ォン酸ナトリウム、α−スルフォン化脂肪酸エステルナ
   トリウム、アルキルスルフォン酸ナトリウム、ソディウ
   ムドデシル硫酸、石鹸及びソフタノール等の界面活性剤
   によって殆ど活性阻害を受けない。 10）キレート剤の影響 EDTA、EGTA、クエン酸及びゼオライトで殆ど活性阻害を
   受けない。 11）プロテアーゼ耐性 アルカリプロテアーゼに対して強い耐性を有する。 を含有し、0.2重量％水溶液のpHが７〜10である自動食
   器洗浄機用洗浄剤組成物。
2. 【請求項２】（ａ）成分が、次の一般式（Ｉ） R¹O（C₂H₄O）ｍ（C₃H₇O）nH （Ｉ） （式中、R¹は炭素数８〜20のアルキル又はアルケニル基
   を示し、ｍは平均付加モル数で５〜15の数を示し、ｎは
   平均付加モル数で３〜15の数を示す） で表わされる高級アルコールのエチレンオキシドとプロ
   ピレンオキシド付加体、分子量1,000〜10,000のポリオ
   キシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体並
   びに1,000〜10,000の分子量を有するエチレンジアミン
   のポリオキシエチレンポリオキシプロピレン付加体より
   選ばれる一種又は二種以上の混合物である請求項１記載
   の自動食器洗浄機用洗浄剤組成物。
3. 【請求項３】（ｂ）成分が、クエン酸塩、リンゴ酸塩、
   酒石酸塩、ポリアクリル酸塩、アクリル酸と無水マレイ
   ン酸との共重合体の塩、無水マレイン酸とメチルビニル
   エーテルとの共重合体の塩、無水マレイン酸とオレフィ
   ンとの共重合体の塩、アクリル酸とメタクリル酸との共
   重合体の塩、無水マレイン酸と酒石酸の縮合物及びゼオ
   ライトからなる群より選ばれる一種又は二種以上のカル
   シウム捕捉キレート剤である請求項１記載の自動食器洗
   浄機用洗浄剤組成物。