BRPI0708833B1 - processos para a produção de um mosto de cervejeiro e para a produção de cerveja - Google Patents

Abstract

processos para a produção de um mosto de cervejeiro e para a produção de cerveja. a presente invenção fornece processos para a produção de mosto e cerveja de um cereal suplemento de amido granular macerado em uma temperatura abaixo da temperatura de gelatinização do referido amido.

Description

“PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE UM MOSTO DE CERVEJEIRO E PARA A PRODUÇÃO DE CERVEJA” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um processo de maceração melhorado com o uso de malte compreendendo o suplemento não gelatinizado.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Tradicionalmente, a cerveja tem sido preparada apenas do malte de cevada, lúpulo e água. Entretanto, freqüentemente parte do malte de cevada é substituída por suplementos tais como o milho, o arroz, o sorgo e o trigo, amido refinado ou carboidratos facilmente fermentáveis, tais como o açúcar ou xaropes. Os suplementos são usados principalmente porque eles se acham facilmente disponíveis e fornecem carboidratos a um custo menor do que aquele que é disponível do malte de cevada. Outras vantagens podem também ser obtidas, por exemplo a estabilidade física acentuada, as qualidades superiores à prova do frio, e a maior brilhância. A maceração é o processo de converter amido do malte de cevada moído e suplementos em açúcares fermentáveis e não fermentáveis para produzir mosto da composição desejada. A maceração tradicional envolve misturar malte de cevada moída e suplementos com água em uma temperatura e volume estabelecidos para prosseguir com as mudanças bioquímicas iniciadas durante o processo de maltagem. O processo de maceração é conduzido durante um período de tempo em várias temperaturas, de modo a ativar as enzimas endógenas responsáveis pela degradação das proteínas e carboidratos. Entretanto, o amido de arroz e de milho, que são freqüentemente usados como amidos suplementos, têm uma temperatura de gelatinização mais elevada do que o amido de malte. Portanto, tais suplementos são cozinhados e gelatinizados em um “fogão de cereais” antes de serem adicionados ao malte moído. Assim, embora o uso do suplemento reduza os custos do material bruto, ele requer um investimento adicional n fogão de cereais, bem como um custo adicional de energia para aquecer o suplemento. Um processo de maceração mais simples que permita o uso do cereal suplemento não gelatinizado é assim desejável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO O inventor da presente invenção surpreendentemente observou que um amido suplemento pode ser adicionado ao malte moído e ser eficientemente macerado sem gelatinização anterior. Assim, um suplemento tal como os cereais de milho, o amido do milho ou o amido do arroz, pode ser macerado com o malte nas temperaturas em que as enzimas de malte endógenas sejam ativas. A liquefação do suplemento não gelatinizado requer que as enzimas de malte endógenas sejam suplementadas por uma composição enzimática exogenamente supridas.

Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a invenção fornece um processo para a produção de um mosto de cervejeiro, compreendendo macerar um cereal contendo malte e um suplemento de amido granular na presença de uma composição enzimática exogenamente fornecida em uma temperatura em que as enzimas de malte endógenas se acham ativas. A invenção ainda fornece um processo para a produção de um mosto de cervejeiro, compreendendo: a) prover um malte moído contendo i) malte, ii) suplemento compreendendo amido granular, e iii) uma composição enzimática exogenamente supridas b) macerar referido malte moído em uma temperatura abaixo da temperatura inicial de gelatinização do referido amido granular, c) separar por maceração em uma temperatura acima da temperatura inicial de gelatinização, e d) separar o grão usado do malte moído e obter um mosto.

Em um segundo aspecto, a invenção provê um mosto produzido pelo processo de acordo com o primeiro e o segundo aspecto.

Em um terceiro aspecto, a invenção provê uma cerveja produzida pela fermentação do mosto do terceiro aspecto.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO É intenção da presente invenção prover um processo de maceração mais simples, possibilitando o uso de cereal suplemento não gelatinizado no processo.

Definições Na totalidade deste relatório descritivo, são usados vários termos que são geralmente entendidos por aqueles de experiência normal na técnica. Entretanto, vários termos são usados com significados específicos, e são entendidos como definido pelo seguinte.

Como aqui usado, o termo “cereal” é entendido como o material contendo amido ou açúcar, que é a base da produção da cerveja, por exemplo o malte de cevada e o suplemento. O termo “malte” é entendido como qualquer grão de cereal maltado, em particular a cevada. O termo “suplemento” é entendido como a parte do cereal que não seja malte de cevada. O suplemento pode ser qualquer material de plantas rico em amido, tal como, porém sem limitar, o milho, o arroz, o sorgo e o trigo. Suplemento preferido para a invenção é o cereal de milho. O termo “malte moído” é entendido como uma pasta contendo amido compreendendo malte de cevada moído, grão não maltado moído, outro material contendo amido, ou uma combinação destes, permanecendo em água para produzir o mosto. O termo “mosto” é entendido como o escorrimento do líquido não fermentado em seguida à extração do cereal durante a maceração. A expressão “grãos usados” é entendida como os sólidos drenados remanescentes quando o cereal tenha sido extraído e o mosto tenha sido separado. O termo “cerveja” é aqui entendido como um mosto fermentado, isto é, uma bebida alcoólica preparada de malte de cevada, opcionalmente suplemento e lúpulos. A expressão “amido granular” é entendida como amido não gelatinizado, ou amido bruto. A expressão “temperatura inicial de gelatinização” é entendida como a temperatura mais baixa em que a gelatinização do amido comece. O amido aquecido em água começa a gelatinizar-se entre 50°C e 75°C; a temperatura exata da gelatinização depende do amido específico, e pode facilmente ser determinada pela pessoa habilitada. Assim, a temperatura inicial de gelatinização pode variar de acordo com a espécie da planta, com a variedade particular da espécie de planta, bem como com as condições de cultivo. No contexto desta invenção, a temperatura inicial de gelatinização de um dado amido é a temperatura em que a birrefringência é perdida em 5% dos grânulos de amido com o uso do método descrito por Gorinstein, S. e Lii, C., Starch/Starke, Vol. 44 (12) pp. 461-466 (1992). Quanto ao amido de milho, a temperatura inicial de gelatinização é de aproximadamente 62°C (ponto central: 67°C, conclusão: 72°C), e quanto ao amido de arroz, a temperatura inicial de gelatinização é de aproximadamente 68°C (ponto central: 74,5°C, conclusão: 78°C) {Starch, 2~ edição Industrial microscopy of starch por Eileen Maywald Snyder). A expressão “recuperação do extrato” no mosto é entendida como a soma das substâncias solúveis do cereal (malte e suplementos) expressa em percentual com base na matéria seca. O termo “identidade”, quando usada acerca de seqüências de polipeptídeos ou de DNA e referida neste relatório descritivo, é entendido como o grau de identidade entre duas seqüências, indicando uma derivação da primeira seqüência a partir da segunda. A identidade pode adequadamente ser determinada por meio de programas de computador conhecidos na técnica, tais como o GAP provido no pacote de programas GCG (Manual de Programas para o Pacote Wisconsin, Versão 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Os seguintes ajustes para comparação das seqüências de polipeptídeo são usados: penalidade de criação do GAP de 3,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,1.

Em um primeiro aspecto da invenção, é fornecido um processo para a produção de um mosto de cervejeiro. O processo compreende a maceração de um cereal compreendendo malte e um suplemento de amido granular na presença de uma composição enzimática exogenamente fornecida em uma temperatura em que as enzimas de malte exógenas sejam ativas. A invenção ainda provê um processo para a produção de um mosto de cervejeiro, compreendendo: a) prover um malte moído contendo i) malte, ii) suplemento contendo amido granular, e iii) uma composição enzimática exogenamente fornecida, b) maceração do referido malte moído em uma temperatura abaixo da temperatura inicial de gelatinização do referido amido granular, c) remoção por maceração em uma temperatura acima da temperatura inicial de gelatinização, e d) separar o grão gasto do malte moído e obter um mosto.

De acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, um cereal contendo malte e suplemento de amido granular é macerado na presença de uma composição enzimática exogenamente fornecida em uma temperatura em que as enzimas de malte endógenas, por exemplo as alfa-amilases, proteases e beta-amilases, nas quais os processos de maceração tradicionais confiam, são ativas. A água pode preferivelmente, antes de ser adicionada ao cereal, ser pré-aquecida de modo a que o malte moído alcance a temperatura desejada no momento da sua formação. Se a temperatura do malte moído formado estiver abaixo da temperatura de maceração desejada, calor adicional preferivelmente é suprido de modo a se obter a temperatura desejada do processo. Preferivelmente, a temperatura de maceração desejada é alcançada dentro dos 15 minutos, ou mais preferível dentro dos 10 minutos, tal como dentro de 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 minutos, ou ainda mais preferível dentro de 1 minutos após a formação do malte moído ou, o mais preferível, a temperatura desejada da maceração é alcançada na formação de malte moído. O perfil de temperatura do processo de maceração pode ser um perfil de um processo de maceração convencional em que as temperaturas são ajustadas para se obter degradação ótima da matéria seca do cereal pelas enzimas do malte. O malte é preferivelmente derivado de um ou mais dos grãos selecionados da lista consistindo de milho, cevada, trigo, centeio, sorgo, painço e arroz. Preferivelmente, o malte é malte de cevada. O cereal preferivelmente compreende de 0,5% a 99%, preferivelmente de 1% a 95%, mais preferível de 5% a 90%, ainda mais preferível de 10% a 80%, e o mais preferível de 50% a 70% de grãos maltados.

Além dos grãos maltados, o cereal pode preferivelmente compreender suplemento tal como o milho não maltado, ou outro grão não maltado, tal como a cevada, o trigo, o centeio, a aveia, o milho, arroz, milo, painço e/ou sorgo, ou material contendo amido e/ou açúcar brutos e/ou refinados derivados de plantas como o trigo, cevada, aveia, milho, arroz, milo, painço, sorgo, batata, batata doce, mandioca, tapioca, sagu, banana, beterraba e/ou cana de açúcar. Quanto aos suplementos da invenção, podem ser obtidos dos tubérculos, das raízes, dos troncos, das folhas, de legumes, cereais e/ou grãos completos. Preferido é o suplemento obtido do milho e/ou do arroz, mais preferível o suplemento é amido de arroz, amido de cormo e/ou cereais de milho. O malte moído preferivelmente compreende de 1% a 50%, preferível de 5% a 45%, mais preferível de 10% a 40%, e ainda mais preferível de 20 a 35% de suplemento de amido. O suplemento contendo carboidratos facilmente fermentáveis, tais como açúcares ou xaropes, pode ser adicionado ao malte moído antes, durante ou após o processo de maceração da invenção, mas é preferivelmente acrescentado após o processo de maceração.

Antes de formar o malte moído, o malte e/ou o suplemento são de preferência moídos e, o mais preferível, moídos secos ou úmidos.

De acordo com a invenção, uma composição enzimática é exogenamente fornecida e pode ser adicionada aos ingredientes do malte moído, por exemplo a água ou o cereal, antes, durante ou após a formação do malte moído. Em uma forma de realização particularmente preferida, a composição enzimática compreende uma alfa-amilase (EC 3.2.1.1) e/ou uma glucoamilase (EC 3.2.1.3). A alfa-amilase é preferivelmente uma alfa-amilase bacteriana e/ou uma alfa-amilase fúngica, por exemplo uma alfa-amilase fúngica ácida. A glucoamilase é preferivelmente uma glucoamilase fúngica.

Pela seleção das enzimas que compõem a composição enzimática o perfil de açúcar do mosto resultante pode ser controlado. Uma composição enzimática contendo alfa-amilase, de preferência uma alfa-amilase bacteriana, e pouca ou nenhuma glucoamilase, resultará em um mosto rico em maltose semelhante a um mosto todo de malte. Uma composição enzimática contendo glucoamilase resultará em um mosto rico em glicose.

Em ainda uma forma de realização preferida, uma outra enzima é adicionada, referida enzima sendo selecionada do grupo consistindo de uma celulase, uma pululanase, uma protease, uma maltose gerando enzima, uma lacase, uma lipase, uma fosfolipolase, uma fitase, uma fitina esterase e uma xilanase.

Durante o processo de maceração, o amido extraído do cereal é gradualmente hidrolisado em açúcares fermentáveis e dextrinas menores. De preferência, o malte moído é amido negativo aos testes de iodo, antes de se extrair o mosto. A maceração é finalizada pela sua remoção em uma temperatura de 70°C ou mais, preferivelmente de pelo menos 71°C, pelo menos 72°C, pelo menos 73°C, pelo menos 74°C, pelo menos 75°C, pelo menos 76°C, pelo menos 77°C, pelo menos 78°C, pelo menos 79°C, pelo menos 80°C e, mais preferível, pelo menos 81 °C ou ainda pelo menos 82°C ou mais. A obtenção do mosto do malte moído tipicamente inclui filtrar o mosto dos grãos gastos, isto é, os grãos insolúveis e a parte formadora do material de folhelhos do cereal. Agua quente pode ser escoada através dos grãos gastos para remover por lavagem, ou aspergir, qualquer extrato remanescente do cereal. Preferivelmente a recuperação do extrato é de pelo menos 80%, de preferência 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, e o mais preferível pelo menos 99%, ou mesmo pelo menos 100%. O mosto pode ser usado de qualquer forma, ou pode ser concentrado e/ou secado.

Em uma forma de realização preferida, um cereal compreendendo 60 a 80% de malte de cevada e 20% a 40% de amido de milho e/ou cereais de milho e/ou amido de arroz é macerado na presença de uma alfa-amilase. Preferivelmente, a alfa-amilase AMY1 ou AMY2 descrita abaixo é usada na quantidade de aproximadamente 2 KNU/g de DM, preferivelmente na quantidade de 0,05 a 10 KNU/g de DM, mais preferível 0,1 a 8 KNU/g de DM, ainda mais preferível 0,5 a 5 KNU/g de DM. Preferivelmente, o amido é macerado com o uso de um perfil de temperatura de preferência iniciando-se em aproximadamente 52°C, aumentando-se até aproximadamente 64°C, e desmaceracerando-se preferivelmente em aproximadamente 78°C ou mais.

Um segundo aspecto da invenção é um mosto produzido pelo método descrito acima. Além do segundo aspecto da invenção, o mosto produzido pelo processo do primeiro aspecto da invenção pode ser fermentado para produzir uma bebida alcoólica, preferivelmente uma cerveja. A fermentação do mosto pode incluir o lançamento do mosto com uma pasta de levedura compreendendo levedura fresca, isto é, levedura não anteriormente usada para a invenção, ou a levedura pode ser levedura reciclada. A levedura aplicada pode ser qualquer levedura adequada para a preparação de cerveja, especialmente leveduras selecionadas de Saccharomyces spp., tal como S. cerevisiae e S. uvarum, incluindo as variantes destes organismos naturais ou artificialmente produzidas. Os métodos para a fermentação do mosto para a produção de cerveja são bem conhecidos da pessoa habilitada na técnica.

Os processos da invenção podem incluir a adição de hidrogel de sílica ao mosto fermentado para aumentar a estabilidade coloidal da cerveja. Os processos podem ainda incluir adicionar kieselgur ao mosto fermentado e filtrar para tomar a cerveja clara.

Um terceiro aspecto da invenção é uma cerveja produzida pelos processos da invenção, uma tal cerveja podendo ser qualquer tipo de cerveja. Tipos preferidos de cerveja compreendem as cervejas inglesas amargas de cor clara, cervejas inglesas fortes, cervejas escuras fortes, cervejas pretas muito fortes, cervejas leves, cervejas amargas, cervejas de exportação, licores de malte, cerveja com baixo teor de malte, cerveja de elevado teor de álcool, cerveja de baixo teor de álcool, cerveja de baixa calorias ou cerveja suave.

ENZIMAS

As enzimas exógenas a serem aplicadas na presente invenção devem ser selecionadas quanto à sua capacidade de reter suficiente atividade na temperatura de processo dos processos da invenção, bem como quanto à sua capacidade de reter suficiente atividade sob o regime de pH moderadamente ácido no malte moído, e devem ser adicionadas em quantidades eficazes. As enzimas podem ser derivadas de qualquer fonte, preferivelmente de uma planta ou de uma alga, e mais preferivelmente de um microorganismo, tal como de uma bactéria ou de um fungo.

Alfa-amilase (EC 3.2.1.1) Uma enzima alfa-amilase particular a ser usada nos processos da invenção pode ser uma alfa-amilase de Bacillus, por exemplo uma alfa-amilase derivada de uma cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens e B. stearothermophilus. Uma alfa-amilase bacteriana preferida é uma variante de alfa-amilase de B. stearothermophilus recombinante com as mutações: 1181* + G182* + N193F. A variante é apresentada na SEQ ID NO: 2 (AMY1). Igualmente preferidas são as alfa-amilases tendo uma seqüência de aminoácidos com no mínimo 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou particularmente pelo menos 99% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2.

Ainda mais preferida para a invenção é uma alfa-amilase bacteriana compreendendo um módulo de ligação a amido, preferivelmente um módulo de ligação a amido da família 20. Uma tal alfa-amilase pode ser derivada de Bacillus flavothermus (sinônimo: Anoxybacillus contaminans). A mais preferida é uma alfa-amilase tendo pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou em particular pelo menos 99% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 (AMY2).

As alfa-amilases de Bacillus podem ser adicionadas nas quantidades de 1,0 a 1000 NU/kg de dm, preferivelmente de 2,0 a 500 NU/kg de dm, preferivelmente 10 a 200 NU/kg de dm.

Outra alfa-amilase particular a ser usada nos processos da invenção pode ser qualquer alfa-amilase fungica. Particularmente preferidas são as alfa-amilases fungicas ácidas. Especialmente consideradas são as alfa-amilases fungicas que apresentam uma alta identidade, isto é, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou ainda pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 10 na WO 96/23874.

As alfa-amilases fungicas podem ser adicionadas em uma quantidade de 1 a 1000 AFAU/kg de DM, preferivelmente de 2 a 500 AFAU/kg de DM, preferivelmente de 20 a 100 AFAU/kg de DM. Glucoamilases Uma outra enzima particular a ser usada nos processos da invenção pode ser uma glucoamilase (E.C. 3.2.1.3) derivada de um microorganismo ou de uma planta. Preferidas são as glucoamilases de origem fungica ou bacteriana selecionadas do grupo consistindo de Aspergillus glucoamilases, em particular a glucoamilase de A. niger G1 ou G2 [Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), pp. 1097-1102), ou suas variantes, tais como apresentadas nas WO 92/00381 e WO 00/04136; a glucoamilase de A. awamori (WO 84/02921), A. oryzae (Agric. Biol. Chem. (1991), 55 (4), pp. 941-949), ou suas variantes ou fragmentos.

Outras variantes de glucoamilase de Aspergillus consideradas incluem as variantes para intensificar a estabilidade térmica: G137A e G139A (Chen et al. (1996), Prot. Engng. 9, 499-505); D257E e D293E/Q (Chen et al. (1995), Prot. Engng. 8, 575-582); N182 (Chen et al. (1994), Biochem. J. 301, 275-281); ligações dissulfeto, A246C (Fierobe et al. (1996), Biochemistry, 35, 8698-8704; e a introdução dos resíduos Pro nas posições A435 e S436 (Li et al. (1997), Protein Engng. 10, 1199-1204). Outras glucoamilases consideradas incluem as glucoamilases de Talaromyces, em particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (Patente U.S. rr Re. 32.153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (U.S. 4.587.215). As glucoamilases bacterianas consideradas incluem glucoamilases do gênero Clostridium, em particular C. thermoamylolyticum (EP 135.138) e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831). Glucoamilases preferidas incluem as glucoamilases derivadas de Aspergillus oryzae, tal como uma glucoamilase tendo pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou particularmente pelo menos 99%, ainda pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 na WO 00/04136. Igualmente considerados são os produtos comerciais AMG 200L, AMG 300 L, SAN® SUPER e AMG® E (da Novozymes); OPTIDEX® 300 (da Genencor Int.); AMIGASE® e AMIGASE® PLUS (da DSM); G-ZYME® G900 (da Enzyme Bio-Systems); G-ZYME® G990 ZR (Glucoamilase de A. niger baixo teor de protease). As glucoamilases podem ser adicionadas nas quantidades eficazes bem conhecidas da pessoa habilitada na técnica.

Celulase ÍE.C. 3.2.1.41 A celulase pode ser de origem microbiana, tal como derivável de uma cepa de um fungo filamentoso (por exemplo, Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Fusarium). Exemplos específicos de celulases incluem a endoglucanase (endoglucanase I) obtenível de H. insolens e ainda definida pela seqüência de aminoácidos da Figura 14 na WO 91/17244 e a endoglucanase de H. insolens de 43 kD descrita na WO 91/17243.

Uma celulase particular a ser usada nos processos da invenção pode ser uma endoglucanase, tal como uma endo-l,4-beta-glucanase. Consideradas são as beta-glucanases tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada como SEQ ID NO: 1 na WO 2003/062409, tal como pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou, particularmente, pelo menos 99%.

Preparações de celulase comercialmente disponíveis que podem ser usadas incluem a CELLU-CLAST®, CELLUZYME®, CEREFLO® e ULTRAFLO® (disponíveis da Novozymes A/S), LAMINEX® e SPEZYME® CP (disponível da Genencor Int.) e ROHAMENT® 7069 W (disponível da Rohm, Alemanha).

As beta-glucanases podem ser adicionadas nas quantidades de 1,0 a 10000 BGU/kg de dm, preferivelmente de 10 a 5000 BGU/kg de dm, preferivelmente de 50 a 1000 BGU/kg de dm, e o mais preferível de 100 a 500 BGU/kg de dm.

Enzimas des-ramifícadoras Outra enzima aplicada no processo da invenção pode ser uma enzima des-ramificadora, tal como uma isoamilase (E.C. 3.2.1.68) ou uma pululanase (E.C. 3.2.1.41). A isoamilase hidrolisa as articulações dos ramos alfa-l,6-D-glucosídicos na amilopectina e nas dextrinas de limite beta, e pode ser distinguida das pululanases pela incapacidade da isoamilase de atacar o pululano, e pela ação limitada sobre as dextrinas de limite alfa. A enzima des-ramificadora pode ser adicionada em quantidades eficazes bem conhecidas da pessoa habilitada na técnica.

Protease As proteases adequadas incluem as proteases microbianas, tais como as proteases fungicas e as bacterianas. Proteases preferidas são as proteases acídicas, isto é, as proteases caracterizadas pela capacidade de hidrolisar proteínas sob condições acídicas abaixo de pH 7.

Proteases fungicas ácidas consideradas incluem as proteases fungicas derivadas de Aspergillus, Mucor, Rhizopus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Penicillium, Sclerotiumand Torulopsis. Especialmente consideradas são as proteases derivadas de Aspergillus niger (ver, por exemplo, Koaze et ah, (1964), Agr. Biol. Chem. Japan, 28, 216), Aspergillus saitoi (ver, por exemplo, Yoshida, (1954) J. Agr. Chem. Soc. Japan, 28, 66), Aspergillus awamori (Elayashida et al., (1977) Agric. Biol. Chem., 42(5), 927-933, Aspergillus aculeatus (WO 95/02044) ou Aspergillus oryzae, tal como a protease pepA; e as proteases acídicas de Mucor pusillus ou Mucor miehei. São também consideradas as proteases neutras e as alcalinas, tais como uma protease derivada de uma cepa de Bacillus. Uma protease particular considerada pela invenção é derivada de Bacillus amylolíquefaciens e tem a seqüência obtenível em Swissprot com o número de Acesso P06832 bem como proteases tendo pelo menos 90% de identidade com a referida seqüência de aminoácidos, tal como pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou particularmente pelo menos 99%. São ainda consideradas as proteases tendo pelo menos 90% de identidade com a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 nos pedidos de patentes dinamarqueses PA 2001 01821 e PA 2002 00005, tal como pelo menos 92%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou particularmente pelo menos 99%. São também consideradas as proteases semelhantes à papaína, tais como as proteases dentro da E.C. 3.4.22.* (cisteína protease), tais como as EC 3.4.22.15 (catepsina L), EC 3.4.22.25 (glicil endopeptidase) e EC 3.4.22.30 (caricaína).

As proteases são responsáveis pela redução do comprimento total das proteínas de elevado peso molecular para as proteínas de baixo peso molecular no malte moído. As proteínas de baixo peso molecular são uma necessidade para a nutrição de levedura, e as proteínas de elevado peso molecular garantem a estabilidade da espuma. Assim sendo, é bem conhecido da pessoa habilitada que a protease deve ser adicionada em uma quantidade equilibrada que, ao mesmo tempo, considere aminoácidos livres amble para a levedura e possibilite suficientes proteínas de alto peso molecular para estabilizar a espuma. As proteases podem ser adicionadas nas quantidades de 0,1 a 1000 AU/kg de dm, preferivelmente 1 a 100 AU/kg de dm, e o mais preferível 5 a 25 AU/kg de dm. MATERIAIS E MÉTODOS Enzimas ΑΜΥ1: Uma variante de alfa-amilase de B. stearothermophilus tendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4 na WO 99/19467, com as mutações: 1181* + G182* + N193F. AMY2: Uma alfa-amilase de Anoxybacillus contaminans tendo a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1. Métodos Atividade Proteolítica (AU) A atividade proteolítica pode ser determinada com hemoglobina desnaturada como substrato. No método Anson-Hemoglobina para a determinação da atividade proteolítica, a hemoglobina desnaturada é digerida, e a hemoglobina não digerida é precipitada com ácido ticloroacético (TCA). A quantidade do produto solúvel de TCA é determinada com reagente de fenol, o qual dá uma cor azul com tirosina e triptofano.

Uma Unidade Anson (AU) é definida como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (isto é, 25°C, pH 7,5, e tempo de reação de 10 minutos), digere a hemoglobina em uma velocidade inicial tal que é liberada por minuto uma quantidade do produto solúvel de TCA que dá a mesma cor com o reagente de fenol como um miliequivalente de tirosina.

Uma pasta AF 4/5 descrevendo o método analítico em mais detalhes, acha-se disponível sob solicitação à Novo Nordisk A/S, Dinamarca, pasta esta que fica aqui incluída como referência.

Atividade da alfa-amilase (NU) A atividade amilolítica pode ser determinada com o uso de amido de batata como substrato. Este método baseia-se na decomposição do amido de batata modificado pela enzima, e a reação é seguida pela mistura de amostras da solução de amido/enzima com uma solução de iodo. Inicialmente, uma cor azul enegrecida é formada, mas durante a decomposição do amido, a cor azul se toma mais fraca e gradualmente se toma um marrom avermelhado, o que é comparado com um padrão de vidro colorido.

Uma Unidade de Kilo Novo (KNU) de alfa-amilase é igual a 1000 NU. Uma KNU é definida como a quantidade de enzima que, sob condições padrão (isto é, em 37°C ± 0,05; Ca2+ 0,0003 M; e pH 5,6) destriniza 5,26 g de substância seca de amido Merck Amylum solúvel.

Uma pasta AF 9/6 descrevendo este método analítico em mais detalhes, acha-se disponível sob solicitação à Novozymes A/S, Dinamarca, pasta esta que fica aqui incluída como referência.

Atividade da glucoamilase (AGU) A Unidade Novo Glucoamilase (AGU) é definida como a quantidade de enzima que hidrolisa 1 micromol de maltose por minuto em 37°C e pH 4,3. A atividade é determinada como AGU/ml por um medido modificado após (AEL-SM-0131, disponível sob solicitação à Novozymes) o uso do kit Glucose God-Perid da Boehringer Mannheim, 124036, Standard: padrão AMG, lote 7-1195, 195 AGU/ml. 375 microlitros de substrato (1% de maltose em acetato de sódio 50 mM, pH 4,3) são incubados por 5 minutos em 37°C. 25 microlitros de enzima diluída em acetato de sódio são adicionados. A reação é interrompida após 10 minutos pela adição de 100 microlitros de NaOH 0,25 M. 20 microlitros são transferidos para uma placa microtituladora de 96 reservatórios e 200 microlitros da solução GOD-Perid (124036, Boehringer Mannheim) são acrescentados. Após 30 minutos na temperatura ambiente, a absorbância é medida em 650 nm e a atividade é calculada em AGU/ml do padrão AMG. Uma descrição detalhada do método analítico (AEL-SM-0131) acha-se disponível mediante solicitação da Novozymes. Atividade da beta-glucanase (BGU) A atividade celulítica pode ser medida em unidades de beta-glucanase (BGU). A beta-glucanase reage com beta-glucano para formar glicose ou carboidrato redutor, o que é determinado como açúcar redutor com o uso do método de Somogyi-Nelson. 1 unidade de beta-glucanase (BGU) é a quantidade de enzima que, sob condições padrão, libera glicose ou carboidrato redutor com uma capacidade de redução equivalente a 1 pmol de glicose por minuto. As condições padrão são 0,5% de beta-glucano como substrato em pH 7,5 e 30°C, para um tempo de redução de 30 minutos. Uma descrição detalhada do método analítico (EB-SM-0070.02/01) acha-se disponível mediante solicitação daNovozymes A/S.

Processo de maceração Congress padrão O processo de maceração Congress padrão foi realizado de acordo com o procedimento do EBC 4.5.1 Extract of Malt: Congress Mash. O perfil de temperatura consistiu da temperatura de maceração inicial de 45°C por 30 minutos, aumentando-se para 70°C com l,0°C/minuto durante 25 minutos, finalizada por 70°C durante 65 minutos, dando um período total de maceração de 2 horas. Métodos adicionais Métodos para análise dos produtos brutos, do mosto, da cerveja etc. podem ser encontrados em Analytica-EBC, Analysis Committee of EBC, European Brewing Convention (1998), Verlag Hans Carl Geranke-Fachverlag. Para a presente invenção, os métodos aplicados para determinação dos seguintes parâmetros foram: Plato: refratômetro.

Assimilável N: Com base no EBC: 8,10, mas com TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico) como reagente, ao invés da ninidrina. O TNBS reage em uma solução de grupos amino livres ou aminoácidos e peptídeos, o que cria um complexo amarelo, o qual é medido mediante espectrofotometria em 340 nm.

Beta-glucano: EBC: 8.13.2 (teor de beta-glucano de alto peso molecular do mosto: Método Fluorométrico).

Cor: EBC: 4.7.2 Modificação: EBC: 4.14 Modificação e Homogeneidade do malte, método Calcoflour.

Filtrabilidade: Determinação do volume do filtrado (ml): De acordo com EBC: 4.5.1 (Extrato de Malte: Congress Mash) subseção 8.2. Filtração: O volume da filtração é lido após 1 hora de filtração através de papel de filtro estriado, diâmetro 320 mm, Schleicher e Schüll n° 597 V2, Machery, Nagel and Co. em funis, diâmetro de 200 mm, ajustados em frascos de 500 ml. pH: EBC: 8.17 (pH do Mosto). índice Kolbach EBC: 4.9.1 (Nitrogênio de Malte Solúvel: Método Espectrofotométrico) e EBC: 3.3.1 [Nitrogênio Total da Cevada: Método Kjeldahl (RM)].

Recuperação do EBC: 4.5.1 (Extrato de Malte: Congress Mash, Extrato a Extrato seco, rendimento). A expressão recuperação do extrato no mosto é definida como a soma das substâncias solúveis (glicose, sacarose, maltose, maltotriose, dextrinas, proteína, gomas, outras substâncias inorgânicas) extraídas do cereal (malte e suplementos) expressas em percentuais com base na matéria seca. A parte insolúvel remanescente é definida como grãos gastos. em que: E\ = teor de extrato da amostra, em% (m/m) E2 = teor de extrato do cereal seco, em% (m/m) P = teor de extrato no mosto, em% de Platô M = teor da umidade do cereal, em% (m/m) 800 = quantidade de água destilada acrescentada à malte moído até 100 g de cereal.

Preparação do malte moído A menos que de outra forma estabelecido, a maceração foi realizada como segue: O malte moído foi preparado de acordo com EBC: 4.5.1 com o uso de malte triturado de acordo com EBC: 1.1. As provas da maceração foram realizadas em vasos tampados de 500 ml, cada um contendo um malte moído com 50 g de cereal e ajustado a um peso total de 250 ± 0,2 g com água pré-aquecida até uma temperatura inicial da maceração de + 1°C. Durante a maceração, os vasos foram incubados em banho de água com agitação. Após a maceração e antes da filtração, foi acrescentada água a cada vaso até um total de 300 g. Após a filtração, o mosto foi fervido por 10 minutos e diluído com água a 1:1. Para porções de 200 g de mosto foi adicionado 1,2 g de levedura e a fermentação foi realizada por 4 dias. Exemplos Exemplo 1 Um cereal compreendendo 65% de malte bem modificado e 35% de amido de milho, foi macerado na presença de uma alfa-amilase com o uso do perfil de temperatura de maceração consistindo de 34 minutos em 52°C, aumento de l°C/minuto durante 18 minutos, 60°C durante 60 minutos, aumento de l°C/minuto durante 18 minutos, 78°C durante 20 minutos, seguido por resfriamento até 20°C. O mosto e a cerveja nova foram analisados por HPLC. Os resultados são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Amido de milho: perfil de açúcar, Plato e rendimento de mosto diluído, álcool, da cerveja nova Exemplo 2 Um cereal compreendendo 65% de malte bem modificado e 35% de amido de arroz, foi macerado na presença de uma alfa-amilase com o uso do perfil de temperatura de maceração consistindo de 34 minutos em 52°C, aumento de l°C/minuto durante 18 minutos, 64°C durante 60 minutos, aumento de l°C/minuto durante 18 minutos, 78°C durante 20 minutos, seguido por resfriamento até 20°C. O mosto e a cerveja nova foram analisados por HPLC. Os resultados são apresentados na Tabela 2.

REIVINDICAÇÕES

Claims (8)

1. Processo para a produção de um mosto de cervejeiro, caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer um cereal compreendendo malte e um suplemento de amido granular derivado de milho, arroz, sorgo ou painço, e b) macerar o cereal na presença de uma alfa-amilase exogenamente fornecida em uma temperatura abaixo da temperatura inicial de gelatinização do referido amido granular, c) desmacerar, em uma temperatura acima da temperatura inicial de gelatinização; e d) separar os grãos gastos do malte moído e obter um mosto.

2. Processo de acordo com a reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o suplemento compreende amido de milho ou amido de arroz.

3. Processo de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o cereal do malte moído compreende 60-80% de malte de cevada.

4. Processo de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que o cereal do malte moído compreende de 10% a 40% de amido de suplemento.

5. Processo de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a alfa-amilase é uma alfa-amilase bacteriana.

6. Processo de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a alfa-amilase bacteriana compreende um módulo de ligação de amido.

7. Processo de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado pelo fato de que a alfa-amilase é usada em uma quantidade de 0,5 a 5 KNU/g DM.

8. Processo para a produção de cerveja, caracterizado pelo fato de que compreende produzir um mosto de cervejeiro pelo processo como definido em qualquer reivindicação precedente e fermentar o mosto.