CN101443439B - 糖化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于从颗粒淀粉辅料谷粉产生麦芽汁和啤酒的方法，所述颗粒淀粉辅料谷粉是在低于所述淀粉的糊化温度的温度下糖化的。

Description

糖化方法

发明领域

本发明涉及使用包含未糊化辅料(adjunct)的谷粉(grist)的改进的糖化方法(mashing process)。

背景技术

传统地，啤酒只从大麦麦芽、啤酒花(hop)和水酿造。然而，经常用辅料代替部分大麦麦芽，所述辅料如玉米、稻(rice)、高粱和小麦、精制淀粉或可易于发酵的碳水化合物，如糖或糖浆(syrup)。使用辅料主要因为它们易于获得，并且以低于从大麦麦芽中获得碳水化合物的成本提供碳水化合物。也可以实现其它优势，例如，增强的物理稳定性、优越的防冻性(chill-proof qualities)和更好的明澄度(brilliancy)。

糖化是将来自碎大麦麦芽(milled barley malt)和辅料的淀粉转化成可发酵和不可发酵的糖，从而产生理想的麦芽汁组合物的过程。传统的糖化包括将碎大麦麦芽和辅料与水在设定温度和以设定体积混合，以使在麦芽制作过程中已经开始的生物化学变化继续进行。糖化过程在各种温度进行一段时期，以活化负责蛋白质和糖降解的内源酶。然而，经常用作辅料淀粉的大米和玉米淀粉具有比麦芽淀粉高的糊化温度(gelatinization temperature)。因此，将这些辅料在加入麦芽醪(malt mash)之前在单独的“谷物蒸煮机(cereal cooker)”中蒸煮并糊化。因此，尽管使用辅料降低了原材料的价格成本，但是要求在谷物蒸煮机上有额外的投资，以及加热辅料所用能源的额外费用。因此允许使用未糊化辅料谷粉的更简单的糖化方法是理想的。

发明简述

本发明的发明人令人惊讶地发现，可以向麦芽醪中加入辅料淀粉，并在未进行预先的糊化(prior gelatinization)时有效地将所述辅料淀粉糖化。因此，辅料，如玉米渣(corn grits)、玉米淀粉或大米淀粉(rice starch)，可以与麦芽一起在内源麦芽酶(malt enzyme)具有活性的温度糖化。将未糊化辅料液化需要通过外源提供的酶组合物来补充内源麦芽酶。

因此，在第一方面，本发明提供产生啤酒用麦芽汁(Brewer’s wort)的方法，其包括在存在外源提供的酶组合物时，在内源麦芽酶具有活性的温度将包含麦芽和颗粒淀粉辅料的谷粉糖化。本发明还提供产生啤酒用麦芽汁的方法，其包括：a)提供醪，所述醪包含：i)麦芽，ii)包含颗粒淀粉的辅料，和iii)外源提供的酶组合物，b)在低于所述颗粒淀粉的起始糊化温度的温度，将所述醪糖化，c)在起始糊化温度以上的温度煮浆(mashing off)，和d)从醪中分离麦糟(spent grain)并获得麦芽汁。

在第二方面，本发明提供根据由第一方面的方法产生的麦芽汁。

在第三方面，本发明提供通过发酵第二方面的麦芽汁而产生的啤酒。

发明详述

本发明的目的是提供更简单的糖化方法，允许在该方法中使用未糊化的辅料谷粉。

定义

在本公开的内容中，使用了本领域普通技术人员通常理解的各种术语。但是，几个术语使用了特定的含义，含义如下所限定。

如本文所使用的，将术语“谷粉”理解为含有淀粉或糖的材料，其是啤酒生产的基础，例如，大麦麦芽和辅料。

将术语“麦芽”理解为任何发芽的谷物谷粒(malted cereal grain)，特别是大麦。

将术语“辅料”理解为不是大麦麦芽的谷粉的部分。辅料可以是任何富含淀粉的植物材料，如，但不限于，玉米(corn)、稻、高粱和小麦。本发明的优选辅料是玉米渣。

将术语“醪(mash)”理解为包含淀粉的浆料，所述浆料包含压碎的大麦麦芽、压碎的未发芽的谷粒、其它含淀粉材料、或它们的组合，其浸于水中用于制备麦芽汁。

将术语“麦芽汁”理解为糖化过程中提取谷粉后的未发酵的液体流出物(liquor run-off)。

将术语“麦糟”理解为提取谷粉和分离麦芽汁后残余的沥干的(drained)固体。

将术语“啤酒”在本文中理解为发酵后的麦芽汁，即，从大麦麦芽，任选地辅料和啤酒花酿造的含酒精饮料(alcoholic beverage)。

将术语“颗粒淀粉”理解为未糊化淀粉，或生淀粉。

将术语“起始糊化温度”理解为淀粉糊化开始的最低温度。水中加热的淀粉在50℃-75℃开始糊化；糊化的确切温度依赖于具体的淀粉，可以由技术人员容易地确定。因此，起始糊化温度可以根据植物物种、植物物种的特定品种以及生长条件而不同。在本发明的上下文中，给定淀粉的起始糊化温度是使用由Gorinstein.S.和Lii.C.，Starch/

，Vol.44(12)pp.461-466(1992)所描述的方法，5％的淀粉颗粒中失去双折射的温度(the temperature at whichbirefringence is lost in5％of the starch granules)。对于玉米淀粉，起始糊化温度为约62℃(中点：67℃，完成：72℃)，对于大米淀粉，起始糊化温度约为68℃(中点：74.5℃，完成：78℃)(Starch，2nd ed.(第二版)Industrial microscopyof starch，Eileen Maywald Snyder著)。

将术语麦芽汁中的“提取回收率”理解为从谷粉(麦芽和辅料)中提取的可溶性物质的总和，以基于干物质的百分比表示。

将本公开中关于多肽或DNA序列所使用并涉及的术语“同一性”理解为两个序列之间的同一性程度，表示第一个序列与第二个序列之间的差别(derivation)。同一性可以通过本领域已知的计算机程序适当确定，如GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version8，August1994，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of MolecularBiology，48,443-453)。对于多肽序列比较，使用下述设定：缺口产生罚分(GAPcreation penalty)为3.0和缺口延伸罚分(GAP extension penalty)为0.1。

在本发明的第一方面，提供了产生啤酒用麦芽汁的方法。该方法包括在存在外源提供的酶组合物时，在内源麦芽酶具有活性的温度将包含麦芽和颗粒淀粉辅料的谷粉糖化。本发明还提供产生啤酒用麦芽汁的方法，其包括：a)提供醪，其包含：i)麦芽，ii)包含颗粒淀粉的辅料，和iii)外源提供的酶组合物，b)在低于所述颗粒淀粉的起始糊化温度的温度将所述醪糖化，c)在高于起始糊化温度的温度煮浆，和d)从醪中分离麦糟并获得麦芽汁。

依照本发明的第一方面，在存在外源提供的酶组合物时，在内源麦芽酶(例如传统糖化方法依赖的α-淀粉酶、蛋白酶和β-淀粉酶)具有活性的温度，将包含麦芽和颗粒淀粉辅料的谷粉糖化。

在向谷粉中加入水之前，可以优选将水预热以使醪在醪形成时达到理想的糖化温度。如果形成的醪的温度低于理想的糖化温度，优选供给额外的热量以达到理想的工艺温度(process temperature)。优选地，在醪形成后15分钟内，或者更优选10分钟内，如9、8、7、6、5、4、3、2分钟内或者甚至更优选1分钟内达到理想的糖化温度，或者最优选在醪形成时达到理想的糖化温度。糖化方法的温度曲线(temperature profile)可以是常规糖化方法的曲线，其中设定温度以实现麦芽酶对谷粉干物质的最佳降解。

麦芽优选源自选自下组的一种或多种谷粒：玉米、大麦、小麦、黑麦、高粱、黍(millet)和稻。优选地，麦芽是大麦麦芽。

谷粉优选包含0.5％至99％，优选1％至95％，更优选5％至90％，甚至更优选10％至80％，和最优选50％至70％的发芽的谷粒。

除了发芽的谷粒，谷粉可以优选包含辅料，如未发芽的玉米，或其它未发芽的谷粒，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、买罗高粱(milo)、黍和/或高粱，或生淀粉和/或精制淀粉和/或源自植物的含糖材料，所述植物像小麦、黑麦、燕麦、玉米、稻、买罗高粱、黍、高粱、马铃薯、甘薯、木薯(cassava)、木薯淀粉(tapioca)、西米(sago)、香蕉、糖甜菜和/或甘蔗。就本发明而言，辅料可以从块茎、根、茎、叶、豆类、谷物和/或整谷粒获得。优选的是从玉米和/或稻获得的辅料，更优选地，辅料是大米淀粉、玉米淀粉和/或玉米渣。醪优选包含1％至50％，优选5％至45％，更优选10％至40％，并且甚至更优选20至35％的辅料淀粉。在本发明的糖化过程之前、过程中或之后，可以向麦芽醪中加入包含可易于发酵的碳水化合物如糖或糖浆的辅料，但是优选在糖化过程之后加入。

在形成醪之前，优选将麦芽和/或辅料磨碎，并最优选干磨或湿磨。

根据本发明，酶组合物由外源提供，并可以在形成醪之前、过程中或之后加入至醪成分，例如水或谷粉中。在特别优选的实施方案中，酶组合物包含α-淀粉酶(EC3.2.1.1)和/或葡糖淀粉酶(EC3.2.1.3)。α-淀粉酶优选为细菌α-淀粉酶和/或真菌α-淀粉酶，例如，酸性真菌α-淀粉酶。葡糖淀粉酶优选为真菌葡糖淀粉酶。

通过选择组成酶组合物的酶，可以控制得到的麦芽汁中糖的组成。包含α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和很少量或不含葡糖淀粉酶的酶组合物会产生富含麦芽糖的麦芽汁，其与全麦芽的麦芽汁(all malt wort)相似。包含葡糖淀粉酶的酶组合物会生成富含葡萄糖的麦芽汁。

在又一个优选实施方案中，加入其它酶，所述酶选自下组中的一种或多种：纤维素酶、支链淀粉酶、蛋白酶、麦芽糖产生酶、漆酶、脂肪酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、植酸钙镁酯酶(phytin esterase)和木聚糖酶。

在糖化过程中，从谷粉提取的淀粉逐渐水解成可发酵的糖和较小的糊精。优选地，在提取麦芽汁之前，醪对碘测试是淀粉阴性。

通过在70℃或更高，优选至少71℃，至少72℃，至少73℃，至少74℃，至少75℃，至少76℃，至少77℃，至少78℃，至少79℃，至少80℃，和更优选至少81℃，或者甚至至少82℃或更高的温度煮浆来完成糖化。

从醪获得麦芽汁通常包括滤去(strain)麦糟中的麦芽汁，所述麦糟即形成谷粉的部分的不溶性谷粒和谷壳材料。可将热水通过麦糟以从谷粉中冲洗或淋洗(sparge)出任何残余的提取物。优选地，提取回收率为至少80％，优选至少85％，至少90％，至少95％，至少98％和更优选至少99％或者甚至至少100％。可以使用麦芽汁本身，或者可将麦芽汁浓缩和/或干燥。

在优选实施方案中，在存在α-淀粉酶时将包含60-80％大麦麦芽和20％至40％玉米淀粉和/或玉米渣和/或大米淀粉的谷粉糖化。优选地，以约2KNU/g

DM的量，优选以0.05至10KNU/g DM，更优选0.1至8KNU/g DM，甚至更优选0.5至5KNU/g DM的量使用下述的α-淀粉酶AMY1或AMY2。优选地，使用温度曲线将淀粉糖化，所述温度曲线优选在约52℃开始，递增至约64℃，并优选在约78℃或更高煮浆。

本发明的第二方面是由上述方法产生的麦芽汁。除本发明的第二方面外，由本发明的第一方面的方法产生的麦芽汁可以发酵以产生酒精饮料，优选啤酒。麦芽汁的发酵可包括向麦芽汁中加入(pitch with)酵母浆料，该浆料包含新鲜酵母(即先前未用于本发明的酵母)或者所述酵母可以是回收酵母。应用的酵母可以是适于啤酒酿造的任何酵母，特别是选自酵母属菌种(Saccharomycesspp.)的酵母，如酿酒酵母和葡萄汁酵母(S.uvarum)，其包括这些生物体的天然或人工产生的变体。用于产生啤酒的麦芽汁的发酵方法为本领域的技术人员所熟知的。

本发明的方法可包括向发酵麦芽汁中加入二氧化硅水凝胶(silicahydrogel)，以增加啤酒的胶质稳定性(colloidal stability)。这些方法还可以包括向发酵的麦芽汁中加入硅藻土(kieselguhr)并过滤以使啤酒鲜亮(bright)。

本发明的第三方面是通过本发明的方法产生的啤酒，这种啤酒可以是任何类型的啤酒。优选的啤酒类型包括爱儿啤酒(ale)、烈性爱儿啤酒(strong ale)、烈性黑啤酒(stout)、钵尔透黑啤酒(porter)、陈贮啤酒(lager)、苦味酒(bitter)、出口型啤酒(export beer)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒(high-alcohol beer)、低醇啤酒(low-alcohol beer)、低热量啤酒(low-caloriebeer)或清淡啤酒(light beer)。

酶

待应用于本发明中的外源酶应该根据它们在本发明方法中的处理温度保持充分活性的能力，以及它们在醪中在适度酸性pH条件下保持充分活性的能力来进行选择，并应以有效量加入。酶可以源自任何来源，优选来自植物或藻类，更优选来自微生物，如来自细菌或真菌。

α-淀粉酶(EC3.2.1.1)

本发明的方法中使用的特定α-淀粉酶可以是芽孢杆菌属α-淀粉酶(Bacillusalpha-amylase)，例如，源自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)和嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)的菌株的α-淀粉酶。优选的细菌α-淀粉酶是具有下述突变的重组嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：I181*+G182*+N193F。变体如SEQ ID NO：2(AMY1)所示。还优选的是α-淀粉酶，其具有与SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列具有至少50％，如至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或者特别地至少99％同一性的氨基酸序列。

对于本发明甚至更优选的是包含淀粉结合模块的细菌α-淀粉酶，优选家族20的淀粉结合模块。这种α-淀粉酶可源自黄热芽孢杆菌(Bacillusflavothermus)(同物异名：Anoxybacilluscontaminans)。最优选的是α-淀粉酶，其与SEQ ID NO：1(AMY2)所示氨基酸序列具有至少50％，如至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，或者特别地至少99％同一性。

芽孢杆菌属α-淀粉酶可以以1.0-1000NU/kgdm，优选2.0-500NU/kg dm，优选10-200NU/kg dm的量加入。

本发明的方法使用的另一种特定的α-淀粉酶可以是任何真菌α-淀粉酶。特别优选的是酸性真菌α-淀粉酶。特别期望的是与WO96/23874中SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列显示高同一性(即至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％或者甚至至少90％同一性)的真菌α-淀粉酶。

真菌α-淀粉酶可以以1-1000AFAU/kg DM，优选2-500AFAU/kg DM，优选20-100AFAU/kg DM的量加入。

葡糖淀粉酶

本发明的方法中使用的其它特定的酶可以是源自微生物或植物的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。优选的是真菌或细菌来源的选自下组中一种或多种的葡糖淀粉酶：曲霉属葡糖淀粉酶(Aspergillus glucoamylase)，特别是黑曲霉(A.niger)G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或其变体，如WO92/00381和WO00/04136中公开的；泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(WO84/02921)、米曲霉(A.oryzae)(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或其变体或片段。

其它期望的曲霉属葡糖淀粉酶变体包括增强热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等(1996)，Prot.Eng.9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，Prot.Engng.8,575-582)；N182(Chen等(1994)，Biochem.J.301，275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等(1996)，Biochemistry，35，8698-8704)；和在位置A435和S436引入Pro残基(Li等(1997)，Protein Engng.10，1199-1204)。其它期望的葡糖淀粉酶包括踝节菌属(Talaromyces)葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利号Re.32,153)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(US4,587,215)的葡糖淀粉酶。期望的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(genus Clostridium)的葡糖淀粉酶，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)。优选的葡糖淀粉酶包括源自米曲霉的葡糖淀粉酶，如与WO00/04136中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或特别地至少99％同一性的葡糖淀粉酶。还期望的是商业产品AMG200L；AMG300L；SAN^TM SUPER和AMG^TM E(来自Novozymes)；OPTIDEX^TM300(来自Genencor Int.)；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900(来自Enzyme Bio-Systems)；G-ZYME^TM和G990ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶而且蛋白酶含量低)。可以以本领域技术人员所熟知的有效量加入葡糖淀粉酶。

纤维素酶(E.C.3.2.1.4)

纤维素酶可以是微生物来源的，如源自丝状真菌(例如，曲霉属、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium))的菌株。纤维素酶的具体实例包括从特异腐质霉(H.insolens)可获得的内切-葡聚糖酶(内切-葡聚糖酶I)，其还由WO91/17244中图14的氨基酸序列定义，和WO91/17243中所述43kD特异腐质霉内切-葡聚糖酶。

本发明的方法中使用的特定纤维素酶可以是内切-葡聚糖酶，如内切-1，4-β-葡聚糖酶。期望的是β-葡聚糖酶，其与WO2003/062409中SEQ ID NO：1所公开的氨基酸序列具有至少90％，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者特定地至少99％同一性。

可以使用的商业上可获得的纤维素酶制剂包括

和

(可从Novozymes A/S获得)、LAMINEX^TM和

CP(可从Genencor Int.获得)和7069W(可从

，Germany获得)。

可以以1.0-10000BGU/kg dm，优选10-5000BGU/kg dm，优选50-1000BGU/kg dm和最优选100-500BGU/kg dm的量加入β-葡聚糖酶。

脱支酶

本发明的方法中应用的另一种酶可以是脱支酶，如异淀粉酶(E.C.3.2.1.68)或支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1，6-D-支链糖苷键(alpha-1，6-D-glucosidic branch linkage)，并可以根据异淀粉酶不能攻击支链淀粉和对α-极限糊精的作用有限来与支链淀粉酶相区别。可以以本领域技术人员所熟知的有效量加入脱支酶。

蛋白酶

合适的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌和细菌蛋白酶。优选的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，通过在低于pH7的酸性条件下水解蛋白质的能力表征的蛋白酶。

期望的酸性真菌蛋白酶包括源自曲霉属、毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、假丝酵母属(Candida)、革盖菌属(Coriolus)、内座壳属(Endothia)、虫霉属(Enthomophtra)、耙菌属(Irpex)、青霉属(Penicillium)、小核菌属(Sclerotium)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌蛋白酶。特别期望的是源自黑曲霉(参见，例如，Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Japan，28，216)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)(参见，例如，Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、泡盛曲霉(Hayashida等，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)(WO95/02044)或米曲霉的蛋白酶，如pepA蛋白酶；和来自微小毛霉(Mucor pusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。

期望的蛋白酶还可以是中性或碱性蛋白酶，如源自芽孢杆菌属的菌株的蛋白酶。预期用于本发明的特定蛋白酶源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloli-quefaciens)，并具有可以在Swissprot以登录号P06832获得的序列，以及与所述氨基酸序列具有至少90％，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者特别地至少99％同一性的蛋白酶。

其它期望的蛋白酶是与丹麦专利申请PA2001 01821和PA2002 00005中SEQ ID NO：1所公开的氨基酸序列具有至少90％，如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者特别地至少99％同一性的蛋白酶。

还期望的是木瓜蛋白酶样的蛋白酶(papain-like protease)，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)中的蛋白酶，如EC3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶(chymopapain))、EC3.4.22.7(萝藦蛋白酶(asclepain))、EC3.4.22.14(猕猴桃蛋白酶(actinidain))、EC3.4.22.15(组织蛋白酶L)、EC3.4.22.25(甘氨酰内肽酶)和EC3.4.22.30(番木瓜蛋白酶(caricain))。

蛋白酶负责在醪中将全长的高分子量蛋白降解成低分子量蛋白。低分子量蛋白对于酵母的营养是必需的，而高分子量蛋白保证泡沫稳定性。因此技术人员熟知蛋白酶应该以平衡量加入，同时为酵母提供缓慢(amble)游离氨基酸并且保留足够的高分子量蛋白以使泡沫稳定化。可以以0.1-1000AU/kg dm，优选1-100AU/kg dm并且最优选5-25AU/kg dm的量加入蛋白酶。

材料与方法

酶

AMY1：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，其具有WO99/19467中SEQ IDNO：4所示的氨基酸序列，并具有突变：I181^*+G182^*+N193F。

AMY2：Anoxybacillus contaminansα-淀粉酶，其具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

方法

蛋白水解活性(AU)

可以用变性的血红蛋白作为底物确定蛋白水解活性。在用于确定蛋白水解活性的Anson-血红蛋白方法中，消化变性的血红蛋白，并且用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血红蛋白。用酚试剂确定TCA可溶产物的量，苯酚与酪氨酸和色氨酸形成蓝色。

一个Anson单位(AU)定义为在标准条件下(即，25℃，pH7.5和10分钟反应时间)以下述初始速率消化血红蛋白的酶量，该初始速率使得每分钟释放的TCA可溶产物的量与酚试剂形成的颜色和一毫当量(milliequivalent)酪氨酸与酚试剂形成的颜色相同。

可从Novo Nordisk A/S，Denmark索取获得更详细描述该分析方法的文件夹AF4/5，所述文件夹通过引用并入本文。

α-淀粉酶活性(NU)

使用马铃薯淀粉作为底物可以确定淀粉分解活性。这种方法基于改性的(modified)马铃薯淀粉通过酶的分解，并通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来跟踪此反应。起初，形成蓝黑色(blackish blue color)，但是在淀粉分解过程中，蓝色越来越浅，并逐渐变成红褐色(reddish-brown)，将其与有色玻璃标准相比较。

一个Kilo Novoα淀粉酶单位(KNU)等于1000NU。一个KNU定义为在标准条件下(即在37℃+/-0.05；0.0003M Ca²⁺；和pH5.6)将5.26g淀粉干物质Merck Amylum solubile糊精化的酶量。

可从Novo NordiskA/S，Denmark索取获得更详细描述该分析方法的文件夹AF9/6，所述文件夹通过引用并入本文。

葡糖淀粉酶活性(AGU)

Novo葡糖淀粉酶活性单位(AGU)定义为在37℃和pH4.3每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量。

使用来自Boehringer Mannheim，124036的Glucose GOD-Perid试剂盒，通过根据(AEL-SM-0131，可应要求从Novozymes获得)修正的方法以AGU/ml确定活性。标准品：AMG-标准品，批号7-1195，195AGU/ml。将375μL底物(50mM乙酸钠，pH4.3中的1％麦芽糖)在37℃温育5分钟。加入稀释于乙酸钠中的25μL酶。10分钟后，通过加入100μL0.25M NaOH而停止反应。将20μL转移至96孔微量滴定板并加入200μLGOD-Perid溶液(124036，Boehringer Mannheim)。30分钟后，在室温测定650nm处的吸光度，并由AMG-标准品，以AGU/ml计算活性。分析方法(AEL-SM-0131)的详细描述可以应要求从Novozymes获得。

β-葡聚糖酶活性(BGU)

可以以β-葡聚糖酶单位(BGU)测定纤维素分解活性。β-葡聚糖酶与β-葡聚糖反应形成葡萄糖或者还原性碳水化合物(reducing carbonhydrate)，所述葡萄糖或者还原性碳水化合物使用Somogyi-Nelson方法作为还原糖测定。1个β-葡聚糖酶单位(BGU)是在标准条件下，以相当于1μmol葡萄糖每分钟的还原能力释放葡萄糖或还原性碳水化合物的酶量。标准条件是0.5％β-葡聚糖作为底物，在pH7.5和30℃，反应时间为30分钟。分析方法(EB-SM-0070.02/01)的详细描述可以应要求从Novozymes A/S获得。

标准的Congress糖化方法

根据EBC：4.5.1Extract ofMalt：Congress Mash(EBC：4.5.1麦芽的提取：欧洲啤酒协会规定的糖化方法制备的醪)的方法进行标准的Congress糖化方法(欧洲啤酒协会规定的糖化方法)。温度曲线由以下组成：初始的糖化温度45℃持续30分钟，在25分钟内以每分钟1.0℃增加至70℃，通过在70℃进行65分钟完成，总糖化时间为2小时。

其它方法

可以在Analytica-EBC，Analysis Committee of EBC，the European BrewingConvention(1998)，Verlag Hans Carl Geranke-Fachverlag中发现分析粗产品、麦芽汁、啤酒等的方法。就本发明而言，用于确定下述参数的方法为：

Plato：折射计。

可同化N：基于EBC：8.10，但以TNBS(2，4，6三硝基苯磺酸)代替水合茚三酮作为试剂。TNBS在游离氨基或氨基酸和肽的溶液中反应，产生黄色复合物，在340nm处用分光光度计测定所述黄色复合物。

β-葡聚糖：EBC：8.13.2(麦芽汁的高分子量β-葡聚糖含量：荧光法)。颜色：EBC：4.7.2

修饰EBC：4.14麦芽的修饰和均一性(Homogenity)，Calcoflour方法

过滤性：滤出液体积(ml)的确定：根据EBC：4.5.1(麦芽的提取：Congress醪)8.2子部分。过滤：通过直径为320mm的槽形滤纸(fluted filter paper)过滤1小时后，读取过滤体积。Schleicher和Schüll No.5971/2，Machery，Nagel and Co.于漏斗中，200mm直径，适于(fit in)500ml摇瓶。

pH：EBC：8.17(麦芽汁的pH)。

Kolbach指数：EBC：4.9.1(麦芽的可溶氮：分光光度计法)和EBC：3.3.1(大麦的总氮：Kjeldahl法(RM))。

提取回收率：EBC：4.5.1(麦芽的提取：Congress醪，干物质提取，得率)。术语麦芽汁中的提取回收率定义为从谷粉(麦芽和辅料)中提取的可溶性物质(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精、蛋白质、树胶、无机物、其它物质)的总和，其以基于干物质的百分比表示。其余的不可溶部分定义为麦糟。

$a)E_1=\frac{P(M+800)}{100-P}$

$b)E_2=\frac{E_1\·100}{100-M}$

其中；

E ₁ ＝样品的提取物含量，％(m/m)

E ₂ ＝干谷粉的提取物含量，％(m/m)

P＝麦芽汁中的提取物含量，％Plato

M＝谷粉的含水量，％(m/m)

800＝对于100g谷粉向醪中加入的蒸馏水量

醪制备

除非另外指出，如下进行糖化。根据EBC：4.5.1，使用根据EBC：1.1碾磨的麦芽制备醪。在500ml有盖容器中进行糖化试验，所述容器每个包含具有50g谷粉的醪，并用预热至起始糖化温度+1℃的水调节至250±0.2g的总重。在糖化过程中，在水浴中温育容器并搅拌。在糖化后和过滤前，向每个容器中加入水，使总重达到300g。在过滤后，将麦芽汁煮沸10分钟并用水1:1稀释。对于200g麦芽汁部分，加入1.2g酵母并进行4天发酵。

实施例

实施例1

在α-淀粉酶存在下，使用如下糖化温度曲线将包含65％充分修饰的麦芽(well modified malt)和35％玉米淀粉的谷粉糖化：52℃34分钟，每分钟增加1℃，60℃持续60分钟，在18分钟内每分钟增加1℃，78℃持续20分钟，然后冷却至20℃。通过HPLC分析麦芽汁和新啤酒(young beer)。结果示于表1中。

表1.玉米淀粉：糖组成，稀释的麦芽汁的Plato和得率，新啤酒的醇。

实施例2

在α-淀粉酶存在下，使用如下糖化温度曲线将包含65％充分修饰的麦芽和35％大米淀粉的谷粉糖化：52℃34分钟，每分钟增加1℃，64℃持续60分钟，每分钟增加1℃，78℃持续20分钟，然后冷却至20℃。通过HPLC分析麦芽汁和新啤酒。结果示于表2中。

Claims (12)

1.用于产生啤酒用麦芽汁的方法，其包括：

a)提供包含麦芽和未糊化淀粉辅料的谷粉，所述的淀粉辅料来自玉米、稻、高粱或黍；

b)在低于所述淀粉辅料的起始糊化温度，在外源提供的α-淀粉酶存在下，水解谷粉中的淀粉；

c)在起始糊化温度以上的温度煮浆；和

d)从醪中分离麦糟并获得麦芽汁。

2.根据权利要求1的方法，其中辅料包含源自玉米或稻的淀粉。

3.根据权利要求1或2的方法，其中谷粉包含60-80％的大麦麦芽。

4.根据权利要求1或2的方法，其中谷粉包含10％至40％的辅料淀粉。

5.根据权利要求3的方法，其中谷粉包含10％至40％的辅料淀粉。

6.根据权利要求1或2的方法，其中α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶。

7.根据权利要求6的方法，其中α-淀粉酶是包含淀粉结合模块的细菌α-淀粉酶。

8.根据权利要求1或2的方法，其中α-淀粉酶是与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。

9.根据权利要求8的方法，其中α-淀粉酶的使用量为0.5至5KNU/gDM。

10.根据权利要求1或2的方法，其中α-淀粉酶是与SEQ ID NO：2所示任何氨基酸序列具有至少50％同一性的多肽。

11.根据权利要求10的方法，其中α-淀粉酶的使用量为0.5至5KNU/gDM。

12.一种产生啤酒的方法，包含用前述权利要求任一项的方法来生产啤酒用麦芽汁，并对麦芽汁进行发酵。