CN109628515A - 发酵生产l-氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵生产L‑氨基酸的方法，所述L‑氨基酸选自L‑赖氨酸、L‑苏氨酸和L‑异亮氨酸，所述方法包括在合适的条件下培养具有在合适的培养基中分泌所述L‑氨基酸的能力的棒杆菌属细菌以及在培养基中累积所述L‑氨基酸以形成含L‑氨基酸的发酵液的步骤。所述细菌包含编码赋予对林可酰胺抗性的多肽的多核苷酸，所述多肽已经通过缺失或替换至少部分所述多核苷酸和编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶的基因的至少一个拷贝而被修饰。
Description
本发明涉及发酵生产选自L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-异亮氨酸的L-氨基酸的方法，所述方法包括在合适的条件下在合适的培养基中培养具有分泌所述L-氨基酸能力的棒杆菌属细菌的以及在培养基中累积所述L-氨基酸以形成含有L-氨基酸的发酵液的步骤。
L-氨基酸用于人类医学、制药工业、食品工业，特别是用于动物营养。
L-氨基酸，例如L-赖氨酸，是通过发酵棒杆菌属、特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的菌株而产生的。由于在经济上的重要性，不断地改良生产方法。所述改良可涉及发酵技术，例如搅拌和供氧，或者涉及营养培养基的成分，例如发酵期间的糖浓度，或者涉及将发酵液加工为合适产物形式，例如通过干燥和粒化发酵液或者通过离子交换层析进行加工，或者可涉及微生物自身的固有性质。
用于改良这些微生物性质的方法是诱变、选择和筛选突变体。以此方式获得的菌株对抗代谢物具有抗性或对于调节重要性的代谢物是营养缺陷型的，并产生L-氨基酸。熟知的抗代谢物是L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(见例如Tosaka et al.:Agricultural and Biological Chemistry42(4),745-752,(1978))。重组DNA技术方法多年来也用于棒杆菌属、特别是谷氨酸棒杆菌的L-氨基酸生产菌株的菌株改良，通过修饰即增强或减弱各个L-氨基酸生物合成基因及研究对L-氨基酸生产的影响进行改良。已经分别揭示了棒杆菌属细菌或谷氨酸棒杆菌菌株的染色体的核苷酸序列及其分析。这个信息可在可公开访问的数据库中获得，并可用于菌株开发目的。这样的数据库之一是NCBI的GenBank数据库(National Center for Biotechnology Information,U.S.National Library ofMedicine 8600Rockville Pike,Bethesda MD,20894USA)。
在生物体的测序染色体的注释程序期间，数据库信息提供者为所鉴定的结构如基因或编码序列提供称为locus_tag的独特标识符。
谷氨酸棒杆菌ATCC13032染色体的核苷酸序列及其分析由Ikeda和Nakagawa(Applied Microbiology and Biotechnology 62,99-109(2003))及在EP1108790A2中描述。其在NCBI可以登录号NC_003450获得。Locus_tag NCgl2592标识编码“主要促进子超家族通透酶”的序列。谷氨酸棒杆菌R染色体的核苷酸序列及其分析由Yukawa et al.(Microbiology153(4):1042-1058(2007))描述。其在NCBI可以登录号AP009044获得。Locus_tag cgR_2586标识编码假设蛋白质的序列。
Lv et al.(Journal of Bacteriology 194(3),742-743(2012)描述了谷氨酸棒杆菌ATCC14067的染色体测序，这是先前称作黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)的菌株。其在NCBI可以登录号AGQQ02000001和AGQQ02000002获得。Locus_tag KIQ_001365标识编码“MFS转运蛋白通透酶”的序列。
先前称作乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的核苷酸序列及其分析由Chen等揭示，在NCBI登录号为NZ_CP016335。Locus_tagBBD29_13115标识编码“MFS转运蛋白通透酶”的序列。
Kim et al.(Molecules and Cells 12(1),112-116(2001))鉴定了谷氨酸棒杆菌的lmrB基因，其编码赋予林可酰胺类如林可霉素和克林霉素抗性的蛋白质。作者使用的谷氨酸棒杆菌菌株称作ASO19E12。菌株ASO19E12源自ATCC13059(见：Follettie et al；Journal of Bacteriology 175(13),4096-4103(1993))。Kim等提示林可霉素抗性是能量依赖性流出系统。所述lmrB基因的核苷酸序列和编码的氨基酸序列可在NCBI的GenBank数据库获得，登录号为AF237667。该序列也在序列表中以SEQ ID NO:1示出。
林可霉素是由林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)产生的林可酰胺类抗生素。CAS(化学文摘服务)注册号为154-21-2。相应的盐酸盐的CAS注册号是859-18-7。克林霉素是林可霉素的氯化衍生物。CAS注册号为18323-44-9。相应的盐酸盐的CAS注册号是21462-39-5。关于抗生素的概述可见于教科书Jason C.Gallagher and Conan MacDougall(Antibiotics Simplified,2nd edition,Jones&Bartlett Learning,2012)。棒杆菌属、特别是谷氨酸棒杆菌在其染色体中含有编码赋予选自林可霉素和克林霉素的林可酰胺类抗生素抗性的多肽的基因。
Nakagawa揭示了GenBank登录号BAC00079的定义为谷氨酸棒杆菌ATCC13032的“主要促进子超家族通透酶”的蛋白质的编码的氨基酸序列。该序列也在本说明书的序列表中以SEQ ID NO:2示出。
发现条目AF237667和BAC00079的氨基酸序列是全长相同的。也发现所述两个氨基酸序列与WO2001000804 A2中SEQ ID NO:2揭示的ATCC13032蛋白质的氨基酸序列是相同的(也见GenBank登录号CAC26288)。WO2001000804A2的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列与本说明书序列表中SEQ ID NO:8所示氨基酸序列相同。
Nishio等揭示了GenBank登录号BAV24312的定义为Corynebacterium glutamicumssp.lactofermentum菌株AJ1511的“林可霉素抗性蛋白lmrB”的蛋白质的编码的氨基酸序列。该序列也在本说明书的序列表中以SEQ ID NO:3示出。
Chen等揭示了GenBank登录号ANU34602的定义为谷氨酸棒杆菌ATCC 13869的“MFS转运蛋白通透酶”的蛋白质的编码的氨基酸序列。这个菌株在先前称作乳糖发酵短杆菌。这个序列在本说明书的序列表中也以SEQ ID NO:4示出。
发现条目ANU34602和BAV24312的氨基酸序列是全长相同的。当与相应的ATCC13032多肽的氨基酸序列比较时，发现相同性为99.2％。
Yukawa等揭示了GenBank登录号BAF55600的具有称作“MFS”区域的谷氨酸棒杆菌R的“假定蛋白cgR_2586”的编码的氨基酸序列。BAF55600中揭示的氨基酸序列也在序列表中以SEQ ID NO:5示出。其与相应的ATCC13032的氨基酸序列的相同性为96.7％。术语“MFS”是“主要促进子超家族”的缩写。根据在NCBI的保守结构域数据库(见数据库条目cd06174)，该术语表示一组较大且多样的二级转运蛋白，包括单向转运蛋白、协同转运蛋白和反向转运蛋白，其促进各种物质包括离子、糖磷酸盐、药物、神经递质、核苷、氨基酸和肽穿过质膜或内膜的转运。
Lv等揭示了GenBank登录号KEI24239的定义为“MFS转运蛋白通透酶”的来自谷氨酸棒杆菌ATCC14067(先前称作黄色短杆菌)的蛋白质的编码的氨基酸序列。该序列也在序列表中以SEQ ID NO:6示出。发现其与相应的ATCC13032的氨基酸序列的相同性为97.9％。
所述发现的概述在表1中示出。
表1：使用Clustal W Larkin et al.:Clustal W and Clustal X version2.0.In:Bioinformatics 23,2947-2948(2007))，通过序列比对比较各个谷氨酸棒杆菌菌株的LmrB多肽的编码氨基酸序列与ATCC13032的LmrB多肽的编码氨基酸序列(GenBank登录号BAC00079)。
| 菌株 | 登录号 | 长度* | 相同的氨基酸 | ％相同性 |
| ASO19E12 | AF237667 | 481 | 481 | 100.0 |
| AJ1511 | BAV24312 | 481 | 477 | 99.2 |
| ATCC13869 | ANU34602 | 481 | 477 | 99.2 |
| R | BAF55600 | 481 | 465 | 96.7 |
| ATCC14067 | KEI24239 | 481 | 471 | 97.9 |
*氨基酸残基数
WO2001000804A2揭示了编码来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的胁迫抗性和耐受性蛋白质的各个基因及其在调节精细化合物生产中的用途。lmrB基因及编码的多肽在所述申请中以标识符RXA01524和SEQ ID NO:1和2揭示。建议使用药物或抗生素抗性基因如lmrB基因作为揭示新抗生素的工具。也建议在合适的宿主中表达或过表达所述基因以产生可用于筛选新的抗生素化合物的物体(参见第54和95-97页)。WO2001000804A2进一步揭示了谷氨酸棒杆菌，其中胁迫抗性和耐受性(SRT)蛋白被破坏，例如lmrB(即SEQ ID NO:2，其与本说明书中SEQ ID NO:8相同)。在一个优选的实施方案中，微生物也用于生产氨基酸，例如L-赖氨酸。
本发明的目的是提供通过棒杆菌属、优选谷氨酸棒杆菌种的细菌发酵生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸的L-氨基酸的新方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种发酵生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸的L-氨基酸的方法，包括以下步骤：
a)培养棒杆菌属细菌，所述细菌在合适的条件下在合适的培养基中能分泌所述L-氨基酸，
b)在培养基中累积所述L-氨基酸以形成含有L-氨基酸的发酵液，
其中在所述细菌中，编码多肽的多核苷酸通过缺失或替换至少部分所述多核苷酸而被修饰，所述多肽与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有至少90％相同性且赋予选自林可霉素和克林霉素的林可酰胺类抗生素抗性，且其中所述细菌包含至少一个拷贝的编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶的基因。
用于本发明的方法中的棒杆菌属细菌、优选谷氨酸棒杆菌种细菌具有分泌选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸、优选L-赖氨酸的L-氨基酸的能力。在这个细菌中，由lmrB基因编码的赋予对选自林可霉素和克林霉素的林可酰胺类抗生素抗性的多肽通过缺失或替换至少部分所述多核苷酸而被修饰，导致所述多肽被消除或关闭。
由修饰的多核苷酸编码的具有赋予对选自林可霉素和克林霉素、优选林可霉素的林可酰胺类抗生素抗性的活性的多肽，包含与SEQ ID NO:8所示氨基酸序列具有至少90％、至少95％、特别优选至少96％、非常特别优选至少97％、至少98％或至少99％或100％、优选99.8％相同性的氨基酸序列。
此外，在本发明的方法中，必需的是，所述细菌包含至少一个拷贝的编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶的多核苷酸。具有反馈抗性的天冬氨酸激酶是指一种天冬氨酸激酶变体，其对L-赖氨酸和/或L-苏氨酸对其活性的抑制作用敏感性较低或者不敏感。
特定天冬氨酸激酶变体的这种反馈抗性可以通过在存在L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物(均10mM)或者L-赖氨酸类似物S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和L-苏氨酸的混合物(例如50mM S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和10mM L-苏氨酸)条件下测量其活性，与包含于野生型菌株如ATCC13032、ATCC14067和ATCC13869中的野生型酶的相应活性相比而确定。
天冬氨酸激酶的EC编号为EC 2.7.2.4。关于编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽变体的谷氨酸棒杆菌的多核苷酸的描述见于例如US5688671、US6844176和US6893848。尤其是，总结列表可见于WO2009141330A1(US2009311758A1)。本领域中使用的编码天冬氨酸激酶多肽的基因的符号是lysC。在基因编码具有反馈抗性的多肽变体的情况中，本领域通常使用如lysCfbr这样的符号，其中fbr表示具有反馈抗性。
SEQ ID NO:15示出菌株ATCC13032的天冬氨酸激酶多肽的编码序列的核苷酸序列，SEQ ID NO:16示出所编码的多肽的氨基酸序列。本领域已知(见US6893848)在SEQ IDNO:16的位置311的氨基酸Thr替换为Ile则赋予所述酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸的混合物的抑制作用的反馈抗性。
因此，优选所述具有反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:16所示氨基酸序列，其在311位含有异亮氨酸而不是苏氨酸。
所述氨基替换可以通过将SEQ ID NO:15的位置932的核碱基胞嘧啶(c)替换为胸腺嘧啶(t)而实现。因此，苏氨酸的acc密码子被改变为异亮氨酸的atc密码子。
本领域还已知天冬氨酸激酶多肽的编码序列的gtg起始密码子替换为atg则增强该多肽的表达(见例如WO201300827A1第50页第23-31行；US20090325244A1；EP2796555A2)。因此，优选编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽的序列以atg起始密码子开始。
发现与未修饰的细菌相比，本发明的修饰的细菌在合适的发酵条件下在合适的培养基中以一或多个参数增加的方式分泌选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸、优选L-赖氨酸的L-氨基酸，所述参数选自产物浓度(即每体积，或者培养基/发酵液的质量单位产生的L-氨基酸的量(例如分别为g/l或g/kg))，产物产率(即每消耗碳源产生的L-氨基酸的量(例如g/g或kg/kg))，产物形成率(即分别每体积或每质量单位的培养基/发酵液及时间单位产生的L-氨基酸的量(例如g/l×h或者g/kg×h))，及特定产物形成速率(即每单位时间及每生产菌株的质量单位产生的L-氨基酸的量(例如g/h×g干重))。
显然，更高的产物浓度有利于产物生产，例如纯化和分离。增加的产物产量降低了原料需求量。增加的产物形成率降低了发酵要求的时间，因此增加了给定发酵罐的可利用性。
因此，本发明的方法中使用的细菌有助于改良生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸的L-氨基酸的技术和经济方面要求。
本文提及的、特别是在产物形成背景中提及的术语L-氨基酸，还包括其离子形式和盐，例如在L-氨基酸L-赖氨酸的情况中包括L-赖氨酸的单盐酸盐或者L-赖氨酸硫酸盐。
为了实施本发明，使用棒杆菌属细菌。关于谷氨酸棒杆菌菌属及这个菌属包含的菌种的描述可见于K.A.Bernard和G.Funke在Bergey’s Manual of Systematics ofArchaea and Bacteria中的文章“Corynebacterium”(Bergey’s Manual Trust,2012)。
在棒杆菌属中，优选谷氨酸棒杆菌种。
合适的谷氨酸棒杆菌菌株是该菌种的野生菌株，例如菌株ATCC13032、ATCC14067和ATCC13869，以及得自这些野生菌株的分泌L-氨基酸的菌株，优选得自这些野生菌株的L-氨基酸分泌菌株。
菌株ATCC13032(也可以DSM20300获得)是谷氨酸棒杆菌种的分类类型菌株。菌株ATCC14067(也可以DSM20411获得)在过去也称作黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)。菌株ATCC13869(也可以DSM1412获得)在过去也称作乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)。基于DNA-DNA杂交的这组细菌的分类学研究由Liebl等(InternationalJournal of Systematic Bacteriology 41(2),255-260,1991)完成。Yang和Yang(BMCGenomics18(1):940)提供了基于基因组序列分析的谷氨酸棒杆菌种各个菌株的对比分析。
在过去几十年中，从如ATCC13032、ATCC14067、ATCC13869等菌株开始，本领域中获得了大批棒杆菌属的L-氨基酸分泌菌株。这些菌株是通过菌株开发程序获得的，使用如传统的诱变、抗代谢物抗性选择以及通过遗传工程方法对提及的L-氨基酸的生物合成途径的基因进行扩增和启动子修饰等方法进行。关于这些方面的概述可见于L.Eggeling和M.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC Press,2005)或者H.Yukawa和M.Inui(Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnolgy,Springer Verlag,2013)。
谷氨酸棒杆菌种的L-赖氨酸分泌菌株为本领域中熟知，且可用于本发明。例如，Blombach等(Applied and Environmental Microbiology 75(2),419-427,2009)描述了菌株DM1933，其根据布达佩斯条约以登录号DSM25442保藏。通过几个菌株开发步骤从ATCC13032获得菌株DM1933。其它分泌L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株在例如WO2008033001A1和EP0841395A1中描述。
关于分泌L-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株的培育概述可见于L.Eggeling和M.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC Press,2005)、V.F.Wendisch(AminoAcid Biosynthesis-Pathways,Regulation and Metabolic Engineering,SpringerVerlag,2007)、H.Yukawa和M.Inui(Corynebacterium glutamicum Biology andBiotechnolgy,Springer Verlag,2013)及Eggeling和Bott(Applied Microbiology andBiotechnology 99(9),3387-3394,2015)。
分泌L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株为本领域已知，可用于本发明。例如EP0358940A1描述了菌株DM368-2，其以DSM5399保藏。
谷氨酸棒杆菌种的L-异亮氨酸分泌菌株是本领域已知的，且可用于本发明。例如，US4656135描述了菌株AJ12152，其以Ferm BP-760保藏。
在第一步，对野生菌株例如ATCC13032、ATCC13869或ATCC14067实施本发明的方法，在第二步对所得菌株进行针对希望的L-氨基酸的菌株开发程序，以获得本发明的细菌。
术语DSM表示位于德国不伦瑞克市的保藏机构德国微生物保藏中心。术语ATCC表示位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯市的保藏机构美国典型培养物保藏中心。术语FERM表示位于日本东京的保藏机构国家高级工业科学技术学院(National Institute of Technologyand Evaluation，NITE)。两个其它熟知的保藏机构是KCCM和NRRL。术语KCCM表示位于韩国首尔的保藏机构韩国微生物保藏中心韩国微生物保藏中心。术语NRRL表示位于美国伊利诺伊州皮奥里亚的保藏机构农业研究机构培养物保藏中心。
关于活的生物体如细菌如棒杆菌或肠杆菌中存在的多核苷酸和多肽的生物化学和化学结构的详细描述可见于Berg等的教科书"Biochemie"(Spektrum AkademischerVerlag Heidelberg,Berlin,Germany,2003；ISBN3-8274-1303-6)。
由含有核碱基或碱基腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)的脱氧核糖核苷酸单体组成的多核苷酸被称为脱氧核糖多核苷酸或脱氧核糖核酸(DNA)。由含有核碱基或碱基腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)的核糖核苷酸单体组成的多核苷酸被称为核糖多核苷酸或核糖核酸(RNA)。所述多核苷酸中的单体通过3',5'-磷酸二酯键彼此共价连接。按照惯例，单链多核苷酸从5'至3'方向书写。因此，多核苷酸具有5'-末端和3'-末端。多核苷酸中核苷酸单体的顺序通常称为核苷酸序列。因此，多核苷酸的特征在于其核苷酸序列。在细菌例如在棒杆菌或埃希氏杆菌中，DNA通常以双链形式存在。因此，DNA分子的长度通常以碱基对(bp)给出。编码特定多肽的核苷酸序列称作编码序列(cds)。
从化学观点来看，基因是多核苷酸，通常是脱氧核糖多核苷酸。
术语基因是指包含编码特定多肽的核苷酸序列(编码序列)和相邻终止密码子的多核苷酸。在更广泛的意义上，该术语包括编码序列之前和之后的调节序列。在前面的序列位于编码序列的5'末端，也称为上游序列。启动子是位于编码序列5'末端的调节序列的实例。编码序列后面的序列位于其3'末端，也称为下游序列。转录终止子是位于编码序列3'末端的调节序列的实例。
多肽由通过肽键连接的L-氨基酸单体组成。对于L-氨基酸的缩写，使用IUPAC(国际理论与应用化学联合会(International Union of Pure and Applied Chemistry))的单字母代码和三字母代码。由于多肽的性质，生物合成多肽具有氨基末端和羧基末端，也称作N-末端和C-末端。多肽中L-氨基酸或L-氨基酸残基的顺序通常称为氨基酸序列。多肽也称为蛋白质。
此外，本领域已知编码序列的起始密码子或初始密码子分别是gtg以及编码氨基酸甲硫氨酸的atg。
此外，在本发明研究期间分析了由谷氨酸棒杆菌种的不同菌株的lmrB基因编码的多肽的氨基酸序列。
在本发明研究期间分析了谷氨酸棒杆菌菌株DM1547的lmrB基因的编码序列及推导的编码的多肽的氨基酸序列，这个菌株得自菌株ATCC13032，描述于EP1239040A2(US2002119537A1)，并以DSM13994保藏。发现所述多肽具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列，其中在位置104包含缬氨酸。因此，其与来自ATCC13032的相应氨基酸序列的相同性为99.8％。
因此，赋予对选自林可霉素和克林霉素、优选林可霉素的林可酰胺类抗生素抗性的所述多肽包含与SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，赋予对选自林可霉素和克林霉素、优选林可霉素的林可酰胺类抗生素抗性的所述多肽包含与SEQ IDNO:8的氨基酸序列具有至少99.5％、优选至少99.8％相同性的氨基酸序列，例如相应于SEQID NO:8的位置104的丙氨酸由缬氨酸替换。
所述多肽在此也被称作LmrB多肽。
测量抗性/敏感性表型的教导尤其可见于医学微生物学教科书，如H.Brandis,W.H.J.Eggers and G.Pulverer(Lehrbuch der Medizinischen Mikrobiologie,7thedition,Gustav Fischer Verlag,1994)、Swenson et al.in Manual of ClinicalMicrobiology(Murry et al.(eds),1356-1367,American Society for Microbiology,1995)或者Kim等所编教科书。
所述编码的LmrB多肽的氨基酸序列通常长度为481个氨基酸残基。本领域已知编码多肽的N-末端氨基酸甲硫氨酸在翻译期间或之后可以通过氨肽酶除去(JocelynE.Krebs,Elliott S.Goldstein and Stephan T.Kilpatrick:Lewin’s Genes X,Jonesand Bartlett Publishers,US,2011)。
来自SEQ ID NO:2示出的ATCC13032的编码的LmrB多肽的氨基酸序列也示于SEQID NO:8。编码所述多肽的核苷酸序列示于SEQ ID NO:7的位置1001-2443。
在本发明的研究期间，分析了在EP1239040A2(US2002119537A1)中描述的并以DSM13994保藏的菌株DM1547的LmrB多肽的编码序列。发现菌株DM1547的所述编码序列与菌株ATCC13032的编码序列除了位置311之外均相同。编码序列的位置311相应于SEQ ID NO:7的位置1311。DM1547中编码序列的位置311含有核碱基胸腺嘧啶(t)，产生缬氨酸的gtg密码子。ATCC13032中编码序列的位置311含有胞嘧啶(c)，产生丙氨酸的gcg密码子。
因此，来自DM1547的编码的LmrB多肽包含SEQ ID NO:8所示氨基酸，其中在104位包含缬氨酸。编码所述多肽的核苷酸序列在SEQ ID NO:7的位置1001-2443示出，其中在第1311位包含胸腺嘧啶(t)。
来自SEQ ID NO:4所示ATCC13869的编码的LmrB多肽的氨基酸序列也示于SEQ IDNO:10中。编码所述多肽的核苷酸序列示于SEQ ID NO:9的位置1001-2443。
来自SEQ ID NO:12所示ATCC14067的编码的LmrB多肽的氨基酸序列也示于SEQ IDNO:1中。编码所述多肽的核苷酸序列示于SEQ ID NO:11的位置1001-2443。
在本发明的研究期间，显示ATCC14067的LmrB多肽在菌株ATCC13032和L-赖氨酸生产菌株DM1933中的过表达导致对林可霉素的抗性增加。
LmrB多肽包含SEQ ID NO:8、其中在位置104包含缬氨酸的SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:10或SEQ ID NO:12的氨基酸序列，特别优选SEQ ID NO:8及其中在104位包含缬氨酸的SEQ ID NO:8。编码所述LmrB多肽的核苷酸序列也可以选自SEQ ID NO:7的位置1001-2443、其中在位置1311包含胸腺嘧啶(t)的SEQ ID NO:7位置1001-2443、SEQ ID NO:9的位置1001-2443及SEQ ID NO:11的位置1001-2443，特别优选SEQ ID NO:7的位置1001-2443及其中在位置包含1311胸腺嘧啶(t)的SEQ ID NO:7的位置1001-2443。
关于多核苷酸的处理和实验工作的教导和信息可见于J.Sambrook等的手册(Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、C.R.Newton和A.Graham的教科书(PCR,Spektrum Akademischer Verlag,1994)及D.Rickwood和B.D.Hames的手册(Gel electrophoresis of nucleic acids,a practicalapproach,IRL Press,1982)。
对于多核苷酸和多肽的序列分析如序列比对，也可以使用公共软件如CLCGenomics Workbench(Qiagen，Hilden，Germany)或由European BioinformaticsInstitute(EMBL-EBI,Hinxton,UK)提供的程序MUSCLE。
在本发明的研究期间，发现通过消除LmrB多肽修饰棒杆菌属、优选谷氨酸棒杆菌属的L-氨基酸分泌细菌，与未修饰的细菌相比增加其分泌L-氨基酸的能力，条件是所述细菌进一步包含如前述至少一个拷贝的编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶的多核苷酸。技术人员已知怎样分别实现棒杆菌中所述LmrB多肽的所述消除或关闭的多种诱变方法。
在本发明的一个实施方案中，导致LmrB活性消除的lmrB多核苷酸的修饰通过以下方式实现：
a)缺失相应于编码的氨基酸序列的位置1-258的氨基酸的所述lmrB多核苷酸的部分编码序列中的一或两个核苷酸，或者
b)至少缺失相应于优选SEQ IDNO:8所示编码氨基酸序列的位置210-258、位置175-302、位置119-364或者位置58-439的氨基酸的所述多肽的部分编码序列，特别优选缺失至少其全部编码序列。
作为通过根据a)或b)、优选b)的缺失获得的所述消除的结果，在棒杆菌、优选谷氨酸棒杆菌的染色体中分别产生新的结合点或者结合位点。
例如，如果缺失全部编码序列，则在棒杆菌优选谷氨酸棒杆菌的染色体中产生新的连接点，其连接编码序列邻接的终止密码子的第一个核碱基(例如SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9或SEQ ID NO:11的位置2444的核碱基)与编码序列的起始密码子前的第一个核碱基，例如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的位置1000的核碱基。
优选地，所述lmrB多核苷酸的修饰导致在所述多核苷酸中插入限制酶EcoRV的识别位点。因此，在根据上文b)的具体实施方案中，缺失SEQ ID NO:7、其中在位置1311包含胸腺嘧啶(t)的SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的位置989-2455的核苷酸序列，其包含所述LmrB多肽的编码序列和相邻终止密码子，并将限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列gatatc插入缺失位点。
因此，在谷氨酸棒杆菌的染色体中产生新的连接位点，其特征在于位于SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的位置988的核碱基与位置2456的核碱基之间的gatatc核苷酸序列桥接。菌株ATCC13032、DM1547和ATCC13869在位置988含有核碱基胞嘧啶(c)，如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9所示。菌株ATCC14067在位置988含有核碱基胸腺嘧啶(t)，如SEQ ID NO:11所示。在位置2456，这三个菌株均含有核碱基胸腺嘧啶，如SEQ ID NO:7、SEQID NO:9和SEQ ID NO:11所示。
产生的新连接位点的核苷酸序列包括其上游和下游的核苷酸序列在SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及表2、表3、表4、表5、表6、表7和表8中示出。
因此，在本发明的更具体的实施方案中，通过选自表2的核苷酸序列鉴定谷氨酸棒杆菌菌株、优选ATCC13032、ATCC13869、ATCC14067及得自这些菌株的L-氨基酸分泌菌株的染色体中的缺失，所述缺失包含LmrB多肽的全部编码序列和相邻终止密码子，伴随插入限制酶EcoRV的识别位点。
因此，在本发明的另一个更具体的实施方案中，通过选自表3的核苷酸序列鉴定谷氨酸棒杆菌菌株、优选ATCC13032、ATCC13869及得自这些菌株的L-氨基酸分泌菌株的染色体中的缺失，所述缺失包含LmrB多肽的全部编码序列和相邻终止密码子，伴随插入限制酶EcoRV的识别位点。
因此，在本发明的另一个更具体的实施方案中，通过选自表4的核苷酸序列鉴定谷氨酸棒杆菌菌株、优选ATCC13032、ATCC13869及得自这些菌株的L-氨基酸分泌菌株的染色体中的缺失，所述缺失包含LmrB多肽的全部编码序列和相邻终止密码子，伴随插入限制酶EcoRV的识别位点。
因此，在本发明的另一个更具体的实施方案中，通过选自表5的核苷酸序列鉴定谷氨酸棒杆菌菌株、优选ATCC13032、ATCC13869及得自这些菌株的L-氨基酸分泌菌株的染色体中的缺失，所述缺失包含LmrB多肽的全部编码序列和相邻终止密码子，伴随插入限制酶EcoRV的识别位点。
因此，在本发明的另一个更具体的实施方案中，通过选自表6的核苷酸序列鉴定谷氨酸棒杆菌菌株、优选ATCC13032、ATCC13869及得自这些菌株的L-氨基酸分泌菌株的染色体中的缺失，所述缺失包含LmrB多肽的全部编码序列和相邻终止密码子，伴随插入限制酶EcoRV的识别位点。
因此，在本发明的另一个更具体的实施方案中，通过选自表7的核苷酸序列鉴定谷氨酸棒杆菌菌株、优选ATCC14067及得自其的L-氨基酸分泌菌株的染色体中的缺失，所述缺失包含LmrB多肽的全部编码序列和相邻终止密码子，伴随插入限制酶EcoRV的识别位点。
因此，在本发明的另一个更具体的实施方案中，通过选自表8的核苷酸序列鉴定谷氨酸棒杆菌菌株、优选ATCC14067及得自其的L-氨基酸分泌菌株染色体中的缺失，所述缺失包含LmrB多肽的全部编码序列及邻近终止密码子，伴随插入限制酶EcoRV的识别位点。
表2：表示包含根据本发明的lmrB基因的编码序列和相邻的终止密码子的谷氨酸棒杆菌染色体中缺失的核苷酸序列列表。限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列从SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14的位置789延伸至位置794。
| 行 | 核苷酸序列 | 长度* |
| a | SEQ ID NO:13位置789-801 | 13 |
| b | SEQ ID NO:13位置789-802 | 14 |
| c | SEQ ID NO:13位置789-803 | 15 |
| d | SEQ ID NO:13位置789-804 | 16 |
| e | SEQ ID NO:13位置789-805 | 17 |
*分别以核碱基或者碱基对记的长度
表3：表示包含根据本发明的lmrB基因的编码序列和相邻终止密码子的谷氨酸棒杆菌菌株染色体中缺失的核苷酸序列列表。限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列从SEQ ID NO:13中位置789延伸至位置794。
| 行 | 核苷酸序列 | 长度* |
| a | SEQ ID NO:13位置788-800 | 13 |
| b | SEQ ID NO:13位置788-801 | 14 |
| c | SEQ ID NO:13位置788-802 | 15 |
| d | SEQ ID NO:13位置788-803 | 16 |
| e | SEQ ID NO:13位置788-804 | 17 |
*分别以核碱基或者碱基对记的长度
表4：表示包含根据本发明的lmrB基因的编码序列和相邻终止密码子的谷氨酸棒杆菌菌株染色体中缺失的核苷酸序列列表。限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列从SEQ ID NO:13中位置789延伸至位置794。
| 行 | 核苷酸序列 | 长度* |
| a | SEQ ID NO:13位置787-798 | 12 |
| b | SEQ ID NO:13位置787-899 | 13 |
| c | SEQ ID NO:13位置787-800 | 14 |
| d | SEQ ID NO:13位置787-801 | 15 |
| e | SEQ ID NO:13位置787-802 | 16 |
| f | SEQ ID NO:13位置787-803 | 17 |
*分别以核碱基或者碱基对记的长度
表5：表示包含根据本发明的lmrB基因的编码序列和相邻终止密码子的谷氨酸棒杆菌菌株染色体中缺失的核苷酸序列列表。限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列从SEQ ID NO:13中位置789延伸至位置794。
| 行 | 核苷酸序列 | 长度* |
| a | SEQ ID NO:13位置784-795 | 12 |
| b | SEQ ID NO:13位置783-795 | 13 |
| c | SEQ ID NO:13位置782-795 | 14 |
| d | SEQ ID NO:13位置781-795 | 15 |
| e | SEQ ID NO:13位置780-795 | 16 |
| f | SEQ ID NO:13位置779-795 | 17 |
*分别以核碱基或者碱基对记的长度
表6：表示包含根据本发明的lmrB基因的编码序列和相邻终止密码子的谷氨酸棒杆菌菌株染色体中缺失的核苷酸序列列表。限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列从SEQ ID NO:13中位置789延伸至位置794。
| 行 | 核苷酸序列 | 长度* |
| a | SEQ ID NO:13位置784-796 | 13 |
| b | SEQ ID NO:13位置783-796 | 14 |
| c | SEQ ID NO:13位置782-796 | 15 |
| d | SEQ ID NO:13位置781-796 | 16 |
| e | SEQ ID NO:13位置780-796 | 17 |
*分别以核碱基或者碱基对记的长度
表7：表示包含根据本发明的lmrB基因的编码序列和相邻终止密码子的谷氨酸棒杆菌菌株染色体中缺失的核苷酸序列列表。限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列从SEQ ID NO:14中位置789延伸至位置794。
| 行 | 核苷酸序列 | 长度* |
| a | SEQ ID NO:14位置782-795 | 14 |
| b | SEQ ID NO:14位置781-795 | 15 |
| c | SEQ ID NO:14位置780-795 | 16 |
| d | SEQ ID NO:14位置779-795 | 17 |
| e | SEQ ID NO:14位置778-795 | 18 |
*分别以核碱基或者碱基对记的长度
表8：表示包含根据本发明的lmrB基因的编码序列和相邻终止密码子的谷氨酸棒杆菌菌株染色体中缺失的核苷酸序列列表。限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列从SEQ ID NO:14的位置789延伸至位置794。
| 行 | 核苷酸序列 | 长度* |
| a | SEQ ID NO:14位置788-801 | 14 |
| b | SEQ ID NO:14位置788-802 | 15 |
| c | SEQ ID NO:14位置788-803 | 16 |
| d | SEQ ID NO:14位置788-804 | 17 |
*分别以核碱基或者碱基对记的长度
在另一个实施方案中，通过如下措施实现导致LmrB活性消除的lrmB多核苷酸的修饰：
a)将一或两个核苷酸插入相应于编码的氨基酸序列位置1-258的氨基酸的所述LmrB多肽编码序列部分中，
b)将编码选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸、优选L-赖氨酸的L-氨基酸的生物合成途径的多肽的基因插入相应于所述LmrB多肽氨基酸位置175-258、优选位置210-258的氨基酸的编码序列部分中。
所述编码L-赖氨酸生物合成途径的多肽的基因优选选自包含以下的列表：
·编码丙酮酸羧化酶(EC 6.4.1.1)的谷氨酸棒杆菌pyc基因，如在例如WO1999018228A2(US7267967B1)或者EP2107128A2中描述，
·编码天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)的谷氨酸棒杆菌aspB基因，如在例如EP0219027A2或WO2008033001A1中描述，
·编码天冬氨酸激酶、优选具有反馈抗性的天冬氨酸激酶(EC 2.7.2.4)的谷氨酸棒杆菌lysC基因，如在例如US6893848中描述，
·编码天冬氨酸半醛脱氢酶(EC 1.2.1.11)的谷氨酸棒杆菌asd基因，如在例如EP0387527A1或WO2008033001A1中描述，
·编码二氢吡啶二羧酸合酶(EC 4.3.3.7)的谷氨酸棒杆菌dapA基因，如在例如EP0197335A1中描述，
·编码二氢吡啶二羧酸还原酶(EC 1.17.1.8)的谷氨酸棒杆菌dapB基因，如在例如US8637295或EP0841395A1中描述，
·编码二氨基庚二酸脱氢酶(EC 1.4.1.16)的谷氨酸棒杆菌ddh基因，如在例如EP0811682A2中描述，
·编码赖氨酸通透酶的谷氨酸棒杆菌lysE基因，如在例如WO9723597A2(US6858406B1)中描述，
·编码二氨基庚二酸表异构酶的谷氨酸棒杆菌dapF基因，如在例如US6670156中描述，及
·编码二氨基庚二酸脱羧酶(EC 4.1.1.20)的谷氨酸棒杆菌的lysA基因，如在例如EP0811682A2中描述。
在另一个实施方案中，导致LmrB活性消除的所述lrmB多核苷酸修饰是通过在相应于编码的氨基酸序列例如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的位置1-258、优选位置1-20、特别优选位置1-2的氨基酸的部分编码序列中，用taa-、tga-或tag-终止密码子、优选taa-或tga-终止密码子、特别优选taa-终止密码子取代编码所述多肽的氨基酸的一个或多个密码子而实现的。
在词句“一或多个密码子”中，术语“多个”当涉及在相应于编码的氨基酸序列位置1-258的氨基酸的部分编码序列中氨基酸密码子取代时，是指至多258、优选至多20、特别优选至多10、更特别优选至多3或2的任何正整数或自然数。
当涉及在相应于编码的氨基酸序列位置1-20的氨基酸的部分编码序列中氨基酸密码子取代时，“多个”是指至多20、优选至多10、特别优选至多3或2的任何正整数或自然数。
当涉及在相应于编码的氨基酸序列位置1-2的氨基酸的部分编码序列中氨基酸密码子取代时，“多个”是指2个。
在另一个实施方案中，导致LmrB活性消除的所述lrmB多核苷酸修饰是通过在相应于所述多肽的编码氨基酸序列的位置1-258、优选位置1-20、特别优选位置1-2的氨基酸的部分编码序列中至少一对相邻或邻近的密码子之间，插入选自taa-、tga-或tag-终止密码子、优选taa-或tga-终止密码子、特别优选taa-终止密码子的至少1个终止密码子、优选不超过10个终止密码子而实现的。
例如，一或两个taa-终止密码子可以插入在编码SEQ ID NO:8或者其中在位置104包含缬氨酸的SEQ ID NO:8的氨基酸序列位置1和2的氨基酸的密码子之间，或者因此插入在SEQ ID NO:7或者其中在位置1311包含胸腺嘧啶(t)的SEQ ID NO:7的核苷酸序列的位置1003和1004之间。
常用的突变谷氨酸棒杆菌基因的方法是Schwarzer和Pühler(Bio/Technology 9,84–87(1991))描述，并由等(Gene 145,69-73(1994))进一步阐述的方法和基因替换。
Peters-Wendisch等(Microbiology 144,915-927(1998))使用基因替换方法失活编码丙酮酸羧化酶的谷氨酸棒杆菌pyc基因。等使用该方法在谷氨酸棒杆菌的hom-thrB基因区中掺入缺失。在EP1094111中，该方法用于在编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的谷氨酸棒杆菌pck基因中掺入缺失。
在基因替换方法中，在所述基因的核苷酸序列中在体外构建突变，例如至少一个核碱基的缺失、插入或取代。在本发明的上下文中，所述基因(lmrB基因)的核苷酸序列编码具有如本发明所述赋予对林可酰胺类抗性的活性的多肽。这种核苷酸序列例如是本说明书序列表中SEQ ID NO:7、在位置1311含有胸腺嘧啶(t)的SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9和SEQID NO:11。在本发明的上下文中，突变是位于所述lmrB基因的编码序列中的至少一个核碱基的缺失、插入或取代，优选至少一个核碱基的缺失。
所述基因的突变核苷酸序列包含：i)突变位点5'末端的核苷酸序列，其在本领域也称作5'-侧翼序列或上游序列，ii)在突变位点的3'末端的核苷酸序列，其在本领域中也称作3'-侧翼序列或下游序列，及iii)在i)和ii)之间的突变位点的核苷酸序列。在缺失的情况下，突变位点除了缺乏特定序列外，其特征还在于侧翼序列形成新的连接点。在本发明的上下文中，所述缺失优选涉及LmrB多肽的全部编码序列或其部分。
对于一些应用，可以方便地将合适的多核苷酸进一步掺入所述突变位点。所述合适的多核苷酸可包含L-氨基酸的生物合成途径酶的编码序列，例如是L-赖氨酸生物合成途径酶的天冬氨酸激酶的编码序列，或者用于进一步菌株改良的限制酶的识别位点的核苷酸序列。
在本发明的上下文中突变的核苷酸序列的实例如SEQ ID NO:13示出。5'-侧翼序列由SEQ ID NO:7的201-988位的核苷酸序列组成。3'-侧翼序列由SEQ ID NO:7的2456-3246位的核苷酸序列组成。包含LmrB多肽的编码序列的SEQ ID NO:7的989-2455位的核苷酸序列被分别除去或缺失，此外并入如SEQ ID NO:13的位置789-794所示的限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列。
在本发明的上下文中突变的核苷酸序列的另一个实例如SEQ ID NO:14示出。5'-侧翼序列由SEQ ID NO:11的201-988位的核苷酸序列组成。3'-侧翼序列由SEQ ID NO:11的2456-3246位的核苷酸序列组成。包含LmrB多肽的编码序列的SEQ ID NO:11的989-2455位的核苷酸序列被除去或缺失，及此外并入如SEQ ID NO:14的789-794位所示的限制性内切核酸酶EcoRV的识别位点的核苷酸序列。
将构建的突变核苷酸序列克隆进在谷氨酸棒杆菌中不能自主复制的质粒载体中。随后通过转化或接合将包含所述突变核苷酸序列的所述质粒载体移至希望的谷氨酸棒杆菌菌株中。在两个同源重组事件(包括由质粒载体提供的5'-侧翼序列与谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列的重组事件，及由质粒载体提供的3'-侧翼序列与谷氨酸棒杆菌染色体的同源序列的重组事件，一次重组导致所述质粒载体的整合，一次重组导致所述质粒的切除)之后，在谷氨酸棒杆菌染色体中掺入突变。因此，所述希望的菌株的染色体中包含的所述基因的核苷酸序列由突变的核苷酸序列替换。
同源重组事件也可以称作交换。
优选地，本发明的分泌L-氨基酸的棒杆菌、优选谷氨酸棒杆菌菌株在合适条件下在合适培养基中具有分泌≥0.1g/l、优选≥0.25g/l、特别优选≥0.5g/l希望的L-氨基酸的能力。
在本发明的发酵方法中，在合适的条件下在合适的培养基中培养根据本发明的修饰的及具有分泌L-氨基酸能力的棒杆菌、优选谷氨酸棒杆菌。由于所述分泌L-氨基酸的能力，在发酵期间培养基中L-氨基酸的浓度增加并累积，从而产生L-氨基酸。
发酵过程可以是不连续发酵，如分批发酵或者补料分批发酵，或者连续发酵。关于发酵过程的一般性质的概述可见于H.Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik,SpektrumAkademischer Verlag,2011)、C.Ratledge和B.Kristiansen的教科书(BasicBiotechnology,Cambridge University Press,2006)或者V.C.Hass和R.的教科书(Praxis der Bioprozesstechnik Spektrum Akademischer Verlag,2011)。
用于通过发酵产生L-氨基酸的合适培养基含有需要的碳源、氮源、磷源、无机离子及其它有机化合物。
合适的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖以及相应的原料如淀粉水解产物、糖蜜或高果糖玉米糖浆。
作为氮源，可以使用有机含氮化合物如蛋白胨、肉浸膏、大豆水解产物或尿素，或者无机化合物如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、硝酸铵、氨气或氨水。
作为磷源，可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠的盐。
无机离子如钾、钠、镁、钙、铁和其它微量元素等以硫酸、磷酸或盐酸的盐形式提供。
其它有机化合物是指必需的生长因子如维生素例如硫胺素，或生物素或L-氨基酸如L-高丝氨酸。
培养基成分可以单一批次形式加入培养物中或在培养期间以适当方式补加。
在发酵期间，培养物的pH可以通过以适当方式应用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或者酸性化合物如磷酸或硫酸加以控制。通常将pH调节至6.0-8.5，优选6.5-8.0。为了控制泡沫，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了保持质粒的稳定性，可以向培养基中加入合适的选择性物质，例如抗生素。发酵过程优选在有氧条件下进行。为了维持这些条件，将氧气或含氧气体混合物如空气导入培养物中。适当时，发酵是在升高的压力下进行，例如0.03-0.2MPa的升高的压力。培养温度通常为25℃-40℃，优选30℃-37℃。在不连续的发酵过程中，持续培养直至形成足以回收的量的希望的L-氨基酸。然后完成培养。这个目标通常在10-160小时内完成。在连续发酵过程中，培养时间可以更长。
合适的培养基和培养条件可见于L.Eggeling和M.Bott(Handbook ofCorynebacterium glutamicum,CRC Press,2005)及专利文件US5770409、US5990350、US5275940、US5763230和US6025169。
因此，发酵过程产生含有希望的L-氨基酸的发酵液。然后从发酵液中以液体或固体形式回收含有L-氨基酸的产物。“发酵液”是指本发明的棒杆菌在其中在一定条件下培养一定时间的培养基。
因此，当发酵过程完成时，所得发酵液包含：
a)本发明棒杆菌的生物量(细胞群)，所述生物量由于所述棒杆菌细胞的增殖而产生，
b)发酵期间累积的希望的精细化合物，
c)在发酵期间累积的有机副产物，及
d)在发酵期间未被消耗的所用培养基的成分。
所述有机副产物包括在发酵期间由本发明棒杆菌在产生希望的L-氨基酸之外形成的化合物。
将发酵液从培养瓶或发酵罐中取出，适当收集，并用于提供液体或固体形式的含有所述精细化合物的产物，优选含有L-氨基酸的产物。表述“回收含有所述精细化合物的产物”也是这个含义。在最简单的情况中，已经从发酵罐中取出的含有L-氨基酸的发酵液自身组成所述回收的产物。
随后可以对发酵液实施选自以下的措施的一或多种：
a)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或者几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)除去水分，
b)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或者几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)除去生物量，所述生物量任选在被除去前失活，
c)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或者几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)除去在发酵期间形成的有机副产物，及
d)部分(>0％至<80％)至完全(100％)或者几乎完全(≥80％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％、≥99％)分别除去所用培养基的剩余成分或者在发酵期间未被消耗的剩余原料。
本领域可获得关于措施a)、b)、c)和d)的大量技术指导。
除去水分(措施a))可以通过蒸发例如使用降膜蒸发器、通过逆渗或纳滤而实现。由此获得的浓缩物可以通过喷雾干燥或喷雾粒化方法进一步处理。也可以使用喷雾干燥或喷雾粒化方法直接干燥发酵液。
除去生物量(措施b))可以通过离心、过滤或倾析或者其组合而实现。
除去有机副产物(措施c))或除去培养基的剩余成分(措施d))可以通过层析例如离子交换层析、用活性炭处理或结晶化而实现。在有机副产物或培养基的剩余成分以固体存在于发酵液中的情况中，则可通过措施b)将其除去。
关于分离、纯化和粒化方法的一般说明可见于R.Ghosh的书籍“Principles ofBioseperation Engineering”(World Scientific Publishing,2006)、F.J.Dechow的书籍“Seperation and Purification Techniques in Biotechnology”(Noyes Publications,1989)、Shaeiwitz等的文章“Bioseparation”(Ullmann’s Encyclopedia of IndustrialChemistry,Wiley-VCH,2012)及P.Serno等的书籍“Granulieren”(Editio Cantor Verlag,2007)。
L-赖氨酸产物的后续处理方案可见于R.Kelle等的文章“L-lysine Production”(L.Eggeling and M.Bott(Handbook of Corynebacterium glutamicum,CRC Press,2005))。US5279744教导了通过离子交换色谱法制备纯化的L-赖氨酸产物。US5431933教导了干燥含有发酵液的大部分成分的L-氨基酸产物、例如L-赖氨酸产物的制备。
因此，实现了希望的L-氨基酸的浓缩或纯化及提供了具有希望量的所述L-氨基酸的产物。
如Spackman等(Analytical Chemistry 30:1190-1206(1958))所述，通过离子交换层析、优选阳离子交换层析分离L-氨基酸及随后使用茚三酮柱后衍生化分析L-氨基酸，以确定在发酵期间的一或多个时间点的浓度。也可以使用邻苯二甲醛而不是茚三酮进行柱后衍生化。关于离子交换层析的概述文章可见于Pickering(LC.GC(Magazine ofChromatographic Science7(6):484-487(1989))。也可以例如使用邻苯二甲醛或异硫氰酸苯酯进行柱前衍生化，及通过反相层析(RP)、优选高效液相层析(HPLC)形式分级分离所得氨基酸衍生物。这种方法在例如Lindroth等(Analytical Chemistry51:1167-1174(1979))中描述。进行光度测定(吸光度，荧光)检测。关于氨基酸分析的综述可见于Lottspeich和Zorbas的教科书"Bioanalytik"(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg,Germany1998)。
实验部分
A)材料和方法
在此简要描述所使用的分子生物学试剂盒、引物和化学品以及所应用的方法的一些细节。
1.化学品
a.来自卡纳链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的卡那霉素溶液购自SigmaAldrich(St.Louis,USA,Cat.no.K0254)。
b.萘啶酮酸钠溶液购自Sigma Aldrich(St.Louis,USA,Cat.no.N4382)。
c.盐酸林可霉素购自Sigma Aldrich(St.Louis,USA,Cat.no.62143-1g)。
d.IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)购自Carl-Roth(Karlsruhe,Germany,Cat.no.2316.4.)。
e.如果没有另外指出，则所有其它化学品均以分析纯购自Merck(Darmstadt,Germany)、Sigma Aldrich(St.Louis,USA)或者Carl-Roth(Karlsruhe,Germany)。
2.培养
如果没有特别指出，则所有培养/温育程序均如下述进行：
a.将来自Merck(Darmstadt,Germany；Cat.no.110285)的LB培养液(MILLER)用于在液体培养基中培养大肠杆菌菌株。将所述液体培养物(10ml液体培养基/100mlErlenmeyer培养瓶(具有3个挡板))在来自Infors GmbH(Bottmingen,Switzerland)的Infors HT Multitron标准温育摇床中在37℃和200rpm条件下温育。
b.来自Merck(Darmstadt,Germany Cat.no.110283)的LB琼脂(MILLER)用于在琼脂平板上培养大肠杆菌菌株。将所述琼脂平板在37℃在来自VWR(Radnor,USA)的小型培养箱中温育。
c.来自Merck(Darmstadt,Germany；Cat.no.110493)的脑心浸液培养液(BHI)用于在液体培养基中培养谷氨酸棒杆菌菌株。将液体培养物(10ml液体培养基/100mlErlenmeyer培养瓶(具有3个挡板))在来自Infors GmbH(Bottmingen,Switzerland)的Infors HT Multitron标准温育摇床中在33℃和200rpm条件下温育。
d.来自Merck(Darmstadt,Germany；Cat.no.113825)的脑心琼脂(BHI-琼脂)用于在琼脂平板上培养谷氨酸棒杆菌菌株。将琼脂平板在来自Heraeus Instruments的具有温度控制仪(Hanau,Germany)的培养箱中在33℃温育。
3.确定光密度
a.使用来自Eppendorf AG(Hamburg,Germany)的BioPhotometer确定摇瓶培养物中细菌悬浮液在600nm的光密度(OD600)。
b.使用来自Tecan Group AG(Switzerland)的GENiosTM酶标仪确定在Wouter Duetz(WDS)微发酵系统(24孔平板)中产生的细菌悬浮液在660nm的光密度(OD660)。
4.离心
a.反应管体积直至2ml的Benchtop离心机
使用Eppendorf 5417R离心机(在13.000rpm离心5分钟)及使用1或2ml反应管(例如Eppendorf 3810X)沉淀最大体积为2ml的细菌悬浮液。
b.反应管体积直至50ml的Benchtop离心机
使用Eppendorf 5810R离心机在4.000rpm离心10分钟及使用15或50ml离心管(例如FalconTM 50ml锥形离心管)沉淀最大体积为50ml的细菌悬浮液。
5.DNA分离
a.根据厂商指导使用来自Qiagen(Hilden,Germany,Cat.No.27106)的QIAprepSpin Miniprep试剂盒从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA。
b.使用Eikmanns等(Microbiology 140,1817-1828,1994)所述的方法分离谷氨酸棒杆菌的总DNA。
6.聚合酶链反应(PCR)
在Gibson组装或者Sanger测序之前，使用校验(高保真)聚合酶的PCR用于扩增希望的DNA节段。
非校验聚合酶试剂盒用于确定直接来自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌菌落的希望的DNA片段的存在与否。
a.根据厂商指导，使用来自New England BioLabs Inc.(Ipswich,USA；Cat.No.M0530)的高保真DNA聚合酶试剂盒(Phusionhi试剂盒)模板校准性扩增选择的DNA区域(见表9)。
表9：使用来自NEB Inc.的高保真DNA聚合酶试剂盒进行PCR的热循环条件
b.来自Qiagen(Hilden,Germany；Cat.No.201203)的Taq PCR核心试剂盒(TaqKit)用于扩增希望的DNA节段以证实其存在与否。所述试剂盒根据厂商指导使用(见表10)。
表10：使用来自Qiagen的Taq PCR核心试剂盒(Taq Kit)进行PCR的热循环条件
c.根据厂商指导，使用来自Takara Bio Inc(Takara Bio Europe S.A.S.；Saint-Germain-en-Laye,France；Cat.No.RR350A/B)的Fast PCR Master Mix(Sapphire Mix)作为替代以证实取自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌菌落的细胞中希望的DNA节段存在与否(见表11)。
表11:使用来自Takara Bio Inc.的Fast PCR Master Mix(Sapphire Mix)进行PCR的热循环条件
d.引物
使用McBride和Caruthers(Tetrahedron Lett.24,245-248,1983)描述的亚磷酰胺方法，通过eurofins genomics GmbH(Ebersberg,Germany)合成寡核苷酸。
e.模板
作为PCR模板，使用适当稀释的分离的质粒DNA或者分离自谷氨酸棒杆菌液体培养物的总DNA或者包含于菌落(菌落PCR)中的总DNA。对于所述菌落PCR，通过用牙签从琼脂平板上的菌落中取细胞材料并将该细胞材料直接置于PCR反应管中制备PCR模板。将细胞材料在来自SEVERIN GmbH(Sundern,Germany)的微波炉型Mikrowave&Grill中在800W加热10秒，然后在PCR反应管中的模板中加入PCR试剂。
f.PCR循环仪
在来自Eppendorf AG(Hamburg,Germany)的Mastercycler或者Mastercyclernexus梯度型PCR循环仪中进行PCR。
7.DNA的限制酶消化
使用来自ThermoFisher Scientific(Waltham,USA,Cat.No.FD0684)的FastDigest限制性核酸内切酶(FD)和相关的缓冲液对质粒DNA进行限制性消化。根据厂商手册指导进行反应。
8.确定DNA片段的大小
使用来自Qiagen(Hilden,Germany)的QIAxcel通过自动毛细管电泳确定DNA片段的大小。
9.PCR扩增物和限制片段的纯化
根据厂商指导，使用来自Qiagen(Hilden,Germany；Cat.No.28106)的QIAquickPCR纯化试剂盒纯化PCR扩增物和限制片段。
10.确定DNA浓度
使用来自PEQLAB Biotechnologie GmbH,since 2015VWR brand(Erlangen,Germany)的NanoDrop分光光度计ND-1000测量DNA浓度。
11.Gibson组装
使用Gibson等(Science 319,1215—20,2008)所述方法，制备表达载体和可以将希望的缺失突变整合进染色体中的载体。为此使用来自New England BioLabs Inc.(Ipswich,USA；Cat.No.E2611)的Gibson组装试剂盒。将含有限制载体和至少一个DNA插入体的反应混合物在50℃温育60分钟。0.5μl组装混合物用于转化实验。
12.大肠杆菌的化学转化
a.化学感受态StellarTM细胞购自Clontech Laboratories Inc.(Mountain View,USA；Cat.No.636763)，根据厂商方案转化(PT5055-2)。
将这些细胞用作通过Gibson组装获得的反应混合物的转化宿主。将转化分批培养物在37℃培养过夜大约18小时，在补加50mg/l卡那霉素的LB琼脂上选择含有质粒的转化株。
b.大肠杆菌K-12菌株S17-1用作将基于pK18mobsacB的质粒从大肠杆菌接合转移至谷氨酸棒杆菌的供体。菌株S17-1由Simon,R.等(Bio/Technology 1,784-794,1983)描述。其可得自美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC47055。
化学感受态大肠杆菌S17-1细胞如下所述制备：用菌株S17-1的100μl细菌悬浮液接种10ml LB培养基(10ml液体培养基/100ml Erlenmeyer培养瓶(具有3个挡板))预培养物，将培养物在37℃和250rpm条件下温育过夜大约18小时。用300μl预培养物接种主培养物(具有3个挡板的250ml Erlenmeyer培养瓶中70ml LB)，在37℃温育至OD600为0.5-0.8。将培养物在4℃和4000rpm离心6分钟。弃去上清。将细胞沉淀重悬于20ml无菌冰的50mM的CaCl2溶液中，在冰上温育30分钟。在另一次离心步骤后，将沉淀重悬于5ml冰的50mM CaCl2溶液中，在冰上悬浮温育30分钟。然后将细胞悬浮液用85％无菌冰甘油调节至终浓度为20％甘油(v/v)。将悬浮液分为50μl等份，在-80℃贮存。
为了转化S17-1细胞，使用Tang等(Nucleic Acids Res.22(14),2857–2858,1994)的方案及热休克45秒。
13.谷氨酸棒杆菌的接合
使用等(Gene 145,69-73,1994)描述的pK18mobsacB质粒系统将希望的DNA片段整合进谷氨酸棒杆菌染色体中。使用如等(Journal of Bacteriology172,1663-1666,1990)所述经修改的方法将各个质粒移至希望的谷氨酸棒杆菌接受菌株中。
在BHI培养基中在33℃进行谷氨酸棒杆菌菌株的液体培养。在48.5℃进行9分钟热休克。通过将接合分批培养物铺板于补加25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸的EM8琼脂(表12)上选择得自第一次重组事件的转化接合株。将EM8琼脂平板在33℃温育72小时。
表12：EM8琼脂的组成成分
| 成分 | 浓度(g/l) |
| 葡萄糖(过滤灭菌) | 23 |
| CSL(玉米浆) | 30 |
| 豆粕蛋白胨(Merck,Germany) | 40 |
| (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> | 8 |
| 尿素 | 3 |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 4 |
| MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.5 |
| FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.01 |
| CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 0.001 |
| ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.01 |
| 泛酸钙，D(+) | 0.01 |
| 硫胺素 | 0.001 |
| 肌醇 | 0.1 |
| 烟酸 | 0.001 |
| 生物素(过滤灭菌) | 0.005 |
| CaCO<sub>3</sub>(单独高压蒸汽灭菌) | 1.6 |
| 琼脂-琼脂(Merck,Germany) | 14 |
使用无菌牙签将转化接合株移至补加25mg/l卡那霉素和50mg/l萘啶酸的BHI琼脂上。将该琼脂平板在33℃温育20小时。然后将以这种方式产生的各个转化接合株的培养物在33℃在具有3个挡板的100ml Erlenmeyer培养瓶中10ml BHI培养基中进一步增殖24小时。为了分离经第二次重组事件的克隆，从液体培养物中取等份试样，适当稀释并铺板于补加10％蔗糖的BHI琼脂上铺板上(通常100-200μl)。将该琼脂平板在33℃温育48小时。然后检查在含有蔗糖的琼脂平板上生长的菌落的卡那霉素敏感性表型。为此，使用牙签从菌落中取细胞材料并将其移至含有25mg/l卡那霉素的BHI琼脂上及含有10％蔗糖的BHI琼脂上。将所述琼脂平板在33℃温育60小时。通过PCR检验经证实对卡那霉素敏感及对蔗糖抗性的转化结合克隆中希望的遗传特征整合进染色体中的情况。
14.确定核苷酸序列
使用Sanger等(Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74,5463–5467,1977)所述双脱氧链终止法，在Applied (Carlsbad,CA,USA)3730xl DNA分析仪上，通过Eurofins Genomics GmbH(Ebersberg,Germany)经循环测序确定DNA分子的核苷酸序列。来自Scientific&Educational Software(Denver，USA)的Clonemanager Professional 9软件用于具化和评估序列。
15.通过电穿孔转化谷氨酸棒杆菌
使用Van der Rest等(Appl Microbiol Biotechnol 52,541-545,1999)所述经修改的电穿孔方法将基于pVWEx1的质粒载体移至谷氨酸棒杆菌的细胞中。
为了产生感受态谷氨酸棒杆菌细胞，通过预培养及随后的主培养物将菌株在BHIS培养基(37g/l BHI，91g/l山梨糖醇(Sigma Aldrich，St.Louis，USA))中增殖。预培养物由包含于具有3个挡板的100ml Erlenmeyer培养瓶中10ml BHIS培养基组成。将其用100μl甘油原种培养物接种，并在33℃和200rpm条件下温育过夜约18小时。主培养物由包含于具有4个挡板的1升Erlenmeyer培养瓶中250ml BHIS培养基组成。将其用5ml预培养物接种，并在33℃和150rpm条件下温育4小时至OD 600为大约1.8。
使用无菌、冰的缓冲液或溶液在冰上进行以下工作步骤。将主培养物在4℃和4000rpm离心20分钟。弃去上清，将细胞沉淀重悬于2ml TG缓冲液(1mM三(羟甲基)-氨基甲烷、10％甘油，用HCl调节至pH7.5)中，并将另外20ml TG缓冲液加入细胞悬浮液中。这个洗涤步骤重复两次。所述洗涤步骤之后是两个进一步的洗涤步骤，其中TG缓冲液用10％(v/v)甘油溶液代替。在最后的离心步骤后，向细胞沉淀中加入2ml 10％(v/v)甘油。然后将获得的细胞悬浮液等分成100μl部分及在-80℃贮存。
如Van der Rest等所述进行谷氨酸棒杆菌菌株的电穿孔。与所述方法不同的是培养温度为33℃，琼脂平板培养基为BHI琼脂。在补加25mg/l卡那霉素的BHI琼脂平板上选择转化株。
16.大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株的甘油原种
为了长时间贮存大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌菌株，制备甘油原种。将选择的大肠杆菌克隆在补加2g/l葡萄糖的10ml LB培养基中培养。将选择的谷氨酸棒杆菌克隆在补加2g/l葡萄糖的2倍浓缩BHI培养基中培养。为含有质粒的大肠杆菌菌株培养物补加50mg/l卡那霉素。为含有质粒的谷氨酸棒杆菌菌株的培养物补加25mg/l卡那霉素。将培养基置于具有3个挡板的100ml Erlenmeyer培养瓶中。为其接种一圈取自菌落的细胞。然后在大肠杆菌的情况中将培养物在37℃和200rpm温育大约18小时，在谷氨酸棒杆菌的情况中将培养物在33℃和200rpm温育大约18小时。在所述温育期之后，向培养物中加入1.2ml的85％(v/v)无菌甘油。然后将获得的含甘油的细胞悬浮液等分成2ml，在-80℃贮存。
17.根据Wouter Duetz的培养系统
根据W.A.Duetz(Trends Microbiol.2007；15(10)：469-75)的毫升级培养系统用于研究构建的谷氨酸棒杆菌菌株的性能。为此目的，使用来自EnzyScreen BV(Heemstede，Netherlands；Cat.no.CR1424)的24深孔微平板(24孔WDS平板)，每个深孔填充2.5ml培养基。
菌株的预培养在10ml双倍浓缩的BHI培养基中进行。将培养基置于具有3个挡板的100ml Erlenmeyer培养瓶中。用100μl甘油原种培养物接种，并将培养物在33℃和200rpm条件下温育24小时。
在所述温育期之后，确定所述预培养物的光密度OD600。
通过用等份预培养物接种24孔WDS-平板的含有2.5ml培养基的孔而获得主培养物，光密度OD600为0.1。
作为主培养物的培养基，使用Keilhauer等(J.Bacteriol.1993Sep；175(17):5595–5603)描述的CGXII培养基。为方便起见，CGXII培养基的成分示于表13。
表13：Keilhauer’s CGXII培养基的组成
| 成分 | 浓度(g/l) |
| MOPS(3-(N-吗啉)丙磺酸) | 42 |
| (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> | 20 |
| 尿素 | 5 |
| KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> | 1 |
| K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> | 1 |
| MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.25 |
| CaCl<sub>2</sub> | 0.01 |
| FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.01 |
| MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O | 0.01 |
| ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.001 |
| CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 0.0002 |
| NiCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 0.00002 |
| 生物素(过滤灭菌) | 0.0002 |
| 原儿茶酸(过滤灭菌) | 0.03 |
| 碳源(过滤灭菌) | 20 |
| 用NaOH调节pH为7 |
将这些主培养物在33℃和300rpm条件下在来自Infors GmbH(Bottmingen，Switzerland)的Infors HT Multitron标准温育摇床温育大约45小时，直至葡萄糖完全消耗。
用来自LifeScan(Johnson&Johnson Medical GmbH，Neuss，Germany)的血糖仪OneTouch分析悬浮液中的葡萄糖浓度。
培养后，将培养悬浮液移至深孔微平板中。将部分培养悬浮液适当稀释以测量OD600。将另一部分培养物离心，分析上清中L-氨基酸如L-赖氨酸或L-缬氨酸和剩余葡萄糖的浓度。
18.氨基酸分析仪
使用来自SYKAM Vertriebs GmbH(Fürstenfeldbruck，Germany)的SYKAM S433氨基酸分析仪，通过离子交换层析确定培养上清液中L-氨基酸、特别是L-赖氨酸的浓度。作为固相，使用来自SYKAM的具有球形的基于聚苯乙烯的阳离子交换子(exchanger)的柱(PeekLCA N04/Na，规格为150×4.6mm)。取决于L-氨基酸，使用缓冲液A和B的混合物洗脱或者使用所述缓冲液通过梯度洗脱进行分离。作为缓冲液A，使用20l中含有263g柠檬酸三钠、120g柠檬酸、1100ml甲醇、100ml 37％HCl和2ml辛酸的水性溶液(最终pH3.5)。作为缓冲液B，使用20l中含有392g柠檬酸三钠、100g硼酸和2ml辛酸的水性溶液(最终pH10.2)。通过柱后衍生化用茚三酮将游离氨基酸着色，并在570nm用光度法检测。
19.使用连续流动系统(CFS)确定葡萄糖
使用来自SKALAR analytic GmbH(Erkelenz，Germany)的SANplus多通道连续流动分析仪确定上清中的葡萄糖浓度。通过NADH形成用偶联酶测定法(己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶)检测葡萄糖。
20.最小抑制浓度测试(MIC-测试)
使用连续稀释测定法测定液体培养物中林可霉素对于不同菌株的最小抑制浓度(MIC)，稀释梯度为1:2，浓度范围为250μg/ml、125μg/ml等，直至降至0.12μg/ml。
为此目的，在微滴定平板的第一个孔中填充补加0.3mM IPTG和250μg/ml盐酸林可霉素的360μl BHI培养基。取出180μl体积并置于预先填充了补加0.3mM IPTG的180μl BHI培养基的第二个孔中。由此制备含有补加0.3mM IPTG和125μg/ml盐酸林可霉素的BHI培养基的第二个孔。从所述第二孔中取出180μl并置于预先填充了补加0.3mM IPTG的180μl BHI培养基的第三个孔中。将这些稀释步骤重复几次以覆盖上述浓度范围。由此获得含有180μl各个测试培养基的孔。在测试程序中包括不含盐酸林可霉素的对照培养基。
在含有质粒的菌株的情况中，在补加250μg/ml卡那霉素的BHI培养基(如培养段落中描述)中产生待测菌株的预培养物。将预培养物离心，并将细胞沉淀重悬于0.9％(w/v)NaCl溶液中，获得1.0的OD660。使用20μl体积的悬浮液接种孔中含有的测试培养基。将微滴定平板在来自Infors GmbH(Bottmingen，Switzerland)的Infors HT Multitron标准温育摇床中在300rpm和33℃条件下温育。20小时后，测量光密度。具有阻止培养物生长的最低浓度的盐酸林可霉素的测试培养基给出MIC。
B)实验结果
实施例1：菌株DM1933、DM1797和DM1547的lmrB基因的序列
菌株DM1933是由Blombach等(Applied and Environmental Microbiology 75(2),419-427,2009)描述的L-赖氨酸生产菌株。其根据布达佩斯条约保藏在DSMZ，保藏号为DSM25442。
菌株DM1933以及DM1797和DM1547的染色体核苷酸序列通过Illumina全基因组测序技术(Illumina Inc.,San Diego,CA,US)确定。见例如Benjak et al.(2015)Whole-Genome Sequencing for Comparative Genomics and De Novo Genome Assembly.In:Parish T.,Roberts D.(eds)Mycobacteria Protocols.Methods in Molecular Biology,Vol 1285.Humana Press,NY,US)and Bennet,S.(Pharmacogenomics 5(4),433-438,2004)。
发现DM1933的lmrB编码序列的核苷酸序列、包括其上游和下游核苷酸序列，与SEQID NO:7所示的ATCC13032的序列相同。
如在US 7,338,790B2(见30列)中描述，菌株DM1797是L-赖氨酸生产菌株。根据布达佩斯条约，其于2004年10月28日保藏在DSMZ，保藏号为DSM16833。DM1797是在N’-甲基-N-硝基-亚硝基胍诱变后获得的菌株ATCC13032的氨乙基半胱氨酸(aminoethylcystein)抗性突变体。DM1797与ATCC13032的区别仅在于DM1797染色体中天冬氨酸激酶基因是编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽的变体。所述具有反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽具有序列表中SEQ ID NO:15所示氨基酸序列，其中在氨基酸序列位置311的L-苏氨酸(Thr)由L-异亮氨酸(Ile)替换。在US 7,338,790中，缩写“lysC T311I”是指这种替换。
DM1797的lmrB编码序列的核苷酸序列、包括其上游和下游核苷酸序列，与SEQ IDNO:7所示的ATCC13032的序列相同。
如EP 1 239 040A2描述，菌株DM1547是L-赖氨酸生产菌株。根据布达佩斯条约，其保藏在DSMZ，保藏号为DSM13944。DM1547是在几次诱变和筛选循环后获得的菌株ATCC13032的氨乙基半胱氨酸抗性突变体。
除了在位置1311的核碱基是胸腺嘧啶，DM1547的lmrB编码序列的核苷酸序列、包括其上游和下游核苷酸序列，与SEQ ID NO:7所示的ATCC13032序列相同。
菌株DM1933还含有所述天冬氨酸激酶基因的变体。根据Blombach等所述将其缩写为“lysC(T311I)”(见Blombach et al.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Jan.2009,p.419–427中的表1)。
实施例2：构建质粒pK18mobsacB_DlmrB
构建质粒pK18mobsacB_Dcmr以使得可以掺入包括lmrB编码序列和相邻终止密码子的缺失，伴随将限制性核酸内切酶EcoRV的识别位点插入希望的谷氨酸棒杆菌菌株的染色体中。所述质粒基于等(Gene 145,69-73,1994)描述的移动载体pK18mobsacB。为了构建pK18mobsacB_Dcmr，使用Gibson组装方法。
为此，分别产生三个多核苷酸或者DNA分子：一个多核苷酸称作lmrB_up，包含上游序列(5’-侧翼序列)；另一个多核苷酸称作lmrB_down，包含lmrB编码序列的下游序列(3’-侧翼序列)。第三个多核苷酸是通过用限制性核酸内切酶XbaI处理成为线性的质粒pK18mobsacB。多核苷酸lmrB_up和lmrB_down在Gibson组装期间融合产生包含于pK18mobsacB_DlmrB中的多核苷酸DlmrB，其包含SEQ ID NO:13所示核苷酸序列。
多核苷酸lmrB_up和lmrB_down是使用分离自谷氨酸棒杆菌ATCC13032培养物的总DNA作为模板，通过PCR合成的。为了进行PCR，使用Phusion试剂盒及延伸步骤为15秒(见表9，步骤4)。为了扩增下游序列(多核苷酸lmrB_down)，使用引物1f-DlmrB和1r-DlmrB，为了扩增上游序列(多核苷酸lmrB_up)，使用引物2f-DlmrB和2r-DlmrB(表14)。所述引物在本说明书序列表中也以SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:20示出。
表14：使用的引物及在Phusion-Kit PCR期间扩增物的大小列表
扩增物lmrB_up的核苷酸序列如SEQ ID NO:21示出。扩增物lmrB_down的核苷酸序列如SEQ ID NO:22示出。
扩增物lmrB_up含有ATCC13032的lmrB编码序列上游区的788个核苷酸的序列。在其5’末端，配备有与用XbaI切割的pK18mobsacB序列重叠的序列。在其3’末端，配备有与扩增物lmrB_down序列重叠的序列。所述在3’末端的序列含有限制性核酸内切酶EcoRV的识别位点。
扩增物lmrB_down含有ATCC13032的lmrB编码序列下游区的791个核苷酸的序列。在其5’末端，配备有与扩增物lmrB_up序列重叠的序列。所述在5’末端的序列含有限制性核酸内切酶EcoRV的识别位点。在其3’末端配备有与用XbaI切割的pK18mobsacB序列重叠的序列。所述重叠序列是为Gibson组装技术所要求的。
质粒pK18mobsacB用限制性核酸内切酶XbaI线性化。消化混合物通过毛细管电泳控制，纯化并量化DNA浓度。
为了组装质粒pK18mobsacB_DlmrB，使用Gibson组装试剂盒混合三个多核苷酸，即用XbaI切割的载体pK18mobsacB、扩增物lmrB_up和扩增物lmrB_down。由此获得的组装混合物用于转化化学感受态大肠杆菌StellarTM细胞。
根据表10示出的方案，使用Taq试剂盒及引物pCV22_1.p和pCV22_2.p进行菌落PCR，分析50个卡那霉素抗性转化株。所述引物在表15中示出，且以序列表中SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24示出。扩增物的大小由毛细管电泳控制。
表15：用于菌落PCR的引物及在Taq Kit PCR期间扩增物的大小列表
由此鉴定的含有希望大小的质粒的转化株之一称作Stellar/pK18mobsacB_DlmrB，保存作为甘油原种。
从所述转化株分离质粒pK18mobsacB_DlmrB的DNA，在Gibson组装期间在pK18mobsacB内产生的多核苷酸DlmrB用表16示出的引物pVW_1.p和M13For通过Sanger测序进行分析。所述引物在序列表中也以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26示出。
表16：用于Sanger测序的引物列表
由此获得的核苷酸序列分析示出包含于pK18mobsacB_DlmrB中的多核苷酸DlmrB具有SEQ ID NO:13所示核苷酸序列。
实施例3：构建菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV
使用质粒pK18mobsacB_DlmrB掺入包括全部lmrB编码序列及邻近终止密码子的缺失，伴随将限制酶EcoRV的识别位点插入L-赖氨酸生产菌株DM1933的染色体中。
适当时，将所述包括全部lmrB编码序列及邻近终止密码子的缺失及伴随插入限制酶EcoRV的识别位点缩写为ΔlmrB::Eco或者deltalmrB::EcoRV。
用在实施例2中获得的质粒DNA转化化学感受态大肠杆菌菌株S17-1细胞。在材料和方法章节描述的 et al.(Journal of Bacteriology 172,1663–1666,1990)的经修改的接合方法用于接合转移进菌株DM1933中，及用于通过其蔗糖抗性和卡那霉素敏感性表型选择转化结合克隆。
使用表17中列出的引物NCgl2591_fw和NCgl2591_rev，通过菌落PCR分析转化接合克隆，随后通过毛细管电泳确定扩增物的大小。所述引物在序列表中也以SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28示出。为了进行PCR，使用Sapphire Mix(见表11)。
表17：用于菌落PCR的引物及Sapphire Mix PCR期间扩增物的大小列表
由此鉴定的转化接合克隆之一被称作DM1933_ΔlmrB::EcoRV。制备所述转化接合克隆的甘油原种培养物，并用作进一步研究的起始材料。
通过Sanger测序分析含有突变的核苷酸序列即缺少(缺失)lmrB编码序列和邻近终止密码子及伴随插入限制性核酸内切酶EcoRV的识别位点的菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV的染色体区域的核苷酸序列。
为此，产生跨越突变位点的PCR扩增物。使用引物NCgl2591_fwd1和NCgl2593_rev1(见表18)和Phusion试剂盒(见表9)及延伸时间为45秒(见表9步骤4)进行菌落PCR。然后使用引物NCgl2591_fwd2和NCgl2593_rev2(见表18)对获得的扩增物测序。在此使用的引物的核苷酸序列也示于SEQ ID NO:29-32。
表18：用于菌落PCR和Sanger测序的引物列表
获得的核苷酸序列以SEQ ID NO:33示出。其含有在表2、3、4、5和6中标示的核苷酸序列。
结果示出菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV在其染色体中含有希望的突变或者希望的突变的核苷酸序列。因此，菌株DM1933的lmrB基因由ΔlmrB::EcoRV突变替换。
实施例4：通过菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV产生L-赖氨酸
使用Wouter Duetz系统，通过分批培养分析菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV和DM1933(参考菌株)从葡萄糖产生L-赖氨酸的能力。
使用含有20g/l葡萄糖作为碳源的培养基CGXII。将培养物温育45小时，直至通过使用血糖分析仪进行葡萄糖分析证实葡萄糖被完全消耗，确定L-赖氨酸的浓度和光密度OD660。实验结果示于表19。
表19：通过菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV产生L-赖氨酸
| 菌株 | L-赖氨酸<sup>1</sup>(g/l) | OD660 |
| DM1933 | 5.1 | 5.3 |
| DM1933_ΔlmrB::EcoRV | 5.9 | 4.0 |
1L-赖氨酸x HCl
DM1933在其染色体中含有编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽的天冬氨酸激酶基因的变体。DM1933_ΔlmrB::EcoRV在其染色体中也含有编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽的天冬氨酸激酶基因的变体，及其lmrB基因由ΔlmrB::EcoRV突变替换。
实验示出与参考菌株DM1933相比，在菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV中L-赖氨酸的形成更高。
实施例5：构建菌株ATCC13032_ΔlmrB::EcoRV和DM1797_ΔlmrB::EcoRV
所述菌株如实施例3所述构建和分析。
实施例6：用菌株ATCC13032_ΔlmrB::EcoRV和DM1797_ΔlmrB::EcoRV产生L-赖氨酸
如实施例4所述进行生产检测。结果示于表20。
表20:用菌株ATCC13032_ΔlmrB::EcoRV和DM1797_ΔlmrB::EcoRV生产L-赖氨酸
1L-赖氨酸x HCl
2不可检测
菌株ATCC13032(也可作为DSM20300获得)是谷氨酸棒杆菌种的野生型菌株类别。
菌株ATCC13032_ΔlmrB::EcoRV与ATCC13032的区别只在于其lmrB基因由ΔlmrB::EcoRV突变替换。
DM1797与ATCC13032的区别只在于DM1797染色体中天冬氨酸激酶基因(lysC)是编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽的变体(lysC T311I)。
DM1797_ΔlmrB::EcoRV在其染色体中也含有编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶多肽的天冬氨酸激酶基因的变体(lysC T311I)，其lmrB基因由ΔlmrB::EcoRV突变替换。
实验示出与参考菌株DM1797相比，在菌株DM1797_ΔlmrB::EcoRV中形成的L-赖氨酸更高。
实施例7：构建质粒pVWEx1_lmrBATCC14067
通过如Peters-Wendisch等(Journal of Molecular Microbiology andBiotechnology 3,295–300,2001)所述，将编码如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:12所示的菌株ATCC14067的LmrB多肽(LmrBATCC14067)的称作lmrBATCC14067的多核苷酸克隆进穿梭载体pVWEx1中。VWEx1的核苷酸序列在GenBank数据库可以登录号MF034723获得。质粒pVWEx1的图谱在图1中示出。
使用菌株ATCC14067的总DNA作为模板及使用表21示出的引物1f-lmrB和1r-lmrB，通过PCR产生lmrBATCC14067的DNA分子。这两个引物在序列表中也以SEQ ID NO:34和SEQ IDNO:35示出。为了进行扩增，使用Phusion试剂盒(表9)及延伸步骤为45秒(见表9的步骤4)。
表21：用于Phusion试剂盒PCR的引物列表
通过毛细管电泳分析扩增物的大小。将质粒pVWEx1用限制性核酸内切酶XbaI处理。通过毛细管电泳控制消化混合物，纯化并量化DNA浓度。
为了组装质粒pVWEx1_lmrBATCC14067，使用Gibson组装试剂盒将两个DNA分子即用XbaI切割的lmrBATCC14067和pVWEx1混合。由此获得的组装混合物用于转化化学感受态大肠杆菌StellarTM细胞。
使用Taq试剂盒(见表10)和表22示出的引物pVW_1.p和pVW_2.p，通过菌落PCR分析转化株。所述引物也以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:36示出。
表22：用于菌落PCR和Sanger测序的引物列表
由此鉴定的含有质粒pVWEx1_lmrBATCC14067的转化株之一被称作Stellar/pVWEx1_lmrBATCC14067，保存作为甘油原种。
分离获得的质粒pVWEx1_lmrBATCC14067的DNA，并用于进一步研究。pVWEx1_lmrBATCC14067的图谱在图2中示出。
插入pVWEx1内的lmrBATCC14067的核苷酸序列使用引物pVW_1.p和pVW_2.p(表22)通过Sanger测序分析，发现其含有希望的核苷酸序列。
实施例8：构建菌株ATCC13032/pVWEx1、ATCC13032/pVWEx1_lmrBATCC14067、DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1和DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1_lmrBATCC14067
作为评估构建的质粒pVWEx1_lmrBATCC14067赋予谷氨酸棒杆菌种林可霉素抗性的能力的宿主，选择菌株ATCC13032和DM1933_ΔlmrB::EcoRV。
将菌株ATCC13032和DM1933_ΔlmrB::EcoRV(见实施例3)用分离的pVWEx1和pVWEx1_lmrBATCC14067质粒DNA通过电穿孔转化。如材料与方法章节所述及在存在卡那霉素条件下进行转化株的选择、转化株的增殖和甘油原种培养物的制备。
使用引物pVW_1.p和pVW_2.p(表22)通过菌落PCR(Sapphire Mix)分析转化株中的希望的核苷酸序列的存在(pVWEx1_lmrBATCC14067)或不存在(pVWEx1)。
因此获得菌株ATCC13032/pVWEx1、ATCC13032/pVWEx1_lmrBATCC14067、DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1和DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1_lmrBATCC14067。
实施例9：林可霉素对于过表达菌株ATCC14067的lmrB基因的不同谷氨酸棒杆菌的MIC
如材料和方法章节所述确定林可霉素对于在实施例8中构建的菌株ATCC13032/pVWEx1、ATCC13032/pVWEx1_lmrBATCC14067、DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1和DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1_lmrBATCC14067的MIC。
实验结果示于表23。结果表明编码SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:12所示多肽的菌株ATCC14067的lmrB基因(lmrBATCC14067)赋予谷氨酸棒杆菌宿主增加的林可霉素抗性。
表23：确定林可霉素1对于不同谷氨酸棒杆菌菌株的MIC
| 菌株 | MIC(μg/ml) |
| ATCC13032/pVWEx1 | 15.6 |
| ATCC13032/pVWEx1lmrB<sup>ATCC14067</sup> | 125 |
| DM1933ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1 | 7.8 |
| DM1933ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1lmrB<sup>ATCC14067</sup> | 62.5 |
1盐酸林可霉素
结果表明菌株ATCC14067的LmrB多肽(LmrBATCC14067)具有赋予谷氨酸棒杆菌林可霉素抗性的活性。
实施例10：构建质粒pVWEx1_lmrBDM1547
将编码菌株DM1547的LmrB多肽的称作lmrBDM1547的多核苷酸克隆进穿梭载体pVWEx1中。
使用菌株DM1547的总DNA作为模板及使用表24示出的引物1f-lmrB和pVT_rev，通过PCR产生DNA分子lmrBDM1547。这两个引物在序列表中也以SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:37示出。为了进行扩增，使用Phusion试剂盒(表9)及延伸步骤进行45秒(见表9的步骤4)。
表24：Phusion试剂盒PCR的引物列表
所有其它技术规程包括PCR扩增及用XbaI处理pVWEx1、克隆程序以及转化株分析均基本如实施例7所述进行。
含有质粒pVWEx1_lmrBDM1547的转化株之一称作Stellar/pVWEx1_lmrBDM1547并保存为甘油原种。
分离获得的质粒pVWEx1_lmrB DM1547的DNA，并用于进一步研究。
插入pVWEx1内的lmrBDM1547的核苷酸序列通过使用引物pVW_1.p和pVW_2.p(见表22)进行Sanger测序分析，发现其含有希望的核苷酸序列。
实施例11：菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1_lmrBDM1547的构建
作为评估构建的质粒pVWEx1_lmrBDM1547赋予谷氨酸棒杆菌种林可霉素抗性的能力的宿主，选择菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV。
包括转化株鉴定的技术规程与实施例8所述基本相同。
这个实验的结果是获得了菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1_lmrBDM1547。
实施例12：林可霉素对于过表达菌株DM1547的lmrB基因的菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1_lmrBDM1547的MIC
林可霉素对于在实施例8和11中构建的菌株DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1和DM1933_ΔlmrB::EcoRV/pVWEx1_lmrBDM1547的MIC如在材料和方法章节中所述进行确定。
实验结果示于表25中。结果表明编码SEQ ID NO:8所示多肽(其中位置104含有缬氨酸)的菌株DM1547的lmrB基因(lmrBDM1547)赋予谷氨酸棒杆菌宿主增加的林可霉素抗性。
表25:确定林可霉素1对于不同谷氨酸棒杆菌菌株的MIC
| 菌株 | MIC(μg/ml) |
| DM1933_DlmrB/pVWEx1 | 7.8 |
| DM1933_DlmrB/pVWEx1_lmrB<sup>DM1547</sup> | 62.5 |
1盐酸林可霉素
结果示出菌株DM1547的LmrB多肽(LmrBDM1547)具有赋予谷氨酸棒杆菌林可霉素抗性的活性。
附图简述
图1是质粒pVWEx1(实施例7)的图谱。
图2是质粒pVWEx1_lmrBATCC14067(实施例)的图谱。
图中缩写列表：
lacI：编码LacI阻抑物的基因
lmrBATCC14067：编码菌株ATCC14067的LmrB多肽的基因
MCS：多克隆位点
neo：编码氨基糖苷3'-磷酸转移酶的基因
ori p15A：大肠杆菌质粒p15A的复制起点
ori pCG1：谷氨酸棒杆菌质粒pCG1的复制起点
PtacI：启动子PtacI的序列(De Boer et al.,Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 80,21–25,1983)
XbaI：由限制性核酸内切酶XbaI识别的序列。
序列表
<110> 赢创德固赛有限公司
<120> 发酵生产L-氨基酸的方法
<130> 文件号: 2017E00286
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 481
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum AS019E12
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(481)
<223> amino acid sequence disclosed in GenBank accession number
AF237667
<400> 1
Met Asp Ser Gln Ile Asn Thr Gln Thr Ser Pro Ala Ala Ala Lys Leu
1 5 10 15
Pro Arg Glu Val Val Val Val Leu Ser Ile Leu Val Val Ser Ala Met
20 25 30
Ile Met Ile Leu Asn Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile
35 40 45
Met Glu Asp Phe Ser Val Pro Glu Thr Thr Ala Gln Trp Leu Thr Thr
50 55 60
Gly Phe Met Leu Thr Met Ala Val Val Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Arg Phe Ser Thr Lys Thr Ile Phe Val Thr Ala Leu Leu Phe
85 90 95
Phe Thr Val Gly Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ala Pro Thr Phe Ala Val
100 105 110
Leu Leu Gly Ala Arg Ile Val Gln Ala Val Gly Thr Ala Leu Val Met
115 120 125
Pro Leu Leu Met Thr Val Thr Leu Thr Val Val Pro Ala Glu Arg Arg
130 135 140
Gly Ser Met Met Gly Ile Ile Ser Ile Val Ile Ser Val Ala Pro Ala
145 150 155 160
Leu Gly Pro Thr Leu Ser Gly Val Ile Leu Asn Ser Leu Thr Trp His
165 170 175
Trp Leu Phe Trp Met Met Leu Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Val Ile
180 185 190
Gly Phe Phe Leu Ile Lys Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu
195 200 205
Asp Val Leu Ser Val Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val
210 215 220
Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val
225 230 235 240
Gly Ile Phe Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala
245 250 255
Leu Arg Gln His Gln Leu Gly Lys Gln Asp Lys Ala Leu Met Asp Leu
260 265 270
Arg Ala Phe Lys Val Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu
275 280 285
Leu Ala Phe Gly Ala Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr
290 295 300
Leu Gln Thr Ser Leu Gly Val Thr Ala Leu Val Thr Gly Leu Val Val
305 310 315 320
Met Pro Gly Gly Leu Leu Gln Gly Leu Ile Ser Pro Phe Ile Gly Arg
325 330 335
Phe Tyr Asp Lys Val Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile
340 345 350
Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ser Ser Met Thr Phe Leu Asn Glu Asn Ser
355 360 365
Pro Val Trp Met Val Val Val Met His Val Val Phe Ser Ile Gly Met
370 375 380
Cys Leu Met Met Thr Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro
385 390 395 400
Lys His Leu Tyr Gly His Gly Ser Ala Ile Leu Asn Thr Phe Gln Gln
405 410 415
Leu Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Leu Ser Phe
420 425 430
Gly Thr Ser Ile Ala Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val
435 440 445
Ala Ala Gly Thr Lys Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val
450 455 460
Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Phe Val Thr Arg Val Glu Glu Glu Ala
465 470 475 480
His
<210> 2
<211> 481
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(481)
<223> amino acid sequence disclosed in GenBank accession number
BAC00079
<400> 2
Met Asp Ser Gln Ile Asn Thr Gln Thr Ser Pro Ala Ala Ala Lys Leu
1 5 10 15
Pro Arg Glu Val Val Val Val Leu Ser Ile Leu Val Val Ser Ala Met
20 25 30
Ile Met Ile Leu Asn Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile
35 40 45
Met Glu Asp Phe Ser Val Pro Glu Thr Thr Ala Gln Trp Leu Thr Thr
50 55 60
Gly Phe Met Leu Thr Met Ala Val Val Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Arg Phe Ser Thr Lys Thr Ile Phe Val Thr Ala Leu Leu Phe
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165 170 175
Trp Leu Phe Trp Met Met Leu Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Val Ile
180 185 190
Gly Phe Phe Leu Ile Lys Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu
195 200 205
Asp Val Leu Ser Val Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val
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Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val
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Gly Ile Phe Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala
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Leu Arg Gln His Gln Leu Gly Lys Gln Asp Lys Ala Leu Met Asp Leu
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Arg Ala Phe Lys Val Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu
275 280 285
Leu Ala Phe Gly Ala Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr
290 295 300
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Phe Tyr Asp Lys Val Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile
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355 360 365
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Cys Leu Met Met Thr Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro
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Ala Ala Gly Thr Lys Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val
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Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Phe Val Thr Arg Val Glu Glu Glu Ala
465 470 475 480
His
<210> 3
<211> 481
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum AJ1511
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(481)
<223> amino acid sequence disclosed in GenBank accession number
BAV24312
<400> 3
Met Asp Ser Gln Ile Asn Thr Gln Thr Ser Pro Ala Ala Ala Lys Leu
1 5 10 15
Pro Arg Glu Val Val Val Val Leu Ser Ile Leu Val Val Ser Ala Met
20 25 30
Ile Met Ile Leu Asn Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile
35 40 45
Met Glu Asp Phe Ser Val Pro Glu Thr Thr Ala Gln Trp Leu Thr Thr
50 55 60
Gly Phe Met Leu Thr Met Ala Val Val Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
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Trp Leu Phe Trp Met Met Leu Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Val Ile
180 185 190
Gly Tyr Phe Leu Ile Gln Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu
195 200 205
Asp Val Leu Ser Val Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val
210 215 220
Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala
245 250 255
Leu Arg Gln His Gln Leu Gly Lys Gln Asp Lys Ala Leu Met Asp Leu
260 265 270
Arg Ala Phe Lys Val Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu
275 280 285
Leu Ala Phe Gly Ala Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr
290 295 300
Leu Gln Thr Ser Leu Gly Val Thr Ala Leu Val Thr Gly Leu Val Val
305 310 315 320
Met Pro Gly Gly Leu Leu Gln Gly Leu Ile Ser Pro Phe Ile Gly Arg
325 330 335
Phe Tyr Asp Lys Val Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile
340 345 350
Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ser Ser Met Thr Phe Leu Asn Glu Asn Ser
355 360 365
Pro Val Trp Met Val Val Val Met His Val Val Phe Ser Ile Gly Met
370 375 380
Cys Leu Met Met Thr Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro
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Lys His Leu Tyr Gly His Gly Ser Ala Ile Leu Asn Thr Phe Gln Gln
405 410 415
Leu Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Leu Ser Phe
420 425 430
Gly Thr Ser Ile Ala Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val
435 440 445
Ala Ala Gly Thr Lys Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val
450 455 460
Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Phe Val Thr Arg Val Glu Glu Glu Thr
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His
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<211> 481
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> amino acid sequence disclosed in GenBank accession number
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Ile Met Ile Leu Asn Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile
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Leu Asp Arg Phe Ser Thr Lys Thr Ile Phe Val Thr Ala Leu Leu Phe
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Leu Gly Pro Thr Leu Ser Gly Val Ile Leu Asn Ser Leu Thr Trp His
165 170 175
Trp Leu Phe Trp Met Met Leu Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Val Ile
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Asp Val Leu Ser Val Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val
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Gly Ile Leu Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala
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Gly Thr Ser Ile Ala Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val
435 440 445
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His
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Gly Ile Val Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Val Ile Phe Ala
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Arg Ala Phe Lys Val Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu
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His
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<213> Corynebacterium glutamicum ATCC14067
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(481)
<223> amino acid sequence disclosed in GenBank accession number
KEI24239
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Met Asp Ser Gln Ile Asn Thr Gln Thr Ser Pro Ala Ala Ala Lys Leu
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Pro Arg Glu Val Val Val Val Leu Ser Ile Leu Val Ile Ser Ala Met
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Leu Gly Pro Thr Leu Ser Gly Val Ile Leu Asn Ser Leu Thr Trp His
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Trp Leu Phe Trp Met Met Leu Pro Ile Val Ala Val Ala Leu Val Ile
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Gly Phe Phe Leu Ile Lys Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu
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Asp Val Leu Ser Val Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val
210 215 220
Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala
245 250 255
Leu Arg Gln His Gln Leu Gly Lys Gln Asp Lys Ala Leu Met Asp Leu
260 265 270
Arg Ala Phe Lys Val Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu
275 280 285
Leu Ala Phe Gly Ala Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr
290 295 300
Leu Gln Thr Ser Leu Gly Val Thr Ala Leu Val Thr Gly Leu Val Val
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Met Pro Gly Gly Leu Leu Gln Gly Leu Ile Ser Pro Phe Ile Gly Arg
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Phe Tyr Asp Lys Val Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile
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Pro Val Trp Met Val Val Val Met His Val Val Phe Ser Ile Gly Met
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Cys Leu Met Met Thr Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro
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Leu Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Leu Ser Phe
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Gly Thr Ser Ile Ala Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val
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Ala Ala Gly Thr Lys Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val
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GenBank accession number NC_003450
<220>
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<223> nucleotide sequence upstream of cds
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<223> nucleobase cytosine
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<223> stop codon
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<223> nucleotide sequence downstream of cds
<220>
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<223> nucleobase adenine
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<221> misc_feature
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<223> nucleobase thymine
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caaatgatta aactcactca tgaagtcgca atcaatgctg aaaagtaccg aagccttcct 60
gcatgggata aagcagccgc ccgagctttt gcagtgggta tgactgtgga caaagcagtg 120
gtagcggggc agtctgcggc gaggttatgg ggataccaaa ctttgactgt tgagaaaacc 180
gtgttgtgtc tgttgccgga aaggctacgt tcaaaatcct ccaagcattg gccgtccggg 240
atgcgatata aagatcgtta cctctcgtcg cgtgatattc gagaggttca tgggatccga 300
gttacgggag cgttccgcac atttttggac atcgctttgg atgatggggt ggtggcggct 360
gtggtcacta ttgattcagc tcgaagacag aatccatcgc ttacgcgtga gaagttaatg 420
cacagtgcgg aaagtttccc gaggcatcgg ggtgtgaagg cgtatcggca ggcgattgag 480
ttgtcgattc ccaattcgga tagtgctcag gagacgaggg ctcggttaat ccttcgggag 540
gccaagctcc cggaaatcca gtcagtgaag gtgcaggccc gtttcgatca atcgcacaac 600
aagtatttcc tcgtcgattt cttgatcaat gagtggatca tcgtggagat tgatggacgt 660
tcgaaatatg attccccgga gctcaatgag gtgctcatgg ctgaacgcga tcgggagaaa 720
ttcttcctca atcagggcta tgcggtctta agaatcgatc cgaaacagtt agacctcaac 780
caagatgggg agtgtgagtt catcggaatc ctcaaaaaca ctttgcagaa gaccccacct 840
gagcacctca agcaagccgc ctaaacactc caagaaccac catttgcaca atgcacttgc 900
ttgtggcact ctttagtagt tttttctcat agctcagttt cgcaacttta gagaactcta 960
gaaactgagc ttcatgctgt gaaaggcctt ttctccattc atg gat tcc caa att 1015
Met Asp Ser Gln Ile
1 5
aat act cag acc tct ccg gca gct gcg aag ctg cct agg gag gtc gtt 1063
Asn Thr Gln Thr Ser Pro Ala Ala Ala Lys Leu Pro Arg Glu Val Val
10 15 20
gtt gtt ctt tcg atc ctc gtg gtt tcc gcg atg atc atg att ctt aat 1111
Val Val Leu Ser Ile Leu Val Val Ser Ala Met Ile Met Ile Leu Asn
25 30 35
gaa acc att ctg tcg gtt gcg ttg cct tcc atc atg gaa gat ttc tcc 1159
Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile Met Glu Asp Phe Ser
40 45 50
gtg cct gaa act act gca cag tgg ttg acc act ggc ttt atg ttg acg 1207
Val Pro Glu Thr Thr Ala Gln Trp Leu Thr Thr Gly Phe Met Leu Thr
55 60 65
atg gca gtg gtg att cca act act ggt tat ctg ctt gat cgt ttt tcc 1255
Met Ala Val Val Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Leu Leu Asp Arg Phe Ser
70 75 80 85
act aag acg atc ttt gtt act gcg ttg ttg ttc ttt acg gtt ggt acg 1303
Thr Lys Thr Ile Phe Val Thr Ala Leu Leu Phe Phe Thr Val Gly Thr
90 95 100
ttg act gcg gcg ttg gct cca acg ttt gcg gtg ctg ctt ggt gct cgt 1351
Leu Thr Ala Ala Leu Ala Pro Thr Phe Ala Val Leu Leu Gly Ala Arg
105 110 115
atc gtt cag gcg gtt ggt act gcg ctg gtg atg cct ttg ctg atg acg 1399
Ile Val Gln Ala Val Gly Thr Ala Leu Val Met Pro Leu Leu Met Thr
120 125 130
gtt acg ttg acg gtg gtt cct gcg gag cgt cgt ggt tcg atg atg ggc 1447
Val Thr Leu Thr Val Val Pro Ala Glu Arg Arg Gly Ser Met Met Gly
135 140 145
att att tcc atc gtg att tct gtt gcg ccg gcg ctt ggt cct acg ttg 1495
Ile Ile Ser Ile Val Ile Ser Val Ala Pro Ala Leu Gly Pro Thr Leu
150 155 160 165
tct ggt gtc att ctt aac tct ttg acc tgg cac tgg ttg ttt tgg atg 1543
Ser Gly Val Ile Leu Asn Ser Leu Thr Trp His Trp Leu Phe Trp Met
170 175 180
atg ctt ccg atc gtt gtt atc gct ttg gta att ggt ttc ttc ttg atc 1591
Met Leu Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Val Ile Gly Phe Phe Leu Ile
185 190 195
aaa aat atc ggc gaa acc aag atc acc cca ctg gat gtt ctg tct gtc 1639
Lys Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu Asp Val Leu Ser Val
200 205 210
atc ctt tcg gtg ttt gcc ttc ggt ggt ttg gtg tac ggc ttc agt tcc 1687
Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val Tyr Gly Phe Ser Ser
215 220 225
ttc gga gca atc ctg gag ggc gaa ggc acc gta ggt atc ttc gcg atc 1735
Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val Gly Ile Phe Ala Ile
230 235 240 245
gtc gtt ggc gcc atc gca ctc ctc atc ttt gct ttg cga cag cac caa 1783
Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala Leu Arg Gln His Gln
250 255 260
ctc ggc aag caa gac aaa gca ctg atg gat ctc cga gcc ttc aag gtg 1831
Leu Gly Lys Gln Asp Lys Ala Leu Met Asp Leu Arg Ala Phe Lys Val
265 270 275
agg aac ttc agc ttc tcc ttg acc acc atc ctt ttg gcg ttc ggc gcg 1879
Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu Leu Ala Phe Gly Ala
280 285 290
atg ctc gga acc gtc atg gtt ttg cca atc tac ctg cag act tcc ctc 1927
Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr Leu Gln Thr Ser Leu
295 300 305
gga gtt act gct ttg gtg acc ggt ttg gtt gtt atg ccc ggc ggc ctc 1975
Gly Val Thr Ala Leu Val Thr Gly Leu Val Val Met Pro Gly Gly Leu
310 315 320 325
ctc cag ggt ctg atc agc cca ttc atc gga cgt ttc tac gac aag gtc 2023
Leu Gln Gly Leu Ile Ser Pro Phe Ile Gly Arg Phe Tyr Asp Lys Val
330 335 340
ggt cca cgt ccg ctg ctg att ccc gga gca att gcg ctg gct atc gcg 2071
Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile Ala Leu Ala Ile Ala
345 350 355
gca tcc tcg atg act ttc ctc aat gag aat tca ccc gtg tgg atg gtc 2119
Ala Ser Ser Met Thr Phe Leu Asn Glu Asn Ser Pro Val Trp Met Val
360 365 370
gtg gtc atg cac gtt gtg ttc agc atc ggc atg tgt ttg atg atg acc 2167
Val Val Met His Val Val Phe Ser Ile Gly Met Cys Leu Met Met Thr
375 380 385
cct ctc atg acc acc gct ctc ggc gcc ctt ccg aag cac ctc tat ggt 2215
Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro Lys His Leu Tyr Gly
390 395 400 405
cac ggc tcc gca att ttg aac acg ttc caa cag ctc gca ggc gca gcc 2263
His Gly Ser Ala Ile Leu Asn Thr Phe Gln Gln Leu Ala Gly Ala Ala
410 415 420
gga aca gcg atc atg att gca gca ctt tcc ttc ggc act tcc att gca 2311
Gly Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Leu Ser Phe Gly Thr Ser Ile Ala
425 430 435
gcg tct tcg gga tct gcg cat gct gaa gct gtt gcc gct ggt acc aag 2359
Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val Ala Ala Gly Thr Lys
440 445 450
gtt gcg ttc atc gca ggc gca atc atc gcg gtg atc gct ttg gtt gtt 2407
Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Val Val
455 460 465
tcc ctc ttc gtc act cgc gtc gag gaa gaa gct cac taaataccaa 2453
Ser Leu Phe Val Thr Arg Val Glu Glu Glu Ala His
470 475 480
aaaatggggc agaaggtcat tgactttctg ccccattttt ttgcttctcg acgcctcccg 2513
ccgccacctc accttaagcg tgctcagcgc tccaggttct gttctcgcca cccggtttgt 2573
ggttcccaca ccaacagctt gttggtaggt cggctttctg ggtttttcag tgaaataaca 2633
attttggttc gggaagaata tgccactgaa aaactattcc tgtctaagtt cacagttgtt 2693
atttgttctg ttgtttcagg gtcgtggaaa gcatatgtgc cttcttgctc atgaaacatc 2753
atgagtgttc cggtgggaaa accgagtgtt ggagaatccc caggtggaag ataaattaga 2813
ccagattcgg gaacctcagg gtcgccaaag acttctacgt tgagaatctc gaggtcctgg 2873
ttaaacgtga tgtggtggtt actagcgcgt aagtaaattc gatcaccgta tgggtaaatt 2933
gctgtgatta tcgatcggcc gatatcaaga tctactgctt taaatggttt aagcctaagg 2993
attgtttgaa gccaaaagtt gtcattaaga cgagggtttt cgcgtgtgac attgtgcaag 3053
tttttcccga agctgtctaa caatctccaa cctgctggaa tcgaagggac agcttcgaat 3113
acttctttaa gatccggaag ctcccatgtt tttcccttgc aatcactgaa atcgtgaggc 3173
cattgctttt gttttacgcg ggctctatta gcggaatcga ggacgatctc ttggaacgtg 3233
gggatggaga tctcgtgtaa tagttcgcct gttgacacgc tgaatccacg gacgaaaggc 3293
aagctttcat cggagagcca aaatatgtca ccgtcactgg tactagtgct gatgccttca 3353
agagtttctt ggtttttggg tggatgcaca ccatctaggg tcacgtcgat aattgcgtcc 3413
gtaccgtggt agtgcgctgc tgtaacgact gca 3446
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<211> 481
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
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1 5 10 15
Pro Arg Glu Val Val Val Val Leu Ser Ile Leu Val Val Ser Ala Met
20 25 30
Ile Met Ile Leu Asn Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile
35 40 45
Met Glu Asp Phe Ser Val Pro Glu Thr Thr Ala Gln Trp Leu Thr Thr
50 55 60
Gly Phe Met Leu Thr Met Ala Val Val Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Arg Phe Ser Thr Lys Thr Ile Phe Val Thr Ala Leu Leu Phe
85 90 95
Phe Thr Val Gly Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ala Pro Thr Phe Ala Val
100 105 110
Leu Leu Gly Ala Arg Ile Val Gln Ala Val Gly Thr Ala Leu Val Met
115 120 125
Pro Leu Leu Met Thr Val Thr Leu Thr Val Val Pro Ala Glu Arg Arg
130 135 140
Gly Ser Met Met Gly Ile Ile Ser Ile Val Ile Ser Val Ala Pro Ala
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Leu Gly Pro Thr Leu Ser Gly Val Ile Leu Asn Ser Leu Thr Trp His
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Trp Leu Phe Trp Met Met Leu Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Val Ile
180 185 190
Gly Phe Phe Leu Ile Lys Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu
195 200 205
Asp Val Leu Ser Val Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val
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Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val
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Gly Ile Phe Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala
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260 265 270
Arg Ala Phe Lys Val Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu
275 280 285
Leu Ala Phe Gly Ala Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr
290 295 300
Leu Gln Thr Ser Leu Gly Val Thr Ala Leu Val Thr Gly Leu Val Val
305 310 315 320
Met Pro Gly Gly Leu Leu Gln Gly Leu Ile Ser Pro Phe Ile Gly Arg
325 330 335
Phe Tyr Asp Lys Val Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile
340 345 350
Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ser Ser Met Thr Phe Leu Asn Glu Asn Ser
355 360 365
Pro Val Trp Met Val Val Val Met His Val Val Phe Ser Ile Gly Met
370 375 380
Cys Leu Met Met Thr Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro
385 390 395 400
Lys His Leu Tyr Gly His Gly Ser Ala Ile Leu Asn Thr Phe Gln Gln
405 410 415
Leu Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Leu Ser Phe
420 425 430
Gly Thr Ser Ile Ala Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val
435 440 445
Ala Ala Gly Thr Lys Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val
450 455 460
Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Phe Val Thr Arg Val Glu Glu Glu Ala
465 470 475 480
His
<210> 9
<211> 3446
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3446)
<223> nucleotide sequence comprising locus_tag BBD29_13115 disclosed in
GenBank accession number NZ_CP016335
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1000)
<223> nucleotide sequence upstream of cds
<220>
<221> CDS
<222> (1001)..(2443)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2444)..(2446)
<223> stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (2444)..(3446)
<223> nucleotide sequence downstream of cds
<400> 9
caaatgatta aactcactca tgaagtcgca atcaatgctg aaaagtaccg aagccttcct 60
gcatgggata aagcagccgc ccgagctttt gcagtgggta tgactgtgga caaagcagtg 120
gtagcggggc agtctgcggc gaggttatgg ggataccaaa ctttgactgt tgagaaaacc 180
gtgttgtgtc tgttgccgga aaggctacgt tcaaaatcct ccaagcattg gccgtccggg 240
atgcgatata aagatcgtta cctctcgccg cgtgatattc gggaagttca tgggattcga 300
gtcacgggag ctttccgcac atttttggac atcgctttgg atgatggggt ggtggcggct 360
gtggtcacta ttgattcagc tcgaaggcag aatccgtcgc ttacgcgtga gaagttgatg 420
tgcagtgcag aaagtttccc gaggcatcgg ggtgtgaagg cgtatcggca ggcgattgag 480
ttgtcgattc ccaattcgga tagtgctcag gagacgaggg ctcggttgat cctgggggag 540
gccaacctcc cggagatcca gtcagtgcag gtgcaagccc gtttcgatca atcgcacaac 600
aagtatttcc tcgtggattt cttaatcaat gagtggatca tcgtggagat tgatggacgt 660
tcgaaatatg attctccaga gcttaatgag gtgctcatgg ctgaacgtga tcgggagaaa 720
ttcttcctca accaaggata tgcagtgctg agaattgatc caaaacaatt agaccccgac 780
caaaacggcg agtgtgaatt catcggaatc ctcaaaaaca ctttgcagaa gaccccgcca 840
gagcacctca agcaagccgc ctaaacactc caagaaccac catttgcaca atgcacttgc 900
ttgtggcact ctttagtagt tttttctcat agctcagttt cgcaacttta gagaactcta 960
gaaactgagc ttcatgctgt gaaaggcctt ttctccattc atg gat tcc caa att 1015
Met Asp Ser Gln Ile
1 5
aat act cag acc tct ccg gca gct gcg aag ctg cct agg gag gtc gtt 1063
Asn Thr Gln Thr Ser Pro Ala Ala Ala Lys Leu Pro Arg Glu Val Val
10 15 20
gtt gtt ctt tcg atc ctc gtg gtt tcc gcg atg atc atg att ctt aat 1111
Val Val Leu Ser Ile Leu Val Val Ser Ala Met Ile Met Ile Leu Asn
25 30 35
gaa acc att ctg tcg gtt gcg ttg cct tcc atc atg gaa gat ttc tcc 1159
Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile Met Glu Asp Phe Ser
40 45 50
gtg cct gaa act act gca cag tgg ttg acc act ggc ttt atg ttg acg 1207
Val Pro Glu Thr Thr Ala Gln Trp Leu Thr Thr Gly Phe Met Leu Thr
55 60 65
atg gca gtg gtg att cct act act ggt tat ctg ctt gat cgt ttt tcc 1255
Met Ala Val Val Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Leu Leu Asp Arg Phe Ser
70 75 80 85
act aag acg atc ttt gtt act gcg ttg ttg ttc ttt acg gtt ggt acg 1303
Thr Lys Thr Ile Phe Val Thr Ala Leu Leu Phe Phe Thr Val Gly Thr
90 95 100
ttg act gcg gcg ttg gcc cca acg ttt gct gtg ctg ctt ggt gct cgt 1351
Leu Thr Ala Ala Leu Ala Pro Thr Phe Ala Val Leu Leu Gly Ala Arg
105 110 115
atc gtt cag gcg gtt ggt act gcg ctg gtg atg cct ttg ctg atg aca 1399
Ile Val Gln Ala Val Gly Thr Ala Leu Val Met Pro Leu Leu Met Thr
120 125 130
gtt acg ttg acg gtg gtt cct gcg gag cgt cgt ggt tcg atg atg ggc 1447
Val Thr Leu Thr Val Val Pro Ala Glu Arg Arg Gly Ser Met Met Gly
135 140 145
att att tcc atc gtg att tct gtt gcg ccg gcg ctt ggt cct act ttg 1495
Ile Ile Ser Ile Val Ile Ser Val Ala Pro Ala Leu Gly Pro Thr Leu
150 155 160 165
tct ggt gtc att ctt aac tct ttg acc tgg cac tgg ttg ttt tgg atg 1543
Ser Gly Val Ile Leu Asn Ser Leu Thr Trp His Trp Leu Phe Trp Met
170 175 180
atg ctt ccg atc gtt gtt atc gct ttg gtg att ggc tac ttc ctg atc 1591
Met Leu Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Val Ile Gly Tyr Phe Leu Ile
185 190 195
caa aac att ggc gaa acc aag atc act cca ctg gat gtt ctg tct gtc 1639
Gln Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu Asp Val Leu Ser Val
200 205 210
atc ctt tcg gtg ttt gcc ttc ggt ggt ttg gtg tac ggc ttc agt tcc 1687
Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val Tyr Gly Phe Ser Ser
215 220 225
ttc gga gca atc ctg gag ggc gaa ggt acc gta ggt atc ctc gcg atc 1735
Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val Gly Ile Leu Ala Ile
230 235 240 245
gtc gtt ggc gcc atc gca ctt ctc atc ttt gct ttg cga cag cac caa 1783
Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala Leu Arg Gln His Gln
250 255 260
ctt ggc aaa caa gac aaa gcc ctc atg gat ttg cgt gct ttc aag gtg 1831
Leu Gly Lys Gln Asp Lys Ala Leu Met Asp Leu Arg Ala Phe Lys Val
265 270 275
agg aac ttc agt ttc tcc ttg acc acc atc ctt ttg gcg ttc ggt gcg 1879
Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu Leu Ala Phe Gly Ala
280 285 290
atg ctc gga acc gtc atg gtt ttg ccc atc tac ctg cag act tcc ctc 1927
Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr Leu Gln Thr Ser Leu
295 300 305
gga gtt act gct ttg gtg acc ggt ttg gtt gtt atg ccc ggc ggc ctc 1975
Gly Val Thr Ala Leu Val Thr Gly Leu Val Val Met Pro Gly Gly Leu
310 315 320 325
ctc cag ggt ctg atc agc cca ttc atc gga cgt ttc tac gac aag gtc 2023
Leu Gln Gly Leu Ile Ser Pro Phe Ile Gly Arg Phe Tyr Asp Lys Val
330 335 340
ggt cca cgt ccg ctg ctg att ccc gga gca att gcg ctg gct atc gcg 2071
Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile Ala Leu Ala Ile Ala
345 350 355
gca tcc tcg atg act ttc ctc aat gag aat tca cct gtg tgg atg gtc 2119
Ala Ser Ser Met Thr Phe Leu Asn Glu Asn Ser Pro Val Trp Met Val
360 365 370
gtg gtc atg cac gtt gtg ttc agc atc ggt atg tgt ttg atg atg acc 2167
Val Val Met His Val Val Phe Ser Ile Gly Met Cys Leu Met Met Thr
375 380 385
cct ctc atg acc acc gct ctc ggc gcc ctt ccg aag cac ctc tat ggt 2215
Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro Lys His Leu Tyr Gly
390 395 400 405
cac ggc tcc gca att ttg aac acg ttc caa cag ctc gca ggt gca gcc 2263
His Gly Ser Ala Ile Leu Asn Thr Phe Gln Gln Leu Ala Gly Ala Ala
410 415 420
gga aca gcg atc atg att gca gca ctt tcc ttc ggc act tcc att gca 2311
Gly Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Leu Ser Phe Gly Thr Ser Ile Ala
425 430 435
gcg tct tcc gga tct gcg cat gct gaa gct gtt gcc gct ggt acc aag 2359
Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val Ala Ala Gly Thr Lys
440 445 450
gtt gcg ttc atc gca ggc gca atc atc gcg gtg atc gct ttg gtt gtt 2407
Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Val Val
455 460 465
tcc ctc ttc gtc act cgc gtt gag gaa gaa act cac taaacgctca 2453
Ser Leu Phe Val Thr Arg Val Glu Glu Glu Thr His
470 475 480
ataatggggc agacggtcat tgactttctg ccccggtttt ttgcttttcg acgcctccct 2513
gcagcgcacc ttgcaggtgc gcggggctta agcgtcgaaa gccctagatt tctacagaga 2573
catcgtcgaa tttaatgttg ctccattgac cgtctctaaa cactgagaca gaggaaggta 2633
ctggtttgag ataatcagta ccagtaggcg gggtaaccag tatgttgaag tggtttggtg 2693
acagaattct gacctcggtg aagtaccctt ccggtgttgt tcacctggtt atttcgcttc 2753
ctgaaatctg atcgagaaat acgatttcat cttttttcgt gaacttggca gctacgcctt 2813
cttgtgtaat ccagcgttca tgcttcgcac caagctgatg ttcttcggca ctttgcactt 2873
gaaagtttga atccaaaaag acggtcatgc tccagaattg cacaaagtac aggtcttcta 2933
ctcggcatgc gtttaggatc ctggatccgt cattgctgat tacacagatt tccaattgtc 2993
ctgctggagt gcttcgaccc agtgctgttt gctctccatc ggtcagggag taaagcccat 3053
cgagaaagct ttcttgtaat tcccaaggcg ctggaacgtc gagttctatg acaggctcta 3113
tccatggttg aggttccgca agcatgcgta ctctaggatt cagtgaccag gcgttttcat 3173
aatcgtgaat caacccttcc gaaaactgaa gcggagaccc gtgagaaacc gaaataggca 3233
cataggtttg ccccaggtat tttccggttt ggagatccca gcatcgaaga attggaagca 3293
tctgatcaag gacccatagt tgttcattga tgatgtgagt gatggatgct tcaaactgtt 3353
gtggctgaag tggtggtgga actgtgccgt caagggtggc atcgacgata acttccaaca 3413
gccagctgcc attttctgtg taggcatcgt ctg 3446
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<211> 481
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13869
<400> 10
Met Asp Ser Gln Ile Asn Thr Gln Thr Ser Pro Ala Ala Ala Lys Leu
1 5 10 15
Pro Arg Glu Val Val Val Val Leu Ser Ile Leu Val Val Ser Ala Met
20 25 30
Ile Met Ile Leu Asn Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile
35 40 45
Met Glu Asp Phe Ser Val Pro Glu Thr Thr Ala Gln Trp Leu Thr Thr
50 55 60
Gly Phe Met Leu Thr Met Ala Val Val Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Arg Phe Ser Thr Lys Thr Ile Phe Val Thr Ala Leu Leu Phe
85 90 95
Phe Thr Val Gly Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ala Pro Thr Phe Ala Val
100 105 110
Leu Leu Gly Ala Arg Ile Val Gln Ala Val Gly Thr Ala Leu Val Met
115 120 125
Pro Leu Leu Met Thr Val Thr Leu Thr Val Val Pro Ala Glu Arg Arg
130 135 140
Gly Ser Met Met Gly Ile Ile Ser Ile Val Ile Ser Val Ala Pro Ala
145 150 155 160
Leu Gly Pro Thr Leu Ser Gly Val Ile Leu Asn Ser Leu Thr Trp His
165 170 175
Trp Leu Phe Trp Met Met Leu Pro Ile Val Val Ile Ala Leu Val Ile
180 185 190
Gly Tyr Phe Leu Ile Gln Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu
195 200 205
Asp Val Leu Ser Val Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val
210 215 220
Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala
245 250 255
Leu Arg Gln His Gln Leu Gly Lys Gln Asp Lys Ala Leu Met Asp Leu
260 265 270
Arg Ala Phe Lys Val Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu
275 280 285
Leu Ala Phe Gly Ala Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr
290 295 300
Leu Gln Thr Ser Leu Gly Val Thr Ala Leu Val Thr Gly Leu Val Val
305 310 315 320
Met Pro Gly Gly Leu Leu Gln Gly Leu Ile Ser Pro Phe Ile Gly Arg
325 330 335
Phe Tyr Asp Lys Val Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile
340 345 350
Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ser Ser Met Thr Phe Leu Asn Glu Asn Ser
355 360 365
Pro Val Trp Met Val Val Val Met His Val Val Phe Ser Ile Gly Met
370 375 380
Cys Leu Met Met Thr Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro
385 390 395 400
Lys His Leu Tyr Gly His Gly Ser Ala Ile Leu Asn Thr Phe Gln Gln
405 410 415
Leu Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Leu Ser Phe
420 425 430
Gly Thr Ser Ile Ala Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val
435 440 445
Ala Ala Gly Thr Lys Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val
450 455 460
Ile Ala Leu Val Val Ser Leu Phe Val Thr Arg Val Glu Glu Glu Thr
465 470 475 480
His
<210> 11
<211> 3446
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC14067
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3446)
<223> nucleotide sequence comprising locus_tag KIQ_001365 disclosed in
GenBank accession number AGQQ02000002
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1000)
<223> nucleotide sequence upstream of cds
<220>
<221> CDS
<222> (1001)..(2443)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2444)..(2446)
<223> stop codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (2444)..(3446)
<223> nucleotide sequence downstream of cds
<400> 11
tacccttccc tcaacgaagc cctcgcacgc aaattcccag gacaaccaga agtaaccatc 60
gactccaccg tcgaagaact ccgcgaaatc gccaaggtaa tcggcctctc cgtccccgaa 120
aatggcggct ggggacacgg caaactcgtc gaagaaatct gggaactcct ctgcgaagac 180
caactctacg gaccaatctt tgtcaaagac ttcccagtag aaacctcccc actcacacgc 240
caacaccgca ccaagccagg cgtcaccgaa aagtgggacc tctacgtccg cggatttgaa 300
ctagcaaccg gatactccga actcatcgac ccagtcatcc aacgcgaacg cttcgaagac 360
caagcccgcc tcgccgccga cggagacgac gaagccatgg tcctcgacga agacttcctc 420
accgcaatgg aacaaggcat gccaccaacc tccggcaacg gcatgggaat cgaccgcctc 480
ctcatggccc tcaccggcct cggaatccgc gaaaccgtac tcttcccaat ggtgaaacca 540
gaacaaaagt aggttttctg tttgggtagg ttagctccag gactttgtgt cctggagttt 600
tcctcttcct agggttgatc gggatgggtt ttgtaaggtc gggtcggcgt cggtccgtaa 660
gttcgatttc acggtttcga gaccttaaca gcgatttcac gggtttcggt ttctcgcgtt 720
caatttcttg tactcaattt cgcatattcg ataccactag gaaagacgtc aaaatccgtt 780
agacctcgac caaaacggcg agtgcgagtt catcggaatc ctcaaaaaca ctttgcagaa 840
gaccccacca gagcacctca ggcaagccgc ctaaacactc caagaaccac cacttgcaca 900
atgcacttgc ttatggcact ctttaggagt tttttctcat agctcagttt cgtaacacta 960
gaaactgagc ttcatgctgt gaaaggcttt ttctccattc atg gat tcc caa att 1015
Met Asp Ser Gln Ile
1 5
aat act cag acc tct ccg gca gct gcg aag ttg cct agg gag gtc gtt 1063
Asn Thr Gln Thr Ser Pro Ala Ala Ala Lys Leu Pro Arg Glu Val Val
10 15 20
gtt gtt ctt tcg atc ctc gtg att tct gcg atg atc atg att ctt aat 1111
Val Val Leu Ser Ile Leu Val Ile Ser Ala Met Ile Met Ile Leu Asn
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Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile Met Ala Asp Phe Gln
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Val Pro Glu Thr Thr Ala Gln Trp Leu Thr Thr Gly Phe Met Leu Thr
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Met Ala Val Val Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Leu Leu Asp Arg Phe Ser
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Leu Thr Ala Ala Leu Ala Pro Thr Phe Ala Val Leu Leu Gly Ala Arg
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Ile Ile Gln Ala Val Gly Thr Ala Leu Val Met Pro Leu Leu Met Thr
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gtc acg ttg acg gtg gtt cct gcg gag cgg cgt agt tcg atg atg ggc 1447
Val Thr Leu Thr Val Val Pro Ala Glu Arg Arg Ser Ser Met Met Gly
135 140 145
att att tcc atc gtg att tct gtc gcg ccg gcg ctt ggt cct act ttg 1495
Ile Ile Ser Ile Val Ile Ser Val Ala Pro Ala Leu Gly Pro Thr Leu
150 155 160 165
tct ggt gtc att ctt aac tct ttg acc tgg cac tgg ttg ttc tgg atg 1543
Ser Gly Val Ile Leu Asn Ser Leu Thr Trp His Trp Leu Phe Trp Met
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atg ctc ccg atc gtg gcc gtt gcg ctg gtt att ggc ttc ttt ttg atc 1591
Met Leu Pro Ile Val Ala Val Ala Leu Val Ile Gly Phe Phe Leu Ile
185 190 195
aaa aat atc ggc gaa acc aag atc acc cca ctg gat gtt ctg tct gtc 1639
Lys Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu Asp Val Leu Ser Val
200 205 210
atc ctt tcg gtg ttt gcc ttc ggt ggt ttg gtg tac gga ttc agt tcc 1687
Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val Tyr Gly Phe Ser Ser
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Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val Gly Ile Leu Ala Ile
230 235 240 245
gtc gtt ggc gcc atc gca ctt ctc atc ttt gct ttg cga cag cac caa 1783
Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala Leu Arg Gln His Gln
250 255 260
ctc ggc aaa caa gac aag gca ctg atg gat ctc cgt gct ttc aag gtg 1831
Leu Gly Lys Gln Asp Lys Ala Leu Met Asp Leu Arg Ala Phe Lys Val
265 270 275
agg aac ttc agc ttc tcc ttg acc acc atc ctt ttg gcg ttc ggc gcg 1879
Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu Leu Ala Phe Gly Ala
280 285 290
atg ctc gga acc gtc atg gtt ttg cca atc tac ctg cag act tct ctc 1927
Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr Leu Gln Thr Ser Leu
295 300 305
gga gtt act gct ttg gtg acc ggt ttg gtt gtt atg ccc ggc ggc ctc 1975
Gly Val Thr Ala Leu Val Thr Gly Leu Val Val Met Pro Gly Gly Leu
310 315 320 325
ctc cag ggt ctg atc agc cca ttc atc gga cgt ttc tac gac aag gtt 2023
Leu Gln Gly Leu Ile Ser Pro Phe Ile Gly Arg Phe Tyr Asp Lys Val
330 335 340
ggt cca cgt ccg ttg ctg att ccc gga gca att gcg ctg gct atc gcg 2071
Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile Ala Leu Ala Ile Ala
345 350 355
gca tcc tcg atg act ttc ctc aat gag aat tca cct gtg tgg atg gtc 2119
Ala Ser Ser Met Thr Phe Leu Asn Glu Asn Ser Pro Val Trp Met Val
360 365 370
gtg gtc atg cac gtt gtg ttc agc atc ggc atg tgt ttg atg atg acc 2167
Val Val Met His Val Val Phe Ser Ile Gly Met Cys Leu Met Met Thr
375 380 385
cct ctc atg acc acc gct ctc ggc gcc ctt ccg aag cac ctc tat ggt 2215
Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro Lys His Leu Tyr Gly
390 395 400 405
cac ggc tcc gca att ctg aac acg ttc caa cag ctc gca ggc gca gcc 2263
His Gly Ser Ala Ile Leu Asn Thr Phe Gln Gln Leu Ala Gly Ala Ala
410 415 420
gga aca gcg atc atg att gcg gca ctt tcc ttc ggc act tcc att gca 2311
Gly Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Leu Ser Phe Gly Thr Ser Ile Ala
425 430 435
gcg tct tcc gga tct gca cac gcc gaa gct gtc gcc gct ggc acc aag 2359
Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val Ala Ala Gly Thr Lys
440 445 450
gtt gcg ttc atc gca ggc gca atc atc gca gtg atc gct ttg gtt att 2407
Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val Ile Ala Leu Val Ile
455 460 465
tcc ctc ttc gtc act cgc gtc gag gaa gaa act cac taaacaccaa 2453
Ser Leu Phe Val Thr Arg Val Glu Glu Glu Thr His
470 475 480
aaaatggggc agaaggtcat tgactttctg ccccattttt tgcttctcga cgcctcccgc 2513
cgccacctca ccttaagcgt gctcagcgct ccaggttttg ttctcgccac ccggtttgtg 2573
gttcccacac caacagtttg tcaatgaggc ggctttctgg atttttcagc gaaataacaa 2633
ttctgttctg agaagcatat tccacttcaa actgcctttt gggcaagttc acagttgtta 2693
gttgctttgt tgttttagga tcgtggaaag cgtagatatc ttgttgttcg tggaacatca 2753
tgagtgatcc gataggaaat cccagcgttg gagaatcccc tggtggaaga tcggaaagtg 2813
gccaataacc tgcatcggga tttccgtgga cctctacact gaggatttca agatcctgat 2873
taaacgtgat ctggtgaaga tcggaacgca gataaattcg ttcaccgtat tggtaaatcg 2933
tcgaaatctc ggcgtatcca agatcaagct caattgcttt gaagggtttg atcctaagga 2993
tggtttgttt ccaggttccg ttgtcagcgc ttacgacatg gaagttcttc ccgaatcttt 3053
tgtgtagttt ccagcctgcg gggatcgctg ggacagggtc ggttgcctct ttaaggtctg 3113
gaagttccca aagttttttc gctgcgcggg ctctattgcc ggattcgagg gcgatctcat 3173
tgaaggtggg tatggagatc tcgtgtacta gcttgcctgt ggagacattg aaaccgcgga 3233
cgaagggcaa gctcttatcg gacagccaga atgtttcacc gtcacaggta ctggtgctgc 3293
tccaatccaa ggattcttga tatctaggag gtttcgcacc gtcgagggtc acgtcgataa 3353
ttgcgtcctt accgtggcgg tagactgcgg tgatgaccgc tgacgtgcgg cggctcgtgt 3413
ccgcgtagga gctgtgggtg aagtagccgg tga 3446
<210> 12
<211> 481
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC14067
<400> 12
Met Asp Ser Gln Ile Asn Thr Gln Thr Ser Pro Ala Ala Ala Lys Leu
1 5 10 15
Pro Arg Glu Val Val Val Val Leu Ser Ile Leu Val Ile Ser Ala Met
20 25 30
Ile Met Ile Leu Asn Glu Thr Ile Leu Ser Val Ala Leu Pro Ser Ile
35 40 45
Met Ala Asp Phe Gln Val Pro Glu Thr Thr Ala Gln Trp Leu Thr Thr
50 55 60
Gly Phe Met Leu Thr Met Ala Val Val Ile Pro Thr Thr Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Leu Asp Arg Phe Ser Thr Lys Thr Ile Phe Val Thr Ala Leu Leu Phe
85 90 95
Phe Thr Val Gly Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ala Pro Thr Phe Ala Val
100 105 110
Leu Leu Gly Ala Arg Ile Ile Gln Ala Val Gly Thr Ala Leu Val Met
115 120 125
Pro Leu Leu Met Thr Val Thr Leu Thr Val Val Pro Ala Glu Arg Arg
130 135 140
Ser Ser Met Met Gly Ile Ile Ser Ile Val Ile Ser Val Ala Pro Ala
145 150 155 160
Leu Gly Pro Thr Leu Ser Gly Val Ile Leu Asn Ser Leu Thr Trp His
165 170 175
Trp Leu Phe Trp Met Met Leu Pro Ile Val Ala Val Ala Leu Val Ile
180 185 190
Gly Phe Phe Leu Ile Lys Asn Ile Gly Glu Thr Lys Ile Thr Pro Leu
195 200 205
Asp Val Leu Ser Val Ile Leu Ser Val Phe Ala Phe Gly Gly Leu Val
210 215 220
Tyr Gly Phe Ser Ser Phe Gly Ala Ile Leu Glu Gly Glu Gly Thr Val
225 230 235 240
Gly Ile Leu Ala Ile Val Val Gly Ala Ile Ala Leu Leu Ile Phe Ala
245 250 255
Leu Arg Gln His Gln Leu Gly Lys Gln Asp Lys Ala Leu Met Asp Leu
260 265 270
Arg Ala Phe Lys Val Arg Asn Phe Ser Phe Ser Leu Thr Thr Ile Leu
275 280 285
Leu Ala Phe Gly Ala Met Leu Gly Thr Val Met Val Leu Pro Ile Tyr
290 295 300
Leu Gln Thr Ser Leu Gly Val Thr Ala Leu Val Thr Gly Leu Val Val
305 310 315 320
Met Pro Gly Gly Leu Leu Gln Gly Leu Ile Ser Pro Phe Ile Gly Arg
325 330 335
Phe Tyr Asp Lys Val Gly Pro Arg Pro Leu Leu Ile Pro Gly Ala Ile
340 345 350
Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ser Ser Met Thr Phe Leu Asn Glu Asn Ser
355 360 365
Pro Val Trp Met Val Val Val Met His Val Val Phe Ser Ile Gly Met
370 375 380
Cys Leu Met Met Thr Pro Leu Met Thr Thr Ala Leu Gly Ala Leu Pro
385 390 395 400
Lys His Leu Tyr Gly His Gly Ser Ala Ile Leu Asn Thr Phe Gln Gln
405 410 415
Leu Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Ile Met Ile Ala Ala Leu Ser Phe
420 425 430
Gly Thr Ser Ile Ala Ala Ser Ser Gly Ser Ala His Ala Glu Ala Val
435 440 445
Ala Ala Gly Thr Lys Val Ala Phe Ile Ala Gly Ala Ile Ile Ala Val
450 455 460
Ile Ala Leu Val Ile Ser Leu Phe Val Thr Arg Val Glu Glu Glu Thr
465 470 475 480
His
<210> 13
<211> 1585
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> nucleotide sequence comprising a deletion of the cds of the lmrB
gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 and the adjoining
stop codon accompanied by insertion of the recognition site for
restriction endonuclease EcoRV
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(788)
<223> nucleotide sequence of ATCC13032 upstream (5'-flanking sequence)
of sequence coding for LmrB polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<222> (789)..(794)
<223> artificially inserted recognition site for restriction
endonuclease EcoRV
<220>
<221> misc_feature
<222> (795)..(1585)
<223> nucleotide sequence of ATCC13032 downstream (3'-flanking
sequence) of sequence coding for LmrB polypeptide
<400> 13
aaggctacgt tcaaaatcct ccaagcattg gccgtccggg atgcgatata aagatcgtta 60
cctctcgtcg cgtgatattc gagaggttca tgggatccga gttacgggag cgttccgcac 120
atttttggac atcgctttgg atgatggggt ggtggcggct gtggtcacta ttgattcagc 180
tcgaagacag aatccatcgc ttacgcgtga gaagttaatg cacagtgcgg aaagtttccc 240
gaggcatcgg ggtgtgaagg cgtatcggca ggcgattgag ttgtcgattc ccaattcgga 300
tagtgctcag gagacgaggg ctcggttaat ccttcgggag gccaagctcc cggaaatcca 360
gtcagtgaag gtgcaggccc gtttcgatca atcgcacaac aagtatttcc tcgtcgattt 420
cttgatcaat gagtggatca tcgtggagat tgatggacgt tcgaaatatg attccccgga 480
gctcaatgag gtgctcatgg ctgaacgcga tcgggagaaa ttcttcctca atcagggcta 540
tgcggtctta agaatcgatc cgaaacagtt agacctcaac caagatgggg agtgtgagtt 600
catcggaatc ctcaaaaaca ctttgcagaa gaccccacct gagcacctca agcaagccgc 660
ctaaacactc caagaaccac catttgcaca atgcacttgc ttgtggcact ctttagtagt 720
tttttctcat agctcagttt cgcaacttta gagaactcta gaaactgagc ttcatgctgt 780
gaaaggccga tatcaatggg gcagaaggtc attgactttc tgccccattt ttttgcttct 840
cgacgcctcc cgccgccacc tcaccttaag cgtgctcagc gctccaggtt ctgttctcgc 900
cacccggttt gtggttccca caccaacagc ttgttggtag gtcggctttc tgggtttttc 960
agtgaaataa caattttggt tcgggaagaa tatgccactg aaaaactatt cctgtctaag 1020
ttcacagttg ttatttgttc tgttgtttca gggtcgtgga aagcatatgt gccttcttgc 1080
tcatgaaaca tcatgagtgt tccggtggga aaaccgagtg ttggagaatc cccaggtgga 1140
agataaatta gaccagattc gggaacctca gggtcgccaa agacttctac gttgagaatc 1200
tcgaggtcct ggttaaacgt gatgtggtgg ttactagcgc gtaagtaaat tcgatcaccg 1260
tatgggtaaa ttgctgtgat tatcgatcgg ccgatatcaa gatctactgc tttaaatggt 1320
ttaagcctaa ggattgtttg aagccaaaag ttgtcattaa gacgagggtt ttcgcgtgtg 1380
acattgtgca agtttttccc gaagctgtct aacaatctcc aacctgctgg aatcgaaggg 1440
acagcttcga atacttcttt aagatccgga agctcccatg tttttccctt gcaatcactg 1500
aaatcgtgag gccattgctt ttgttttacg cgggctctat tagcggaatc gaggacgatc 1560
tcttggaacg tggggatgga gatct 1585
<210> 14
<211> 1585
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> nucleotide sequence comprising a deletion of the cds of the lmrB
gene of Corynebacterium glutamicum ATCC14067 and the adjoining
stop codon accompanied by insertion of the recognition site for
restriction endonuclease EcoRV
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(788)
<223> nucleotide sequence of ATCC14067 upstream (5'-flanking sequence)
of sequence coding for LmrB polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<222> (789)..(794)
<223> artificially inserted recognition site for restriction
endonuclease EcoRV
<220>
<221> misc_feature
<222> (789)..(794)
<223> nucleotide sequence of ATCC14067 downstream (3'-flanking
sequence) of sequence coding for LmrB polypeptide
<400> 14
tgtcaaagac ttcccagtag aaacctcccc actcacacgc caacaccgca ccaagccagg 60
cgtcaccgaa aagtgggacc tctacgtccg cggatttgaa ctagcaaccg gatactccga 120
actcatcgac ccagtcatcc aacgcgaacg cttcgaagac caagcccgcc tcgccgccga 180
cggagacgac gaagccatgg tcctcgacga agacttcctc accgcaatgg aacaaggcat 240
gccaccaacc tccggcaacg gcatgggaat cgaccgcctc ctcatggccc tcaccggcct 300
cggaatccgc gaaaccgtac tcttcccaat ggtgaaacca gaacaaaagt aggttttctg 360
tttgggtagg ttagctccag gactttgtgt cctggagttt tcctcttcct agggttgatc 420
gggatgggtt ttgtaaggtc gggtcggcgt cggtccgtaa gttcgatttc acggtttcga 480
gaccttaaca gcgatttcac gggtttcggt ttctcgcgtt caatttcttg tactcaattt 540
cgcatattcg ataccactag gaaagacgtc aaaatccgtt agacctcgac caaaacggcg 600
agtgcgagtt catcggaatc ctcaaaaaca ctttgcagaa gaccccacca gagcacctca 660
ggcaagccgc ctaaacactc caagaaccac cacttgcaca atgcacttgc ttatggcact 720
ctttaggagt tttttctcat agctcagttt cgtaacacta gaaactgagc ttcatgctgt 780
gaaaggctga tatcaatggg gcagaaggtc attgactttc tgccccattt tttgcttctc 840
gacgcctccc gccgccacct caccttaagc gtgctcagcg ctccaggttt tgttctcgcc 900
acccggtttg tggttcccac accaacagtt tgtcaatgag gcggctttct ggatttttca 960
gcgaaataac aattctgttc tgagaagcat attccacttc aaactgcctt ttgggcaagt 1020
tcacagttgt tagttgcttt gttgttttag gatcgtggaa agcgtagata tcttgttgtt 1080
cgtggaacat catgagtgat ccgataggaa atcccagcgt tggagaatcc cctggtggaa 1140
gatcggaaag tggccaataa cctgcatcgg gatttccgtg gacctctaca ctgaggattt 1200
caagatcctg attaaacgtg atctggtgaa gatcggaacg cagataaatt cgttcaccgt 1260
attggtaaat cgtcgaaatc tcggcgtatc caagatcaag ctcaattgct ttgaagggtt 1320
tgatcctaag gatggtttgt ttccaggttc cgttgtcagc gcttacgaca tggaagttct 1380
tcccgaatct tttgtgtagt ttccagcctg cggggatcgc tgggacaggg tcggttgcct 1440
ctttaaggtc tggaagttcc caaagttttt tcgctgcgcg ggctctattg ccggattcga 1500
gggcgatctc attgaaggtg ggtatggaga tctcgtgtac tagcttgcct gtggagacat 1560
tgaaaccgcg gacgaagggc aagct 1585
<210> 15
<211> 1266
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1263)
<223> nucleotide sequence encoding aspartokinase
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> gtg start codon
<220>
<221> misc_feature
<222> (1264)..(1266)
<223> stop codon
<400> 15
gtg gcc ctg gtc gta cag aaa tat ggc ggt tcc tcg ctt gag agt gcg 48
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
gaa cgc att aga aac gtc gct gaa cgg atc gtt gcc acc aag aag gct 96
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
gga aat gat gtc gtg gtt gtc tgc tcc gca atg gga gac acc acg gat 144
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
gaa ctt cta gaa ctt gca gcg gca gtg aat ccc gtt ccg cca gct cgt 192
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
gaa atg gat atg ctc ctg act gct ggt gag cgt att tct aac gct ctc 240
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
gtc gcc atg gct att gag tcc ctt ggc gca gaa gcc caa tct ttc acg 288
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
ggc tct cag gct ggt gtg ctc acc acc gag cgc cac gga aac gca cgc 336
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
att gtt gat gtc act cca ggt cgt gtg cgt gaa gca ctc gat gag ggc 384
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
aag atc tgc att gtt gct ggt ttc cag ggt gtt aat aaa gaa acc cgc 432
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
gat gtc acc acg ttg ggt cgt ggt ggt tct gac acc act gca gtt gcg 480
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
ttg gca gct gct ttg aac gct gat gtg tgt gag att tac tcg gac gtt 528
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
gac ggt gtg tat acc gct gac ccg cgc atc gtt cct aat gca cag aag 576
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
ctg gaa aag ctc agc ttc gaa gaa atg ctg gaa ctt gct gct gtt ggc 624
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
tcc aag att ttg gtg ctg cgc agt gtt gaa tac gct cgt gca ttc aat 672
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
gtg cca ctt cgc gta cgc tcg tct tat agt aat gat ccc ggc act ttg 720
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
att gcc ggc tct atg gag gat att cct gtg gaa gaa gca gtc ctt acc 768
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
ggt gtc gca acc gac aag tcc gaa gcc aaa gta acc gtt ctg ggt att 816
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
tcc gat aag cca ggc gag gct gcg aag gtt ttc cgt gcg ttg gct gat 864
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
gca gaa atc aac att gac atg gtt ctg cag aac gtc tct tct gta gaa 912
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
gac ggc acc acc gac atc acc ttc acc tgc cct cgt tcc gac ggc cgc 960
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
cgc gcg atg gag atc ttg aag aag ctt cag gtt cag ggc aac tgg acc 1008
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
aat gtg ctt tac gac gac cag gtc ggc aaa gtc tcc ctc gtg ggt gct 1056
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
ggc atg aag tct cac cca ggt gtt acc gca gag ttc atg gaa gct ctg 1104
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
cgc gat gtc aac gtg aac atc gaa ttg att tcc acc tct gag att cgt 1152
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
att tcc gtg ctg atc cgt gaa gat gat ctg gat gct gct gca cgt gca 1200
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
ttg cat gag cag ttc cag ctg ggc ggc gaa gac gaa gcc gtc gtt tat 1248
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
gca ggc acc gga cgc taa 1266
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 16
<211> 421
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032
<400> 16
Met Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1 5 10 15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20 25 30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50 55 60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65 70 75 80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85 90 95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305 310 315 320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325 330 335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Leu Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370 375 380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(41)
<223> primer 1f_DlmrB
<400> 17
agctcggtac ccggggatcc tagatctcca tccccacgtt c 41
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<223> primer 1r_DlmrB
<400> 18
gcttcatgct gtgaaaggcc gatatcaatg gggcagaagg tcattg 46
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<223> primer 2f_DlmrB
<400> 19
caatgacctt ctgccccatt gatatcggcc tttcacagca tgaagc 46
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(39)
<223> primer 2r_DlmrB
<400> 20
tgcatgcctg caggtcgact aaggctacgt tcaaaatcc 39
<210> 21
<211> 834
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> amplificate lmrB_up
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 5'-overlap to pK18mobsacB cut by XbaI
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(808)
<223> sequence corresponding to the sequence of SEQ ID NO:7 positions
201 to 988
<220>
<221> misc_feature
<222> (789)..(834)
<223> 3'-overlap to amplificate lmrB_down
<220>
<221> misc_feature
<222> (809)..(814)
<223> recognition site for restriction endonuclease EcoRV
<400> 21
tgcatgcctg caggtcgact aaggctacgt tcaaaatcct ccaagcattg gccgtccggg 60
atgcgatata aagatcgtta cctctcgtcg cgtgatattc gagaggttca tgggatccga 120
gttacgggag cgttccgcac atttttggac atcgctttgg atgatggggt ggtggcggct 180
gtggtcacta ttgattcagc tcgaagacag aatccatcgc ttacgcgtga gaagttaatg 240
cacagtgcgg aaagtttccc gaggcatcgg ggtgtgaagg cgtatcggca ggcgattgag 300
ttgtcgattc ccaattcgga tagtgctcag gagacgaggg ctcggttaat ccttcgggag 360
gccaagctcc cggaaatcca gtcagtgaag gtgcaggccc gtttcgatca atcgcacaac 420
aagtatttcc tcgtcgattt cttgatcaat gagtggatca tcgtggagat tgatggacgt 480
tcgaaatatg attccccgga gctcaatgag gtgctcatgg ctgaacgcga tcgggagaaa 540
ttcttcctca atcagggcta tgcggtctta agaatcgatc cgaaacagtt agacctcaac 600
caagatgggg agtgtgagtt catcggaatc ctcaaaaaca ctttgcagaa gaccccacct 660
gagcacctca agcaagccgc ctaaacactc caagaaccac catttgcaca atgcacttgc 720
ttgtggcact ctttagtagt tttttctcat agctcagttt cgcaacttta gagaactcta 780
gaaactgagc ttcatgctgt gaaaggccga tatcaatggg gcagaaggtc attg 834
<210> 22
<211> 838
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> amplificate lmrB_down
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<223> 5'-overlap to amplificate lmrB_up
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(26)
<223> recognition site for restriction endonuclease EcoRV
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(817)
<223> sequence corresponding to the sequence of SEQ ID NO:7 positions
2456 to 3246
<220>
<221> misc_feature
<222> (818)..(838)
<223> 3'-overlap to pK18mobsacB cut by XbaI
<400> 22
gcttcatgct gtgaaaggcc gatatcaatg gggcagaagg tcattgactt tctgccccat 60
ttttttgctt ctcgacgcct cccgccgcca cctcacctta agcgtgctca gcgctccagg 120
ttctgttctc gccacccggt ttgtggttcc cacaccaaca gcttgttggt aggtcggctt 180
tctgggtttt tcagtgaaat aacaattttg gttcgggaag aatatgccac tgaaaaacta 240
ttcctgtcta agttcacagt tgttatttgt tctgttgttt cagggtcgtg gaaagcatat 300
gtgccttctt gctcatgaaa catcatgagt gttccggtgg gaaaaccgag tgttggagaa 360
tccccaggtg gaagataaat tagaccagat tcgggaacct cagggtcgcc aaagacttct 420
acgttgagaa tctcgaggtc ctggttaaac gtgatgtggt ggttactagc gcgtaagtaa 480
attcgatcac cgtatgggta aattgctgtg attatcgatc ggccgatatc aagatctact 540
gctttaaatg gtttaagcct aaggattgtt tgaagccaaa agttgtcatt aagacgaggg 600
ttttcgcgtg tgacattgtg caagtttttc ccgaagctgt ctaacaatct ccaacctgct 660
ggaatcgaag ggacagcttc gaatacttct ttaagatccg gaagctccca tgtttttccc 720
ttgcaatcac tgaaatcgtg aggccattgc ttttgtttta cgcgggctct attagcggaa 780
tcgaggacga tctcttggaa cgtggggatg gagatctagg atccccgggt accgagct 838
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
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<223> primer
<220>
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aggtttcccg actggaaagc 20
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<213> artificial sequence
<220>
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<220>
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<222> (1)..(20)
<223> primer pCV22_2.p
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tgcaaggcga ttaagttggg 20
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
<220>
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<222> (1)..(23)
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gtgagcggat aacaatttca cac 23
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ggcgagaaca gaacctggag 20
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<213> artificial sequence
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<221> misc_feature
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<223> primer NCgl2591_fwd2
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ttccagcagg ttggagattg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<220>
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<222> (1)..(20)
<223> primer NCgl2593_rev2
<400> 32
ggcggctgtg gtcactattg 20
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<211> 1532
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum DM1933_deltalmrB::EcoRV
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1532)
<223> sequence displayed in SEQ ID NO:13 positions 34 to 1565
<220>
<221> misc_feature
<222> (756)..(761)
<223> recognition site for restriction endonuclease EcoRV
<400> 33
gtccgggatg cgatataaag atcgttacct ctcgtcgcgt gatattcgag aggttcatgg 60
gatccgagtt acgggagcgt tccgcacatt tttggacatc gctttggatg atggggtggt 120
ggcggctgtg gtcactattg attcagctcg aagacagaat ccatcgctta cgcgtgagaa 180
gttaatgcac agtgcggaaa gtttcccgag gcatcggggt gtgaaggcgt atcggcaggc 240
gattgagttg tcgattccca attcggatag tgctcaggag acgagggctc ggttaatcct 300
tcgggaggcc aagctcccgg aaatccagtc agtgaaggtg caggcccgtt tcgatcaatc 360
gcacaacaag tatttcctcg tcgatttctt gatcaatgag tggatcatcg tggagattga 420
tggacgttcg aaatatgatt ccccggagct caatgaggtg ctcatggctg aacgcgatcg 480
ggagaaattc ttcctcaatc agggctatgc ggtcttaaga atcgatccga aacagttaga 540
cctcaaccaa gatggggagt gtgagttcat cggaatcctc aaaaacactt tgcagaagac 600
cccacctgag cacctcaagc aagccgccta aacactccaa gaaccaccat ttgcacaatg 660
cacttgcttg tggcactctt tagtagtttt ttctcatagc tcagtttcgc aactttagag 720
aactctagaa actgagcttc atgctgtgaa aggccgatat caatggggca gaaggtcatt 780
gactttctgc cccatttttt tgcttctcga cgcctcccgc cgccacctca ccttaagcgt 840
gctcagcgct ccaggttctg ttctcgccac ccggtttgtg gttcccacac caacagcttg 900
ttggtaggtc ggctttctgg gtttttcagt gaaataacaa ttttggttcg ggaagaatat 960
gccactgaaa aactattcct gtctaagttc acagttgtta tttgttctgt tgtttcaggg 1020
tcgtggaaag catatgtgcc ttcttgctca tgaaacatca tgagtgttcc ggtgggaaaa 1080
ccgagtgttg gagaatcccc aggtggaaga taaattagac cagattcggg aacctcaggg 1140
tcgccaaaga cttctacgtt gagaatctcg aggtcctggt taaacgtgat gtggtggtta 1200
ctagcgcgta agtaaattcg atcaccgtat gggtaaattg ctgtgattat cgatcggccg 1260
atatcaagat ctactgcttt aaatggttta agcctaagga ttgtttgaag ccaaaagttg 1320
tcattaagac gagggttttc gcgtgtgaca ttgtgcaagt ttttcccgaa gctgtctaac 1380
aatctccaac ctgctggaat cgaagggaca gcttcgaata cttctttaag atccggaagc 1440
tcccatgttt ttcccttgca atcactgaaa tcgtgaggcc attgcttttg ttttacgcgg 1500
gctctattag cggaatcgag gacgatctct tg 1532
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<220>
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<222> (1)..(37)
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gcctgcaggt cgactatgga ttcccaaatt aatactc 37
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<212> DNA
<213> artificial Sequence
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<223> primer
<220>
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<223> primer 1r-lmrB
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ggtacccggg gatcctttag tgagtttctt cctcg 35
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<220>
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<222> (1)..(20)
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cgacggccag tgaattcgag 20
<210> 37
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<220>
<223> primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35)
<223> primer pVT_rev
<400> 37
ggtacccggg gatcctttag tgagcttctt cctcg 35
Claims (9)
1.一种发酵生产选自L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-异亮氨酸的L-氨基酸的方法，包括以下步骤：
a)培养棒杆菌属细菌，所述细菌在合适的条件下在合适培养基中能分泌所述L-氨基酸，
b)在培养基中累积所述L-氨基酸以形成含有L-氨基酸的发酵液，
其中在所述细菌中，所述多核苷酸通过缺失或替换编码与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少90％相同且赋予对选自林可霉素和克林霉素的林可酰胺抗性的多肽的多核苷酸的至少部分而被修饰，且其中所述细菌包含至少一个拷贝的编码具有反馈抗性的天冬氨酸激酶的基因。
2.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸通过缺失相应于SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的位置1-258的氨基酸的所述多核苷酸的编码序列的部分中的至少一或两个核苷酸而被修饰。
3.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸通过缺失相应于SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的位置210-258的氨基酸的所述多核苷酸的编码序列的部分中至少一或两个核苷酸而被修饰。
4.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸通过缺失至少其全部编码序列而被修饰。
5.权利要求4的方法，其中所述多核苷酸通过缺失至少其全部编码序列及相邻的终止密码子而被修饰。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述多核苷酸的修饰导致在所述多核苷酸中插入限制酶EcoRV的识别位点。
7.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸通过将编码L-氨基酸的生物合成途径的多肽的基因插入相应于SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的位置175-258的氨基酸的编码序列的部分中而被修饰。
8.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸通过用TAA-、TGA-或TAG-终止密码子取代编码所述多肽的氨基酸的一或多个密码子或者将TAA-、TGA-或TAG-终止密码子插入相应于SEQID NO:8所示氨基酸序列的位置1-258氨基酸的编码序列的部分中而被修饰。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述L-氨基酸是L-赖氨酸。
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