CN114410675A

CN114410675A - 含有烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因的重组菌株及其在萜类化合物生产中的应用

Info

Publication number: CN114410675A
Application number: CN202111484978.6A
Authority: CN
Inventors: 罗小舟; 周小雪; 沈俊峰
Original assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Current assignee: Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date: 2021-12-07
Filing date: 2021-12-07
Publication date: 2022-04-29
Also published as: WO2023104046A1

Abstract

本发明公开了含有烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因的重组菌株及其在萜类化合物生产中的应用。重组菌株包含烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因，优选地，所述重组菌株选自酵母菌或大肠杆菌。本发明还公开了包含烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因的重组质粒及其构建方法以及利用上述重组菌株生产萜类化合物的方法。本发明将基因构建在穿梭质粒上或整合到基因组上在重组菌中表达烯醇激酶和异戊烯基磷酸激酶，以烯醇为底物生产异戊烯焦磷酸和二甲基丙烯基焦磷酸参与萜类化合物的合成。该途径只需2步反应和一个辅因子(ATP)的参与，脱离于中心碳代谢；本发明使萜类化合物的生物合成过程具有更强的代谢流，提高萜类化合物的产量。

Description

含有烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因的重组菌株及其在萜类化合物生产中的应用

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及含有烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因的重组菌株及其在萜类化合物生产中的应用。

背景技术

萜类化合物是一类种类繁多、功能多样的化合物，广泛应用于医药、农业、生物燃料、香料和保健品等各个领域，具有重要的生理活性和极高的经济与医药战略价值。一些萜类化合物已经是经过批准的临床用药，还有很多正在进行临床测试。研究者们利用微生物生产萜类取得了很大进步，是目前公认的低成本、高效率、可持续生产的最有效方式。虽然在工程菌中已经实现了多种萜类的异源合成，但产量较低，无法满足巨大的市场需求。因此，如何对工程菌进行改造，进一步提高萜类化合物的产量，将为解决利用微生物工业化生产高价值萜类的技术瓶颈奠定基础。

萜类生物合成中面临的主要瓶颈之一是前体分子生成量不足。萜类的共同前体为异戊烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)，二者缩合成萜类骨架，是整个生物合成途径的关键节点，起到承上启下的作用。IPP和 DMAPP的自然合成路径为甲羟戊酸途径(MVA)和甲基赤藓糖醇4-磷酸途径 (MEP)，二者与细胞的中心碳代谢密切相关并受其动态调控，不可避免地受牵制于碳源、低能效和生物体内其他代谢途径，因此以自然合成途径为切入点，增强前体的代谢通量，不能从根本上解决问题。

为了突破这一瓶颈，本发明构建了全新的异戊烯醇途径(IAP)，该途径仅由两种激酶组成，能将异戊烯醇催化为异戊烯磷酸(IP、DMAP)和萜类化合物前体分子(IPP、DMAPP)。而且在酵母工程菌中引入IAP途径合成前体，能够脱离于中心碳代谢；整个合成路径简单，只需两种酶和一个辅因子参与，可解决原代谢途径(MVA途径和MEP途径)冗长及中间产物对酶毒性的问题，构建酵母平台菌株，为产业化合成萜类化合物提供基础。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供含有烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因的重组菌株及其在萜类化合物生产中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明一方面，提供一种重组质粒，所述重组质粒包括烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因。

作为优选地实施方式，所述烯醇激酶基因包括下述的至少一个基因：

(1)ScCK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，来源于酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)；

(2)SeCK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示，来源于真贝酵母(Saccharomyces eubayanus)。

作为优选地实施方式，所述异戊烯基磷酸激酶基因包括下述的至少一个基因：

(1)AtIPK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)；

(2)CsIPK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO:8所示，来源于大麻(Cannabis sativa)。

本发明又一方面，提供上述重组质粒的构建方法，将所述烯醇激酶基因和所述异戊烯基磷酸激酶基因分别通过融合PCR的方式与启动子、终止子组合成表达框，再利用Gibson组装的方式与载体骨架连接，即得到重组质粒；

优选地，所述烯醇激酶基因的启动子为Gal1启动子；

优选地，所述异戊烯基磷酸激酶基因的启动子为Gal10启动子；

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒为酵母菌-大肠杆菌之间的穿梭载体，在大肠杆菌中的抗性标记为氨苄青霉素(AmpR)，在酵母菌中的筛选标记为亮氨酸(LEU)缺陷型互补。

本发明又一方面，提供一种重组菌株，所述重组菌株包含烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因；

优选地，所述重组菌株选自酵母菌或大肠杆菌。

在本发明的技术方案中，所述烯醇激酶基因的编码产物即烯醇激酶能够将烯醇底物磷酸化。

作为优选地实施方式，所述烯醇激酶作用的底物包括3-甲基-3-丁烯-1-醇(Isoprenol)和3-甲基-2-丁烯醇(Prenol)；

在本发明的技术方案中，所述烯醇激酶将3-甲基-3-丁烯-1-醇(Isoprenol) 磷酸化为异戊烯基单磷酸(IP)；

在本发明的技术方案中，所述烯醇激酶将3-甲基-2-丁烯醇(Prenol)磷酸化为二甲基丙烯基单磷酸(DMAP)。

在本发明的技术方案中，所述异戊烯基磷酸激酶基因的编码产物即异戊烯基磷酸激酶能够将异戊烯基磷酸底物磷酸化为萜类前体分子。

作为优选地实施方式，所述异戊烯基磷酸激酶作用的底物包括异戊烯基单磷酸(IP)和二甲基丙烯基单磷酸(DMAP)；

在本发明的技术方案中，所述异戊烯基磷酸激酶将异戊烯基单磷酸(IP) 磷酸化为萜类前体分子异戊烯焦磷酸(IPP)；

在本发明的技术方案中，所述异戊烯基磷酸激酶将二甲基丙烯基单磷酸 (DMAP)磷酸化为萜类前体分子二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)。

在本发明的一种实施方式中，利用融合PCR的方式，将合成番茄红素 (Lycopene)相关的三个基因CrtE(香叶基香叶基焦磷酸合酶，GGPP合成酶)、 CrtB(八氢番茄红素合成酶)、CrtI(八氢番茄红素脱氢酶)分别与Gal10启动子、Gal1启动子、Gal7融合并组装成一个表达框；再利用CRISPR-Cas9技术将该表达框敲入酵母基因组Gal80的位置，获得产Lycopene的重组菌 GLy80。

在本发明的一种实施方式中，采用PEG/LiAc法将上述重组质粒转入酵母细胞中，并在SC-LEU的平板上进行筛选；平板上生长的粉红色单克隆即为引入IAP途径的产番茄红素(Lycopene)的酵母工程菌。

本发明又一方面，提供上述重组质粒或上述重组菌株在萜类化合物生产中的应用。

本发明又一方面，提供一种利用重组菌株生产萜类化合物的方法，包括如下步骤：

在培养基中培养上述重组菌株；加入烯醇底物；从所述培养基中分离所述萜类化合物。

作为优选地实施方式，所述烯醇底物选自3-甲基-3-丁烯-1-醇(Isoprenol) 和3-甲基-2-丁烯醇(Prenol)中的一种或两种；

优选地，所述底物添加的时间为培养基中重组菌的OD600为4～5。

优选地，所述烯醇底物为3-甲基-3-丁烯-1-醇(Isoprenol)和3-甲基-2-丁烯醇(Prenol)时，其摩尔比为3-甲基-3-丁烯-1-醇(Isoprenol)：3-甲基-2- 丁烯醇(Prenol)＝3：1。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是挑取酵母菌作为重组菌株，将酵母重组菌株单克隆接种至氨基酸缺陷型培养基(SC-LEU+2％葡萄糖)中活化，在30℃，800rpm下培养16小时。24小时后转接至新的氨基酸缺陷型培养基 (SC-LEU+2％葡萄糖)中扩大培养，起始OD为0.2，继续培养24小时后，培养基中酵母菌的OD600为4～5，加入25mM的底物(Isoprenol和/或Prenol) 和10％的十二烷(V/V)。

本发明具有以下优点和有益效果：

本发明通过以下研究：(1)通过生物信息学的方法，选择多组与IAP途径相关的酶基因，并构建其组合表达框。(2)向酿酒酵母中引入新的合成途径IAP，该途径用于积累中间体IPP和DMAPP以及对IAP途径相关的两种酶 (烯醇激酶和磷酸激酶)进行筛选。(3)利用IAP途径提高酵母底盘中萜类化合物的产量。(4)提供一种培养发酵条件，使IAP途径在酵母底盘中得到高效利用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明通过在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞中引入一条新的代谢途径：异戊烯醇途径(Isoprenoid alcohol pathway，IAP)，来合成IPP和 DMAPP。IAP途径只需2步反应和一个辅因子(ATP)的参与，并脱离于中心碳代谢；使萜类的生物合成过程具有更强的代谢流，最终帮助提高萜类化合物的产量。

(1)该途径脱离中心碳代谢，不与细胞内其它代谢途径竞争，有利于中间体IPP和DMAPP积累。

(2)该途径只需要2步反应和一个辅因子(ATP)参与，有利于产物快速积累。

附图说明

图1是利用异戊烯醇途径(IAP)途径和MVA途径在酿酒酵母中合成番茄红素的示意图；

图2是实施例1中构建的番茄红素基因表达框；

图3是实施例1中酿酒酵母敲入工具Cas9-sgRNA载体；

图4是实施例2中构建的重组质粒图谱；

图5是实施例5中以3-甲基-3-丁烯-1-醇为底物的含有不同重组质粒的酵母合成番茄红素的产量对比图；

图6是实施例5中以3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-2-丁烯醇为底物的含有不同重组质粒的酵母合成番茄红素的产量对比图。

具体实施方式

下面结合实施例以及对比例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。具体包括以下实施例：

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例与附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：异源合成四萜化合物(番茄红素)酵母底盘的构建

用高保真酶(

Max Super-Fidelity DNA Polymerase)PCR获得启动子(P_GAL1、P_GAL10、P_GAL7)，终止子(T_ADH1、T_CYC1、T_TDH2)和异源基因CrtE (香叶基香叶基焦磷酸合酶，GGPP合成酶)、CrtB(八氢番茄红素合酶)和 CrtI(八氢番茄红素脱氢酶)。通过融合PCR，将上述元件组装 P_GAL10-CrtE-T_ADH1、P_GAL1-CrtB-T_CYC1、P_GAL7-CrtI-T_TDH2并构建成外源基因表达框CrtE-CrtB-CrtI，结构如图2所示。切胶回收，获得纯化的目的片段。

采用CRISPR/Cas9工具将上述外源基因表达框CrtE-CrtB-CrtI整合到野生型酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组GAL80位置，得到产萜酵母底盘。

本实施例中的敲入载体pCut-GAL80为本领域常规的重组载体(图3所示)，并含有尿嘧啶筛选标记，其能够转化尿嘧啶营养缺陷型酵母。

在进行基因组敲入转化时，目的片段为1μg，pCUT-G80载体为250ng。转化方法为PEG/LiAc法。为了保证效率，酿酒酵母转化所用的感受态细胞现制现用。具体过程如下：

(1)从YPD平板挑取野生型酵母CEN.PK2-1C单克隆于10mL 1*YPD 培养基，30℃，200rpm下过夜培养。

(2)第二天上午，取一定量(1)中发酵液转接至50mL新鲜的2*YPD 液体培养基中，转接后的初始OD600为0.2；30℃，200rpm培养4.5小时左右。

(3)测得OD600为1左右，低速离心(3000rpm，10min)收集菌体。

(4)用等体积的灭菌水将上述菌体清洗一遍，低速离心(3000rpm，10 min)收集菌体。再用1/2体积的0.1M LiOAc将上述菌体清洗一遍，低速离心收集菌体。

(5)冰上分装为50μL/5OD感受态细胞。

(6)向上述50μL感受态细胞中加入260μL PEG3350(50％W/V)，36μL 1M LiOAc，10μL单链鲑鱼精DNA(100℃温育5min解链)，1μg敲入片段， 250ng pCut-GAL80载体。

(7)将该混合体系上下颠倒并涡旋震荡均匀后放于42℃水浴锅中温育50 分钟。

(8)收集上述混合体系，低速离心(4000rpm，2min)收集菌体；1mL 灭菌水清洗一遍后，再次低速离心收集菌体。

(9)100μL灭菌水重悬菌体，涂布于SC-URA平板。待平板吹干后倒置于30℃培养箱中3-4天。

上述转化平板所长出的红色单克隆进行脱pCut、PCR鉴定和测序鉴定，经过序列比对，萜类外源基因表达框已成功、正确的敲入野生型酵母基因组 GAL80位点。

本实施例中所获得的产四萜化合物(番茄红素)酵母底盘命名为GLy80。

实施例2：IAP途径功能元件的组装和表达

通过融合PCR将不同来源的烯醇激酶(IAK)基因、磷酸激酶(IPK)基因与双向强启动子P_GAL10-GAL1组装成IAK-IPK表达框。采用Gibson组装技术将IAK-IPK表达框与低拷贝载体pRS415-LEU2(CEN/ARS)重组，得到重组质粒pRS415-IAK-IPK(结构如图4所示)。将这些重组质粒转入上述产萜酵母底盘GLy80中进行表达，转化方法同上述实施例1。

本实施例中构建的重组质粒为：pRS415-ScCK-AtIPK和 pRS415-SeCK-CsIPK。

其中，pRS415-ScCK-AtIPK质粒组合中具体的基因型为：来源于酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的ScCK基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)和来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtIPK基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)。

pRS415-SeCK-CsIPK质粒组合中具体的基因型为：来源于真贝酵母菌的 SeCK基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)和来源于大麻的CsIPK基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示)。

转化时菌体涂布于SC-LEU平板，30℃培养箱中3天。

实施例3：异戊烯醇途径(IAP)在酵母底盘中的应用

将上述实施例2中转化的酵母菌涂布平板3天左右长出粉红色单克隆。

(1)挑取单克隆于灭菌的24孔板中，24孔板每个孔装载2mL氨基酸缺陷型培养基(SC-LEU+2％葡萄糖)，30℃，800rpm过夜培养。

(2)第二天转接，取一定量上述菌液至新的24孔板中。同上，24孔板每个孔装载2mL氨基酸缺陷型培养基(SC-LEU+2％葡萄糖)。转接后的初始OD600为0.2；30℃，800rpm培养24小时。

(3)24小时后，测得上述菌体生长至OD600为4-5左右，向培养基中加入烯醇底物Isoprenol和(或)Prenol，终浓度为25mM，再加入10％十二烷 (V/V)，即200μL。

(4)继续培养3-4天。30℃，800rpm。

(5)发酵结束后，离心收集菌体。

(6)HPLC测定番茄红素的产量，并确定在酵母细胞中异戊烯醇途径发挥功能的最佳IAK-IPK酶组合。

本实施例中，酵母底盘中合成番茄红素的途径，如图1所示，MVA途径为酵母底盘合成萜类的天然途径，其为葡萄糖经由3个乙酰辅酶A通过6步反应生成IPP，IPP在异构酶的作用下进而生成DMAPP；IPA途径为以烯醇为底物经过2步反应生成IPP和DMAPP。

实施例4：萜类产物(番茄红素)提取

(1)发酵结束后，将24孔板置于水平落地离心机离心；4000rpm，10min。

(2)弃掉上层发酵液，每个孔加入1mL去离子水重旋清洗菌体；4000rpm 10min。

(3)重复(2)中操作一次。

(4)用1mL 3M盐酸重旋菌体，取出置于1.5mL EP管中。

(5)将上述菌体置于100℃金属浴中3min，然后立即置于冰水浴中3min。重复3次。

(6)12000rpm离心5min，弃上层液体。

(7)加入1mL去离子水重旋清洗菌体，12000rpm离心5min，弃上层液体。重复一次。

(8)向收集有菌体的1.5mL EP管中加入500μL丙酮，涡旋震荡10s使细胞彻底分散，萃取其中的番茄红素。然后置于超声清洗仪中超声30min，彻底提取其中的番茄红素。

(9)离心收集上层有机相；再加入500μL丙酮，重复(8)一次。

(10)将收集的1mL有机相(含目标产物番茄红素)用0.45μm的有机滤头过滤，滤液用于后续的HPLC定量分析。

实施例5：高效液相色谱(HPLC)对萜类产物(番茄红素)定量分析

HPLC分析条件：色谱柱：YMC Carotenoid，4.6*250mm，5.0μm。流动相：A相：90％乙腈，B相：100％甲基叔丁基醚。检测所用机器，安捷伦1260；条件设置：0min，40％B；5min，95％B；10min，95％B；10.01min，40％B； 20min，40％B。上样量，20μL。流速，1mL/min。柱温，30℃。标准品为： 2.5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L番茄红素(用丙酮溶解)。

根据HPLC定量的结果如图5，图6所示，图中，横坐标为酵母底盘类型，纵坐标为番茄红素产量。

图5为饲喂25mM 3-甲基-3-丁烯-1-醇底物后的发酵结果。其中底盘G80 和G80(pRS415)为对照组；底盘G80(pRS415-ScCK-AtIPK)和 G80(pRS415-SeCK-CsIPK)为实验组。图6为饲喂25mM双底物3-甲基-3-丁烯-1-醇+3-甲基-2-丁烯醇(摩尔比3：1)的发酵结果。其中底盘G80和 G80(pRS415)为对照组；底盘G80(pRS415-ScCK-AtIPK)和 G80(pRS415-SeCK-CsIPK)为实验组。从图5和图6中可以得出结论：将 pRS415-ScCK-AtIPK和pRS415-SeCK-CsIPK转入酵母底盘GLy80中，可将番茄红素的产量提高1-1.3倍。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳先进技术研究院

<120> 含有烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因的重组菌株及其在萜类化合物生产中的应用

<130> 2021

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1749

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

atggtacaag aatcacgtcc agggagtgta agaagttact cggtcggtta ccaagcaagg 60

tccagatcga gttctcaaag aagacattcg ttaacacgcc aacgttcctc gcaaagactg 120

attagaacca tcagtatcga gtctgatgtg tctaatatta ctgacgatga cgatttgaga 180

gctgtcaatg agggagtagc gggtgtgcaa ctggacgtct ctgaaaccgc aaataaggga 240

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caggacatat taaatctcat tcagagtttg aagatatcca aatggtataa caacaagaaa 420

atccaaccgg tagcacaaga tatgaactta gtcaagatct ctggtgcgat gacaaacgca 480

attttcaaag ttgaataccc taagttacca tcgttgctat tgagaatata cggaccgaat 540

attgataata tcattgacag ggaatatgaa ttgcagattt tggctaggct ttcattgaaa 600

aatataggtc cttcccttta cggctgtttt gtaaacggta gatttgagca gtttctggag 660

aattctaaga ctttaacaaa agacgacatt agaaactgga agaactctca aaggattgca 720

aggagaatga aggagttaca tgtaggtgtt cctctcttga gttcagaaag gaagaacggg 780

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gatattgtcg atagatatca caagtggctt atttctcaag aacagggtat agagcaagtc 960

aacaaaaatc ttatattctg ccataatgat gcccaatacg gcaatttact tttcactgct 1020

cctgtgatga acacaccgag cctatacact gcaccttcgt ctacatcatt gacttcccaa 1080

tcaagttcct tatttccttc gagctccaat gtcattgtag atgatataat caacccgcca 1140

aagcaggagc aaagccaaga ttccaaattg gtcgtcattg attttgaata tgcaggtgcc 1200

aatcccgccg catatgattt agcgaatcat ctttccgagt ggatgtatga ttacaacaat 1260

gctaaggccc cacatcagtg ccacgctgat agatatcccg ataaagaaca ggttttgaat 1320

ttcttatact cttatgtttc gcatctaagg ggtggtgcta aggaacccat agatgaagag 1380

gttcaaagac tctataagtc aatcattcaa tggagaccca ctgtacaact attttggtcg 1440

ctctgggcca tcctacaaag tggtaaatta gagaaaaaag aagcctccac tgccatcact 1500

agagaagaaa ttggacccaa tggaaaaaaa tatatcatca agactgaacc cgaatcccct 1560

gaagaagact ttgttgaaaa tgacgacgag cctgaagctg gcgtcagcat tgacacgttc 1620

gattatatgg cttatggtcg tgacaagatt gcggtctttt ggggcgacct cattggctta 1680

ggcataatca ccgaagaaga atgcaaaaat ttcagctctt tcaagttcct cgatactagt 1740

tatttgtaa 1749

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<211> 581

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 2

Met Val Gln Glu Ser Arg Pro Gly Ser Val Arg Ser Tyr Ser Val Gly

1 5 10 15

Tyr Gln Ala Arg Ser Arg Ser Ser Ser Gln Arg Arg His Ser Leu Thr

20 25 30

Arg Gln Arg Ser Ser Gln Arg Leu Ile Arg Thr Ile Ser Ile Glu Ser

35 40 45

Asp Val Ser Asn Ile Thr Asp Asp Asp Asp Leu Arg Ala Val Asn Glu

50 55 60

Gly Val Ala Gly Val Gln Leu Asp Val Ser Glu Thr Ala Asn Lys Gly

65 70 75 80

Pro Arg Arg Ala Ser Ala Thr Asp Val Thr Asp Ser Leu Gly Ser Thr

85 90 95

Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Ile Pro Phe Val Lys Glu Thr Leu Asp Ala

100 105 110

Ser Leu Pro Ser Asp Tyr Leu Lys Gln Asp Ile Leu Asn Leu Ile Gln

115 120 125

Ser Leu Lys Ile Ser Lys Trp Tyr Asn Asn Lys Lys Ile Gln Pro Val

130 135 140

Ala Gln Asp Met Asn Leu Val Lys Ile Ser Gly Ala Met Thr Asn Ala

145 150 155 160

Ile Phe Lys Val Glu Tyr Pro Lys Leu Pro Ser Leu Leu Leu Arg Ile

165 170 175

Tyr Gly Pro Asn Ile Asp Asn Ile Ile Asp Arg Glu Tyr Glu Leu Gln

180 185 190

Ile Leu Ala Arg Ser Leu Lys Asn Ile Gly Pro Ser Leu Tyr Gly Cys

195 200 205

Phe Val Asn Gly Arg Phe Glu Gln Phe Leu Glu Asn Ser Lys Thr Leu

210 215 220

Thr Lys Asp Asp Ile Arg Asn Trp Lys Asn Ser Gln Arg Ile Ala Arg

225 230 235 240

Arg Met Lys Glu Leu His Val Gly Val Pro Leu Leu Ser Ser Glu Arg

245 250 255

Lys Asn Gly Ser Ala Cys Trp Gln Lys Ile Asn Gln Trp Leu Arg Thr

260 265 270

Ile Glu Lys Val Asp Gln Trp Val Gly Asp Pro Lys Asn Ile Glu Asn

275 280 285

Ser Leu Leu Cys Glu Asn Trp Ser Lys Phe Met Asp Ile Val Asp Arg

290 295 300

Tyr His Lys Trp Leu Ile Ser Gln Glu Gln Gly Ile Glu Gln Val Asn

305 310 315 320

Lys Asn Leu Ile Phe Cys His Asn Asp Ala Gln Tyr Gly Asn Leu Leu

325 330 335

Phe Thr Ala Pro Val Met Asn Thr Pro Ser Leu Tyr Thr Ala Pro Ser

340 345 350

Ser Thr Ser Leu Thr Ser Gln Ser Ser Ser Leu Phe Pro Ser Ser Ser

355 360 365

Asn Val Ile Val Asp Asp Ile Ile Asn Pro Pro Lys Gln Glu Gln Ser

370 375 380

Gln Asp Ser Lys Leu Val Val Ile Asp Phe Glu Tyr Ala Gly Ala Asn

385 390 395 400

Pro Ala Ala Tyr Asp Leu Ala Asn His Leu Ser Glu Trp Met Tyr Asp

405 410 415

Tyr Asn Asn Ala Lys Ala Pro His Gln Cys His Ala Asp Arg Tyr Pro

420 425 430

Asp Lys Glu Gln Val Leu Asn Phe Leu Tyr Ser Tyr Val Ser His Leu

435 440 445

Arg Gly Gly Ala Lys Glu Pro Ile Asp Glu Glu Val Gln Arg Leu Tyr

450 455 460

Lys Ser Ile Ile Gln Trp Arg Pro Thr Val Gln Leu Phe Trp Ser Leu

465 470 475 480

Trp Ala Ile Leu Gln Ser Gly Lys Leu Glu Lys Lys Glu Ala Ser Thr

485 490 495

Ala Ile Thr Arg Glu Glu Ile Gly Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Ile Ile

500 505 510

Lys Thr Glu Pro Glu Ser Pro Glu Glu Asp Phe Val Glu Asn Asp Asp

515 520 525

Glu Pro Glu Ala Gly Val Ser Ile Asp Thr Phe Asp Tyr Met Ala Tyr

530 535 540

Gly Arg Asp Lys Ile Ala Val Phe Trp Gly Asp Leu Ile Gly Leu Gly

545 550 555 560

Ile Ile Thr Glu Glu Glu Cys Lys Asn Phe Ser Ser Phe Lys Phe Leu

565 570 575

Asp Thr Ser Tyr Leu

580

<210> 3

<211> 1749

<212> DNA

<213> Saccharomyces eubayanus

<400> 3

atggtttcag aatcgcgtcg agggagtgta aaaagttatt cggtcggcta tcaagcaagg 60

tctagatcga gttcccagag gagaccttca ttgacacgtc aacgctcttc tcaaaggttg 120

attaggacta ttagcatcgg gtccgatgtt actaatgtta ctgacgatga tgatttgaag 180

gctgtcaatg aaggagttgc agaccttgaa ttagatattt cagaaactac aaataaggga 240

caaaggatta catcagcaac agacgccgca gacaatttgg gctcggttcc atcagaatgt 300

attgagatac cttttgtcga ggaaacactg gatgcaagtt taccgttgga ttatttaaag 360

caagacatat taaatctcgt tcagagcttg aaaatatcaa aatggtataa caacaagaaa 420

attcaaccat tggctcagga tataaactta acaaagatgt ccggtgcaat gaccaatgca 480

atcttcaaag ttgaatatcc taatttgccg tcgctactat tgaggattta cggtcccaac 540

atcgataaca tcattgatag agaatatgag ttgcagatcc tagctagact ttcgttgagg 600

aacataggtc cgtcactttt tggctgtttt ataaacggta gatttgaaca gtttctagaa 660

aactcgaaga ccttgacgaa ggatgacatc agaaattgga aaagctctca aagaattgca 720

agaagaatga aggagttgca cgtaggtgta cctcttctga gttcagaaag aaagaacggc 780

tctgcctgtt ggcaaaagat taaccaatgg ctgcgcacaa tcgaaaatgt ccaacaatgg 840

gtgggagacc ccaaaaatct tgacaagtct ctattgtgcg aggactggtc caagttcaaa 900

gatattattc aaagatacca caaatggttg gtcgtacaag aacatggcat ggaccgagtc 960

aacaagaatt tggtgttttg ccacaatgat gcgcaatacg gtaatttgct ttttaccgca 1020

cctgtgatgg acacatcaaa tctgcactcg gcgccttcct ccacgtcact ctcgtcacat 1080

tcgagttcat tgttcccttc agattctaat gtcatcgtgg atgatattat caacccgcca 1140

aagcaggaac aaagccaaga ttctaaactg gtcgtcattg attttgaata tgcaggcgca 1200

aacccagccg catacgatct agcaaatcat ctctctgagt ggatgtatga ttacaataat 1260

gcagaggctc cgcacaactg ccattctgat aaatatcccg ataaggagca agtcctaaac 1320

ttcttgtact cttatgtctc ccatttaagg ggcggagcta aggagcccat tgatgaggaa 1380

gttcaaaggc tctacaactc aatcctgcaa tggagaccca cggtccaatt gttttggtcg 1440

ctctgggcca tcctacaaag cggtgagttg gaagaggaag agcctcacac tgtcaccgcc 1500

aaagaagaaa ctggccccaa tggaaacaaa tacatcatca agacggatcc cagccctgtg 1560

gaagaggatc tcgtggataa cgaagatcag ccagaggctg gtgtcagcat cgacacgttc 1620

gattatatgg cttatggccg cgacaagatt gcggtctttt ggggtgacct cattggtctg 1680

ggcataatca ccaaggaaga atgcgaaaaa tttagctctt tcaaattcct agatactagc 1740

tatttgtaa 1749

<210> 4

<211> 582

<212> PRT

<213> Saccharomyces eubayanus

<400> 4

Met Val Ser Glu Ser Arg Arg Gly Ser Val Lys Ser Tyr Ser Val Gly

1 5 10 15

Tyr Gln Ala Arg Ser Arg Ser Ser Ser Gln Arg Arg Pro Ser Leu Thr

20 25 30

Arg Gln Arg Ser Ser Gln Arg Leu Ile Arg Thr Ile Ser Ile Gly Ser

35 40 45

Asp Val Thr Asn Val Thr Asp Asp Asp Asp Leu Lys Ala Val Asn Glu

50 55 60

Gly Val Ala Asp Leu Glu Leu Asp Ile Ser Glu Thr Thr Asn Lys Gly

65 70 75 80

Gln Arg Ile Thr Ser Ala Thr Asp Ala Ala Asp Asn Leu Gly Ser Val

85 90 95

Pro Ser Glu Cys Ile Glu Ile Pro Phe Val Glu Glu Thr Leu Asp Ala

100 105 110

Ser Leu Pro Leu Asp Tyr Leu Lys Gln Asp Ile Leu Asn Leu Val Gln

115 120 125

Ser Leu Lys Ile Ser Lys Trp Tyr Asn Asn Lys Lys Ile Gln Pro Leu

130 135 140

Ala Gln Asp Ile Asn Leu Thr Lys Met Ser Gly Ala Met Thr Asn Ala

145 150 155 160

Ile Phe Lys Val Glu Tyr Pro Asn Leu Pro Ser Leu Leu Leu Arg Ile

165 170 175

Tyr Gly Pro Asn Ile Asp Asn Ile Ile Asp Arg Glu Tyr Glu Leu Gln

180 185 190

Ile Leu Ala Arg Leu Ser Leu Arg Asn Ile Gly Pro Ser Leu Phe Gly

195 200 205

Cys Phe Ile Asn Gly Arg Phe Glu Gln Phe Leu Glu Asn Ser Lys Thr

210 215 220

Leu Thr Lys Asp Asp Ile Arg Asn Trp Lys Ser Ser Gln Arg Ile Ala

225 230 235 240

Arg Arg Met Lys Glu Leu His Val Gly Val Pro Leu Leu Ser Ser Glu

245 250 255

Arg Lys Asn Gly Ser Ala Cys Trp Gln Lys Ile Asn Gln Trp Leu Arg

260 265 270

Thr Ile Glu Asn Val Gln Gln Trp Val Gly Asp Pro Lys Asn Leu Asp

275 280 285

Lys Ser Leu Leu Cys Glu Asp Trp Ser Lys Phe Lys Asp Ile Ile Gln

290 295 300

Arg Tyr His Lys Trp Leu Val Val Gln Glu His Gly Met Asp Arg Val

305 310 315 320

Asn Lys Asn Leu Val Phe Cys His Asn Asp Ala Gln Tyr Gly Asn Leu

325 330 335

Leu Phe Thr Ala Pro Val Met Asp Thr Ser Asn Leu His Ser Ala Pro

340 345 350

Ser Ser Thr Ser Leu Ser Ser His Ser Ser Ser Leu Phe Pro Ser Asp

355 360 365

Ser Asn Val Ile Val Asp Asp Ile Ile Asn Pro Pro Lys Gln Glu Gln

370 375 380

Ser Gln Asp Ser Lys Leu Val Val Ile Asp Phe Glu Tyr Ala Gly Ala

385 390 395 400

Asn Pro Ala Ala Tyr Asp Leu Ala Asn His Leu Ser Glu Trp Met Tyr

405 410 415

Asp Tyr Asn Asn Ala Glu Ala Pro His Asn Cys His Ser Asp Lys Tyr

420 425 430

Pro Asp Lys Glu Gln Val Leu Asn Phe Leu Tyr Ser Tyr Val Ser His

435 440 445

Leu Arg Gly Gly Ala Lys Glu Pro Ile Asp Glu Glu Val Gln Arg Leu

450 455 460

Tyr Asn Ser Ile Leu Gln Trp Arg Pro Thr Val Gln Leu Phe Trp Ser

465 470 475 480

Leu Trp Ala Ile Leu Gln Ser Gly Glu Leu Glu Glu Glu Glu Pro His

485 490 495

Thr Val Thr Ala Lys Glu Glu Thr Gly Pro Asn Gly Asn Lys Tyr Ile

500 505 510

Ile Lys Thr Asp Pro Ser Pro Val Glu Glu Asp Leu Val Asp Asn Glu

515 520 525

Asp Gln Pro Glu Ala Gly Val Ser Ile Asp Thr Phe Asp Tyr Met Ala

530 535 540

Tyr Gly Arg Asp Lys Ile Ala Val Phe Trp Gly Asp Leu Ile Gly Leu

545 550 555 560

Gly Ile Ile Thr Lys Glu Glu Cys Glu Lys Phe Ser Ser Phe Lys Phe

565 570 575

Leu Asp Thr Ser Tyr Leu

580

<210> 5

<211> 999

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 5

atggagctga atatttccga gagtcgaagc agatcaattc gttgcattgt gaaacttgga 60

ggtgcggcaa ttacttgcaa aaacgagctg gagaagattc acgatgaaaa tctggaggtc 120

gtggcgtgtc agttacgtca agctatgttg gagggttcag ctccaagcaa ggttattggc 180

atggattgga gcaagagacc tggaagctct gagatttctt gtgatgtgga tgacataggg 240

gatcaaaagt cttctgagtt tagtaaattt gttgtggttc atggcgctgg ttcctttggg 300

cactttcagg ccagtagatc tggggttcac aaaggaggac ttgagaaacc tattgtcaaa 360

gctggtttcg ttgctactcg tatatctgtg acaaatctta atcttgaaat tgtacgagca 420

ctagcccgag agggcattcc tacgataggc atgtctccat tttcatgtgg ttggtcaacc 480

tccaaaagag atgtggcttc tgcagatcta gcaaccgtag ctaaaaccat agactcagga 540

tttgtccctg ttctccatgg agatgcagtg ctggacaata tactgggctg caccatattg 600

agtggtgatg ttatcatccg tcatcttgca gatcatttga agccagaata tgttgtcttt 660

ctcacagatg tactaggtgt ctacgatcga ccaccttcac cttcagagcc cgacgctgtg 720

ctcttgaaag agatcgctgt tggagaagat ggaagctgga aggttgtgaa tccactgttg 780

gagcacacag acaagaaagt tgactactct gttgcggcgc acgatacaac cggtggaatg 840

gaaacgaaga tatcagaagc tgctatgatt gcaaaacttg gagtcgatgt ctacattgtg 900

aaggctgcga caactcattc acagagagca ctaaacggtg atttgagaga tagtgttcct 960

gaagattggc ttggtactat catcagattc tcaaagtag 999

<210> 6

<211> 332

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 6

Met Glu Leu Asn Ile Ser Glu Ser Arg Ser Arg Ser Ile Arg Cys Ile

1 5 10 15

Val Lys Leu Gly Gly Ala Ala Ile Thr Cys Lys Asn Glu Leu Glu Lys

20 25 30

Ile His Asp Glu Asn Leu Glu Val Val Ala Cys Gln Leu Arg Gln Ala

35 40 45

Met Leu Glu Gly Ser Ala Pro Ser Lys Val Ile Gly Met Asp Trp Ser

50 55 60

Lys Arg Pro Gly Ser Ser Glu Ile Ser Cys Asp Val Asp Asp Ile Gly

65 70 75 80

Asp Gln Lys Ser Ser Glu Phe Ser Lys Phe Val Val Val His Gly Ala

85 90 95

Gly Ser Phe Gly His Phe Gln Ala Ser Arg Ser Gly Val His Lys Gly

100 105 110

Gly Leu Glu Lys Pro Ile Val Lys Ala Gly Phe Val Ala Thr Arg Ile

115 120 125

Ser Val Thr Asn Leu Asn Leu Glu Ile Val Arg Ala Leu Ala Arg Glu

130 135 140

Gly Ile Pro Thr Ile Gly Met Ser Pro Phe Ser Cys Gly Trp Ser Thr

145 150 155 160

Ser Lys Arg Asp Val Ala Ser Ala Asp Leu Ala Thr Val Ala Lys Thr

165 170 175

Ile Asp Ser Gly Phe Val Pro Val Leu His Gly Asp Ala Val Leu Asp

180 185 190

Asn Ile Leu Gly Cys Thr Ile Leu Ser Gly Asp Val Ile Ile Arg His

195 200 205

Leu Ala Asp His Leu Lys Pro Glu Tyr Val Val Phe Leu Thr Asp Val

210 215 220

Leu Gly Val Tyr Asp Arg Pro Pro Ser Pro Ser Glu Pro Asp Ala Val

225 230 235 240

Leu Leu Lys Glu Ile Ala Val Gly Glu Asp Gly Ser Trp Lys Val Val

245 250 255

Asn Pro Leu Leu Glu His Thr Asp Lys Lys Val Asp Tyr Ser Val Ala

260 265 270

Ala His Asp Thr Thr Gly Gly Met Glu Thr Lys Ile Ser Glu Ala Ala

275 280 285

Met Ile Ala Lys Leu Gly Val Asp Val Tyr Ile Val Lys Ala Ala Thr

290 295 300

Thr His Ser Gln Arg Ala Leu Asn Gly Asp Leu Arg Asp Ser Val Pro

305 310 315 320

Glu Asp Trp Leu Gly Thr Ile Ile Arg Phe Ser Lys

325 330

<210> 7

<211> 1161

<212> DNA

<213> Cannabis sativa

<400> 7

atgtccagca gacaagagta tttagttgac tataaaccac gtggcactcc cacaacttgg 60

cacaaattta ggaccaaact actcagtaaa gaagcgtttt cgaaaaccaa aagcaaagca 120

ttttcaaaca aaacaaaaca aaatcgagaa atggagaaaa aaaaccaaac gatggaacaa 180

agcgcctcca tcaatctctc aacaccaatc agatgcatcg tcaagctcgg gggggcagca 240

attacttgca agaatgaact agagacaata catgatgaaa acctcaagga ggtttcattg 300

cagctgaggg aatccatgaa tgtgcagtcg ccttctggca agattcttgg gatggattgg 360

agcaaaggag ctggagaatc agaaatttca tgcagcataa atgattttag tgctgtgcca 420

gcaatggatt ccagctcatt tattgttgtt cacggtgcag gttcttttgg gcactttcaa 480

gctagtaaat ctggggttca taaaggagga ctgaacaaac ctcttgtgaa ggctggtttt 540

gttgctacgc gcatttctgt tacaaagctc aatcatgaaa ttgttagagc tctagccaga 600

gagggtattc cttctattgg agtgtctcca ttttcatgtg gatggtcaac caatatgaga 660

aatatagctt cagctgactt atctgcaatg actaaggcta ttgattctgg ctttgtacct 720

gttacccatg gagatgctgt acttgatgat gaactgggat gcaccatact gagtggagat 780

gttatcatac gacatctggc agcacacttc aagcccgaat tcgtagtttt tatgacagat 840

gttcttgggg tatacgaccg accaccattg gatagcactg cagtgctgtt gagagaaatt 900

gaagtgcatg aagatgggag ctggtcagtt gtgaagccaa cacttgagaa cataagtaaa 960

gtgaaaacag atgtagcagc tcacgacaca acagggggca tggagaccaa gattttggaa 1020

gctgccatga ttgcaagact tgggatagat gtctacatag tcaaggcggg aacaaaccat 1080

tctttgaggg cattgcgtgg tgaattgaga ggcaatgttc ctgaagactg gcttgggaca 1140

gtaattcgat tttcaaaatg a 1161

<210> 8

<211> 386

<212> PRT

<213> Cannabis sativa

<400> 8

Met Ser Ser Arg Gln Glu Tyr Leu Val Asp Tyr Lys Pro Arg Gly Thr

1 5 10 15

Pro Thr Thr Trp His Lys Phe Arg Thr Lys Leu Leu Ser Lys Glu Ala

20 25 30

Phe Ser Lys Thr Lys Ser Lys Ala Phe Ser Asn Lys Thr Lys Gln Asn

35 40 45

Arg Glu Met Glu Lys Lys Asn Gln Thr Met Glu Gln Ser Ala Ser Ile

50 55 60

Asn Leu Ser Thr Pro Ile Arg Cys Ile Val Lys Leu Gly Gly Ala Ala

65 70 75 80

Ile Thr Cys Lys Asn Glu Leu Glu Thr Ile His Asp Glu Asn Leu Lys

85 90 95

Glu Val Ser Leu Gln Leu Arg Glu Ser Met Asn Val Gln Ser Pro Ser

100 105 110

Gly Lys Ile Leu Gly Met Asp Trp Ser Lys Gly Ala Gly Glu Ser Glu

115 120 125

Ile Ser Cys Ser Ile Asn Asp Phe Ser Ala Val Pro Ala Met Asp Ser

130 135 140

Ser Ser Phe Ile Val Val His Gly Ala Gly Ser Phe Gly His Phe Gln

145 150 155 160

Ala Ser Lys Ser Gly Val His Lys Gly Gly Leu Asn Lys Pro Leu Val

165 170 175

Lys Ala Gly Phe Val Ala Thr Arg Ile Ser Val Thr Lys Leu Asn His

180 185 190

Glu Ile Val Arg Ala Leu Ala Arg Glu Gly Ile Pro Ser Ile Gly Val

195 200 205

Ser Pro Phe Ser Cys Gly Trp Ser Thr Asn Met Arg Asn Ile Ala Ser

210 215 220

Ala Asp Leu Ser Ala Met Thr Lys Ala Ile Asp Ser Gly Phe Val Pro

225 230 235 240

Val Thr His Gly Asp Ala Val Leu Asp Asp Glu Leu Gly Cys Thr Ile

245 250 255

Leu Ser Gly Asp Val Ile Ile Arg His Leu Ala Ala His Phe Lys Pro

260 265 270

Glu Phe Val Val Phe Met Thr Asp Val Leu Gly Val Tyr Asp Arg Pro

275 280 285

Pro Leu Asp Ser Thr Ala Val Leu Leu Arg Glu Ile Glu Val His Glu

290 295 300

Asp Gly Ser Trp Ser Val Val Lys Pro Thr Leu Glu Asn Ile Ser Lys

305 310 315 320

Val Lys Thr Asp Val Ala Ala His Asp Thr Thr Gly Gly Met Glu Thr

325 330 335

Lys Ile Leu Glu Ala Ala Met Ile Ala Arg Leu Gly Ile Asp Val Tyr

340 345 350

Ile Val Lys Ala Gly Thr Asn His Ser Leu Arg Ala Leu Arg Gly Glu

355 360 365

Leu Arg Gly Asn Val Pro Glu Asp Trp Leu Gly Thr Val Ile Arg Phe

370 375 380

Ser Lys

385

Claims

1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述烯醇激酶基因包括下述的至少一个基因：

(1)ScCK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

(2)SeCK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述异戊烯基磷酸激酶基因包括下述的至少一个基因：

(1)AtIPK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

(2)CsIPK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

4.权利要求1-3任一所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，将所述烯醇激酶基因和所述异戊烯基磷酸激酶基因分别通过融合PCR的方式与启动子、终止子组合成表达框，再利用Gibson组装的方式与载体骨架连接，即得到重组质粒；

优选地，所述烯醇激酶基因的启动子为Gal1启动子；

优选地，所述异戊烯基磷酸激酶基因的启动子为Gal10启动子。

5.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株包含烯醇激酶基因和异戊烯基磷酸激酶基因；

优选地，所述重组菌株为酵母菌或大肠杆菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述烯醇激酶基因包括下述的至少一个基因：

(2)SeCK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

优选地，所述烯醇激酶作用的底物包括3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-2-丁烯醇。

7.根据权利要求权利要求5所述的重组菌株，其特征在于，所述异戊烯基磷酸激酶基因包括下述的至少一个基因：

(2)CsIPK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

优选地，所述异戊烯基磷酸激酶作用的底物包括异戊烯基单磷酸和二甲基丙烯基单磷酸。

8.权利要求1-3任一所述的重组质粒或权利要求5-7任一所述的重组菌株在萜类化合物生产中的应用。

9.一种利用重组菌株生产萜类化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

在培养基中培养权利要求5-7任一所述的重组菌株；加入烯醇底物；从所述培养基中分离所述萜类化合物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述烯醇底物选自3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-2-丁烯醇中的一种或两种；

优选地，所述底物添加的时间为培养基中重组菌株的OD600为4～5；

优选地，所述烯醇底物为3-甲基-3-丁烯-1-醇和3-甲基-2-丁烯醇时，其摩尔比为3-甲基-3-丁烯-1-醇：3-甲基-2-丁烯醇＝3：1。