CN111349638A - 构建包含大片段反向互补序列载体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种构建包含大片段反向互补序列载体的方法：把包含大片段反向互补的目标序列分成两个无反向互补序列的片段(片段1和片段2)，基因合成这两个片段，在每个片段的两端加上TypeIIS酶切位点；经过酶切后片段1和片段2及目标载体间能够产生互补的粘性末端，经连接和转化可得到包含大片段反向互补序列的阳性克隆。此方法能够有效解决包含大片段反向互补序列载体构建的难题，具有重要意义。

Description

构建包含大片段反向互补序列载体的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种构建包含大片段反向互补序列载体的方法。

背景技术

普通分子生物学实验中经常涉及构建DNA质粒载体，在构建质粒载体过程中，经常遇到目标DNA片段包含大片段的反向互补序列(如构建长双链RNA前体载体)(>100bp)，反向互补序列可以形成发夹结构，从而增加载体构建的难度。当前基因合成是构建DNA载体的重要途经之一，如果需要合成的DNA中包含大片段反向互补序列，进行基因合成难度大，不可行。构建这类载体，通常会采用普通的酶切/连接的方法，先将一个片段放入载体中，再将第二个片段(与已插入的片段形成反向互补结构)插入质粒载体中。但是，这个方法耗时费力，成功率极低，经常出现插入第二个片段后没有阳性克隆生长的情况。另一方面，采用同源重组的方法，因为反向同源序列的存在影响同源重组的过程。因此，如何快速构建包含大片段反向互补序列的载体，是分子生物学操作中经常遇到的难题。

References

Engler C,Gruetzner R,Kandzia R,Marillonnet S.Golden gate shuffling:aone-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.PLoS One,2009,vol.4pg.e5553

Cermak T,Doyle EL,Christian M,Wang L,Zhang Y,Schmidt C,Baller JA,Somia NV,Bogdanove AJ,Voytas DF.Efficient design and assembly of custom TALENand other TAL effector-based constructs for DNA targeting.Nucleic AcidsRes.2011Jul；39(12):e82

发明内容

本发明提供一种快速构建包含大片段反向互补序列载体的方法，能够有效解决构建包含大片段反向互补序列载体的难题，具有重要意义。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种构建包含大片段反向互补序列的方法，其中反向互补序列跨度大于或等于100bp，反向互补序列同源性大于或等于50％，该方法包括以下步骤：

S1：序列分割：把目标序列分解成两个无反向互补序列的片段：片段1，片段2，在每个片段的两端均设计为包含Type IIS酶切位点；基因合成这两个片段。

S2：酶切/连接反应：将片段1和片段2和/或克隆载体用type IIS内切酶进行酶切/连接反应，经酶切后，片段1，片段2和克隆载体能够产生互补的粘性末端，连接反应后片段1，片段2和克隆载体通过粘性末端结合在一起，获得连接产物。

进一步地，上述酶切和连接反应在同一反应体系中进行。

进一步地，上述步骤S2中还包括加热使酶失活的步骤。

进一步地，上述步骤S1中分解成两个无反向互补序列的片段中，分解位点位于两个反向互补序列之间任何两个相邻碱基位点之间。

进一步地，上述酶切反应温度为25℃-58℃，连接反应温度为4℃-24℃。

进一步地，本发明的方法还包括：

S3：转化：将连接产物转化至感受态细胞，将感受细胞在平板培养基中进行抗生素筛选。

优选地，上述步骤S1中Type IIS酶是BsaI、BmsBI、BbsI或SpaI。

优选地，上述步骤S2连接酶为T4连接酶。

本发明的有益效果是：本发明采用type IIS酶切连接系统，可快速成功构建包含大片段反向互补序列的载体。本发明公布的方法可操作性强，所需时间短，阳性率高且易掌握等特点，具有重大应用价值。

附图说明

图1A-1B显示了本发明一个实施例合成的包含大片段反向互补序列的目标片段；

图2显示了本发明实施例的酶切连接反应示意图；

图3为本发明实施例1的电泳结果图片；

图4A-4B显示了本发明另一个实施例合成的包含大片段反向互补序列的目标片段；

图5为本发明实施例2的电泳结果图片鉴定图片。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员理解，下面将结合附图和具体实施例对本发明进行进一步描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种包含大片段反向互补序列载体构建的方法，主要包括以下步骤：

1.包含大片段反向互补序列的分割：把包含2个大片段反向互补的目标序列分成两个无反向互补序列的片段(片段1和片段2)，基因合成这两个片段，在两端加上typeIIS酶切位点(如BsaI或BmsBI位点)；经过酶切后片段1和片段2能够产生互补的粘性末端，使不同片段的末端可以依次相连，其中在分解时两个可以互补的序列保持完整，分解的位点可以为两个互补序列之间的序列中的任何位点。

2.酶切/连接反应：将合成的两个互补序列和/或载体序列(可以包括克隆载体，也可以不包括克隆载体，即分两步处理)酶切后连接在一起。具体地，将克隆载体100ng，片段1取100ng，片段2取100ng，加入T4连接酶0.4ul，type IIS内切酶，酶切/连接缓冲液及灭菌水一共10ul,在PCR仪上进行酶切/连接反应。经过3-6个酶切/连接循环反应后，85℃加热使酶失活。

3.转化：取5ul步骤2获得的连接产物，转化至感受态细胞；将感受细胞在平板中进行抗生素筛选；

4.阳性克隆鉴定：在平板中挑起5-8个单菌落，通过PCR进行阳性克隆鉴定；

5.质粒提取：将阳性菌过夜培养，提取质粒备用。

本发明实施例使用了Type IIS内切酶，该内切酶是一类较为特殊的内切酶，它们在识别位点下游的特定位置切割DNA，产生4个碱基的粘性末端。因为识别位点与酶切位点分离，酶切后产生的粘性末端可以人为设计。多个DNA片段经一种Type IIS酶切后，可以产生多个人为设计的粘性末端，不同DNA片段可以通过粘性末端的互补连接在一起，这种克隆技术被称为Golden Gate连接法(Engler et al.,2008)。这种方法跟传统的酶切/连接方法相比，具有以下特点：1.同一酶切反应可产生多种不同粘性末端；2.对多个片段同时进行酶切产生互补的粘性末端；3.酶切/连接反应可在同一试管中进行。在本发明中，我们首次采用Golden Gate连接法成功构建了包含大片段反向重复序列的载体，能够有效解决构建包含大片段反向互补序列载体的难题，具有重要意义。

本文所描述的“无反向互补序列”是指整个序列长度中自身不会形成发卡结构，本发明实施例中该序列长度大于或等于100bp。

具体地，目标载体中包含反向互补序列；反向互补序列区域>50bp；反向互补序列碱基的配对率在50％-100％之间，因此其跨度(从第一个碱基至最后一个碱基的长度)可以大于或者等于100bp；大片段反向互补序列可以分割成N个小段(N≥2)进行基因合成；各片段的两端包含type IIS酶切位点；type IIS酶除BsaI和BmsBI外，还包含BbsI,SpaI等；除基因合成外，也可采用其他方法如PCR扩增获得目标片段。

具体地，目标载体中包含type IIS酶切位点；酶切与连接反应同时进行；反应中设定的酶切温度在25℃-58℃之间，连接温度4℃-24℃都在本专利的保护范围。其他参数如片段浓度，酶浓度等都可在一定范围内变动。

以下通过具体实施例对本发明进行进一步详细阐述。

实施例1

本实施例提供一种包含大片段反向互补序列载体的构建方法，包括以下步骤：

1.包含大片段反向互补序列的分割：如附图1A-1B所示，本实施例中需要构建的片段(目标片段1：SEQ ID NO.1)包含516bp反向互补序列(图1A中两个下划线部分，中间加粗字体部分为不互补的序列，每个下划线部分长度为516bp)。首先我们将序列分成两个无反向互补序列的片段(F1-1(SEQ ID NO.2)和F1-2(SEQ ID NO.3)，图1B中下划线部分之间的序列为目标序列)。在苏州某基因合成公司分别合成这两个片段，并在片段的两端加上BsaI酶切位点(附图1A-1B，图1A包含大片段反向互补序列的两个片段，这两个片段可以形成不同程度碱基匹配的发夹结构。图1B为包含大片段反向互补序列的目标片段F1-1和F1-2，其中互补序列在两个下划线部分之间，并在每个序列的两端添加BsaI酶切位点(背景灰色标识)。图1B中dr274(SEQ ID NO.4)为载体。经BsaI酶切后，F1-1，F1-2和dr274载体(该骨架载体包含两个BsaI酶切位点)能够产生互补的粘性末端(下滑线标识)。

2.酶切/连接反应：如图2所示，通过酶切/连接反应，载体、第1片段(F1-1)和第2片段(F1-2)可以依次连接组装在一起。

将合成的片段连接至目标dr274载体中，10ul反应体系如下：

在PCR仪上进行酶切/连接反应，反应条件如下:

(1).37℃,20min

(2).16℃,20min

以上循环数为6个；

(3).50℃,30min

(4).85℃,5min，使酶失活；

(5).12℃反应终止。

3.转化：取5μl步骤2制得的连接产物加入已制备好的感受态菌液中，混匀后在冰上放置20min；42℃水浴1.5min后冰上放置5～10min；加入500μl LB，150rpm振荡培养1h；室温下10,000×g离心1min后吸掉400μl LB，用枪头吸打重悬管底的沉菌。吸打混匀后在超净工作台均匀涂布于Kan⁺LB固体培养平板上。37℃培养1h后，翻转平板继续倒置培养12～16h。平板保存于4℃。

4.阳性克隆鉴定：在平板中挑起5-8个单菌落，通过PCR进行阳性克隆鉴定；PCR反应体系如下表所示：

PCR反应条件：1)95℃,3min；2)95℃,15s；52℃,15s；72℃,30s；40个循环；3)72℃,10min；12℃,保持恒温。将10μl PCR产物在预先制好的1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，根据电泳结果判定阳性克隆。

5.质粒提取：将步骤4鉴定的阳性单菌落接种至5～6ml kan⁺LB液体培养基中，37℃200rpm培养12～16h；室温下多次10,000×g离心(<30s)收集沉菌；加入solution I 250μl，振荡使沉菌重悬；加入solution II 250μl，温和倒转4～6次，室温放置2min以完全裂解菌体；加入solution III，温和倒转至有白色絮状沉淀产生，室温16,000×g离心10min；小心转移上清于分离柱中，室温10,000×g离心1min；弃滤液，加入500μl HB buffer，室温10,000×g离心1min；弃滤液，加入700μl Wash buffer，室温静置2min，10,000×g离心1min；弃滤液，室温10,000×g离心1min以除去分离柱中残留的乙醇；转移分离柱至一新的1.5ml离心管中，加入25～50μl灭菌水，室温10,000×g离心1min，收集的滤液中即含有纯化的重组质粒DNA。测定OD260和OD280值以确定浓度以及质粒DNA纯度，其中OD260/280值约在1.8～2.0之间。

琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增目标片段1产物。挑起5个单克隆菌落对是否插入目标片段进行PCR鉴定，结果经为阳性，电泳结果如图3所示，。挑选两个菌落进行质粒提取，通过测序表明，构建质粒载体的序列正确。

实施例2

本实施例提供一种包含大片段反向互补序列载体的方法，包括以下步骤：

1.包含大片段反向互补序列的分割：如附图4A和4B所示，需要构建的片段(目标片段2：SEQ ID NO.5)包含609bp反向互补序列。首先我们将序列分成两个无反向互补序列的片段(F2-1：SEQ ID NO.6和F2-2：SEQ ID NO.7，见图4B，其中F2-1包括一段没有互补序列的结构，F2-2序列在F2-1中都有对应的互补序列)。在苏州某基因合成公司分别合成这两个片段，并在片段的两端加上BmsBI酶切位点(图4B)包含大片段反向互补序列的目标片段2。将目标序列分成两段，并在每个序列的两端添加BmsBI酶切位点(背景灰色标识)。经BmsBI酶切后，F1-1，F1-2和pCS2_TALEN_KKR载体(该骨架载体包含两个BmsBI酶切位点)能够产生互补的粘性末端(下滑线标识)。

2.酶切/连接反应：将步骤1合成的片段连接至目标pCS2_TALEN_KKR载体(SEQ IDNO.8)中，10ul连接反应体系如下：

在PCR仪上进行酶切/连接反应:

(1).37℃,20min；

(2).16℃,20min；

以上循环数为6个；

(3).50℃,30min

(4).85℃,5min

(5).12℃反应终止

转化、阳性克隆鉴定及质粒提取等常规分子生物学实验步骤参照实施例1。

结果鉴定：在挑起的5个单菌落中，PCR鉴定全部为阳性克隆(见图5)。挑选两个菌落进行质粒提取，经测序表明构建质粒载体的序列正确。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)方法简单易操作

本发明采用的方法是常规分子生物学都能够掌握的，简单易行易推广。

(2)时间短，效率高

本发明仅需要一次酶切连接/连接，在3天内完成实验。其单菌落的阳性率接近100％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不能限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 深圳市泽龙生物技术有限公司

<120> 构建包含大片段反向互补序列载体的方法

<130> 20I0039CN

<141> 2020-03-17

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1051

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcttgccac aatcgacggt cgtattgctg gtccgcaagc caaggcaaag agccgcgagc 60

acataacacc taagatgcgc aaagtggcta gggacttcgt gcaccatctg gtgccgattg 120

ccggtacggg ccgtccctac cccctcacgt atgtcgagga gcagcagacc aagccgttac 180

agcgggctcg gaatgatgct aaccgatatc acgatgagtt tactatgaag ggcaaagcgt 240

tccaaaagaa agaagcatac aacgccccaa actaccccag gaacatttca accgttccgc 300

acacccaaaa cgtcaagttg tccagctaca cctacgcttt caaagccagt gttctccagc 360

atgttccgtg gtacatgcca acgcacacac cagcggaaat cgctgacgca gtgcaaaact 420

tggccgcaag ttccactgag ctggtcgaaa ctgactacag caagttcgat ggcacattct 480

tgcgcttcat gcgtgagtgc gtcgaatttg ccatttcttg agtggagaga gagagaaatg 540

gcaaattcga cgcactcacg catgaagcgc aagaatgtgc catcgaactt gctgtagtca 600

gtttcgacca gctcagtgga acttgcggcc aagttttgca ctgcgtcagc gatttccgct 660

ggtgtgtgcg ttggcatgta ccacggaaca tgctggagaa cactggcttt gaaagcgtag 720

gtgtagctgg acaacttgac gttttgggtg tgcggaacgg ttgaaatgtt cctggggtag 780

tttggggcgt tgtatgcttc tttcttttgg aacgctttgc ccttcatagt aaactcatcg 840

tgatatcggt tagcatcatt ccgagcccgc tgtaacggct tggtctgctg ctcctcgaca 900

tacgtgaggg ggtagggacg gcccgtaccg gcaatcggca ccagatggtg cacgaagtcc 960

ctagccactt tgcgcatctt aggtgttatg tgctcgcggc tctttgcctt ggcttgcgga 1020

ccagcaatac gaccgtcgat tgtggcaagc t 1051

<210> 2

<211> 559

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagggtctcc taggagcttg ccacaatcga cggtcgtatt gctggtccgc aagccaaggc 60

aaagagccgc gagcacataa cacctaagat gcgcaaagtg gctagggact tcgtgcacca 120

tctggtgccg attgccggta cgggccgtcc ctaccccctc acgtatgtcg aggagcagca 180

gaccaagccg ttacagcggg ctcggaatga tgctaaccga tatcacgatg agtttactat 240

gaagggcaaa gcgttccaaa agaaagaagc atacaacgcc ccaaactacc ccaggaacat 300

ttcaaccgtt ccgcacaccc aaaacgtcaa gttgtccagc tacacctacg ctttcaaagc 360

cagtgttctc cagcatgttc cgtggtacat gccaacgcac acaccagcgg aaatcgctga 420

cgcagtgcaa aacttggccg caagttccac tgagctggtc gaaactgact acagcaagtt 480

cgatggcaca ttcttgcgct tcatgcgtga gtgcgtcgaa tttgccattt cttgagtgga 540

gagagagagc gagaccctt 559

<210> 3

<211> 544

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagggtctcc agagaaatgg caaattcgac gcactcacgc atgaagcgca agaatgtgcc 60

atcgaacttg ctgtagtcag tttcgaccag ctcagtggaa cttgcggcca agttttgcac 120

tgcgtcagcg atttccgctg gtgtgtgcgt tggcatgtac cacggaacat gctggagaac 180

actggctttg aaagcgtagg tgtagctgga caacttgacg ttttgggtgt gcggaacggt 240

tgaaatgttc ctggggtagt ttggggcgtt gtatgcttct ttcttttgga acgctttgcc 300

cttcatagta aactcatcgt gatatcggtt agcatcattc cgagcccgct gtaacggctt 360

ggtctgctgc tcctcgacat acgtgagggg gtagggacgg cccgtaccgg caatcggcac 420

cagatggtgc acgaagtccc tagccacttt gcgcatctta ggtgttatgt gctcgcggct 480

ctttgccttg gcttgcggac cagcaatacg accgtcgatt gtggcaagct gtttcgagac 540

cctt 544

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatttctagc tctaaaactg agaccctctc tcggtctctc ctatagtgag tcgtattagc 60

tagcgg 66

<210> 5

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatctttctt tcactctttc ggtcgtgtcg gccatcctcg ccatcactgc tgtgattgct 60

gtatttattg tgatttttag gtatcacaac actgtgacca agaccatcga aacccgcaca 120

gacaatatcg agacaaacat tgattaaaac ctccgcattc ctgtgactgc tgaggttgga 180

tcaggctact tcaagattac tgatttgtcc tttgacagcg acaccttggg caaaatcaag 240

atccgcaatt gaaagtctga tgcacagatg aaggaagaag atgcggatct tgtcatcact 300

cccgtggagg gccgagcact cgaagtgact gtggggcaga atctcacctt tgagggaaca 360

ttcaaggtgt ggaacaacac atcaagaaag atcaacatca ctggtatgca gatggtgcca 420

aagattaacc catcaaaggc ctttgtcggt agctccaaca cctcctcctt cacccccgtc 480

tctattgatg aggatgaagt tggcaccttt gtgtgtggta ccacctttgg cgcaccaatt 540

gcagctaccg ccggtggaaa tcttttcgac atgtacgtgc acgtcaccta ctctggcact 600

gagaccgagt tcaagagatt caagagattc aagagatcaa ggattcagag attcaggctc 660

ggtctcagtg ccagagtagg tgacgtgcac gtacatgtcg aaaagatttc caccggcggt 720

agctgcaatt ggtgcgccaa aggtggtacc acacacaaag gtgccaactt catcctcatc 780

aatagagacg ggggtgaagg aggaggtgtt ggagctaccg acaaaggcct ttgatgggtt 840

aatctttggc accatctgca taccagtgat gttgatcttt cttgatgtgt tgttccacac 900

cttgaatgtt ccctcaaagg tgagattctg ccccacagtc acttcgagtg ctcggccctc 960

cacgggagtg atgacaagat ccgcatcttc ttccttcatc tgtgcatcag actttcaatt 1020

gcggatcttg attttgccca aggtgtcgct gtcaaaggac aaatcagtaa tcttgaagta 1080

gcctgatcca acctcagcag tcacaggaat gcggaggttt taatcaatgt ttgtctcgat 1140

attgtctgtg cgggtttcga tggtcttggt cacagtgttg tgatacctaa aaatcacaat 1200

aaatacagca atcacagcag tgatggcgag gatggccgac acgaccgaaa gagtgaaaga 1260

aagatc 1266

<210> 6

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcgtctcg ctgggatctt tctttcactc tttcggtcgt gtcggccatc ctcgccatca 60

ctgctgtgat tgctgtattt attgtgattt ttaggtatca caacactgtg accaagacca 120

tcgaaacccg cacagacaat atcgagacaa acattgatta aaacctccgc attcctgtga 180

ctgctgaggt tggatcaggc tacttcaaga ttactgattt gtcctttgac agcgacacct 240

tgggcaaaat caagatccgc aattgaaagt ctgatgcaca gatgaaggaa gaagatgcgg 300

atcttgtcat cactcccgtg gagggccgag cactcgaagt gactgtgggg cagaatctca 360

cctttgaggg aacattcaag gtgtggaaca acacatcaag aaagatcaac atcactggta 420

tgcagatggt gccaaagatt aacccatcaa aggcctttgt cggtagctcc aacacctcct 480

ccttcacccc cgtctctatt gatgaggatg aagttggcac ctttgtgtgt ggtaccacct 540

ttggcgcacc aattgcagct accgccggtg gaaatctttt cgacatgtac gtgcacgtca 600

cctactctgg cactgagacc gagttcaaga gattcaagag attcaagaga tcaaggattc 660

agagattcag gcgagacgct t 681

<210> 7

<211> 637

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagcgtctcg caggctcggt ctcagtgcca gagtaggtga cgtgcacgta catgtcgaaa 60

agatttccac cggcggtagc tgcaattggt gcgccaaagg tggtaccaca cacaaaggtg 120

ccaacttcat cctcatcaat agagacgggg gtgaaggagg aggtgttgga gctaccgaca 180

aaggcctttg atgggttaat ctttggcacc atctgcatac cagtgatgtt gatctttctt 240

gatgtgttgt tccacacctt gaatgttccc tcaaaggtga gattctgccc cacagtcact 300

tcgagtgctc ggccctccac gggagtgatg acaagatccg catcttcttc cttcatctgt 360

gcatcagact ttcaattgcg gatcttgatt ttgcccaagg tgtcgctgtc aaaggacaaa 420

tcagtaatct tgaagtagcc tgatccaacc tcagcagtca caggaatgcg gaggttttaa 480

tcaatgtttg tctcgatatt gtctgtgcgg gtttcgatgg tcttggtcac agtgttgtga 540

tacctaaaaa tcacaataaa tacagcaatc acagcagtga tggcgaggat ggccgacacg 600

accgaaagag tgaaagaaag atctacgcga gacgctt 637

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcgaattcg tatgagacgc ttaggtcagc gtgcgtctca ccagatggca gg 52

Claims (8)

1.一种构建包含大片段反向互补序列的方法，其中反向互补序列跨度大于或等于100bp，反向互补序列同源性大于或等于50％，该方法包括以下步骤：

S1：序列分割：把目标序列分成两个无反向互补序列的片段：片段1，片段2，在每个片段的两端均设计为包含Type IIS酶切位点，合成这两个片段；

S2：酶切/连接反应：将片段1和片段2和/或克隆载体用type IIS内切酶进行酶切，然后用连接酶进行连接，得到连接产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，酶切和连接反应在同一反应体系中进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中还包括加热使酶失活的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中分解成两个无反向互补序列的片段中，分解位点位于两个反向互补序列之间任何两个相邻碱基位点之间。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶切反应温度为25℃-58℃，连接反应温度为4℃-24℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：

S3：转化：将步骤S2获得的包括克隆载体的连接产物转化至感受态细胞，将感受细胞在平板培养基中进行抗生素筛选。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中Type IIS酶是BsaI、BmsBI、BbsI或SpaI。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤S2中连接酶为T4连接酶。

Images