CN103194477A

CN103194477A - 一种融合型原核表达载体及其构建方法和应用

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Publication number: CN103194477A
Application number: CN2013101199183A
Authority: CN
Inventors: 华权高; 马峰; 沈鹤霄; 舒芹; 易汪雪
Original assignee: CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Current assignee: CUSABIO BIOTECH Co Ltd
Priority date: 2013-04-08
Filing date: 2013-04-08
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2033-04-08
Also published as: CN103194477B

Abstract

本发明公开了一种融合型原核表达载体及其构建方法和应用，包括：启动子、纯化标签基因、蛋白酶切割位点、多克隆位点和终止子；其中，在纯化标签基因和蛋白酶切割位点之间连接有β2微球蛋白基因。本发明融合型原核表达载体中带有β2微球蛋白（β2M）基因，将不易表达的外源蛋白连接在β2M基因的下游，使表达载体在表达不易表达的外源蛋白时能充分利用β2M基因的优良特性，使外源蛋白在宿主细胞中高效表达，且利于后期目标蛋白的复性及分离纯化。此外，本发明融合型原核表达载体中带有纯化标签和酶切位点，也有利于蛋白表达完成之后的分离纯化，也有利于纯化标签以及β2M蛋白的去除，获得更加接近天然序列的目的蛋白。

Description

一种融合型原核表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种表达载体，尤其涉及一种融合型原核表达载体及其构建方法，本发明进一步涉及该融合型原核表达载体在表达外源蛋白中的应用，属于融合型原核表达载体领域。

背景技术

自1983年人免疫缺陷病毒（HIV-1）首次从一个全身淋巴结肿大的病人体内分离出来以来，在对病毒生活周期以及HIV-1编码的九个基因的功能意义的理解上已经取得了巨大的进步。大量的注意力被放在了HIV-1的四个开放读码框Vif，Vpr，Vpu和Nef上。这些基因最初被称为附属基因，这些基因产物共同调节宿主细胞生理来利于病毒复制，它们在HIV-1的致病机制中起很大的作用，特别是Vpr蛋白的表达，它导致细胞周期G2期阻滞和细胞凋亡。

人免疫缺陷病毒（HIV-1）的病毒蛋白R（Vpr）含有96个氨基酸残基，分子量大约为14KD，在HIV-1，HIV-2，SIV中高度保守。Vpr对AIDS的致病机理极其重要，研究表明Vpr在病毒复制过程中具有多种功能：1.影响反转录过程的准确性；2.作为前整合体复合物的一个组成部分参与病毒DNA转运至细胞核；3.使被感染细胞的繁殖周期发生G2期阻滞；4.诱导病毒被感染细胞的凋亡；5.与宿主基因共同反式激活HIV-1长末端重复序列（Long terminal reprat,LRT）。因此，研究HIV病毒的Vpr蛋白对于艾滋病的致病以及发病和后期的治疗具有一定的意义。

β2微球蛋白（β₂M）基因编码的是一个只有99个氨基酸组成的小分子蛋白质，现有大量的文献资料显示，该基因可以在大肠杆菌中高效表达，可达到总蛋白30%。迄今为止，没有文献报道将难以表达的目的蛋白基因融合在β2微球蛋白基因的下游后进行表达能够提高目的蛋白在原核系统中的表达效率。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种融合型原核表达载体，该表达载体能够将不易表达的蛋白在原核系统中进行高效表达；

本发明的目的之一是提供一种构建所述融合型原核表达载体的方法；

本发明的目的之三是将所述融合型原核表达载体应用于在原核系统中表达外源蛋白。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种融合型原核表达载体，包括：启动子、纯化标签基因、蛋白酶切割位点、多克隆位点和终止子；其中，在纯化标签基因和蛋白酶切割位点之间连接有β2微球蛋白基因；纯化标签基因位于启动子的下游，多克隆位点位于蛋白酶切割位点和终止子之间。

所述β2微球蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

所述的启动子可以大肠杆菌表达体系中常用的启动子，例如可以是lac启动子、trp启动子、P₁启动子、由lac启动子-10区和trp启动子-35区融合形成的tac启动子或Tn5启动子等。

所述的纯化标签可以为his标签、avidin标签、t7标签或myc标签等，优选为his标签。

所述的蛋白酶切割位点的蛋白酶可以为PSP酶、肠激酶或凝血酶等，优选为PSP酶。

本发明的另一目的是提供一种构建所述融合型原核表达载体的方法，包括：（1）将纯化标签基因、β2微球蛋白基因、蛋白酶切割位点和多克隆位点依次连接在一起，得到融合基因：（2）将融合基因可操作的与原核表达载体的启动子和终止子连接在一起，即得；其中，融合基因序列位于原核表达载体的启动子下游。

其中，所述的原核表达载体可以是pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK、pBAD或pBV220等原核表达载体；优选为pET28a。

所述的融合基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了利用所述融合型原核表达载体生产外源蛋白的方法，该方法包括：将外源蛋白基因可操作的插入到上述融合型原核表达载体中得到含有外源蛋白基因的重组融合型原核表达载体，再将该重组融合型原核表达载体表达载体导入宿主细胞，获得重组菌株；培养重组菌株，诱导外源基因表达，收集表达产物，分离纯化，即得。

所述外源蛋白优选为不易表达的蛋白，尤其是多肽、小蛋白或毒性蛋白等，优选为HIV的Vpr蛋白；所述HIV的Vpr蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示。

所述的宿主细胞可以是大肠杆菌、芽孢杆菌、蓝藻、或衣藻等，优选为大肠杆菌BL21。

本发明融合型原核表达载体中带有β2M基因，将不易表达的外源蛋白连接在β₂m基因的下游，使表达载体在表达蛋白时能充分利用β2M基因的优良特性，使外源蛋白高效表达，并且利于后期目标蛋白的复性及分离纯化。同时本发明表达载体中带有的纯化标签和酶切位点，这也有利于蛋白表达完成之后的分离纯化，有利于纯化标签以及β2M蛋白的去除，获得更加接近天然序列的目的蛋白。

附图说明

图1为重组质粒pET-β2M的物理图谱。

图2为各表达载体在大肠杆菌中表达Vpr蛋白结果；A为阴性对照；B为表达载体pET-β2M-Vpr在大肠杆菌中表达Vpr蛋白；C、D为表达载体pET-Vpr在大肠杆菌中表达Vpr蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1含有β2M基因的表达载体pET-β2M的构建

1)合成以下带有His纯化标签、β2微球蛋白、肠激酶切位点、多克隆酶切位点的核苷酸序列：

CATCATCATCATCATCATATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGACGACGACGAC AAGGGATCCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGC（SEQ ID No.2）

2)在引物1：5’GTACCCATGGGCCATCATCATCATCATCATAT3'（下划线部分为Nco I识别位点）

引物2：5’GTACGCGGCCGCAAGCTTGTCGACGGAGCTCG3’（下划线部分为Not I识别位点）的引导下，以步骤1）中的序列为模板进行PCR，扩增得到带有NcoI和Not I的以下核苷酸序列：

GTACCCATGGGCCATCATCATCATCATCATATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTATGTGTCTGGGTTTCATCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTGAAGAATGGAGAGAGAATTGAAAAAGTGGAGCATTCAGACTTGTCTTTCAGCAAGGACTGGTCTTTCTATCTCTTGTACTACACTGAATTCACCCCCACTGAAAAAGATGAGTATGCCTGCCGTGTGAACCATGTGACTTTGTCACAGCCCAAGATAGTTAAGTGGGATCGAGACATGGACGACGACGACAAGGGATCCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCGTAC

3)将pET-28a(+)空载质粒，以及步骤2）得到的带有NcoI和Not I酶切位点的基因，分别用NcoI和Not I进行双酶切。回收大片段，用T4DNA连接酶连接，CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，用含100ug/ml卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，PCR法挑取阳性克隆，碱裂解法提取阳性克隆质粒，经基因测序鉴定，获得正确的克隆命名为pET-β2M。

实施例2含有HIV的Vpr蛋白基因及β2M基因的表达载体pET-β2M-Vpr的构建

1)合成以下Vpr基因序列

ATGGAACAAGCCCCAGAAGACCAAGGGCCACAGAGGGAGCCACACAATGAATGGACACTAGAGCTTTTAGAGGAGCTTAAGAATGAAGCTGTTAGACATTTTCCTAGGATTTGGCTCCATGGCTTAGGGCAACATATCTATGAAACTTATGGGGATACTTGGGCAGGAGTGGAAGCCATAATAAGAATTCTGCAACAACTGCTGTTTATCCATTTCAGAATTGGGTGTCGACATAGCAGAATAGGCGTTACTCAACAGAGGAGAGCAAGAAATGGAGCCAGTAGATCC（SEQ ID No.3）

2)以引物1:5’GTACGGATCCATGGAACAAGCCCCAGAAGA3’(下划线部分为BamH I识别位点)

引物2：5’GTACGCGGCCGCTTAGGATCTACTGGCTCCATTTC(下划线部分为Not I识别位点1)为引导，以步骤1）中的基因为模板，进行PCR，获得以下带有Bam H I和Not I识别位点的Vpr基因:

GTACGGATCCATGGAACAAGCCCCAGAAGACCAAGGGCCACAGAGGGAGCCACACAATGAATGGACACTAGAGCTTTTAGAGGAGCTTAAGAATGAAGCTGTTAGACATTTTCCTAGGATTTGGCTCCATGGCTTAGGGCAACATATCTATGAAACTTATGGGGATACTTGGGCAGGAGTGGAAGCCATAATAAGAATTCTGCAACAACTGCTGTTTATCCATTTCAGAATTGGGTGTCGACATAGCAGAATAGGCGTTACTCAACAGAGGAGAGCAAGAAATGGAGCCAGTAGATCCTAAGCGGCCGCGTAC

3)将实施例1中获得的pET-β2M质粒以及步骤2）中获得带有BamH I和Not I酶切位点的Vpr基因，分别用Bam H I和Not I进行双酶切。回收大片段，用T₄DNA连接酶连接，CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，用含100ug/ml卡那霉素的LB固体培养基进行筛选，PCR法挑取阳性克隆，碱裂解法提取质粒，经基因测序鉴定正确的表达质粒命名为pET-β2M-Vpr。

实施例3HIV的Vpr蛋白的表达及分离纯化

1）将实施例2中获得的表达质粒pET-β2M-Vpr，采用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21，用含100ug/ml卡那霉素的LB固体培养基进行筛选。获得Vpr表达菌株，命名为pET-β2M-Vpr/BL21。

2）挑取单菌落，用含100ug/ml卡那霉素的LB液体培养基37℃，220rpm振荡培养16小时左右，1%的比例转接至新鲜的含100ug/ml卡那霉素的LB液体培养基37℃，220rpm振荡培养3小时左右至OD600≈0.6，加入IPTG至终浓度1mM，继续振荡培养3小时。

3）10000rpm4℃离心10分钟，收集菌体。PBS重悬菌体，离心10分钟收集菌体，用20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA重悬菌体，4℃超声破菌。4℃10000rpm离心，分别收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE电泳，结果表明，目的蛋白表达明显大菌体总蛋白10%以上，并且以包涵体沉淀形式存在。

4）包涵体沉淀用20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素充分溶解，16000rpm离心30分钟收集上清。镍离子亲和层析，咪唑梯度洗脱纯化包涵体。平衡缓冲为20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素。梯度洗脱缓冲分别为：A.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，20mM咪唑；B.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，60mM咪唑；C.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，100mM咪唑；D.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，200mM咪唑；E.200mMpH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，8M尿素，500mM咪唑。结果表明目的蛋白β2M-Vpr主要集中于200mM咪唑洗脱峰，纯度大于90%。

5）按照文献（张劲郭霭光丰美福人β2微球蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化的方法《西北农林科技大学学报：自然科学版》2006年第7期87-90页）进行复性。获得β2M-Vpr融合蛋白。用肠激酶酶对复性后的β2M-Vpr融合蛋白进行酶切，融合蛋白被充分切开。

6）酶切后的蛋白产物，进行镍离子螯合层析。平衡缓冲为20mMpH8.0Tris-HCl，5mM EDTA。梯度洗脱缓冲分别为：A.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，20mM咪唑；B.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，60mM咪唑；C.20mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，100mM咪唑；D.20mMpH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，200mM咪唑；E.200mM pH8.0Tris-HCl，5mM EDTA，500mM咪唑。结果表明目的蛋白his-β2M标签主要集中于200mM咪唑洗脱峰，Vpr蛋白主要位于流穿液中，流穿液中Vpr蛋白纯度大于90%。

7）SDS-PAGE胶验证流穿液中的Vpr蛋白，结果见附图2，从图2的结果可见，pET-β2M-Vpr表达载体在大肠杆菌中可高效表达Vpr蛋白。实施例4pET-β2M-Vpr表达载体与pET-Vpr表达载体在大肠杆菌中表达Vpr蛋白的差异

1）构建含有HIV的Vpr蛋白基因的表达载体pET-Vpr

pET-Vpr表达载体除了不含有β2M基因以外，其余与pET-β2M-Vpr完全相同，pET-Vpr表达载体构建方法参照实施例1和实施例2。

2）HIV的Vpr蛋白的表达及分离纯化

用构建好的pET-Vpr表达载体和pET-β2M-Vpr表达载体在大肠杆菌BL21中表达HIV的Vpr蛋白，实验方法同实施例3，实验结果见图2，从实验结果可见，采用带有β2M基因的表达载体pET-β2M-Vpr，其在大肠杆菌BL21中HIV的Vpr蛋白的表达产量要显著高于不含β2M基因的表达载体pET-Vpr的表达量。

<110> 武汉华美生物工程有限公司

<120> 一种融合型原核表达载体及其构建方法和应用

<130> XLB-0026

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 363

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 1

catcatcatc atcatcatat ccagcgtact ccaaagattc aggtttactc acgtcatcca 60

gcagagaatg gaaagtcaaa tttcctgaat tgctatgtgt ctgggtttca tccatccgac 120

attgaagttg acttactgaa gaatggagag agaattgaaa aagtggagca ttcagacttg 180

tctttcagca aggactggtc tttctatctc ttgtactaca ctgaattcac ccccactgaa 240

aaagatgagt atgcctgccg tgtgaaccat gtgactttgt cacagcccaa gatagttaag 300

tgggatcgag acatggacga cgacgacaag ggatccgagc tccgtcgaca agcttgcggc 360

cgc 363

<210> 2

<211> 363

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 2

catcatcatc atcatcatat ccagcgtact ccaaagattc aggtttactc acgtcatcca 60

gcagagaatg gaaagtcaaa tttcctgaat tgctatgtgt ctgggtttca tccatccgac 120

attgaagttg acttactgaa gaatggagag agaattgaaa aagtggagca ttcagacttg 180

tctttcagca aggactggtc tttctatctc ttgtactaca ctgaattcac ccccactgaa 240

aaagatgagt atgcctgccg tgtgaaccat gtgactttgt cacagcccaa gatagttaag 300

tgggatcgag acatggacga cgacgacaag ggatccgagc tccgtcgaca agcttgcggc 360

cgc 363

<210> 3

<211> 288

<212> DNA

<213> Human Immunodeficiency Virus

<400> 3

atggaacaag ccccagaaga ccaagggcca cagagggagc cacacaatga atggacacta 60

gagcttttag aggagcttaa gaatgaagct gttagacatt ttcctaggat ttggctccat 120

ggcttagggc aacatatcta tgaaacttat ggggatactt gggcaggagt ggaagccata 180

ataagaattc tgcaacaact gctgtttatc catttcagaa ttgggtgtcg acatagcaga 240

ataggcgtta ctcaacagag gagagcaaga aatggagcca gtagatcc 288

Claims

1.一种融合型原核表达载体，包括：启动子、纯化标签基因、蛋白酶切割位点、多克隆位点和终止子；其特征在于：在纯化标签基因和蛋白酶切割位点之间连接有β2微球蛋白基因；所述β2微球蛋白基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.按照权利要求1所述的融合型原核表达载体，其特征在于：纯化标签基因位于启动子的下游；多克隆位点位于蛋白酶切割位点和终止子之间。

3.按照权利要求1所述的融合型原核表达载体，其特征在于：所述的启动子是大肠杆菌表达体系中所用的启动子；优选的，所述的启动子是lac启动子、trp启动子、P₁启动子、由lac启动子-10区和trp启动子-35区融合形成的tac启动子或Tn5启动子。

4.按照权利要求1所述的融合型原核表达载体，其特征在于：所述的纯化标签为his标签、avidin标签、t7标签或myc标签。

5.按照权利要求1所述的融合型原核表达载体，其特征在于：所述的蛋白酶切割位点的蛋白酶为PSP酶、肠激酶或凝血酶。

6.一种构建权利要求1-5任何一项融合型原核表达载体的方法，包括：（1）将纯化标签基因、β2微球蛋白基因、蛋白酶切割位点和多克隆位点依次连接在一起，得到融合基因：（2）将融合基因可操作的与原核表达载体的启动子和终止子连接在一起，即得；其中，融合基因序列位于原核表达载体的启动子下游。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的原核表达载体是pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK、pBAD或pBV220；所述的融合基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

8.权利要求1-5任何一项融合型原核表达载体在生产外源蛋白的用途。

9.按照权利要求8所述的方法，其特征在于：将外源蛋白基因可操作的插入到所述融合型原核表达载体中得到含有外源蛋白基因的重组融合型原核表达载体表达载体，再将该重组融合型原核表达载体导入宿主细胞，获得重组菌株；培养重组菌株，诱导外源基因表达，收集表达产物，分离纯化，即得。

10.按照权利要求9所述的方法，其特征在于：所述外源蛋白为多肽、小蛋白或毒性蛋白，优选为人免疫缺陷病毒的Vpr蛋白；所述的宿主细胞是大肠杆菌、芽孢杆菌、蓝藻或衣藻，优选为大肠杆菌BL21。