CN1283802C - 一种新型重组腺病毒及其在恶性肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种表达人表皮生长因子受体反义RNA的重组腺病毒及其在恶性肿瘤治疗中的应用。该重组腺病毒本身不但可抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管生成，而且还可增加放射线对肿瘤细胞的杀灭作用。据此认为：该类重组腺病毒在肿瘤的基因治疗中具有良好的临床应用前景。

Description

一种新型重组腺病毒及其在恶性肿瘤治疗中的应用

本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种表达人表皮生长因子受体(EGFR)反义RNA的重组腺病毒及其在恶性肿瘤治疗中的应用。

恶性肿瘤随着人口老龄化和社会工业化程度的提高而上升，在发达国家及我国一些大城市已成为第一、二位致死性疾病。虽然外科手术、放疗及化疗作为恶性肿瘤的常规治疗手段仍在不断发展，但常不能治愈肿瘤，且其疗效已基本达到极限，因而迫切需要开发新的治疗手段。基因治疗在基因水平上对治疗疾病，近年来逐步成熟，国际上已广泛进入临床试验，是一种很有发展前景的治疗手段。研究表明，恶性肿瘤的发生是环境因素与遗传因素相互作用，导致基因变异所产生的效果积累起来的结果。肿瘤的基因治疗就是以一定的基因转移方法将外源遗传物质转移到肿瘤细胞中，达到治疗肿瘤的目的。目前国际上被批准的基因治疗研究中60％以上针对恶性肿瘤，所涉及的基因范围和治疗策略很广泛，可分为免疫治疗、直接杀灭或抑制肿瘤细胞、改善肿瘤化疗疗效及抗肿瘤血管生成几方面。

EGFR为一170kD大小具有酪氨酸激酶活性的膜受体，由1186个氨基酸残基组成，其中621个氨基酸组成胞外区，23个氨基酸构成的跨膜区，剩余的542个氨基酸构成胞内区。在实验研究中，EGFR的超量表达可使正常细胞转化为恶性细胞，而且这种转化取决于表皮生长因子受体数量，并同时伴随着其配体的表达。EGFR的表达在如肺、头颈、消化道、泌尿生殖道等多种表皮来源恶性肿瘤和最常见的脑瘤—胶质瘤的发生与发展中起着重要作用(Ciardiello F，Tortora G.Clin Cancer Res，2001，7：2958-2970；Slichenmyer WJ，Fry DW.Semin Oncol，2001，28(suppl 16)：67-79)，不但是很多恶性肿瘤的不良愈后因素，而且伴随着肿瘤放疗抗拒能力的提高(Pawlowski V，et al.Clin Cancer Res，2000，6：4217-4225；AkimotoT，et al.Clin Cancer Res，1999，5：2884-2890)。因而EGFR作为肿瘤治疗的新靶点倍受关注。

针对EGFR有单克隆抗体、特异性酪氨酸激酶抑制剂等多种抑制手段。反义(antisense)战略也是其中之一，其特点为直接作用于靶基因mRNA，有特异性强、效率高、毒副作用小等优点。但存在的问题是传统的反义寡核苷酸难以有效地通过细胞膜进入细胞内发挥作用，严重地阻碍了此技术用于体内实验及其进一步的潜在临床应用(Ma L，Calvo F.FundamClin Pharmacol，1996，5：97-115)。发明人曾以EGFR反义RNA表达载体转染乳腺癌细胞，发现对肿瘤生长的抑制可达80％以上(Ma L，et al.Int J Cancer，1998，78：112-119)。本发明所涉及的表达EGFR反义RNA的重组腺病毒将反义战略特异性强、效率高、毒副作用小的优点与腺病毒对上皮性恶性肿瘤细胞的高感染效率的特点相结合，避免了反义寡核苷酸的弱点。

本发明具体实施方案如下：

1.将在巨细胞病毒(CMV)立即-早期启动子驱动下的反向人EGFR A64-1 cDNA片段(UllrichA，et al.Nature，.1984，309：418-425)及聚腺苷酸化信号序列重组进E1区和E3区缺失的Ad5腺病毒载体中获得重组腺病毒。发明人曾以含有同一EGFR反义RNA表达盒的真核细胞表达质粒转染乳腺癌细胞后，将肿瘤细胞的体内生长抑制80％以上(Ma L，et al.Int JCancer，1998，78：112-119)。因为E3区编码蛋白抑制细胞毒性T细胞介导的免疫反应及细胞因子介导的凋亡，所以为了不降低基因治疗的疗效而选择了E3区缺失的腺病毒载体(Windheim M，et al.Curr Top Microbiol Immunol，2004，273：29-85)。

2.观察到重组腺病毒可有效地进入肿瘤细胞。

3.观察到EGFR反义RNA在肿瘤细胞中表达。

4.观察到EGFR蛋白在肿瘤细胞和人微血管内皮细胞中的表达被抑制。

5.观察到肿瘤细胞的体外和体内生长以及人微血管内皮细胞的体外生长被抑制。

6.观察到重组腺病毒诱导肿瘤细胞凋亡的作用。

7.观察到重组腺病毒对肿瘤新生血管的抑制作用。

8.观察到重组腺病毒增强放射线杀伤肿瘤细胞的作用。

本发明提供一种表达EGFR反义RNA的重组腺病毒，不但可以以液体形式被配成注射液、滴液、喷雾液、涂抹液等用于恶性肿瘤或恶性肿瘤术后瘤床的治疗，还可与其他非手术疗法联合应用，其肿瘤类型可以是乳腺癌，非手术疗法可以是放疗。实施例将通过EGFR反义重组腺病毒对乳腺癌的基因治疗作用进一步阐述本发明。

由于EGFR在多种恶性肿瘤的发生和发展中起着关键作用，若本发明得以应用，不但将为肿瘤治疗提供一种新的治疗策略，而且具有广泛的临床应用价值。

结合附图进一步说明本发明：

图1.EGFR反义重组腺病毒AdE5的构建

图2.以RNA酶保护实验检测感染了AdE5重组腺病毒的MDA-MB-231细胞(1)，感染了AdE5(2)、AdCO1(3)或PBS处理(4)的MDA-MB-468细胞中EGFR反义RNA的表达。EGFR反义RNA片段被EGFR正义核酸探针保护(箭头)。以GAPDH反义核酸探针保护GAPDH RNA片段作为内对照。

图3.以Western印迹杂交实验检测10μg(MDA-MB-468细胞)及25μg(MDA-MB-231或HMEC-1细胞)全细胞蛋白中EGFR的表达水平。

图4.(A)重组腺病毒对体外贴壁生长的MDA-MB-468细胞增殖的影响。(B)EGF及重组腺病毒对体外贴壁生长的HMEC-1细胞增殖的影响。

图5.AdE5抑制乳腺癌细胞的体内生长。(A)MDA-MB-481肿瘤，(B)MDA-MB-231肿瘤(每组10只裸鼠)。

图6.重组腺病毒感染MDA-MB-468细胞后检测聚(ADP-核糖)聚合酶活性。

图7.TUNEL实验检测重组腺病毒对体外生长的MDA-MB-468细胞(A～E)及肿瘤细胞凋亡的诱导(f～G)。(A)无病毒，(B)AdCO1 50pfu/细胞，(C)AdCO1 100pfu/细胞，(D)AdE550pfu/细胞，(E)AdE5 100pfiu/细胞。(F)AdCO1，(G)AdE5 10⁹pfu/肿瘤。(×10)图8.肿瘤内(A)PBS(n＝5)，(B)AdCO1(n＝3)，(C)AdE5(n＝4)注射后MDA-MB-231肿瘤新生血管研究。新生血管采用抗肌动朊抗体标记成棕色(×10)。

图9.以MDA-MB-231细胞克隆形成实验研究AdE5对γ射线的增敏作用。A.重组腺病毒剂量为150pfu/细胞；B.重组腺病毒剂量为300pfu/细胞。

图10.以γ射线联合重组腺病毒对MDA-MB-231细胞周期分布的影响。

实施例：EGFR反义重组腺病毒及其对乳腺癌的基因治疗作用

1.EGFR反义重组腺病毒AdE5的构建(图1)

(a)将EGFR A64-1 EcoRI酶解cDNA片段反向插入pCDNA 3载体(InvitrogenCorporation公司)中获得EGFR AS质粒，其中含EGFR反义RNA表达盒。该表达盒依次包括：巨细胞病毒(CMV)立即—早期基因启动子序列，反向插入的人EGFR 1838碱基对cDNA片段(编码受体胞外区及穿膜区域)，聚腺苷酸化信号序列。

(b)以XmnI酶解EGFR AS后回收3.9kb片段，然后插入含Ad5腺病毒基因的载体pAIX中的E1区域(1.3～9.4mu)形成重组质粒pAIX AS。pAIX含有腺病毒左端0～1.3/9.4～17mu基因片段。

(c)将携带EGFR反义RNA表达盒的质粒pAIX AS与ClaI酶解线性化的携带d1327腺病毒基因组DNA的RSV-βgal重组腺病毒大片段(LacZ基因插入1.3～9.4mu区域，其后有9.4～100mu病毒基因片段)共转染293细胞(ATCC公司)，二者在细胞内发生同源重组，形成表达EGFR反义RNA的重组腺病毒AdE5。

2.AdE5的扩增和纯化

以10个空斑形成单位(pfu)/细胞感染90％汇合状态的接种于100mm平皿中的293细胞，36～48小时后细胞出现完病变效应时收集细胞。30～40个平皿的细胞汇集在一起，于-80℃～37℃间反复冻融4次后离心去除细胞碎片。

将2.5ml 1.4g/ml的CsCl溶液和2.5ml 1.25g/ml的CsCl溶液依此加入超离心管中制成CsCl密度梯度液。将5ml待纯化的病毒置于CsCl密度梯度液上，SW41转头35000转/min 18℃离心1h30min，吸出病毒带加在5ml 1.35g/ml的CsCl溶液上，SW41转头35000转/min 18℃离心18h后吸出病毒带加至交换柱上，以PBS缓冲液洗脱CsCl并收集纯化的病毒，加入7％的无菌干油后保存于-80℃。以空斑形成实验确定病毒滴度，

3.腺病毒载体对乳腺癌细胞的转染率

分别以病毒感染倍数(MOI)为25、50、100和25、50、100、200、400pfu/细胞的RSV-βgal重组腺病毒感染乳腺癌细胞MDA-MB-468和MDA-MB-231(ATCC公司)，24～48h后以1％甲醛/0.2％戊二醛溶液固定细胞，以β半乳糖苷酶(β-gal)底物X-gal显色(37℃，1h)，显微镜下记数β-gal表达细胞及视野内细胞总数。发现病毒转染率随病毒量的增大及时间的延迟而提高，48h病毒量在50pfu/细胞或以上时转染率超过90％。

4.EGFR反义RNA在乳腺癌细胞中的表达(图2)

将EGFR A64-1 cDNA片段EcoRI-SmaI双酶切片段克隆入pGEM4载体中(Promega公司)获得pGEM-EGFR质粒。以Afl III酶解pGEM-EGFR后，采用SP6聚合酶合成可杂交保护230碱基长度的EGFR反义RNA片段的正义核酸探针。线性化的pTRI-GAPDH人3-磷酸甘油醛脱氢酶反义对照载体(Ambion公司)经DdeI酶解后，采用T7聚合酶合成可杂交保护154碱基长度的GAPDH RNA片段的反义核酸探针，作为内对照。探针由Ambion公司的MAXIscript试剂盒和800Ci/mmol 32P UTP标记后，以含8M尿素的5％丙烯酰胺凝胶电泳纯化。

重组腺病毒感染乳腺癌细胞3天后的总细胞RNA通过胍氯化铯法提取后保存于-80℃下。10μg细胞RNA与3×10⁴cpm探针混合后，以Ambion公司的Hybspeed RPA试剂盒行RNA酶保护实验，检测EGFR反义RNA的表达。发现，只在感染了AdE5重组腺病毒的乳腺癌细胞中才有EGFR反义RNA的表达，而在对照空病毒AdCO1或PBS处理的细胞中则无EGFR反义RNA的表达。

5.EGFR蛋白在乳腺癌细胞及人微血管内皮细胞中的表达被AdE5抑制(图3)

以western印迹杂交检验AdE5对EGFR蛋白表达的抑制作用。50～700pfu/细胞重组腺病毒感染MDA-MB-468、MDA-MB-231细胞及人微血管内皮细胞HMEC-13天后提取全细胞蛋白。10～25μg蛋白以7％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上，以丽春红染色验证蛋白加样的均匀性。以1μg/ml小鼠抗人EGFR单克隆抗体(UpstateBiotechnology公司)为一抗4℃孵育过夜，再以辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG Fab片段为二抗室温孵育1h，最后采用Amersham Life Science公司的ECL试剂检测EGFR的表达水平。与对照空病毒AdCO1和未感染病毒(0)比较，AdE5显著抑制此3种细胞EGFR的表达。

6.乳腺癌细胞和微血管内皮细胞的体外增殖被AdE5抑制(图4)

感染前1天7×10⁴ MDA-MB-468细胞植于9.6cm²细胞培养皿中。第1天以50和100pfu/细胞的病毒于0.5ml培养液中感染4h，重复3次。以PBS缓冲液冲洗后，细胞在含10％的胎牛血清的培养液中培养。第2、3天胰蛋白酶消化后细胞记数，研究细胞增殖情况。如图4-A所示，与AdCO1比较，AdE5抑制细胞增殖，且此抑制效果随着病毒量的增大和时间的延长而加强。

观察150和300pfu/细胞的AdE5和AdCO1感染MDA-MB-231细胞后细胞的增殖情况，与未感染病毒的细胞比较未发现2种重组腺病毒对细胞增殖有任何影响。

感染前1天2×10⁵ HMEC-1细胞植于9.6cm²细胞培养皿中。第1天以350和700pfu/细胞的病毒感染细胞，重复2次。细胞在含1％去除生长因子(以活性碳-葡聚糖处理)的胎牛血清的培养液中(+/-表皮生长因子，EGF，Upstate Biotechnology公司)培养。第2、4天胰蛋白酶消化后细胞记数，研究细胞增殖情况。如图4-B所示，EGF刺激细胞的增殖，且此刺激作用随生长因子浓度的提高而增大；高量不但AdE5抑制细胞增殖，而且可抵消EGF的作用；AdCO1对细胞的增殖以及对EGF的反应无影响。

7.乳腺癌肿瘤生长被AdE5抑制(图5)

将悬浮在0.2ml PBS缓冲液中处于对数生长状态的10⁷MDA-MB-468细胞及6×10⁶MDA-MB-231细胞皮下接种于5周雌性swiss nu/nu小鼠右肋部。细胞接种后第7天(d7)，肿瘤体积达70mm³左右时将动物进行随机分组，以稀释于100μl PBS缓冲液中的10⁹pfuAdE5、AdCO1或100μl PBS缓冲液进行肿瘤内注射。(A)MDA-MB-468肿瘤d7注射1次，(B)MDA-MB-231肿瘤d7和d13各注射1次。每4～8天测量1次肿瘤体积，体积计算公式为π×平均直径³/6。于d53，MDA-MB-468肿瘤生长被显著抑制(PBS/AdCO1，p＝0.24；PBS/AdE5，p＝0.0027；AdCO1/AdE5，p＝0.00010)。于d34，肿瘤生长被显著抑制(PBS/AdCO1，p＝0.71；PBS/AdE5，p＝0.0050；AdCO1/AdE5，p＝0.0058)。

8.AdE5对乳腺癌细胞凋亡的诱导(图6，7；表1)

以50～100pfu/细胞重组腺病毒感染体外贴壁生长的MDA-MB-468细胞，24h后收集提取全细胞蛋白，行western印迹杂交检测聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)。50μg蛋白以10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至硝酸纤维素膜上，以丽春红染色验证蛋白加样的均匀性。以1μg/ml小鼠抗PARP单克隆抗体(Oncogene Research Products公司)为一抗4℃孵育过夜，再以辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG Fab片段为二抗室温孵育1h，最后采用AmershamLife Science公司的ECL试剂检测PARP活性。以经P53重组腺病毒AdP53感染的MDA-MB-468细胞作为阳性对照。当细胞发生凋亡时，分子量为115kD的PARP被切割，产生一85～90kD的小片段。如图6(A)所示，与阴性对照和AdCO1相比，AdE5诱导MDA-MB-468细胞凋亡。且此诱导作用随病毒量的增加而增强。至300pfu/细胞，检测PARP片段，重组腺病毒对MDA-MB-231细胞无凋亡诱导作用。

以50～100pfu/细胞重组腺病毒感染体外贴壁生长的MDA-MB-468细胞，3天后收集并将其离心甩辅在玻片上，经4％多聚甲醛固定后采用Roche公司原位细胞死亡检测试剂盒，以TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)技术检测细胞凋亡情况，凋亡细胞核被碱性磷酸酶底物Fast Fast Red(Sigma公司)染成红色，以苏木素复染。如图7(A～E)所示，与阴性对照和AdCO1比较，AdE5诱导MDA-MB-468细胞凋亡，且此诱导作用随病毒量的增加而增强。至300pfu/细胞，检测TUNEL，重组腺病毒对MDA-MB-231细胞无凋亡诱导作用。

重组腺病毒感染细胞48h后以流式细胞仪研究细胞周期分布，与AdCO1相比AdE5诱导MDA-MB-468细胞凋亡，在表1中表现为处于＜G0/G1期的细胞显著增加。且此凋亡诱导作用随病毒量的增加而增强。

10⁷MDA-MB-468细胞皮下接种于5周雌性swiss nu/nu小鼠右肋部成瘤，第6天和第10天以稀释于100μl PBS缓冲液中的10⁹pfu AdE5或AdCO1瘤内注射。第3天处死动物将肿瘤保存于液氮中。5μm肿瘤冰冻切片经4％多聚甲醛固定后采用Roche公司TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况。如图7(F～G)所示，与AdCO1比较，AdE5诱导肿瘤细胞凋亡。

            表1.重组腺病毒感染MDA-MB-468细胞后流式细胞仪分析

	pfu/细胞	＜G0/G1(％)	G0/G1(％)	S(％)	G2/M(％)
						对照AdCO1AdE5	-5010050100	1.684.8714.1619.4541.08	48.2944.0043.0546.2730.97	3.795.396.7211.9612.89	46.2645.7436.0722.3215.06

9.AdE5对乳腺癌新生血管的抑制(图8)

裸鼠皮下接种MDA-MB-231细胞成瘤后，以稀释于100μl PBS缓冲液中的10⁹pfu AdE5或AdCO1瘤内注射2次，间隔5天。结束治疗后5天处死动物，肿瘤组织以含5％乙酸、75％乙醇、2％甲醛的固定液固定后以石蜡包埋。5μm切片经二甲苯处理后，以3％ H₂O₂室温孵育5min以阻内源性过氧化物酶活性，然后微波处理；采用1∶100稀释的小鼠抗人平滑肌肌动朊单克隆抗体(Dako公司)为一抗室温孵育1h；经Zymed Laboratories Inc公司Histomouse-Max试剂盒处理，阳性细胞被辣根过氧化物酶底物DAB染成棕色。切片以苏木素复染，以略去第一抗体的免疫组化染色作为阴性对照。进行血管定量分析时，先以低倍视野在每个切片上确定出3个血管最丰富的肿瘤区域，然后分别以400倍视野记数肌动朊阳性细胞。

如图8，AdE5注射后，较PBS和AdCO1肿瘤内新生血管数量显著降低。与AdCO1比较，AdE5注射后可将肿瘤内新生血管数量抑制74.21％。

10.AdE5对乳腺癌细胞的放射增敏作用(图9，10；表2，3)

以150pfu/细胞AdE5、AdCO1感染MDA-MB-231细胞后48h，胰酶消化，计数，分别以0、2、4、6、8Gyγ-射线(Co⁶⁰放射源)照射，然后按500～4000个细胞/皿接种于6cm直径培养皿(事先接种同源细胞经过30Gyγ-射线照射而制成的饲细胞)，每个培养皿饲细胞和活细胞总数为5.25×10⁴个。接种后细胞常规培养10～14天，中间第5天换液，以便清除死细胞。最后行结晶紫染色，计数≥50个细胞的克隆。每个剂量点重复3次。

如图9所示，与AdCO1比较AdE5提高放射线对MDA-MB-231细胞的杀灭作用。而且这种增敏作用与病毒量和照射剂量相关，150pfu/细胞AdE5联合8Gyγ-射线后细胞的存活分数为0.4％，而300pfu/细胞AdE5联合8Gyγ-射线后的细胞存活分数则降低至0.23％。而150pfu/细胞和300pfu/细胞AdCO1联合8Gyγ-射线后的细胞存活分数分别为0.66％和0.64％。单纯8Gyγ-射线后的细胞存活分数为1.11％。

为了明确AdE5提高MDA-MB-231细胞放射敏感性的机制，我们研究了重组腺病毒对这种乳腺癌细胞细胞动力学的影响。如表2所示，300pfu/细胞AdE5感染MDA-MB-231细胞48h后处于G0/G1期的细胞比例显著降低，同时处于G2/M期的细胞比例显著增高。

              表2.重组腺病毒感染MDA-MB-231细胞后流式细胞仪分析

	pfu/细胞	＜G0/G1(％)	G0/G1(％)	S(％)	G2/M(％)
						对照AdCO1AdE5	-150300150300	2.741.901.702.210.24	54.7148.8745.8945.7838.23	36.5739.1142.9839.4239.12	8.7212.0211.1314.8022.65

而4Gyγ-射线照射MDA-MB-231细胞后不同时间检测细胞周期分布发现，G0/G1期的细胞比例首先降低，24h后增高并超过0h对照组；处于G2/M期的细胞比例显著增高，至12h时达到高峰，然后下降，但于48h时仍显著高于0h对照组：S期的细胞比例在8h后一过性升高后随着时间的延迟不断降低，48h后显著降低，说明细胞活性逐渐减退(表3)。以上结果说明，γ-射线照射导致G0/G1期和G2/M期阻滞，并使细胞活性明显降低；300pfu/细胞AdE5感染可使细胞摆脱对放射线不敏感的G0/G1期，同时使更多的细胞进入对放射线敏感的G2/期。进一步的细胞动力学分析表明，MDA-MB-231细胞被300pfu/细胞的AdE5感染后24h接受4Gyγ-射线照射24h后，G0/G1期的细胞比例既低于单纯4Gyγ-射线照射又低于单纯AdE5处理，处于G2/M期的细胞比例既高于单纯4Gyγ-射线照射又高于单纯AdE5处理，而处于S期的细胞比例近似于单纯4Gyγ-射线照射但显著低于单纯AdE5处理，从而印证了我们对AdE5提高MDA-MB-231细胞放射敏感性机制的判断(图10)。AdCO1可使处于G0/G1期的细胞比例略有降低，处于G2/M期的细胞比例略有升高，但与病毒量无关(表2)；联合γ-射线照射后处于G0/G1期的细胞比例略低于单纯照射，处于G2/M期的细胞比例略高于单纯照射(图10)。从而可以腺病毒本身对MDA-MB-231细胞动力学的影响来AdCO1较弱的放射增敏作用。

                 表3.4Gyγ射线照射MDA-MB-231细胞后流式细胞仪分析

照射后时间	＜G0/G1(％)	G0/G1(％)	S(％)	G2/M(％)
					0h8h12h24h48h	3.263.355.683.965.22	43.3522.1021.2954.158.55	45.1853.1640.4318.9613.74	11.4621.7438.2935.9427.7

Claims (7)

1.一种用于恶性肿瘤治疗的重组腺病毒，其特征是该腺病毒基因组中E1区及E3区缺失，并在E1区位置插入下人表皮生长因子受体(EGFR)反义RNA表达盒，该表达盒依次包括：巨细胞病毒(CMV)立即-早期基因启动子序列，反向插入的人EGFR A64-1 EcoRI酶解1838碱基对cDNA片段，聚腺苷酸化信号序列。

2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于该腺病毒为Ad5型腺病毒。

3.根据权利要求1所述的重组腺病毒的用途，其特征在于该腺病毒可用于制备治疗表皮来源恶性肿瘤及脑胶质瘤的药物。

4.根据权利要求3所述的重组腺病毒的用途，其特征是表皮来源的恶性肿瘤可以是乳腺癌或其它表达EGFR的恶性肿瘤。

5.根据权利要求3所述的重组腺病毒的用途，其特征是该腺病毒可用于制备治疗表皮来源恶性肿瘤、脑胶质瘤及其术后瘤床的药物。

6.根据权利要求3所述的重组腺病毒的用途，其特征是该腺病毒可联合放疗或化疗。

7.根据权利要求3所述的重组腺病毒的用途，其特征是所述的重组腺病毒可以以液体形式被配成注射液、滴液、喷雾液、涂抹液等。

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