CN115838720A - 一种携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒的减毒沙门氏菌载体及其应用 - Google Patents
一种携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒的减毒沙门氏菌载体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种携带shSTAT3/shPD‑L1重组质粒的减毒沙门氏菌载体及其应用，属于生物技术领域。本发明在同一个表达载体中采用两个启动子分别表达两个shRNA，成功构建携带shSTAT3/shPD‑L1重组质粒的减毒沙门氏菌载体；shSTAT3/shPD‑L1重组质粒能够同时沉默结直肠癌细胞中STAT3、PD‑L1的表达，从而抑制癌细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡，引起细胞周期阻滞；减毒沙门氏菌携带的shSTAT3/shPD‑L1重组质粒，能够通过抑制细胞增殖、促进凋亡及增加免疫细胞浸润等机制，明显抑制了C57BL/6N小鼠原位结直肠癌的生长，具有良好的抗肿瘤作用，成为一种有效的结直肠癌治疗新策略。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒的减毒沙门氏菌载体及其应用。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer)是常见的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处。几十年前，由于医疗技术的落后，以及人们卫生意识的缺乏等原因，结直肠癌很少被诊断出来，而如今结直肠癌已成为全球癌症死亡的第三大常见原因，发病率为10.2％，死亡率占所有癌症死亡率的9.2％。结直肠癌不仅影响患者生活质量，如何提升结直肠的癌治疗效果，同时降低治疗成本成为科研人员的研究重点。
结直肠癌的标准常规治疗方法包括手术、化学疗法和放射疗法。根据疾病的定位和进展，这些治疗可以组合使用。通过腹腔镜和经肛门手术方法进行的全直肠系膜切除术(TME)通常是局部癌症的治疗选择，然而，完全去除所有癌细胞通常是不可能的，部分结直肠癌患者需接受辅助化疗和放疗的进一步治疗。由于这些疗法对任何正在生长和分裂的细胞存在非特异性的细胞毒性，会给机体带来许多副作用。此外，经辅助疗法治疗后，仍有很大比例的患者复发。因此，探索有效的替代方法对治疗结直肠癌患者显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种短发夹RNA，所述短发夹RNA为shSTAT3或shPD-L1，其中shSTAT3序列如SEQ ID NO.2所示，shPD-L1序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的目的之二在于提供一种重组质粒，所述重组质粒中含有权利要求1中的shSTAT3 和shPD-L1。
优选地，所述重组质粒含有PLKO.1骨架。
更优选地，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的目的之三在于提供一种减毒沙门氏菌载体，所述减毒沙门氏菌载体含有序列如 SEQ ID NO.1所示的重组质粒。
本发明的目的之四在于提供序列如SEQ ID NO.2所示的shSTAT3或序列如SEQ IDNO.3 所示的shPD-L1在制备结直肠癌及相关实体肿瘤药物中的应用。
本发明的目的之五在于提供上述重组质粒在制备结直肠癌及相关实体肿瘤药物中的应用。
本发明的目的之六在于提供上述减毒沙门氏菌载体在制备结直肠癌及相关实体肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明在同一个表达载体中采用两个启动子分别表达两个shRNA，成功构建携带 shSTAT3/shPD-L1重组质粒的减毒沙门氏菌载体；
(2)shSTAT3/shPD-L1重组质粒能够同时沉默结直肠癌细胞中STAT3、 PD-L1的表达，从而引起细胞周期阻滞，抑制癌细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡；
(3)携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒的减毒沙门氏菌能够在肿瘤组织中特异性聚集，具有良好的肿瘤靶向性；
(4)减毒沙门氏菌携带的shSTAT3/shPD-L1重组质粒，能够通过抑制细胞增殖、促进凋亡及增加免疫细胞浸润等机制，明显抑制了C57BL/6N小鼠结直肠癌的生长，具有良好的抗肿瘤作用，成为一种有效的结直肠癌治疗新策略。
附图说明
图1为实施例1中的STAT3、PD-L1的mRNA表达量化图。
图2为实施例1中的RT-PCR、Western Blot检测CT26细胞STAT3、PD-L1表达水平结果图，其中(A)为STAT3、PD-L1的mRNA表达量化图；(B)为STAT3、PD-L1的蛋白表达情况(C)STAT3、PD-L1的蛋白表达量化图。
图3为实施例2中的CCK-8实验检测细胞增殖结果图。
图4为实施例2中的克隆形成实验检测细胞增殖图，其中(A)为克隆形成实验结果图； (B)为克隆形成实验结果量化图。
图5为实施例2中的流式细胞术检测细胞凋亡比例图，其中(A)为流式细胞术检测细胞凋亡结果图；(B)为细胞凋亡结果量化图。
图6为实施例2中的Western blot检测细胞凋亡相关蛋白表达结果图，其中(A)为细胞凋亡相关蛋白结果图；(B)为Bcl-2/Bax蛋白结果量化图；(C)Cleaved-caspase3蛋白结果量化图。
图7为实施例2中的Transwell小室侵袭实验检测细胞迁移能力结果图，其中(A)为侵袭实验结果图；(B)为侵袭实验结果量化图。
图8为实施例2中的细胞划痕实验检测细胞迁移能力结果图，其中(A)为划痕实验结果图；(B)为划痕实验结果量化图。
图9为实施例2中的流式细胞术实验检测细胞周期结果图，其中(A)为流式细胞术实验检测细胞周期结果图；(B)为细胞周期结果量化图。
图10为实施例2中的流式细胞术检测细胞周期相关蛋白结果图，其中(A)为细胞周期相关蛋白结果图；(B)为细胞周期相关蛋白结果量化图。
图11为实施例3中的治疗期间小鼠肿瘤体积及体重变化图，其中(A)为治疗期间小鼠肿瘤体积变化图；(B)为治疗期间小鼠体重变化图。
图12为实施例3中的减毒沙门氏菌在小鼠体内的分布情况图。
图13为实施例3中的治疗结束后小鼠肿瘤重量结果图，其中(A)为治疗结束后收获小鼠肿瘤图；(B)为治疗结束后小鼠肿瘤重量量化图。
图14为实施例3中的肿瘤组织相关蛋白表达图，其中(A)为蛋白表达情况图；(B)为蛋白表达量化图。
图15为实施例3中的小鼠主要脏器图。
图16为实施例3中的小鼠主要脏器H&E染色(Bar＝50μm)图。
图17为实施例3中的肿瘤组织H&E染色(Bar＝50μm)图。
图18为实施例3中的肿瘤STAT3、PD-L1表达情况(Bar＝50μm)图。
图19为实施例3中的肿瘤增殖相关蛋白表达情况(Bar＝50μm)图。
图20为实施例3中的肿瘤凋亡相关蛋白表达情况(Bar＝50μm)图。
图21为实施例3中的肿瘤TUNEL染色情况(Bar＝50μm)图。
图22为实施例3中的肿瘤周期相关蛋白表达情况(Bar＝50μm)图。
图23为实施例3中的肿瘤浸润免疫细胞情况(Bar＝50μm)图。
图24为实施例3中的肿瘤相关细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α变化图，其中(A)为IL-6 浓度量化图；(B)为IFN-γ浓度量化图(C)TNF-α浓度量化图。
图25为实施例4中的原位结直肠癌小鼠模型造模过程及体重变化图，其中(A)为AOM-DSS造模过程图；(B)为小鼠体重变化图(C)造模期间小鼠症状。
图26为实施例4中的原位结直肠癌肿瘤及肿瘤差异图，其中(A)为收获肿瘤图；(B)为肠重/体重量化；图(C)结直肠长度量化图；图(D)结直肠上的肿瘤数量图。
图27为对比例1中的Western Blot检测CT26细胞STAT3、PD-L1表达水平结果图，其中(A)为STAT3、PD-L1的蛋白表达情况；(B)STAT3、PD-L1的蛋白表达量化图。
图28为对比例1中的中的流式细胞术检测细胞凋亡比例图，其中(A)为流式细胞术检测细胞凋亡结果图；(B)为细胞凋亡结果量化图。
具体实施方式
以下实施例所用试剂如下表所示：
表1
实施例1
1.质粒的获得
本实施例使用的含有PLKO.1骨架的shControl质粒、shSTAT3质粒、shPD-L1质粒、shSTAT3/shPD-L1重组质粒委托赛信生物构建，该重组质粒含有氨苄霉素(Amp)抗性基因，用于排除杂菌干扰，shSTAT3/shPD-L1重组质粒序列如SEQ ID NO.1所示。
shRNA序列信息如下：
SEQ ID NO.2：shSTAT3(5’-GCAGCAGCTGAACAACATG-3’)；
SEQ ID NO.3：shPD-L1(5’-CCGAAATGATACACAATTCGA-3’)。
本实验室保存的减毒沙门氏菌phoP/phoQ突变株，该突变株为专利“CN108913690BPD-1 特异性干扰序列、质粒、减毒沙门氏菌及在抗肿瘤的应用”中公开的减毒沙门氏菌phoP/phoQ 突变株。
PCR引物如表2所示。
表2
2.重组质粒转染鼠结肠癌CT26细胞株
(1)消化、离心收集80％-90％融合度的CT26细胞，细胞计数，每个六孔板中放入约2×105个细胞，每个孔加入2mL培养液，十字晃六孔板，使细胞均匀分布在六孔板，放入细胞孵箱培养24h。
(2)CT26细胞融合度在80％左右时，按照lipo3000说明书进行转染，取4个高压过的 1.5mL EP管(A管)，分别加入125μL不含胎牛血清、青霉素链霉素双抗的RPMI-1640培养液，再分别加入7.5μL LipofectamineTM3000，另取4个高压过的1.5mL EP管(B管)，加入125μL不含胎牛血清、青霉素链霉素双抗的RPMI-1640培养液，分别加入2.5μg的 shControl质粒、shSTAT3质粒、shPD-L1质粒、shSTAT3/shPD-L1重组质粒，再分别加入5μL P3000TM，将A管试剂分别加入B管，室温孵育15min，轻轻混匀，分别滴加到六孔板的四个孔，轻轻晃六孔板，使包被着质粒的转染试剂在六孔板中分布均匀。4-6h后，吸出六孔板中培养液，每孔加入2mL新的培养液，继续培养24-48h。
3.qPCR检测mRNA表达
转染24h后弃去细胞培养液，向六孔板中加入Trizol裂解液0.5mL，收集细胞，将Trizol 转移至1.5mL离心管中，静置5min。加入0.2mL氯仿混匀，静置10min，12000rpm、4℃离心15min。吸取上层水相移至新的1.5mL离心管，加入0.5mL异丙醇混匀，室温静置15min，12000rpm、4℃离心8min。弃上清，加入75％乙醇1mL，混匀后9000rpm、4℃离心5min。弃上清，离心管干燥10min，用无菌DEPC水50μL溶解沉淀，轻轻吹打后置于冰上，上机检测RNA浓度。
将样品RNA、逆转录Mix(全式金，AE341)和RNase-free水按比例混合，混匀后42℃孵育15min，85℃加热5sec，上机检测合成cDNA浓度。
将cDNA、目的基因引物、qPCR Mix(全式金，AQ601)和RNase-free水按比例混合均匀。两步法进行扩增：94℃，30sec；94℃，5sec-60℃，30sec，45循环，检测结果参见图1，由图1可知，与单沉默组相比，shSTAT3/shPD-L1重组质粒转染组STAT3、PD-L1 mRNA表达明显减少(P<0.001)。
4.细胞蛋白提取、浓度测定以及Western blot检测
(1)用1.5mLEP管收集转染48h的细胞培养液，1050rpm，5min离心弃上清，收集沉淀，向六孔板每个孔加入50μL1％蛋白酶抑制剂(PMSF)的细胞裂解液(RIPA)，细胞刮刀将六孔板贴壁细胞刮下，转移到对应EP管中。细胞超声破碎后置于冰上裂解10min， 12000rpm、4℃离心15min，收集上清至新的EP管。
(2)蛋白标准品(5mg/mL)取10μL原液用PBS稀释10倍，将稀释后的蛋白标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μL加入96孔板，加入PBS补足至20μL。取2μL蛋白样品原液加入96孔板，用PBS补足至20μL，每孔加入提前配制的BCA工作液200μL，37℃环境下放置30min。酶标仪检测A562吸光度，根据蛋白标准品数值绘制蛋白浓度标准曲线，计算待测样品浓度。
(3)制样：蛋白样品中加入loading，定量制作20μg/20μL上样蛋白，放入100℃沸水中10min使蛋白变形。
SDS-PAGE、缓冲液体、抗体配制：根据分子量大小配制8％、10％或12％浓度SDS-PAGE 胶。电泳液、转膜液及相应抗体按比例配制，4℃短期存储使用。
电泳：在电泳液中拔出SDS-PAGE胶的梳子，废弃边缘2孔道，每个孔道上样10μL，加入Marker进行标记。上层浓缩胶电压设置为75V，30min，下层分离胶电压设置为110V，60min。
转膜：电泳完成后，根据Marker位置切胶，用甲醇活化PVDF膜30s，将其贴到胶面，转膜夹放置顺序依次为湿润海绵、三层湿润滤纸、电泳胶片段、三层湿润滤纸、湿润海绵，放置过程避免气泡产生。转膜槽加入新鲜配制的转膜液，并用冰覆盖，防止转膜释放大量的热烧坏机器，电压设置为100V，45min。
脱脂牛奶封闭：转膜完成后，将PVDF膜放入5％脱脂牛奶封闭1h，封闭结束后，用TBST 洗涤PVDF膜3次，每次5min，期间置于水平摇床。
杂交：用相应的一抗稀释液对PVDF膜进行孵育，放入4℃冰箱过夜。第二天，用TBST洗涤PVDF膜3次，每次5min，再用相应的二抗稀释液进行封闭1h，用TBST洗涤PVDF 膜3次，每次5min。
ECL显色：显色液现用现配，注意避光，孵育PVDF膜，立即放入ECL成像仪显色。
蛋白条带定量：ImageJ软件进行蛋白条带量化，确定蛋白表达水平差异。
结果参见图2，与单沉默组相比，shSTAT3/shPD-L1重组质粒转染组STAT3、PD-L1mRNA 表达明显减少(P<0.001)；与单沉默组相比，重组质粒转染组STAT3、PD-L1蛋白表达明显减少(P<0.001)。上述结果表明shSTAT3/shPD-L1重组质粒成功转染CT26细胞并发挥生物学作用。
实施例2
1.电转化减毒沙门氏菌phoP/phoQ突变株
(1)制备电转化感受态：第一天取减毒沙门氏菌phoP/phoQ突变株菌液1μL放入50mL LB液体培养基中，37℃，200rpm摇床中培养14-16h。第二天，取1mL菌液放入100mL 新的培养液中，定时检测菌液OD值，当OD值到0.3-0.4时，放于冰上预冷30min。在2个 15mL离心管中加入菌液，4200rpm，4℃，10min离心收集沉淀，弃上清，加入ddH2O重悬沉淀，4200rpm，4℃，10min离心收集沉淀，两管合并为一管，加入ddH2O重悬沉淀，4200 rpm，4℃，10min离心收集沉淀，弃上清，用10％甘油重悬沉淀，，转入1.5mLEP管，液氮冷冻1min，-80℃冰箱保存。
(2)电转化步骤：取1μL浓度不低于500ng/μL的质粒放入1.5mLEP管中，将其与0.1cm电极杯插冰上预冷，100μL解冻的感受态转移至此1.5mLEP管中，充分混匀，冰上放置10min。调节电转仪电压2.5KV，25μF，200Ω，将混合物转移至电极杯，轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯底，将电极杯放入电转仪，蜂鸣声后电转结束，立即向电极杯中加入1mL高压灭菌的LB液体培养基，重悬液体，转移至1.5mLEP管，放置于37℃、250 rpm摇床复苏1h。取200μL转化产物涂布在含有Amp的固体LB培养基，37℃孵箱过夜培养。
(3)保种：过夜培养后查看固体LB平板，将其中单克隆菌落挑入新的液体LB培养基(含Amp)，37℃、200rpm摇床中培养14-16h，取部分菌液按照1：1比例加入25％甘油，充分混匀后放于-80℃冰箱保存。
2.含重组质粒沙门氏菌的鉴定
将电转后的减毒沙门氏菌菌液送到生工生物公司进行测序，检测是否存在目的基因片段并获得转染成功的减毒沙门氏菌phoP/phoQ突变株。
3.CCK-8检测细胞增殖情况
第一天在96孔板每孔加入7000个CT26细胞，每孔培养液100μL，第二天按照实验分组采用转染试剂瞬时转染重组质粒到肿瘤细胞CT26中，转染24h后每孔加入10μL CCK-8 溶液，放入细胞孵箱孵育1h，拿至酶标仪检测A450吸光度；转染48h、72h后重复上述步骤。结果参见图3，由图3可知，与对照组、单沉默基因组相比，shSTAT3/shPD-L1重组质粒能够明显抑制CT26细胞生长(P<0.001)，差异具有显著统计学意义。
4.细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力
六孔板每孔加入500个转染质粒24h的CT26细胞，放入细胞孵箱进行培养7-9d，观察到细胞克隆时倒掉细胞培养液，停止培养。PBS溶液清洗一次，用吹风机吹六孔板底部，加速晾干，再用甲醛固定20min，吸出甲醛，用0.1％结晶紫染色5-10min，用ddH2O清洗掉残余结晶紫，拍照留存。结果参见图4，由图4可知，在接种CT26细胞后，shSTAT3/shPD-L1 重组质粒转染组克隆形成数量明显少于对照组以及沉默单个基因组(P<0.001)，统计学分析具有明显差异。以上结果表明shSTAT3/shPD-L1重组质粒能够明显抑制结肠癌CT26细胞的克隆形成能力。
5.流式细胞术检测细胞凋亡
CT26细胞转染24h后收集1-5×105个细胞，用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(沈阳万类，WLA001c)检测细胞凋亡情况：用500μL Binding buffer重悬细胞；加入5μLAnnexin V-FITC重悬细胞，再加入10μL PI混匀，避光孵育10min后用流式细胞仪检测细胞染色情况，结果如图5所示，可知shSTAT3/shPD-L1重组质粒在转染CT26细胞48h后，相对于对照组、单沉默组，凋亡细胞比例显著增加(P<0.001)。上述结果说明shSTAT3/shPD-L1重组质粒对CT26细胞有明显促凋亡能力。
6.Western blot检测重组质粒对结肠癌CT26细胞凋亡的影响
通过Western blot实验检测凋亡相关蛋白表达情况，验证shSTAT3/shPD-L1重组质粒对结肠癌CT26细胞凋亡的影响。结果如图6所示，可知相对于对照组、单沉默组，shSTAT3/shPD-L1重组质粒转染组Cleaved Caspase-3蛋白显著增加(P<0.01)，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.001)，Bcl-2与Bax蛋白比值下降(P<0.01)。上述结果进一步说明，shSTAT3/shPD-L1重组质粒通过调节凋亡相关蛋白促进CT26细胞凋亡。
7.Transwell实验检测细胞迁移能力
CT26细胞转染24h后收集1-2×105个细胞，转入Transwell小室中，并加入无血清的培养液200μL，小室置于24孔板内，下室中加入含血清的培养液，放入培养箱中培养。48h后，取出小室至新的24孔板，吸走培养液，加入600μL4％多聚甲醛，固定20-30min。弃固定液，用0.1％结晶紫染色5-10min，PBS洗3遍，除去未与细胞结合的结晶紫，用棉签轻轻擦除小室上侧的细胞，镜下拍照留存，用3％醋酸洗脱结晶紫染料，洗脱液在酶标仪上测量 OD值(570nm)，间接反映组间迁移细胞数量差异。结果参见图7，由图7可知， shSTAT3/shPD-L1重组质粒转染组染色程度最小，迁移细胞数量最少；通过将结晶紫染料进行脱色，570nm波长定量检测组间吸光度差异，shSTAT3/shPD-L1重组质粒转染组吸光度数值最低，说明其迁移细胞数量最少，差异具有统计学意义(P<0.001)。
8.细胞划痕实验检测细胞迁移能力
在细胞转染前，用1mL枪头在六孔板孔中笔直刮掉一条直线的细胞，吸去未贴壁细胞，镜下拍照，转染细胞24h后，镜下拍照观察划痕愈合情况。结果参见图8，由图8可知，与单沉默组相比，shSTAT3/shPD-L1重组质粒转染组划痕愈合距离最短(P<0.001)，说明shSTAT3/shPD-L1重组质粒能够显著抑制结肠癌CT26细胞迁移能力。
9.流式细胞术检测细胞周期变化
细胞转染48h后，收集细胞，用PBS清洗一遍，再用70％预冷乙醇500μL固定，放置 4℃冰箱过夜；第二天1050rpm，5min离心收集沉淀，弃上清，细胞沉淀加入100μl RNaseA 溶液重悬，再加入400μL PI染色液混匀，避光孵育30min，上机检测。结果参见图9，由图 9可知，与对照组相比，重组质粒组G1期细胞数目明显增加(P<0.001)，S期细胞数目显著减少(P<0.05)，差异具有明显统计学意义。上述结果说明shSTAT3/shPD-L1重组质粒能够使CT26细胞发生G1期阻滞，从而抑制癌细胞增殖。
10.Western blot检测重组质粒对结肠癌CT26细胞周期相关蛋白的影响
为了探究shSTAT3/shPD-L1重组质粒对CT26细胞周期阻滞的影响，通过Westernblot 实验检测质粒转染后CT26细胞周期相关蛋白表达变化。图10显示，与单沉默组相比，shSTAT3/shPD-L1重组质粒转染细胞后，细胞G1期阻滞相关蛋白Cyclin D1表达显著下调(P<0.01)。Western blot实验说明重组质粒可能通过调节Cyclin D1蛋白表达，诱导细胞发生G1期周期阻滞，从而抑制细胞增殖。
实施例3
1.结肠癌皮下荷瘤模型的构建
取对数生长期的CT26细胞，计数后每只C57BL/6N小鼠皮下注射100μL含有3×105个 CT26细胞的悬液，注射部位为左侧背部，注射部位实验前做脱毛处理。待肿瘤长到黄豆粒大小时进行治疗，腹腔注射减毒沙门氏菌phoP/phoQ突变株，治疗剂量为100μL，浓度为107cfu。期间每两天检测肿瘤体积和小鼠体重一次，绘制肿瘤体积变化曲线及小鼠体重变化曲线，结果如图11所示，由图11可知，与单沉默组相比，携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒的减毒沙门氏菌在治疗小鼠12d后，肿瘤体积下降趋势最明显，差异具有统计学意义(P<0.05)；与 PBS治疗组相比，shSTAT3/shPD-L1组小鼠体重增加最多，差异具有统计学意义(P<0.05)。
小鼠肿瘤体积计算公式：肿瘤体积＝(长径)×(短径)2/2。
无菌状态下，取治疗4d后小鼠的肿瘤、肝脏、脾脏、肺脏各80mg，组织剪剪碎后研磨，用预冷的PBS稀释4倍后，取50μL接种到含Amp的固体培养基中，37℃孵箱过夜，第二天计算单克隆数量，结果参见图12，由图12可知，肿瘤样本形成2170±122个单克隆，脾脏形成17±4个单克隆，肝脏形成12±2个单克隆，肺脏无单克隆形成，肿瘤组织单克隆数量与其他脏器相比，差异具有明显统计学意义(P<0.001)，上述结果表明减毒沙门氏菌能够靶向聚集在肿瘤部位。
治疗第12d处死所有小鼠，收集肿瘤进行称重，结果如图13所示，与其它组相比，shSTAT3/shPD-L1组小鼠肿瘤重量最轻(P<0.05)，差异具有统计学意义。上述结果表明减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒对结肠癌肿瘤生长的抑制作用最明显。
2.Western blot检测肿瘤组织相关蛋白表达
为了探究减毒沙门氏菌携带重组质粒对肿瘤生长的影响，12天处死小鼠后，通过Western blot实验检测肿瘤组织凋亡、周期相关蛋白表达，结果如图14所示，减毒沙门氏菌携带 shSTAT3/shPD-L1质粒能够显著降低目的基因STAT3、PD-L1蛋白表达(P<0.001)；与单沉默组相比，shSTAT3/shPD-L1组抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低(P<0.001)，活化的凋亡蛋白Cleaved-caspase3表达明显增加(P<0.001)，周期蛋白CyclinD1表达明显减少(P<0.001)。上述结果表明减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒通过调控凋亡、周期蛋白表达进而抑制肿瘤进展。
3.免疫组织化学染色检测
为了检测减毒沙门氏菌治疗对小鼠的影响，12天处死小鼠后对小鼠心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色，观察小鼠脏器有无毒副作用。图15显示，肉眼观察小鼠脏器无明显变化；图16为H&E染色结果，减毒沙门氏菌治疗组小鼠主要脏器与对照组相比无明显差异。上述结果说明减毒沙门氏菌治疗措施对小鼠脏器无明显毒副作用。
4.为了检测沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1质粒对肿瘤组织的杀伤作用，12天处死小鼠后,对肿瘤组织进行H&E染色，结果如图17所示，普通光镜下观察，shSTAT3/shPD-L1组肿瘤组织面积明显减少，大量细胞核固缩、破裂现象，核呈蓝黑色，胞浆呈淡红色。上述结果说明，减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒对肿瘤细胞有明显的杀伤作用。
5.为了检测减毒沙门氏菌携带的质粒能否在体内发挥RNA干扰功能，12天处死小鼠后, 对STAT3、PD-L1基因表达情况进行免疫组化检测，结果如图18所示，与对照组及单基因转染组相比，shSTAT3/shPD-L1组肿瘤STAT3、PD-L1表达均明显降低。上述结果说明，减毒沙门氏菌携带的质粒能够发挥生物学功能，在肿瘤组织中降低STAT3、PD-L1表达。
6.12天处死小鼠后,对肿瘤组织进行增殖相关蛋白组化染色，结果如图19所示，shSTAT3/shPD-L1组肿瘤Ki67表达明显减少，说明减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒通过影响肿瘤Ki67表达进而抑制肿瘤生长。
7.12天处死小鼠后,对肿瘤组织进行凋亡相关蛋白组化染色，结果如图20所示，shSTAT3/shPD-L1组肿瘤活化的Caspase3表达明显增加，说明减毒沙门氏菌携带 shSTAT3/shD-L1重组质粒通过活化Caspase3进而促进肿瘤凋亡。
8.12天处死小鼠后,取各组肿瘤组织进行TUNEL染色，观察减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒对肿瘤细胞凋亡的影响。结果如图21所示，与对照组及单沉默组相比，shSTAT3/shPD-L1组肿瘤细胞TUNEL染色阳性细胞数量明显增加，说明 shSTAT3/shPD-L1组肿瘤凋亡细胞增加，从而抑制肿瘤生长。
9.12天处死小鼠后,对肿瘤组织进行周期相关蛋白组化染色，结果如图22所示，shSTAT3/shPD-L1组肿瘤Cyclin D1表达明显降低，说明减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1 重组质粒通过降低Cyclin D1表达进而抑制肿瘤进展。
10.为了检测携带不同质粒的减毒沙门氏菌对肿瘤浸润免疫细胞的影响，12天处死小鼠后，采用免疫组化染色CD4+、CD8+T细胞，结果如图23所示，减毒沙门氏菌治疗可以促进肿瘤免疫细胞浸润，其中减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒组治疗最为明显，免疫浸润细胞显著增加。上述结果说明，减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒可以促进肿瘤免疫细胞CD4+、CD8+T细胞的浸润，进而发挥自身免疫系统功能，杀伤肿瘤。
11.小鼠血清细胞因子的检测
为了检测减毒沙门氏菌携带不同shRNA质粒对小鼠血清细胞因子的影响，12天处死小鼠后，通过ELISA试剂盒检测肿瘤相关细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α浓度，结果如图24所示，与其它组相比，shSTAT3/shPD-L1组经过治疗后IL-6浓度显著下降(P<0.001)，IFN-γ浓度增加(P<0.001)，TNF-α浓度降低(P<0.001)，差异具有统计学意义。上述结果表明，减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒通过调节相关细胞因子进而抑制肿瘤进展。
实施例4
结直肠癌原位模型的构建：
每一只小鼠腹腔注射AOM，剂量10mg/kg，一周后饲喂3％DSS饮水7d，之后改为正常饮水14d，再饲喂1％DSS饮水7d，正常饮水14d，重复1％DSS饮水7d与正常饮水14 d，造模结束。在腹腔注射AOM后的第60、67d进行治疗，腹腔注射减毒沙门氏菌phoP/phoQ 突变株，治疗剂量为100μL，浓度为5×105cfu。第74d处死所有小鼠，取材同皮下荷瘤模型。图25中(A)为原位结直肠癌造模及减毒沙门氏菌治疗过程。图25中(B)显示，在小鼠注射AOM后，体重有下降趋势，5d后体重又开始增加，饲喂3％DSS饮用水期间，体重急剧下降，改用正常水喂养后，体重又开始逐渐增加；降低DSS饲养水浓度至1％，饲喂DSS水 7d、饲喂正常水14d，此为一循环，再重复一循环，期间体重缓慢生长。图25中(C)显示，除体重变化外，每次DSS水饲养造模期间，小鼠出现肛周红肿、湿润、便血情况，随着造模时间增加，小鼠便血严重，后肢无力、臀部坠地现象明显，脱肛严重，病理检查结果显示：与癌旁组织相比，肿瘤部位HE染色提示肿瘤细胞显著增生，上述现象表明原位结直肠癌小鼠造模成功。
在治疗结束后，我们收获小鼠结直肠组织并进行评估。对结直肠组织进行直接观察，图 26中(A)显示，减毒沙门氏菌携带重组质粒可以明显抑制原位结直肠癌的生长。肠重/体重为衡量原位结直肠癌严重程度的指标，称量小鼠体重及其肠重，图26中(B)结果显示，与单沉默组相比，shSTAT3/shPD-L1组肿瘤比值最小(P<0.05)，说明其严重程度最低。此外，我们还统计了小鼠结直肠的长度及肿瘤数量。图26中(C)显示，不同治疗措施的小鼠结直肠长度没有组间差异，说明治疗措施对小鼠结直肠长度没有影响。结直肠上的肿瘤数量如图 26中(D)，与单沉默组相比，shSTAT3/shPD-L1组小鼠肿瘤数量最少(P<0.001)，说明减毒沙门氏菌携带shSTAT3shPD-L1重组质粒能够明显抑制肿瘤的进展。
首先，本发明构建了shSTAT3/shPD-L1的重组质粒，通过qPCR、Western Blot实验验证了其能够在鼠结肠癌细胞系CT26中发挥作用，结果显示，CT26中目的基因的mRNA、蛋白表达沉默效率均在50％以上。我们发现重组质粒相对于单沉默组，沉默效率更高，沉默STAT3 表达的同时，会降低PD-L1的表达。越来越多的证据也表明，PD-L1的表达是由信号通路的致癌激活介导，并且还受肿瘤微环境因素的调节。而沉默PD-L1对上游STAT3的影响，有可能是通过降低PI3K、AKT通路进而降低STAT3的表达。
接下来利用电转化技术将重组质粒电转入减毒沙门氏菌，将成功电转的菌落进行扩大培养，留存用于后续动物实验。取一小部分菌液进行测序，在菌液中我们检测到了目的基因片段，因此可以说明电转成功。
接下来先观察转染重组质粒的CT26细胞。CCK-8实验表明重组质粒比单基因转染组更能抑制肿瘤增殖，细胞克隆形成实验同样证实了重组质粒对CT26细胞的增殖抑制作用，细胞划痕实验、Transwell小室实验表明重组质粒对结肠癌细胞迁移能力的影响。重组质粒的效果更好，一方面是STAT3表达沉默所带来的肿瘤抑制作用，shSTAT3与其它治疗措施联合作用的报道层出不穷；一方面有可能是shPD-L1增加了对STAT3的正反馈，免疫抑制分子在非免疫方面的研究有待进一步考证。抑制增殖的途径有很多，我们首先利用流式细胞术检测细胞早期凋亡与晚期凋亡细胞比例，结果显示，重组质粒可以明显促进结肠癌细胞晚期凋亡的比例。STAT3与癌症中的细胞凋亡密切相关，抑制STAT3会导致抑制Bcl-2，从而促进细胞凋亡；shSTAT3同样会增加Cleaved-caspase3、降低CyclinD1的表达，我们的结果也证实了这点，重组质粒起到了与shSTAT3组相同的效果，其作用甚至更明显。然而在用流式细胞术检测细胞周期变化时，发现重组质粒组较对照组有明显的G1期阻滞，但比单沉默组周期阻滞比例低；同时，Western Blot检测周期蛋白CyclinD1发现，重组质粒组蛋白表达最低，我们猜测流式结果与CT26细胞状态有关，也有可能受其它未被确认的机制影响，仍有待商榷。重组质粒对细胞周期的影响，仍需进一步探讨。
体外实验的成功促使我们转向体内动物实验，我们成功构建了皮下荷瘤模型以及原位结直肠癌模型，实验结果表明减毒沙门氏菌携带shSTAT3/shPD-L1重组质粒起到了协同抗肿瘤作用，一方面减毒沙门氏菌能够发挥溶瘤作用，一方面利用其靶向肿瘤部位的载体功能，使重组质粒积聚在肿瘤部位，shPD-L1成功激活免疫系统的功能。在原位结直肠癌模型中，我们检测了脾脏免疫细胞比例的变化，遗憾的是结果没有统计学意义，但是我们期待接下来的研究关注重组质粒对免疫系统更多的影响。
对比例1
本对比例提供的shSTAT3/shPD-L1重组质粒除shPD-L1序列之外，其余序列都与实施例 1相同，本对比例使用的shPD-L1序列为GACGUAAGCAGUGUUGAA(SEQ ID NO.10)。
重组质粒转染CT26细胞后，与shControl组相比，对比例1shSTAT3/shPD-L1重组质粒组STAT3、PD-L1蛋白表达没有变化，无统计学差异；而实施例1shSTAT3/shPD-L1重组质粒组可以有效抑制STAT3、PD-L1表达，差异具有统计学意义，对比结果参见图27，图27 中shControl、shSTAT3、shPD-L1与实施例1相同，shSTAT3/shPD-L1重组质粒为本对比例构建的重组质粒。
重组质粒转染CT26细胞24h后，与shSTAT3组相比，对比例2shSTAT3/shPD-L1重组质粒组凋亡及坏死细胞比例没有统计学差异；而实施例1shSTAT3/shPD-L1重组质粒组凋亡细胞显著下降，差异具有统计学意义，对比结果参见图28，图28中shControl、shSTAT3、shPD-L1与实施例1相同，shSTAT3/shPD-L1重组质粒为本对比例构建的重组质粒。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种短发夹RNA，其特征在于，所述短发夹RNA 为shSTAT3 或shPD-L1，其中shSTAT3
序列如SEQ ID NO.2 所示，shPD-L1 序列如SEQ ID NO.3 所示。
2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒中含有权利要求1 中的shSTAT3 和shPD-L1。
3.根据权利要求2 中所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有PLKO.1 骨架。
4.根据权利要求3 所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO.1
所示。
5.一种减毒沙门氏菌载体，其特征在于，所述减毒沙门氏菌载体含有权利要求4 中所述
的重组质粒。
6.权利要求1 所述的短发夹RNA 在制备结直肠癌及相关实体肿瘤药物中的应用。
7.权利要求2-4 中任一项所述的重组质粒在制备结直肠癌及相关实体肿瘤药物中的应用。
8.权利要求5 所述的减毒沙门氏菌载体在制备结直肠癌及相关实体肿瘤药物中的应用。
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