CN115869404A

CN115869404A - 抑制或下调ttc9c基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用

Info

Publication number: CN115869404A
Application number: CN202210948972.8A
Authority: CN
Inventors: 曹堃; 王航; 张西德; 刘婷婷; 高福; 杨彦勇; 陈媛媛; 李竹青; 杜志鹏; 李俊实
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2022-08-09
Filing date: 2022-08-09
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明涉及基因药物领域，具体是抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。本发明提供TTC9C基因和抑制或下调TTC9C基因表达的试剂的新应用，抑制或下调TTC9C基因表达的试剂能够促进肿瘤细胞照后凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖迁移能力，促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤，有效提高颅内胶质瘤细胞的放射敏感性。

Description

抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用

技术领域

本发明涉及基因药物领域，具体地说，是抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。

背景技术

胶质瘤是威胁人类健康的主要恶性肿瘤之一，主要发生于神经外胚层，占颅内肿瘤的35％～60％，占脑部恶性肿瘤的80％左右，其发病率、术后复发率较高且治愈率较低。恶性脑胶质瘤具有高度的侵袭性，患者预后往往不佳，其平均生存期仅有14个月，5年生存率仅5％。由于恶性脑胶质瘤形成的早期就具有很强的弥散能力，且多处于脑部重要结构，手术无法做到真正的彻底切除，故复发率高。传统的化疗药物难以通过血脑屏障，对脑内胶质瘤的杀灭效果十分有限。由于放射治疗可杀灭或抑制术后残余的肿瘤细胞、降低局部复发率，已成为高级别胶质瘤的标准疗法。然而，恶性脑胶质瘤对于放射治疗普遍不敏感，出现放疗抵抗，限制了放射治疗疗效的进一步发挥。放疗抵抗指的是肿瘤在放疗过程中，能够逐渐适应相应的理化环境变化，从而对射线的杀伤作用产生抵抗效果，极大地限制了放射治疗的临床应用，是放射医学需要攻克的难点。

TTC9C(Tetratricopeptide repeat domain 9C，四肽重复序列结构域9C)，属于TTC蛋白家族。通过GeneCards数据库查询，它位于11号染色体q12.3，定位于62728069-62740293 forward strand。Archive数据库显示TTC9C共计包含6个转录本，其中1、2、4号为蛋白质编码基因，3、5号为无义介导的mRNA降解基因，6号为保守内含子。迄今为止关于TTC9C的研究非常有限，目前国内外仅有2篇文献提及TTC9C基因：Xu等发现TTC9C与毛状细胞器纤毛的功能有关，它可能在斑马鱼胚胎发育过程中的正常身体形状、耳石形成等发挥着重要作用(Xu Y,Cao J,Huang S,et al.Characterization of tetratricopeptiderepeat-containing proteins critical for cilia formation and function.PLoSOne.2015；10(4):e0124378-e0124378.)；Cederstrom等通过分析心肌梗死患者的白细胞基因表达，筛选出TTC9C可能是一个心肌梗死相关的候选基因。以上研究只局限于广泛的基因筛选，并没有对TTC9C发挥功能的具体作用机制进行深入研究(

S,Lundman P,Folkersen L,et al.New candidate genes for ST-elevation myocardialinfarction.J Intern Med.2020；287(1):66-77.)。

抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用国内外至今无人报道。

发明内容

本发明的目的在于提供抑制或下调TTC9C基因表达的试剂的新用途，即抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明的第一方面，提供抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。

进一步的，所述的肿瘤为颅内胶质瘤。

进一步的，所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂是通过CRISPR Cas9技术抑制或下调TTC9C基因表达的试剂。

进一步的，所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂是靶向TTC9C基因的gRNA-cas9，所述的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

5’-TCCGGCCCGATACAAGGCCT-3’(SEQ ID NO:1)；

5’-AGTTATGGAGAAGCGTCTGC-3’(SEQ ID NO:2)；

进一步的，所述的肿瘤放疗增敏药物是促进肿瘤细胞照后凋亡，促进肿瘤细胞G2/S期细胞阻滞，抑制肿瘤细胞的增殖迁移能力，促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤，提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性的药物。

本发明将TTC9C敲除、过表达及NC序列通过聚凝胺(polybrene)转入颅内胶质瘤细胞U87MG、U251中，将细胞放回培养箱中继续培养24h后换液，之后应用Western blot对颅内胶质瘤细胞U87MG、U251的TTC9C蛋白进行检测。结果发现：SEQ ID NO:2敲除质粒可以有效抑制U87MG、U251细胞中表达的TTC9C蛋白。

进一步，对转染TTC9C敲除、过表达及NC序列的U87MG、U251细胞给予不同剂量(0、2、4、8Gy)的⁶⁰Coγ射线照射，然后继续培养2周后采用克隆形成率检测细胞生长和增殖，结果显示：TTC9C敲除细胞照后克隆形成能力显著降低，而TTC9C过表达提高了照后克隆形成能力。同时，本发明给予细胞8Gy的⁶⁰Coγ射线照射，然后继续培养24h后采用Annexin V-FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示：转染TTC9C敲低的U87MG、U251细胞的凋亡率照后明显高于转染NC组及过表达细胞组。

同时，本发明将三种细胞以1×10⁵个/ml密度接种于十二孔板，加2ml DMEM培养基培养；第二天给予细胞8Gy的⁶⁰Coγ射线照射，使用20ul枪头划出横线竖线各3条，分别在day0、day1、day2及day3用显微镜进行拍照，观察细胞的迁移情况。结果显示：TTC9C缺失显著抑制胶质瘤细胞的增殖迁移能力、提高了细胞的放射敏感性、促进了照后凋亡，而过表达效应相反。

进一步，本发明将转染了三种质粒的胶质瘤细胞U87MG在小鼠BALB/C中进行脑部原位荷瘤，第15天给予15Gy的γ射线局部照射，6周后去脑部组织切片，进行KI67和TUNEL染色。结果显示：TTC9C敲除可显著促进颅内胶质瘤的照后凋亡且细胞增殖减缓。

最后，本发明将细胞以2×10⁵个/ml密度接种于六孔板，加2ml DMEM培养基培养；将清洁的载玻片浸入熔融的1％高熔点琼脂糖中并立即擦拭来制备彗星电泳预涂片。第二天给予细胞8Gy的⁶⁰Coγ射线照射，分别在0h、4h及8h处理细胞，进行单细胞凝胶电泳，通过荧光显微镜(Olympus BX60)在10x目标下观察所有凝胶。结果显示：TTC9C敲除的U251细胞的DNA拖尾更长，损伤更为严重。

因此，本发明要求保护抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用。通过抑制TTC9C基因表达，可以提高放射治疗的敏感性，从而提高放射治疗疗效。

本发明的第二方面，提供一种重组载体在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，所述的重组载体中包含抑制或下调TTC9C基因表达的试剂；所述的肿瘤为颅内胶质瘤。

本发明的第三方面，提供一种肿瘤放疗增敏剂，所述的肿瘤放疗增敏剂中包含抑制或下调TTC9C基因表达的试剂；所述的肿瘤为颅内胶质瘤。

进一步的，所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂为靶向TTC9C基因的gRNA-cas9。

进一步的，所述的肿瘤放疗增敏剂中还包含药学上可接受的载体或辅料。

本发明优点在于：

本发明提供TTC9C基因和抑制或下调TTC9C基因表达的试剂的新应用，抑制或下调TTC9C基因表达的试剂能够促进肿瘤细胞照后凋亡，促进肿瘤细胞G2/S期细胞阻滞，抑制肿瘤细胞的增殖迁移能力，促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤，能够有效提高肿瘤细胞的放射敏感性。

附图说明

图1为实施例1中转染TTC9C敲低、过表达及NC序列的正常U251、U87MG细胞TTC9C蛋白的表达情况；

图2为实施例2中转染TTC9C敲低、过表达及NC序列的U251、U87MG细胞照后克隆形成率；

图3为实施例3中转染TTC9C敲低、过表达及NC序列的U251、U87MG细胞照后的凋亡变化；

图4为实施例4中转染TTC9C敲低、过表达及NC序列的U251、U87MG细胞迁移的变化；

图5为实施例5中裸鼠脑胶质瘤颅内原位荷瘤模型的建立；

图6为实施例4中转染TTC9C敲低、过表达及NC序列U87MG细胞原位荷瘤模型的建立与脑部组织免疫组化的变化；

图7为实施例6中转染TTC9C敲低、过表达及NC序列的U251细胞照后DNA损伤变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

材料：细胞株和细胞培养：将恶性脑胶质瘤细胞系U251、U87MG(美国细胞收藏中心)在含有10％胎牛血清的DMEM培养基于37℃、5％CO₂培养箱中培养。药物与主要试剂：药DMEM培养基、胎牛血清、胰酶购自Gibco公司；Annexin V-FITC及PI购自Invitrogen公司。结晶紫、标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、10×转膜液、30％Acry-Bis、Tris-HCl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工程有限公司；抗TTC9C、GAPDH抗体购自abcam。

实施例1：

(1)细胞培养：将U251细胞培养于含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM培养基中；将其细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，每2-3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

(2)细胞转染：感染前24h，将目的细胞接种于六孔板，3×10⁵cell/孔，2ml培养基，当细胞长至70％-80％时进行慢病毒感染。于冰上融化病毒上清，弃去孔中原有的旧培养基，各孔加入1ml新鲜培养基；2ml病毒上清液；1.5μl Polybrene(10μg/μl)，轻轻晃匀。将细胞放回恒温培养箱，继续培养24-48h后，SDS-PAGE凝胶电泳验证TTC9C敲除效果。

(3)在培养基中加入1μg/ml嘌呤霉素进行筛选，72h后仍然存活的细胞即判断为稳转细胞株，提取蛋白，进行Western blot电泳。

结果如图1所示，TTC9C gRNA-cas9转染入U25、U87MG细胞后成功抑制了TTC9C蛋白的表达，TTC9C过表达效果显著。

实施例2：

(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；

(2)细胞克隆形成方法：取转染TTC9C敲除、过表达、NC质粒72h的U87MG、U251细胞，并按不同照射剂量要求接种不同数量的细胞到六孔板中(0，2，4，8Gy剂量接种细胞数量分别为200，400，800和1600个)。三组细胞同时接受γ射线照射，照后继续直至培养皿中出现明显肉眼可见的细胞团块时(约2周)终止培养。弃培养基，PBS洗两次，并采用多聚甲醛固定30分钟，结晶紫染液染色30分钟，流水轻轻冲洗后晾干后进行拍照和计数，计算出细胞存活率。

结果如图2所示：随着照射剂量的增加，TTC9C敲除组的细胞死亡率明显高于NC及过表达组。

实施例3：

(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；

(2)流式细胞仪检测细胞凋亡法：取对数生长期的转入TTC9C敲除、过表达和NC质粒72h后的U87MG、U251细胞(2×10⁵/mL)接种至六孔板中，给予细胞10Gy的⁶⁰Coγ射线照射，然后继续培养24h后，使用不含EDTA的胰酶消化细胞，1500转离心5分钟后PBS洗2遍，采用Annexin V-FITC及PI双染后通过流式细胞仪检测细胞凋亡。

结果如图3所示：TTC9C敲除组的细胞的照后凋亡率明显高于NC和过表达质粒组。

实施例4：

(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；

(2)细胞迁移方法：取对数生长期的转入TTC9C敲除、过表达和NC质粒72h后的U87MG、U251细胞(3×10⁵/mL)接种至六孔板中，37℃、5％CO2培养箱中培养12h，第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜，每孔划三道。PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基继续培养。在第0，1，2，3天4倍镜下进行拍照，保证划痕居中且垂直，背景一致。

结果如图4所示：TTC9C敲除组的细胞迁移受到了抑制，划线视野内的细胞数目减少。

实施例5：

(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；

(2)裸鼠脑胶质瘤颅内原位荷瘤模型的建立

订购雄性4周龄Balb/c-nu/nu裸鼠，饲养1周适应环境后，进行颅内原位荷瘤，具体步骤如下：取处于对数生长期的TTC9C NC、敲除和过表达U87MG细胞，胰酶消化后重悬计数，稀释为2×10⁵/μl浓度，吹匀后吸入微量进样器，至于4℃冰上待用。小鼠气体麻醉后，头部正中切口，剥离骨膜，使用1毫升注射器针头，于前囟左侧2毫米、前侧1毫米处穿破颅骨造孔。使用微量进样器，于造孔处缓慢进针3.5毫米，后退针0.5毫米，之后于3分钟内，缓慢推注5微升U87MG细胞PBS悬液，荷瘤细胞量为1×10⁶。注射完成后，于5分钟内，缓慢退针(如图5)。对合皮下软组织，缝合皮肤，消毒。颅内原位荷瘤裸鼠于荷瘤15天后，进行头颅局部放射处理。具体步骤如下：(1)使用7.5％水合氯醛麻醉裸鼠，固定于裸鼠固定盒中，使用曲别针固定裸鼠四肢及尾部；(2)使用铅砖遮挡裸鼠头部以下部位，暴露头部；(3)使用⁶⁰Co照射源进行15Gyγ射线照射，剂量率为1Gy/min；(4)复苏裸鼠，重新置于鼠笼中继续饲养。在照后6周，剥离脑部肿瘤，将其浸泡于多聚甲醛组织固定液中，室温固定24h进行TUNEL、Ki67染色，分别检测照后裸鼠荷瘤模型肿瘤细胞凋亡和增殖情况的变化。

结果如图6所示：TTC9C敲除组颅内胶质瘤的照后细胞增殖能力受到显著抑制，且细胞照后凋亡比率增加。

实施例6：

(1)细胞培养及细胞转染同实施例1；

(2)彗星电泳检测DNA损伤变化：将三种细胞以1×10⁵个/ml密度接种于十二孔板，加2ml DMEM培养基培养；将清洁的载玻片浸入熔融的1％高熔点琼脂糖中并立即擦拭来制备彗星电泳预涂片。第二天给予3种细胞8Gy的⁶⁰Coγ射线照射，分别在0h、4h及8h用胰酶进行消化，1000rpm离心5min；用PBS液洗一遍，弃上液；用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS将单细胞悬浮液的浓度调节至2×10⁴个细胞/ml，然后将0.4ml的细胞溶液浸入1.2ml的0.65％低熔点琼脂糖中，40℃水浴。将1.6ml细胞悬浮液混合并快速移液到预涂片的表面上并铺均匀；晾干后将玻片轻轻浸于新鲜配置并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解2小时。从裂解液中取出玻片，用电泳液淋洗5秒后移入水平电泳槽，倒满电泳液。25V电泳30分钟。电泳后取出玻片，用双蒸水轻轻清洗。用PI(10μg/ml)染色20分钟，然后用双蒸水轻轻冲洗。

结果如图7所示：照后三种细胞的尾矩及尾相均有增加，但是敲低TTC9C组与转染NC组及对照组有明显差异。说明敲低TTC9C促进了照射对U251细胞的DNA损伤。

统计学处理：上述实施例的所有实验均重复3次以上，结果采用

表示。采用SAS统计软件对相关数据进行t检验，以P<0.05为有显著性差异。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims

1.抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用；所述的肿瘤为颅内胶质瘤。

2.根据权利要求1所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，其特征在于，所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂是通过CRISPR Cas9技术抑制或下调TTC9C基因表达的试剂。

3.根据权利要求2所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，其特征在于，所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂是靶向TTC9C基因的gRNA。

4.根据权利要求3所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，其特征在于，所述的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求1所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤放疗增敏药物是促进肿瘤细胞照后凋亡，促进肿瘤细胞G2/S期细胞阻滞，抑制肿瘤细胞的增殖迁移能力，促进照射对肿瘤细胞的DNA损伤，提高肿瘤细胞对放射治疗的敏感性的药物。

6.一种重组载体在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，其特征在于，所述的重组载体中包含抑制或下调TTC9C基因表达的试剂；所述的肿瘤为颅内胶质瘤。

7.根据权利要求6所述的重组载体在制备肿瘤放疗增敏药物中的应用，其特征在于，其特征在于，所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂为靶向TTC9C基因的gRNA-cas9，所述的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

8.一种肿瘤放疗增敏剂，其特征在于，所述的肿瘤放疗增敏剂中包含抑制或下调TTC9C基因表达的试剂；所述的肿瘤为颅内胶质瘤。

9.根据权利要求8所述的肿瘤放疗增敏剂，其特征在于，所述的抑制或下调TTC9C基因表达的试剂为靶向TTC9C基因的gRNA-cas9，所述的gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示。