CN110151777B - hsa-miR-12462在抗急性髓系白血病中的应用 - Google Patents

hsa-miR-12462在抗急性髓系白血病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体地涉及hsa‑miR‑12462在急性髓系白血病治疗中的应用。实验研究表明，在急性髓系白血病发生发展过程中，hsa‑miR‑12462的表达水平存在明显的变化；在急性髓系白血病和急性髓系白血病细胞中hsa‑miR‑12462表达水平的上调或下调，可以显著促进或抑制细胞分化进程；hsa‑miR‑12462能够明显促进抗急性髓系白血病细胞的凋亡。本发明研究结果表明通过上调hsa‑miR‑12462的表达能够达到治疗急性髓系白血病的目的。基于hsa‑miR‑12462的功能其可用于制备抗急性髓系白血病药物，本发明为开发新的抗急性髓系白血病的药物提供了重要的基础。

Description

hsa-miR-12462在抗急性髓系白血病中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地涉及hsa-miR-12462在急性髓系白血病治疗中的应用。
背景技术
急性髓系白血病(AcuteMyeloidLeukemia，AML)是一种异质性髓细胞肿瘤，也称急性非淋巴细胞性白血病，常进展迅速。其特点是造血干细胞健康分化受阻，恶性肿瘤细胞克隆性增生取代健康造血，从而造成贫血、出血、感染及脏器浸润等一系列症状。在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病在儿童及35岁以下成人中居第一位。在我国，白血病中以急性髓系白血病的年发病率最高，约占所有病例的58.7％。
微小RNA(MicroRNA)是一类长约19～25个核苷酸(nt)的单链小分子RNA，主要通过抑制蛋白翻译或在转录后通过对靶基因表达的调节，影响相关蛋白质的表达，从而调节细胞活动。1993年，分别由两个研究小组在线虫中发现了第一种微小RNA——lin-4，2001年将之正式命名为MicroRNA。随后大量的研究表明，微小RNA的生物学功能几乎涉及到动植物生命活动的方方面面，包括胚胎发育和肿瘤发生过程。胚胎发育是动植物从受精卵到成体的必经之路；肿瘤，包括恶性血液疾病和实体瘤，是生长失控和分化异常的细胞群体，恶性肿瘤严重威胁着人们的身心健康。越来越多的研究已经表明，早期胚胎发育与肿瘤发生发展的生物学行为之间存在许多相似之处。这些研究为从发育生物学角度理解肿瘤的发生发展和为开发下一代肿瘤诊断治疗技术提供了新的科学思维方法。
综上所述，虽然还需要人们进行更系统的基础研究和大量的临床数据，但是将微小RNA用于多种重大恶性疾病的临床诊断和治疗，仍然具有非常光明的前景。
发明内容
本发明提供一种hsa-miR-12462在抗急性髓系白血病中的应用，解决了现有技术中存在的问题，本发明所采用的技术方案是：
一种急性髓系白血病治疗药物，包含hsa-miR-12462。
进一步的，药物至少还包含阿糖胞苷。
hsa-miR-12462在制备抗急性髓系白血病药物中的应用。
进一步的，药物为以hsa-miR-12462为活性成分，加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、香味剂、甜味剂及色素。
进一步的，药物为增加急性髓系白血病细胞对阿糖胞苷的增敏剂。
进一步的，药物为抑制急性髓系白血病细胞的抑制剂。
进一步的，药物为一种抗急性髓系白血病药物组合物，该组合物含有药学上有效量的hsa-miR-12462和药学上有效量的阿糖胞苷及药学上可接受的载体。
进一步的，药物被制药学上可接受的剂型，剂型包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、纳米制剂、注射剂。
本发明确定了hsa-miR-12462在在抗急性髓系白血病细胞的生长、分化和转移方面发挥重要的调控作用，以及hsa-miR-12462在抗急性髓系白血病发生发展中的作用，旨在为寻找新型急性髓系白血病治疗药物提供新的思路和方法，研究结果如下：
(一)hsa-miR-12462在抗急性髓系白血病缓解、难治复发组样本之间的表达、以及在抗急性髓系白血病病人对照组的外周血单个核细胞之间的表达，均具有显著的差异性；
(二)运用WB技术检测WT/MOCK/OE组抗急性髓系白血病细胞株,发现在OEhsa-miR-12462细胞株中GLI1的表达受抑制；
(三)hsa-miR-12462促进抗急性髓系白血病细胞的凋亡；
本发明通过如下方法验证上述结果：
1、收集临床样本
于2015年到2018年收集101例年龄范围为15-71岁。所有患者标本均为参照世界卫生组织2008年急性髓系白血病的诊断标准确诊。标本来源为均中南大学湘雅医院门诊或者住院部的急性髓系白血病患者，同时本实验已通过伦理审核。患者标本分为两组，命名为复发难治/复发组(AML-RR组)、缓解组(AML-CR组)，如表1所示。
单个核细胞提取:
(1)用肝素抗凝管收集新鲜骨髓标本，每份量约1-2mL，按1:1比例用PBS(4℃预冷)稀释骨髓样本。
(2)将2mL人淋巴细胞分离液加入15mL离心管中。用1mL移液枪吸取上述已稀释的骨髓液，将离心管倾斜约45度，沿管壁缓慢将已经稀释的骨髓液覆盖于淋巴细胞分离液液面之上。
(3)用离心机离心0.4rcf/min×20min。
(4)勿晃动取出离心管，可见明显分层。从上到下依次为：血浆、乳白色单个核细胞、透明淋巴细胞分离液以及红细胞。取另一离心管，加入4℃预冷的PBS，用1mL移液枪吸取单个核细胞放入该管并混匀。
(5)0.2rcf/min×5min离心并丢弃上清，予以4℃预冷的PBS重复洗涤2次后进行下一步实验。
Figure BDA0002082358860000031
表1
2、序列:ggaggaggaggaGgauuu
分别收取21份复发/难治和21份缓解样本，通过microRNA芯片技术(microRNAarray)检测复发/难治组与缓解组,通过microrna阵列在CR和R/R患者样本中筛选出87108个基因，233个已知的microrna差异表达使阈值水平翻倍，12个新的microrna在两组之间表现出极为不同，这与癌症密切相关。最高的一个命名为hsa-mir-12462。
3、提取总RNA
(1)将上述已提取的单个核细胞加入1.5mL EP管中，离心1000rpm/min离心5分钟，去除上清(保证细胞量约1-5×106个/mL)。冰上，在上述EP管中加入1mL Trizol，移液枪吹匀，使单个核细胞完全溶解于1ml Trizol中。
(2)每1mLTrizol加入200μL氯仿，震荡混匀30s，室温放置5min后4℃离心12000g×15min。
(3)轻轻取出EP管，管中可见分为明显的三层：上层为RNA层，中层为DNA及蛋白质层，底层为Trizol等有机溶剂及蛋白。小心吸取上层水相至另一1.5mL EP管。每管约吸取500ul。
(4)将500μL异丙醇加入EP管中，轻轻震荡充分混匀，室温放置约10min，将将EP管放置4℃离心机离心，12000g/min,10min；取出EP管，管壁底部可见白色絮状RNA沉积。
(5)倒掉上清，加入用现配75％乙醇1mL，轻轻震荡EP管悬浮RNA沉淀，4℃离心7500g×5min；尽量弃上清。
(6)将离心管放置室温干燥10-20min后，加入适量RNA无酶水。
(7)将提取的RNA标本进行测定A260/A280比值和RNA的浓度。
(8)收集AML及正常细胞株，按照上诉实验步骤提取AML细胞珠总RNA。
4、测miR逆转录及QPCR定量反应
逆转录体系:
将模板RNA置于冰上溶解，mRQ Buffer和ddH2O室温溶解；轻柔混匀试剂盒中各种组份，短暂离心后置于冰上保存；准备反转录反应液，将表2中试剂加入预冷的RNase-free反应管置终体积为10uL。
试剂 体积
mRQ Buffer(2X) 5
RNA样本 3.75
mRQ Enzyme 1.25
总体积 10
表2
反应条件：37℃，60min；85℃，5min；4℃冷却。
QPCR定量反应
(1)解冻并轻柔混匀试剂盒中的SYBR，短暂离心使离心管中试剂集中于底部，冰上保存；
(2)建立25μL的反应体系，按表3将各组分加入无核酸酶的96孔板中，混匀。
Figure BDA0002082358860000041
Figure BDA0002082358860000051
表3
(3)设置反应条件：
预变性：95℃，10s
变性(40个循环)：95℃，5sec；退火：60℃，20s；延伸：72℃，10s。
实验结果:在急性髓系白血病患者中,缓解组较难治复发组hsa-miR-12462表达高。
6、细胞增殖的检测
(一)、CCK8
(1)将HL-60和U937细胞野生型、阴性对照株、过表达hsa-miR-12462表达株按5000个细胞/100ul接种于六孔板并放入培养箱培养五天,(为减少实验误差，每株设置三个副孔并列接种两块六孔板)
(2)0h、24h、48h、72h、96h、120h分别从六孔板中取100ul接种于96孔板(不同处理的细胞均设置三个副孔)；
(3)每孔加入10ul的CCK-8溶液；
(4)在细胞培养箱内继续孵育2-2.5小时；
(5)将孵育好的细胞放入吸光仪中，测各样本在450nm测定吸光度。
Figure BDA0002082358860000052
Figure BDA0002082358860000061
表4
(二)、EDU
将HL-60和U937细胞野生型、阴性对照株、过表达hsa-miR-12462表达株用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)；
每孔加入100μL 50μM EdU培养基孵育2小时，离心后重悬；
PBS清洗细胞1～2次，每次5分钟。
细胞固定化
每孔加入100μL细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟；
每孔加入2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；
每孔加入100μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，离心后PBS重悬；
每孔加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟；PBS清洗1次，5分钟后离心后PBS重悬。
Apollo染色
每孔加入100μL的1X
Figure BDA0002082358860000062
染色反应液(表3)，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，离心后PBS重悬；
加入100μL渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次10分钟，离心后弃渗透剂重悬；
每孔每次加入100μL甲醇清洗1～2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。
DNA染色
用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1X Hoechst33342反应液；
每孔加入100μL 1X Hoechst 33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，离心后弃渗透剂弃染色反应液重悬；
每孔每次加入100μL PBS清洗1～3次。
实验结果证明：CCK8、EDU结果验证在AML细胞株HL-60、U937中，过表达hsa-miR-12462可以抑制AML细胞的增殖。
7、细胞凋亡的检测
(1)U937、HL60细胞株(野生型、阴性对照株、过表达hsa-miR-12462表达株)1×106/mL中12孔板,加入4um阿糖胞苷/孔，培养24H收集细胞(平行4个复孔)。
(2)按照Annexin V-APC/7-AAD试剂盒方法进行处理上机前处理。
方法：
1.1000rpm×5min，用预冷PBS溶液洗涤细胞2次，离心弃上清。
2.5×Binding Buffer用PBS稀释成1×Binding Buffer，4度预冷，取适量1×Binding Buffer重悬细胞沉淀，使细胞浓度约为1×106个细胞/mL。
3.将每株细胞均分为四管，每管中加入100μL细胞悬液，约1×105个细胞/每管。
4.每株细胞均按表5加样。
Figure BDA0002082358860000071
表5
5.轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15分钟。
6.无需洗涤，每管加入380μL预冷1×Binding Buffer。
(3)处理后的细胞上流式细胞仪检测凋亡率。
8.CCK8加药实验:
将U937、HL60细胞的野生型、阴性对照株、过表达分别用不同浓度的阿糖胞苷处理48h，运用CCK-8方法测定细胞生长抑制率。野生型、阴性对照株、过表达hsa-miR-12462相比较，从而验证hsa-miR-12462在AML中对阿糖胞苷敏感性的影响。
实验结果证明:hsa-miR-12462可以增强细胞对阿糖胞苷的敏感性，尤其对其诱导的细胞凋亡有明显促进作用。
8、细胞周期的检测
(1)饥饿12H后再换1640培养基培养12H,收集5×105的U937、HL60细胞株(野生型、阴性对照株、过表达hsa-miR-12462表达株)于流式管中。
(2)1000rpm×5min，离心弃上清，用4℃预冷PBS洗涤1次，离心弃上清。
(1)在上述EP管中分别加入1ml DNA Staining solution和10ulPermeabilization solution重悬细胞沉淀,涡旋震荡5-10秒混匀，室温避光孵育30分钟。
(4)处理后的细胞上流式细胞仪检测细胞周期。
实验结果证明:过表达hsa-miR-12462,AML细胞S期明显减少.HL60细胞中过表达hsa-miR-12462后阿糖胞苷药物敏感性的作用在G0/G1阶段的滞留率明显高于阴性对照。
9、裸鼠成瘤模型
从湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司购买BALB/c雄鼠(4周、雌性)，在中南大学动物实验中心SPF级饲养。前述构建的过表达hsa-miR-12462表达株细胞U937和空载组LV-Control细胞培养后收集，PBS洗2次，用无血清培养基1640重悬，调整密度为5×106个/毫升。消毒裸鼠左前肢腋下周围的皮肤后，以上各组细胞用1ml无菌注射器分别注射到4周龄的BALB/c雌鼠左前肢腋下的皮下，每只裸鼠注射150μL细胞悬液，每组接种9只裸鼠。自皮下种植瘤细胞后，每天探视一次裸鼠的一般生长状况并每周测量裸鼠腋下肿瘤的大小，肿瘤体积计算公式为V(mm3)＝(L×W2)×0.5(V：肿瘤体积，L：瘤体长径，W：瘤体短径)。皮下种植5周后拍MRI并脱颈处死各组裸鼠，取出肿瘤拍照。每个瘤体切取一小块，制作成石蜡标本，石蜡标本切片，行HE染色.该动物学实验通过了中南大学动物学部的审核，全程管理处理动物谨遵中南大学动物学部要求的人道主义原则。
实验结果证明:过表达miR hsa-miR-12462后，肿瘤体积、质量明显减小。10、蛋白质印迹法(Western blot)
蛋白样品制备
(1)使用巴氏管将HL60、U937细胞(野生型、阴性对照株、过表达hsa-miR-12462表达株)从培养瓶内取出，分别放入15ml离心管，离心1000rpm/min×5min，弃上清。用4℃预冷的PBS反复洗涤2次后移入1.5mL离心管，置于冰上。
(2)蛋白裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂的混合液按100:1:1比例配置，置于冰上。
(3)按每106约50～100μL以上混合液加入1.5mL离心管中，放置于冰上裂解约30分钟，期间每隔10分钟放置振荡器上震荡混匀一次。
(4)待蛋白充分裂解后，在超声破碎仪对蛋白进行冰上超声。
(5)将离心管放入4℃离心机，以12000rpm/min离心20min。
(6)取出离心管，吸取上清至1.5mL无菌离心管中，进行蛋白浓度测定，如暂不进行下一步实验，则保存于-80℃冰箱。
测定蛋白含量(BCA法)
(1)冰上解冻标准蛋白样品溶液，用超纯水将25mg/mL的浓度标准蛋白样品溶液稀释至终浓度为0.5mg/mL。
(2)根据样本总数量，计算总需工作液，按照体积50:1，将试剂盒中的A液和B液按充分混匀，制成所需工作液。
(3)将上述蛋白标准品溶液(0.5mg/mL)按0、1、2、4、8、12、16加到96孔板中，再加入超纯水使每孔总体积均为16μL。
(4)取实验样本蛋白约1～2μL加至同一96孔板孔中，超纯水稀释体积至16μL。(设置两个复孔)。
(5)在以上各孔中均加入由A、B试剂配好的BCA工作液200μL，置于37℃恒温箱孵育30分钟。
(6)取出96孔板，去除气泡，放入酶标仪检测562nm波长处蛋白样本的吸光度(OD值)。绘制标准曲线后算出原蛋白样本的浓度并计算出上样量。
凝胶电泳
(1)流动水洗净玻璃板，吹干，对齐放入制胶夹，卡紧于制胶架上。
(2)按SDS-PAGE分离胶(8％)配置方法配置下层胶，1ml移液枪吹打混匀，移液枪沿着一角匀速灌胶，最后使用ddH2O封胶。
(3)待水胶界面出现表明胶已经凝固，约1小时。缓慢倒去上层ddH2O。参照SDS-PAGE浓缩胶(5％)的配置方法配制上层浓缩胶，同样的方法混匀后快速进行灌胶，灌胶完毕后立即将梳子插入浓缩胶中，注意不能有气泡形成。
(4)待胶体完全凝固后，将其从制胶夹中取下，用电泳夹卡紧后放入盛有现配的电泳缓冲液的电泳槽中，电泳缓冲液水平面约为玻璃杯的中下1/3交界处。
(5)取出蛋白样本，放于冰上溶解，测浓度，按体积4:1加入5×SDS上样缓冲液，充分震荡混匀，置于100℃干式加热器中加热5min-10min使蛋白变性。变性后将样品迅速置于冰上冷却。
(6)上样：加入5-10μL蛋白Marker，并根据蛋白样品浓度计算上样量(50μg)，在梳孔中用10μL移液枪加入已充分混匀的蛋白样本。
(7)电泳：先以100V恒压电泳跑上层胶，当溴酚蓝带跑至下层胶时，改120V电泳，溴酚蓝带接近胶底时停止电泳，进行转膜。
转膜
(1)将现配转膜液放4℃冰箱预冷，将已电泳完的胶板浸泡于4℃预冷的转膜缓冲液中，取出胶条，根据蛋白Marker切出目的蛋白所在分离胶区域，裁剪大小一致PVDF膜，置于甲醇中浸泡5分钟，将浸泡后的PVDF膜覆盖于分离胶上。
(2)按以下顺序放置好：转膜夹负极—海绵—滤纸—胶—PVDF膜—滤纸—海绵—转膜夹正极，叠好后夹紧转膜夹。
(3)将上述转膜夹放入转膜槽中，倒入4℃预冷的转膜缓冲液约900ml，直至覆盖海绵，置入冰盒中，以240mA恒流转膜，时长约90分钟。
(4)转膜结束，取出PVDF膜，注意正反，做好标记。
免疫反应
(1)BSA封闭。按照5％BSA配置封闭液，将标记好的PVDF膜放入配好的5％BSA封闭液中，室温于摇床上缓慢摇动，封闭约1-2小时。
(2)一抗孵育。封闭结束后，用1XTBST缓冲液于摇床快速摇动清洗3遍PVDF膜，每次10分钟，滤纸吸干PVDF膜，放入一抗孵育盒中，加入已用一抗稀释液配至好的适当浓度的一抗，置于4℃冰箱过夜。(注意一抗需覆盖整条PVDF膜)
(3)二抗孵育。将PVDF膜从一抗孵育盒中取出，放入1XTBST缓冲液中于摇床上快速摇动清洗3遍，每次10分钟；放入二抗孵育盒中，加入已用二抗稀释液配至好的适当浓度的二抗，室温于摇床上缓慢摇动，孵育1小时。
(4)将孵育好的PVDF膜放入1XTBST缓冲液中于摇床上快速摇动，反复清洗3遍，每次大约10分钟。
化学发光成像
(1)取出PVDF膜，用滤纸吸干后置于培养皿中，加入适量发光液。
(2)置于化学发光凝胶成像仪中。用成像软件Image Lab获取蛋白成像条带。
实验结果证明:miR hsa-miR-12462主要是通过抑制GLI1影响AML细胞。
附图说明
图1a是hsa-miR-12462的基因图；
图1b是12个新的microrna在两组之间表现图；
图2是hsa-miR-12462抑制增殖的实验验证图；
图3是hsa-miR-12462促凋亡的实验验证图；
图4是hsa-miR-12462影响周期的实验验证图；
图5是hsa-miR-12462裸鼠成瘤的实验验证图；
图6是hsa-miR-12462WB的实验验证图；
具体实施方式
参考图1～6
1、收集临床样本
于2015年到2018年收集101例年龄范围为15-71岁。所有患者标本均为参照世界卫生组织2008年急性髓系白血病的诊断标准确诊。标本来源为均中南大学湘雅医院门诊或者住院部的急性髓系白血病患者，同时本实验已通过伦理审核。患者标本分为两组，命名为复发难治/复发组(AML-RR组)、缓解组(AML-CR组)。
单个核细胞提取:
(1)用肝素抗凝管收集新鲜骨髓标本，每份量约1-2mL，按1:1比例用PBS(4℃预冷)稀释骨髓样本。
(2)将2mL人淋巴细胞分离液加入15mL离心管中。用1mL移液枪吸取上述已稀释的骨髓液，将离心管倾斜约45度，沿管壁缓慢将已经稀释的骨髓液覆盖于淋巴细胞分离液液面之上。
(3)用离心机离心0.4rcf/min×20min。
(4)勿晃动取出离心管，可见明显分层。从上到下依次为：血浆、乳白色单个核细胞、透明淋巴细胞分离液以及红细胞。取另一离心管，加入4℃预冷的PBS，用1mL移液枪吸取单个核细胞放入该管并混匀。
(5)0.2rcf/min×5min离心并丢弃上清，予以4℃预冷的PBS重复洗涤2次后进行下一步实验。
2、序列:ggaggaggaggaGgauuu
3、提取总RNA
(1)将上述已提取的单个核细胞加入1.5mL EP管中，离心1000rpm/min离心5分钟，去除上清(保证细胞量约1-5×106个/mL)。冰上，在上述EP管中加入1mL Trizol，移液枪吹匀，使单个核细胞完全溶解于1ml Trizol中。
(2)每1mLTrizol加入200μL氯仿，震荡混匀30s，室温放置5min后4℃离心12000g×15min。
(3)轻轻取出EP管，管中可见分为明显的三层：上层为RNA层，中层为DNA及蛋白质层，底层为Trizol等有机溶剂及蛋白。小心吸取上层水相至另一1.5mL EP管。每管约吸取500ul。
(4)将500μL异丙醇加入EP管中，轻轻震荡充分混匀，室温放置约10min，将将EP管放置4℃离心机离心，12000g/min,10min；取出EP管，管壁底部可见白色絮状RNA沉积。
(5)倒掉上清，加入用现配75％乙醇1mL，轻轻震荡EP管悬浮RNA沉淀，4℃离心7500g×5min；尽量弃上清。
(6)将离心管放置室温干燥10-20min后，加入适量RNA无酶水。
(7)将提取的RNA标本进行测定A260/A280比值和RNA的浓度。
(8)收集AML及正常细胞株，按照上诉实验步骤提取AML细胞珠总RNA。
4、测miR逆转录及QPCR定量反应
逆转录体系:
将模板RNA置于冰上溶解，mRQ Buffer和ddH2O室温溶解；轻柔混匀试剂盒中各种组份，短暂离心后置于冰上保存；准备反转录反应液，将表6中试剂加入预冷的RNase-free反应管置终体积为10uL。
试剂 体积
mRQ Buffer(2X) 5
RNA样本 3.75
mRQ Enzyme 1.25
总体积 10
表6
反应条件：37℃，60min；85℃，5min；4℃冷却。
QPCR定量反应
(1)解冻并轻柔混匀试剂盒中的SYBR，短暂离心使离心管中试剂集中于底部，冰上保存；
(2)建立25μL的反应体系，按表7将各组分加入无核酸酶的96孔板中，混匀。
Figure BDA0002082358860000121
Figure BDA0002082358860000131
表7
(3)设置反应条件：
预变性：95℃，10s
变性(40个循环)：95℃，5sec；退火：60℃，20s；延伸：72℃，10s。
5、蛋白质印迹法(Western blot)
蛋白样品制备
(1)使用巴氏管将各实验细胞从培养瓶内取出，分别放入15ml离心管，离心1000rpm/min×5min，弃上清。用4℃预冷的PBS反复洗涤2次后移入1.5mL离心管，置于冰上。
(2)蛋白裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂的混合液按100:1:1比例配置，置于冰上。
(3)按每106约50～100μL以上混合液加入1.5mL离心管中，放置于冰上裂解约30分钟，期间每隔10分钟放置振荡器上震荡混匀一次。
(4)待蛋白充分裂解后，在超声破碎仪对蛋白进行冰上超声。
(5)将离心管放入4℃离心机，以12000rpm/min离心20min。
(6)取出离心管，吸取上清至1.5mL无菌离心管中，进行蛋白浓度测定，如暂不进行下一步实验，则保存于-80℃冰箱。
测定蛋白含量(BCA法)
(1)冰上解冻标准蛋白样品溶液，用超纯水将25mg/mL的浓度标准蛋白样品溶液稀释至终浓度为0.5mg/mL。
(2)根据样本总数量，计算总需工作液，按照体积50:1，将试剂盒中的A液和B液按充分混匀，制成所需工作液。
(3)将上述蛋白标准品溶液(0.5mg/mL)按0、1、2、4、8、12、16加到96孔板中，再加入超纯水使每孔总体积均为16μL。
(4)取实验样本蛋白约1～2μL加至同一96孔板孔中，超纯水稀释体积至16μL。(设置两个复孔)。
(5)在以上各孔中均加入由A、B试剂配好的BCA工作液200μL，置于37℃恒温箱孵育30分钟。
(6)取出96孔板，去除气泡，放入酶标仪检测562nm波长处蛋白样本的吸光度(OD值)。绘制标准曲线后算出原蛋白样本的浓度并计算出上样量。
凝胶电泳
(1)流动水洗净玻璃板，吹干，对齐放入制胶夹，卡紧于制胶架上。
(2)按SDS-PAGE分离胶(8％)配置方法配置下层胶，1ml移液枪吹打混匀，移液枪沿着一角匀速灌胶，最后使用ddH2O封胶。
(3)待水胶界面出现表明胶已经凝固，约1小时。缓慢倒去上层ddH2O。参照SDS-PAGE浓缩胶(5％)的配置方法配制上层浓缩胶，同样的方法混匀后快速进行灌胶，灌胶完毕后立即将梳子插入浓缩胶中，注意不能有气泡形成。
(4)待胶体完全凝固后，将其从制胶夹中取下，用电泳夹卡紧后放入盛有现配的电泳缓冲液的电泳槽中，电泳缓冲液水平面约为玻璃杯的中下1/3交界处。
(5)取出蛋白样本，放于冰上溶解，测浓度，按体积4:1加入5×SDS上样缓冲液，充分震荡混匀，置于100℃干式加热器中加热5min-10min使蛋白变性。变性后将样品迅速置于冰上冷却。
(6)上样：加入5-10μL蛋白Marker，并根据蛋白样品浓度计算上样量(50μg)，在梳孔中用10μL移液枪加入已充分混匀的蛋白样本。
(7)电泳：先以100V恒压电泳跑上层胶，当溴酚蓝带跑至下层胶时，改120V电泳，溴酚蓝带接近胶底时停止电泳，进行转膜。
转膜
(1)将现配转膜液放4℃冰箱预冷，将已电泳完的胶板浸泡于4℃预冷的转膜缓冲液中，取出胶条，根据蛋白Marker切出目的蛋白所在分离胶区域，裁剪大小一致PVDF膜，置于甲醇中浸泡5分钟，将浸泡后的PVDF膜覆盖于分离胶上。
(2)按以下顺序放置好：转膜夹负极—海绵—滤纸—胶—PVDF膜—滤纸—海绵—转膜夹正极，叠好后夹紧转膜夹。
(3)将上述转膜夹放入转膜槽中，倒入4℃预冷的转膜缓冲液约900ml，直至覆盖海绵，置入冰盒中，以240mA恒流转膜，时长约90分钟。
(4)转膜结束，取出PVDF膜，注意正反，做好标记。
免疫反应
(1)BSA封闭。按照5％BSA配置封闭液，将标记好的PVDF膜放入配好的5％BSA封闭液中，室温于摇床上缓慢摇动，封闭约1-2小时。
(2)一抗孵育。封闭结束后，用1XTBST缓冲液于摇床快速摇动清洗3遍PVDF膜，每次10分钟，滤纸吸干PVDF膜，放入一抗孵育盒中，加入已用一抗稀释液配至好的适当浓度的一抗，置于4℃冰箱过夜。(注意一抗需覆盖整条PVDF膜)
(3)二抗孵育。将PVDF膜从一抗孵育盒中取出，放入1XTBST缓冲液中于摇床上快速摇动清洗3遍，每次10分钟；放入二抗孵育盒中，加入已用二抗稀释液配至好的适当浓度的二抗，室温于摇床上缓慢摇动，孵育1小时。
(4)将孵育好的PVDF膜放入1XTBST缓冲液中于摇床上快速摇动，反复清洗3遍，每次大约10分钟。
化学发光成像
(1)取出PVDF膜，用滤纸吸干后置于培养皿中，加入适量发光液。
(2)置于化学发光凝胶成像仪中。用成像软件Image Lab获取蛋白成像条带。
6、细胞增殖的检测
(1)将HL-60和U937细胞株野生型及转染过表达hsa-miR-12462株按5000个细胞/100ul接种于六孔板并放入培养箱培养一周,(为减少实验误差，每株设置三个副孔并列接种两块六孔板)
(2)0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、172h分别从六孔板中取100ul接种于96孔板(不同处理的细胞均设置三个副孔)；
(3)每孔加入10ul的CCK-8溶液；
(4)在细胞培养箱内继续孵育2-2.5小时；
(5)将孵育好的细胞放入吸光仪中，测各样本在450nm测定吸光度。
hl60 WT MOCK OE
Day0 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Day1 1.65 1.37 1.48 1.79 1.93 1.56 1.89 2.06 1.62 1.74 1.79
Day2 3.53 4.00 3.99 3.99 3.41 3.74 3.86 3.55 3.16 3.43 3.36
Day3 5.69 6.47 6.50 6.54 4.55 5.56 5.69 5.20 3.91 4.05 4.14
Day4 6.66 6.59 6.60 6.97 3.83 5.18 5.02 4.67 3.03 3.50 3.49
u937 WT MOCK OE
Day0 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
Day1 1.92 1.78 1.72 1.85 1.69 1.43 1.45 1.71 1.59 1.55 1.55
Day2 2.11 2.03 2.31 2.27 1.77 1.68 1.78 1.98 1.52 1.71 1.75
Day3 5.72 5.66 5.71 5.38 4.62 3.83 4.52 4.77 3.78 3.54 3.82
Day4 7.05 6.42 6.53 7.02 5.40 4.95 5.47 5.32 4.18 3.85 3.97
表8
实验结果证明：CCK8、EDU结果均在AML细胞株HL-60、U937中，过表达hsa-miR-12462可以抑制AML细胞的增殖。
7、细胞凋亡的检测
(1)收集经不同处理的U937、HL60细胞株(野生株、过表达株)，约2×106-1×107/mL，置于1.5ml EP管中。
(2)按照Annexin V-APC/7-AAD试剂盒方法进行处理上机前处理。
方法：
1.1000rpm×5min，用预冷PBS溶液洗涤细胞2次，离心弃上清。
2.5×Binding Buffer用PBS稀释成1×Binding Buffer，4度预冷，取适量1×Binding Buffer重悬细胞沉淀，使细胞浓度约为1×106个细胞/mL。
3.将每株细胞均分为四管，每管中加入100μL细胞悬液，约1×105个细胞/每管。
4.每株细胞均按表9加样。
Figure BDA0002082358860000161
表9
5.轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15分钟。
6.无需洗涤，每管加入380μL预冷1×Binding Buffer。
(3)处理后的细胞上流式细胞仪检测凋亡率。
8、CCK8加药实验:
将U937、HL60细胞的野生型、阴性对照株、过表达分别用不同浓度的阿糖胞苷处理48h，运用CCK-8方法测定细胞生长抑制率。野生型、阴性对照株、过表达hsa-miR-12462相比较，从而验证hsa-miR-12462在AML中对阿糖胞苷敏感性的影响。
实验结果证明:hsa-miR-12462可以增强细胞对阿糖胞苷的敏感性，尤其对其诱导的细胞凋亡有明显促进作用。
9、细胞周期的检测
(1)饥饿12H后再换1640培养基培养12H,收集5×105的U937、HL60细胞株(野生株、过表达株)于流式管中。
(2)1000rpm×5min，离心弃上清，用4℃预冷PBS洗涤1次，离心弃上清。
(3)在上述EP管中分别加入1ml DNA Staining solution和10ulPermeabilization solution重悬细胞沉淀,涡旋震荡5-10秒混匀，室温避光孵育30分钟。
(4)处理后的细胞上流式细胞仪检测细胞周期。
实验结果证明:过表达hsa-miR-12462,AML细胞S期明显减少.HL60细胞中过表达hsa-miR-12462后阿糖胞苷药物敏感性的作用在G0/G1阶段的滞留率明显高于阴性对照。
9.裸鼠成瘤模型
从湖南斯莱克景达实验动物有限责任公司购买BALB/c雄鼠(4周、雌性)，在中南大学动物实验中心SPF级饲养。前述构建的过表达细胞U937和空载组LV-Control细胞培养后收集，PBS洗2次，用无血清培养基1640重悬，调整密度为5×106个/毫升。消毒裸鼠左前肢腋下周围的皮肤后，以上各组细胞用1ml无菌注射器分别注射到4周龄的BALB/c雌鼠左前肢腋下的皮下，每只裸鼠注射150μL细胞悬液，每组接种9只裸鼠。自皮下种植瘤细胞后，每天探视一次裸鼠的一般生长状况并每周测量裸鼠腋下肿瘤的大小，肿瘤体积计算公式为V(mm3)＝(L×W2)×0.5(V：肿瘤体积，L：瘤体长径，W：瘤体短径)。皮下种植5周后脱颈处死各组裸鼠，取出肿瘤拍照。每个瘤体切取一小块，制作成石蜡标本，石蜡标本切片，行HE染色.该动物学实验通过了中南大学动物学部的审核，全程管理处理动物谨遵中南大学动物学部要求的人道主义原则。
实验结果证明:过表达miR hsa-miR-12462后，肿瘤体积、质量明显减小。
10、蛋白质印迹法(Western blot)
蛋白样品制备
(1)使用巴氏管将各实验细胞从培养瓶内取出，分别放入15ml离心管，离心1000rpm/min×5min，弃上清。用4℃预冷的PBS反复洗涤2次后移入1.5mL离心管，置于冰上。
(2)蛋白裂解液RIPA与蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸酶抑制剂的混合液按100:1:1比例配置，置于冰上。
(3)按每106约50～100μL以上混合液加入1.5mL离心管中，放置于冰上裂解约30分钟，期间每隔10分钟放置振荡器上震荡混匀一次。
(4)待蛋白充分裂解后，在超声破碎仪对蛋白进行冰上超声。
(5)将离心管放入4℃离心机，以12000rpm/min离心20min。
(6)取出离心管，吸取上清至1.5mL无菌离心管中，进行蛋白浓度测定，如暂不进行下一步实验，则保存于-80℃冰箱。
测定蛋白含量(BCA法)
(1)冰上解冻标准蛋白样品溶液，用超纯水将25mg/mL的浓度标准蛋白样品溶液稀释至终浓度为0.5mg/mL。
(2)根据样本总数量，计算总需工作液，按照体积50:1，将试剂盒中的A液和B液按充分混匀，制成所需工作液。
(3)将上述蛋白标准品溶液(0.5mg/mL)按0、1、2、4、8、12、16加到96孔板中，再加入超纯水使每孔总体积均为16μL。
(4)取实验样本蛋白约1～2μL加至同一96孔板孔中，超纯水稀释体积至16μL。(设置两个复孔)。
(5)在以上各孔中均加入由A、B试剂配好的BCA工作液200μL，置于37℃恒温箱孵育30分钟。
(6)取出96孔板，去除气泡，放入酶标仪检测562nm波长处蛋白样本的吸光度(OD值)。绘制标准曲线后算出原蛋白样本的浓度并计算出上样量。
凝胶电泳
(1)流动水洗净玻璃板，吹干，对齐放入制胶夹，卡紧于制胶架上。
(2)按SDS-PAGE分离胶(8％)配置方法配置下层胶，1ml移液枪吹打混匀，移液枪沿着一角匀速灌胶，最后使用ddH2O封胶。
(3)待水胶界面出现表明胶已经凝固，约1小时。缓慢倒去上层ddH2O。参照SDS-PAGE浓缩胶(5％)的配置方法配制上层浓缩胶，同样的方法混匀后快速进行灌胶，灌胶完毕后立即将梳子插入浓缩胶中，注意不能有气泡形成。
(4)待胶体完全凝固后，将其从制胶夹中取下，用电泳夹卡紧后放入盛有现配的电泳缓冲液的电泳槽中，电泳缓冲液水平面约为玻璃杯的中下1/3交界处。
(5)取出蛋白样本，放于冰上溶解，测浓度，按体积4:1加入5×SDS上样缓冲液，充分震荡混匀，置于100℃干式加热器中加热5min-10min使蛋白变性。变性后将样品迅速置于冰上冷却。
(6)上样：加入5-10μL蛋白Marker，并根据蛋白样品浓度计算上样量(50μg)，在梳孔中用10μL移液枪加入已充分混匀的蛋白样本。
(7)电泳：先以100V恒压电泳跑上层胶，当溴酚蓝带跑至下层胶时，改120V电泳，溴酚蓝带接近胶底时停止电泳，进行转膜。
转膜
(1)将现配转膜液放4℃冰箱预冷，将已电泳完的胶板浸泡于4℃预冷的转膜缓冲液中，取出胶条，根据蛋白Marker切出目的蛋白所在分离胶区域，裁剪大小一致PVDF膜，置于甲醇中浸泡5分钟，将浸泡后的PVDF膜覆盖于分离胶上。
(2)按以下顺序放置好：转膜夹负极—海绵—滤纸—胶—PVDF膜—滤纸—海绵—转膜夹正极，叠好后夹紧转膜夹。
(3)将上述转膜夹放入转膜槽中，倒入4℃预冷的转膜缓冲液约900ml，直至覆盖海绵，置入冰盒中，以240mA恒流转膜，时长约90分钟。
(4)转膜结束，取出PVDF膜，注意正反，做好标记。
免疫反应
(1)BSA封闭。按照5％BSA配置封闭液，将标记好的PVDF膜放入配好的5％BSA封闭液中，室温于摇床上缓慢摇动，封闭约1-2小时。
(2)一抗孵育。封闭结束后，用1XTBST缓冲液于摇床快速摇动清洗3遍PVDF膜，每次10分钟，滤纸吸干PVDF膜，放入一抗孵育盒中，加入已用一抗稀释液配至好的适当浓度的一抗，置于4℃冰箱过夜。(注意一抗需覆盖整条PVDF膜)
(3)二抗孵育。将PVDF膜从一抗孵育盒中取出，放入1XTBST缓冲液中于摇床上快速摇动清洗3遍，每次10分钟；放入二抗孵育盒中，加入已用二抗稀释液配至好的适当浓度的二抗，室温于摇床上缓慢摇动，孵育1小时。
(4)将孵育好的PVDF膜放入1XTBST缓冲液中于摇床上快速摇动，反复清洗3遍，每次大约10分钟。
化学发光成像
(1)取出PVDF膜，用滤纸吸干后置于培养皿中，加入适量发光液。
(2)置于化学发光凝胶成像仪中。用成像软件Image Lab获取蛋白成像条带。
实验结果证明:miR hsa-miR-12462主要是通过抑制GLI1影响AML细胞.
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种急性髓系白血病治疗药物，其特征在于：包含hsa-miR-12462，其序列为：ggaggaggaggaggauuu。
2.根据权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物至少还包含阿糖胞苷。
3.hsa-miR-12462在制备抗急性髓系白血病药物中的应用；hsa-miR-12462序列为：ggaggaggaggaggauuu。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为以hsa-miR-12462为活性成分，加入一种或多种药学上可接受的辅料，所述辅料包括药学领域常规的填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、稳定剂、香味剂、甜味剂及色素。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为增加急性髓系白血病细胞对阿糖胞苷的增敏剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制急性髓系白血病细胞的抑制剂。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为一种抗急性髓系白血病药物组合物，该组合物含有药学上有效量的hsa-miR-12462和药学上有效量的阿糖胞苷及药学上可接受的载体。
8.根据权利要求4-7任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物被制成药学上可接受的剂型，所述剂型包括：片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、缓释制剂、纳米制剂、注射剂。
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Applicant after: THE FIRST AFFILIATED HOSPITAL OF JINAN University (GUANGZHOU OVERSEAS CHINESE Hospital)

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