CN110967490A - Abin3在制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ABIN3在制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。本发明以ABIN3肝脏特异性转基因小鼠及野生型小鼠为实验对象,构建肝脏缺血再灌注损伤模型,结果表明与野生型小鼠对比,肝脏特异性ABIN3转基因小鼠的肝脏坏死则明显被抑制。此外,本发明还构建了ABIN3过表达和敲低的原代肝细胞,建立缺氧复氧模型,结果表明与对照组病毒对比,ABIN3蛋白敲低可显著促进炎症因子及凋亡因子的表达,促进缺氧复氧导致的肝细胞损伤;而ABIN3蛋白过表达可显著抑制炎症因子及凋亡因子的表达,进而减轻肝细胞的损伤。本发明方案提供ABIN3作为药物靶标筛选治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物,ABIN3及其激动剂可用于制备治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物。
Description
技术领域
本发明涉及基因的功能与应用领域,特别涉及一种泛素链结合蛋白,即与A20结合的核因子κB抑制蛋白3(A20 binding inhibitor of NF-κB activation,ABIN3)在制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。
背景技术
缺血再灌注损伤是指组织缺血缺氧达到一定的时间和程度引起细胞发生病理改变,在恢复血液供应后不一定使病变的细胞恢复功能,反而在一定条件下出现进一步加重的现象。临床上广泛的肝叶切除术以及肝移植术等常需部分或完全阻断肝脏血流,而肝脏是一个对缺血缺氧非常敏感的器官,因此不可避免地发生缺血再灌注损伤。肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic Ischemia Reperfusion Injury,HIRI)机制相当复杂,确切的发病机制仍不十分清楚。目前,对于肝脏缺血再灌注损伤发生机制的研究己成为移植界关注的热点。肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP迅速耗尽,导致乳酸酮体等的堆积,及线粒体氧化磷酸化功能低下,引发代谢性酸中毒;ATP含量的下降,导致肝细胞内外Ca2+重新分布,即Ca2+内流,引起线粒体的损伤;肝脏缺血再灌注损伤可以分为两个时限,早期阶段以Kupffer细胞激活为主要特征。Kupffer细胞可以释放大量的氧自由基或超氧阴离子,可以引起肝细胞的急性损伤。在缺血再灌注损伤的第二阶段,Kupffer细胞激活以后,可以引起大量的炎症因子的释放,激活炎症反应通路,使大量的中性粒细胞在肝脏内浸润。中性粒细胞在肝脏内浸润后可以通过释放氧自由基和蛋白酶,引起严重的肝功能损害。
众多文献资料表明缺血再灌注损伤可能与下列因素有关:1.氧自由基的生成;2.钙超载;3.细胞因子的参与;4.Kupffer细胞及中性粒细胞激活;5.内皮素和一氧化氮浓度的失衡。总之,肝脏缺血再灌注损伤是由各种机制相互影响,综合作用的结果,进一步了解及明确其作用机制,将对临床防治肝脏缺血再灌注损伤有着重要的意义。
发明内容
为解决上述现有技术的缺陷和不足,本发明的目的在于研究ABIN3基因的表达与肝脏缺血再灌注损伤之间的相互关系,提供一种ABIN3在制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。
为实现上述目的,本发明的方案如下:
第一方面,本发明提供一种ABIN3在制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。
作为优选方案,所述ABIN3即与A20结合的核因子κB抑制蛋白3作为靶基因用以设计并制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或生物学试剂。
进一步地,所述ABIN3基因作为药物靶点,构建与ABIN3基因敲除的体外细胞模型或动物模型,用于筛选预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物。
本发明以野生型(Wild type,WT)小鼠以及ABIN3肝脏特异性基因过表达小鼠(HTG)作为实验对象,通过构建小鼠肝脏缺血再灌注损伤的模型来研究ABIN3基因的功能,结果发现与WT小鼠对比,小鼠肝脏缺血再灌注后,HTG小鼠表现出肝损伤减轻的现象。
另外,本发明以ABIN3过表达/敲低的腺病毒为实验材料,以小鼠原代肝细胞作为实验对象,通过构建小鼠原代肝细胞缺氧复氧的模型来研究ABIN3基因的功能,结果发现与对照组病毒相比,腺病毒敲低ABIN3蛋白可显著促进炎症因子Tnfa、IL6及凋亡因子Bcl-2、Bax mRNA的表达,促进肝细胞损伤;而腺病毒过表达ABIN3蛋白可显著抑制炎症因子Tnfa、IL6及凋亡因子Bcl-2、BaxmRNA的表达,进而缓解肝细胞的损伤。
这表明,在肝脏缺血再灌注过程中,ABIN3的表达及升高能减弱肝损伤的过程。因此,ABIN3基因可作为药物靶点,构建ABIN3基因敲除的体外细胞模型或动物模型,用于筛选预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物;ABIN3可作为基因治疗中的靶基因,设计并制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或生物学试剂,通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤的目的。
附图说明
图1 ABIN3肝脏特异性过表达小鼠的Western Blotting鉴定结果。
图中:与WT组(野生型小鼠,ABIN3未过表达)对比,HTG(ABIN3肝脏特异性过表达小
鼠)组的ABIN3蛋白表达量显著升高,说明ABIN3肝脏特异性过表达小鼠构建成功。
图2 ABIN3肝脏特异性过表达对肝缺血再灌注损伤影响的研究。
图中:ABIN3肝脏特异性过表达小鼠肝缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)
诱导的小鼠肝脏损伤中,肝脏坏死区域的HE染色结果。与WT组相比,缺血再灌注后ABIN3肝
脏特异性过表达小鼠肝脏损伤面积减小。
图3腺病毒过表达ABIN3的小鼠原代肝细胞的Western Blotting鉴定结果。
图中:与AdGFP组(腺病毒过表达对照)对比,AdABIN3组(ABIN3腺病毒过表达载体)
的ABIN3蛋白表达量上调,说明该腺病毒可以很好地过表达ABIN3,后续细胞实验可以选用
该腺病毒进行实验研究。
图4腺病毒过表达ABIN3对小鼠原代肝细胞缺氧复氧刺激的影响。
图中:ABIN3过表达后H/R(缺氧复氧的刺激)诱导的小鼠原代肝细胞损伤中,炎症
因子Il-6、Tnf-α及凋亡因子Bax、Bcl-2的mRNA的检测结果(n.s.表示P≥0.05,*表示0.01≤
P<0.05,**表示P<0.01)。与对照组相比,ABIN3过表达后,缺氧复氧导致的小鼠肝细胞损伤
减轻。
图5腺病毒敲低ABIN3的小鼠原代肝细胞的Western Blotting鉴定结果。
图中:与AdshNC组(腺病毒空载体)对比,AdshABIN3-1#和AdshABIN3-3#组(ABIN3
腺病毒敲低载体)的ABIN3蛋白表达量并无显著差异,而AdshABIN3-2#组(ABIN3腺病毒敲低
载体)的ABIN3蛋白表达量下调,说明该腺病毒可以很好地敲低ABIN3,后续细胞实验可以选
用该腺病毒进行实验研究。
图6腺病毒敲低ABIN3对小鼠原代肝细胞缺氧复氧刺激的影响。
图中:ABIN3敲低后H/R(缺氧复氧的刺激)诱导的小鼠原代肝细胞损伤中,炎症因
子Il-6、Tnf-α及凋亡因子Bax、Bcl-2的mRNA的检测结果(n.s.表示P≥0.05,*表示0.01≤P<
0.05,**表示P<0.01)。与对照组相比,ABIN3敲低后,缺氧复氧导致的小鼠肝细胞损伤加重。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步地详细描述。
以下实施例所用化学试剂都是常规试剂,均可商购获得。未做特殊说明的实验方法都是采用本领域已知的常规方法。
在以下实施例中所采用的动物模型及各研究指标的检测方法:
实验动物:选用8-10周龄、体重在24g-27g、背景为雄性C57BL/6品系的野生型(Wild type,WT)小鼠(购自北京华阜康生物科技股份有限公司)为实验对象。
动物饲养:所有实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级实验动物中心。饲养条件:室温在22-24℃之间,湿度在40-70%之间,明暗交替照明时间为12h,自由饮水摄食。
小鼠原代肝细胞分离自WT小鼠肝组织,步骤如下:
1)紫外线照射超净工作台30分钟,用水浴锅预温培养基。用鼠尾胶包被培养皿,吹干待用。
2)原位肝脏灌流:麻醉固定小鼠,消毒,开放全腹,将肝脏上推,肠道下推,暴露门静脉及下腔静脉,留置针穿刺门静脉,固定,注入SC-1灌流液30ml-35ml,待肝脏肿胀发白,穿刺下腔静脉,灌流至清亮。
3)消化细胞:改用SC-2灌流液,灌流中观察肝脏薄膜消化情况:压迫肝脏后不再回缩,表面出现渗出、被膜下肝组织呈现糜烂状时判断肝脏已被消化充分,可以终止灌注。
4)分离细胞:消化完成后将肝脏完整取下,置于无菌平皿中,用眼科镊轻轻将肝脏被膜撕下,用即M199培养液冲洗肝脏,并借助吸管吹打的机械作用来促进肝细胞的分离。不停吸走混悬液至一离心管并加入新的M199培养基,最终收集至该离心管中。40um筛网过滤,然后50g、4℃离心2min,弃上清,重悬细胞,50g、4℃离心2min,弃上清,加完全培养基重悬细胞,接种于鼠尾胶包被的6孔板中(每孔细胞量为5×105个)。于37℃,5%二氧化碳培养箱中静置培养。
细胞均培养于DMEM高糖培养基(含10%FBS,1%青霉素-链霉素)中。培养环境:37℃,5%CO2。
腺病毒敲低/过表达ABIN3原代肝细胞的构建:
ABIN3敲低/过表达腺病毒均购自汉恒生物。
分离的原代肝细胞培养4h后换液,换液4h后感染腺病毒,每孔病毒量1×1011pfu/ml。腺病毒感染小鼠原代肝细胞48h后,收集细胞,提蛋白,进行Western Blotting检测,检测ABIN3蛋白的表达。
Western Blotting检测:
1)蛋白提取
原代肝细胞蛋白提取:小鼠原代肝细胞加入裂解液,裂解完成后离心取上清,运用BCA Protein Assay Kit(PierecTM,23225)定量收集蛋白样品。
组织中蛋白提取:向于干冰中预冷的EP管重放入3-4颗钢珠,并加入称重定量之后的组织样本。向裂解液中加入PMSF,混匀后加至样品中,迅速摇匀。于-80℃预冷研磨仪适配器中研磨样品,研磨参数设置为30Hz/s,90s。研磨结束后于冰上放置10min,取出钢珠。之后用超声裂解仪裂解样本,完成后冰上放置10min。之后将样本放入4℃预冷的离心机中,12000rpm/min离心30min,吸取上清转移到新的EP管中,4℃,14000rpm/min离心10min。之后吸取上清转移到新的EP管中继续离心,4℃,14000rpm/min离心5min。准确吸取上清液并利用BCA Protein Assay Kit进行蛋白定量。
2)上样与电泳
配置好电泳凝胶,并在电泳槽内加入电泳液。把蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内,点样完成后开始电泳。
3)转膜
①配制转膜液,于4℃预冷。
②将PVDF在甲醇中浸泡15s后放入转膜液中备用。
③取出凝胶板中的凝胶,用转膜液洗涤凝胶,将凝胶平铺在负极的滤纸上,将PVDF膜覆盖其上,夹上夹板。
④将夹板放入转膜槽中,灌满转膜液以淹没凝胶。
⑤转膜槽接通电源,电压设为250V,电流设为0.2A。转移1.5h。
⑥转移结束后,取出PVDF膜。
4)封闭
把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中,洗去膜上的转膜液。蛋白膜放入封闭液中,在摇床上缓慢摇动,室温封闭1-4h。
5)一抗孵育
①用TBST洗涤蛋白膜3次,每次5min。
②封口机将薄膜封入杂交袋中,加上一抗。
③将杂交袋放入4℃摇床中,过夜。
6)二抗孵育
①将薄膜取出用TBST洗涤3次,每次5min,回收一抗。
②将膜放入对应的加有二抗的二抗稀释液中,避光孵育1h。
7)蛋白检测
孵育后用TBST洗涤3次,每次5min。利用Bio-Rad Chemi Doc XRS+凝胶成像系统检测目的条带。
抗体:anti-ABIN3(5303,ProSci);anti-β-actin(ab8226,Abcam,mouse);;anti-Flag(M185-3L,MBL)。
原代肝细胞缺氧复氧步骤:
小鼠原代肝细胞分为4组:腺病毒空载对照组、腺病毒敲低或过表达ABIN3对照组、腺病毒空载实验组、腺病毒敲低或过表达ABIN3实验组。小鼠原代肝细胞铺板(密度为80%)6h后,进行腺病毒感染,腺病毒感染36h后,两个对照组更换含10%血清的DMEM培养基并正常培养,两个实验组更换无血清DMEM/F12培养基并放入模块化培养箱(Biospherix,Lacona,NY,USA)进行细胞缺氧(1%氧气,5%二氧化碳和94%氮气的混合物)的孵育。60min缺氧孵育后,实验组更换含10%血清的DMEM高糖培养基,细胞在95%空气和5%二氧化碳的常压条件下继续培养12h。
RT-PCR实验步骤如下:
1)小鼠原代肝细胞RNA的提取
①小鼠原代肝细胞培养于6孔板中,细胞经1×PBS清洗后,每孔加入1ml TRizol,在冰上吹打裂解,并吸入1.5ml离心管中,漩涡混匀器震荡30s,室温静置5min,使核蛋白完全从核酸上解离;
②4℃12000r/min离心5min,取上清液,加氯仿200μl,漩涡混匀器震荡30s,冰盒上静置10min;
③4℃12000r/min离心15min,取上清液,加入0.5ml异丙醇,充分混匀,冰盒上静置10min,使RNA充分沉淀;
④4℃12000r/min离心15min,弃去上清,加入1ml预冷的75%乙醇,漩涡混匀器震荡30s洗涤RNA沉淀;
⑤4℃12000r/min离心5min,弃去上清液,沉淀快速风干。提取RNA加适量的DEPC去离子水溶解。
2)反转录
使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(04896866001,Roche,Basel,Switzerland)反转录试剂盒根据试剂盒说明书进行反转录实验。
荧光定量PCR引物信息:
基因 | 正向引物 | 反向引物 |
Il6 | Gaggataccactcccaacagacc(SEQ1) | aagtgcatcatcgttgttcataca(SEQ2) |
Tnfα | caggcggtgcctatgtctc(SEQ3) | cgatcaccccgaagttcagtag(SEQ4) |
Bcl-2 | atgcctttgtggaactatatggc(SEQ5) | ggtatgcacccagagtgatgc(SEQ6) |
Bax | tgagcgagtgtctccggcgaat(SEQ7) | gcactttagtgcacagggccttg(SEQ8) |
β-actin | gtgacgttgacatccgtaaaga(SEQ9) | gccggactcatcgtactcc(SEQ10) |
ABIN3肝脏特异性转基因小鼠的构建:
为制备肝细胞特异性ABIN3转基因小鼠(ABIN3-HTG),将小鼠ABIN3全长cDNA插入小鼠白蛋白启动子(ALB)下游,将ALB-ABIN3表达载体(PiggyBac系统)微注射入已受精的C57BL/6J(WT)受精卵中,最后用Westernblot实验鉴定肝细胞特异性过表达ABIN3转基因小鼠(HTG)。
小鼠肝脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤模型的构建:
1)手术前12h给小鼠禁食,可自由饮水。
2)手术前用3%戊巴比妥钠成功麻醉小鼠后,将其平卧固定肢体,用剃毛器将小鼠腹部术区毛刮净,用10%碘酒和75%乙醇对术区消毒。
3)取腹正中切口进腹,暴露肝脏左、中叶之肝蒂。
4)用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉,使约70%的肝脏缺血,以防止发生严重肠系膜静脉淤血。0.5min后,与非阻断的右叶相比,可见阻断叶变白,说明阻断成功。此时,注意记录缺血开始时间,维持缺血60min,期间用湿的盐水纱布覆盖切口,并注意小鼠的保温(Sham组的小鼠与手术组小鼠平行操作,但不进行血流阻断)。
5)缺血60min后去除血管夹,恢复缺血的肝脏血流,然后关闭腹腔。手术后小鼠置单独饲养,观察,到达预定的时间点后取材。
实施例1肝脏特异性ABIN3过表达减轻缺血再灌注导致的损伤
取ABIN3肝脏特异性转基因小鼠的肝脏组织,提蛋白,进行Western Blotting检测,检测ABIN3蛋白的表达。检测结果发现,与WT组(野生型小鼠,ABIN3未过表达)对比,HTG(ABIN3肝脏特异性过表达小鼠)组的ABIN3蛋白表达量显著升高(图1),说明ABIN3肝脏特异性过表达小鼠构建成功。
鉴定完成后,WT小鼠及HTG小鼠分为4组:WT小鼠对照组、HTG小鼠对照组、WT小鼠实验组、HTG小鼠实验组。对照组进行假手术(Sham),实验组小鼠同时进行肝缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)手术。手术完成后12h取小鼠肝脏组织制作石蜡切片,进行HE染色,以观察小鼠肝脏组织损伤情况。HE染色结果如图2所示,无论是WT小鼠还是HTG小鼠,对照组的肝损伤区域均无显著性差异,而针对肝脏进行缺血再灌注的刺激后,与WT小鼠相比,HTG小鼠实验组的肝损伤区域显著降低,说明过表达ABIN3可以缓解肝损伤的进程。
实施例2过表达ABIN3缓解缺氧复氧刺激导致的肝细胞损伤
ABIN3过表达腺病毒感染小鼠原代肝细胞后,收集细胞,提蛋白,进行WesternBlotting检测,检测ABIN3的表达。检测结果发现,与AdGFP组(腺病毒过表达对照)对比,AdABIN3组(ABIN3腺病毒过表达载体)的ABIN3蛋白表达量上调,说明该腺病毒可以很好地过表达ABIN3,后续细胞实验可以选用该腺病毒进行实验研究(图3)。
鉴定完成后,将AdGFP组细胞及AdABIN3组细胞各分为2组,即AdGFP对照组(AdGFP-sham)、AdABIN3对照组(AdABIN3-sham)、AdGFP实验组(AdGFP-12h)、AdABIN3实验组(AdABIN3-12h)。对照组正常培养,实验组进行缺氧复氧刺激。刺激完成后12h收集各组细胞进行RT-PCR检测,检测炎症以及凋亡相关分子的表达,以评价细胞的损伤情况。
细胞荧光定量PCR结果如图4所示,AdGFP-sham组和AdABIN3-sham组的炎症因子Tnfa、IL6及凋亡分子Bcl-2、Bax均无显著性差异,而进行缺氧复氧刺激后,与AdGFP-12h组相比,AdABIN3-12h组的炎症因子Tnfa、IL6及凋亡分子Bcl-2、Bax指标显著降低,说明过表达ABIN3可以抑制肝细胞缺氧复氧导致的损伤。
实施例3 ABIN3敲低促进缺氧复氧刺激导致的肝细胞损伤
ABIN3敲低腺病毒感染小鼠原代肝细胞后,收集细胞,提蛋白,进行WesternBlotting检测,检测ABIN3的表达。检测结果发现,与AdshNC组(腺病毒空载体)对比,AdshABIN3-1#和AdshABIN3-3#组(ABIN3腺病毒敲低载体)的ABIN3蛋白表达量并无显著差异,而AdshABIN3-2#组(ABIN3腺病毒敲低载体)的ABIN3蛋白表达量下调,说明该腺病毒可以很好地敲低ABIN3,后续细胞实验可以选用该腺病毒进行实验研究(图5)。
鉴定完成后,将AdshNC组细胞及AdshABIN3-2组细胞各分为2组,即AdshNC对照组(shNC-sham)、AdshABIN3-2对照组(shABIN3-sham)、AdshNC实验组(shNC-12h)、AdshABIN3-2实验组(shABIN3-12h)。对照组正常培养,实验组进行缺氧复氧刺激。刺激完成后12h收集各组细胞进行RT-PCR检测,检测炎症以及凋亡相关分子的表达,以评价细胞的损伤情况。
细胞荧光定量PCR结果如图6所示,shNC-sham组和shABIN3-sham组的炎症因子Tnfa、IL6及凋亡分子Bcl-2、Bax均无显著性差异,而进行缺氧复氧刺激后,与shNC-12h组相比,shABIN3-12h组的炎症因子Tnfa、IL6及凋亡分子Bcl-2、Bax指标显著升高,说明抑制ABIN3的表达可以促进肝细胞缺氧复氧导致的损伤。
序列表
<110> 武汉大学
<120> ABIN3在制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaggatacca ctcccaacag acc 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagtgcatca tcgttgttca taca 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caggcggtgc ctatgtctc 19
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgatcacccc gaagttcagt ag 22
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgcctttgt ggaactatat ggc 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtatgcacc cagagtgatg c 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgagcgagtg tctccggcga at 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcactttagt gcacagggcc ttg 23
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgacgttga catccgtaaa ga 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccggactca tcgtactcc 19
Claims (3)
1.一种ABIN3在制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的ABIN3在制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用,其特征在于:所述ABIN3即与A20结合的核因子κB抑制蛋白3作为靶基因用以设计并制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或生物学试剂。
3.根据权利要求2所述的ABIN3在制备预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用,其特征在于:所述ABIN3基因作为药物靶点,构建与ABIN3基因敲除的体外细胞模型或动物模型,用于筛选预防、缓解和/或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物。
Priority Applications (1)
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WO2003000580A1 (fr) * | 2001-05-30 | 2003-01-03 | Hitachi, Ltd. | Systeme d'elevation |
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