CN111514167B - 阿胶在用于缓解细胞氧化应激损伤产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种阿胶在用于缓解细胞氧化应激损伤产品中的应用，涉及生物制药技术领域。将阿胶用于制备可以调控培养对象基因表达的产品，可调控基因包括氧化应激损伤修复和应激反应相关的基因。将阿胶应用于培养物中可以缓解氧化应激损伤对培养对象基因表达水平的改变。

Description

阿胶在用于缓解细胞氧化应激损伤产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，尤其是涉及一种阿胶在用于缓解细胞氧化应激损伤产品中的应用。

背景技术

阿胶是一味传统中药，在中国具有两千多年的食用历史，它是由黑驴皮熬制而成，主要成分为胶原蛋白降解产物，还含有多肽、多糖、酮类、杂环化合物和无机元素等。阿胶在2000多年的食用过程中，广泛被用于补血止血，促进造血；扩张血管，改善微循环；抗疲劳，延缓衰老；提高人体免疫力等。然而，上述疾病的发病机制与氧化应激损伤相关。到目前为止，未见阿胶抗氧化应激及调节相关基因表达产品的发明。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明第一目的在于提供阿胶在制备用于调控培养对象基因表达组合物中的应用，该组合物可以缓解氧化应激对培养对象基因表达水平的改变。

本发明第二目的在于提供阿胶或上述用于调控培养对象基因表达组合物在制备缓解细胞氧化应激损伤产品中的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了阿胶在制备用于调控培养对象基因表达组合物中的应用，所述组合物用于调控培养对象基因的表达水平；所述基因包括氧化应激损伤修复和应激反应相关的基因。为了方便描述，“用于调控培养对象基因表达的组合物”在下文中也表述为“组合物”或“阿胶基因调控组合物”。

本发明通过实验发现，利用双氧水诱导小鼠成纤维细胞(MEF)发生氧化应激损伤时，在培养基中添加阿胶，提取对照组，损伤组，及阿胶实验组中MEF细胞的mRNA进行RNASeq基因表达分析后，发现含有阿胶的培养基能够调控小鼠成纤维细胞基因的表达，尤其是调控经氧化应激损伤后表达量发生变化的基因。当MEF细胞受氧化损伤后，阿胶的处理能调节一部分基因对氧化应激损伤进行修复，以及调节由氧化损伤导致相关基因表达量的变化，即培养物中的阿胶降低了MEF细胞在氧化应激压力下大部分上调和/或下调基因表达量的改变程度。

本发明中，RNAseq测序及数据分析方法如下：

转录组测序参考图10所示流程图，具体方法如下：提取样品总RNA并使用DNase消化DNA后，用带有oligo(dT)的磁珠富集MEF细胞mRNA；加入打断试剂将mRNA打断成短片段，以打断后的mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后配制第二链合成反应体系合成第二条cDNA链，并使用试剂盒纯化双链cDNA；纯化的双链cDNA进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Aglilent2100Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina HiSeqXTMTen测序仪进行测序。

基因表达水平分析参考图11所示流程图，具体分析方法如下：

一个基因表达水平的直接体现就是其丰度情况，基因丰度程度越高，则基因表达水平越高。在转录组测序分析中，通过定位到基因组区域或基因外显子区的测序序列(Reads)的计算来估计基因的表达水平。Read计数除了与基因的真实表达水平成正比外，还与基因的长度和测序深度成正相关。

在一些可选的实施例中，培养对象可被调控的基因包括DNA损伤修复基因、细胞周期调控相关基因、促细胞死亡基因和抗细胞死亡基因。

在一些可选的实施例中，所述组合物至少上调了部分DNA损伤修复基因，促进了DNA损伤的修复，以缓解氧化应激压力。与DNA损伤修复相关的基因包括但不限于Mcm3ap、Mcm2、Mcm5、Pola1、Pole、Pold2、Pole2、Mcm4、Rfc4、Pola2、Rnaseh2c、Prim1、Prim2、Mcm6、Pole3、Rpa2、Rfc5、Mcm7、Dna2、Pold1、Mcm3和Lig1中的一种或多种。

在一些可选的实施例中，所述阿胶基因调控组合物还能调控细胞周期相关基因，包括但不限于下调Cdk14、Cdk16、Mad2l1bp和Cdk13中的至少一种，和/或，上调Mcm3ap、Cdc45、Dbf4、Mcm2、Mcm5、Cdc6、Mcm4、Smc3、Rbl1、Cdc7和Wee1中的至少一种。

在一些可选的实施例中，所述阿胶基因调控组合物还参与调控促细胞死亡基因和/或抗细胞死亡基因。本发明中细胞死亡包括但不限于细胞凋亡、细胞坏死、细胞焦亡和细胞自噬等细胞死亡形式。促细胞死亡基因指的是促进细胞死亡这一生理过程相关的基因，抗细胞死亡相关基因指的是缓解细胞死亡这一生理过程相关的基因。所述阿胶基因调控组合物优选下调促细胞死亡基因，例如：本发明实施例发现，含有阿胶的组合物能够下调如下细胞凋亡通路相关基因：Bbc、Ctsd、Ern1、Capn1、Capn10、Capn2和Itpr2中的至少一种；以及能够下调和细胞坏死通路相关的如下基因：Capn10、Casp1和Parp3中的至少一种。所述阿胶基因调控组合物优选上调抗细胞死亡基因。

在另一些可选的实施例中，所述阿胶基因调控组合物对培养对象基因的调控还通过以下一个或多个基因的调控来体现：

上调葡萄糖醛酸酯代谢过程相关基因、细胞葡萄糖醛酸化过程相关基因、类黄酮代谢过程相关基因、外源性葡萄糖醛酸化相关基因和类黄酮葡萄糖醛酸化相关基因中的一种或多种；和/或，下调细胞周期相关基因、染色质沉默调节相关基因、细胞器组织调节相关基因、DNA构象变化相关调节基因和染色体组织调控相关基因中的一种或多种。

在一些优选的实施例中，所述组合物的培养对象包括哺乳动物细胞，其中哺乳动物包括但不限于人、猪、牛、羊、猴、小鼠和大鼠中的一种或多种，在一些具体的实施例中，哺乳动物细胞包括成纤维细胞，例如小鼠成纤维细胞。

本发明提供的阿胶在制备基因调控组合物中的应用，所述组合物可以为培养基、培养基的添加剂或其他具有培养功能的产品等，组合物的剂型包括但不限于粉剂、固体、半固体或液体等。在一些可选地实施例中，阿胶基因调控组合物包括培养基，所述培养基中除去阿胶外，还可以包括本领域可接受的用于培养动物细胞的其他成分，包括但不限于基础培养基，例如DMEM培养基、H-DMEM培养基、MEM培养基或RPMI-1640培养基等；血清，例如胎牛血清；抗生素，例如青霉素和链霉素等。

在一个具体的实施例中，所述阿胶基因调控组合物以DMEM培养基为基础培养基，其中添加10％v/v的FBS和1％v/v的PS(Penicillin-Streptomycin,青链霉素)，并添加阿胶至组合物中阿胶的总浓度为0.3～300μg/mL。

在一些优选的实施例中，所述阿胶基因调控组合物中阿胶的使用浓度为0.3～300μg/mL，但不限于为0.3μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL或300μg/mL，当培养对象为MEF细胞时，组合物中阿胶的使用浓度优选为30μg/mL。其中“使用浓度”指的是组合物中阿胶对培养细胞起到基因调控作用时的最适终浓度。可以理解为，当组合物未被使用时，其中阿胶以独立包装提供，也可以和组合物中的其他成分或其他部分以混合包装提供。

基于本发明所述的阿胶基因调控组合物对培养对象的基因调控作用以及阿胶改善双氧水诱导细胞损伤模型下细胞幸存指标的作用，结合阿胶对体外培养细胞无毒副作用的优势，本发明还提供了阿胶或阿胶基因调控组合物用于缓解细胞氧化应激损伤产品中的应用。含有阿胶的组合物能够对培养对象的应激修复相关基因进行调控，这些基因被调控后可以提高细胞对氧化应激的抵抗能力，及细胞幸存率，因此阿胶可以用于制备缓解细胞氧化应激损伤的产品。所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、药物或培养基等。所述产品通过其中的阿胶成分实现对细胞氧化应激损伤的抵抗作用。

在一些优选的实施例中，所述细胞包括哺乳动物细胞，其中哺乳动物包括但不限于人、猪、牛、羊、猴、小鼠和大鼠中的一种或多种，在一些具体的实施例中，哺乳动物细胞包括小鼠成纤维细胞。

在一些可选的实施方式中，所述产品中阿胶的使用浓度为0.3～300μg/mL，但不限于为0.3μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL或300μg/mL。

基于阿胶对基因调控的作用以及缓解细胞氧化应激损伤的作用，在一些可选的实施例中，阿胶还可以制备用于抗细胞氧化应激的药物，或用于预防和/或治疗氧化应激引起细胞损伤相关疾病的药物，其中细胞死亡包括但不限于细胞凋亡、细胞坏死、细胞焦亡或细胞自噬。所述药物通过阿胶对细胞凋亡、细胞坏死、细胞焦亡和细胞自噬中的至少一种起到预防和/或治疗的作用。与细胞死亡相关的疾病包括但不限于败血症、脑卒中、神经退行性疾病和伴有炎症释放综合症的疾病，其中所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿氏舞蹈病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症中的至少一种。

本发明提供了阿胶在制备基因调控组合物中的应用，阿胶在制备用于缓解细胞氧化应激损伤产品中的应用，以及阿胶在制备药物中的应用。本发明涉及的阿胶可以商业购买，例如市售的阿胶块或阿胶粉。当将阿胶应用于制备基因调控组合物和/或用于缓解细胞氧化应激损伤产品时，所述阿胶可选地包括阿胶块、或阿胶粉溶解于超纯水或PBS缓冲液后得到的阿胶溶液，优选将上述阿胶溶液作为储液备用，储液浓度优选300mg/mL。所述阿胶也可以包括阿胶的提取物和/或阿胶的酶解产物。阿胶的提取物指的是从阿胶中提取得到的活性成分，所述活性成分与阿胶的生物或生理功能相同。所述酶解产物指的是阿胶经酶解后得到的产物，并且所述酶解产物和阿胶的生物或生理功能相同，酶解产物的实例包括但不限于阿胶经胃蛋白酶和/或胰蛋白酶酶解后的产物。所述活性成分和所述酶解产物分别独立的包括但不限于无机化合物、多肽、酯类和蛋白质中的一种或多种，蛋白质中优选含有胶原蛋白。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的阿胶在制备用于调控培养对象基因表达组合物中的应用，能够对氧化应激损伤引起的培养对象相关基因进行调控和修复，将氧化应激压力下发生表达水平改变的基因进行上调或下调，进而将氧化应激压力下培养对象的基因表达量调控到正常水平。

本发明提供的阿胶或上述组合物在制备用于缓解细胞氧化应激损伤产品中的应用，缓解细胞培养过程中的常见问题，改善体外培养的细胞状态同时降低了在氧化应激诱导细胞死亡的比例。

由于传统中药在中国具有两千多年的食用历史，且是临床常用的保健品，因此将阿胶应用于制备药物无毒副作用，用于预防和/或治疗氧化应激引起细胞损伤相关的药物的开发提供了新的思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施例或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同浓度阿胶溶液在加入培养基后对MEF细胞的毒副作用；

图2为在双氧水诱导细胞损伤模型下不同浓度阿胶的药理学作用及抗MEF细胞损伤效果；

图3为在双氧水诱导细胞损伤模型下，以对照组为基准、300μg/ml阿胶实验组、双氧水损伤组的差异性表达基因的热图(heatmap)结果；

图4为对照组基因表达与H₂O₂损伤组和300μg/ml阿胶实验组的Pearson相关性研究结果；

图5为对照组、300μg/ml阿胶实验组、双氧水损伤组的三组差异性表达基因比较的韦恩分析结果，具体两两比较的组别分别为：H₂O₂ vs对照组；H₂O₂ vs阿胶处理组；阿胶处理组vs对照组；

图6为H₂O₂ vs对照组，H₂O₂ vs阿胶处理组，和阿胶处理组vs对照组差异性表达基因的数量统计图；

图7为H₂O₂ vs对照组，H₂O₂ vs阿胶处理组，和阿胶处理组vs对照组差异性表达基因GO-BP分析中上调基因或下调基因所在信号通路的种类；

图8为对照组、300μg/ml阿胶实验组、双氧水损伤组的三组差异性表达基因在凋亡信号转导通路和细胞坏死转导通路上不同基因的表达情况；

图9为对照组、300μg/ml阿胶实验组、双氧水损伤组的三组差异性表达基因在细胞周期调控通路和DNA损伤修复转导通路上不同基因的表达情况；

图10为RNAseq测序实验流程；

图11为差异性表达基因分析方法流程。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提及的方法中各步骤的执行顺序，除特别说明外，并不限于本文的文字所体现出来的顺序，即各个步骤的执行顺序是可以改变的，且两个步骤之间根据需要可以插入其他步骤。

术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括已列举要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

下文公开提供了许多不同的实施方式或例子用来说明阿胶基因表达调控功能。为了简化本申请的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，其目的不在于限制本申请。此外，本申请可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施方式和/或设置之间的关系。此外，本申请提供了多种特定工艺和材料例子，但本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《生物信息学(第3版)》(科学出版社)、《细胞生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

材料和试剂：

MEF细胞：小鼠成纤维细胞从ICR孕鼠(13.5-14天)中提取。ICR孕鼠购买于维通利华。

DMEM培养基：购于Gibco公司，为DMEM高糖培养基。

DMEM完全培养基：DMEM培养基，10％FBS(Gibco公司胎牛血清)，1％PS(Penicillin-Streptomycin,青链霉素(双抗)，Gibco)。

0.6mM H₂O₂诱导细胞损伤的培养基：DMEM培养基，10％FBS，1％PS，终浓度0.6mMH₂O₂。

ATP检测试剂：购于Promega公司(货号：G7571)。

PBS缓冲液：购于Gibco公司(货号：10010049)。

Trizol裂解液：购于Invitrogen公司(货号：15596018)。

阿胶：由山东东阿阿胶有限公司提供。

实施例1

(1)首先将阿胶商品块利用机械外力磨成小碎块，用PBS进行溶解，利用高压灭菌锅进行常规的高压灭菌(121℃，灭菌30分钟)，此过程的主要目的是使阿胶块充分溶解且灭菌后的阿胶液能直接用于细胞培养。将灭菌后的阿胶液用PBS配置成300mg/ml的储存液，低速(800rpm/min)离心5min，去除上层的油脂和杂质。配好的阿胶储存液(浓度300mg/ml)放在4℃保存。在进行细胞培养时预先在37℃预热。

(2)LDH检测不同浓度阿胶对体外培养MEF细胞的毒副作用。

(a)获取小鼠胚胎成纤维细胞：

实验材料准备：

①动物：孕期13.5至14天的孕鼠(小鼠)。

②试剂：无Ca²⁺和Mg²⁺的PBS(D-PBS)、0.05％胰酶、MEF生长培养基(高糖DMEM+10％FBS+双抗)。

③器械：眼科直剪3把、眼科直镊3把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套、200目尼龙滤网、50ml和15ml离心管和手术刀片。以上物品均需要高压灭菌消毒处理。

具体操作：

①处死孕鼠，全身置于75％酒精里浸泡，然后在超净台中用剪刀和镊子将孕鼠皮肤剪开，用另外一组剪刀、镊子剪开腹部肌层，露出子宫，最后用第三组剪刀和镊子将子宫小心取出放在盛有D-PBS的玻璃平皿中，冲洗去血。

②用两把弯镊子将胚胎外的胞膜小心去除，然后去掉头和内脏，将其余胚胎转移到一个装有30ml D-PBS的50ml离心管中，轻轻颠倒两次，倒掉D-PBS，再重复此步骤一次，注意要留少许D-PBS，然后将胚胎转移到另一装有D-PBS的平皿中，并用手术刀片将其细细切碎。

③用200μl的移液枪反复、快速地吹打平皿中的液体，转移至15ml离心管中，于4℃1500rpm离心5分钟，倒掉上清，以10ml胰酶重悬沉淀，放在37℃水浴中消化30分钟，且每隔五分钟轻轻晃动，使之充分消化。

④将上层细胞悬液倒入一个装有10ml MEF生长培养基的50ml离心管中，用200目的尼龙网过滤后，以1500rpm离心5分钟收集细胞，再用30ml MEF生长培养基洗涤两次。

⑤细胞沉淀用15ml MEF生长培养基重悬后进行细胞计数。

⑥3×10⁶细胞悬浮于15ml MEF生长培养基中，接种到10cm细胞培养皿中进行后续实验。

(b)将培养在37℃，5％CO₂孵箱中的MEF细胞进行传代处理，此细胞培养在10％FBS(Gibco公司胎牛血清货号：10099-041)，5％PS(Gibco公司青霉素链霉素双抗货号：15140122)高糖DMEM培养基(货号：11995-065)中，用完全的DMEM培养基进行吹打，将细胞制备成均一的细胞悬液。

(c)利用血细胞计数板进行计数，将MEF细胞，以3×10⁴的细胞数种入24孔板中进行培养，同时加入不同浓度的阿胶(0.3μg/ml，3μg/ml，30g/ml，300/ml)进行预孵育，24小时待细胞正常贴壁后进行LDH含量检测，其中采用0.7mM的双氧水刺激12h为细胞死亡阳性对照组。

(d)12～14小时后收集培养基到1.5ml离心管中，并用试剂盒提供的细胞裂解液将存活的贴壁细胞在37℃裂解45min。将不同处理组同孔中的培养基和贴壁细胞裂解液分别在冰上进行超声5～7次，每次超声5s间隔10s进行下一次超声。吸取50μl超声后的样品液再加入50μl的检测试剂，室温避光孵育30min，利用Infinite M200 PRO Microplate reader酶标仪检测490nm的吸光度，分别测出培养基和细胞中LDH的含量，使用公式：LDH _medium/(LDH _medium+LDH_cell)进行各组LDH释放量的计算，LDH是一种死亡指标，释放量越多代表细胞死亡数越多。该实验独立进行3次，利用GraphPad Prism 6.0进行统计，统计结果以mean±SEM表示。

实验结果参见图1：LDH检测结果表示双氧水诱导的细胞死亡模型为阳性对照组。图1中，Con(H₂O₂-；0μg/ml)为正常细胞培养组12h LDH释放量的检测数据；H₂O₂(H₂O₂+；0μg/ml)为损伤死亡组12h LDH释放量的检测数据；实验组(H₂O₂-；0.3μg/ml)、(H₂O₂-；3μg/ml)、(H₂O₂-；30μg/ml)和(H₂O₂-；300μg/ml)4个实验组LDH的释放量与正常培养的MEF细胞相同，说明不同浓度阿胶对MEF细胞没有毒副作用。

(3)LDH检测在双氧水诱导细胞死亡条件下检测阿胶的抗原代MEF细胞死亡作用效果。

检测方法与(2)相同，不同之处在于不同浓度的阿胶(0.3μg/ml，3μg/ml，30μg/ml，300μg/ml)，进行预孵育，24小时待细胞正常贴壁后，将旧培养基更换成死亡诱导培养基，即采用0.7mM的双氧水或0.7mM的双氧水加入不同浓度的阿胶(0.3μg/ml，3μg/ml，30μg/ml，300μg/ml)刺激12h～14h后进行LDH释放量的检测，正常培养的MEF细胞为对照组。

实验结果参见图2：LDH检测结果表示双氧水诱导的细胞死亡模型为阳性对照组。图2中，Con(H₂O₂-；0μg/ml)为正常细胞培养组12h LDH释放量的检测数据；H₂O₂(H₂O₂+；0μg/ml)为损伤死亡组12h LDH释放量的检测数据；实验组(H₂O₂+；0.3μg/ml)、(H₂O₂+；3μg/ml)、(H₂O₂+；30μg/ml)和(H₂O₂+；300μg/ml)4个实验组LDH的释放量，与(H₂O₂+；0μg/ml)细胞死亡组相比阿胶实验组0.3μg/ml～30μg/ml均对原代MEF细胞有保护作用，且最适工作浓度为30μg/ml。说明阿胶处理能够调节细胞抵抗氧化应激损伤基因的表达从而降低了LDH的释放量。

实施例2

阿胶调控基因表达的聚类分析及各组对原代MEF细胞基因表达水平的相关性分析：

2.1.MEF细胞处理及RNA提取：

(a)将培养在37℃，5％CO₂孵箱中的MEF细胞进行传代处理，此细胞培养在10％FBS(Gibco公司胎牛血清货号：10099-041)，5％PS(Gibco公司青霉素链霉素双抗货号：15140122)高糖DMEM培养基(货号：11995-065)中，用完全的DMEM培养基进行吹打，将细胞制备成均一的细胞悬液。

(b)利用血细胞计数板进行计数，将MEF细胞，以60×10⁴的细胞数种入60mm的细胞培养皿中进行培养，同时加入不同浓度的阿胶(0.3μg/ml，3μg/ml，30μg/ml，300μg/ml)进行预孵育，24小时待细胞正常贴壁后采用0.7mM的双氧水刺激或0.7mM双氧水刺激的同时加入不同浓度的阿胶(0.3μg/ml，3μg/ml，30μg/ml，300μg/ml)。14h后收集细胞样品。

(c)收集培养基中漂浮细胞及冰冷PBS洗涤下来的细胞，1000转离心5min，向培养皿中加入1ml Trizol裂解细胞提取总RNA。

(d)室温裂解5min，1ml移液枪吹打细胞至液体澄清或摇动混匀后室温孵育10min。

(e)将裂解液转移至1.5ml灭酶EP管中，加入氯仿0.2ml(1/5Trizol体积)，用手剧烈震摇15s，置室温5min，4℃、12000g(12300rcf)离心15min，可见分层。

(f)收集上层水相约0.5ml置于另一1.5ml灭酶EP管中，各管分别加入0.5ml异丙醇(等体积)，用力摇匀，置室温10min。

(g)4℃、12000g离心10min，可见RNA沉淀。弃上清，用滤纸吸干管口余液，加入预冷的75％灭酶乙醇1ml，用指轻弹管壁使RNA沉淀飘起洗涤。

(h)4℃、7500g离心5min，沉淀即为总RNA。弃上清，空气中干燥5～10min，加入20μlDEPC水。取少量测OD值，-70℃保存进行后续RNASeq测序。RNA质量要求：样品纯度的OD 260/280值应在1.8～2.2之间；样本RNA完整性Agilent 2100score≥7。

实验结果参见图3为热图，它是使用对照组和损伤组的差异基因为准，绘制了6个样本的基因热图，其中每组两个重复，例如对照组rep 1，对照组rep 2；H₂O₂ rep 1，H₂O₂rep 2；阿胶rep 1，阿胶rep 2。从每一组的两个重复可以看出RNASeq数据检测质量和重复性较好，两个重复基因的表达重现率较高，其次对照组与H₂O₂阳性细胞死亡组相比基因表达发生重大变化，说明氧化应激的确诱导了某些基因的上调和一些基因的下调。阿胶实验组的两个重复可以将H₂O₂阳性细胞死亡组基因表达上调的基因下调到接近对照组，同时将下调的基因上调回来接近对照组，热图的实验结果充分说明阿胶可以调控基因的表达。其中图中每个小方格表示1个基因，其颜色表示该基因表达量大小，表达量越大颜色越深(红色为上调，蓝色为下调)。每行表示每个基因在不同样本中的表达量情况，每列表示每个样品中所有基因的表达量情况。

图4为样品间Person相关性检验：6个样品间基因表达水平相关性是检验试验可靠性和样本选择合理性的重要指标。相关系数的绝对值越大，相关性越强：相关系数越接近于1或-1，相关度越强，相关系数越接近于0，相关度越弱。一般通过以下取值范围判断变量的相关强度：相关系数0.8-1.0极强相关；0.6-0.8强相关；0.4-0.6中等程度相关；0.2-0.4弱相关；0.0-0.2极弱相关或无相关。如图所示，H₂O₂阳性细胞死亡组：H₂O₂ rep1与对照组rep1和rep2的相关指数分别为0.8993和0.9411；H₂O₂ rep2与对照组rep1和rep2的相关指数分别为0.9363和0.7981。然而实验组阿胶rep1与对照组rep1和rep2的相关指数分别为0.93和0.9358；阿胶rep2与对照组rep1和rep2的相关指数分别为0.9221和0.9559。即阿胶组与对照组的平均相关系数为0.936，而H₂O₂阳性细胞死亡组与对照的平均相关系数为0.8937。即阿胶组能够逆转双氧水处理后基因表达的改变使其相关性更接近对照组，即相关系数更接近于1。

实施例3

阿胶组与H₂O₂损伤组差异性表达基因的个数及韦恩图分析：

小鼠成纤维细胞(MEF cells)实验处理方法及RNA提取方法与实例2相同。

(1)实验结果如图5示韦恩图：每个椭圆表示一个比较组合(例如实验组阿胶对H₂O₂损伤组)中的差异表达基因，椭圆重叠区域的数字表示对应的多个比较组合之间的共有差异基因个数，未重叠区域表示各比较组合特有的差异基因。从韦恩图可以观察到比较组合共有和特有的基因信息。如韦恩图所示是三个差异比较组。

1：H₂O₂ vs对照；

2：H₂O₂ vs阿胶；

3：阿胶vs对照。

(2)RNASeq差异性表达基因的火山图如图6，差异表达分析旨在找出6个样本间存在差异表达的基因，得到差异表达基因之后在利用RNA-seq数据比对分析两个样品中同一个基因是否存在差异表达，可以选取两个标准：一是Fold Change，就是两样品中同一个基因表达水平的变化倍数；二是pvalue或FDR(adjusted pvalue)，FDR值的计算方法先要对每个基因进行p-value的计算，再用FDR错误控制法对P-value作多重假设检验校正。默认筛选差异的条件为p＜0.05且差异倍数大于2。如图中所示红色为上调，蓝色为下调，将6个样本差异性表达基因两两比较后我们能观察到：

1：H₂O₂ vs对照：相比差异性表达上调基因为350个，下调基因为381个。

2：H₂O₂ vs阿胶：相比差异性表达上调基因为31个，下调基因为10个。

3：阿胶vs对照：相比差异性表达上调基因为417个，下调基因为558个。

(3)图7为差异性表达基因的GO富集分析：利用上述方法得到差异表达基因之后，对差异表达基因进行GO富集分析，并对其功能进行描述，结合GO注释结果，统计每个GO条目中所包括的差异基因个数，并用超几何分布检验方法计算每个GO条目中差异基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的P值，小的P值表示差异基因在该GO条目中出现了富集。如图所示我们将差异基因富集到GO条目中以参与的信号转导通路进行区分，例如H₂O₂ vs对照对比后参与葡萄糖醛酸代谢过程的上调的差异性表达基因数为13个；H₂O₂ vs阿胶对比后参与细胞周期调控的下调差异性表达基因数为1127个。

实施例4

阿胶组与H₂O₂在细胞死亡通路上差异性表达基因的分析：

小鼠成纤维细胞(MEF cells)实验处理方法及RNA提取方法与实例2相同。

细胞凋亡和细胞坏死通路中差异性表达基因热图如图8，图中基因表达量越大颜色越深(红色为上调，蓝色为下调)我们主要关注阿胶处理后是否能将H₂O₂损伤组中的差异表达基因逆转调控回正常水平，进而从基因调控水平解释阿胶抗细胞死亡的药理学作用效果。

实验结果如图8所示，细胞死亡通路，为阿胶组与H₂O₂损伤组差异性基因表达的热图，能观察到Bbc，Ctsd，Ern1，Capn1，Capn10，Capn2，Itpr2等大多数促进细胞凋亡的基因被下调，其次阿胶能促进Capn15，Ctsk，Sptan1，Csf2rb，Csf2r2等多功能基因的上调。在细胞坏死通路中观察到阿胶处理能降低细胞坏死基因Capn10，Casp1，Parp3等的表达，同时能上调Capn15，Parp3，Tnfrsf10b，Stat6等多功能基因的表达。总的来讲阿胶能对应激修复相关基因进行调控。

实施例5

阿胶组与H₂O₂损伤组在细胞周期和DNA损伤修复通路上差异性表达分析：

小鼠成纤维细胞(MEF cells)方法及RNA提取方法与实例2相同。

细胞周期和DNA损伤修复通路也能调控细胞在氧化应激刺激后的存活，当细胞受到外界不良环境刺激时，一般会启动细胞周期监测点基因的调控，这时细胞周期减缓进而对损伤的DNA及蛋白进行修复和检测。两个通路中差异性表达基因热图如图9，图中基因表达量越大颜色越深(红色为上调，蓝色为下调)，本实施例主要关注阿胶处理后是否能将H₂O₂损伤组诱导的差异表达基因逆转调控到正常水平，从细胞周期和DNA损伤修复通路的热图结果可以看出阿胶的处理与双氧水刺激后基因的表达呈现相反的趋势，即阿胶能将氧化应激压力下大部分上调的基因下调下来，进而使参与细胞周期和DNA损伤修复的基因调控到正常水平，从而说明阿胶的处理能够调节体外培养细胞在应激条件下的基因表达水平。

上述实施例中基因表达水平分析的具体方法如下：

用已知的参考基因序列以及注释文件作为数据库，采用序列相似性比对的方法鉴定出各基因在各样本中的表达丰度。使用htseq软件获取每个样本中比对到基因上的reads数，cufflinks软件来计算基因的表达量FPKM值。FPKM法(Fragments Per kb Per MillionReads)，是每百万fragment中来自某一基因每千碱基长度的fragment数目。FPKM同时考虑了测序深度和基因长度对fragments计数的影响，是目前最为常用的基因表达水平估算方法。FPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。

FPKM计算公式如下：

PFKM(A)＝(比对到基因A的fragments数/比对到所有基因的总fragments数×基因A的长度)×10⁹

样品间相关性检验：

样品间基因表达水平相关性是检验试验可靠性和样本选择合理性的重要指标。相关系数越接近1，表明样品之间表达模式的相似度越高。

样品对样品的聚类分析：

当样本数目较多时(≥3)，可以利用聚类方法计算样本和样本的距离，从而对样本之间的相似性进行考察。该分析结果能准确反映实验设计情况，属于同一设计的样本距离相近，优先聚在一起。聚类分析是对差异表达基因进行非监督层次聚类。计算多个样品两两之间的距离，构成距离矩阵，合并距离最近的两类为一新类，计算新类与当前各类的距离，再合并计算，直至只有一类为止，用挑选的差异基因的表达情况来计算样品直接的相关性，一般来说，同一类样品能通过聚类出现在同一个簇中，聚在同一个簇中的基因可能具有相似的生物学功能。一般用热图展示，如具体实施方式中记载的实施例2。

差异表达基因的分析：

差异表达分析旨在找出不同样本间存在差异表达的基因，得到差异表达基因之后，对其做GO功能显著性和KEGG信号转导通路显著性分析。在利用RNA-seq数据比对分析两个样品中同一个基因是否存在差异表达的时候，可以选取两个标准：一是Fold Change，就是两样品中同一个基因表达水平的变化倍数；二是pvalue或FDR(adjusted pvalue)，FDR值的计算方法先要对每个基因进行p-value的计算，再用FDR错误控制法对P-value作多重假设检验校正。默认筛选差异的条件为p＜0.05且差异倍数大于2。

差异基因GO富集分析：

得到差异表达基因之后，对差异表达基因进行GO富集分析，对其功能进行描述(结合GO注释结果)。统计每个GO条目中所包括的差异基因个数，并用超几何分布检验方法计算每个GO条目中差异基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的P值，小的P值表示差异基因在该GO条目中出现了富集。GO富集分析top30(筛选三种分类中对应基因数目大于2的GO条目，按照每个条目对应的-log10Pvalue由大到小排序的各10条)。

差异基因KEGG富集分析：

KEGG是有关Pathway的主要公共数据库，利用KEGG数据库对差异基因进行信号转导通路分析(结合KEGG注释结果)，并用超几何分布检验的方法计算每个信号通路条目中差异基因富集的显著性。计算的结果会返回一个富集显著性的P值，小的P值表示差异基因在该信号通路中出现了富集。相应的计算公式参见GO富集分析。信号通路分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的信号通路中出现了富集。相应的计算公式参见GO富集分析。信号通路分析对实验结果有提示的作用，通过差异基因的信号通路分析，可以找到富集差异基因的信号通路条目，寻找不同样品的差异基因可能和那些细胞通路的改变有关。KEGG富集分析top20(筛选对应基因数目大于2的信号通路条目，按照每个条目对应的-log10pvalue由大到小排序)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (12)

1.阿胶在用于制备调控培养对象基因表达组合物中的应用；所述基因为DNA损伤修复基因；

所述组合物中所述阿胶的使用浓度为0.3~300 μg/mL；

所述培养对象为哺乳动物细胞。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物上调DNA损伤修复基因。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述组合物上调的基因包括如下至少一种：

葡萄糖醛酸酯代谢过程相关基因、细胞葡萄糖醛酸化过程相关基因、类黄酮代谢过程相关基因、外源性葡萄糖醛酸化相关基因和类黄酮葡萄糖醛酸化相关基因。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述组合物包括细胞培养基。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞培养基还包括基础培养基、血清和抗生素中的一种或多种。

6.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞选自人、猪、牛、羊、猴、小鼠和大鼠中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述成纤维细胞包括小鼠成纤维细胞。

9.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述培养对象为MEF细胞，所述阿胶的使用浓度为30 μg/mL。

10.阿胶在制备用于缓解哺乳动物细胞DNA损伤产品中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述产品为药物。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述药物包括抗DNA损伤的药物。

Images