CN117925541A - 一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31及其构建方法和应用 - Google Patents

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CN117925541A CN202310575324.7A CN202310575324A CN117925541A CN 117925541 A CN117925541 A CN 117925541A CN 202310575324 A CN202310575324 A CN 202310575324A CN 117925541 A CN117925541 A CN 117925541A
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Abstract

本发明公开了一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31及其构建方法和应用，以溶瘤腺病毒SD55为载体，利用基因工程方法，构建携带PDL1‑shRNA序列与CXCL9、GM‑CSF序列的重组溶瘤腺病毒AD‑SD55‑shRNA‑CXCL9‑GMCSF，同时表达干扰PD‑L1的shRNA、趋化因子CXCL9、免疫因子GM‑CSF。本发明具有溶瘤广谱性且抗肿瘤效果好，为病毒疗法、基因治疗、免疫疗法相结合的癌症靶向治疗提供了新方向。

Description

一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基于工程技术领域，特别涉及一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31及其构建方法和应用。
背景技术
癌症严重威胁人类生命健康，依旧是亟待解决的生物医学问题。癌症治疗一直是焦点话题，也是医药研发的热门方向，但目前还有能够根治的方法。非小细胞肺癌、胰腺癌、结直肠癌都是恶性程度极高的恶性癌症，发病率和致死率在逐年提升。在临床上，肿瘤细胞区分实体瘤与非实体瘤，传统癌症治疗方法有外科手术、放疗、化疗和药物；新型治疗方法逐渐增多，如靶向基因治疗、免疫治疗。其中免疫治疗主要包括疫苗、免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒等。
溶瘤病毒(Oncolytic Virus,OVs)是一类对肿瘤细胞高度敏感的特殊病毒，其对正常的细胞杀伤性较小。溶瘤病毒可以靶向地识别、感染肿瘤细胞，在肿瘤细胞内复制，最终致使肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞裂解死亡，有利于放病原体相关分子(Pathogen-associated Molecular Pattern Molecules，PAMP)、肿瘤抗原(Tumor-associatedAntigen，TAA)等释放，能够引起体内的抗肿瘤免疫反应，引导免疫系统对其他癌细胞甚至远端病灶展开攻击。
在溶瘤病毒疗法中，病毒载体又分为天然溶瘤病毒、基因改造溶瘤病毒两种。基因改造溶瘤病毒有以下几种：腺病毒(Adenovirus)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VacciniaVirus)等。溶瘤腺病毒是一种能够特异性靶向肿瘤细胞的病毒，也是目前肿瘤靶向基因治疗常用到的病毒载体。
腺病毒是一种没有包膜，内含双链DNA病毒，直径大小为70～90nm，目前研究较多的是2型和5型腺病毒。将腺病毒作为基因治疗的载体，构建肿瘤特异性启动子启动溶瘤腺病毒，使其表现出靶向性，也增强了溶瘤腺病毒的安全性。
溶瘤腺病毒的改造分为：1、E1A改造，2、E1B改造，3、E3区改造。E1A区域是病毒复制起始的调控区域]，包含三个保守区域CR1、CR2、CR3。其中CR2能结合视网膜细胞瘤突变基因(RB1-抑癌基因)，使细胞进入复制期。但肿瘤细胞中无RB调控，因此删除该区域不影响溶瘤腺病毒在肿瘤细胞内的增殖；E1B区域有两个细胞周期调控蛋白E1B-19K、E1B-55K，删除并不会影响溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中的增殖，如E1B-55K激活TP53介导的凋亡通路，而肿瘤细胞中缺乏TP53；E3区改造集中在删除gp19k、删除E3B、删除ADP。对溶瘤腺病毒的改造还有选择肿瘤特异性启动子进行调控，如CEA启动子、Survivin启动子或GP73启动子，均可实现针对癌细胞的靶向性。
CXCL9(又称MIG)是一种CXC家族免疫趋化因子。CXCL9通常被干扰素γ所诱导，主要分布在Th1、B细胞和NK细胞等，有介导和调节免疫及炎性反应的作用。CXCL9在人体内主要有三个作用：趋化作用、抑制血管生成、诱导细胞凋亡。
粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，又称集落刺激因子2(CSF2)，是由巨噬细胞、肥大细胞、NK细胞等分泌，是一种糖蛋白。CSF2刺激粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC cell)的增殖分化，特别促进嗜中性粒细胞的增殖和成熟。发现GM-CSF也可以作为一种免疫佐剂，来有效辅助提升治疗效果。由于GM-CSF的免疫调节功能，对其在抗肿瘤领域研究较多，是抗肿瘤研究中非常重要的免疫因子。在临床研究中，GM-CSF在肿瘤免疫治疗有很重要的抗肿瘤作用，有很好的临床应用前景。
现有的溶瘤腺病毒常规采用单一的基因疗法或病毒疗法策略，或者采用基因疗法结合病毒疗法策略，但是抑瘤效果还是不够理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31及其构建方法和应用，重组溶瘤腺病毒GOV31具有溶瘤广谱性且抗肿瘤效果好，为病毒疗法、基因治疗、免疫疗法相结合的癌症靶向治疗提供了新方向。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31，以溶瘤腺病毒SD55为载体，利用基因工程方法，构建携带干扰PDL1的shRNA序列、CXCL9序列和GM-CSF序列的重组溶瘤腺病毒AD-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF即为多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31，所述多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31同时表达干扰PD-L1的shRNA、趋化因子CXCL9以及免疫因子GM-CSF。
溶瘤腺病毒SD55经过删除E1B 55KD和采用肿瘤特异性启动子survivin的改造，来提高溶瘤效果和安全性。腺病毒的E1B 55KD区表达后与P53结合，P53诱导细胞发生凋亡，而肿瘤细胞中缺乏P53表达，因此可以删除E1B 55KD区。survivin蛋白在正常组织中不表达，而在肿瘤组织中高度表达，提高溶瘤腺病毒的安全性。
所述干扰PDL1的shRNA序列为SEQ ID No.1-SEQ ID No.4其中之一。本发明首先设计并构建一个靶向PD-L1的小干扰shRNA慢病毒载体，通过qPCR和Western Blot实验筛选出干扰PD-L1效率高的shRNA序列。其中SEQ ID No.3的干扰效率最高。
一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31的构建方法，包括如下步骤：
(1)合成U6-shRNA片段和hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段：
以含U6-shRNA片段的质粒、含CXCL9-T2A-GMCSF片段的质粒为模板进行无缝克隆获得U6-shRNA片段和hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段；
(2)三片段无缝克隆
用Hind III单酶切，将pSD55质粒线性化得到线性化pSD55质粒，将线性化pSD55质粒与U6-shRNA片段和hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段一起进行多片段无缝克隆得到连接产物；(3)SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒构建
无缝克隆的连接产物转化DH5α感受态细胞后，培养，挑选阳性克隆菌落，提取质粒，利用EcoRⅠ单酶切鉴定并测序验证，得到SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒；
(4)溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF的构建
将SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒线性化后，接着采用去磷酸化酶FastAP去磷酸化，然后转化进BJ583感受态细胞中进行重组，培养，挑选阳性克隆菌落，提取质粒，得到Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒，利用MluⅠ单酶切鉴定并测序验证，验证通过后表明构建的溶瘤腺病毒构建成功。
含U6-shRNA片段的质粒是采用两种限制性内切酶BamHI、MluI线性化过表达plent-U6-CMV-copGFP-P2A-Puro质粒，将线性化的质粒载体与shRNA双链模版进行连接形成。
含CXCL9-T2A-GMCSF片段的质粒是合成CXCL9-T2A-GMCSF片段并连接到pCA13质粒载体上形成。
步骤(2)中，线性化pSD55质粒与U6-shRNA片段和hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段的摩尔比＝1:1.5:1.5。
一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明以溶瘤腺病毒SD55为载体，利用基因工程方法，构建携带PDL1-shRNA序列与CXCL9、GM-CSF序列的重组溶瘤腺病毒AD-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF，同时表达干扰PD-L1的shRNA、趋化因子CXCL9、免疫因子GM-CSF，通过Western Blot实验验证敲降PD-L1和过表达CXCL9、GM-CSF成功。本发明将干扰PD-L1的shRNA、趋化因子CXCL9、免疫因子GM-CSF组合，三个因子之间形成特定的作用协作配合关系，结合病毒的靶向作用，能显著提高抗肿瘤效果。
体外细胞实验中，通过MTT、结晶紫实验探究溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的杀伤性，结果表明相比未改造病毒组Ad-SD55，重组溶瘤腺病毒AD-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF对非小细胞肺癌(A549)、结直肠癌(SW480)、胰腺癌(SW1990)都存在更显著的杀伤作用；Honchest33342染色实验检测细胞凋亡，发现在溶瘤病毒处理后，非小细胞肺癌(A549)、结直肠癌(SW480)、胰腺癌(SW1990)都出现凋亡小体，重组溶瘤腺病毒AD-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF比对照组Ad-SD55，存活细胞数量更少且诱导产生更多凋亡小体。体外细胞实验表明重组溶瘤腺病毒对肺癌、结直肠癌、胰腺癌均具有很好的溶瘤效果。
附图说明
图1是PD-L1过表达载体质粒图谱；
图2是干扰质粒PDL1-shRNA图谱；
图3是构建干扰质粒测序结果，图a.-d.分别为PDL1-shRNA1、PDL1-shRNA2、PDL1-shRNA3、PDL1-shRNA4序列及其测序对比；
图4是慢病毒感染HEK293的GFP图。a、为PDL1-shRNA1慢病毒感染HEK293，b、为PDL1-shRNA2慢病毒感染HEK293，c、为PDL1-shRNA2慢病毒感染HEK293，d、为PDL1-shRNA2慢病毒感染HEK293，e、为未改造慢病毒感染HEK293。图a-e普通光学显微镜图(左)和荧光显微镜图(右)；
图5是WB检测病毒感染细胞后PD-L1基因表达图；
图6是qPCR检测病毒感染细胞后PD-L1基因表达图；
图7是D55-shRNA-CXCL9-GMCSF重组质粒构建鉴定图。M：DNA marker；泳道1和泳道2:阳性克隆提取出的质粒；
图8是SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF重组质粒测序鉴定图。a为CMV正向测序对比图；b为CMV反向测序对比图；
图9是溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF MluⅠ单酶切鉴定图。M为15000bpMarker；泳道1-3为阳性克隆实验组；
图10是溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF测序鉴定图。a为原始序列与测序结果对比图；b为hCMV启动子区域1号突变位置；
图11是溶瘤腺病毒干扰A549细胞表达PD-L1的Western Blot实验结果图；
图12是溶瘤腺病毒过表达CXCL9、GM-CSF的Western Blot实验结果图。a.为CXCL9、GM-CSF检测的Western Blot实验结果图；b.为CXCL9 Western Blot实验量化图；c.为GM-CSF Western Blot实验量化图；
图13是Western Blot实验检测不同癌细胞PD-L1的表达图；
图14是不同处理条件下病毒对A549癌细胞的杀伤作用。a.24h病毒处理后A549细胞存活率；b.48h病毒处理后A549细胞存活率；c.72h病毒处理后A549细胞存活率；d.96h病毒处理后A549细胞存活率；
图15是不同处理条件下病毒对SW480癌细胞的杀伤作用。a.24h病毒处理后SW480细胞存活率；b.48h病毒处理后SW480细胞存活率；c.72h病毒处理后SW480细胞存活率；d.96h病毒处理后SW480细胞存活率；
图16是不同处理条件下病毒对SW1990癌细胞的杀伤作用。a.24h病毒处理后SW1990细胞存活率；b.48h病毒处理后SW1990细胞存活率；c.72h病毒处理后SW1990细胞存活率；d.96h病毒处理后SW1990细胞存活率；
图17是结晶紫检测病毒对细胞病变效应。(a)72h病毒处理后A549细胞病变效应；(b)48h病毒处理后SW480细胞病变效应；(c)48h病毒处理后SW1990细胞病变效应；
图18Hochest33342染色检测病毒对细胞病变效应。(a)48h病毒处理后A549细胞病变效应；(b)48h病毒处理后SW480细胞病变效应；(c)48h病毒处理后SW1990细胞病变效应。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：干扰PD-L1靶点的shRNA慢病毒的筛选和鉴定
1.1PD-L1-shRNA质粒的构建
1.1.1试剂
所用主要试剂见下表：
表1-1试剂表
试剂名称 来源厂家 产品货号
DMEM Gibco 030034DJ
FBS 翊圣生物 40130ES76
DH5α感受态细胞 诺唯赞 C502-02
质粒小抽试剂盒 捷瑞生物 GK2004
。
1.1.2试验方法
1.1.2.1靶向PD-L1的shRNA序列设计
首先在NCBI上找到PD-L1对应的基因ID，其次在Invitrogen siRNA设计网站上输入PD-L1的Genbank ID，其中GC含量在35％到55％之间，进行设计，选取评分较高的前几个序列，最后在NCBI blast上进行比对，筛选出四个靶点序列。根据RNAi序列设计的基本原则，设计了4种靶向PD-L1的shRNA干扰序列，序列如表1-2所示。
表1-2 4种靶向PD-L1的shRNA序列
1.1.2.2PD-L1过表达载体构建
为了探究干扰PD-L1的shRNA的干扰效率，采用构建HEK293A细胞系来过表达PD-L1质粒，与慢病毒包装质粒PMD2.G、psPAX2以及干扰质粒共转染HEK293。NCBI上查询PD-L1的序列，合成片段。过表达质粒载体pcDNA3.1由山东维真科技生物有限公司提供。
通过EcoRV和XhoI双酶切将过表达质粒载体pcDNA3.1线性化，37℃水浴锅酶切过夜。跑胶验证，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，用有康生物胶回收试剂盒回收线性化载体。线性化载体与PD-L1合成片段在T4连接酶的作用下，22℃水浴锅连接1h，连接获得PD-L1过表达载体(见图1)。
1.1.2.3干扰质粒线性化
干扰质粒plent-U6-CMV-copGFP-P2A-Puro(图2)由山东维真科技生物有限公司提供。往质粒溶液中加入两种限制性内切酶BamHI、MluI和Buffer后，震荡混匀后置于37℃水浴锅酶切过夜，将过表达质粒载体线性化。酶切反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并用有康生物胶回收试剂盒回收载体。
1.1.2.4获取PDL1-shRNA双链
以干扰PD-L1的shRNA为正义链，干扰PD-L1的shRNA的互补链为反义链，合成shRNA双链模板，由山东维真科技生物有限公司合成，浓度为200nM。
1.1.2.5PDL1-shRNA与载体连接
将线性化的干扰质粒载体与shRNA双链模版进行连接，加入T4 DNA连接酶后，震荡混匀、瞬时离心，22℃水浴锅连接1h(表1-3)。在T4连接酶的催化下，连接形成PDL1-shRNA干扰载体；
表1-3退火体系配置
成分 体积
shRNA双链模版 2μL
线性化的干扰质粒载体 1μL
10×T4 Buffer 0.5μL
T4 DNA连接酶 0.5μL
ddH2O 1μL
Total 5μL
。
1.1.2.6连接产物的转化
用冰盒装好冰后，从-80℃冰箱中取出诺唯赞公司的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放在冰盒上7-8min直到解冻。取10μL的1.1.2.5的连接产物加入100μL DH5a感受态细胞中，冰浴30min混匀。将EP管放在42℃的水浴锅中热激40s，后快速转移到冰上，静置2min。向离心管加入200μL的LB培养基(无抗生素)，37℃摇床，摇1h使菌体复苏。离心后弃去大部分上清，吹打混匀剩下的菌液。取剩余菌液均匀涂布于含50μg/mL Ampicillin LB平板上。待平板上液体被吸收后，将平板倒置于37℃培养箱中，过夜培养。目的是连接产物转化进大肠杆菌中扩增并保存。
1.1.2.7阳性克隆的筛选及验证
从每块平板上挑取几个单菌落，加入5mL含Ampicillin的LB培养基中，37℃摇床培养16小时。取500μL菌液加500μL甘油，保菌。使用质粒小抽试剂盒提取质粒，将阳性克隆进行测序鉴定。从阳性克隆中提取的质粒进行测序，测序结果见图3。成功将PDL1-shRNA构建进过表达干扰质粒载体，并将质粒保存于大肠杆菌DH5α中。
1.2PD-L1-shRNA慢病毒的包装、扩增及验证
1.2.1慢病毒的包装
慢病毒包装系统为三质粒系统，分别是pMD2.G，psPAX2，干扰质粒(图2)。其中干扰质粒为构建含有表达PDL1-shRNA序列的质粒；pMD2.G，psPAX2含有病毒包装所必须的元件。
接种对数生长期的HEK293细胞于培养皿，37℃，CO2培养箱内培养，当细胞密度达60％～70％时转染。将293T细胞培养液由10％ FBS DMEM换成6ml含有2％ FBS的DMEM。提前制备好A液(pMD2.G，psPAX2、干扰质粒与ddH2O混合)、B液(PEI与ddH2O混合)，震荡混匀，瞬时离心后静置5min，往B液中加入A液，并震荡混匀静置15min后，加入293T细胞培养皿中。转染6h后换10ml含10％ FBS的DMEM培养液。培养48h、72h后收集上清；将收集的上清液于4℃，4000g离心10min，收集上清液，0.22μm过膜，于-80℃保存备用。
PEG 8000纯化慢病毒。称取NaCl 8.766g、PEG 8000 50g，溶解在200mL超纯水中，高压蒸汽灭菌30min，4℃保存。30mL慢病毒液样品加入7.5mL 5×PEG 8000NaCl，20-30min混匀一次，共3-5次，4℃放置过夜。4℃4000g离心，收集沉淀，将纯化好的病毒保存在-80℃备用。
1.2.2慢病毒滴度测定
第一天HEK293计数后均匀地铺在96孔板中，37℃，5％ CO2培养箱中培养使细胞贴壁，且确保在感染时细胞数有30％-50％。第二天，将慢病毒液解冻后配成范围从10-6-10-2的一系列的梯度稀释液。将每一个浓度的慢病毒液稀释于完全培养基，终体积为1ml。弃去原先的细胞培养基。轻轻混合每种病毒和培养基混合液，将混合液加入6孔板中。第三天,将含有病毒的培养基弃去，换成2ml的完全培养基，37℃，5％ CO2过夜培养。第四天检测GFP细胞，检测滴度。
构建的4种慢病毒和未改造慢病毒同时感染HEK293细胞，在普通光学显微镜和荧光显微镜下的图片如图4所示。图4e是未改造慢病毒，为对照组，图4a-d为4个实验组：PDL1-shRNA1慢病毒、PDL1-shRNA2慢病毒、PDL1-shRNA3慢病毒、PDL1-shRNA4慢病毒。图4a-e右图都有荧光，说明对照组和4个实验组慢病毒均感染成功。与对照组图4e相比较，4个实验组荧光强度相近，说明构建的PDL1-shRNA干扰片段并不影响慢病毒的感染与增殖。
通过检测GFP计算出病毒滴度测得病毒滴度在3.05×108TU/ml。
1.2.3Western Blot检测PD-L1表达量
为了检测构建的4种PDL1-shRNA慢病毒对A549细胞PD-L1表达量的干扰效果，开展了在翻译水平检测PD-L1的表达的Western Blot实验。如图5所示，实验设置了6组，分别是：Con空白对照、NC未改造慢病毒、shRNA1慢病毒、shRNA2慢病毒、shRNA3慢病毒、shRNA4慢病毒。图5a为WB实验结果，从图中明显看出构建的4种PDL1-shRNA慢病毒的PD-L1干扰效果十分明显。图5b为WB量化图，我们可以看出4个实验组可以明显减少PD-L1的蛋白表达量。相比较NC组，shRNA1实验组干扰效率达到60.2％；shRNA2实验组干扰效率达到46.7％；shRNA3实验组干扰效率达到68.8％；shRNA4实验组干扰效率达到65.0％。实验组中，shRNA1、shRNA3、shRNA4的干扰效率都达到60％以上，shRNA2的干扰效率略差一些；其中shRNA3的干扰效率最好。以上结果表明，在翻译水平4个实验组都可以干扰PD-L1的表达，并且筛选出PD-L1干扰效率最高的是shRNA3。
2.2.4qPCR检测PD-L1mRNA表达量
为了检测构建的4种PDL1-shRNA慢病毒对HEK293细胞PD-L1表达量的干扰效果，开展了在转录水平检测PD-L1的表达的qPCR实验。实验设置了5组，分别是：NC为未改造慢病毒(阴性对照组)、PDL1-shRNA1、PDL1-shRNA2、PDL1-shRNA3、PDL1-shRNA4。从图6可以看出，构建的4种PDL1-shRNA慢病毒的PD-L1干扰效果十分显著。PDL1-shRNA1慢病毒感染的细胞中PD-L1在mRNA水平表达水平是阴性对照组(NC组)的22％，即敲低78％；PDL1-shRNA2慢病毒感染的细胞中PD-L1在mRNA水平表达水平是NC组的42％，即敲低58％；PDL1-shRNA3慢病毒感染后PD-L1在mRNA水平表达是NC组的3％，即敲低97％；PDL1-shRNA4慢病毒感染后PD-L1在mRNA水平表达是NC组的5％，即敲低95％。以上结果表明，在转录水平4个实验组都可以干扰PD-L1的表达，并且筛选出PD-L1干扰效率最高的是shRNA3。
综合qPCR和WB实验结果，筛选出干扰序列shRNA3，在转录和翻译水平干扰效率最好。
实施例2：溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF(GOV31)的构建与鉴定
2.1重组质粒pSD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF的构建和验证
2.1.1pSD55质粒载体的线性化
取含pSD55质粒的大肠杆菌20μL，加入5mL LB培养基(含有5μL KanR)，摇床培养12-16h。抽提质粒选用捷瑞生物的质粒小抽试剂盒，按实验说明书操作，完成质粒抽提工作。酶切验证，确定为pSD55质粒。
用Hind III单酶切，将pSD55质粒线性化，酶切体系见表2-1。37℃水浴锅，酶切4h。
表2-1pSD55线性化酶切体系表
成分 体积
Hind III 1μL
pSD55质粒 1μg
10×buffer 2μL
ddH2O 补至20μL
跑胶验证pSD55线性化是否完全。配1％琼脂糖凝胶，半小时后胶凝固后即可使用。将20μL酶切产物与5×Loading buffer混匀后，加样跑胶，电泳条件：120V，40min。切割下正确条带，用有康生物胶回收试剂盒回收线性化的pSD55。
2.1.2U6-shRNA、hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段PCR获取
本实验所用含U6-shRNA片段的质粒为干扰质粒plent-U6-CMV-copGFP-P2A-Puro(图2)由山东维真科技生物有限公司提供；CXCL9-T2A-GMCSF片段由山东维真生物科技有限公司合成并连接到pCA13载体上。
根据无缝克隆引物的设计原则，在诺唯赞多片段克隆引物设计网站(https://crm.vazyme.com/cetool/multifragment.html)上，设计出U6-shRNA、hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段的无缝克隆引物(表2-2)。
表2-2无缝克隆用引物序列表
引物名称 引物序列
U6-shRNA-For 5′-atcgtctagcatcgaaagcttGAGGGCCTATTTCCCATGATTC-3′(SEQ ID No.5)
U6-shRNA-Rev 5′-gccagggaattaCATATTGGACATGTCTAGACGCG-3′(SEQ ID No.6)
cxcl9-gmcsf-For 5′-ccaatatgTAATTCCCTGGCATTATGCCC-3′(SEQ ID No.7)
cxcl9-gmcsf-Rev 5′-atcttcgagtcgacaagcttGATCTTCGATGCTAGACGATCCA-3′(SEQ ID No.8)
PCR溶液体系的配制见表2-3。U6-shRNA片段PCR程序：98℃，30s；98℃，10s；58℃，5s；72℃2s；72℃1min；循环35次。hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段PCR程序：98℃30s；98℃10s；57℃5s；72℃2s；72℃1min；循环35次。
表2-3PCR溶液配制体系
成分 体积
引物F 1μL
引物R 1μL
质粒模版 1μL
2×Phanta Flash Master Mix 10μL
ddH2O 7μL
总体积 20μL
。
2.1.3三片段无缝克隆
根据碧云天无缝克隆试剂盒说明书，按照多片段无缝克隆的要求，加入pSD55、U6-shRNA、hCMV-CXCL9-GMCSF片段，按照摩尔比pSD55：U6-shRNA：hCMV-CXCL9-GMCSF＝1:1.5:1.5来设计无缝克隆的反应体系(见表2-4)。
表2-4三片段无缝克隆反应体系
将上述反应体系置于PCR仪中：50℃孵育30min。反应完成后将反应样品保存于-20℃冰箱中。
2.1.4连接产物的转化和挑选单克隆菌落
(1)-80℃冰箱提前取出DH5α感受态细胞冰上化冻7-8min，取5μL无缝克隆的连接产物加入到100μL DH5α感受态细胞中轻轻混匀，将该混合物置于冰上冰浴30min；
(2)将混合物在水浴锅中42℃热激90s，然后迅速放回冰上，冰浴静置2min；
(3)加入500μL LB培养液(不含抗生素)，轻轻混匀，37℃摇床培养1h；
(4)菌液离心，5000rpm，1min沉淀菌体。吸去大部分培养液，剩余培养液吹打混匀，重悬菌体。将菌液均匀涂布到含KanR抗生素的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜；
(5)第二天，挑取LB平板上的单克隆加入5mL LB液体培养基中(含KanR抗生素)，摇床摇菌12-16h。
2.1.5质粒抽提
将2.1.4获得的菌液保藏菌种后，用捷瑞生物质粒小抽试剂盒，按照说明书操作提取质粒，测得质粒浓度。
2.1.6EcoRⅠ单酶切鉴定、测序鉴定
利用EcoRⅠ单酶切鉴定，并且跑胶鉴定。酶切结果为7096bp、3326bp的DNA片段，如果琼脂糖凝胶电泳跑胶结果在7000bp、3500bp左右的条带，则证明SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF质粒构建成功，将质粒送去测序验证。酶切体系如下表2-5：
表2-5SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF质粒酶切体系
成分 体积
EcoRⅠ 1μL
buffer 1μL
质粒模版 1μL
2×Phanta Flash Master Mix 10μL
ddH2O 7μL
总体积 20μL
。
EcoRⅠ单酶切，获得7096bp、3326bp的DNA片段。琼脂糖凝胶电泳跑胶结果(见图7)显示，出现7000bp、3500bp左右的条带，符合酶切预期片段大小，说明pSD55、U6-shRNA、hCMV-CXCL9-GMCSF三片段无缝克隆成功，SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF质粒构建成功。
将EcoRⅠ单酶切鉴定正确的质粒送去测序，hCMV正向设计引物，正向测序，测通后比对CXCL9-T2A-GMCSF序列，结果一致；hCMV反向设计引物，反向测序，测通后比对U6-shRNA序列，结果一致(见图8)。测序结果表明，U6-shRNA和hCMV-CXCL9-GMCSF序列和pSD55重组成功，且U6-shRNA片段和CXCL9-GMCSF片段均无丢失和突变。
2.2腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF的构建
2.2.1BJ583感受态细胞的制备
首先配置制备感受态细胞所需要的CaCl2溶液：1M HEPES溶液1ml、CaCl20.88125g、甘油15mL、无菌ddH2O定溶至100mL，最后用0.22μm膜过滤。
具体实验步骤：
1、将BJ583置于5mLLB培养基中，摇床培养16h；
2、按照1:100的比例吸取过夜菌液，加入LB液体培养基中，37℃，220rpm摇床震荡培养2-3h，直到OD600达到0.5左右；
3、预冷好50mL离心管后，加入菌液，冰上冰浴30min，使菌液的温度降到0℃；
4、菌液离心4℃，4000rpm离心10min，丢弃上清液，并且倒置离心管1min，目的是为了使CaCl2溶液完全流净；
5、每50mL菌液用2mL预冷的0.1M CaCl2 15％甘油溶液重悬沉淀菌体；
6、在冰上分装菌液，100μL/管，-80℃保存；
注意事项：若当天使用，将制好的感受态细胞放于4℃冰箱4h后使用；注意全程无菌操作；整个过程在冰上操作；枪头、离心管等都需要提前预冷。
2.2.2MluⅠ酶切验证感pAdEasy
制备好的BJ583感受态细胞在使用前需要验证，感受态细胞内提前转化的SD55腺病毒的骨架质粒pAdEasy，因为在感受态细胞中转入的pAdEasy质粒可能会丢失。37℃摇床培养BJ583菌液16h后，用质粒小提试剂盒抽提质粒。再用MluⅠ单酶切，37℃水浴锅酶切过夜。pAdEasy质粒上有5个MluⅠ酶切位点，分别会产生5个DNA片段：20397bp，5844bp，4305bp，1797bp，1134bp。若酶切后产物跑琼脂糖凝胶电泳出现的条带和预期相符合，则该感受态细胞制备完成，并且质粒未丢失。
2.2.3SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒线性化
PmeⅠ单酶切使SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒线性化，37℃水浴锅酶切过夜。酶切体系见下表2-6。酶切结果为10422bp大小的DNA片段。
表2-6PmeⅠ酶切体系表
成分 体积
SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒 2μg
PmeⅠ 2μL
10×buffer 2μL
ddH2O 补至20μL
2.2.4线性化质粒琼脂糖凝胶电泳、胶回收
配制1％琼脂糖凝胶，等待30min胶凝。将酶切产物全部跑胶，验证PmeⅠ是否将SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒完全切开。电泳条件：120V，40min。若跑胶条带大小为11000bp大小左右，且没有杂带，表明PmeⅠ将SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒完全切开。将正确的条带用刀片割下放在eppendorf管，称得凝胶块的重量，加入等体积的BindingBuffer，55℃金属浴5-7min直到胶融化，按照胶回收试剂盒(有康生物，YK00A2)说明书进行操作，胶回收结束后测DNA浓度。
2.2.5去磷酸化
SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒线性化后，容易发生自连或环化的情况，故采取去除5’端磷酸基团的方法。本实验使用的是去磷酸化酶FastAP进行处理，在胶回收的20μL溶液中加入FastAP酶，10×buffer，ddH2O，在PCR仪上控温：37℃，30min；75℃，5min(酶失活)。去磷酸化结束后，将产物放在-20℃冰箱保存。去磷酸化体系见表2-7。
表2-7去磷酸化体系表
成分 体积
胶回收产物 20μL
FastAP 1μL
10×buffer 3μL
ddH2O 6μL
2.2.6线性化SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF片段转化
将SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒去磷酸化后，转化进BJ583感受态细胞中进行重组，获得完成的SD55腺病毒的基因。
具体操作为：-80℃冰箱中取出BJ583感受态细胞，放在冰上冰浴化冻7-8min，操作过程中注意手勿触碰菌体处。加入10μL去磷酸化的SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒于100μL感受态细胞中，手拨混匀，再冰浴30min待其自由混匀。提前打开水浴锅，42℃热激45s，迅速冰浴2min。感受态细胞中加入700μL LB培养基，摇床培养1h。菌体离心6000rpm1min，弃去690μL上清LB培养基，混匀剩下的菌体和培养液，吸取加入37℃预热平板上(含KanR抗性)，用涂布棒涂布至液体被吸收。置于37℃培养箱培养12h-16h。
2.2.7阳性克隆的筛选及抽提质粒
挑取单菌落于5mL LB培养基(含5μL KanR抗生素)，摇床培养12h。500μL甘油中加入500μL菌液，-80℃保存菌种。
剩余菌液提取Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒，利用质粒小抽试剂盒提取质粒，测浓度。
2.2.8Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF酶切验证
MluⅠ单酶切质粒，六个酶切位点，获得15358bp、9259bp、5844bp、4305bp、1797bp、1134bp六个DNA片段。MluⅠ酶切体系见表2-8，37℃水浴锅酶切过夜。第二天，配制1％琼脂糖凝胶，电泳120V 30min跑胶，若跑胶结果符合预期条带大小，则SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF与骨架质粒重组成功。
表2-8MluⅠ酶切体系表
成分 体积
改造后SD55质粒 2μg
MluⅠ酶 2μL
10×buffer 2μL
ddH2O 补至20μL
跑胶结果如图9所示，泳道M为15000bpMarker，其中泳道1只有5条带说明未重组成功，泳道2和泳道3为6条带，且条带和预期大小相符合。从图可知，泳道2和泳道3，pshuttle穿梭质粒和AdEasy骨架质粒在BJ583中重组成功，改造的SD55溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF构建成功。
2.2.9Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF测序验证
将酶切结果正确的质粒(图9泳道2的实验组质粒)，送去有康公司进行测序。在BJ583感受态菌中穿梭质粒与AdEasy骨架质粒发生基因重组，存在基因突变的可能，为了验证shRNA、CXCL9、GM-CSF基因序列是否发生突变，测序从hCMV启动子正向测序，测得CXCL9和GM-CSF序列，hCMV反向测序测得U6-shRNA序列。
测序结果见图10，两次测序结果拼接后发现，在体内重组的过程中出现了两处突变，分别在图10a中的1和2发生突变，其中1号在hCMV启动子区域发生突变可见图10b中由c突变成a，但不影响启动子的功能。所以测序结果与构建PDL1-shRNA、CXCL9、GM-CSF序列一致，说明构建的溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF构建成功，且几个表达元件未发生影响表达的突变。
实施例3：溶瘤腺病毒包装、扩增、纯化及验证
3.1溶瘤腺病毒SD55、SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF的包装
利用生工生物的无内毒素质粒小抽试剂盒分别抽提Ad-SD55和Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF质粒。采用PacⅠ单酶，将Ad-SD55和Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF质粒线性化，并且用FastAp酶去磷酸化，离心12000rpm，4℃，20min，获得线性化、去磷酸化质粒。
提前一天在六孔板中铺70％-80％的293A细胞用PEI脂转染试剂将质线性化质包裹并转染进293A细胞。设计一个空白组仅加入PEI试剂，一个Ad-SD55实验组，一个Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF实验组。具体操作步骤如下：A液体：在去磷酸化的30μL产物加入200μL无FBS DMEM；B液：6μL PEI中加入200μL无FBS DMEM。将A、B液震荡混匀，暂离后，将B液缓慢滴加进A液中，滴加后轻弹混合液管壁，室温孵育15min。将6孔板中的10％FBS DMEM培养液更换成600μL 2％FBS DMEM培养液，并用PBS清洗两次。将AB混合液加入6孔板中，37℃CO2培养箱培养6h后，弃去培养基，PBS清洗两次，每孔加入2mL 5％FBS DMEM培养基。37℃CO2培养箱培养7-10天，观察细胞病变情况，待大部分细胞变圆、漂浮后收集细胞和上清储存在-80℃冰箱；反复冻融三次后，进行后续扩增、纯化及细胞实验。
3.2溶瘤腺病毒SD55、SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF的扩增包装出来的病毒液为病毒种子液，即P0代溶瘤腺病毒，由于刚包出来病毒的滴度低，溶液量少，需要进行不断的薄层感染来扩大病毒的滴度，增加病毒液的量。
具体操作步骤：提前一天铺24孔板293A细胞，将复冻融三次后的腺病毒离心去除细胞碎片，将6孔板中培养液去除，加入病毒后4h再吸出病毒液，加入10％FBS DMEM培养液，来扩增病毒滴度。至等到细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒，以此病毒为P1代病毒。以P1代溶瘤腺病毒再感染6孔板HEK293细胞，进行第三代感染，收集的细胞及上清则为P2代溶瘤腺病毒。再用6孔板扩出来的P2代溶瘤腺病毒感染10cm Dish的293A细胞，收集的细胞和上清即P3代溶瘤腺病毒，用P3代溶瘤腺病毒进行大量扩增。将扩增的病毒测定滴度后分装于-80℃保存，待扩出的病毒量达到纯化需求量，则进行氯化铯梯度离心纯化浓缩。
3.3溶瘤腺病毒SD55、SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF的纯化
本实验纯化病毒的方法使用的是CsCl密度梯度离心法。
首先将收集的病毒液(细胞和上清)反复冻融三次，离心10min、4℃、12000rpm，沉淀为细胞碎片，收集离心后的上清液。将上清(病毒液)和配好的PEG 8000按2:1的体积比混合均匀，在冰上共孵育过夜。第二天将病毒与PEG 8000混合液分装在50mL离心管中离心20min、12000rpm、4℃。依次用2mL、2mL和1mL的CsCl溶液(1.1g/mL)吹起管底沉淀，重悬病毒。将收集的病毒重悬液离心10min、7000rpm、4℃，收集上清液。
铺CsCl溶液梯度：先加入2mL 1.3g/mL CsCl溶液，再缓慢滴加3mL 1.4g/mL CsCl溶液，在两者之间应该出现一条明显的分层线，如果出现该分界线，则CsCl密度梯度铺成功，若未出现则取新的离心管重新铺梯度。铺好CsCl密度梯度后，往离心管中缓慢加入5mL的病毒悬液，配平后超速离心于21800rpm，4℃下离心2h。离心后，纯化好的病毒液会出现在1.3g/mL和1.4g/mL CsCl溶液交界，呈现出乳白色的条带。将上层液体吸弃，收集乳白色的病毒条带。提前将透析袋在10mM Na2EDTA溶液中煮沸进行活化，再将病毒液加入MW14000的透析袋内透析48h，目的是去除CsCl，中途更换一次透析液，透析结束后将病毒液吸出，混匀后分装，于-80℃冰箱内长期保存。
3.4溶瘤腺病毒PD-L1、CXCL9、GMCSF因子的表达鉴定
3.4.1溶瘤腺病毒干扰PD-L1表达的Western Blot鉴定
实验设计了空白对照组A549(未加病毒)、Ad-SD55溶瘤腺病毒组、Ad-SD55-shRNA溶瘤腺病毒组。首先将溶瘤腺病毒感染72h后的A549，用预冷的PBS清洗两遍；其次，用含1％PMSF的RPMI裂解液裂解细胞2-10min，将裂解物收集到EP管内，于12000rpm、4℃条件下离心10min，收集上清之后，对上清液中的蛋白进行定量；最后，用适量SDS-PAGE缓冲液将蛋白样品稀释到2μg/mL，100℃煮沸7-10min，将蛋白样品于-80℃下保存，用于后续实验。
Western Blot实验结果见图11。从图11a可见shRNA构建在溶瘤腺病毒上，对A549的PD-L1表达的干扰效果不佳；图11b为量化图，从实验数据上看，SD55溶瘤腺病毒对A549PD-L1的表达没有任何影响，与NC组相比较表达量一致，溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA实验组检测PD-L1的表达量相比较NC组为88.2％，干扰效率为11.8％。结果显示，溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA对PD-L1存在一定的干扰效果，说明该溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA构建成功。
3.4.2溶瘤腺病毒过表达CXCL9、GM-CSF Western Blot鉴定同样用相同MOI值溶瘤腺病毒感染A549细胞，72h收集蛋白。实验设计了空白对照组A549(未加病毒)、Ad-SD55溶瘤腺病毒组、Ad-SD55-CXCL9-GMCSF溶瘤腺病毒组。
过表达的Western Blot鉴定结果见图12。从图12a中，看出CXCL9和GM-CSF都存在过表达。A549细胞是不表达CXCL9和GM-CSF，未改造的溶瘤腺病毒Ad-SD55也是不表达CXCL9和GM-CSF，只有改造后过表达这两个因子的溶瘤腺病毒Ad-SD55-CXCL9-GMCSF感染A549细胞后检测出CXCL9和GM-CSF。图12b，相比内参，CXCL9的表达上调了9.8倍，说明CXCL9的过表达溶瘤腺病毒构建成功；图12c，相比内参，GM-CSF的表达上调了3倍，说明GM-CSF的过表达溶瘤腺病毒构建成功。同一个过表达框，CXCL9和GM-CSF过表达量有差异，原因是T2A断裂对后一个过表达因子GM-CSF产生影响。
实施例4：溶瘤腺病毒的体外细胞实验
4.1TCID50测病毒滴度
首先96孔板中铺入每孔3000个293A细胞，37℃培养箱过夜培养。第二天，将10cmDish收集来的病毒液反复冻融3次，按10-12-10-3的梯度稀释病毒液，加入96孔板中，37℃培养箱培养7-10天。7-10天观察并记录96孔板中病变情况，计算出Ad-SD55和Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF溶瘤腺病毒的滴度。实验结果：溶瘤腺病毒Ad-SD55滴度为6.93×107pfu/mL、溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF滴度为2.759×106pfu/mL。
4.2Western Blot检测各种癌细胞的PD-L1表达量
将多种癌细胞铺在6孔板中，待细胞长满后6孔板后提取相关蛋白，并进行相应的Western Blot实验。
通过Western Blot实验检测了胰腺癌细胞hHTERT-HPNE、PANC-1、ASPC-1、SW1990、cFPAN-1和肝癌PLC、结肠癌细胞HCT-116、结肠腺癌SW480、非小细胞肺癌A549、人肺腺癌细胞H1975、人胆管癌RBE、人乳腺癌细胞MCF-7，这些细胞的PD-L1的表达情况。从图13a中可以看出非小细胞肺癌A549的PD-L1表达量最高，结肠腺癌SW480表达量次之；从图13b可以看出胰腺癌细胞ASPC-1、SW1990、cFPAN-1的PD-L1表达量度较高，但是由于ASPC-1、cFPAN-1培养过程中，细胞生长状态不佳，所以后续细胞实验选择了SW1990。综上所述，胰腺癌细胞SW1990、非小细胞肺癌A549、结肠腺癌SW480的PD-L1表达量都较高，选取这些细胞作为后续细胞实验的细胞株。
4.3MTT检测溶瘤腺病毒对癌细胞生长的影响
第一天，96孔板中铺入每孔5000个癌细胞，37℃培养箱过夜培养。第二天加入不同MOI值的病毒液，对照组加入等量无血清DMEM。分别在24h、48h、72h、96h后分别进行后续操作。将处理好后的细胞从培养箱中取出，96孔板每孔加入20μL MTT工作液后，37℃培养箱继续培养4h。4h后用真空吸液器将上清液去除，再往孔中加入150μL DMSO，振荡10min，用酶标仪检测OD490 nm。按照如下公式计算细胞存活率。
a·
b
本实验探究了不同感染复数及不同处理时间下重组病毒对三种癌细胞A549、SW480、SW1990的杀伤效果。细胞铺96孔板后，第二天分别加入5MOI、10MOI、15MOI、20MOI、30MOI、40MOI的病毒，分别处理24h、48h、72h、96h后加入试剂进行MTT实验，检测细胞存活率。
MTT检测溶瘤腺病毒对A549细胞生长的影响结果如图14所示，与空载溶瘤腺病毒Ad-SD55相比，重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF对A549有更好的杀伤作用，且随之时间的增加，细胞存活率越低。随着感染复数的增加，A549细胞的存活率越低，Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF重组溶瘤腺病毒的杀伤作用越明显，说明对A549肿瘤细胞，杀伤效果与重组溶瘤腺病毒的感染复数呈正相关，有感染复数依赖性。
MTT检测溶瘤腺病毒对SW480细胞生长的影响结果如图15所示，与空载溶瘤腺病毒Ad-SD55相比，重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF对SW480有更好的杀伤作用，且随之时间的增加，细胞存活率越低。MOI值达到5后，随着MOI值的增加，细胞的存活率没有明显变化，说明，在1-5MOI处存在最适的病毒加入量达到SW480细胞的最大杀伤效果。
MTT检测溶瘤腺病毒对SW1990细胞生长的影响结果如图16所示，与空载溶瘤腺病毒Ad-SD55相比，重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF对SW1990有更好的杀伤作用，且随之时间的增加，细胞存活率越低。随着感染复数的增加，A549细胞的存活率越低，溶瘤腺病毒Ad-SD55和Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF的杀伤作用越明显，说明对SW1990肿瘤细胞，杀伤效果与溶瘤腺病毒的感染复数呈正相关，有感染复数依赖性。随着感染复数的增加，SW1990细胞的存活率越低，Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF重组溶瘤腺病毒的杀伤作用越明显，说明对SW1990肿瘤细胞，杀伤效果与重组溶瘤腺病毒的感染复数呈正相关，有感染复数依赖性。
4.4结晶紫检测溶瘤腺病毒对癌细胞生长的影响
24孔板中铺入相应癌细胞，每孔5×104个细胞，37℃培养箱过夜。将相应的MOI值将病毒加到24孔板中，培养箱中培养48h、72h。将24孔板内的培液弃去，PBS洗两次，加入200μL结晶紫溶液染色20min。用娃哈哈水洗去染液后，将24孔板倒置放入烘箱中烘干，烘干后拍照记录。
本实验旨在定性探究重组病毒对A549、SW480、SW990三种癌细胞的杀伤作用。结晶紫是一种常用的细胞染色试剂，为碱性染料，可以和细胞内DNA结合，从而细胞核呈现深紫色，通过颜色来反映活细胞数量。结晶紫实验结果如图17所示，图17(a)为病毒处理A549后72h结晶紫实验结果；图17(b)为病毒处理SW480后48h结晶紫实验结果；图17(c)为病毒处理SW1990后48h结晶紫实验结果。图中紫色越浅说明活细胞数量越少，即细胞的存活率越低。图17(a)中，与对照溶瘤腺病毒Ad-SD55相比，Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF重组溶瘤腺病毒对A549癌细胞的杀伤作用更加明显，且杀伤效果随着MOI值的升高而愈发明显。图17(b)中，与对照相比，Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF重组溶瘤腺病毒对SW480癌细胞的杀伤作用更加明显。图17(c)中，与对照相比，Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF重组溶瘤腺病毒对SW1990癌细胞的杀伤作用更加明显。综上所述，重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF对肿瘤细胞具有广谱杀伤。
4.5hoechst33342染色法检测细胞凋亡
按照结晶紫的实验操作铺板，加入病毒处理24h，弃去培养基，PBS清洗。加入200μL的Honchest33342工作液，避光孵育20min，在荧光显微镜下观察凋亡小体，拍照记录。
本实验旨在定性评估重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF对癌细胞的凋亡产生的影响。Hochest33342染色检测三种癌细胞凋亡的实验结果如图18所示，对照组溶瘤腺病毒Ad-SD55和重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF处理后，48h荧光显微镜观察，两种病毒处理后明显A549、SW480、SW990癌细胞数量都减少，体积变大；与Ad-SD55对照组相比较，重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF处理组，癌细胞数量更少，在细胞内部出现更多的凋亡小体。综上所述，重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF相比较普通溶瘤腺病毒Ad-SD55，能诱导更多细胞产生凋亡，故对癌细胞的杀伤性更好。
本发明将靶向病毒治疗、基因质量和免疫治疗相结合，构建出新型重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF，能够靶向杀伤对中肿瘤细胞，重组溶瘤腺病毒感染后使肿瘤细胞表面PD-L1表达降低，降低肿瘤免疫逃逸；GM-CSF过表达，刺激肿瘤区域粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞的增殖分化，增强免疫网络反应；在肿瘤病灶区表达CXCL9增加CD8+T细胞、DC细胞等免疫细胞的迁移浸润，减少肿瘤局部血管的生成，并且CXCL9可以诱导细胞发生凋亡。病毒裂解细胞后释放相关因子将肿瘤由冷转热，解除肿瘤抑制性免疫微环境，过表达多因子共同作用增强免疫，靶向杀伤肿瘤细胞。本发明中，通过体外细胞实验，验证了重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF对多种肿瘤细胞均具有很好的杀伤性，在肺癌、胰腺癌、结直肠癌中表现出很强的抗肿瘤活性。
综上，构建的新型重组溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-GMCSF不仅能够靶向杀伤肿瘤细胞，还能发挥免疫治疗的作用，为肿瘤治疗的病毒-免疫疗法提供新的策略和思路。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (9)

1.一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31，其特征在于，以溶瘤腺病毒SD55为载体，利用基因工程方法，构建携带干扰PDL1的shRNA序列、CXCL9序列和GM-CSF序列的重组溶瘤腺病毒AD-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF即为多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31，所述多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31同时表达干扰PD-L1的shRNA、趋化因子CXCL9以及免疫因子GM-CSF。
2. 根据权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31，其特征在于，所述干扰PDL1的shRNA序列为SEQ ID No.1- SEQ ID No.4其中之一。
3.如权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）合成U6-shRNA片段和hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段：
以含U6-shRNA片段的质粒、 含CXCL9-T2A-GMCSF片段的质粒为模板进行无缝克隆获得U6-shRNA片段和hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段；
（2）三片段无缝克隆
用Hind III单酶切，将pSD55质粒线性化得到线性化pSD55质粒，将线性化pSD55质粒与U6-shRNA片段和hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段一起进行多片段无缝克隆得到连接产物；
（3）SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒构建
无缝克隆的连接产物转化DH5α感受态细胞后，培养，挑选阳性克隆菌落，提取质粒，利用EcoRⅠ单酶切鉴定并测序验证，得到SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒；
（4）溶瘤腺病毒Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF的构建
将SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒线性化后，接着采用去磷酸化酶FastAP去磷酸化，然后转化进BJ583感受态细胞中进行重组，培养，挑选阳性克隆菌落，提取质粒，得到Ad-SD55-shRNA-CXCL9-T2A-GMCSF质粒，利用MluⅠ单酶切鉴定并测序验证，验证通过后表明构建的溶瘤腺病毒构建成功。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，含U6-shRNA片段的质粒是采用两种限制性内切酶BamHI、MluI线性化过表达plent-U6-CMV-copGFP-P2A-Puro质粒，将线性化的质粒载体与shRNA双链模版进行连接形成。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，含CXCL9-T2A-GMCSF片段的质粒是合成CXCL9-T2A-GMCSF片段并连接到pCA13质粒载体上形成。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，线性化pSD55质粒与U6-shRNA片段和hCMV-CXCL9-T2A-GMCSF片段的摩尔比=1:1.5:1.5。
7.如权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
8.如权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
9.如权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒GOV31在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
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